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WO2005047538A2 - Ligands du represseur mycobacterien ethr, procedes de selection et applications - Google Patents

Ligands du represseur mycobacterien ethr, procedes de selection et applications Download PDF

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WO2005047538A2
WO2005047538A2 PCT/FR2004/002721 FR2004002721W WO2005047538A2 WO 2005047538 A2 WO2005047538 A2 WO 2005047538A2 FR 2004002721 W FR2004002721 W FR 2004002721W WO 2005047538 A2 WO2005047538 A2 WO 2005047538A2
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WO
WIPO (PCT)
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ethr
compound
repressor
etha
gene
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/FR2004/002721
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English (en)
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WO2005047538A3 (fr
Inventor
Frédéric FRENOIS
Jean Engohang-Ndong
Vincent Villeret
Camille Locht
Alain Baulard
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut Pasteur de Lille
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Institut Pasteur
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut Pasteur de Lille
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Institut Pasteur
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Publication date
Priority claimed from FR0312801A external-priority patent/FR2861742B1/fr
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Institut Pasteur de Lille, Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM, Institut Pasteur filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of WO2005047538A2 publication Critical patent/WO2005047538A2/fr
Publication of WO2005047538A3 publication Critical patent/WO2005047538A3/fr
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/635—Externally inducible repressor mediated regulation of gene expression, e.g. tetR inducible by tetracyline
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/12—Ketones
    • A61K31/121—Ketones acyclic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof

Definitions

  • the present invention relates to the field of research into new drugs for the treatment of mycobacterial infections, in particular tuberculosis and leprosy. More specifically, the invention relates to methods for selecting compounds capable of binding to the mycobacterial repressor EthR, this binding preventing it from repressing the expression of the mycobacterial gene ethA encoding an activator of ethionamide (ETH). The present invention also relates to the compounds thus selected, as well as to their applications for the prophylaxis and / or the treatment of mycobacterial infections. It is currently estimated that approximately 7 to 8 million people contract tuberculosis each year. About 50 million people are currently infected with strains of
  • Mycobact ⁇ um tuberculosis multi-resistant to antibiotics are in particular resistant to both isoniazid (INH) and rifampicin (RIF), the two first-line antibiotics (ie, including the therapeutic index, representing the toxic dose / therapeutic dose ratio-high ) -used-for-tuberculosis (Espinal e ' a / :,
  • ETH and INH are prodrugs which must be converted into active compounds by specific mycobacterial enzymes (Baulard et a, 2000). These two antibiotics inhibit the biosynthesis of mycolic acids, essential constituents of the mycobacterial wall. They both target the enzyme enoyl-AcpM reductase (InhA). However, the mechanism of action of these two antibiotics follow different metabolic pathways: INH is activated by catalase peroxidase KatG, while activation of ETH is dependent on the enzyme EthA. Consequently 95% of the strains resistant to INH remain sensitive to ETH. Another major difference between these two antibiotics lies in their respective minimum inhibitory concentration (MIC).
  • MIC minimum inhibitory concentration
  • ethA is placed under the control of the adjacent ethR gene, insofar as the overexpression of ethR leads to resistance to ETH and the chromosomal inactivation of ethR is associated with hypersensitivity to ETH, thereby revealing that not all ETH molecules are activated in vitro in wild-type mycobacteria.
  • the present invention aims to provide means which allow more efficient activation of ETH by mycobacteria. So, thanks to means according to the invention, it is now possible to optimize the therapeutic efficacy of ETH by reducing the dosages to be administered to patients and, consequently, by reducing the side effects linked to the administration of this antibiotic according to current protocols. .
  • the present invention provides methods of selecting compounds which act as ligands for the repressor EthR, and which, when linked to said repressor, prevent the latter from repressing the expression of the ethA gene.
  • these compounds will also be called “EthR repressor inhibitors”.
  • selection of a compound is meant the fact that one chooses to retain and use this compound because it has the property of interest sought: an inhibitor of the EthR repressor, in other words in the present case, as indicated below, it has the capacity, by attaching to the EthR repressor, to prevent the latter from repressing the expression of the ethA gene.
  • a compound can be a nucleic acid (eg, a sense or antisense oligonucleotide such as an antisense RNA), a protein, a fatty acid, an antibody, a polysaccharide, a steroid, a purine, a pyrimidine, a molecule organic, chemical radical, etc.
  • the term "compound” also covers fragments, derivatives, structural analogs or combinations thereof, as long as they have the ability, by attaching to the repressor EthR, to prevent the latter from repressing the expression of the ethA gene. This capacity represents the property of interest which must be presented by the compounds selected by the implementation of the methods which are the subject of the present invention.
  • a selection method as targeted by the present invention comprises at least (method A): a) cloning of the gene encoding said EthR repressor on a first recombinant expression plasmid, and cloning of at least the promoter and operator region of the ethA gene upstream of a reporter gene on a second recombinant expression plasmid; b) transformation of a recombinant host cell with at least the plasmids according to step a); c) culturing said recombinant host cell in the presence of a candidate compound; d) measuring the level Ni of expression of the reporter gene in the presence of said candidate compound; e) comparing the level Ni measured in step d)
  • a second embodiment of the selection method according to the invention corresponds to the method described above, in which, however, not two recombinant expression plasmids are used (steps a) and b)), but only one, on which are cloned both the gene encoding the repressor EthR and at least the promoter and operator region of the gene ethA upstream of a reporter gene.
  • such a method comprises at least (method B): a) the cloning of the gene coding for said EthR repressor, and the cloning of at least the promoter and operator region of the ethA gene upstream of a reporter gene, on a plasmid recombinant expression; b) transformation of a recombinant host cell with at least the plasmid from step a); c) culturing said recombinant host cell in the presence of a candidate compound; d) measuring the level Ni of expression of the reporter gene in the presence of said candidate compound; e) comparing the level Ni measured in step d) with the level N 0 of expression of the reporter gene in the absence of said candidate compound; and f) if Ni is significantly greater than No, the selection of the compound.
  • the promoter and operator region of the ethA gene to be cloned for the purposes of implementing a method according to the invention comprises at least the sequence SEQ ID No. 1, which corresponds to the promoter and operator region of the ethA gene on which fix 4 repressor molecules (see experimental part below).
  • this region comprises at least the sequence SEQ ID No. 2, to which 8 molecules of EthR are attached. More preferably, this region comprises at least the sequence SEQ ID No. 3, which corresponds to the intergenic sequence ethA-R.
  • a recombinant expression plasmid containing the ethR gene (coding for EthR) is pMV261-ef /? : ? (see experimental part below).
  • a recombinant expression plasmid containing at least the promoter and operator region of the ethA gene upstream of a reporter gene is pBSh-P ethA - lacZ (see experimental part below).
  • the reporter gene is lacZ.
  • said recombinant host cell is a mycobacterial cell. It is preferably a Mycobacterium bovis, M. smegmatis, M. tuberculosis or M. leprae cell.
  • a person skilled in the art can choose a cell of M. bovis BCG 1173P2 (vaccine strain accessible on simple request from the World Health Organization), or of M.
  • a selection method in accordance with the present invention comprises at least (method C): a) determining the level of binding of the EthR repressor on at least the promoter and operator region of the ethA gene, in the presence a candidate compound; b) comparing the Li level with the Lo level of binding of the EthR repressor on at least the promoter and operator region of the ethA gene, in the absence of said candidate compound; and c) if Li is significantly less than L 0 , the selection of the compound.
  • the binding levels L 0 and U can be determined using a method chosen from surface plasmon resonance, detection of natural fluorescence and energy transfer by fluorescence resonance (FRET for
  • a selection process targeted by the present invention comprises at least (method D): a) bringing together the repressor EthR and at least two candidate compounds; b) crystallization of the mixture thus obtained; c) analysis of the structure of the crystal resulting from step b); d) if this analysis reveals that one of said compounds is linked to said EthR repressor, the solubilization of said crystal; e) elution and selection of said compound.
  • the steps d) of solubilization of the crystal and e) of elution and selection of the compound call for conventional methods (see for example the experimental part below), well known in the technical field of the invention.
  • method E comprises at least (method E): a) bringing together the repressor EthR and a candidate compound; b) crystallization of the mixture thus obtained; c) analysis of the structure of the crystal resulting from step b); d) if this analysis reveals that said compound is linked to said EthR repressor, the selection of said compound (from the starting candidate compound).
  • the stages of crystallization (stage b)), of analysis of the structure of the crystal (stage c)) and, where appropriate, that of the selected compound (as indicated below, it can be determined, in the context an additional subsequent step, the structure of the selected compound) can be carried out, for example using the techniques described in the examples below, or by any other conventional method known to those skilled in the art. It will be noted that at the end of the selection methods according to the invention described above (methods A, B, C, D and E), a step of determining the structure of the selected compound can be advantageously implemented. In addition, the selection methods according to the invention described above (methods A, B, C, D and E) can be implemented alone or in combination.
  • a person skilled in the art can choose a selection method according to one or other of the five above-mentioned embodiments.
  • one of the first three embodiments above (method A, B or C) will then be implemented.
  • a person skilled in the art may first implement the fourth or fifth embodiment (method D or E) in order to select a compound, then any one of the first three embodiments (method A, B or C) in order to confirm that the compound thus selected exhibits the capacity, by binding to the repressor EthR, to prevent the latter from repressing the expression of the ethA gene.
  • a second aspect of the present invention relates to a compound, as defined above, inhibitor of the EthR repressor, capable of being obtained by the implementation of a selection process according to the invention.
  • a compound targeted by the invention is capable of being obtained by the successive implementation of several, of preferably two, different selection methods from those described above.
  • a compound targeted by the present invention interacts with residues F110 and F114 of the repressor EthR (see experimental part below, paragraph ll-E).
  • a compound object of the invention is fixed in the binding pocket of the ligand of the EthR repressor, which is defined by the following EthR residues: R128, V134, G124, L76, Q125, F187, F184 , T121, W138, F114, L183, E180, M142, N179, N176, W145, F110, W207, T149, 1107, L87, V152, Y148, G106, W103 and M102 (see experimental section below, paragraph ll-E ). Note that hexadecyl octanoate (Garcia-Rubio et al.;
  • the present invention provides means useful in the field of prevention and / or treatment of diseases, in particular bacterial infections and, preferably, mycobacterial infections such as tuberculosis and leprosy.
  • the invention relates to a compound which inhibits the repressor EthR as a medicament, intended in particular for preventing and / or treating bacterial infections, preferably mycobacterial infections.
  • such a compound can be obtained by at least one selection process described above. Indeed, since the knockout mutant ethR described in
  • the compound used as a medicament can be an analog or a derivative of the co-crystallized ligand described in the experimental part below (octanoate of hexadecyl). It can also be an analogue or a derivative of benzylacetone (see experimental part below).
  • an “analog” is any modified, pharmaceutically acceptable (in particular non-toxic) version of an initial compound, said modified version possibly being natural or synthetic, in which one or more atoms, such that atoms of carbon, hydrogen, oxygen, or heteroatoms such as nitrogen, sulfur or a halogen, have been added or removed from the structure of the initial compound, so as to obtain a new molecular compound pharmaceutically acceptable.
  • derivative here designates any pharmaceutically acceptable compound which has an affinity for the repressor EthR, a resemblance or a structural motif, in common with a reference compound.
  • This definition also includes, on the one hand, the compounds which, alone or with other compounds, can be precursors or intermediate products in the synthesis of the reference compound, by means of one or more chemical reactions, and on the other hand compounds which can be formed from the reference compound, alone or with other compounds, via one or more chemical reactions.
  • ketones and esters obtained from a reference compound are included in the definition of the term "derivative”.
  • pharmaceutically acceptable designates here what is suitable and useful for preparing a pharmaceutical composition or a drug, which is generally devoid of toxicity, especially in humans.
  • at least some of the pharmaceutically acceptable compounds described by Fraaije et al. Are covered by the definitions of "analogs" and “derivatives” above.
  • a compound useful as a medicament targeted by the invention is chosen from analogs and pharmaceutically acceptable inhibitors of EthR and derivatives of 2-hexanone, 2-heptanone, 4-heptanone, 2 -octanone, 3-octanone, 2-decanone, 2-dodecanone (Fraaije et al. 2004).
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising at least, as active principle, a compound which inhibits the repressor EthR and which is useful as a medicament (that is to say in particular pharmaceutically acceptable), as described above, in combination with the at least one pharmaceutically acceptable excipient.
  • a pharmaceutically acceptable excipient e.g., solution, suspension, emulsion, tablets, capsules, etc.
  • the route of administration chosen will depend on the route of administration chosen.
  • a medicament or a pharmaceutical composition can be administered by any suitable route, for example the oral, local, systemic, intravenous, intramuscular or mucosal route, or alternatively by using a patch, or again in a form encapsulated in, or immobilized on, liposomes, microparticles, microcapsules, and the like.
  • excipients suitable for oral administration talc, lactose, starch and its derivatives, cellulose and its derivatives, polyethylene glycols, polymers d acrylic acid, gelatin, magnesium stearate, animal, vegetable or synthetic fats, paraffin derivatives, glycols, stabilizers, preservatives, wetting agents, dispersants, emulsifiers, penetration agents, solubilization, etc.
  • excipients suitable for oral administration talc, lactose, starch and its derivatives, cellulose and its derivatives, polyethylene glycols, polymers d acrylic acid, gelatin, magnesium stearate, animal, vegetable or synthetic fats, paraffin derivatives, glycols, stabilizers, preservatives, wetting agents, dispersants, emulsifiers, penetration agents, solubilization, etc.
  • the techniques for formulating and administering drugs and pharmaceutical compositions are well known in the art considered here (a person skilled in the art may in particular refer to the work "Remington's Pharmaceutical
  • the present invention also relates to the use of at least one compound inhibiting the EthR repressor and useful as a medicament (that is to say in particular pharmaceutically acceptable), as described above, for the manufacture of a medicament intended prevention and / or treatment of bacterial infections, preferably mycobacterials.
  • the invention relates to products containing a compound which inhibits the repressor EthR and is useful as a medicament (that is to say in particular pharmaceutically acceptable), in accordance with the invention, and either ETH or one of its derivatives, an antibiotic activatable by the mycobacterial activator EthA, as a combination product for simultaneous, separate or spread over time in anti-tuberculosis or anti-leprosy therapy.
  • Figure 1 ⁇ -galactosidase activity in transformed mycobacteria.
  • A detection of ⁇ -galactosidase activity in M. smegmatis transformed with (a) pBSh-P ethA - / acZ, (b) pBSh-P ethA - / acZ + pMV261-e7? R, (c) pMV261-ef ? R, on agar plates containing LB medium enriched in X-Gal.
  • B quantification of ⁇ -galactosidase activity in M.
  • the labeled probe of 191 bp (100,000 cpm) was mixed with 0 ⁇ g (lane 1), 0.45 ⁇ g (lane 2), 0.90 ⁇ g (lane 3), 1, 35 ⁇ g (lane 4), 1, 8 ⁇ g (lane 5) and 3.6 ⁇ g (lane 6) His 6 -EthR in the absence (A) or in the presence of an excess of the unmarked ethA-R intergenic region used as specific competitor (B) or still in the presence of an excess of non-specific competitor DNA (C).
  • the 2 probes (A: Hind ⁇ - Sph ⁇ fragment of 323 bp; B: Xho ⁇ - HindlW fragment of 312 bp) were incubated without (lane 1) or with different amounts of His 6 -EthR (A: lane 2: 0.0625 ⁇ g; lane 3: 0.125 ⁇ g; lane 4: 0.25 ⁇ g; lane 5: 0.5 ⁇ g; lane 6: 1 ⁇ g; B: lane 2: 1 ⁇ g; lane 3: 2.5 ⁇ g ; lane 4: 5 ⁇ g; lane 5: 7.5 ⁇ g; lane 6: 10 ⁇ g), before treatment with DNase I.
  • C localization of the region protected by Hise-EthR against digestion by DNase I.
  • D analysis of primer extension. The coding strand sequence is shown and the +1 transcription point is underlined.
  • Figure 4 overall affinity and stoichiometry of the interaction between His 6 -EthR and Pet A measured by SPR.
  • A structure of the ethA-R intergenic region.
  • IG-37 includes 2 imperfect direct repetitions (solid arrows) which include 2 imperfect indirect repetitions (bases in italics).
  • IG-36 includes 2 imperfect indirect repetitions (dotted arrows).
  • Figure 5 Hill representation for the binding of His 6 -EthR on the ethA-R intergenic region.
  • Figure 6 gel filtration chromatography.
  • Y-axis relative absorbances (mAU for milliabsorbance unit) to
  • Figures 8 and 9 structure of the ligand linked to the homodimer of EthR, according to a respectively perpendicular view [Figure 8: structure of the crystal of the EthR repressor of the space group P2-
  • EthR consists of 9 helices: ⁇ 1 (23-38), ⁇ 2 (47-54), ⁇ 3 (56-64), ⁇ 4 (68-92), ⁇ 5 (99-115), ⁇ 6 (118-129), ⁇ 7 (132-158), ⁇ (168-188) and ⁇ 9
  • the HeOc molecules occupy space across the entire ligand binding domain.
  • Figure 10 superposition of the central ligand binding region (helices ⁇ 4 to ⁇ 9) of EthR and that of the repressor QacR, equivalent from a topological point of view, in the induced form.
  • a water molecule is buried via a hydrogen bridge formed with the residue N179.
  • the recognition of the ligand involves residues of the 6 helices which form the binding domain of the ligand.
  • Figure 12 superimposition of the central ligand binding region (helices ⁇ 4 to ⁇ 9) of EthR in complex with hexadecyl octanoate and that of QacR in complex with dequalinium.
  • F110 apparently plays an important role in the induction of EthR, by analogy with that played by the Y92 region of QacR.
  • the structure of QacR highlights the binding pocket comprising several sites. Although the two repressors have the same ligand entry portal and have partially overlapping adjacent binding sites, they are particularly divergent with respect to the overall binding cavities.
  • the EthR ligand is deeply buried, primarily in the central hydrophobic region of the ligand binding domain, in a cavity which is located parallel to the axes of the propellers ⁇ 4 and ⁇ 7.
  • the pocket connecting to several QacR sites is practically parallel to ⁇ 6.
  • the displacement of ⁇ 5 in EthR compared to that of QacR closes this cavity in EthR.
  • Figure 13 electron density map, performed at a level of 1.5 ⁇ , calculated by excluding hexadecyl octanoate (HeOc) from the model.
  • Figure 14 Identification of the EthR ligand by GC-MS after organic extraction.
  • Figure 15 Synergistic effect of benzylacetone and ETH on the growth of M. smegmatis.
  • the synergistic effect was tested by depositing 4 ⁇ L of dilutions in series (A: 10 '2 ; B: 10 "3 ; C: 10 -4 ; D: 10 ' 5 ) of a culture in the growth phase of M. smegmatis me 2 155 on dishes of LB medium not containing antibiotics, or containing 5 ⁇ g / mL of ETH alone (ETH), 1 mM benzylacetone alone (BA), or a combination of the two compounds (ETH + BA).
  • I- EthR suppresses the expression of ethA by binding directly to the promoter and operator region of ethA:
  • the E. coli strains were cultivated in Luria-Bertani (LB) medium (Life
  • the mycobacterial strains were cultivated in Sauton medium (Sauton).
  • antibiotics Sigma were added to the medium at the following concentrations: kanamycin at 20 ⁇ g / ml, ampicillin at 100 ⁇ g / ml, hygromycin at 50 ⁇ g / ml, streptomycin at 20 ⁇ g / ml and gentamicin at 15 ⁇ g / ml.
  • the bacteria were harvested, washed with PBS phosphate buffer and stored at -20 ° C.
  • the promoter region P and A was amplified by PCR using the primers 0-161: 5'-CCAGCGGACGGTCCTCTAGAAGGTTC-3 '(SEQ ID No. 4), 0-162: 5'-GTGAGATCTCATGGATCCACGCTATCAAGGTAA-3' (SEQ ID No. 5).
  • the PCR product was inserted into pCR2.1Topo (Invitrogen) to give pCR2.P and hA (2 + 4).
  • the plasmid was redigested with Xba ⁇ and BglII and the 191 bp fragment containing P ethA was inserted into pBSh- lacZ, previously digested with Xba ⁇ and BamHI to give pBSH-P e tha- lacZ.
  • the region encoding EthR was amplified by PCR using the primers O-243: 5'-CTGCAGTGACCACCTCCGCGGCCAG-3 '(SEQ ID N ° 6) and O- 244: 5'-GGTACCTTATCTGTTCTCGCCGTAA-3' (SEQ ID N ° 7) .
  • the amplified sequence was cleaved by Pst ⁇ and / 4sp718, and inserted into pT25 digested with Psfl-, 4sp718 (Karimova et al., 1998), to give pT25-EthR.
  • the same chromosomal region was amplified by PCR using the primers O-240: 5'-
  • a strain of E. coli cyclase-deficient (DHP1) (Karimova et al., 1998) was co-transformed with these two plasmids. The capacity of the resulting clones to ferment the maltose was determined at 30 ° C.
  • the ⁇ -galactosidase activities of the recombinant strains of M. smegmatis and M. bovis BCG were detected on M7H11 agar dishes enriched with 100 ⁇ g / ml of X-gal. ⁇ -galactosidase activities have been quantified in liquid cultures, using a method adapted from Miller (1972). Briefly, the mycobacterial cells were cultured in Sauton medium (50 ml) to an optical density (OD) at 600 nm of 0.6. The cells were then harvested by centrifugation (4000 g, 15 min, 4 ° C), and the pellets were washed, then resuspended in 1 ml of PBS.
  • Sauton medium 50 ml
  • OD optical density
  • AS ( ⁇ A 2 onm min "1 ) / (DO ⁇ oonm I of culture). Triplicate samples were measured for each bacterial clone. assess the potential influence of ETH on the activity of the EthR repressor, M. smegmatis co-transformed with pBSh-P ethA - / acZ and pM261-ef / 7f? was cultured up to an OD ⁇ oonm of 0.3 .
  • the PCR product was inserted into pCR2.1 Topo so as to form pCR2 ⁇ -ethR.
  • the sequence of the fragment encoding EthR was determined on the two strands and, then, isolated from pCR2.1-0 ethR by digestion with Nde ⁇ and BamHI, then inserted into pET-15b (Novagen), to give pET-15b -e # 7R.
  • This plasmid codes for an EthR protein carrying an amino terminal tag having the following sequence: MGSSH 6 SSGLVPRGSHM (SEQ ID No. 12).
  • This plasmid was introduced into E. coli BL21 (DE3).
  • E. coli BL21 (DE3) (pET-15b-etf?
  • Electrophoretic mobility interference measurement (EMSA for “Electrophoretic mobility shift assays”)
  • the 191 bp PCR fragment obtained using oligonucleotides 0-161 and 0-162 and containing the promoter region of ethA was purified by agarose gel electrophoresis and labeled with 10 ⁇ Ci of [ ⁇ - 32 P] ATP (3000 Ci / mmol; Amersham Biosciences) using T4 polynucleotide kinase (10 units, Invitrogen).
  • the radiolabelled fragment ([ 32 P] -P e thA) was purified using a MicroSpin G-25 column (Amersham, Biosciences).
  • [ 32 P] -P eth A (100,000 counts per minute; cpm) was incubated for 10 min at room temperature with variable amounts of HiS ⁇ -EthR in a reaction volume of 20 ⁇ l containing 1 ⁇ g of poly- (dl- dC) (Amersham Biosciences) and 2 mM Tris-HCI (pH 8.0), 0.4 mM MgCI 2 , 5 mM KCI, 0.2 mM DTT, 10% glycerol and 0.01% non-ionic detergent P40 (Igepal CA-630, Sigma).
  • a 94 bp DNA fragment overlapping P ethA was amplified by PCR using the chromosomal DNA of M. tuberculosis H37Rv as template and O-270: 5'-CGGTCATGGATCCACGCTATCAAC-3 '(SEQ ID NO: 13) and O - 272: 5'-GGAGGTGGTCACCCTGGCAGC-3 '(SEQ ID No. 14) as primers.
  • Varying amounts of His 6 -EthR were mixed with 6.7 ⁇ g (0.108 mmol) of PCR products in buffer A (50 mM NaH 2 P0 4 , pH 7.5; 250 mM NaCl) and filtered through a Superdex column 200 HR 10/30 connected to an AKTA FPLC system (Amersham Biosciences) at a flow rate of 0.3 ml per minute. Relative protein and DNA concentrations in the eluent were monitored by measuring absorbance at 280 nm and 260 nm.
  • the apparent molecular mass of Hise-EthR in the absence of DNA was estimated using the standard curve V e / V 0 against the log of the molecular masses of the standard proteins (ribonuclease A, 13.7 kDa chymotrypsinogen A, 25 kDa ; ovalbumin, 45 kDa; albumin, 66 kDa aldolase, 158 kDa; catalase, 232 kDa; apoferritin, 440 kDa thyroglobulin, 669 kDa; molecular size standards for protein gel filtration; Amersham Biosciences).
  • Vo is the dead volume and V e is the elution volume.
  • a 106 bp fragment (Figure 4A; IG-106) overlapping the ethA-R intergenic region was obtained using O-270: 5'-CGGTCATGGATCCACGCTATCAAC- 3 '(SEQ ID NO: 13) and 0-271: 5' -biotin-CTGACTGGCCGCGGAGGTGGT- 3 '(SEQ ID No. 15).
  • a 62 bp DNA fragment (IG-62) spanning a 55 bp region identified by DNase I fingerprinting experiments was amplified using 0-248: 5'-biotin-GATCCACGCTATCAACGTA-3 '(SEQ ID No. 16) and O-250: 5'-CTACGTGTCGATAGTGTCG-3 '(SEQ ID No.
  • a 37 bp fragment overlapping 2 direct repeats was amplified using 0-255: 5'-ATCAACGTAATGTCGAG-3 '(SEQ ID No 18) and 0-256: 5'-GTCGACATCTCGTTGACG-3' (SEQ ID No 19 ), then clone into pCR2.1Topo.
  • a 104 bp biotinylated DNA fragment was then obtained by PCR using 0-255 and 5'-biotin-AATTGGGCCCTCTAGATGCAT-3 '(SEQ ID No. 20).
  • a 36 bp fragment overlapping 2 reverse repeats was amplified using 0-253: 5'-GTAATGTCGAGGCCGTCAA-3 '(SEQ ID No. 21) and 0-254: 5'-ATAGTGTCGACATCTCGTT-3' (SED ID N ° 22), then clone into pCR2.1Topo.
  • a 103 bp biotinylated DNA fragment (IG-36) was then obtained by PCR using 0-253 and 5'-biotin-AATTGGGCCCTCTAGATGCAT-3 '(SEQ ID No. 23).
  • the amplified biotinylated fragments were purified on a Quiaquick column (Qiagen), then their sequence was determined before immobilization on a cell coupled to streptavidin CM5 Sensor Chip using the standard protocol provided with the "Amine Coupling" system (BIAcore '). Briefly, streptavidin was injected at 500 ng / ⁇ l in 10 mM sodium acetate (pH 3.5) for 12 minutes at a rate of 10 ⁇ l / min. Biotinylated DNA (approximately 69 kDa for the 106 bp fragment) was injected through each cell at 200 ng / ml to obtain a stable fixation of streptavidin of 205 resonance units (RU).
  • RU 205 resonance units
  • the integrity and the quantity of DNA attached were checked by injection for 120 seconds of 1.6 ⁇ M of calf H1 histone (Sigma) at 10 ⁇ l / min.
  • the binding of His 6 -EthR to DNA was carried out at 25 ° C in .0.05 M NaH 2 P0 4 (pH 7.15), 0.25 M NaCl, 0.002 M MgCl 2 , 0.05 M KCI and 0.001 M DTT at a flow rate of 20 ⁇ l / min. His6-EthR was injected at the desired concentrations in circulation buffer until equilibrium was reached.
  • the Sensor Chip cells were regenerated by a 60-second injection of 0.03% SDS.
  • the final curves were obtained by subtraction of the signal corresponding to a cell functionalized with an irrelevant double-stranded DNA fragment of 100 bp (fragment -276 to - 176 of the promoter of human stromelyin-1).
  • R max represents the maximum binding capacity of Hise-EthR estimated at 225 RU in this experiment.
  • KH and ⁇ H represent respectively the Hill constant and the Hill coefficient.
  • the same procedure and the same calculations were adapted and applied to the IG-62, IG-37 and IG-36 fragments.
  • RNA samples 10 ⁇ g of total RNA were mixed with 2 pmol of labeled primer and a mixture of dNTP (25 nmole for each nucleotide) in a final volume of 12 ⁇ l. After hybridization for 5 min at 70 ° C., the mixtures were rapidly cooled in ice, and 4 ⁇ l of First-Strand-Buffer [50 mM Tris-HCl, pH 8.3; 75 mM KCI and 3 mM MgCI 2 , 10 mM DTT, DnaseOut (40 U; Invitrogen)] were added.
  • First-Strand-Buffer 50 mM Tris-HCl, pH 8.3; 75 mM KCI and 3 mM MgCI 2 , 10 mM DTT, DnaseOut (40 U; Invitrogen)
  • reaction mixture was then incubated at 37 ° C for 2 min before the addition of 200 units of M-MLV RT (Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase; Invitrogen).
  • M-MLV RT Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase
  • the extension reaction was carried out at 37 ° C for 50 min, then the enzyme was inactivated at 70 ° C for 15 min.
  • a sequencing reaction using the dideoxy chain terminator with primer 0-273 was carried out in parallel and loaded onto a sequence gel containing 8 M urea and 6% polyacrylamide, concomitantly with the extension products d 'primer, so as to determine the position of the starting point of the transcription.
  • DNase I fingerprint DNase I protection experiments were carried out essentially as previously described (Reisenauer et al., 1999; Bellefontaine et al., 2002).
  • a Hind ⁇ - Sph ⁇ fragment of 323 bp and an Xho ⁇ -Hind ⁇ fragment of 312 bp overlapping P e thA were isolated from pCR2.1-P e thA (2 + 4) (see paragraph A. 2 above).
  • the first fragment was labeled at its end at the HindWl site using only 50 ⁇ Ci [ ⁇ - 32 P] dATP (3000 Ci / mmol; Amersham Biosciences) and 5 ⁇ l of Klenow fragment (Invitrogen).
  • the Xho ⁇ -Hind ⁇ fragment was tagged at its end at the Xho ⁇ site using the same protocol.
  • the labeled DNA fragments (10,000 cpm) were incubated with purified His ⁇ -EthR. Diluted DNase I (0.025 U, Roche) was added to each reaction mixture for 3 min at room temperature, then the reaction was stopped with 100 ⁇ l of stop solution (200 mM NaCl, 20 mM EDTA and 10% SDS ).
  • the DNAse I digests were extracted with phenol, precipitated with ethanol and separated on a gel containing 8 M of urea and 6% of polyacrylamide.
  • a sequencing standard generated with the universal primer and M13mp18 as a matrix was used to identify the position of the protected region.
  • pBSh-D a shuttle plasmid E. co // - mycobacterium which replicates in the form of a simple copy in mycobacteria ( Picardeau et al., 2000).
  • the plasmid resulting, called pBSh-P ethA - / acZ was electrotransformed in M. smegmatis mc 2 155 and M. bovis BCG 1173P2.
  • the colonies of recombinant M. smegmatis displayed an intense blue color on dishes of M7H11 enriched in X-gal (FIG. 1A), revealing the expression of ethA under these conditions.
  • a pale blue color was observed for M. bovis BCG colonies (pBSh-P ethA - / acZ) (data not shown).
  • the two recombinant strains were then co-transformed with pMV261-e ⁇ f / ⁇ R, a compatible multicopy plasmid comprising ethR (Baulard et al., 2000).
  • the resulting colonies of M. smegmatis and M. bovis BCG were white on dishes enriched in X-gal, revealing that the presence of ethR repressed the expression of ethA.
  • Mycobacterium bovis BCG (pBSh-P ethA - / acZ) exhibited a significantly higher ⁇ -galactosidase activity (15.7 U) compared to BCG co-transformed with pBSh-PethA- / acZ and pMV261 -ethR (0.51 U) (FIG. 1B).
  • pBSh-P ethA - / acZ Mycobacterium bovis BCG
  • pBSh-PethA- / acZ exhibited a significantly higher ⁇ -galactosidase activity (15.7 U) compared to BCG co-transformed with pBSh-PethA- / acZ and pMV261 -ethR (0.51 U)
  • EthR In order to determine whether the repression of ethA by EthR occurs via a direct physical interaction between the promoter region of ethA (P e thA) and EthR, tests of modification of electrophoretic mobility (EMSA) were carried out on a DNA fragment. of 191 bp marked with [ 32 P] at its end, containing the ethA-R intergenic region, amplified by PCR from the chromosomal DNA of M. tuberculosis H37Rv. Complete and recombinant EthR was labeled with a histidine tag (His 6 -EthR), at its N-terminal end, in order to facilitate the purification of the enzyme using Ni 2+ -chelate affinity chromatography.
  • HSA electrophoretic mobility
  • Hise-EthR Since Hise-EthR has a calculated M r of 25,920 and 205 RU of DNA fragment (69 k Da) have been fixed on the surface of the Sensor Chip cell, the Hise-EthR: DNA ratio has been estimated using Equation 1 for each concentration of Hise-EthR. A stoichiometry of 8 molecules of .His 6 - EthR per DNA molecule was deduced. Interestingly, this stoichiometry was very quickly reached at a Hise-EthR concentration threshold ( Figure 4C). This experiment was repeated using a 62 bp biotinylated double stranded DNA fragment (Figure 4A; IG-62) overlapping the 55 bp region identified by the DNase I fingerprint experiments. An identical stoichiometry of 8 molecules of His 6 -EthR per DNA molecule was measured ( Figure 4D), confirming that all of the repressor molecules bind in the region protected by DNAse I.
  • EthR In order to determine whether EthR can dimerize in the absence of its target DNA, the bacterial double hybrid system (BACTH) was used (Karimova et al., 1998). In this system, the interaction of two proteins leads to functional complementation between the two domains of adenylate cyclase (CyaA) from Bordetella pertussis, leading to the synthesis of cAMP. As a soluble regulatory molecule, cAMP is then able to activate the transcription of dependent cAMP genes. ethR was thus cloned in phase with the region coding for the 25 kDa domain of CyaA, giving pT25-EthR.
  • BACTH bacterial double hybrid system
  • ethR was then fused with the region coding for the 18 kDa domain of CyaA so as to produce pT18-EthR.
  • a strain of E. coli cyclase-deficient (DHP1) (Karimova et al., 1998), was transformed with different combinations of plasmids ( Figure 7). When they were co-transformed with pT25-EthR and pT18-EthR, the colonies regained their capacity to grow on minimum medium enriched in maltose.
  • E. coli BL21 (DE3) was transformed and the recombinant clones were selected on LB containing 100 ⁇ g / ml of ampicillin. Five ml of LB containing 100 mg / ml of ampicillin were inoculated with E.coli BL21 (DE3) (pET15b-His 6 EthR) and cultured with stirring at 37 ° C overnight.
  • the preculture was used to inoculate 2 liters of LB medium in a D0 6 oo of 0.1.
  • DO ⁇ oo 0.6-0.7
  • the expression of ethR was induced by adding 1 mM IPTG.
  • the bacteria were recovered by centrifugation at 7,500 rpm, with a Sorval RC 5B PLUS centrifuge, rotor SS-34. The bacterial pellet was then frozen at -20 ° C.
  • the pellet was resuspended in 10 ml of buffer A (50 mM Tris, pH 7.5, 10 mM imidazole, 250 mM NaCl) and then lysed by passage through the French press (Bioritech) under a pressure of 6.2 ⁇ 10 6 Pa.
  • the lysate was centrifuged for 30 minutes at 4 ° C at 18,000 rpm in a Sorvall RC-5B PLUS centrifuge, SLA-3000 rotor and the supernatant recovered.
  • affinity resin chelating Sepharose Fast Flow - Amersham Biosciences
  • Nickel by adding 5 volumes of NiS0 4 100mM.
  • the resin was washed with 5 volumes of double-distilled water and equilibrated with 5 volumes of buffer A.
  • the resin was loaded on a disposable column.
  • the bacterial lysis supernatant was loaded onto the affinity column at a flow rate of 2 ml / min using a P-3 peristaltic pump (Pharmacia Biosciences).
  • the column was washed with 10 volumes of 50 mM Tris pH 7.5 buffer; 50 mM imidazole; 250 mM NaCI.
  • the His 6 -EthR protein was eluted with 1.5 volumes of elution buffer (50 mM Tris pH 7.5; 250 mM imidazole; 250 mM NaCI). The recovered fractions were analyzed on a 12.5% SDS-PAGE gel. The fractions with sufficient purity were pooled and dialyzed twice in 10 mM Tris pH 7.5; 200 mM NaCl, at 4 ° C. The solution was then concentrated on a Centriplus YM-3 column (Amicon), then with Macrosep 3K (Pall), in order to reach a final concentration of 50 mg / ml of protein.
  • elution buffer 50 mM Tris pH 7.5; 250 mM imidazole; 250 mM NaCI.
  • the recovered fractions were analyzed on a 12.5% SDS-PAGE gel. The fractions with sufficient purity were pooled and dialyzed twice in 10 mM Tris pH 7.5; 200 mM NaCl, at 4 °
  • Crystallization was carried out at 20 ° C, by the method of the drop suspended in vapor diffusion (2 ⁇ l of protein solution, 2 ⁇ l of precipitant solution and 0.75 ml of reservoir). His ⁇ -EthR crystals were obtained in 7-10 days with solution 15 of Cryokit for protein crystallization (Sigma) (0.17 M ammonium sulfate; 0.085 M Na-cacodylate pH 6.5; 15% glycerol; 25.5% PEG8000). These crystals are called form 2 in the remainder of the protocol.
  • the lysate was centrifuged at 18,000 rpm, 30 minutes, at 4 ° C, with a Sorvall RC-SB PLUS centrifuge, rotor SS-34.
  • the supernatant was loaded using a P-3 peristaltic pump (Amersham Biosciences) onto 25 ml of affinity resin (Chelating Sepharose Fast Flow- Amersham Biosciences) pre-balanced with 5 volumes of lysis buffer.
  • the Hise-EthR protein was eluted with 1.5 volumes of elution buffer (50 mM Tris pH 7.5, 250 mM imidazole, 250 mM NaCl).
  • the recovered fractions were supplemented with 10 mM of Dithiothreitol (DTT), 0.2 mM of ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), then analyzed by 12.5% SDS-PAGE gel stained with Coomassie blue.
  • the pure fractions were combined and dialyzed twice against 10 mM Tris, pH 7.5, 200 mM NaCl, 10 mM DTT and 0.2 mM EDTA. The solution was then concentrated as described above to reach a spectral concentration of 10 mg / ml, then stored at -80 ° C.
  • Co-crystallization tests were carried out using the protein HiS 6 - EthR / met-sel in the presence of 5 different DNA fragments 15 bp long and covering the zone of binding of the protein to the operator of ethA (see section I above).
  • the protein was thawed on ice and concentrated to 50 mg / ml.
  • the protein-DNA ratio was fixed at 2: 1.
  • the mixture was subjected to co-crystallization by the method of drops suspended in vapor diffusion (1 ⁇ l of protein solution, 1 ⁇ l of DNA solution, 2 ⁇ l of crystallizing agents, 0.75 ml of reservoir), at a temperature of 20 ° C.
  • Crystals were obtained after 2 to 3 days of incubation, for the His 6 -EthR / met-sel / DNA fragment 1 mixture (SEQ ID No. 27) with a crystallization solution containing 0.17 M sulfate d ammonium (Fluka), 0.085 M Na-cacodylate pH 6.5 (Sigma), 15% glycerol (ICN) and 35% PEG8000 (Fluka). These crystals are called form 3 in the remainder of the protocol.
  • crystals of form 1 were used to determine the crystallographic structure.
  • the diffraction data were acquired on the BM14 beamline at the European synchrotron in Grenoble (ESRF).
  • ESRF European synchrotron in Grenoble
  • a crystal of form 1 was frozen using an Oxford brand cryogenics system.
  • the diffraction data were measured by a CCD detector, of the Marresearch brand, 133 mm in diameter, positioned 150 mm from the crystal. Diffraction patterns have been recorded for a crystal oscillation of 1 °.
  • the exposure time per exposure was set to 20 seconds. 360 images were measured at the wavelength of 0.97865A.
  • the orientation matrix of the crystal in the X-ray beam was determined with the XDS software.
  • the diffraction data were integrated and reduced with the same software.
  • the crystals obtained belong to the space group P2-
  • Each monomer (amino acids 22 to 215) is entirely helical and comprises 9 helices (respectively ⁇ 1 to ⁇ 9 and 1 'to ⁇ 9', see Figure 8).
  • the crystal revealed the presence of one ligand molecule per monomer, embedded in a tunnel formed by the helices ⁇ 4, ⁇ 5, ⁇ 6, al, ⁇ 8 and ⁇ 8 '(from the second monomer).
  • the centers of the HTH (“helix-turn-helix”) domains for attachment to the DNA of this structure are 52 A.
  • the determination of the phases associated with each structural factor was determined by the “SAD” method (“ Single Wavelength Anomalous Diffraction ”).
  • This method is based on the use of the abnormal signal of selenium incorporated into the protein via selenomethionines (see preparation of form 1 crystals).
  • This signal is maximum at the wavelength used (0.97865 A), wavelength selected on the basis of an analysis of fluorescence emission by the crystals.
  • the position of the selenium atoms in the asymmetric unit of the crystal was determined with the Shelxd software. These positions have been refined and the initial phases calculated with Sharp software. The phases were then improved by electronic density modification procedures implemented in Solomon and Dm software, from the CCP4 software suite.
  • the molecular model was initially built with the software Arp / Warp and the TURBO-FRODO software. The final structure was obtained by energy minimization (refinement procedure) with the CNS software and manually inspected with the TURBO-FRODO software.
  • the parameters describing the topology of the EthR ligand were obtained with the HIC-UP software.
  • the crystals of form 2 are similar to the crystals of form 1. These, however, were obtained with non-seleniated recombinant protein.
  • the crystallization conditions are identical, but the source of the crystallization solutions is different.
  • the diffraction data were acquired at the Lille Institute of Biology, using equipment from the macromolecular crystallography laboratory. The procedure for acquiring data and determining the structure was as follows. A crystal of form 2 was frozen using an Oxford brand cryogenics system. The diffraction data were measured by an Imaging Plate detector, of the Marresearch brand, of 345 mm in diameter, positioned at 250 mm from the crystal. Diffraction patterns were recorded for a crystal oscillation of 1 °. The exposure time per exposure was set to 120 seconds.
  • the orientation matrix of the crystal in the X-ray beam was determined with the XDS software.
  • the diffraction data were integrated and reduced with the same software.
  • the phases associated with each structure factor were determined by isomorphic positioning of the molecular model of HiS ⁇ -EthR / met-sel (obtained from type 1 crystals).
  • the final structure was obtained by energy minimization (refinement procedure) with the CNS software and manually inspected with the TURBO-FRODO software.
  • the parameters describing the topology of the EthR ligand were obtained with the HIC-UP software.
  • the crystals of form 3 belong to the space group P4 ⁇ 2-
  • the diffraction data were acquired at the Lille Institute of Biology, using equipment from the macromolecular crystallography laboratory. The procedure for acquiring data and determining the structure was as follows.
  • a crystal of form 3 was frozen using an Oxford brand cryogenics system.
  • the diffraction data were measured by an Imaging Plate detector, of the Marresearch brand, of 345 mm in diameter, positioned at 250 mm from the crystal. Diffraction patterns were recorded for a crystal oscillation of 1 °. The exposure time per exposure was set to 600 seconds. 100 images were measured at the wavelength of 1.5418 A.
  • the orientation matrix of the crystal in the X-ray beam was determined with the XDS software.
  • the diffraction data were integrated and reduced with the same software.
  • the determination of the phases associated with each structure factor was carried out by the molecular replacement method (implemented in the AMoRe software) using as a model the structure of EthR obtained from type 1 crystals.
  • the final structure was obtained by energy minimization (refinement procedure) with CNS software and manually inspected with TURBO-FRODO software.
  • the parameters describing the topology of the EthR ligand were obtained with the HIC-UP software.
  • the crystals of form 3 contain only one monomer per asymmetric unit, confirming the strict symmetry of order two in the homodimer of EthR in the presence of a lipophilic inducer.
  • TetR is the transcriptional repressor of TetA, the protein responsible for resistance to tetracycline in gram negative bacteria. The repression function of TetR is inhibited by tetracycline, which attaches symmetrically to each monomer on the TetR homodimer.
  • QacR is the transcriptional repressor of QacA, the protein responsible in Staphylococcus aureus for resistance to many antiseptics and disinfectants.
  • QacR and TetR are homodimers, of different topology although they are both composed only of ⁇ helices.
  • EthR like TetR and QacR, is a homodimer.
  • Each monomer has a topology similar to that of QacR and consists of 9 ⁇ helices.
  • the three N terminal helices of each monomer make up the HTH type DNA binding motif ( ⁇ 2, ⁇ 3), stabilized by ⁇ 1 ( Figure 8).
  • the other 6 ⁇ helices make up the ligand binding domain as well as the dimerization zone ( Figure 9).
  • the dimerization pattern consists of the helices ⁇ 8 and ⁇ 9 (with ⁇ 'and ⁇ 9') in EthR, just like in QacR.
  • the dimerization covers an area of 1562 A 2 per monomer of EthR, a contact area comparable to that observed for QacR (1530 A 2 ).
  • the ligand binding domains of QacR and EthR are similar, they exhibit weak sequence homology, which is reflected by the different relative orientations of the helices forming these domains (overall RMSD of the main 2 A chains for ⁇ 4 helices to ⁇ 9).
  • the ⁇ 4, ⁇ 7 and ⁇ 9 helices are oriented similarly in QacR and EthR, while the ⁇ 5, ⁇ and ⁇ helices have more divergent axial orientations, causing displacements of up to 5 A between the topologically equivalent residues.
  • connection is used interchangeably.
  • the conformational changes resulting from the binding of ligands to QacR have been described.
  • the binding of ligands causes changes in conformation which result in a relative reorientation of the two HTH domains within the dimer. This reorientation produces a separation of the HTH motifs so that they can no longer bind in the major groove of the target DNA molecule.
  • the binding of ligands to QacR produces a turn-helix transition which extends the ⁇ 5 helix. This movement has repercussions on the surrounding propellers. Note that only one ligand molecule binds per QacR dimer, resulting in an asymmetric dimer.
  • the monomer on which the ligand binds undergoes the most drastic conformational change (elongation of the ⁇ 5 helix, and repercussion on the adjacent helices).
  • the binding of a ligand in a monomer affects to a lesser extent the conformation of the second monomer of the repressor, the signal propagating via the dimerization zone.
  • these conformation modifications cause an increase in the “center to center” distance of the recognition helices of the two HTH ⁇ 3- ⁇ 3 'motifs in QacR dimers from 37 A (free form or linked to DNA) to 4 ⁇ A (liganded or induced form in the presence of ligands).
  • EthR This induced form of EthR with its lipophilic ligand reveals structural characteristics similar to those observed in the structure of QacR in the induced form.
  • the ⁇ 5 helix of EthR has a length similar to the ⁇ 5 helix of QacR in the ligand-binding monomer.
  • EthR fixes a ligand per monomer, symmetrically, unlike QacR which fixes only one ligand per dimer.
  • the binding of the ligand causes a turn-helix transition of the residues T ⁇ 9 to Y93, only at the level of the subunit linked to the ligand, so that the C-terminal end of ⁇ 5, but not of ⁇ 5 ′, is extended by a tower.
  • Y92 and Y93 are therefore capable of interacting with the ligand.
  • the turn-helix transition is essential not only for ligand binding, but also for induction, since the formation of the extra turn in the ⁇ 5 helix results in repositioning of ⁇ and the DNA binding domain which is attached to him.
  • the movement of ⁇ 6 causes the translation and rotation of the DNA binding domain which releases QacR from its operator site.
  • the length of the ⁇ 5 helix, an imprint in the induction of QacR is comparable in EthR and QacR linked to their ligand, which suggests similar induction mechanisms.
  • both the ⁇ 5 and ⁇ 5 'helices undergo the putative HT-helix transition and displacement of the HTH motif, which results in a more open conformation of the recognition propellers separated by 52 A.
  • This induction mechanism differs from that of TetR, which binds to 2 ligands per dimer and uses an induction mechanism, involving several movements "through helix", in which the binding of tetracycline increases the distance center to center DNA recognition helices of only 3 A (Orth et al., 2000). Furthermore, the ligand binding domain of EthR is unique and does not present a molecular analogy with that of QacR. The ligand binding site in EthR crosses the domain defined by the ⁇ 4 to ⁇ 9 helices.
  • this pocket consists of residues belonging to all the helices of the ligand binding domain of EthR.
  • the only apparent portal of entry into the ligand binding site is formed by the divergence of the ⁇ 6, ⁇ 7 and ⁇ 8 helices.
  • one end of the ligand is almost parallel to ⁇ 6 (C1 to C6 in the HeOc ligand molecule described below), near the surface of the protein. Then, it winds around the Trp13 ⁇ residue (C7 to C15) and sinks into the ligand binding domain, parallel to the axes of the ⁇ 4, ⁇ 5 and ⁇ 7 helices.
  • the structure indicates that the C1 to C15 region of HeOc is divided into 4 segments with different curvatures (C1 to C6; C6 to C9; C9 to C12 and C12 to C15), and which bypass the aromatic cycle of the W133 residue (Figure 11 ).
  • HeOc adopts a buried stretched conformation from position C15 to its end C24, over approximately 12 A.
  • the HeOc ligand essentially adopts a stretched conformation, over a distance of 21 A between carbons C1 and C24, with a coiled region (C1 to C15) then a linear carbon chain (C15 to C24).
  • the ligand binding pocket is defined by the following EthR residues (see Figure 11, in the direction C1 to C24): R128, V134, G124, L76, Q125, F187, F184, T121, W138, F114, L183, E180 , M142, N179, N176, W145, F110, W207, T149, 1107, L ⁇ 7, V152, Y148, G106, W103 and M102.
  • the binding cavity of the region C15 to C24 is rich in hydrophobic (M142, 1107, L ⁇ 7, V152, M102) and aromatic amino acids (W145, F110, W207, Y14 ⁇ , W103). It also contains 2 asparagines, both located opposite the He17 C17 and C13 carbons ( Figure 11). A water molecule is also buried via a hydrogen bridge with the N179 residue near the C17 carbon of the ligand. 4 aromatic residues play a particularly important role in the curvature of segments C6 to C15: F114, F110, W13 ⁇ and W145. W133 is crucial for delineating the ligand binding domain. It is stabilized by the interactions of its side chain NE1 with OE1 of the residue E160. E1 ⁇ 0 is very stabilized, since it also interacts with NE of the residue R1 ⁇ 1 belonging to the other monomer present in the dimer of EthR, near the axis of double symmetry.
  • the structures of the QacR repressor linked to various cytotoxic ligands revealed the presence of 2 separate but potentially overlapping binding sites within from a single pocket. These 2 binding sites are practically parallel to ⁇ of QacR and end in ⁇ 5 which closes the cavity.
  • the comparison of the binding sites of QacR and EthR revealed that the 2 ligand binding domains have the same ligand entry portal. HeOc partially overlaps site 1 of QacR, adjacent to the ligand gateway. However, site 2 of QacR is not found in the HeOc-EthR complex due to the different orientations of the ⁇ 5 and ⁇ helices which narrow the binding cavity of EthR.
  • EthR has a second cavity, not observed in QacR, which extends over approximately 15 A, parallel to ⁇ 4 and ⁇ 7 ( Figure 12).
  • Site 2 is delimited from site 1 of EthR by the positions W13 ⁇ and E1 ⁇ 0.
  • This second binding site in EthR is not completely occupied by HeOc since it also contains a molecule of water buried near the C17 position of HeOc.
  • the linking cavities not occupied by the various ligands also contain water molecules.
  • A- Materials and methods In order to characterize the ligand, 750 ng of co-crystal of EthR-ligand were washed using the crystallization buffer, transferred individually into chloroform in order to denature the proteins and to extract therefrom the ligand. Analysis of the extraction chloroform by GC / MS made it possible to identify hexadecyl octanoate (HeOc) as a major product present in the solution. The structure of HeOc was then superimposed on the X-ray analysis spectrum of the crystal and was found to be compatible with the electron density corresponding to the ligand.
  • HeOc hexadecyl octanoate
  • the stearate molecule acts as a "filler" rather than a true ligand, since a small percentage of bag occupancy and a partially disordered conformation have been observed, and, moreover, that no activating effect or antagonist on the activity of ROR ⁇ has been detected.
  • EthR the homodimer of EthR systematically co-crystallizes with HeOc according to a stoichiometry of 2: 2, with total occupation and a well defined electron density, which indicates an essential role of HeOc in the stabilization of the induced conformation. of EthR.
  • EthA is a Baeyer-Villiger type monooxygenase, capable of converting a wide range of ketones, including long chain ketones, into their corresponding esters (Fraaije et al., 2004). Given the regulation of the ethA gene by the EthR repressor, it appears that substrates of EthA could serve as ligands for the EthR repressor.
  • M. smegmatis me 2 155 was grown in 250 ml Erlenmeyer flasks containing 100 ml Sauton medium. The cells were incubated at 37 ° C with shaking for 2 days. During this experiment, the synergy between ETH and a given ketone was determined to be the ability of this ketone to promote the bacteriotoxicity of ETH at a concentration below the minimum inhibitory concentration (15 ⁇ g / ml) .
  • ketones The phenotypic effect of ketones was evaluated by depositing serial dilutions of the culture on LB medium containing a low concentration of ETH (5 ⁇ g / ml), 1 mM of ketones (benzylacetone, 2-octanone, 3-octanone or 2- decanone), or a combination of ETH (5 ⁇ g / ml) and ketones (1 mM). The appearance and the number of colonies for each deposit were analyzed after three days of growth at 37 ° C.
  • hexadecyl octanoate is a compound too hydrophobic to be used in combination with a biologically compatible solvent.
  • EthA has recently been described as being capable of converting a wide range of ketones, including long chain alkanones and aromatic ketones, to their corresponding esters, suggesting a possible role for this activator in acid metabolism mycolic (Fraaije et al., 2004).
  • the capacity of EthR to bind to a long hydrophobic ester such as hexadecyl octanoate is compatible with this hypothesis and proves the link between the regulation of the ethA gene and the activity of the monoA oxygenasease EthA.
  • benzylacetone (BA) showed a significant bacteriostatic effect when it was co-administered with a low dose of ETH (5 ⁇ g / ml). No antimycobacterial effect of benzylacetone was observed in the absence of ETH, which therefore demonstrates the strict synergy of this compound with ETH (see Figure 15). Strong inhibitors of EthR could therefore lead to a drastic reduction in the therapeutic dose of ETH required in therapy and, consequently, reduce the toxicity associated with the treatment of tuberculosis with ETH and related drugs.
  • EthA is also involved in the activation of other thioamides, such as thioacetazone and isoxyl (De Barber et al., 2000).
  • Mycobacterium leprae is also sensitive to ETH and derivatives such as prothionamide, but is not sensitive to clinically significant levels of INH, due to multiple lesions in the katG gene of this organism. This is why INH cannot be used to treat leprosy.
  • ETH and derivatives such as prothionamide
  • INH cannot be used to treat leprosy.
  • ethR and ethA are conserved in the reduced genome of M. leprae, the development of EthR ligands that inhibit its repressor activity, as drug additives to ETH and its derivatives, could therefore allow improve chemotherapy for leprosy.

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Abstract

La présente invention concerne des procédés de sélection de composés capables de se lier au répresseur mycobactérien EthR, cette liaison l’empêchant de réprimer l’expression du gène mycobactérien ethA codant EthA, le bio-activateur de l’éthionamide. L’invention a également pour objets les composés inhibiteurs du répresseur EthR, ainsi que leurs applications thérapeutiques.

Description

LIGANDS DU REPRESSEUR MYCOBACTERIEN EthR, PROCEDES DE SELECTION ET APPLICATIONS
La présente invention se rapporte au domaine de la recherche de nouveaux médicaments pour le traitement des infections mycobactériennes, notamment la tuberculose et la lèpre. Plus précisément, l'invention concerne des procédés de sélection de composés capables de se lier au répresseur mycobactérien EthR, cette liaison l'empêchant de réprimer l'expression du gène mycobactérien ethA codant un activateur de l'éthionamide (ETH). La présente invention s'intéresse également aux composés ainsi sélectionnés, ainsi qu'à leurs applications pour la prophylaxie et/ou le traitement des infections mycobactériennes. L'on estime à l'heure actuelle qu'environ 7 à 8 millions de personnes contractent la tuberculose chaque année. Environ 50 millions de personnes sont actuellement infectées par des souches de
Mycobactθ um tuberculosis multi-résistantes aux antibiotiques. De telles souches sont en particulier résistantes à la fois à l'isoniazide (INH) et à la rifampicine (RIF), les deux antibiotiques de première ligne (i.e., dont l'indice thérapeutique, représentant le rapport dose toxique / dose thérapeutiquerest-élevé)-utilisés-pouriraiterla-tuberculose (Espinal e 'a/:,
2001 ). Ces patients sont donc soumis à un traitement à l'aide de composés de seconde ligne (i.e., dont l'indice thérapeutique est plus faible), moins actifs, plus chers et ou plus toxiques ( ahmoudi et Iseman, 1993). L'antibiotique de seconde ligne ethionamide (2-éthyl- thioisonicotinamide, ETH, Trescatyl) est utilisé en clinique depuis plus de 35 ans. Il est associé à des troubles gastro-intestinaux et une hépatotoxicité importants. Sa prescription est dès lors limitée essentiellement au traitement de patients qui rechutent du fait de souches de M. tuberculosis résistantes aux antibiotiques de première ligne, ou au traitement de patients présentant une lèpre lépromateuse, en remplacement de la clofazimine (Jenner et Smith, 1987). L'ETH est un analogue structural de l'INH. ETH et INH sont des prodrogues qui doivent être converties en composés actifs par des enzymes mycobactériennes spécifiques (Baulard et a , 2000). Ces deux antibiotiques inhibent la biosynthèse des acides mycoliques, constituants essentiels de la paroi mycobactérienne. Ils ont tous deux pour cible l'enzyme énoyl-AcpM réductase (InhA). Cependant, le mécanisme d'action de ces deux antibiotiques suivent des voies métaboliques différentes : l'INH est activée par la catalase peroxydase KatG, alors que l'activation de l'ETH est dépendante de l'enzyme EthA. Dès lors 95% des souches résistantes à l'INH restent sensibles à l'ETH. Une autre différence majeure entre ces deux antibiotiques résident dans leur concentration minimale inhibitrice respective (CMI). Afin d'assurer des concentrations d'ETH dans les fluides corporels en excès par rapport à la CMI in vitro (2,5 μg/ml), il est recommandé d'utiliser des dosages quotidiens de 10 mg/kg (Johnston et al., 1967), soit 5 fois plus que le dosage recommandé pour l'INH. Récemment, les gènes ethA et ethR impliqués dans l'activation de la prodrogue ETH ont été identifiés (Baulard et al. 2000, DeBarber et a , 2000). EthA est une enzyme contenant du FAD qui catalyse en deux étapes l'activation de l'ETH (Vannelli et al. 2002). L'expression d'ethA est placée sous le contrôle du gène adjacent ethR, dans la mesure où la surexpression d'ethR conduit à une résistance à l'ETH et où l'inactivation chromosomique d'ethR est associée à une hypersensibilité à l'ETH, révélant par là-même que toutes les molécules d'ETH ne sont pas activées in vitro chez les mycobactéries de type sauvage. La présente invention vise à fournir des moyens qui permettent une activation plus efficace de l'ETH par les mycobactéries. Ainsi, grâce aux moyens selon l'invention, il est désormais possible d'optimiser l'efficacité thérapeutique de l'ETH en réduisant les dosages à administrer aux patients et, partant, en réduisant les effets secondaires liés à l'administration de cet antibiotique selon les protocoles actuels. Selon un premier aspect, la présente invention fournit des procédés de sélection de composés qui agissent comme ligands du répresseur EthR, et qui, lorsqu'ils sont liés audit répresseur, empêchent ce dernier de réprimer l'expression du gène ethA.. Dans ce qui suit, ces composés seront également appelés « inhibiteurs du répresseur EthR ». Dans le cadre de l'invention, l'on entend par « sélection d'un composé » le fait que l'on choisit de retenir et d'utiliser ce composé parce qu'il présente la propriété d'intérêt recherchée : c'est un inhibiteur du répresseur EthR, autrement dit en l'espèce, comme indiqué ci-dessous, il présente la capacité, en se fixant au répresseur EthR, d'empêcher ce dernier de réprimer l'expression du gène ethA. Les formules « composé qui agit comme ligand du répresseur EthR » ou « ligand du répresseur EthR » sont équivalentes et désignent un « composé capable de se lier au répresseur EthR ». Dans la mesure où le composé en question bloque l'activité du répresseur EthR en l'empêchant de réprimer l'expression du gène ethA, ce composé sera également, et de manière équivalente aux formules précédentes, appelé « inhibiteur du répresseur EthR » ou « inhibiteur de EthR ». Dans le présent contexte, un « composé » peut être n'importe quel type de molécule, biologique ou chimique, naturelle, recombinante ou synthétique. Par exemple, un composé peut être un acide nucléique (e.g., un oligonucléotide sens ou antisens tel qu'un ARN antisens), une protéine, un acide gras, un anticorps, un polysaccharide, un stéroïde, une purine, une pyrimidine, une molécule organique, un radical chimique, etc.. Le terme « composé » couvre également les fragments, dérivés, analogues structurels ou combinaisons de ceux-ci, dès lors qu'ils possèdent la capacité, en se fixant au répresseur EthR, d'empêcher ce dernier de réprimer l'expression du gène ethA. Cette capacité représente la propriété d'intérêt que doivent -présenter les composés sélectionnés par la mise en œuvre des procédés objets de la présente invention. L'on entend ici par « réprimer », le fait de diminuer, réduire, décroître, réguler négativement, inhiber, bloquer, prévenir, empêcher. A contrario, l'on doit comprendre par « activer », le fait d'augmenter, accroître, réguler positivement, promouvoir, améliorer, stimuler. Selon un premier mode de réalisation, un procédé de sélection tel que visé par la présente invention comprend au moins (procédé A) : a) le clonage du gène codant ledit répresseur EthR sur un premier plasmide d'expression recombinant, et le clonage d'au moins la région promotrice et opératrice du gène ethA en amont d'un gène rapporteur sur un second plasmide d'expression recombinant ; b) la transformation d'une cellule hôte recombinante avec au moins les plasmides selon l'étape a) ; c) la culture de ladite cellule hôte recombinante en présence d'un composé candidat ; d) la mesure du niveau Ni d'expression du gène rapporteur en présence dudit composé candidat ; e) la comparaison du niveau Ni mesuré à l'étape d) avec le niveau No d'expression du gène rapporteur en l'absence dudit composé candidat ; et f) si Ni est significativement supérieur à No, la sélection du composé. Un deuxième mode de réalisation du procédé de sélection selon l'invention correspond au procédé décrit ci-dessus, dans lequel toutefois l'on utilise non pas deux plasmides d'expression recombinants (étapes a) et b)), mais_ un seul, sur lequel sont clones à la fois le gène codant le répresseur EthR et au moins la région promotrice et opératrice du gène ethA en amont d'un gène rapporteur. Ainsi, un tel procédé comprend au moins (procédé B) : a) le clonage du gène codant ledit répresseur EthR, et le clonage d'au moins la région promotrice et opératrice du gène ethA en amont d'un gène rapporteur, sur un plasmide d'expression recombinant ; b) la transformation d'une cellule hôte recombinante avec au moins le plasmide issu del'étape a) ; c) la culture de ladite cellule hôte recombinante en présence d'un composé candidat ; d) la mesure du niveau Ni d'expression du gène rapporteur en présence dudit composé candidat ; e) la comparaison du niveau Ni mesuré à l'étape d) avec le niveau N0 d'expression du gène rapporteur en l'absence dudit composé candidat ; et f) si Ni est significativement supérieur à No, la sélection du composé. Pour la mise en œuvre des étapes citées ci-dessus (clonage, transformation, culture, mesure de l'expression d'un gène rapporteur), l'homme du métier fera appel à des techniques conventionnelles (voir par exemple Sambrook et Russel, 2001). La région promotrice et opératrice du gène ethA à cloner aux fins de la mise en œuvre d'un procédé selon l'invention comprend au moins la séquence SEQ ID N°1 , qui correspond à la région promotrice et opératrice du gène ethA sur laquelle se fixent 4 molécules de répresseur (voir partie expérimentale infra). De préférence, cette région comprend au moins la séquence SEQ ID N°2, sur laquelle se fixent 8 molécules de EthR. De manière encore préférée, cette région comprend au moins la séquence SEQ ID N°3, laquelle correspond à la séquence intergénique ethA-R. Selon un mode de réalisation particulier, un plasmide d'expression recombinant contenant le gène ethR (codant EthR) est pMV261-ef/? :? (voir partie expérimentale ci-dessous). Selon un autre mode de réalisation particulier, un plasmide d'expression recombinant contenant au moins la région promotrice et opératrice du gène ethA en amont d'un gène rapporteur est pBSh-PethA - lacZ (voir partie expérimentale ci-dessous). Dans le plasmide pBSh-PethA - lacZ, le gène rapporteur est lacZ.
Bien évidemment, l'homme du métier peut mettre en oeuvre n'importe quel autre gène rapporteur connu dans le domaine de l'invention pour être utilisable chez les mycobactéries, notamment les gènes xylE, gfp, lux et le gène codant pour la protéine glucuronidase. Dans les procédés selon l'invention, ladite cellule hôte recombinante est une cellule mycobactérienne. Il s'agit de préférence d'une cellule de Mycobacterium bovis, M. smegmatis, M. tuberculosis ou M. leprae. En particulier, l'homme du métier peut choisir une cellule de M. bovis BCG 1173P2 (souche vaccinale accessible sur simple demande auprès de l'Organisation Mondiale de la Santé), ou de M. smegmatis mc2155 (Snapper et a , 1988 ; voir partie expérimentale ci- dessous). Selon un troisième mode de réalisation, un procédé de sélection conforme à la présente invention comprend au moins (procédé C) : a) la détermination du niveau Li de liaison du répresseur EthR sur au moins la région promotrice et opératrice du gène ethA, en présence d'un composé candidat ; b) la comparaison du niveau Li avec le niveau Lo de liaison du répresseur EthR sur au moins la région promotrice et opératrice du gène ethA, en l'absence dudit composé candidat ; et c) si Li est significativement inférieur à L0, la sélection du composé. En particulier, les niveaux de liaison L0 et U peuvent être déterminés à l'aide d'une méthode choisie parmi la résonance plasmonique de surface, la détection de la fluorescence naturelle et le transfert d'énergie par résonance de fluorescence (FRET pour
« Fluorescence résonance energy transfer ») par lequel l'homme du métier déterminera le transfert d'énergie entre EthR et là région promotrice et opératrice de ethA, en présence et en absence d'un ligand (Jia et al., 1996 ; Pyles et al., 1998 ; Hillisch et al., 2001 ; Engohang- Ndong ef a/., 2004). Selon un quatrième mode de réalisation, un procédé de sélection visé par la présente invention comprend au moins (procédé D) : a) la mise en présence du répresseur EthR et d'au moins deux composés candidats ; b) la cristallisation du mélange ainsi obtenu ; c) l'analyse de la structure du cristal issu de l'étape b) ; d) si cette analyse révèle que l'un desdits composés est lié audit répresseur EthR, la solubilisation dudit cristal ; e) l'élution et la sélection dudit composé. Les étapes d) de solubilisation du cristal et e) d'élution et sélection du composé font appel à des méthodes conventionnelles (voir par exemple la partie expérimentale infra), bien connues dans le domaine technique de l'invention. Selon un cinquième mode de réalisation, un procédé de sélection objet de la présente invention comprend au moins (procédé E) : a) la mise en présence du répresseur EthR et d'un composé candidat ; b) la cristallisation du mélange ainsi obtenu ; c) l'analyse de la structure du cristal issu de l'étape b) ; d) si cette analyse révèle que ledit composé est lié audit répresseur EthR, la sélection dudit composé (à partir du composé candidat de départ). Dans les deux modes de réalisation qui précèdent (procédés D et
E), les étapes de cristallisation (étape b)), d'analyse de la structure du cristal (étape c)) et, le cas échéant, celle du composé sélectionné (comme indiqué ci-dessous, on peut déterminer, dans le cadre d'une étape ultérieure supplémentaire, la structure du composé sélectionné) peuvent être réalisées, par exemple à l'aide des techniques décrites dans les exemples ci-après, ou par n'importe quelle autre méthode classique, connue de l'homme du métier. On notera qu'à l'issue des procédés de sélection selon l'invention décrits supra (procédés A, B, C, D et E), une étape de détermination de la structure du composé sélectionné peut être avantageusement mise en œuvre. En outre, les procédés de sélection selon l'invention décrits supra (procédés A, B, C, D et E) peuvent être mis en œuvre seuls ou en combinaison. Ainsi, par exemple, l'homme du métier pourra choisir un procédé de sélection selon l'un ou l'autre des cinq modes de réalisation susmentionnés. De préférence, l'un parmi les trois premiers modes de réalisation ci-dessus (procédé A, B ou C) sera alors mis en oeuvre. Alternativement, l'homme du métier pourra d'abord mettre en œuvre le quatrième ou cinquième mode de réalisation (procédé D ou E) afin de sélectionner un composé, puis l'un quelconque des trois premiers modes de réalisation (procédé A, B ou C) afin de confirmer que le composé ainsi sélectionné présente la capacité, en se fixant au répresseur EthR, d'empêcher ce dernier de réprimer l'expression du gène ethA. Ainsi, de préférence, le procédé selon le quatrième ou cinquième mode de réalisation (procédé D ou E) sera mis en œuvre préalablement à un procédé selon l'un quelconque des trois premiers modes de réalisation (procédé A, B ou C). Un deuxième aspect de la présente invention concerne un composé, tel que défini supra, inhibiteur du répresseur EthR, susceptible d'être obtenu par la mise en œuvre d'un procédé de sélection selon l'invention. Alternativement, un composé visé par l'invention est susceptible d'être obtenu par la mise en œuvre successive de plusieurs, de préférence deux, procédés de sélection différents parmi ceux décrits ci- dessus. Selon un mode de réalisation, un composé visé par la présente invention interagit avec les résidus F110 et F114 du répresseur EthR (voir partie expérimentale ci-dessous, paragraphe ll-E). De préférence, un tel composé interagit non seulement avec les résidus F110 et F114, mais également avec les résidus W138 et W145 de EthR. Selon un autre mode de réalisation, un composé objet de l'invention se fixe dans la poche de liaison du ligand du répresseur EthR, laquelle est définie par les résidus de EthR suivants : R128, V134, G124, L76, Q125, F187, F184, T121 , W138, F114, L183, E180, M142, N179, N176, W145, F110, W207, T149, 1107, L87, V152, Y148, G106, W103 et M102 (voir partie expérimentale ci-dessous, paragraphe ll-E). On notera que l'octanoate d'hexadécyle (Garcia-Rubio et al. ;
2002), ainsi que les composés décrits par Fraaije et al. (2004) sont déjà connus en tant que tels. Les composés connus sont exclus des composés faisant, en tant que tels, l'objet de la présente invention. Selon un troisième aspect, là présente invention fournit des moyens utiles dans le domaine de la prévention et/ou du traitement des maladies, notamment des infections bactériennes et, de préférence, des infections mycobactériennes telles que la tuberculose et la lèpre. Ainsi, l'invention a trait à un composé inhibiteur du répresseur EthR comme médicament, destiné eh particulier à prévenir et/ou traiter les infections bactériennes, de préférence mycobactériennes. En particulier, un tel composé pourra être obtenu par au moins un procédé de sélection décrit supra. En effet, dans la mesure où le mutant knockout ethR décrit dans
Baulard et al. (2000) présente un phénotype de ralentissement important de la croissance, EthR constitue à lui seul une cible thérapeutique. Un ligand de EthR est susceptible de donner lieu à un phénotype comparable à celui du mutant sus-cité. Eh tout état de cause, un ligand de EthR peut présenter des propriétés avantageusement bactériostatiques, voire bactéricides, contre les mycobactéries. Par exemple, outre les composés susceptibles d'être obtenus par au moins un procédé selon l'invention, le composé utilisé comme médicament peut être un analogue ou un dérivé du ligand co-cristallisé décrit dans la partie expérimentale ci-dessous (octanoate d'hexadécyle). Ce peut être également un analogue ou un dérivé de la benzylacétone (voir partie expérimentale infra). Au sens de la présente invention, un « analogue » est n'importe quelle version modifiée, pharmaceutiquement acceptable (notamment non toxique), d'un composé initial, ladite version modifiée pouvant être naturelle ou synthétique, dans laquelle un ou plusieurs atomes, tels que des atomes de carbone, d'hydrogène, d'oxygène, ou des hétéroatomes tels que l'azote, le soufre ou un halogène, ont été ajoutés ou supprimés de la structure du composé initial, de manière à obtenir un nouveau composé moléculaire pharmaceutiquement acceptable. Le terme « dérivé » désigne ici n'importe quel composé pharmaceutiquement acceptable qui présente une affinité pour le répresseur EthR, une ressemblance ou un motif structurel, en commun avec un composé de référence. Entrent également dans cette définition, d'une part les composés qui, seuls ou avec d'autres composés, peuvent être des précurseurs ou des produits intermédiaires dans la synthèse du composé de référence, moyennant une ou plusieurs réactions chimiques, et d'autre part les composés qui peuvent être formés à partir du composé de référence, seul ou avec d'autres composés, via une ou plusieurs réactions chimiques. En particulier, les cétones et les esters obtenus à partir d'un composé de référence sont compris dans la définition du terme « dérivé ». L'expression « pharmaceutiquement acceptable » désigne ici ce qui est apte et utile pour préparer une composition pharmaceutique ou un médicament, qui est généralement dépourvu de toxicité, notamment chez l'homme. Sont ainsi couverts par les définitions d' « analogues » et de « dérivés » ci-dessus au moins certains des composés pharmaceutiquement acceptables décrits par Fraaije et al. comme étant soit des substrats, soit des produits de l'activateur mycobactérien EthA (voir le Tableau I dans Fraaije et al. 2004 ; et voir le paragraphe lll-B de la partie expérimentale ci-dessous), et/ou leurs analogues et/ou dérivés pharmaceutiquement acceptables. Ainsi, selon un mode de réalisation particulier, un composé utile comme médicament visé par l'invention est choisi parmi les analogues et dérivés inhibiteurs de EthR et pharmaceutiquement acceptables de la 2- hexanone, la 2-heptanone, la 4-heptanone, la 2-octanone, la 3-octanone, la 2-décanone, la 2-dodécanone (Fraaije et al. 2004). L'invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant au moins, en tant que principe actif, un composé inhibiteur du répresseur EthR et utile comme médicament (c'est-à-dire notamment pharmaceutiquement acceptable), tel que décrit supra, en association avec au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable. L'homme du métier choisira un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables en fonction de la voie d'administration de la composition pharmaceutique. En outre, la forme du médicament ou de la composition pharmaceutique (par exemple, une solution, une suspension, une emulsion, des comprimés, des gélules, etc..) dépendra de la voie d'administration choisie. Ainsi, au sens de l'invention, un médicament ou une composition pharmaceutique peut être administré par n'importe quelle voie appropriée, par exemple la voie orale, locale, systémique, intraveineuse, intramusculaire ou mucosale, ou bien en utilisant un patch, ou encore sous une forme encapsulée dans, ou immobilisée sur, des liposomes, des microparticules, des microcapsules, et analogues. On peut notamment citer, à titre d'exemples non limitatifs d'excipients appropriés pour une administration par voie orale, le talc, le lactose, l'amidon et ses dérivés, la cellulose et ses dérivés, les polyéthylène-glycols, les polymères d'acide acrylique, la gélatine, le stéarate de magnésium, des matières grasses animales, végétales ou synthétiques, les dérivés de la paraffine, les glycols, les stabilisants, les conservateurs, les mouillants, les dispersants, les émulsionnants, les agents de pénétration, de solubilisation, etc.. Les techniques de formulation et d'administration des médicaments et compositions pharmaceutiques sont bien connues dans la technique ici considérée (l'homme du métier pourra notamment se référer à l'ouvrage « Remington's Pharmaceutical Sciences », dernière édition). La présente invention a également pour objet l'utilisation d'au moins un composé inhibiteur du répresseur EthR et utile comme médicament (c'est-à-dire notamment pharmaceutiquement acceptable), tel que décrit supra, pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention et/ou au traitement des infections bactériennes, de préférence mycobactériennes. En outre, l'invention concerne des produits contenant un composé inhibiteur du répresseur EthR et utile comme médicament (c'est-à-dire notamment pharmaceutiquement acceptable), conformément à l'invention, et soit l'ETH ou l'un de ses dérivés, soit un antibiotique activable par l'activateur mycobactérien EthA, comme produit de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps en thérapie antituberculeuse ou antilépreuse. Les figures suivantes sont fournies à titre purement illustratif et ne limitent en aucune façon la présente invention. Figure 1 : activité β-galactosidase chez les mycobactéries transformées. A : détection de l'activité β-galactosidase chez M. smegmatis transformé avec (a) pBSh-PethA-/acZ, (b) pBSh-PethA-/acZ + pMV261-e7?R, (c) pMV261-ef ?R, sur boîtes gélosées contenant du milieu LB enrichi en X- Gal. B : quantification de l'activité β-galactosidase chez M. bovis BCG transformé avec (a) pBSh-PethA-/acZ, (b) pBSh-PethA-/acZ + pMV261-e /?f?, (c) pMV261-ef ? Chaque valeur est une moyenne faite sur 3 répliques de cultures. Figure 2 : EMSA de la liaison de Hise-EthR à la région intergenique ethA- R.
La sonde marquée de 191 pb (100000 cpm) a été mélangée avec 0 μg (piste 1 ), 0,45 μg (piste 2), 0,90 μg (piste 3), 1 ,35 μg (piste 4), 1 ,8 μg (piste 5) et 3,6 μg (piste 6) His6-EthR en l'absence (A) ou en présence d'un excès de la région intergenique ethA-R non marquée utilisée comme compétiteur spécifique (B) ou encore en présence d'un excès d'ADN compétiteur non spécifique (C).
B et C : les EMSA ont été réalisés sans (piste 1 ) ou avec 0,9 μg (autres pistes) Hise-EthR purifié. Figure 3 : A et B : protection à la Dnase I de la région intergenique ethA-R par His6- EthR.
Les 2 sondes (A : fragment Hind\\\-Sph\ de 323 pb ; B : fragment Xho\- HindlW de 312 pb) ont été incubées sans (piste 1) ou avec différentes quantités de His6-EthR (A : piste 2 : 0,0625 μg ; piste 3 : 0,125 μg ; piste 4 : 0,25 μg ; piste 5 : 0,5 μg ; piste 6 : 1 μg ; B : piste 2 : 1 μg ; piste 3 : 2,5 μg ; piste 4 : 5 μg ; piste 5 : 7,5 μg ; piste 6 : 10 μg), avant traitement par la DNase I.
C : localisation de la région protégée par Hise-EthR contre la digestion par la DNase I. D : analyse d'extension d'amorce. La séquence du brin codant est montrée et le point +1 de transcription est souligné.
Figure 4 : affinité globale et stoechiométrie de l'interaction entre His6-EthR et Pet A mesurée par SPR. A : structure de la région intergenique ethA-R.
IG-37 comprend 2 répétitions directes imparfaites (flèches pleines) qui comprennent 2 répétitions indirectes imparfaites (bases en italique).
IG-36 comprend 2 répétitions indirectes imparfaites (flèches en pointillé).
B : sensorgrammes d'injections de 0,35 ; 0,70 ; 1 ,39 ; 3,47 et 8,6 μM Hisβ- EthR, en utilisant le fragment IG-106.
C : stoechiométrie de liaison en fonction de la concentration en Hise-EthR.
Sensorgrammes de 0,612 ; 1 ,25 ; 2,50 et 5 μM His6-EthR, en utilisant les fragments IG-62 (D), IG-37 (E) et IG-36 (F).
Figure 5 : représentation de Hill pour la liaison de His6-EthR sur la région intergenique ethA-R.
Figure 6 : chromatographie par filtration sur gel.
Profils d'élution d'un fragment PCR (0,108 nmole) chevauchant la région intergenique ethA-R en l'absence (A) ou en la présence de 0,385 nmole
(B), 1 ,920 nmole (C) et 3,850 nmole (D) de His6-EthR purifié. E : profil d'élution de 3,850 nmole de His6-EthR en l'absence d'ADN.
Axe des y : absorbances relatives (mAU pour unité de milliabsorbance) à
260 nm (pointillé) et 280 nm (trait plein).
Figure 7 : interaction in vivo entre les molécules EthR.
Boîtes gélosées contenant du milieu minimal, enrichi en maltose et X-Gal. Figures 8 et 9 : structure du ligand lié à l'homodimère de EthR, selon une vue respectivement perpendiculaire [figure 8 : structure du cristal du répresseur EthR du groupe d'espace P2-|2-ι2 (forme 1 )] ou le long (figure
9) de l'axe double du dimère.
EthR est constitué de 9 hélices : α1 (23-38), α2 (47-54), α3 (56-64), α4 (68-92), α5 (99-115), α6 (118-129), α7 (132-158), αδ (168-188) et α9
(192-212). Les molécules de HeOc occupent l'espace à travers tout le domaine de fixation du ligand. Les 2 hélices de reconnaissance α3 et α3' sont séparées par 52 A.
Figure 10 : superposition de la région centrale de liaison du ligand (hélices α4 à α9) de EthR et celle du répresseur QacR, équivalent d'un point de vue topologique, sous la forme induite.
Les résidus 89 à 93 de QacR subissent, comme illustré, une transition tour-hélice (TTH) dans l'hélice α5 suite à la liaison du ligand, cette transition n'étant pas observée dans la structure du répresseur non lié. Cette transition est également présente dans EthR. Les motifs HTH, bien que relativement bien conservés d'un point de vue structurel entre les deux répresseurs (RMSD de 1 A pour ces régions isolées) ne se superposent pas du fait des orientations relatives différentes de leur domaine de liaison du ligand respectif. Figure 11 : reconnaissance du ligand par EthR.
Seuls les résidus dont les atomes se situent dans une sphère de 5Â autour du ligand sont indiqués.
Une molécule d'eau est enfouie via un pont hydrogène formé avec le résidu N179. La reconnaissance du ligand implique des résidus des 6 hélices qui forment le domaine de liaison du ligand.
Figure 12 : superposition de la région centrale de liaison du ligand (hélices α4 à α9) de EthR en complexe avec l'octanoate d'hexadécyle et celle de QacR en complexe avec le déqualinium. F110 joue apparemment un rôle important dans l'induction de EthR, par analogie avec celui joué par la région Y92 de QacR. La structure de QacR met en évidence la poche de liaison comprenant plusieurs sites. Bien que les deux répresseurs présentent le même portail d'entrée du ligand et possèdent des sites de liaison adjacents partiellement chevauchants, ils sont particulièrement divergents en ce qui concerne les cavités de liaison dans leur globalité. Le ligand de EthR est profondément enfoui, essentiellement dans la région centrale hydrophobe du domaine de liaison du ligand, dans une cavité qui est située parallèlement aux axes des hélices α4 et α7. En revanche, la poche de liaison à plusieurs sites de QacR se trouve pratiquement parallèle à α6. Le déplacement de α5 dans EthR par rapport à celui de QacR ferme cette cavité dans EthR. Figure 13 : carte de la densité d'électrons, effectuée à un niveau de 1 ,5 σ, calculée en excluant l'octanoate d'hexadécyle (HeOc) du modèle. Figure 14 : identification du ligand de EthR par GC-MS après extraction organique. Chromatogramme (temps de rétention 21.00 min à 27.00 min) de la fraction organique des cristaux de EthR (A). Spectre d'ionisation d'électrons (El) du pic GC à 22.16 min (B). En utilisant comme données d'entrée les masses mesurées à partir du spectre GC-MS pour cribler une banque interne GC-MS, le ligand a été identifié comme étant un octanoate d'hexadécyle. Spectre de référence El de l'octanoate d'hexadécyle (C). Il présente un pic moléculaire d'ions M+ à m/z= 368 et des pics d'ions caractéristiques à m/z = 43, 57, 111 , 127, 145, 269. Le pic GC à 24.17 min correspond à l'octanoate d'hexadécyle. Le pic GC à 25.99 min correspond à des contaminants non spécifiques (phtalates).
Figure 15 : Effet synergique de la benzylacétone et de l'ETH sur la croissance de M. smegmatis. L'effet synergique a été testé en déposant 4μL de dilutions en série (A : 10'2 ; B : 10"3 ; C : 10-4 ; D : 10'5) d'une culture en phase de croissance de M. smegmatis me2 155 sur des boîtes de milieu LB ne contenant pas d'antibiotiques, ou contenant 5μg/mL de ETH seul (ETH), 1 mM de benzylacétone seule (BA), ou une combinaison des deux composés (ETH + BA).
La partie expérimentale ci-après, appuyée par des exemples et références aux figures, vise à illustrer, sans limiter, la présente invention. PARTIE EXPERIMENTALE
I- EthR réprime l'expression de ethA en se liant directement sur la région promotrice et opératrice de ethA :
A. Matériels et méthodes :
A.1. Souches bactériennes et conditions de croissance
Toutes les souches ont été cultivées en aérobiose à 37°C. Toutes les étapes de clonage ont été réalisées chez E. coli XL1- Blue (Stratagène).
Les souches de E. coli ont été cultivées en milieu Luria-Bertani (LB) (Life
Technologies) en présence ou non de 1 ,5% d'agar (Difco).
Les souches mycobactériennes ont été cultivées en milieu Sauton (Sauton
1912) enrichi avec 0,001 % ZnS04 et 0,25% Triton WR1339 (Sigma) ou sur agar M7H11 enrichi avec 10% de mélange catalase-dextrose- albumine-acide oléique (Becton Dickinson). Mycobacterium smegmatis et
M. bovis BCG 1173P2 ont été transformées comme décrit précédemment
(Wards et Collins, 1996).
Les cultures à grande échelle de mycobactéries ont été amenées en milieu de phase exponentielle (36 h pour M. smegmatis mc2155 ; 11 à 16 jours pour M. bovis BCG).
Le cas échéant, les antibiotiques (Sigma) ont été ajoutés au milieu aux concentrations suivantes : kanamycine à 20 μg/ml, ampicilline à 100 μg/ml, hygromycine à 50 μg/ml, streptomycine à 20 μg/ml et gentamicine à 15 μg/ml.
Après croissance, les bactéries ont été récoltées, lavées avec du tampon phosphate PBS et stockées à - 20 °C.
A.2. Plasmides et manipulations d'ADN Toutes les manipulations d'ADN ont . été réalisées en utilisant des protocoles classiques, tels que décrits par Sambrook et Russell (2001 ). Le système « Fast-link™ DNA ligation » (Epicentre Technologies) a été utilisé pour les ligatures. a) Construction de pBSh -lacZ Le fragment Bam λ\-Bgl\\ de 3,678 kb, contenant le cadre ouvert de lecture (ORF) codant la β-galactosidase, a été isolé de pQEGM (Antoine et al., 2000) et inséré dans pBSh-D (Picardeau et al., 2000) avant d'être digéré par SamHI. b) Construction de oBSH-PethA-lacZ
La région promotrice Pet A a été amplifiée par PCR en utilisant les amorces 0-161 : 5'-CCAGCGGACGGTCCTCTAGAAGGTTC-3' (SEQ ID N°4), 0-162 : 5'-GTGAGATCTCATGGATCCACGCTATCAAGGTAA-3' (SEQ ID N°5). Le produit PCR a été inséré dans pCR2.1Topo (Invitrogen) pour donner pCR2.PethA (2 + 4). Le plasmide a été redigéré par Xba\ et BglU et le fragment de 191 pb contenant PethA a été inséré dans pBSh- lacZ, préalablement digéré par Xba\ et SamHI pour donner pBSh-PethA- lacZ.
c) Plasmides pour le test double hybride bactérien
La région codant EthR a été amplifiée par PCR en utilisant les amorces O- 243 : 5'-CTGCAGTGACCACCTCCGCGGCCAG-3' (SEQ ID N°6) et O- 244 : 5'-GGTACCTTATCTGTTCTCGCCGTAA-3' (SEQ ID N°7). La séquence amplifiée a été clivée par Pst\ et /4sp718, et insérée dans pT25 digéré par Psfl-,4sp718 (Karimova et al., 1998), pour donner pT25-EthR. Alternativement, la même région chromosomique a été amplifiée par PCR en utilisant les amorces O-240 : 5'-
GGTACCGACTACTTCCGCAGCCAGTCA-3' (SEQ ID N°8) et 0-242 : 5'- AAGCTTTCGCCGTAAATGCTGGTCA-3' (SEQ ID N°9), clivée par Hind\\\ et Asp718, et insérée dans pT18 (Karimova et a , 1998) préalablement digéré par les mêmes enzymes pour donner pT18-EthR. Une souche de E. coli cyclase-déficiente (DHP1 ) (Karimova et al., 1998) a été co- transformée avec ces deux plasmides. La capacité des clones résultants à fermenter le maltose a été déterminée à 30°C sur des boîtes de milieu minimum M9 solide fraîchement préparé, contenant 1 % de maltose comme unique source de carbone et 40 μg/ml de 5-bromo-4-chloro-3- indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal, Promega).
A.3. Tests Beta-galactosïdase
Les activités β-galactosidase des souches recombinantes de M. smegmatis et M. bovis BCG ont été détectées sur des boîtes d'agar M7H11 enrichi avec 100 μg/ml de X-gal. Les activités β-galactosidase ont été quantifiées en cultures liquides, en utilisant une méthode adaptée de Miller (1972). Brièvement, les cellules mycobactériennes ont été cultivées en milieu Sauton (50 ml) jusqu'à une densité optique (DO) à 600 nm de 0,6. Les cellules ont ensuite été récoltées par centrifugation (4000 g, 15 min, 4°C), et les culots ont été lavés, puis resuspendus dans 1 ml de PBS. Après sonication des suspensions bactériennes, des aliquots des lysats ont été incubés avec de l'orthonitrophényl-β-D-galactoside (ONPG, Sigma) à 30°C. La réaction enzymatique a été suivie par spectrophotométrie à une absorbance de 420 nm (A 2onm), et la vitesse initiale a été calculée en utilisant la proportion linéaire de la courbe cinétique. L'Activité β- galactosidase Spécifique (AS) a été déterminée comme suit : AS = (ΔA 2onm min"1) / (DOβoonm I de culture). Des échantillons en triple exemplaire ont été mesurés pour chaque clone bactérien. Afin d'évaluer l'influence potentielle de l'ETH sur l'activité du répresseur EthR, M. smegmatis co-transforφé avec pBSh-PethA-/acZ et pM261-ef/7f? a été cultivé jusqu'à une DOβoonm de 0,3.
Des concentrations variables de ETH (0-10-20-40 μg/ml) ont ensuite été ajoutées à la culture (en double), et les activités β-galactosidase ont été mesurées toutes les 10 min pendant une heure. A.4. Production et purification de His6-EthR L'ADN codant EthR a été amplifié par PCR en utilisant l'ADN chromosomique de M. tuberculosis H37Rv comme matrice et les 5. oligonucléotides 0-183 : 5'-CATATGACCACCTCCGCGGCCAGT-3' (SEQ ID N°10) et 0-184 : 5'-GGATCCGAGCACCCCCGACCGAGT-3' (SEQ ID N°11 ) comme amorces. Le produit PCR a été inséré dans pCR2.1 Topo de manière à former pCR2Λ-ethR. La séquence du fragment codant EthR a été déterminée sur les deux brins et, ensuite, isolée à partir de pCR2.1-0 ethR par digestion avec Nde\ et BamHI, puis insérée dans pET-15b (Novagen), pour donner pET-15b-e#7R. Ce plasmide code une protéine EthR portant une étiquette amino terminale ayant la séquence suivante : MGSSH6SSGLVPRGSHM (SEQ ID N°12). Ce plasmide a été introduit dans E. coli BL21(DE3). E. coli BL21(DE3)(pET-15b-etf?R) a été cultivé en5 milieu LB (120 ml) jusqu'à une DOeoonm de 0,6-0,7. De l'isopropylthiogalactoside (IPTG) a ensuite été ajouté à une concentration finale de 1 mM, et la culture a été maintenue pendant 3 heures de plus. Les cellules ont été récoltées par centrifugation à 12 000 g à 4°C, resuspendues dans 10 ml de tampon de lyse (50 mM NaH2P04,0 300 mM NaCI, pH 7,5, 10 mM imidazole) et lysées par deux passages à travers une presse de French à 6,2 x 106Pa. Après centrifugation (20 000 g, 25 min, 4°C), le surnageant a été récupéré, et His6-EthR a été séparé du lysat de cellules totales par chromatographie sur colonne d'agarose Ni-NTA (Qiagen). Après un lavage extensif avec du tampon de5 lyse, Hise-EthR a été élue de la résine par 100 mM imidazole dans du tampon de lyse, puis dialyse sur la nuit contre du tampon de lyse. Environ 900 μg/ml de protéines purifiées ont été obtenus comme déterminé à l'aide du système « Bio-Rad protein assay ». La pureté des protéines a été déterminée par coloration au Bleu de Coomassie après0 électrophorèse SDS-PAGE sur un gel de polyacrylamide à 12%. La protéine purifiée a été stockée dans 10% de glycérol à -20°C, puis dialysée avant usage.
A.5. Mesure de l'interférence de la mobilité électrophorétique (EMSA pour « Electrophoretic mobility shift assays »)
Le fragment PCR de 191 pb obtenu en utilisant les oligonucléotides 0-161 et 0-162 et contenant la région promotrice de ethA a été purifié par électrophorèse sur gel d'agarose et marqué avec 10 μCi de [γ-32P]ATP (3000 Ci/mmol ; Amersham Biosciences) en utilisant la T4 polynucléotide kinase (10 unités, Invitrogen). Le fragment radio-marqué ([32P]-PethA) a été purifié en utilisant une colonne MicroSpin G-25 (Amersham, Biosciences). [32P]-PethA (100 000 coups par minutes ; cpm) a été incubé pendant 10 min à température ambiante avec des quantités variables de HiSβ-EthR dans un volume réactionnel de 20 μl contenant 1 μg de poly-(dl-dC) (Amersham Biosciences) et 2 mM Tris-HCI (pH 8,0), 0,4 mM MgCI2, 5 mM KCI, 0,2 mM DTT, 10% de glycérol et 0,01 % de détergent non-ionique P40 (Igepal CA-630, Sigma).
Après incubation, le mélange a été chargé sur un gel de polyacrylamide à 10% non dénaturant et soumis à une électrophorèse. Le gel a ensuite été séché sous vide et exposé toute la nuit à un film radiographique Biomax (Kodak).
Les tests de compétition ont été réalisés comme décrit (Tang et al., 2001 ). Du Pet A non marqué et la cassette de résistance à la streptomycine de pHP45Ω non marquée (Frey et Krisch, 1985) (en excès molaire de 0 à 1000 fois) ont été respectivement pré-incubés comme ADN compétiteurs spécifiques et non spécifiques avec Hise-EthR pendant 10 min à température ambiante, suivi de l'addition de sondes marquées et l'incubation pendant 10 min à température ambiante. Les complexes protéines-ADN résultants ont été soumis à une électrophorèse et à une auto-radiographie comme décrit ci-dessus. A.6. Filtration sur gel
Un fragment d'ADN de 94 pb chevauchant PethA a été amplifié par PCR en utilisant l'ADN chromosomique de M. tuberculosis H37Rv comme matrice et O-270 : 5'-CGGTCATGGATCCACGCTATCAAC-3' (SEQ ID N°13) et O- 272 : 5'-GGAGGTGGTCACCCTGGCAGC-3' (SEQ ID N°14) comme amorces. Des quantités variables de His6-EthR ont été mélangées avec 6,7 μg (0,108 mmoles) de produits PCR dans du tampon A (50 mM NaH2P04, pH 7,5 ; 250 mM NaCI) et filtrées sur une colonne Superdex 200 HR 10/30 reliée à un système AKTA FPLC (Amersham Biosciences) à un débit de 0,3 ml par minute. Les concentrations relatives de protéines et d'ADN dans l'éluent ont été suivies en mesurant l'absorbance à 280 nm et 260 nm. La masse moléculaire apparente de Hise-EthR en l'absence d'ADN a été estimée en utilisant la courbe standard Ve/V0 contre le log des masses moléculaires des protéines standards (ribonucléase A, 13,7 kDa chymotrypsinogène A, 25 kDa ; ovalbumine, 45 kDa ; albumine, 66 kDa aldolase, 158 kDa ; catalase, 232 kDa ; apoferritine, 440 kDa thyroglobuline, 669 kDa ; standards de taille moléculaire pour filtration sur gel de protéine ; Amersham Biosciences). Vo est le volume mort et Ve est le volume d'élution.
A.7. Test de liaison par résonance plasmonique de surface (SPR) L'appareil BIAcore 2000' (BIAcore'AB, Uppsala, Suède) a été utilisé pour des analyses en temps réels des interactions moléculaires entre Hise-EthR et la région promotrice de ethA. 4 fragments d'ADN ont été obtenus par PCR en utilisant l'ADN chromosomique de M. tuberculosis H37Rv comme matrice. Un fragment de 106 pb (figure 4A ; IG-106) chevauchant la région intergenique ethA-R a été obtenu en utilisant O-270 : 5'-CGGTCATGGATCCACGCTATCAAC- 3' (SEQ ID N°13) et 0-271 : 5'-biotine-CTGACTGGCCGCGGAGGTGGT- 3' (SEQ ID N°15). Un fragment d'ADN de 62 pb (IG-62) chevauchant une région de 55 pb identifiée par des expériences d'empreintes à la DNase I a été amplifié en utilisant 0-248 : 5'-biotine-GATCCACGCTATCAACGTA-3' (SEQ ID N°16) et O-250 : 5'-CTACGTGTCGATAGTGTCG-3' (SEQ ID N°17). Un fragment de 37 pb chevauchant 2 répétitions directes a été amplifié en utilisant 0-255 : 5'-ATCAACGTAATGTCGAG-3' (SEQ ID N°18) et 0-256 : 5'-GTCGACATCTCGTTGACG-3' (SEQ ID N°19), puis clone dans pCR2.1Topo. Un fragment d'ADN biotinylé de 104 pb (IG-37) a ensuite été obtenu par PCR en utilisant 0-255 et 5'-biotine- AATTGGGCCCTCTAGATGCAT-3' (SEQ ID N°20).
Finalement, un fragment de 36 pb chevauchant 2 répétitions inversées a été amplifié en utilisant 0-253 : 5'-GTAATGTCGAGGCCGTCAA-3' (SEQ ID N°21 ) et 0-254 : 5'-ATAGTGTCGACATCTCGTT-3' (SED ID N°22), puis clone dans pCR2.1Topo. Un fragment d'ADN biotinylé de 103 pb (IG-36) a ensuite été obtenu par PCR en utilisant 0-253 et 5'-biotine-AATTGGGCCCTCTAGATGCAT-3' (SEQ ID N°23).
Les fragments biotinylés amplifiés ont été purifiés sur colonne Quiaquick (Qiagen), puis leur séquence a été déterminée avant immobilisation sur une cellule couplée à la streptavidine CM5 Sensor Chip en utilisant le protocole standard fourni avec le système « Aminé Coupling » (BIAcore'). Brièvement, la streptavidine a été injectée à 500 ng/μl dans 10 mM d'acétate de sodium (pH 3,5) pendant 12 minutes à un débit de 10 μl/min. L'ADN biotinylé (environ 69 kDa pour le fragment de 106 pb) a été injecté à travers chaque cellule à 200 ng/ml pour obtenir une fixation stable de la streptavidine de 205 unités de résonance (RU). L'intégrité et la quantité d'ADN fixé ont été contrôlées par injection durant 120 secondes de 1 ,6 μM d'histone H1 de veau (Sigma) à 10 μl/min. La liaison de His6-EthR à l'ADN a été effectuée à 25°C dans .0,05 M NaH2P04 (pH 7,15), 0,25 M NaCI, 0,002 M MgCI2, 0,05 M KCI et 0,001 M DTT à un débit de 20 μl/min. His6-EthR a été injecté aux concentrations désirées dans du tampon de circulation jusqu'à ce que l'équilibre soit atteint.
Les cellules Sensor Chip ont été régénérées par une injection de 60 secondes de SDS à 0,03%. Les courbes finales ont été obtenues par soustraction du signal correspondant à une cellule fonctionnalisée avec un fragment d'ADN double brin non pertinent de 100 pb (fragment -276 à - 176 du promoteur de la stroméIysine-1 humaine). Le rapport molaire entre Hise-EthR (25,9 kDa) et l'ADN immobilisé ont été déterminés selon l'équation 1 suivante : n = (α RU Hise-EthR / β RUADN) X (MrADN/MrHis6-EthR) dans laquelle n est la stoechiométrie du complexe, RU est la réponse mesurée (en unités) obtenue à la saturation de liaison, et Mr est le poids moléculaire, α = 1 pg de protéines liées par RU/mm2 and β = 0,73 pg d'ADN lié par RU/mm2. Ces facteurs proviennent de la différence d'indice de réfraction molaire entre ADN et protéines, ce qui se traduit par un comportement plasmonique différent (PharmaciaBiosensor, 1994 ; Speck et al., 1999). Afin de déterminer le coefficient de Hill et le Ko global de l'interaction, une deuxième cellule Sensor Chip contenant le même produit PCR biotinylé a été créée de manière à obtenir une fixation de l'ADN sur la streptavidine équivalente à 100 RU. His6-EthR a été injecté comme décrit précédemment selon des concentrations croissantes allant de 100 nM à 2 μM de manière à obtenir l'équilibre de liaison. Pour chaque concentration, le signal à l'équilibre, noté Req, a été mesuré. La saturation fractionnaire, θ = Req/Rmax, a été calculée. Rmax représente le maximum de capacité de liaison de Hise-EthR estimé à 225 RU dans cette expérience. La portion linéaire (de θ = 0,2 à θ = 0,8) de la représentation de Hill, représentant le log (Θ/1-Θ) en fonction du log [His6-EthR], a été ajustée par approximation linéaire de l'équation de Hill, log (Θ/1-Θ) = KH + ΠH [Hise-EthR]. KH et ΠH représentent respectivement la constante de Hill et le coefficient de Hill. Pour la demi saturation (θ = 0,5), l'équation de Hill est égale à 0, la constante de dissociation globale à l'équilibre (Ko) est donnée par la relation Ko = io kH/nH. La même procédure et les mêmes calculs ont été adaptés et appliqués aux fragments IG-62, IG-37 et IG-36.
A.8. Analyse d'extension d'amorces
L'ARN total a été isolé à partir de M. bovis BCG 1173P2 comme décrit précédemment (Mangan et al., 1997). L'ADN contaminant a été éliminé de la préparation d'ARN en utilisant la DNase I (DNA-free™ kit, Ambiom). Cinq pmoles d'amorce 0-273 : 5'-GCTCTTGGTCGGGCAACGGTCCTG- 3' (SEQ ID N°24) ont été marquées à l'extrémité 5' en utilisant du [γ- 32P]ATP comme décrit précédemment.
10 μg d'ARN totaux ont été mélangés avec 2 pmoles d'amorce marquée et un mélange de dNTP (25 nmole pour chaque nucléotide) dans un volume final de 12 μl. Après hybridation pendant 5 min à 70°C, les mélanges ont été rapidement refroidis dans de la glace, et 4 μl de First- Strand-Buffer [50 mM Tris-HCI, pH 8,3 ; 75 mM KCI et 3 mM MgCI2, 10 mM DTT, DnaseOut (40 U ; Invitrogen)] ont été ajoutés. Le mélange de réaction a ensuite été incubé à 37°C pendant 2 min avant l'addition de 200 unités de M-MLV RT (Reverse transcriptase du virus de la leucémie murine de Moloney ; Invitrogen). La réaction d'extension a été conduite à 37°C pendant 50 min, puis l'enzyme a été inactivée à 70°C pendant 15 min. Une réaction de séquençage en utilisant la terminaison de chaîne au didéoxy avec l'amorce 0-273 a été menée en parallèle et chargée sur un gel de séquence contenant 8 M d'urée et 6% de polyacrylamide, concomitamment aux produits d'extension d'amorce, de manière à déterminer la position du point de départ de la transcription.
A.9. Empreinte à la DNase I : Des expériences de protection à la DNase I ont été réalisées essentiellement comme décrit précédemment (Reisenauer et al., 1999 ; Bellefontaine et al., 2002). Un fragment Hind\\\-Sph\ de 323 pb et un fragment Xho\-Hind\\\ de 312 pb chevauchant PethA ont été isolés de pCR2.1-PethA (2 + 4) (voir paragraphe A.2 ci-dessus). Le premier fragment a été marqué à son extrémité au niveau du site HindWl en utilisant seulement 50 μCi [α-32P]dATP (3000 Ci/mmol ; Amersham Biosciences) et 5 μl de fragment de Klenow (Invitrogen). Le fragment Xho\-Hind\\\ a été marqué à son extrémité au niveau du site Xho\ en utilisant le même protocole. Les fragments d'ADN marqués (10 000 cpm) ont été incubés avec Hisβ- EthR purifié. De la DNase I diluée (0,025 U, Roche) a été ajoutée à chaque mélange réactionnel pendant 3 min à température ambiante, puis la réaction a été stoppée avec 100 μl de solution stop (200 mM NaCI, 20 mM EDTA et 10% de SDS). Les produits de digestion à la DNAse I ont été extraits au phénol, précipités à l'éthanol et séparés sur un gel contenant 8 M d'urée et 6% de polyacrylamide. Un étalon de sequençage généré avec l'amorce universelle et M13mp18 comme matrice a été utilisé pour identifier la position de la région protégée.
B. Résultats :
B.1. Répression de EthA par EthR
Il a été démontré précédemment que la surexpression de ethR entraînait une résistance accrue à l'ETH chez les mycobactéries, tandis qu'une inactivation par mutation de ethR augmentait la sensibilité à l'ETH (Baulard et al ., 2000), ce qui suggère que EthR régule de manière négative la production de EthA, la mono-oxygénase putative requise pour l'activation de l'ETH.
Afin de confirmer cette hypothèse, la région promotrice de ethA a été insérée en amont du gène rapporteur lacZ dans pBSh-D, un plasmide navette E. co//-mycobacterie qui se réplique sous la forme d'une simple copie dans les mycobactéries (Picardeau et al., 2000). Le plasmide résultant, appelé pBSh-PethA-/acZ a été électrotransformé dans M. smegmatis mc2155 et M. bovis BCG 1173P2.
Les colonies de M. smegmatis recombinant présentaient une couleur bleue intense sur des boîtes de M7H11 enrichi en X-gal (Figure 1A), révélant l'expression de ethA dans ces conditions. Une couleur bleu pâle a été observée pour les colonies de M. bovis BCG (pBSh-PethA-/acZ) (données non montrées). Les deux souches recombinantes ont ensuite été co-transformées avec pMV261-eιf/ιR, un plasmide multicopie compatible comprenant ethR (Baulard et al., 2000). Les colonies de M. smegmatis et M. bovis BCG résultantes étaient blanches sur boîtes enrichies en X-gal, révélant que la présence de ethR réprimait l'expression de ethA.
De manière à confirmer le phénotype de M. bovis BCG, l'activité β- galactosidase a été quantifiée chez les souches recombinantes : Mycobacterium bovis BCG (pBSh-PethA-/acZ) présentait une activité β- galactosidase significativement supérieure (15,7 U) par rapport à BCG co- transformé avec pBSh-PethA-/acZ et pMV261 -ethR (0,51 U) (Figure 1 B). Ainsi, la surexpression de ethR chez M. smegmatis et chez BCG a conduit à une forte inhibition de l'expression de ethA. Ces résultats confirment l'hypothèse selon laquelle EthR régule de manière négative l'expression de ethA. Par analogie avec la capacité de la tétracycline à inhiber la liaison de TetR sur son opérateur, l'influence de l'ETH sur l'activité du répresseur EthR a été évaluée. Mycobacterium smegmatis co-transformé avec pBSh-PethA-/acZ et pMV261-ef/?R a été cultivé en présence de concentrations variables d'ETH, et les activités β-galactosidase ont été mesurées. Les activités β-galactosidase n'ont pas semblé être influencées par un traitement à l'ETH (données non montrées), indiquant que l'ETH n'entrave pas la capacité de EthR à réprimer ethA, même à haute concentration. B.2. Liaison de EthR à Pet A démontrée par des tests de modification de la mobilité électrophorétique
Afin de déterminer si la répression de ethA par EthR intervient via une interaction physique directe entre la région promotrice de ethA (PethA) et EthR, des tests de modification de la mobilité électrophorétique (EMSA) ont été réalisés sur un fragment d'ADN de 191 pb marqué au [32P] à son extrémité, contenant la région intergenique ethA-R, amplifié par PCR à partir de l'ADN chromosomique de M. tuberculosis H37Rv. EthR complet et recombinant a été marqué par une étiquette histidine (His6-EthR), à son extrémité N-terminale, afin de faciliter la purification de l'enzyme en utilisant la chromatographie d'affinité Ni2+-chélate. Comme montré sur la figure 2A, l'ajout de quantités croissantes de His6-EthR purifié au fragment d'ADN marqué au [32P] entraînait le retard de la migration du fragment sur des gels de polyacrylamide natifs, révélant que EthR est capable de se fixer sur le région intergenique ethA-R. Des compétiteurs d'ADN spécifiques et non spécifiques ont été utilisés pour déterminer la spécificité de liaison de HiS6-EthR à la région promotrice de ethA (Figures 2 B et 2C). La réapparition d'une sonde libre a été observée lorsqu'un compétiteur spécifique (sonde non marquée) était ajouté en excès de 500 à 1000 fois au mélange contenant la sonde marquée et His6-EthR, tandis que la même quantité de compétiteur non spécifique (voir Matériels et Méthodes, partie A supra) ne modifiait pas l'interaction entre Hise-EthR et la sonde marquée.
B.3. Détermination des sites de liaison de EthR
Afin de localiser précisément l'opérateur de ethA, des expériences d'empreintes à la DNase I ont été réalisées sur les deux brins de l'ADN. Deux fragments, un fragment Hind\\\-Sph\ de 323 pb et un fragment XΛol- HindWl, contenant la région intergenique ethA-R ont été marqués à leurs extrémités sur les brins opposés. Pour les deux fragments, Hise-EthR purifié était capable de protéger la même région de 55 pb après digestion modérée à la DNase I (Figures 3A et 3B). Cette région se situe de 5 nucléotides en amont du codon d'initiation d'ethA à 16 nucléotides en amont du codon d'initiation d'ethR, couvrant ainsi 55 pb au-delà de la région intergenique de 75 pb (Figure 3C). Ainsi, EthR se lie à une région d'ADN inhabituelllement longue, suggérant qu'il interagit avec son opérateur sous la forme d'un multimère fonctionnel. De manière intéressante, les expériences de protection à la DNase I réalisées avec soit de faibles (Figure 3A) soit de fortes (Figure 3B) concentrations de His6-EthR ont donné lieu à des empreintes équivalentes, suggérant une association coopérative de la protéine à l'opérateur.
B.4. Identification du point d'initiation de la transcription du gène ethA
Afin de comprendre les mécanismes de répression d'ethA par EthR, le point +1 de transcription d'ethA a été identifié en utilisant une analyse par extension d'amorces. Lorsque l'ARN total préparé à partir de M. bovis BCG 1173P2 a été soumis à une analyse d'extension d'amorces, un produit unique a été identifié, commençant au nucléotide A localisé 13 bases en amont du codon d'initiation de la traduction de ethA (Figure 3D). Ce résultat indique que le point d'initiation de la transcription d'efM et les sites de reconnaissance de l'ARN polymérase chevauchent l'opérateur de ethA (Figure 3C).
Lorsque la séquence en amont du point d'initiation de la transcription d'efM a été comparée avec d'autres séquences promotrices mycobactériennes, aucune boîte conservée -10 ou -35 putative n'a pu être identifiée (Figure 3C). Le promoteur d'efM ne ressemble pas au consensus de σ70 de E. coli et donc devrait être classé dans le groupe C des promoteurs régulés proposés par Gomez et Smith (2000).
B.5. Stoechiométrie de l'interaction entre His6-EthR et la région intergenique ethA-R Un fragment d'ADN double brin biotinylé de 106 pb (Figure 4A ; IG-106) chevauchant la région intergenique ethA-R a été utilisé comme ligand pour mesurer la stoechiométrie de liaison de Hisβ-ËthR par résonance plasmonique de surface (SPR). Des concentrations croissantes de His6-EthR ont été injectées sur une cellule Sensor Chip fonctionnalisée par 205 RU de fragment d'ADN biotinylé jusqu'à saturation du ligand à l'équilibre (Figure 4B). Etant donné que Hise-EthR a un Mr calculé de 25 920 et que 205 RU de fragment d'ADN (69 k Da) ont été fixées sur la surface de la cellule Sensor Chip, le rapport Hise-EthR : ADN a été estimé à l'aide de l'équation 1 pour chaque concentration de Hise-EthR. Une stoechiométrie de 8 molécules de .His6- EthR par molécule d'ADN a été déduite. De manière intéressante, cette stoechiométrie était très rapidement atteinte à un seuil de concentration de Hise-EthR (Figure 4C). Cette expérience a été répétée en utilisant un fragment d'ADN double brin biotinylé de 62 pb (Figure 4A ; IG-62) chevauchant la région de 55 pb identifiée par les expériences d'empreinte à la DNase I. Une stoechiométrie identique de 8 molécules de His6-EthR par molécule d'ADN a été mesurée (Figure 4D), confirmant que toutes les molécules de répresseur se lient dans la région protégée par la DNAse I.
En supposant qu'un homo-octamère a de grandes chances de présenter une certaine symétrie de liaison, le centre de la région protégée par la DNase I (le G en position 32 de la région intergenique ethA-R) semble scinder deux copies d'une longue répétition directe (7-C-A-4-C-G-t/a-a/g- A-T-G-T-C-G-A ; SEQ ID N°25 et 26) qui comprend elle-même des répétitions inversées imparfaites (bases en italique, Figure 4A). Lorsqu'un fragment de 37 pb (Figure 4A, IG-37) chevauchant ces deux, répétitions, directes était fixé sur la surface de la cellule Sensor chip, une liaison coopérative d'en moyenne 4,5 molécules de Hise-EthR par molécule d'ADN a été observée (Figure 4E). Lorsqu'un fragment PCR de 36 pb (Figure 4A ; IG-36) chevauchant les deux répétitions inversées pratiquement parfaites (T-A-a/g-T-G-T-C-G-A) centrées sur la base 34 était utilisé, la liaison de His6-EthR était fortement réduite (Figure 4F).
β. 6. Détermination du coefficient de Hill (n») et du Ko de l'interaction entre Hise-EthR et la région intergenique ethA-R Afin d'évaluer l'affinité de Hise-EthR pour la région intergenique ethA-R, des analyses de l'interaction à l'équilibre ont été effectuées. 100 RU du fragment d'ADN biotinylé de 106 pb mentionné ci-dessus (IG-106) ont été immobilisées sur une cellule Sensor Chip. Cette faible quantité d'ADN immobilisé a permis à la protéine d'atteindre un équilibre de liaison pour une plus large plage de concentrations de protéines (de 0,1 à 2 μM) dans le volume maximal d'injection possible pour l'appareil BIAcore 2000'. Dans ces conditions, la capacité de la cellule Sensor Chip a été estimée à Rmaχ = 225 RU, ce qui correspond à la même stoechiométrie de 8 molécules His6-EthR que celle déduite des analyses SPR précédentes (voir paragraphe B.5). La saturation fractionnaire de l'ADN à l'équilibre Req/Rmax (où Req est la valeur de RU mesurée à l'équilibre) a été déterminée pour chaque concentration de protéines. La fonction de Hill (Fersht, 1985), a été reportée comme une fonction du log de [His6-EthR] (Figure 5). L'analyse de la partie linéaire de la fonction de Hill (de 0,2 à 0,8) par régression linéaire (R2 = 0,9904) a fourni une constante de liaison globale à l'équilibre (KD) de 146 nM et un coefficient de Hill (ΠH) de 3,46. La valeur de KD représente une valeur moyenne pour les 8 sites de liaison. La valeur théorique maximale du coefficient de Hill est 8 et correspond au nombre de sites de liaison de His6-EthR. La valeur du coefficient de Hill de 3,46, supérieure à 1 , indique une liaison coopérative de HiSβ-EthR sur la sonde d'ADN (Fersht, 1985). B.7. Nécessité de la présence de l'opérateur pour l'octomérisation de His6-EthR
Les expériences de SPR décrites ci-dessus (voir paragraphe B.5) ont indiqué que EthR se lie de manière coopérative sous la forme d'un homo- octamère à l'opérateur d'ethA.
Afin de déterminer si la multimérisation de EthR nécessite la présence de cette cible d'ADN, Hise-EthR a été soumis à une chromatographie analytique d'exclusion de taille sur une colonne Superdex 200 HR 10/30 en présence d'un fragment PCR de 94 pb contenant la région intergenique ethA-R (voir matériels et méthodes, partie A supra).
Le fragment d'ADN de 94 pb éluait sous la forme d'un pic simple avec une absorbance maximale à 260 nm à un volume d'élution (Ve) de 11 ,11 ml (Figure 6A). L'ajout de faibles quantités de His6-EthR purifié au fragment d'ADN de 94 pb a entraîné l'élution d'un pic simple avec une absorbance maximale à 260 nm à un Ve de 10,27 ml (Figure 6 B). Comme ces résultats ont été obtenus dans les mêmes conditions salines que celles utilisées pour les analyses SPR, le volume d'élution décroissant de l'ADN en présence de Hise-EthR correspond très certainement à une augmentation de la masse moléculaire du complexe d'ADN de 94 pb du fait de la liaison de l'octamère proteique au site opérateur. L'ajout de concentrations croissantes de His6-EthR au fragment d'ADN a conduit à l'apparition progressive d'un pic additionnel éluant 15,30 ml après la charge, avec une absorbance maximale à 280 nm (Figures 6C et 6D). Ce pic correspond à une molécule qui présente un rayon de Stokes pratiquement équivalent à celui du standard de masse moléculaire chymotrypsinogène A (25 000 Da) (Amersham Biosciences). Ces données ont été confirmées en déterminant le volume d'élution de Hise-EthR en l'absence de fragment d'ADN (Figure 6E), et suggèrent fortement que, dans des conditions in vitro qui permettent à Hise-EthR de se lier à son opérateur, le répresseur non lié n'adopte pas une grosse forme multimérique, mais plutôt une forme monomérique. Cependant, étant donné que la chromatographie d'exclusion de taille est fondée sur le rayon de Stokes plutôt que sur la masse moléculaire per se, le fait queΗis6-EthR se dimérise en solution en l'absence de son site opérateur ne peut être exclu.
B.8. Oligomérisation de EthR in vivo
Afin de déterminer si EthR peut se dimériser en l'absence de son ADN cible, le système double hybride bactérien (BACTH) a été utilisé (Karimova et al., 1998). Dans ce système, l'interaction de deux protéines entraîne une complémentation fonctionnelle entre les deux domaines de l'adénylate cyclase (CyaA) de Bordetella pertussis, conduisant à la synthèse d'AMPc. En tant que molécule de régulation soluble, AMPc est ensuite capable d'activer la transcription de gènes AMPc dépendants. ethR a ainsi été clone en phase avec la région codant le domaine de 25 kDa de CyaA, donnant pT25-EthR. ethR a ensuite été fusionné avec la région codant le domaine de 18 kDa de CyaA de manière à produire pT18-EthR. Une souche de E. coli cyclase-déficiente (DHP1) (Karimova et al., 1998), a été transformée avec des combinaisons différentes de plasmides (Figure 7). Lorsqu'elles étaient co-transformées avec pT25- EthR et pT18-EthR, les colonies retrouvaient leur capacité à pousser sur milieu minimum enrichi en maltose. Aucun des clones obtenus par la co- transformation des divers plasmides contrôles n'était capable de pousser, démontrant que la complémentation fonctionnelle de T25-EthR et T18- EthR était spécifiquement liée à l'interaction de deux molécules de EthR (Figure 7). Puisqu'aucun ADN homologue à l'opérateur de EthR n'a été détecté dans le génome de E. coli, ce résultat suggère que EthR est un dimère lorsqu'il n'est pas lié à son opérateur. II- Purification et cristallisation du répresseur Hise-EthR :
A. Préparation de la protéine Hisg-EthR
L'entièreté de l'ORF codant le répresseur EthR de M. tuberculosis a été sous-cloné dans le vecteur d'expression pET15b (Novagen) afin de permettre la production de la protéine fusionnée à un tag-Histidineβ amino- terminal. E. coli BL21 (DE3) a été transformé et les clones recombinants ont été sélectionnés sur LB contenant 100 μg/ml d'ampicilline. Cinq ml de LB contenant 100mg/ml d'ampicilline ont été inoculés avec E.coli BL21(DE3)(pET15b-His6EthR) et mis en culture sous agitation à 37°C durant une nuit. La préculture a été utilisée pour inoculer 2 litres de milieu LB à une D06oo de 0,1. A DOβoo = 0,6-0,7, l'expression de ethR a été induite par addition de 1 mM IPTG. Après 2 heures d'induction à 37°C, les bactéries ont été récupérées par centrifugation à 7500 tr/min, avec une centrifugeuse Sorval RC 5B PLUS, rotor SS-34. Le culot bactérien a ensuite été congelé à -20°C. Le culot a été resuspendu dans 10 ml de tampon A (50 mM Tris, pH 7,5, 10 mM imidazole, 250 mM NaCI) puis lysé par passage à la presse de French (Bioritech) sous une pression de 6,2 x 106 Pa. Le lysat a été centrifugé 30 minutes à 4°C à 18000 tr/min dans une centrifugeuse Sorvall RC-5B PLUS, rotor SLA-3000 et le surnageant récupéré.
25 ml de résine d'affinité (chelating Sepharose Fast Flow - Amersham Biosciences) ont été lavés par 5ml d'eau bidistillée, puis chargés en Nickel par ajout de 5 volumes de NiS04 100mM. La résine a été lavée avec 5 volumes d'eau bidistillée et équilibrée avec 5 volumes de tampon A. La résine a été chargée sur une colonne jetable. Le surnageant de lyse bactérienne a été chargé sur la colonne d'affinité à un débit de 2 ml/min à l'aide d'une pompe péristaltique P-3 (Pharmacia Biosciences). La colonne a été lavée par passage de 10 volumes de tampon 50 mM Tris pH 7,5 ; 50 mM imidazole ; 250 mM NaCI. La protéine His6-EthR a été éluée par 1 ,5 volume de tampon d'élution (50 mM Tris pH 7,5 ; 250 mM imidazole ; 250 mM NaCI). Les fractions récupérées ont été analysées sur gel SDS-PAGE à 12,5%. Les fractions présentant une pureté suffisante ont été groupées et dialysées 2 fois dans 10 mM Tris pH 7,5 ; 200 mM NaCI, à 4°C. La solution a ensuite été concentrée sur colonne Centriplus YM-3 (Amicon), puis par Macrosep 3K (Pall), afin d'atteindre une concentration finale de 50mg/ml de protéine.
Cristallisation : La cristallisation a été réalisée à 20 °C, par la méthode de la goutte suspendue en diffusion de vapeur (2 μl de solution de protéine, 2 μl de solution de précipitant et 0,75 ml de réservoir). Des cristaux d'Hisβ-EthR ont été obtenus en 7-10 jours avec la solution 15 du Cryokit de cristallisation pour protéines (Sigma) (0,17 M sulfate d'ammonium ; 0,085 M Na-cacodylate pH 6,5 ; 15% glycérol ; 25,5% PEG8000). Ces cristaux sont dénommés forme 2 dans la suite du protocole.
B. Marquage de la protéine EthR par des méthionines séléniées
E.coli BL21(DE3)(pET15b-His6EthR) a été cultivé à 37°C dans 2 litres de milieu M9 contenant 6 g/l de Na2HP04, 3 g/l de KH2P04, 0,5 g/l de NaCI ; et additionnés, au départ de la culture, de 4 g/l de glucose, 1 g/l de NH4CI, 2 ml de MgS04 1 M, 2 ml de CaCI2 100 mM, 20 ml du mélange de vitamines MEM (Sigma) et d'ampicilline à 100 mg/l., La voie de biosynthèse de la méthionine de E.coli BL21(DE3)(pET15b-HiS6EthR) a été bloquée à Dθ6oo= 0,5 (Doublie, 1997), par ajout d'acides aminés inhibant les aspartokinases: lysine à 100 mg/l, threonine à 100 mg/l, phénylalanine à 100mg/l, leucine à 50 mg/l, isoleucine à 50 mg/l, valine à 50 mg/l et sélénométhionine à 75 mg/l. L'incubation à 37°C a été poursuivie pour atteindre une Dθ6oo=0,6, puis 1 mM d'IPTG a été ajouté afin d'induire l'expression d'ethR. La culture a été agitée à 37°C pendant 3 heures supplémentaires. Le culot bactérien, récupéré par centrifugation à 7500 tr/min dans une centrifugeuse Sόrvall RC-5B PLUS, rotor SLA-3000, a été resuspendu dans 20 ml de tampon de lyse (50 mM Tris pH 7,5, 10 mM imidazole, 250 mM NaCI). 1 ml de mélange anti-protéasique Complète (Roche) a été ajouté avant de casser les bactéries à la presse de French. Le lysat a été centrifugé à 18000 tr/min, 30 minutes, à 4°C, avec une centrifugeuse Sorvall RC-SB PLUS, rotor SS-34. Le surnageant a été chargé à l'aide d'une pompe péristaltique P-3 (Amersham Biosciences) sur 25 ml de résine d'affinité (Chelating Sepharose Fast Flow- Amersham Biosciences) pré-équilibrée par 5 volumes de tampon de lyse. La protéine Hise-EthR a été éluée par 1 ,5 volume de tampon d'élution (50 mM Tris pH 7,5, 250 mM imidazole, 250 mM NaCI). Les fractions récupérées ont été supplémentées par 10 mM de Dithiothreitol (DTT), 0,2 mM d'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), puis analysées par gel SDS-PAGE 12,5% coloré au bleu de Coomassie. Les fractions pures ont été regroupées et dialysees 2 fois contre 10 mM de Tris, pH 7,5, 200 mM de NaCI, 10 mM de DTT et 0,2 mM d'EDTA. La solution a ensuite été concentrée comme décrit ci-avant pour atteindre une concentration spectrale de 10 mg/ml, puis stockée à -80°C.
Cristallisation de EthR-sélénométhionine : Avant d'être utilisée pour la cristallisation, Hisβ-EthR/met-sél a été décongelée sur glace et concentrée à 50 mg/ml à l'aide de microcons 3K (Amicon), à 4°C. La protéine séléniée a été cristallisée par la méthode des gouttes suspendues en diffusion de vapeur (2 μl de solution de protéine, 2 μl de solution de précipitant, 0,75 ml de réservoir), à une température de 20°C. Des cristaux sont apparus entre 7 et 10 jours dans les gouttes contenant 0,17 M sulfate d'ammonium (Fluka), 0,085 M Na-cacodylate pH 6,5 (Sigma), 15% glycérol (ICN) et 25% de polyéthyléne glycol 8000 (Fluka). Ces cristaux ont été utilisés pour déterminer la structure tridimensionnelle d' His6-EthR/met-sél. Ils sont dénommés cristaux de forme 1 dans la suite du protocole. C- Obtention d'une seconde forme cristalline
Des essais de co-cristallisation ont été réalisés à partir de la protéine HiS6- EthR/met-sél en présence de 5 fragments différents d'ADN longs de 15 pb et couvrant la zone de fixation de la protéine sur l'opérateur de ethA (voir section I supra). La protéine a été décongelée sur glace et concentrée à 50 mg/ml. Le ratio protéine-ADN a été fixé à 2 : 1. Le mélange a été soumis à la co-cristallisation par la méthode des gouttes suspendues en diffusion de vapeur (1 μl de solution de protéine, 1 μl de solution d'ADN, 2 μl d'agents cristallisants, 0,75 ml de réservoir), à une température de 20°C. Des cristaux ont été obtenus après 2 à 3 jours d'incubation, pour le mélange His6-EthR/met-sél / fragment 1 d'ADN (SEQ ID N°27) avec une solution de cristallisation contenant 0,17 M sulfate d'ammonium (Fluka), 0,085 M Na-cacodylate pH 6,5 (Sigma), 15% glycérol (ICN) et 35% PEG8000 (Fluka). Ces cristaux sont dénommés forme 3 dans la suite du protocole.
D- Acquisition des données de diffraction et détermination de la structure d'EthR
Les cristaux de la forme 1 (cristaux élaborés à partir de protéine Hisβ- EthR/met-sél contenant des sélénométhionines) ont été utilisés pour déterminer la structure cristallographique.
L'acquisition des données de diffraction a été réalisée sur la ligne de lumière BM14 au synchrotron européen de Grenoble (ESRF). La procédure d'acquisition des données et de détermination de la structure a été la suivante.
Un cristal de la forme 1 a été congelé à l'aide d'un système de cryogénie de marque Oxford. Les données de diffraction ont été mesurées par un détecteur de type CCD, de marque Marresearch, de 133 mm de diamètre, positionné à 150 mm du cristal. Les clichés de diffraction ont été enregistrés pour une oscillation du cristal de 1 °. Le temps d'exposition par cliché a été réglé sur 20 secondes. 360 images ont été mesurées à la longueur d'onde de 0,97865A. La matrice d'orientation du cristal dans le faisceau de rayons X a été déterminée avec le logiciel XDS. Les données de diffraction ont été intégrées et réduites avec le même logiciel. Les cristaux obtenus appartiennent au groupe d'espace P2-|2-ι2 (Figure 8) et présentent les paramètres de maille suivants : a=57,57 A; b=85,94 A; c=100,41 A. Ils contiennent deux monomères par unité asymétrique. Comme le montre la Figure 8, la structure révèle deux monomères du répresseur EthR associés en un dimère symétrique. Les monomères sont associés par leur domaine de fixation du ligand.
Chaque monomère (acides aminés 22 à 215) est entièrement hélicoïdal et comprend 9 hélices (respectivement α1 à α9 et 1 ' à α9', voir Figure 8). Le cristal a révélé la présence d'une molécule de ligand par monomère, enchâssée dans un tunnel formé par les hélices α4, α5, α6, al, α8 et α8' (provenant du second monomère). Les centres des domaines HTH (« hélice-tour-hélice ») de fixation à l'ADN de cette structure sont distants de 52 A. La détermination des phases associées à chaque facteur de structure a été déterminée par la méthode « SAD » («Single Wavelength Anomalous Diffraction »). Cette méthode est basée sur l'utilisation du signal anomal du sélénium incorporé dans la protéine via les sélénométhionines (voir préparation des cristaux de forme 1 ). Ce signal est maximal à la longueur d'onde employée (0,97865 A), longueur d'onde sélectionnée sur base d'une analyse d'émission de fluorescence par les cristaux. La position des atomes de sélénium dans l'unité asymétrique du cristal a été déterminée avec le logiciel Shelxd. Ces positions ont été affinées et les phases initiales calculées avec le logiciel Sharp. Les phases ont ensuite été améliorées par des procédures de modification de densité électronique implementees dans les logiciels Solomon et Dm, de la suite de logiciels CCP4. Le modèle moléculaire a été initialement construit avec le logiciel Arp/Warp et le logiciel TURBO-FRODO. La structure finale a été obtenue par minimisation en énergie (procédure d'affinement) avec le logiciel CNS et inspectée manuellement avec le logiciel TURBO-FRODO. Les paramètres décrivant la topologie du ligand d'EthR ont été obtenus avec le logiciel HIC-UP.
Les cristaux de la forme 2 sont semblables aux cristaux de la forme 1. Ceux-ci ont cependant été obtenus avec de la protéine recombinante non séléniée. Les conditions de cristallisation sont identiques, mais la provenance des solutions de cristallisation est différente. L'acquisition des données de diffraction a été réalisée à l'Institut de Biologie de Lille, en utilisant l'équipement du laboratoire de cristallographie macromoléculaire. La procédure d'acquisition des données et de détermination de la structure a été la suivante. Un cristal de la forme 2 a été congelé à l'aide d'un système de cryogénie de marque Oxford. Les données de diffraction ont été mesurées par un détecteur de type Imaging Plate, de marque Marresearch, de 345 mm de diamètre, positionné à 250 mm du cristal. Les clichés de diffraction ont été enregistrés pour une oscillation du cristal de 1 °. Le temps d'exposition par cliché a été réglé sur 120 secondes. 180 images ont été mesurées à la longueur d'onde de 1 ,5418 A. La matrice d'orientation du cristal dans le faisceau de rayons X a été déterminée avec le logiciel XDS. Les données de diffraction ont été intégrées et réduites avec le même logiciel. Les phases associées à chaque facteur de structure ont été déterminées par positionnement isomorphe du modèle moléculaire d' HiSδ-EthR/met-sél (obtenu à partir des cristaux de type 1 ). La structure finale a été obtenue par minimisation en énergie (procédure d'affinement) avec le logiciel CNS et inspectée manuellement avec le logiciel TURBO-FRODO. Les paramètres décrivant la topologie du ligand d'EthR ont été obtenus avec le logiciel HIC-UP. Les cristaux de la forme 3 appartiennent au groupe d'espace P4ι2-|2, avec les paramètres de maille suivants : a=122,2 A; b=122,2 A; c=33,6 A. Ceux-ci ont été obtenus avec de la protéine recombinante séléniée (His6- EthR/met-sél). L'acquisition des données de diffraction a été réalisée à l'Institut de Biologie de Lille, en utilisant l'équipement du laboratoire de cristallographie macromoléculaire. La procédure d'acquisition des données et de détermination de la structure a été la suivante.
Un cristal de la forme 3 a été congelé à l'aide d'un système de cryogénie de marque Oxford. Les données de diffraction ont été mesurées par un détecteur de type Imaging Plate, de marque Marresearch, de 345 mm de diamètre, positionné à 250 mm du cristal. Les clichés de diffraction ont été enregistrés pour une oscillation du cristal de 1 °. Le temps d'exposition par cliché a été réglé sur 600 secondes. 100 images ont été mesurées à la longueur d'onde de 1 ,5418 A. La matrice d'orientation du cristal dans le faisceau de rayons X a été déterminée avec le logiciel XDS. Les données de diffraction ont été intégrées et réduites avec le même logiciel. La détermination des phases associées à chaque facteur de structure a été effectuée par la méthode du remplacement moléculaire (implémentée dans le logiciel AMoRe) en utilisant comme modèle la structure d'EthR obtenue à partir des cristaux de type 1. La structure finale a été obtenue par minimisation en énergie (procédure d'affinement) avec le logiciel CNS et inspectée manuellement avec le logiciel TURBO-FRODO. Les paramètres décrivant la topologie du ligand d'EthR ont été obtenus avec le logiciel HIC-UP. Les cristaux de la forme 3 ne contiennent qu'un monomère par unité asymétrique, confirmant la symétrie stricte d'ordre deux dans l'homodimère d'EthR en présence d'un inducteur lipophile.
E. Analyse de la structure
L'analyse de la structure de EthR confirme l'appartenance de ce répresseur transcriptionnel à la famille dénommée « TetR/CamR ». A l'heure actuelle, les structures de deux membres de cette famille, TetR et QacR, ont été déterminées, dans les conformations induites et non induites. TetR est le répresseur transcriptionnel de TetA, protéine responsable de la résistance à la tétracycline chez les bactéries à gram négatif. La fonction de répression de TetR est inhibée par la tétracycline, qui se fixe de manière symétrique à chaque monomère sur l'homodimère TetR. QacR est le répresseur transcriptionnel de QacA, protéine responsable, chez Staphylococcus aureus, de la résistance à de nombreux antiseptiques et désinfectants. QacR et TetR sont des homodimères, de topologie différente bien que composés tous deux uniquement d'hélices α. EthR, tout comme TetR et QacR, est un homodimère. Chaque monomère présente une topologie semblable à celle de QacR et se compose de 9 hélices α. Les trois hélices N terminales de chaque monomère composent le motif de fixation à l'ADN de type HTH (α2, α3), stabilisé par α1 (Figure 8). Les 6 autres hélices α composent le domaine de fixation du ligand ainsi que la zone de dimérisation (Figure 9). Le motif de dimérisation est constitué des hélices α8 et α9 (avec αδ' et α9') dans EthR, tout comme dans QacR. La dimérisation couvre une surface de 1562 A2 par monomère de EthR, une surface de contact comparable à celle observée pour QacR (1530 A2). Bien que les domaines de fixation du ligand de QacR et EthR se ressemblent, ils présentent une homologie de séquence faible, ce qui est reflété par les orientations relatives différentes des hélices formant ces domaines (RMSD global des chaînes principales de 2 A pour les hélices α4 à α9). Les hélices α4, α7 et α9 sont orientées de manière similaire dans QacR et EthR, tandis que les hélices α5, αδ et αδ présentent des orientations axiales plus divergentes, entraînant des déplacements allant jusqu'à 5 A entre les résidus topologiquement équivalents. Cette observation traduit la spécificité des répresseurs vis-à-vis de leurs différents inducteurs respectifs. L'orientation relative des motifs HTH et du domaine de fixation du ligand sont également légèrement différents (Figure 9), ce qui donne lieu à un dimère EthR plus aplati. On précise que les termes « ligand » et « inducteur » sont ici synonymes et renvoient à la définition donnée précédemment. En outre, la forme « ligandée » ou « induite » du répresseur EthR correspond au répresseur « lié à un ligand ».
De la même façon, dans le contexte de l'invention, les termes « fixation » et « liaison » sont employés indifféremment. Les changements de conformation résultant de la fixation de ligands sur QacR ont été décrits. La fixation des ligands provoque des modifications de conformation qui aboutissent à une réorientation relative des deux domaines HTH au sein du dimère. Cette réorientation produit un écartement des motifs HTH de telle sorte que ceux-ci ne puissent plus se fixer dans le sillon majeur de la molécule d'ADN cible. La fixation des ligands à QacR produit une transition tour-hélice qui prolonge l'hélice α5. Ce mouvement se répercute sur les hélices environnantes. Il est à noter qu'une seule molécule de ligand se fixe par dimère de QacR, résultant en un dimère asymétrique. Le monomère sur lequel le ligand se fixe subit le changement conformationnel le plus drastique (élongation de l'hélice α5, et répercussion sur les hélices adjacentes). Cependant, la fixation d'un ligand dans un monomère affecte dans une moindre mesure la conformation du second monomère du répresseur, le signal se propageant via la zone de dimérisation. Globalement, ces modifications de conformation provoquent une augmentation de la distance « centre à centre » des hélices de reconnaissance des deux motifs HTH α3-α3' dans les dimères de QacR de 37 A (forme libre ou liée à l'ADN) à 4δ A (forme ligandée ou induite en présence de ligands). Cette augmentation de distance explique l'incapacité de fixation de la forme induite de QacR à l'ADN. Les trois formes cristallines d'EthR obtenues révèlent toutes la présence d'un ligand lipophile associé à chaque sous-unité du dimère (octanoate d'hexadécyle (HeOc) ; pour la caractérisation spécifique de ce ligand, se reporter à la partie III ci-dessous).
Cette forme induite d'EthR avec son ligand lipophile révèle des caractéristiques structurales similaires à celles observées dans la structure de QacR sous la forme induite. L'hélice α5 de EthR présente une longueur similaire à l'hélice α5 de QacR dans le monomère fixant le ligand.
Une analyse détaillée de la structure de EthR a indiqué que les hélices de reconnaissance de l'ADN α3 et α3' sont séparées par 52 A. Une telle distance entre les domaines HTH est, par analogie avec QacR, incompatible avec la liaison du répresseur sur son ADN cible (Schumacher et al., 2001 et Schumacher et al., 2002). EthR fixe un ligand par monomère, de manière symétrique, au contraire de QacR qui ne fixe qu'un seul ligand par dimère. La liaison du ligand entraîne une transition tour-hélice des résidus Tδ9 à Y93, uniquement au niveau de la sous-unité liée au ligand, de sorte que l'extrémité C-terminale de α5, mais pas de α5', est prolongée par un tour. Y92 et Y93 sont donc capables d'interagir avec le ligand. La transition tour-hélice est essentielle non seulement pour la liaison du ligand, mais également pour l'induction, étant donné que la formation du tour supplémentaire dans l'hélice α5 entraîne un repositionnement de αδ et du domaine de liaison à l'ADN qui lui est attaché. Comme indiqué supra, le mouvement de α6 provoque la translation et la rotation du domaine de liaison à l'ADN qui relargue QacR de son site opérateur. La longueur de l'hélice α5, une empreinte dans l'induction de QacR, est comparable dans EthR et QacR liés à leur ligand, ce qui suggère des mécanismes d'induction similaires.
Cependant, du fait de la présence d'une molécule de ligand par monomère dans EthR, à la fois les hélices α5 et α5' subissent la transition tour-hélice et le déplacement du motif HTH putatifs, ce qui entraîne une conformation plus ouverte des hélices de reconnaissance séparées par 52 A.
Ce mécanisme d'induction se distingue de celui de TetR, lequel se lie à 2 ligands par dimère et utilise un mécanisme d'induction, impliquant plusieurs mouvements « à travers hélice », dans lequel la liaison de la tétracycline augmente la distance centre à centre des hélices de reconnaissance de l'ADN de 3 A seulement (Orth et al., 2000). Par ailleurs, le domaine de fixation du ligand de EthR est unique et ne présente pas d'analogie moléculaire avec celui de QacR. Le site de fixation du ligand chez EthR traverse le domaine défini par les hélices α4 à α9. Il est délimité par les hélices α4, α5, α6, al, α8 et αδ' (provenant du second monomère) et se présente sous la forme d'un tunnel ou poche se prolongeant parallèlement aux hélices α4, α5 et al. Ainsi, cette poche est constituée de résidus appartenant à toutes les hélices du domaine de liaison du ligand de EthR. Le seul portail d'entrée apparent dans le site de liaison du ligand est formé par la divergence des hélices α6, α7 et α8.
Comme le montre la Figure 11 , une des extrémités du ligand est quasi parallèle à α6 (C1 à C6 dans la molécule de ligand HeOc décrite infra), près de la surface de la protéine. Ensuite, elle s'enroule aux alentours du résidu Trp13δ (C7 à C15) et s'enfonce dans le domaine de liaison du ligand, parallèlement aux axes des hélices α4, α5 et α7. La structure indique que la région C1 à C15 de HeOc est divisée en 4 segments présentant des courbures différentes (C1 à C6 ; C6 à C9 ; C9 à C12 et C12 à C15), et qui contournent le cycle aromatique du résidu W133 (Figure 11 ). HeOc adopte une conformation enfouie étirée de la position C15 jusqu'à son extrémité C24, sur environ 12 A. Ainsi, le ligand HeOc adopte pour l'essentiel une conformation étirée, sur une distance de 21 A entre les carbones C1 et C24, avec une région enroulée (C1 à C15) puis une chaîne carbonée linéaire (C15 à C24). La poche de liaison du ligand est définie par les résidus de EthR suivants (voir Figure 11 , dans le sens C1 vers C24) : R128, V134, G124, L76, Q125, F187, F184, T121 , W138, F114, L183, E180, M142, N179, N176, W145, F110, W207, T149, 1107, Lδ7, V152, Y148, G106, W103 et M102. La cavité de liaison de la région C15 à C24 est riche en acides aminés hydrophobes (M142, 1107, Lδ7, V152, M102) et aromatiques (W145, F110, W207, Y14δ, W103). Elle contient également 2 asparagines, toutes deux situées face aux carbones C17 et C13 de HeOc (Figure 11 ). Une molécule d'eau est également enfouie via un pont hydrogène avec le résidu N179 près du carbone C17 du ligand. 4 résidus aromatiques jouent un rôle particulièrement important dans la courbure des segments C6 à C15 : F114, F110, W13δ et W145. W133 est crucial pour délimiter le domaine de liaison du ligand. Il est stabilisé par les interactions de sa chaîne latérale NE1 avec OE1 du résidu E160. E1δ0 est très stabilisé, étant donné qu'il interagit aussi avec NE du résidu R1δ1 appartenant à l'autre monomère présent dans le dimère de EthR, près de l'axe de double symétrie.
Bien que la structure de EthR non lié ne soit pas encore élucidée, il a été observé que F110 et F114, qui appartiennent au dernier tour de α5, pointent en direction du site de liaison du ligand et interagissent avec le ligand. Par analogie avec le changement au niveau de Y92 lorsque QacR est lié à son ligand, il apparaît qu'une augmentation de la distance centre à centre des domaines HTH lorsque EthR se lie à son ligand puisse être due à des changements conformationnels naissant dans la portion distale de α5, sous la forme d'une transition tour-hélice qui aboutit au changement aromatique près du site de liaison du ligand. QacR est induit par liaison à des ligands lipophiles cationiques mono- et bivalents présentant une grande diversité structurelle. Les structures du répresseur QacR lié à divers ligands cytotoxiques ont révélé la présence de 2 sites de liaison séparés mais potentiellement chevauchants au sein d'une seule poche. Ces 2 sites de liaison sont pratiquement parallèles à αδ de QacR et se terminent par α5 qui ferme la cavité. La comparaison des sites de liaison de QacR et EthR a révélé que les 2 domaines de liaison du ligand possèdent le même portail d'entrée du ligand. HeOc chevauche en partie le site 1 de QacR, adjacent à la porte d'entrée du ligand. Toutefois, le site 2 de QacR n'est pas retrouvé dans le complexe HeOc-EthR du fait des orientations différentes des hélices α5 et αδ qui rétrécissent la cavité de liaison de EthR. A la place, EthR possède une seconde cavité, non observée dans QacR, qui s'étend sur environ 15 A, parallèlement à α4 et α7 (Figure 12). Le site 2 est délimité du site 1 de EthR par les positions W13δ et E1δ0. Ce second site de fixation dans EthR n'est pas complètement occupé par HeOc étant donné qu'il contient en outre une molécule d'eau enfouie près de la position C17 de HeOc. En général, dans QacR, les cavités de liaison non occupées par les divers ligands contiennent elles aussi des molécules d'eau.
III- Caractérisation des ligands du répresseur EthR :
A- Matériels et méthodes : Afin de caractériser le ligand, 750 ng de co-cristal d'EthR-ligand ont été lavés à l'aide du tampon de cristalisation, transférés individuellement dans du chloroforme afin de dénaturer les protéines et d'en extraire le ligand. L'analyse du chloroforme d'extraction par GC/MS a permis d'identifier l'hexadecyl octanoate (HeOc) comme produit majeur présent dans la solution. La structure de l'HeOc a ensuite été superposée au spectre d'analyse RX du cristal et s'avère compatible avec la densité électronique correspondant au ligand. B- Résultats : Le ligand lipophile co-purifié et co-cristallisé avec le répresseur EthR a été identifié, à la fois par cartographie de la densité d'électrons (Figure 13) et par analyse GC-MS/MS (Figure 14). L'équivalent de 750 ng d'EthR co-cristallisé a été extrait par immersion des cristaux dans le chloroforme. Le profil d'élution de la chromatographie en phase gazeuse présente un pic spécifique à 22,16 min. Le spectre d'ionisation électronique (El) de ce pic a été comparé à une banque de spectres et correspond à l'octanoate d'hexadécyle (HeOc). Ce spectre présente un pic correspondant à l'ion moléculaire M+ à m/z=36δ. Les ions présentant les caractéristiques m/z = 41 , 55, 57, 69, 63, 97, 111 sont caractéristiques des molécules CnH2n-ι. Les ions m/z = 43, 57, 71 correspondent à des CnH2n+ι. L'ion m/z = 144 représente un réarrangement de type Me Lafferty de l'ester et m/z = 269 correspond à l'ion C16H330-CO+ (Me Lafferty et Turecek, 1993).
La co-cristallisation d'un ligand a été décrite pour la première fois pour la structure cristalline du complexe RXR α (F31δA)/RAR α, en révélant la présence d'un acide gras responsable de la propriété d'agoniste constitutif de ce mutant (Bourguet et al., 2000). Plus récemment, la structure du cristal du domaine de liaison du ligand de ROR β a été résolue en liaison avec un ligand stéarate (Potier et al., 2003). La molécule de stéarate agit comme un « remplisseur » plutôt que comme un véritable ligand, étant donné qu'un faible pourcentage d'occupation de la poche et une conformation en partie désordonnée ont été observés, et, de surcroît, qu'aucun effet activateur ou antagoniste sur l'activité de ROR β n'a été décelé.
En revanche, l'homodimère de EthR co-cristallise systématiquement avec HeOc selon une stoechiométrie de 2:2, avec une occupation totale et une densité d'électrons bien définie, ce qui indique un rôle essentiel de HeOc dans la stabilisation de la conformation induite de EthR. Par ailleurs, de manière intéressante, il a récemment été montré que EthA est une monooxygénase du type Baeyer-Villiger, capable de convertir une large gamme de cétones, y compris des cétones à longue chaîne, en leurs esters correspondants (Fraaije et al., 2004). Compte tenu de la régulation du gène ethA par le répresseur EthR, il apparaît que des substrats de EthA pourraient servir de ligands du répresseur EthR.
IV - Augmenter la sensibilité des mycobactéries à l'ETH : des perspectives thérapeutigues :
A. Tests de synergie :
M. smegmatis me2 155 a été cultivé dans des flacons Erlenmeyer de 250 ml contenant 100 ml de milieu Sauton. Les cellules ont été incubées à 37°C sous agitation pendant 2 jours. Au cours de cette expérience, la synergie entre l'ETH et une cétone donnée a été déterminée comme étant la capacité de cette cétone à promouvoir la bactério-toxicité de l'ETH à une concentration inférieure à la concentration minimale inhibitrice (15μg/ml). L'effet phénotypique des cétones a été évalué en déposant des dilutions en série de la culture sur milieu LB contenant une faible concentration de ETH (5μg/ml), 1 mM de cétones (benzylacétone, 2- octanone, 3-octanone ou 2-décanone), ou une combinaison de l'ETH (5μg/ml) et des cétones (1 mM). L'aspect et le nombre des colonies pour chaque dépôt ont été analysés après trois jours de croissance à 37°C.
B. Résultats
La répression du gène ethA par le répresseur EthR réduit la sensibilité des mycobactéries à l'ETH. A l'inverse, un mutant EthR-déficient montrait une sensibilité augmentée à l'ETH par rapport à la souche mère (Baulard et al., 2000). Une interférence avec l'activité de EthR conduit donc à une augmentation de la sensibilité à l'ETH.
L'interférence avec EthR in vivo a été testée en utilisant l'octanoate d'hexadécyle synthétique. Cependant, l'octanoate d'hexadécyle est un composé trop hydrophobe pour être utilisé en association avec un solvant biologiquement compatible.
D'autres composés apparentés, plus solubles, ont donc été recherchés. Comme indiqué ci-dessus, EthA a récemment été décrit comme étant capable de convertir une large gamme de cétones, incluant des alcanones à longue chaîne et des cétones aromatiques, en leur esters correspondants, suggérant un rôle possible de cet activateur dans le métabolisme des acides mycoliques (Fraaije et al., 2004). La capacité de EthR à se lier à un long ester hydrophobe tel que l'octanoate d'hexadécyle est compatible avec cette hypothèse et prouve le lien entre la régulation du gène ethA et l'activité de la monooxygénase EthA.
Il a donc été envisagé que certaines des molécules décrites par Fraaije et al. pouvaient constituer des ligands de EthR intéressants au sens de la présente invention. Afin de déterminer si certaines de ces molécules pouvaient effectivement interférer avec l'activité du répresseur EthR, et par là-même modifier la sensibilité des mycobactéries à l'ETH, 4 cétones différentes ont été testées pour leur aptitude à augmenter la sensibilité de M. smegmatis à l'ETH. Cette aptitude a été testée sur la croissance des mycobactéries, sur boîtes d'agar additionné de 5μg/ml d'ETH, ce qui est une concentration significativement inférieure à sa concentration minimale inhibitrice, laquelle est de 15μg/ml.
L'une d'entre elles, la benzylacétone (BA), a montré un effet bactériostatique important lorsqu'elle était co-administrée avec une faible dose d'ETH (5μg/ml). Aucun effet antimycobactérien de la benzylacétone n'a été observé en l'absence d'ETH, ce qui démontre donc la synergie stricte de ce composé avec l'ETH (voir figure 15). Des inhibiteurs puissants d'EthR pourraient donc entraîner une réduction drastique de la dose thérapeutique d'ETH requise en thérapie et, par conséquent, réduire la toxicité associée au traitement de la tuberculose par l'ETH et des prodrogues apparentées. En sus de l'ETH, EthA est également impliqué dans l'activation d'autres thioamides, tels que la thioacétazone et l'isoxyl (De Barber et al., 2000). En dépit de son efficacité, l'Organisation Mondiale de la Santé ne préconise pas l'utilisation de thioacétazone, en particulier chez les individus infectés par le VIH du fait d'un risque de réaction dermique sévère (Blanc et al., 2003). La dé-repression du gène ethA par des ligands de EthR pourrait donc permettre de réduire la dose thérapeutique de la thioacétazone et de l'isoxyl. Il a récemment été montré que ce dernier composé ciblait une désaturase lipidique (Phetsuksiri et al., 2003), qui représente une cible anti-mycobactérienne encore non exploitée à des fins thérapeutiques.
Mycobacterium leprae est également sensible à l'ETH et à des dérivés tels que le prothionamide, mais n'est pas sensible à des niveaux cliniquement significatifs d'INH, du fait de lésions multiples dans le gène katG de cet organisme. C'est pourquoi l'INH ne peut être utilisé pour traiter la lèpre. Cependant, étant donné qu'à la fois ethR et ethA sont conservés dans le génome réduit de M. leprae, le développement de ligands de EthR inhibiteurs de son activité répresseur, comme additifs médicamenteux à l'ETH et à ses dérivés, pourrait donc permettre d'améliorer la chimiothérapie de la lèpre. REFERENCES
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Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de sélection d'un composé capable de se lier au répresseur mycobactérien EthR, cette liaison empêchant ledit répresseur EthR de réprimer l'expression du gène mycobactérien ethA codant un activateur EthA de l'éthionamide, ledit procédé comprenant au moins : a) le clonage du gène codant ledit répresseur EthR sur un premier plasmide d'expression recombinant, et le clonage d'au moins la région promotrice et opératrice du gène ethA en amont d'un gène rapporteur sur un second plasmide d'expression recombinant ; b) la transformation d'une cellule hôte recombinante avec au moins les plasmides selon l'étape a) ; c) la culture de ladite cellule hôte recombinante en présence d'un composé candidat ; d) la mesure du niveau N-t d'expression du gène rapporteur en présence dudit composé candidat ; e) la comparaison du niveau Ni mesuré à l'étape d) avec le niveau No d'expression du gène rapporteur en l'absence dudit composé candidat ; et f) si Ni est significativement supérieur à N0, la sélection du composé.
2. Procédé de sélection d'un composé capable de se lier au répresseur mycobactérien EthR, cette liaison empêchant ledit répresseur EthR de réprimer l'expression du gène mycobactérien ethA codant un activateur EthA de l'éthionamide, ledit procédé comprenant au moins : a) le clonage du gène codant ledit répresseur EthR, et le clonage d'au moins la région promotrice et opératrice du gène ethA en amont d'un gène rapporteur, sur un plasmide d'expression recombinant ; b) la transformation d'une cellule hôte recombinante avec au moins le plasmide issu del'étape a) ; c) - la culture de ladite cellule hôte recombinante en présence d'un composé candidat ; d) la mesure du niveau Ni d'expression du gène rapporteur en présence dudit composé candidat ; e) la comparaison du niveau Ni mesuré à l'étape d) avec le niveau N0 d'expression du gène rapporteur en l'absence dudit composé candidat ; et f) si Ni est significativement supérieur à No, la sélection du composé.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ladite région promotrice et opératrice du gène ethA comprend au moins la séquence SEQ ID N°1 , de préférence la séquence SEQ ID N°2, de manière encore préférée la séquence SEQ ID N°3.
4. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce le plasmide d'expression recombinant contenant ledit gène codant le répresseur EthR est pMV261-e#7R.
5. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ledit gène rapporteur est choisi parmi lacZ, xylE, gfp, lux et le gène codant la glucuronidase.
6. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le plasmide d'expression recombinant contenant au moins ladite région promotrice et opératrice du gène ethA en amont d'un gène rapporteur est pBSh-PethA - lacZ.
1. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ladite cellule hôte recombinante est une cellule mycobactérienne, de préférence une cellule de Mycobacterium bovis, M. smegmatis, M. tuberculosis ou M. leprae. δ. Procédé selon lequel la revendication 7, caractérisé en ce que ladite cellule est une cellule de M. bovis BCG 1173P2 ou de M. smegmatis mc2155.
9. Procédé de sélection d'un composé capable de se lier au répresseur mycobactérien EthR, cette liaison empêchant ledit répresseur EthR de réprimer l'expression du gène mycobactérien ethA codant un activateur EthA de l'éthionamide, ledit procédé comprenant au moins : a) la détermination du niveau Li de liaison du répresseur EthR sur au moins la région promotrice et opératrice du gène ethA, en présence d'un composé candidat ; b) la comparaison du niveau Li avec le niveau Lo de liaison du répresseur EthR sur au moins la région promotrice et opératrice du gène ethA, en l'absence dudit composé candidat ; et c) si Li est significativement inférieur à Lo, la sélection du composé.
10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que ladite détection est réalisée à l'aide d'une méthode choisie parmi la résonance plasmonique de surface, la détection de la fluorescence naturelle et le transfert d'énergie par résonance de fluorescence.
11. Procédé de sélection d'un composé capable de se lier au répresseur mycobactérien EthR, cette liaison empêchant ledit répresseur EthR de réprimer l'expression du gène mycobactérien ethA codant un activateur EthA de l'éthionamide, ledit procédé comprenant au moins : a) la mise en présence dudit répresseur EthR et d'au moins deux composés candidats ; b) la cristallisation du mélange ainsi obtenu ; c) l'analyse de la structure du cristal issu de l'étape b) ; d) si cette analysé révèle que l'un desdits composés est lié audit répresseur EthR, la solubilisation dudit cristal ; e) l'élution et la sélection dudit composé. 12. Procédé de sélection d'un composé capable de se lier au répresseur mycobactérien EthR, cette liaison empêchant ledit répresseur EthR de réprimer l'expression du gène mycobactérien èthA codant un activateur EthA de l'éthionamide, ledit procédé comprenant au moins : a) la mise en présence dudit répresseur EthR et d'un composé candidat ; b) la cristallisation du mélange ainsi obtenu ; c) l'analyse de la structure du cristal issu de l'étape b) ; d) si cette analyse révèle que ledit composé est lié audit répresseur EthR, la sélection dudit composé.
13. Procédé selon la revendication 11 ou 12, caractérisé en ce qu'il est mis en œuvre préalablement à un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10. 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape de détermination de la structure du composé sélectionné.
15. Composé inhibiteur du répresseur EthR susceptible d'être obtenu par la mise en œuvre d'un procédé de sélection selon l'une quelconque des revendications 1 à 14.
16. Composé selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'il interagit avec les résidus F110 et F114 du répresseur EthR. • -
17. Composé selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il interagit en outre avec les résidus W13δ et W145.
1δ. Composé selon l'une quelconque des revendications 15 à 17, caractérisé en ce qu'il se fixe dans la poche de liaison du ligand du répresseur EthR, ladite poche étant définie par les résidus suivants : R128, V134, G124, L76, Q125, F187, F184, T121 , W138, F114, L183, E180, M142, N179, N176, W145, F110, W207, T149, 1107, L87, V152, Y148, G106, W103 et M102.
19. Composition pharmaceutique comprenant au moins un composé inhibiteur du répresseur EthR en tant que principe actif, "en association avec au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable.
20. Composition pharmaceutique selon la revendication 19, caractérisée en ce que ledit composé est choisi parmi les analogues et dérivés pharmaceutiquement acceptables de l'octanoate d'hexadécyle, ou de la benzylacétone.
21. Composition pharmaceutique selon la revendication 20, caractérisée en ce que ledit composé est choisi parmi les analogues et dérivés inhibiteurs de EthR et pharmaceutiquement acceptables de la 2- hexanone, la 2-heptanone, la 4-heptanone, la 2-octanone, la 3-octanone, la 2-décanone, la 2-dodécanone.
22. Produits contenant un composé inhibiteur du répresseur EthR et l'éthionamide ou l'un de ses dérivés, comme produit de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps en thérapie antituberculeuse.
23. Produits contenant un composé inhibiteur du répresseur EthR et un antibiotique activable par l'activateur mycobactérien EthA, comme produit de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps en thérapie antituberculeuse.
24. Produits contenant un composé inhibiteur du répresseur EthR et l'éthionamide ou l'un de ses dérivés, comme produit de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps en thérapie antilépreuse.
25. Produits contenant un composé inhibiteur du répresseur EthR et un antibiotique activable par l'activateur mycobactérien EthA, comme produit de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps en thérapie antilépreuse.
26. Produits selon l'une quelconque des revendications 22 à 25, caractérisés en ce que ledit composé est choisi parmi les analogues et dérivés pharmaceutiquement acceptables de l'octanoate déxadécyle, ou de la benzylacétone.
27. Produits selon la revendication 26, caractérisés en ce que ledit composé est choisi parmi les analogues et dérivés inhibiteurs de EthR et pharmaceutiquement acceptables de la 2-hexanone, la 2-heptanone, la 4- heptanone, la 2-octanone, la 3-octanone, la 2-décanone, la 2- dodécanone.
2δ. Composé inhibiteur du répresseur EthR comme médicament.
29. Composé selon la revendication 2δ, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les analogues et dérivés pharmaceutiquement acceptables de l'octanoate déxadécyle, ou de la benzylacétone.
30. Composé selon la revendication 29, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les analogues et dérivés inhibiteurs de EthR et pharmaceutiquement acceptables de la 2-hexanone, la 2-heptanone, la 4- heptanone, la 2-octanone, la 3-octanone, la 2-décanone, la 2- dodécanone.
31. Utilisation d'au moins un composé inhibiteur du répresseur EthR pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention et/ou au traitement des infections bactériennes, de préférence mycobactériennes.
32. Utilisation selon la revendication 31 , caractérisée en ce que ledit composé est choisi parmi les analogues et dérivés pharmaceutiquement acceptables de l'octanoate déxadécyle, ou de la benzylacétone.
33. Utilisation selon la revendication 32, caractérisée en ce que ledit composé est choisi parmi les analogues et dérivés inhibiteurs de EthR et pharmaceutiquement acceptables de la 2-hexanone, la 2-heptanone, la 4- heptanone, la 2-octanone, la 3-octanone, la 2-décanone, la 2- dodécanone.
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