FR2861742A1

FR2861742A1 - LIGANDS DU REPRESSEUR MYCOBATERIEN EthR, PROCEDES DE SELECTION ET APPLICATIONS

Info

Publication number: FR2861742A1
Application number: FR0312801A
Authority: FR
Inventors: Frederique Frenois; Ndong Jean Engohang; Vincent Villeret; Camille Locht; Alain Baulard
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut Pasteur de Lille; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Institut Pasteur
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut Pasteur de Lille; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Institut Pasteur
Priority date: 2003-10-31
Filing date: 2003-10-31
Publication date: 2005-05-06
Anticipated expiration: 2023-10-31
Also published as: FR2861742B1

Abstract

La présente invention concerne des procédés de sélection de composés capables de se lier au répresseur mycobactérien EthR, cette liaison l'empêchant de réprimer l'expression du gène mycobactérien ethA codant EthA, le bio-activateur de l'éthionamide.

Description

LIGANDS DU REPRESSEUR MYCOBACTERIEN EthR,
PROCEDES DE SELECTION ET APPLICATIONS
La présente invention se rapporte au domaine de la recherche de nouveaux médicaments pour le traitement des infections mycobactériennes, notamment la tuberculose et la lèpre.

Plus précisément, l'invention concerne des procédés de sélection de composés capables de se lier au répresseur mycobactérien EthR, cette liaison l'empêchant de réprimer l'expression du gène mycobactérien ethA codant un activateur de l'éthionamide (ETH).

La présente invention s'intéresse également aux composés ainsi sélectionnés, ainsi qu'à leurs applications pour la prophylaxie et/ou le traitement des infections mycobactériennes.

L'on estime à l'heure actuelle qu'environ 7 à 8 millions de personnes contractent la tuberculose chaque année. Environ 50 millions de personnes sont actuellement infectées par des souches de Mycobacterium tuberculosis multi-résistantes aux antibiotiques. De telles souches sont en particulier résistantes à la fois à l'isoniazide (INH) et à la rifampicine (RIF), les deux antibiotiques de première ligne (i.e., dont l'indice thérapeutique, représentant le rapport dose thérapeutique/dose toxique, est élevé) utilisés pour traiter la tuberculose (Espinal et al., 2001).

Ces patients sont donc soumis à un traitement à l'aide de composés de seconde ligne (i.e., dont l'indice thérapeutique est plus faible), moins actifs, plus chers et/ou plus toxiques (Mahmoudi et Iseman, 1993).

L'antibiotique de seconde ligne éthionamide (2-éthylthioisonicotinamide, ETH, Trescatyl) est utilisé en clinique depuis plus de 35 ans. Il est associé à des troubles gastro-intestinaux et une hépatotoxicité importants. Sa prescription est dès lors limitée essentiellement au traitement de patients qui rechutent du fait de souches de M. tuberculosis résistantes aux antibiotiques de première ligne, ou au

traitement de patients présentant une lèpre lépromateuse, en remplacement de la clofazimine (Jenner et Smith, 1987).

L'ETH est un analogue structural de l'INH.

ETH et INH sont des prodrogues qui doivent être converties en composés actifs par des enzymes mycobactériennes spécifiques (Baulard étal., 2000).

Ces deux antibiotiques inhibent la biosynthèse des acides mycoliques, constituants essentiels de la paroi mycobactérienne. Ils ont tous deux pour cible l'enzyme énoyl-AcpM réductase (InhA).

Cependant, le mécanisme d'action de ces deux antibiotiques suivent des voies métaboliques différentes : l'INH est activée par la catalase peroxydase KatG, alors que l'activation de l'ETH est dépendante de l'enzyme EthA. Dès lors 95% des souches résistantes à l'INH restent sensibles à l'ETH.

Une autre différence majeure entre ces deux antibiotiques résident dans leur concentration minimale inhibitrice respective (CMI). Afin d'assurer des concentrations d'ETH dans les fluides corporels en excès par rapport à la CMI in vitro (2,5 g/ml), il est recommandé d'utiliser des dosages quotidiens de 10 mg/kg (Johnston et al., 1967), soit 5 fois plus que le dosage recommandé pour l'INH.

Récemment, les gènes ethA et ethR impliqués dans l'activation de la prodrogue ETH ont été identifiés (Baulard et al. 2000, DeBarber et al., 2000). EthA est une enzyme contenant du FAD qui catalyse en deux étapes l'activation de l'ETH (Vannelli et al. 2002). L'expression d'ethA est placée sous le contrôle du gène adjacent ethR, dans la mesure où la surexpression d'ethR conduit à une résistance à l'ETH et où l'inactivation chromosomique d'ethR est associée à une hypersensibilité à l'ETH, révélant par là-même que toutes les molécules d'ETH ne sont pas activées in vitro chez les mycobactéries de type sauvage.

La présente invention vise à fournir des moyens qui permettent une activation plus efficace de l'ETH par les mycobactéries. Ainsi, grâce aux

moyens selon l'invention, il est désormais possible d'optimiser l'efficacité thérapeutique de l'ETH en réduisant les dosages à administrer aux patients et, partant, en réduisant les effets secondaires liés à l'administration de cet antibiotique selon les protocoles actuels.

Selon un premier aspect, la présente invention fournit des procédés de sélection de composés qui agissent comme ligands du répresseur EthR, et qui, lorsqu'ils sont liés audit répresseur, empêchent ce dernier de réprimer l'expression du gène ethA.

Les formules composé qui agit comme ligand du répresseur EthR ou ligand du répresseur EthR sont équivalentes et désignent un composé capable de se lier au répresseur EthR .

Dans le présent contexte, un composé peut être n'importe quel type de molécule, biologique ou chimique, naturelle, recombinante ou synthétique. Par exemple, un composé peut être un acide nucléique (e.g., un oligonucléotide sens ou antisens tel qu'un ARN antisens), une protéine, un acide gras, un anticorps, un polysaccharide, un stéroïde, une purine, une pyrimidine, une molécule organique, un radical chimique, etc... Le terme composé couvre également les fragments, dérivés, analogues structurels ou combinaisons de ceux-ci, dès lors qu'ils possèdent la capacité, en se fixant au répresseur EthR, d'empêcher ce dernier de réprimer l'expression du gène ethA.

Cette capacité représente la propriété d'intérêt que doivent présenter les composés sélectionnés par la mise en #uvre des procédés objets de la présente invention.

L'on entend ici par réprimer , le fait de diminuer, réduire, décroître, réguler négativement, inhiber, bloquer, prévenir, empêcher. A contrario, l'on doit comprendre par activer , le fait d'augmenter, accroître, réguler positivement, promouvoir, améliorer, stimuler.

Selon un premier mode de réalisation, un procédé de sélection tel que visé par la présente invention comprend au moins :

a) le clonage du gène codant ledit répresseur EthR sur un premier plasmide d'expression recombinant, et le clonage d'au moins la région promotrice et opératrice du gène ethA en amont d'un gène rapporteur sur un second plasmide d'expression recombinant ; b) la transformation d'une cellule hôte recombinante avec au moins les plasmides selon l'étape a) ; c) la culture de ladite cellule hôte recombinante en présence d'un composé candidat ; d) la mesure du niveau N1 d'expression du gène rapporteur en présence dudit composé candidat ; e) la comparaison du niveau N1 mesuré à l'étape d) avec le niveau No d'expression du gène rapporteur en l'absence dudit composé candidat ; et f) si N1 est significativement supérieur à No, la sélection du composé.

Un deuxième mode de réalisation du procédé de sélection selon l'invention correspond au procédé décrit ci-dessus, dans lequel toutefois l'on utilise non pas deux plasmides d'expression recombinants (étapes a) et b)), mais un seul, sur lequel sont clonés à la fois le gène codant le répresseur EthR et au moins la région promotrice et opératrice du gène ethA en amont d'un gène rapporteur. Ainsi, un tel procédé comprend au moins : a) le clonage du gène codant ledit répresseur EthR, et le clonage d'au moins la région promotrice et opératrice du gène ethA en amont d'un gène rapporteur, sur un plasmide d'expression recombinant ; b) la transformation d'une cellule hôte recombinante avec au moins le plasmide issu del'étape a) ; c) la culture de ladite cellule hôte recombinante en présence d'un composé candidat ; d) la mesure du niveau N1 d'expression du gène rapporteur en présence dudit composé candidat ;

e) la comparaison du niveau N1 mesuré à l'étape d) avec le niveau No d'expression du gène rapporteur en l'absence dudit composé candidat ; et f) si N1 est significativement supérieur à No, la sélection du composé.

Pour la mise en oeuvre des étapes citées ci-dessus (clonage, transformation, culture, mesure de l'expression d'un gène rapporteur), l'homme du métier fera appel à des techniques conventionnelles (voir par exemple Sambrook et Russel, 2001).

La région promotrice et opératrice du gène ethA à cloner aux fins de la mise en #uvre d'un procédé selon l'invention comprend au moins la séquence SEQ ID N 1, qui correspond à la région promotrice et opératrice du gène ethA sur laquelle se fixent 4 molécules de répresseur (voir partie expérimentale infra). De préférence, cette région comprend au moins la séquence SEQ ID N 2, sur laquelle se fixent 8 molécules de EthR. De manière encore préférée, cette région comprend au moins la séquence SEQ ID N 3, laquelle correspond à la séquence intergénique ethA-R.

Selon un mode de réalisation particulier, un plasmide d'expression recombinant contenant le gène ethR (codant EthR) est pMV261-ethR (voir partie expérimentale ci-dessous).

Selon un autre mode de réalisation particulier, un plasmide d'expression recombinant contenant au moins la région promotrice et opératrice du gène ethA en amont d'un gène rapporteur est pBSh-PethA lacZ (voir partie expérimentale ci-dessous).

Dans le plasmide pBSh-PethA - lacZ, le gène rapporteur est lacZ.

Bien évidemment, l'homme du métier peut mettre en oeuvre n'importe quel autre gène rapporteur connu dans le domaine de l'invention pour être utilisable chez les mycobactéries, notamment les gènes xylE, gfp, lux et le gène codant pour la protéine glucuronidase.

Dans les procédés selon l'invention, ladite cellule hôte recombinante est une cellule mycobactérienne. Il s'agit de préférence d'une cellule de Mycobacterium bovis, M. smegmatis, M. tuberculosis ou

M. leprae. En particulier, l'homme du métier peut choisir une cellule de M. bovis BCG 1173P2 (souche vaccinale accessible sur simple demande auprès de l'Organisation Mondiale de la Santé), ou de M. smegmatis mc2155 (Snapper et al., 1988 ; voir partie expérimentale cidessous).

Selon un troisième mode de réalisation, un procédé de sélection conforme à la présente invention comprend au moins : a) la détermination du niveau L1 de liaison du répresseur EthR sur au moins la région promotrice et opératrice du gène ethA, en présence d'un composé candidat ; b) la comparaison du niveau L1 avec le niveau Lo de liaison du répresseur EthR sur au moins la région promotrice et opératrice du gène ethA, en l'absence dudit composé candidat ; et c) si Li est significativement inférieur à Lo, la sélection du composé.

En particulier, les niveaux de liaison Lo et L1 peuvent être déterminés à l'aide d'une méthode choisie parmi la résonance plasmonique de surface, la détection de la fluorescence naturelle et le transfert d'énergie par résonance de fluorescence (FRET pour Fluorescence résonance energy transfer ) par lequel l'homme du métier déterminera le transfert d'énergie entre EthR et la région promotrice et opératrice de ethA, en présence et en absence d'un ligand (Jia et al., 1996; Pyles et al., 1998; Hillisch et al., 2001 ; EngohangNdong et al., 2004).

Un deuxième aspect de la présente invention concerne un composé, tel que défini supra, obtenu par la mise en oeuvre d'un procédé de sélection selon l'invention.

En particulier, un tel composé peut être le ligand cocristallisé décrit dans la partie expérimentale ci-dessous, ou un analogue de celui-ci.

Selon un troisième aspect, la présente invention est utile dans le domaine de la prévention et/ou du traitement des maladies, notamment des infections mycobactériennes telles que la tuberculose et la lèpre.

Ainsi, l'invention a trait à un composé tel que visé ci-dessus comme médicament, destiné en particulier à prévenir et/ou traiter les infections mycobactériennes.

En effet, dans la mesure où le mutant knockout ethR décrit dans Baulard et al. (2000) présente un phénotype de ralentissement important de la croissance, EthR constitue à lui seul une cible thérapeutique. Un ligand de EthR est susceptible de donner lieu à un phénotype comparable à celui du mutant sus-cité. En tout état de cause, un ligand de EthR peut présenter des propriétés avantageusement bactériostatiques, voire bactéricides, contre les mycobactéries.

Au sens de l'invention, un médicament peut être administré par n'importe quelle voie appropriée, par exemple la voie orale, locale, systémique, intraveineuse, intramusculaire ou mucosale, ou bien en utilisant un patch, ou encore sous une forme encapsulée dans, ou immobilisée sur, des liposomes, des microparticules, des microcapsules, et analogues.

En outre, un tel médicament comprend de préférence, en sus du composé susmentionné, au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

Les techniques de formulation et d'administration des médicaments sont bien connues dans la technique ici considérée (l'homme du métier pourra notamment se référer à l'ouvrage Remington's Pharmaceutical Sciences , dernière édition).

La présente invention a également pour objet l'utilisation d'au moins un composé tel que décrit supra pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention et/ou au traitement des infections mycobactériennes.

En outre, l'invention concerne des produits contenant un composé comme mentionné ci-dessus, et soit l'ETH ou l'un de ses dérivés, soit un antibiotique activable par l'activateur mycobactérien EthA, comme produit

de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps en thérapie antituberculeuse ou antilépreuse.

Les figures suivantes sont fournies à titre purement illustratif et ne limitent en aucune façon la présente invention.

Figure 1 : activité -galactosidase chez les mycobactéries transformées.

A : détection de l'activité ss-galactosidase chez M. smegmatis transformé avec (a) pBSh-PethA-lacZ, (b) pBSh-PethA-lacZ + pMV261-ethR, (c) pMV261-ethR, sur boîtes gélosées contenant du milieu LB enrichi en XGal.

B : quantification de l'activité -galactosidase chez M. bovis BCG transformé avec (a) PBSh-PethA-laCZ, (b) pBSh-PethA-lacZ + pMV261-ethR, (c) pMV261-ethR. Chaque valeur est une moyenne faite sur 3 répliques de cultures.

Figure 2 : EMSA de la liaison de His6-EthR à la région intergénique ethAR.

La sonde marquée de 191 pb (100000 cpm) a été mélangée avec 0 g (piste 1), 0,45 g (piste 2), 0,90 g (piste 3), 1,35 g (piste 4), 1,8 g (piste 5) et 3,6 g (piste 6) His6-EthR en l'absence (A) ou en présence d'un excès de la région intergénique ethA-R non marquée utilisée comme compétiteur spécifique (B) ou encore en présence d'un excès d'ADN compétiteur non spécifique (C).

B et C : les EMSA ont été réalisés sans (piste 1) ou avec 0,9 g (autres pistes) His6-EthR purifié.

Figure 3 : A et B : protection à la Dnase 1 de la région intergénique ethA-R par His6EthR.

Les 2 sondes (A : fragment HindIII-SphI de 323 pb ; B : fragment XholHindlll de 312 pb) ont été incubées sans (piste 1) ou avec différentes quantités de His6-EthR (A : piste 2 : 0,0625 g ; piste 3 : 0,125 g ; piste

4 : 0,25 pg ; piste 5 : 0,5 pg ; piste 6 : 1 ug ; B : piste 2 : 1 pg ; piste 3 :

2,5 Ng ; piste 4 : 5 erg ; piste 5 : 7,5 pg ; piste 6 : 10 pg), avant traitement par la DNase I.

C : localisation de la région protégée par His6-EthR contre la digestion par la DNase I.

D : analyse d'extension d'amorce.

La séquence du brin codant est montrée et le point +1 de transcription est souligné.

Figure 4 : affinité globale et stoechiométrie de l'interaction entre His6-EthR et PethA mesurée par SPR.

A : structure de la région intergénique ethA-R.

IG-37 comprend 2 répétitions directes imparfaites (flèches pleines) qui comprennent 2 répétitions indirectes imparfaites (bases en italique).

IG-36 comprend 2 répétitions indirectes imparfaites (flèches en pointillé).

B : sensorgrammes d'injections de 0,35 ; 0,70 ; 1,39 ; 3,47 et 8,6 M His6- EthR, en utilisant le fragment IG-106.

C : stoechiométrie de liaison en fonction de la concentration en His6-EthR.

Sensorgrammes de 0,612 ; 1,25 ; 2,50 et 5 M His6-EthR, en utilisant les fragments IG-62 (D), IG-37 (E) et IG-36 (F).

Figure 5 : représentation de Hill pour la liaison de His6-EthR sur la région intergénique ethA-R.

Figure 6 : chromatographie par filtration sur gel.

Profils d'élution d'un fragment PCR (0,108 nmole) chevauchant la région intergénique ethA-R en l'absence (A) ou en la présence de 0,385 nmole (B), 1,920 nmole (C) et 3,850 nmole (D) de His6-EthR purifié.

E : profil d'élution de 3,850 nmole de His6-EthR en l'absence d'ADN.

Axe des y : absorbances relatives (mAU pour unité de milliabsorbance) à 260 nm (pointillé) et 280 nm (trait plein).

Figure 7 : interaction in vivo entre les molécules EthR.

Boîtes gélosées contenant du milieu minimal, enrichi en maltose et X-Gal.

Figure 8 : structure du cristal du répresseur EthR du groupe d'espace P21212 (forme 1).

La partie expérimentale ci-après, appuyée par des exemples et références aux figures, vise à illustrer, sans limiter, la présente invention.

PARTIE EXPERIMENTALE 1- EthR réprime l'expression de ethA en se liant directement sur la région promotrice et opératrice de ethA :
A. Matériels et méthodes : A.1. Souches bactériennes et conditions de croissance Toutes les souches ont été cultivées en aérobiose à 37 C. Toutes les étapes de clonage ont été réalisées chez E. coli XL1- Blue (Stratagène).

Les souches de E. coli ont été cultivées en milieu Luria-Bertani (LB) (Life Technologies) en présence ou non de 1,5% d'agar (Difco).

Les souches mycobactériennes ont été cultivées en milieu Sauton (Sauton 1912) enrichi avec 0,001% ZnS04 et 0,25% Triton WR1339 (Sigma) ou sur agar M7H11 enrichi avec 10% de mélange catalase-dextrosealbumine-acide oléique (Becton Dickinson). Mycobacterium smegmatis et M. bovis BCG 1173P2 ont été transformées comme décrit précédemment (Wards et Collins, 1996).

Les cultures à grande échelle de mycobactéries ont été amenées en milieu de phase exponentielle (36 h pour M. smegmatis mc2155 ; 11 à 16 jours pour M. bovis BCG).

Le cas échéant, les antibiotiques (Sigma) ont été ajoutés au milieu aux concentrations suivantes :

kanamycine à 20 p.glml, ampicilline à 100 ig/mI, hygromycine à 50 g/m), streptomycine à 20 g/ml et gentamicine à 15 g/ml.

Après croissance, les bactéries ont été récoltées, lavées avec du tampon phosphate PBS et stockées à - 20 C.

A.2. Plasmides et manipulations d'ADN Toutes les manipulations d'ADN ont été réalisées en utilisant des protocoles classiques, tels que décrits par Sambrook et Russell (2001). Le système Fast-linkTM DNA ligation (Epicentre Technologies) a été utilisé pour les ligatures. a) Construction de pBSh -lacZ Le fragment BamHI-Bg/ll de 3,678 kb, contenant le cadre ouvert de lecture (ORF) codant la -galactosidase, a été isolé de pQEGM (Antoine et al., 2000) et inséré dans pBSh-D (Picardeau et al., 2000) avant d'être digéré par BamHI. b) Construction de pBSH-PethA-lacZ La région promotrice PethA a été amplifiée par PCR en utilisant les amorces 0-161 : 5'-CCAGCGGACGGTCCTCTAGAAGGTTC-3' (SEQ ID N 4), 0-162: 5'-GTGAGATCTCATGGATCCACGCTATCAAGGTAA-3' (SEQ ID N 5). Le produit PCR a été inséré dans pCR2.1Topo (Invitrogen) pour donner pCR2.PethA (2 + 4). Le plasmide a été redigéré par Xbal et Bg/ll et le fragment de 191 pb contenant PethA a été inséré dans pBShlacZ, préalablement digéré par Xbal et BamHl pour donner pBSh-PethAlacZ. c) Plasmides pourle test double hybride bactérien La région codant EthR a été amplifiée par PCR en utilisant les amorces 0- 243 : 5'-CTGCAGTGACCACCTCCGCGGCCAG-3' (SEQ ID N 6) et 0- 244 : 5'-GGTACCTTATCTGTTCTCGCCGTAA-3' (SEQ ID 7). La séquence amplifiée a été clivée par Pstl et Asp718, et insérée dans pT25 digéré par Pstl-Asp718 (Karimova et al., 1998), pour donner pT25-EthR.

Alternativement, la même région chromosomique a été amplifiée par PCR en utilisant les amorces 0-240: 5'GGTACCGACTACTTCCGCAGCCAGTCA-3' (SEQ ID N 8) et 0-242 : 5'-

AAGCTTTCGCCGTAAATGCTGGTCA-3' (SEQ ID N 9), clivée par Hindlll et Asp718, et insérée dans pT18 (Karimova et aL, 1998) préalablement digéré par les mêmes enzymes pour donner pT18-EthR. Une souche de E. coli cyclase-déficiente (DHP1) (Karimova et al., 1998) a été cotransformée avec ces deux plasmides. La capacité des clones résultants à fermenter le maltose a été déterminée à 30 C sur des boîtes de milieu minimum M9 solide fraîchement préparé, contenant 1% de maltose comme unique source de carbone et 40 g/ml de 5-bromo-4-chloro-3-

indolyl-p-D-galactopyranoside (X-gal, Promega).

A.3. Tests Beta-galactosidase Les activités ss-galactosidase des souches recombinantes de M. smegmatis et M. bovis BCG ont été détectées sur des boîtes d'agar

M7H11 enrichi avec 100 ptg/ml de X-gal. Les activités p-galactosidase ont été quantifiées en cultures liquides, en utilisant une méthode adaptée de Miller (1972). Brièvement, les cellules mycobactériennes ont été cultivées en milieu Sauton (50 ml) jusqu'à une densité optique (DO) à 600 nm de 0,6. Les cellules ont ensuite été récoltées par centrifugation (4000 g, 15 min, 4 C), et les culots ont été lavés, puis resuspendus dans 1 ml de PBS.

Après sonication des suspensions bactériennes, des aliquots des lysats ont été incubés avec de l'orthonitrophényl-p-D-galactoside (ONPG, Sigma) à 30 C. La réaction enzymatique a été suivie par spectrophotométrie à une absorbance de 420 nm (A42onm), et la vitesse initiale a été calculée en utilisant la proportion linéaire de la courbe cinétique. L'Activité ssgalactosidase Spécifique (AS) a été déterminée comme suit : AS = (AA420nm min-1) / (DOeoonm x # de culture). Des échantillons en triple exemplaire ont été mesurés pour chaque clone bactérien. Afin d'évaluer l'influence potentielle de l'ETH sur l'activité du répresseur EthR, M. smegmatis co-transformé avec pBSh-PethA-lacZ et pM261-ethR a été cultivé jusqu'à une DO600nm de 0,3.

Des concentrations variables de ETH (0-10-20-40 g/ml) ont ensuite été ajoutées à la culture (en double), et les activités p-galactosidase ont été mesurées toutes les 10 min pendant une heure.

A.4. Production et purification de His6-EthR L'ADN codant EthR a été amplifié par PCR en utilisant l'ADN chromosomique de M. tuberculosis H37Rv comme matrice et les oligonucléotides 0-183 : 5'-CATATGACCACCTCCGCGGCCAGT-3' (SEQ ID N 10) et 0-184 : 5'-GGATCCGAGCACCCCCGACCGAGT-3' (SEQ ID N 11) comme amorces. Le produit PCR a été inséré dans pCR2. 1 Topo de manière à former pCR2.1-ethR. La séquence du fragment codant EthR a été déterminée sur les deux brins et, ensuite, isolée à partir de pCR2.1ethR par digestion avec Ndel et BamHl, puis insérée dans pET-15b (Novagen), pour donner pET-15b-ethR. Ce plasmide code une protéine EthR portant une étiquette amino terminale ayant la séquence suivante : MGSSH6SSGLVPRGSHM (SEQ ID N 12). Ce plasmide a été introduit dans E. coli BL21 (DE3). E. coli BL21(DE3)(pET-15b-ethR) a été cultivé en milieu LB (120 ml) jusqu'à une DO600nm de 0,6-0,7.

De l'isopropylthiogalactoside (IPTG) a ensuite été ajouté à une concentration finale de 1 mM, et la culture a été maintenue pendant 3 heures de plus. Les cellules ont été récoltées par centrifugation à 12 000 g à 4 C, resuspendues dans 10 ml de tampon de lyse (50 mM NaH2P04, 300 mM NaCI, pH 7,5,10 mM imidazole) et lysées par deux passages à travers une presse de French à 6,2 x 106Pa. Après centrifugation (20 000 g, 25 min, 4 C), le surnageant a été récupéré, et His6-EthR a été séparé du lysat de cellules totales par chromatographie sur colonne d'agarose Ni-NTA (Qiagen). Après un lavage extensif avec du tampon de lyse, His6-EthR a été élué de la résine par 100 mM imidazole dans du tampon de lyse, puis dialysé sur la nuit contre du tampon de lyse.

Environ 900 g/ml de protéines purifiées ont été obtenus comme déterminé à l'aide du système Bio-Rad protein assay . La pureté des

protéines a été déterminée par coloration au Bleu de Coomassie après électrophorèse SDS-PAGE sur un gel de polyacrylamide à 12%. La protéine purifiée a été stockée dans 10% de glycérol a -20 C, puis dialysée avant usage.

A.5. Mesure de l'interférence de la mobilité électrophorétique (EMSA pour Electrophoretic mobility shift assays ) Le fragment PCR de 191 pb obtenu en utilisant les oligonucléotides 0-161 et 0-162 et contenant la région promotrice de ethA a été purifié par électrophorèse sur gel d'agarose et marqué avec 10 Ci de [[gamma]-32P]ATP (3000 Ci/mmol ; Amersham Biosciences) en utilisant la T4 polynucléotide kinase (10 unités, Invitrogen). Le fragment radio-marqué ([32P]-PethA) a été purifié en utilisant une colonne MicroSpin G-25 (Amersham, Biosciences).

[32P]-PethA (100 000 coups par minutes; cpm) a été incubé pendant 10 min à température ambiante avec des quantités variables de His6-EthR dans un volume réactionnel de 20 (il contenant 1 g de poly-(dl-dC) (Amersham Biosciences) et 2 mM Tris-HCI (pH 8,0), 0,4 mM MgCl2, 5 mM KCI, 0,2 mM DTT, 10% de glycérol et 0,01% de détergent non-ionique P40 (Igepal CA-630, Sigma).

Après incubation, le mélange a été chargé sur un gel de polyacrylamide à 10% non dénaturant et soumis à une électrophorèse. Le gel a ensuite été séché sous vide et exposé toute la nuit à un film radiographique Biomax (Kodak).

Les tests de compétition ont été réalisés comme décrit (Tang et al., 2001).

Du PethA non marqué et la cassette de résistance à la streptomycine de pHP45Q non marquée (Frey et Krisch, 1985) (en excès molaire de 0 à 1000 fois) ont été respectivement pré-incubés comme ADN compétiteurs spécifiques et non spécifiques avec His6-EthR pendant 10 min à température ambiante, suivi de l'addition de sondes marquées et l'incubation pendant 10 min à température ambiante. Les complexes

protéines-ADN résultants ont été soumis à une électrophorèse et à une auto-radiographie comme décrit ci-dessus.

A.6. Filtration sur gel Un fragment d'ADN de 94 pb chevauchant PethA a été amplifié par PCR en utilisant l'ADN chromosomique de M. tuberculosis H37Rv comme matrice et 0-270: 5'-CGGTCATGGATCCACGCTATCAAC-3' (SEQ ID N 13) et O- 272 : 5'-GGAGGTGGTCACCCTGGCAGC-3' (SEQ ID N 14) comme amorces. Des quantités variables de His6-EthR ont été mélangées avec 6,7 g (0,108 mmoles) de produits PCR dans du tampon A (50 mM NaH2P04, pH 7,5 ; 250 mM NaCI) et filtrées sur une colonne Superdex 200 HR 10/30 reliée à un système AKTA FPLC (Amersham Biosciences) à un débit de 0,3 ml par minute. Les concentrations relatives de protéines et d'ADN dans l'éluent ont été suivies en mesurant l'absorbance à 280 nm et 260 nm. La masse moléculaire apparente de His6-EthR en l'absence d'ADN a été estimée en utilisant la courbe standard Ve/V0 contre le log des masses moléculaires des protéines standards (ribonucléase A, 13,7 kDa ; chymotrypsinogène A, 25 kDa ; ovalbumine, 45 kDa ; albumine, 66 kDa ; aldolase, 158 kDa ; catalase, 232 kDa ; apoferritine, 440 kDa ; thyroglobuline, 669 kDa ; de taille moléculaire pour filtration sur gel de protéine ; Amersham Biosciences). Vo est le volume mort et Ve est le volume d'élution.

A.7. Test de liaison par résonance plasmonique de surface (SPR) L'appareil BIAcore 2000' (BIAcore'AB, Uppsala, Suède) a été utilisé pour des analyses en temps réels des interactions moléculaires entre His6-EthR et la région promotrice de ethA.

4 fragments d'ADN ont été obtenus par PCR en utilisant l'ADN chromosomique de M. tuberculosis H37Rv comme matrice. Un fragment de 106 pb (figure 4A ; IG-106) chevauchant la région intergénique ethA-R a été obtenu en utilisant 0-270: 5'-CGGTCATGGATCCACGCTATCAAC-

3' (SEQ ID N 15) et 0-271 : 5'-biotine-CTGACTGGCCGCGGAGGTGGT- 3' (SEQ ID N 16).

Un fragment d'ADN de 62 pb (IG-62) chevauchant une région de 55 pb identifiée par des expériences d'empreintes à la DNase I a été amplifié en utilisant 0-248 : 5'-biotine-GATCCACGCTATCAACGTA-3' (SEQ ID N 17) et 0-250: 5'-CTACGTGTCGATAGTGTCG-3' (SEQ ID N 18).

Un fragment de 37 pb chevauchant 2 répétitions directes a été amplifié en utilisant 0-255 : 5'-ATCAACGTAATGTCGAG-3' (SEQ ID N 19) et 0-256 : 5'-GTCGACATCTCGTTGACG-3' (SEQ ID N 20), puis clone dans pCR2.1Topo. Un fragment d'ADN biotinylé de 104 pb (IG-37) a ensuite été obtenu par PCR en utilisant 0-255 et 5'-biotineAATTGGGCCCTCTAGATGCAT-3' (SEQ ID N 21).

Finalement, un fragment de 36 pb chevauchant 2 répétitions inversées a été amplifié en utilisant 0-253 : 5'-GTAATGTCGAGGCCGTCAA-3' (SEQ ID N 22) et 0-254: 5'-ATAGTGTCGACATCTCGTT-3' (SED ID N 23), puis cloné dans pCR2.1Topo.

Un fragment d'ADN biotinylé de 103 pb (IG-36) a ensuite été obtenu par PCR en utilisant 0-253 et 5'-biotine-AATTGGGCCCTCTAGATGCAT-3' (SEQ ID N 24).

Les fragments biotinylés amplifiés ont été purifiés sur colonne Quiaquick (Qiagen), puis leur séquence a été déterminée avant immobilisation sur une cellule couplée à la streptavidine CM5 Sensor Chip en utilisant le protocole standard fourni avec le système Amine Coupling (BIAcore').

Brièvement, la streptavidine a été injectée à 500 ng/ l dans 10 mM d'acétate de sodium (pH 3,5) pendant 12 minutes à un débit de 10 l/min.

L'ADN biotinylé (environ 69 kDa pour le fragment de 106 pb) a été injecté à travers chaque cellule à 200 ng/ml pour obtenir une fixation stable de la streptavidine de 205 unités de résonance (RU). L'intégrité et la quantité d'ADN fixé ont été contrôlées par injection durant 120 secondes de 1,6 M d'histone H1 de veau (Sigma) à 10 l/min.

La liaison de Hiss-EthR à l'ADN a été effectuée à 25 C dans 0,05 M NaH2P04 (pH 7,15), 0,25 M NaCI, 0,002 M MgCI2, 0,05 M KCI et 0,001 M DTT à un débit de 20 l/min.

His6-EthR a été injecté aux concentrations désirées dans du tampon de circulation jusqu'à ce que l'équilibre soit atteint.

Les cellules Sensor Chip ont été régénérées par une injection de 60 secondes de SDS à 0,03%. Les courbes finales ont été obtenues par soustraction du signal correspondant à une cellule fonctionnalisée avec un fragment d'ADN double brin non pertinent de 100 pb (fragment-276 à - 176 du promoteur de la stromélysine-1 humaine). Le rapport molaire entre His6-EthR (25,9 kDa) et l'ADN immobilisé ont été déterminés selon l'équation 1 suivante :

n = (a RU His6-EthR il RUADN) x (MrADN/MrH,,6-EthR) dans laquelle n est la stoechiométrie du complexe, RU est la réponse mesurée (en unités) obtenue à la saturation de liaison, et Mr est le poids moléculaire. a = 1pg de protéines liées par RU/mm2 and ss = 0,73 pg d'ADN lié par RU/mm2. Ces facteurs proviennent de la différence d'indice de réfraction molaire entre ADN et protéines, ce qui se traduit par un comportement plasmonique différent (PharmaciaBiosensor, 1994 ; Speck et aL, 1999). Afin de déterminer le coefficient de Hill et le Ko global de l'interaction, une deuxième cellule Sensor Chip contenant le même produit PCR biotinylé a été créée de manière à obtenir une fixation de l'ADN sur la streptavidine équivalente à 100 RU. His6-EthR a été injecté comme décrit précédemment selon des concentrations croissantes allant de 100 nM à 2 M de manière à obtenir l'équilibre de liaison.

Pour chaque concentration, le signal à l'équilibre, noté Req, a été mesuré.

La saturation fractionnaire, # = Req/Rmax, a été calculée. Rmax représente le maximum de capacité de liaison de His6-EthR estimé à 225 RU dans cette expérience. La portion linéaire (de 3 = 0,2 à # = 0,8) de la représentation de Hill, représentant le log (#/1-#) en fonction du log [His6-EthR], a été

ajustée par approximation linéaire de l'équation de Hill, log (6/1-6) = KH + nH [His6-EthR]. KH et nH représentent respectivement la constante de Hill et le coefficient de Hill.

Pour la demi saturation (6 = 0,5), l'équation de Hill est égale à 0, la constante de dissociation globale à l'équilibre (KD) est donnée par la relation KD = 10 kH/nH . La même procédure et les mêmes calculs ont été adaptés et appliqués aux fragments IG-62, IG-37 et IG-36.

A.8. Analyse d'extension d'amorces L'ARN total a été isolé à partir de M. bovis BCG 1173P2 comme décrit précédemment (Mangan et al., 1997). L'ADN contaminant a été éliminé de la préparation d'ARN en utilisant la DNase # (DNA-freeTM kit, Ambiom).

Cinq pmoles d'amorce 0-273 : 5'-GCTCTTGGTCGGGCAACGGTCCTG- 3' (SEQ ID N 25) ont été marquées à l'extrémité 5' en utilisant du [y- 32P]ATP comme décrit précédemment.

10 g d'ARN totaux ont été mélangés avec 2 pmoles d'amorce marquée et un mélange de dNTP (25 nmole pour chaque nucléotide) dans un volume final de 12 l. Après hybridation pendant 5 min à 70 C, les mélanges ont été rapidement refroidis dans de la glace, et 4 l de FirstStrand-Buffer [50 mM Tris-HCI, pH 8,3 ; 75 mM KCI et 3 mM MgCl2, 10 mM DTT, DnaseOut (40 U ; Invitrogen)] ont été ajoutés. Le mélange de réaction a ensuite été incubé à 37 C pendant 2 min avant l'addition de 200 unités de M-MLV RT (Reverse transcriptase du virus de la leucémie murine de Moloney ; Invitrogen). La réaction d'extension a été conduite à 37 C pendant 50 min, puis l'enzyme a été inactivée à 70 C pendant 15 min. Une réaction de séquençage en utilisant la terminaison de chaîne au didéoxy avec l'amorce 0-273 a été menée en parallèle et chargée sur un gel de séquence contenant 8 M d'urée et 6% de polyacrylamide, concomitamment aux produits d'extension d'amorce, de manière à déterminer la position du point de départ de la transcription.

A.9. Empreinte à la DNase I : Des expériences de protection à la DNase # ont été réalisées essentiellement comme décrit précédemment (Reisenauer et aL, 1999; Bellefontaine et al., 2002). Un fragment HindIII-SphI de 323 pb et un fragment Xhol-Hindlll de 312 pb chevauchant PethA ont été isolés de pCR2. 1-PethA (2 + 4) (voir paragraphe A. 2 ci-dessus).

Le premier fragment a été marqué à son extrémité au niveau du site Hindlll en utilisant seulement 50 Ci [a-32P]dATP (3000 Ci/mmol; Amersham Biosciences) et 5 l de fragment de Klenow (Invitrogen). Le fragment Xhol-Hindlll a été marqué à son extrémité au niveau du site Xhol en utilisant le même protocole.

Les fragments d'ADN marqués (10 000 cpm) ont été incubés avec His6EthR purifié. De la DNase 1 diluée (0,025 U, Roche) a été ajoutée à chaque mélange réactionnel pendant 3 min à température ambiante, puis la réaction a été stoppée avec 100 l de solution stop (200 mM NaCl, 20 mM EDTA et 10% de SDS). Les produits de digestion à la DNAse # ont été extraits au phénol, précipités à l'éthanol et séparés sur un gel contenant 8 M d'urée et 6% de polyacrylamide. Un étalon de séquençage généré avec l'amorce universelle et M13mp18 comme matrice a été utilisé pour identifier la position de la région protégée.

B. Résultats : B.1. Répression de EthA par EthR Il a été démontré précédemment que la surexpression de ethR entraînait une résistance accrue à l'ETH chez les mycobactéries, tandis qu'une inactivation par mutation de ethR augmentait la sensibilité à l'ETH (Baulard et al.,2000), ce qui suggère que EthR régule de manière négative la production de EthA, la mono-oxygénase putative requise pour l'activation de l'ETH.

Afin de confirmer cette hypothèse, la région promotrice de ethA a été insérée en amont du gène rapporteur lacZ dans pBSh-D, un plasmide navette E. coli-mycobacterie qui se réplique sous la forme d'une simple copie dans les mycobactéries (Picardeau et al., 2000). Le plasmide résultant, appelé pBSh-PethA-lacZ a été électrotransformé dans M. smegmatis mc2155 et M. bovis BCG 1173P2.

Les colonies de M. smegmatis recombinant présentaient une couleur bleue intense sur des boîtes de M7H11 enrichi en X-gal (Figure 1A), révélant l'expression de ethA dans ces conditions. Une couleur bleu pâle a été observée pour les colonies de M. bovis BCG (pBSh-PethA-lacZ) (données non montrées). Les deux souches recombinantes ont ensuite été co-transformées avec pMV261-ethR, un plasmide multicopie compatible comprenant ethR (Baulard et al., 2000). Les colonies de M. smegmatis et M. bovis BCG résultantes étaient blanches sur boîtes enrichies en X-gal, révélant que la présence de ethR réprimait l'expression de ethA.

De manière à confirmer le phénotype de M. bovis BCG, l'activité ssgalactosidase a été quantifiée chez les souches recombinantes : Mycobacterium bovis BCG (pBSh-PethA-lacZ) présentait une activité p- galactosidase significativement supérieure (15,7 U) par rapport à BCG cotransformé avec pBSh-PethA-/acZ et pMV261-ethR (0,51 U) (Figure 1 B).

Ainsi, la surexpression de ethR chez M. smegmatis et chez BCG a conduit à une forte inhibition de l'expression de ethA. Ces résultats confirment l'hypothèse selon laquelle EthR régule de manière négative l'expression de ethA. Par analogie avec la capacité de la tétracycline à inhiber la liaison de TetR sur son opérateur, l'influence de l'ETH sur l'activité du répresseur EthR a été évaluée. Mycobacterium smegmatis co-transformé avec pBSh-PethA-/acZ et pMV261-ethR a été cultivé en présence de concentrations variables d'ETH, et les activités ss-galactosidase ont été mesurées. Les activités ss-galactosidase n'ont pas semblé être influencées par un traitement à l'ETH (données non montrées), indiquant que l'ETH

n'entrave pas la capacité de EthR à réprimer ethA, même à haute concentration.

B.2. Liaison de EthR à PethA démontrée par des tests de modification de la mobilité électrophorétique Afin de déterminer si la répression de ethA par EthR intervient via une interaction physique directe entre la région promotrice de ethA (PethA) et EthR, des tests de modification de la mobilité électrophorétique (EMSA) ont été réalisés sur un fragment d'ADN de 191 pb marqué au [32P] à son extrémité, contenant la région intergénique ethA-R, amplifié par PCR à partir de l'ADN chromosomique de M. tuberculosis H37Rv. EthR complet et recombinant a été marqué par une étiquette histidine (His6-EthR), à son extrémité N-terminale, afin de faciliter la purification de l'enzyme en utilisant la chromatographie d'affinité Ni2±chélate. Comme montré sur la figure 2A, l'ajout de quantités croissantes de His6-EthR purifié au fragment d'ADN marqué au [32P] entraînait le retard de la migration du fragment sur des gels de polyacrylamide natifs, révélant que EthR est capable de se fixer sur le région intergénique ethA-R. Des compétiteurs d'ADN spécifiques et non spécifiques ont été utilisés pour déterminer la spécificité de liaison de His6-EthR à la région promotrice de ethA (Figures 2 B et 2C). La réapparition d'une sonde libre a été observée lorsqu'un compétiteur spécifique (sonde non marquée) était ajouté en excès de 500 à 1000 fois au mélange contenant la sonde marquée et His6-EthR, tandis que la même quantité de compétiteur non spécifique (voir Matériels et Méthodes, partie A supra) ne modifiait pas l'interaction entre His6-EthR et la sonde marquée.

B. 3. Détermination des sites de liaison de EthR Afin de localiser précisément l'opérateur de ethA, des expériences d'empreintes à la DNase I ont été réalisées sur les deux brins de l'ADN. Deux fragments, un fragment HindIII-SphI de 323 pb et un fragment Xhol-

Hindlll, contenant la région intergénique ethA-R ont été marqués à leurs extrémités sur les brins opposés. Pour les deux fragments, His6-EthR purifié était capable de protéger la même région de 55 pb après digestion modérée à la DNase # (Figures 3A et 3B). Cette région se situe de 5 nucléotides en amont du codon d'initiation d'ethA à 16 nucléotides en amont du codon d'initiation d'ethR, couvrant ainsi 55 pb au-delà de la région intergénique de 75 pb (Figure 3C). Ainsi, EthR se lie à une région d'ADN inhabituelllement longue, suggérant qu'il interagit avec son opérateur sous la forme d'un multimère fonctionnel. De manière intéressante, les expériences de protection à la DNase 1 réalisées avec soit de faibles (Figure 3A) soit de fortes (Figure 3B) concentrations de HiS6-EthR ont donné lieu à des empreintes équivalentes, suggérant une association coopérative de la protéine à l'opérateur.

B. 4. Identification du point d'initiation de la transcription du gène ethA Afin de comprendre les mécanismes de répression d'ethA par EthR, le point +1 de transcription d'ethA a été identifié en utilisant une analyse par extension d'amorces. Lorsque l'ARN total préparé à partir de M. bovis BCG 1173P2 a été soumis à une analyse d'extension d'amorces, un produit unique a été identifié, commençant au nucléotide A localisé 13 bases en amont du codon d'initiation de la traduction de ethA (Figure 3D).

Ce résultat indique que le point d'initiation de la transcription d'ethA et les sites de reconnaissance de l'ARN polymérase chevauchent l'opérateur de ethA (Figure 3C).

Lorsque la séquence en amont du point d'initiation de la transcription d'ethA a été comparée avec d'autres séquences promotrices mycobactériennes, aucune boîte conservée-10 ou-35 putative n'a pu être identifiée (Figure 3C). Le promoteur d'ethA ne ressemble pas au consensus de #70 de E. coli et donc devrait être classé dans le groupe C des promoteurs régulés proposés par Gomez et Smith (2000).

B.5. Stoechiométrie de l'interaction entre His6-EthR et la région intergénique ethA-R Un fragment d'ADN double brin biotinylé de 106 pb (Figure 4A ; IG-106) chevauchant la région intergénique ethA-R a été utilisé comme ligand pour mesurer la stoechiométrie de liaison de His6-EthR par résonance plasmonique de surface (SPR).

Des concentrations croissantes de His6-EthR ont été injectées sur une cellule Sensor Chip fonctionnalisée par 205 RU de fragment d'ADN biotinylé jusqu'à saturation du ligand à l'équilibre (Figure 4B). Etant donné que His6-EthR a un Mr calculé de 25 920 et que 205 RU de fragment d'ADN (69 k Da) ont été fixées sur la surface de la cellule Sensor Chip, le rapport His6-EthR : ADN a été estimé à l'aide de l'équation 1 pour chaque concentration de His6-EthR. Une stoechiométrie de 8 molécules de His6EthR par molécule d'ADN a été déduite. De manière intéressante, cette stoechiométrie était très rapidement atteinte à un seuil de concentration de His6-EthR (Figure 4C).

Cette expérience a été répétée en utilisant un fragment d'ADN double brin biotinylé de 62 pb (Figure 4A ; IG-62) chevauchant la région de 55 pb identifiée par les expériences d'empreinte à la DNase I. Une stoechiométrie identique de 8 molécules de His6-EthR par molécule d'ADN a été mesurée (Figure 4D), confirmant que toutes les molécules de répresseur se lient dans la région protégée par la DNAse I.

En supposant qu'un homo-octamère a de grandes chances de présenter une certaine symétrie de liaison, le centre de la région protégée par la DNase 1 (le G en position 32 de la région intergénique ethA-R) semble scinder deux copies d'une longue répétition directe (T-C-A-A-C-G-t/a-a/g- A-T-G-T-C-G-A; SEQ ID N 26 et 27) qui comprend elle-même des répétitions inversées imparfaites (bases en italique, Figure 4A).

Lorsqu'un fragment de 37 pb (Figure 4A, IG-37) chevauchant ces deux répétitions directes était fixé sur la surface de la cellule Sensor chip, une

liaison coopérative d'en moyenne 4,5 molécules de His6-EthR par molécule d'ADN a été observée (Figure 4E).

Lorsqu'un fragment PCR de 36 pb (Figure 4A ; IG-36) chevauchant les deux répétitions inversées pratiquement parfaites (T-A-a/g-T-G-T-C-G-A) centrées sur la base 34 était utilisé, la liaison de His6-EthR était fortement réduite (Figure 4F).

B.6. Détermination du coefficient de Hill (nH) et du KD de l'interaction entre His6-EthR et la région intergénique ethA-R Afin d'évaluer l'affinité de His6-EthR pour la région intergénique ethA-R, des analyses de l'interaction à l'équilibre ont été effectuées. 100 RU du fragment d'ADN biotinylé de 106 pb mentionné ci-dessus (IG-106) ont été immobilisées sur une cellule Sensor Chip. Cette faible quantité d'ADN immobilisé a permis à la protéine d'atteindre un équilibre de liaison pour une plus large plage de concentrations de protéines (de 0,1 à 2 M) dans le volume maximal d'injection possible pour l'appareil BIAcore 2000'. Dans ces conditions, la capacité de la cellule Sensor Chip a été estimée à Rmax = 225 RU, ce qui correspond à la même stoechiométrie de 8 molécules His6-EthR que celle déduite des analyses SPR précédentes (voir paragraphe B.5). La saturation fractionnaire de l'ADN à l'équilibre Req/Rmax (où Req est la valeur de RU mesurée à l'équilibre) a été déterminée pour chaque concentration de protéines. La fonction de Hill (Fersht, 1985), a été reportée comme une fonction du log de [His6-EthR] (Figure 5). L'analyse de la partie linéaire de la fonction de Hill (de 0,2 à 0,8) par régression linéaire (R2= 0,9904) a fourni une constante de liaison globale à l'équilibre (Ko) de 146 nM et un coefficient de Hill (nH) de 3,46. La valeur de Ko représente une valeur moyenne pour les 8 sites de liaison. La valeur théorique maximale du coefficient de Hill est 8 et correspond au nombre de sites de liaison de His6-EthR. La valeur du coefficient de Hill de 3,46, supérieure à 1, indique une liaison coopérative de His6-EthR sur la sonde d'ADN (Fersht, 1985).

B.7. Nécessité de la présence de l'opérateur pour l'octomérisation de His 6-EthR Les expériences de SPR décrites ci-dessus (voir paragraphe B. 5) ont indiqué que EthR se lie de manière coopérative sous la forme d'un homooctamère à l'opérateur d'ethA.

Afin de déterminer si la multimérisation de EthR nécessite la présence de cette cible d'ADN, Hiss-EthR a été soumis à une chromatographie analytique d'exclusion de taille sur une colonne Superdex 200 HR 10/30 en présence d'un fragment PCR de 94 pb contenant la région intergénique ethA-R (voir matériels et méthodes, partie A supra).

Le fragment d'ADN de 94 pb éluait sous la forme d'un pic simple avec une absorbance maximale à 260 nm à un volume d'élution (Ve) de 11,11 ml (Figure 6A). L'ajout de faibles quantités de Hiss-EthR purifié au fragment d'ADN de 94 pb a entraîné l'élution d'un pic simple avec une absorbance maximale à 260 nm à un Ve de 10,27 ml (Figure 6 B). Comme ces résultats ont été obtenus dans les mêmes conditions salines que celles utilisées pour les analyses SPR, le volume d'élution décroissant de l'ADN en présence de His6-EthR correspond très certainement à une augmentation de la masse moléculaire du complexe d'ADN de 94 pb du fait de la liaison de l'octamère protéique au site opérateur. L'ajout de concentrations croissantes de His6-EthR au fragment d'ADN a conduit à l'apparition progressive d'un pic additionnel éluant 15,30 ml après la charge, avec une absorbance maximale à 280 nm (Figures 6C et 6D). Ce pic correspond à une molécule qui présente un rayon de Stokes pratiquement équivalent à celui du standard de masse moléculaire chymotrypsinogène A (25 000 Da) (Amersham Biosciences). Ces données ont été confirmées en déterminant le volume d'élution de HiS6-EthR en l'absence de fragment d'ADN (Figure 6E), et suggèrent fortement que, dans des conditions in vitro qui permettent à His6-EthR de se lier à son opérateur, le répresseur non lié n'adopte pas une grosse forme

multimérique, mais plutôt une forme monomérique. Cependant, étant donné que la chromatographie d'exclusion de taille est fondée sur le rayon de Stokes plutôt que sur la masse moléculaire perse, le fait que HiS6-EthR se dimérise en solution en l'absence de son site opérateur ne peut être exclu.

B.8. Oligomérisation de EthR in vivo Afin de déterminer si EthR peut se dimériser en l'absence de son ADN cible, le système double hybride bactérien (BACTH) a été utilisé (Karimova et aL, 1998). Dans ce système, l'interaction de deux protéines entraîne une complémentation fonctionnelle entre les deux domaines de l'adénylate cyclase (CyaA) de Bordetella pertussis, conduisant à la synthèse d'AMPc. En tant que molécule de régulation soluble, AMPc est ensuite capable d'activer la transcription de gènes AMPc dépendants. ethR a ainsi été cloné en phase avec la région codant le domaine de 25 kDa de CyaA, donnant pT25-EthR. ethR a ensuite été fusionné avec la région codant le domaine de 18 kDa de CyaA de manière à produire pT18-EthR. Une souche de E. coli cyclase-déficiente (DHP1) (Karimova et al., 1998), a été transformée avec des combinaisons différentes de plasmides (Figure 7). Lorsqu'elles étaient co-transformées avec pT25EthR et pT18-EthR, les colonies retrouvaient leur capacité à pousser sur milieu minimum enrichi en maltose. Aucun des clones obtenus par la cotransformation des divers plasmides contrôles n'était capable de pousser, démontrant que la complémentation fonctionnelle de T25-EthR et T18EthR était spécifiquement liée à l'interaction de deux molécules de EthR (Figure 7). Puisqu'aucun ADN homologue à l'opérateur de EthR n'a été détecté dans le génome de E. coli, ce résultat suggère que EthR est un dimère lorsqu'il n'est pas lié à son opérateur.

Il- Purification et cristallisation du répresseur His6-EthR :

A. Préparation de la protéine His6-EthR L'entièreté de l'ORF codant le répresseur EthR de M. tuberculosis a été sous-cloné dans le vecteur d'expression pET15b (Novagen) afin de permettre la production de la protéine fusionnée à un tag-Histidine6 aminoterminal. E. coli BL21 (DE3) a été transformé et les clones recombinants ont été sélectionnés sur LB contenant 100 pg/ml d'ampicilline. Cinq ml de LB contenant 100mg/ml d'ampicilline ont été inoculés avec

E.coli BL21 (DE3)(pET15b-His6EthR) et mis en culture sous agitation à 37 C durant une nuit. La préculture a été utilisée pour inoculer 2 litres de milieu LB à une D0600 de 0,1. A D06oo = 0,6-0,7, l'expression de ethR a été induite par addition de 1 mM IPTG. Après 2 heures d'induction à 37 C, les bactéries ont été récupérées par centrifugation à 7500 tr/min, avec une centrifugeuse Sorval RC 5B PLUS, rotor SS-34. Le culot bactérien a ensuite été congelé à -20 C. Le culot a été resuspendu dans 10 ml de tampon A (50 mM Tris, pH 7,5,10 mM imidazole, 250 mM NaCI) puis lysé par passage à la presse de French (Bioritech) sous une pression de 6,2 x 106 Pa. Le lysat a été centrifugé 30 minutes à 4 C à 18000 tr/min dans une centrifugeuse Sorvall RC-5B PLUS, rotor SLA-3000 et le surnageant récupéré.

25 ml de résine d'affinité (chelating Sepharose Fast Flow - Amersham Biosciences) ont été lavés par 5ml d'eau bidistillée, puis chargés en Nickel par ajout de 5 volumes de NiS04 100mM. La résine a été lavée avec 5 volumes d'eau bidistillée et équilibrée avec 5 volumes de tampon A. La résine a été chargée sur une colonne jetable. Le surnageant de lyse bactérienne a été chargé sur la colonne d'affinité à un débit de 2 ml/min à l'aide d'une pompe péristaltique P-3 (Pharmacia Biosciences).

La colonne a été lavée par passage de 10 volumes de tampon 50 mM Tris pH 7,5 ; 50 mM imidazole ; 250 mM NaCI. La protéine His6-EthR a été éluée par 1,5 volume de tampon d'élution (50 mM Tris pH 7,5 ; 250 mM imidazole ; 250 mM NaCI). Les fractions récupérées ont été analysées sur gel SDS-PAGE à 12,5%. Les fractions présentant une pureté suffisante

ont été groupées et dialysées 2 fois dans 10 mM Tris pH 7,5 ; mM NaCI, à 4 C. La solution a ensuite été concentrée sur colonne Centriplus YM-3 (Amicon), puis par Macrosep 3K (Pall), afin d'atteindre une concentration finale de 50mg/ml de protéine.

Cristallisation : La cristallisation a été réalisée à 20 C,par la méthode de la goutte suspendue en diffusion de vapeur (2 l de solution de protéine, 2 l de solution de précipitant et 0,75 ml de réservoir). Des cristaux d'His6- EthR ont été obtenus en 7-10 jours avec la solution 15 du Cryokit de cristallisation pour protéines (Sigma) (0,17 M sulfate d'ammonium ; 0,085 M Na-cacodylate pH 6,5 ; 15%glycérol ; 25,5% PEG8000). Ces cristaux sont dénommés forme 2 dans la suite du protocole.

B. Marquage de la protéine EthR par des méthionines séléniées E.coli BL21(DE3)(pET15b-His6EthR) a été cultivé à 37 C dans 2 litres de milieu M9 contenant 6 g/l de Na2HP04, 3 g/l de KH2P04, 0,5 g/l de NaCI ; et additionnés, au départ de la culture, de 4 g/l de glucose, 1 g/l de NH4CI, 2 ml de MgS04 1 M, 2 ml de CaCl2 100 mM, 20 ml du mélange de vitamines MEM (Sigma) et d'ampicilline à 100 mg/l., La voie de biosynthèse de la méthionine de E.coli BL21 (DE3)(pET15b-His6EthR) a été bloquée à D06oo= 0,5 (Doublie, 1997), par ajout d'acides aminés inhibant les aspartokinases: lysine à 100 mgll, thréonine à 100 mg/l, phénylalanine à 100mg/l, leucine à 50 mg/l, isoleucine à 50 mg/l, valine à 50 mg/l et sélénométhionine à 75 mg/l. L'incubation à 37 C a été poursuivie pour atteindre une DO600=0,6, puis 1 mM d'IPTG a été ajouté afin d'induire l'expression d'ethR. La culture a été agitée à 37 C pendant 3 heures supplémentaires. Le culot bactérien, récupéré par centrifugation à 7500 tr/min dans une centrifugeuse Sorvall RC-5B PLUS, rotor SLA-3000, a été resuspendu dans 20 ml de tampon de lyse (50 mM Tris pH 7,5,10 mM imidazole, 250 mM NaCI). 1 ml de mélange anti-protéasique

Complete (Roche) a été ajouté avant de casser les bactéries à la presse de French. Le lysat a été centrifugé à 18000 tr/min, 30 minutes, à 4 C, avec une centrifugeuse Sorvall RC-SB PLUS, rotor SS-34. Le surnageant a été chargé à l'aide d'une pompe péristaltique P-3 (Amersham Biosciences) sur 25 ml de résine d'affinité (Chelating Sepharose Fast Flow- Amersham Biosciences) pré-équilibrée par 5 volumes de tampon de lyse. La protéine His6-EthR a été éluée par 1,5 volume de tampon d'élution (50 mM Tris pH 7,5,250 mM imidazole, 250 mM NaCI). Les fractions récupérées ont été supplémentées par 10 mM de Dithiothreitol (DTT), 0,2 mM d'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), puis analysées par gel SDS-PAGE 12,5% coloré au bleu de Coomassie. Les fractions pures ont été regroupées et dialysées 2 fois contre 10 mM de Tris, pH 7,5,200 mM de NaCI, 10 mM de DTT et 0,2 mM d'EDTA. La solution a ensuite été concentrée comme décrit ci-avant pour atteindre une concentration spectrale de 10 mg/ml, puis stockée à -80 C.

Cristallisation de EthR-sélénométhionine : Avant d'être utilisée pour la cristallisation, His6-EthR/met-sél a été décongelée sur glace et concentrée à 50 mg/ml à l'aide de microcons 3K (Amicon), à 4 C. La protéine séléniée a été cristallisée par la méthode des gouttes suspendues en diffusion de vapeur (2 l de solution de protéine, 2 l de solution de précipitant, 0,75 ml de réservoir), à une température de 20 C. Des cristaux sont apparus entre 7 et 10 jours dans les gouttes contenant 0,17 M sulfate d'ammonium (Fluka), 0,085 M Na-cacodylate pH 6,5 (Sigma), 15% glycérol (ICN) et 25% de polyéthyléne glycol 8000 (Fluka).

Ces cristaux ont été utilisés pour déterminer la structure tridimensionnelle d' His6-EthR/met-sél. Ils sont dénommés cristaux de forme 1 dans la suite du protocole.

C- Obtention d'une seconde forme cristalline Des essais de co-cristallisation ont été réalisés à partir de la protéine His6EthR/met-sél en présence de 5 fragments différents d'ADN longs de 15 pb et couvrant la zone de fixation de la protéine sur l'opérateur de ethA (voir section # supra). La protéine a été décongelée sur glace et concentrée à 50 mg/ml. Le ratio protéine-ADN a été fixé à 2 :1. Le mélange a été soumis à la co-cristallisation par la méthode des gouttes suspendues en diffusion de vapeur (1 l de solution de protéine, 1 l de solution d'ADN, 2 l d'agents cristallisants, 0,75 ml de réservoir), à une température de 20 C. Des cristaux ont été obtenus après 2 à 3 jours d'incubation, pour le mélange His6-EthR/met-sél / fragment 1 d'ADN (SEQ ID N 28) avec une solution de cristallisation contenant 0,17 M sulfate d'ammonium (Fluka), 0,085 M Na-cacodylate pH 6,5 (Sigma), 15% glycérol (ICN) et 35% PEG8000 (Fluka). Ces cristaux sont dénommés forme 3 dans la suite du protocole.

D- Acquisition des données de diffraction et détermination de la structure d'EthR Les cristaux de la forme 1 (cristaux élaborés à partir de protéine His6EthR/met-sél contenant des sélénométhionines) ont été utilisés pour déterminer la structure cristallographique.

L'acquisition des données de diffraction a été réalisée sur la ligne de lumière BM14 au synchrotron européen de Grenoble (ESRF).

La procédure d'acquisition des données et de détermination de la structure a été la suivante.

Un cristal de la forme 1 a été congelé à l'aide d'un système de cryogénie de marque Oxford. Les données de diffraction ont été mesurées par un détecteur de type CCD, de marque Marresearch, de 133 mm de diamètre, positionné à 150 mm du cristal. Les clichés de diffraction ont été

enregistrés pour une oscillation du cristal de 1 . Le temps d'exposition par cliché a été réglé sur 20 secondes. 360 images ont été mesurées à la longueur d'onde de 0,97865A. La matrice d'orientation du cristal dans le faisceau de rayons X a été déterminée avec le logiciel XDS. Les données de diffraction ont été intégrées et réduites avec le même logiciel. Les cristaux obtenus appartiennent au groupe d'espace P21212 (Figure 8) et présentent les paramètres de maille suivants :a=57,57 A ; b=85,94 A; c=100,41 A. Ils contiennent deux monomères par unité asymétrique.

Comme le montre la Figure 8, la structure révèle deux monomères du répresseur EthR associés en un dimère symétrique. Les monomères sont associés par leur domaine de fixation du ligand. Le cristal a révélé la présence d'une molécule de ligand par monomère, enchassée dans un tunnel formé par les hélices a4, a5, a6, a7, a8 et a8' (provenant du second monomère). Les centres des domaines HTH ( hélice-tourhélice ) de fixation à l'ADN de cette structure sont distants de 48 A.

La détermination des phases associées à chaque facteur de structure a été déterminée par la méthode SAD ( Single Wavelength Anomalous Diffraction ). Cette méthode est basée sur l'utilisation du signal anomal du sélénium incorporé dans la protéine via les sélénométhionines (voir préparation des cristaux de forme 1). Ce signal est maximal à la longueur d'onde employée (0,97865 A), longueur d'onde sélectionnée sur base d'une analyse d'émission de fluorescence par les cristaux. La position des atomes de sélénium dans l'unité asymétrique du cristal a été déterminée avec le logiciel Shelxd. Ces positions ont été affinées et les phases initiales calculées avec le logiciel Sharp. Les phases ont ensuite été améliorées par des procédures de modification de densité électronique implémentées dans les logiciels Solomon et Dm, de la suite de logiciels CCP4. Le modèle moléculaire a été initialement construit avec le logiciel Arp/Warp et le logiciel TURBO-FRODO. La structure finale a été obtenue par minimisation en énergie (procédure d'affinement) avec le logiciel CNS et inspectée manuellement avec le logiciel TURBO-FRODO. Les

paramètres décrivant la topologie du ligand d'EthR ont été obtenus avec le logiciel HIC-UP.

Les cristaux de la forme 2 sont semblables aux cristaux de la forme 1.

Ceux-ci ont cependant été obtenus avec de la protéine recombinante non séléniée. Les conditions de cristallisation sont identiques, mais la provenance des solutions de cristallisation est différente. L'acquisition des données de diffraction a été réalisée à l'Institut de Biologie de Lille, en utilisant l'équipement du laboratoire de cristallographie macromoléculaire.

Un cristal de la forme 2 a été congelé à l'aide d'un système de cryogénie de marque Oxford. Les données de diffraction ont été mesurées par un détecteur de type Imaging Plate, de marque Marresearch, de 345 mm de diamètre, positionné à 250 mm du cristal. Les clichés de diffraction ont été enregistrés pour une oscillation du cristal de 1 . Le temps d'exposition par cliché a été réglé sur 120 secondes. 180 images ont été mesurées à la longueur d'onde de 1,5418 A. La matrice d'orientation du cristal dans le faisceau de rayons X a été déterminée avec le logiciel XDS. Les données de diffraction ont été intégrées et réduites avec le même logiciel.

Les phases associées à chaque facteur de structure ont été déterminées par positionnement isomorphe du modèle moléculaire d' His6-EthR/met-sél (obtenu à partir des cristaux de type 1). La structure finale a été obtenue par minimisation en énergie (procédure d'affinement) avec le logiciel CNS et inspectée manuellement avec le logiciel TURBO-FRODO. Les paramètres décrivant la topologie du ligand d'EthR ont été obtenus avec le logiciel HIC-UP.

Les cristaux de la forme 3 appartiennent au groupe d'espace P41212, avec les paramètres de maille suivants: a=122,2 A; b=122,2 A ; c=33,6A.

Ceux-ci ont été obtenus avec de la protéine recombinante séléniée (Hise- EthR/met-sél). L'acquisition des données de diffraction a été réalisée à l'Institut de Biologie de Lille, en utilisant l'équipement du laboratoire de

cristallographie macromoléculaire. La procédure d'acquisition des données et de détermination de la structure a été la suivante.

Un cristal de la forme 3 a été congelé à l'aide d'un système de cryogénie de marque Oxford. Les données de diffraction ont été mesurées par un détecteur de type Imaging Plate, de marque Marresearch, de 345 mm de diamètre, positionné à 250 mm du cristal. Les clichés de diffraction ont été enregistrés pour une oscillation du cristal de 1 . Le temps d'exposition par cliché a été réglé sur 600 secondes. 100 images ont été mesurées à la longueur d'onde de 1,5418 A. La matrice d'orientation du cristal dans le faisceau de rayons X a été déterminée avec le logiciel XDS. Les données de diffraction ont été intégrées et réduites avec le même logiciel. La détermination des phases associées à chaque facteur de structure a été effectuée par la méthode du remplacement moléculaire (implémentée dans le logiciel AMoRe) en utilisant comme modèle la structure d'EthR obtenue à partir des cristaux de type 1. La structure finale a été obtenue par minimisation en énergie (procédure d'affinement) avec le logiciel CNS et inspectée manuellement avec le logiciel TURBO-FRODO. Les paramètres décrivant la topologie du ligand d'EthR ont été obtenus avec le logiciel HIC-UP. Les cristaux de la forme 3 ne contiennent qu'un monomère par unité asymétrique, confirmant la symétrie stricte d'ordre deux dans l'homodimère d'EthR en présence d'un inducteur lipophile.

E. Analyse de la structure L'analyse de la structure de EthR confirme l'appartenance de ce répresseur transcriptionnel à la famille dénommée TetR/CamR . A l'heure actuelle, les structures de deux membres de cette famille, TetR et QacR, ont été déterminées, dans les conformations induites et non induites. TetR est le répresseur transcriptionnel de TetA, protéine responsable de la résistance à la tétracycline chez les bactéries à gram négatif. La fonction de répression de TetR est inhibée par la tétracycline,

qui se fixe de manière symétrique à chaque monomère sur l'homodimère TetR. QacR est le répresseur transcriptionnel de QacA, protéine responsable, chez Staphylococcus aureus, de la résistance à de nombreux antiseptiques et désinfectants. QacR et TetR sont des homodimères, de topologie différente bien que composés tous deux uniquement d'hélices alpha.

EthR, tout comme TetR et QacR, est un homodimère. Chaque monomère présente une topologie semblable à celle de QacR et se compose de 9 hélices alpha. Les trois hélices N terminales de chaque monomère composent le motif de fixation à l'ADN de type HTH. Les 6 autres hélices a composent le domaine de fixation du ligand ainsi que la zone de dimérisation.

Les termes ligand et inducteur sont ici synonymes et renvoient à la définition donnée précédemment. En outre, la forme ligandée ou induite du répresseur EthR correspond au répresseur lié à un ligand .

Les changements de conformation résultant de la fixation de ligands sur QacR ont été décrits. La fixation des ligands provoque des modifications de conformation qui aboutissent à une réorientation relative des deux domaines HTH au sein du dimère. Cette réorientation produit un écartement des motifs HTH de telle sorte que ceux-ci ne puissent plus se fixer dans le sillon majeur de la molécule d'ADN cible. La fixation des ligands à QacR produit une transition tour-hélice qui prolonge l'hélice alpha 5. Ce mouvement se répercute sur les hélices environnantes. Il est à noter qu'une seule molécule de ligand se fixe par dimère de QacR, résultant en un dimère asymétrique. Le monomère sur lequel le ligand se fixe subit le changement conformation nele plus drastique (élongation de l'hélice alpha 5, et répercussion sur les hélices adjacentes). Cependant, la fixation d'un ligand dans un monomère affecte dans une moindre mesure la conformation du second monomère du répresseur, le signal se propageant via la zone de dimérisation. Globalement, ces modifications de

conformation provoquent une augmentation de la distance centre à centre de l'hélice de reconnaissance des deux motifs HTH de 37 A (forme libre ou liée à l'ADN) à 48 A (forme ligandée ou induite en présence de ligands). Cette augmentation de distance explique l'incapacité de fixation de la forme induite de QacR à l'ADN.

Les trois formes cristallines d'EthR obtenues révèlent toutes la présence d'un ligand lipophile associé à chaque sous-unité du dimère. Cette forme induite d'EthR avec son ligand lipophile révèle des caractéristiques structurales similaires à celles observées dans la structure de QacR sous la forme induite. L'hélice alpha 5 de EthR présente une longueur similaire à l'hélice alpha 5 de QacR dans le monomère fixant le ligand. La séparation des motifs HTH dans EthR est également de l'ordre de 48 A ce qui, par analogie à QacR, devrait empêcher la fixation de la forme induite d'EthR sur son ADN cible. Cependant, le domaine de fixation du ligand de EthR est unique et ne présente pas d'analogie moléculaire avec celui de QacR. Le site de fixation du ligand chez EthR traverse le domaine défini par les hélices alpha 4 à alpha 9. Il est délimité par les hélices a4, a5, a6, a7, a8 et a8' (provenant du second monomère) et se présente sous la forme d'un tunnel se prolongeant parallèlement aux hélices a4, a5 et a7. Une autre différence est le fait que EthR fixe un ligand par monomère, de manière symétrique, au contraire de QacR qui ne fixe qu'un seul ligand par dimère. Il apparaît dès lors que deux ligands sont nécessaires dans EthR pour induire la séparation des motifs HTH de manière similaire à celle observée dans QacR.

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Claims

REVENDICATIONS 1. Procédé de sélection d'un composé capable de se lier au répresseur mycobactérien EthR, cette liaison empêchant ledit répresseur EthR de réprimer l'expression du gène mycobactérien ethA codant un activateur EthA de l'éthionamide, ledit procédé comprenant au moins : a) le clonage du gène codant ledit répresseur EthR sur un premier plasmide d'expression recombinant, et le clonage d'au moins la région promotrice et opératrice du gène ethA en amont d'un gène rapporteur sur un second plasmide d'expression recombinant ; b) la transformation d'une cellule hôte recombinante avec au moins les plasmides selon l'étape a) ; c) la culture de ladite cellule hôte recombinante en présence d'un composé candidat ; d) la mesure du niveau N1 d'expression du gène rapporteur en présence dudit composé candidat ; e) la comparaison du niveau N1 mesuré à l'étape d) avec le niveau No d'expression du gène rapporteur en l'absence dudit composé candidat ; et f) si N1 est significativement supérieur à No, la sélection du composé.
2. Procédé de sélection d'un composé capable de se lier au répresseur mycobactérien EthR, cette liaison empêchant ledit répresseur EthR de réprimer l'expression du gène mycobactérien ethA codant un activateur EthA de l'éthionamide, ledit procédé comprenant au moins : a) le clonage du gène codant ledit répresseur EthR, et le clonage d'au moins la région promotrice et opératrice du gène ethA en amont d'un gène rapporteur, sur un plasmide d'expression recombinant ; b) la transformation d'une cellule hôte recombinante avec au moins le plasmide issu del'étape a) ;

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c) la culture de ladite cellule hôte recombinante en présence d'un composé candidat ; d) la mesure du niveau N1 d'expression du gène rapporteur en présence dudit composé candidat ; e) la comparaison du niveau Ni mesuré à l'étape d) avec le niveau No d'expression du gène rapporteur en l'absence dudit composé candidat ; et f) si N1 est significativement supérieur à No, la sélection du composé.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ladite région promotrice et opératrice du gène ethA comprend au moins la séquence SEQ ID N 1, de préférence la séquence SEQ ID N 2, de manière encore préférée la séquence SEQ ID N 3.
4. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce le plasmide d'expression recombinant contenant ledit gène codant le répresseur EthR est pMV261-ethR.
5. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ledit gène rapporteur est choisi parmi lacZ, xylE, gfp, lux et le gène codant la glucuronidase.
6. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le plasmide d'expression recombinant contenant au moins ladite région promotrice et opératrice du gène ethA en amont d'un gène rapporteur est pBSh-PethA - lacZ.
7. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ladite cellule hôte recombinante est une cellule mycobactérienne, de préférence une cellule de Mycobacterium bovis, M. smegmatis, M. tuberculosis ou M. leprae.

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8. Procédé selon lequel la revendication 7, caractérisé en ce que ladite cellule est une cellule de M. bovis BCG 1173P2 ou de M. smegmatis mc2155.
9. Procédé de sélection d'un composé capable de se lier au répresseur mycobactérien EthR, cette liaison empêchant ledit répresseur EthR de réprimer l'expression du gène mycobactérien ethA codant un activateur EthA de l'éthionamide, ledit procédé comprenant au moins : a) la détermination du niveau Li de liaison du répresseur EthR sur au moins la région promotrice et opératrice du gène ethA, en présence d'un composé candidat ; b) la comparaison du niveau L1 avec le niveau Lo de liaison du répresseur

EthR sur au moins la région promotrice et opératrice du gène ethA, en l'absence dudit composé candidat ; et c) si Li est significativement inférieur à Lo, la sélection du composé.
10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que ladite détection est réalisée à l'aide d'une méthode choisie parmi la résonance plasmonique de surface, la détection de la fluorescence naturelle et le transfert d'énergie par résonance de fluorescence.