WO2005043166A1

WO2005043166A1 - 子宮腺癌の診断薬及び腺癌細胞の検出方法

Info

Publication number: WO2005043166A1
Application number: PCT/JP2004/015784
Authority: WO
Inventors: Koichi Nakano; Miharu Watanabe
Original assignee: Sysmex Corp
Current assignee: Sysmex Corp
Priority date: 2003-10-30
Filing date: 2004-10-25
Publication date: 2005-05-12
Anticipated expiration: 2006-04-30
Also published as: EP1698899A4; JPWO2005043166A1; US20070134742A1; EP1698899A1

Abstract

　細胞診用に採取された子宮頸部細胞群から、腺癌細胞の有無を判定できる診断薬、特に扁平上皮癌細胞と区別して腺癌を特異的に検出できる診断薬又は診断薬キット、及び腺癌細胞の検出方法を提供する。子宮頸部細胞群のうち腺癌細胞に最も多く含まれるサイトケラチン８をサイトケラチン８抗体又はこの二次抗体を用いて腺癌細胞を検出する。ＨＩＫ１０８３抗体を併用することにより、検出感度を上げることができる。対象とする検体は、子宮頸部組織であってもよいし、個々に分散された細胞群であってもよい。

Description

明細書

子宮腺癌の診断薬及び腺癌細胞の検出方法

技術分野

[0001] 本発明は、子宮頸部の細胞群から腺癌細胞の有無を特異的に検出する腺癌診断薬及び腺癌細胞の検出方法に関する。

背景技術

[0002] 子宮頸部癌は、扁平上皮癌と腺癌に分類され、子宮頸部癌の 95%は扁平上皮癌であると言われているが、近年腺癌の比率が増加しつつある。腺癌は比較的若年者層に多発し、予後が悪いため臨床上問題となっている（Lea JS, Sheets EE, Wenham RM, Duska LR, Coleman RL, Miller DS, Schorge JO.

Gynecol Oncol. 2002 ; 84 (1) : 115— 119. )。

[0003] 一般的な細胞診、すなわちパパニコロウ染色で細胞を染色し、その形態から悪性度を判定する方法では、腺癌細胞が正常と悪性細胞の形態が類似しているため、腺癌を見つけ出すことは困難である（Channg WC, Matisic JP, Zhou C, Thorns on T, Clement PB, Hayes MM. Cancer. 1999 ; 87 (1) : 5— 11. ) (Gallup DG, Harper RH, Stock RJ. Gynecol. 1985 ; 65 (3) : 416—422.；)。このため、腺癌については見逃されやすぐ細胞診では陰性と判定されたにもかかわらず、症状と局所所見から腺癌の可能性が高!ヽ場合が多ヽ。

[0004] 病理組織診では、癌細胞による細胞配列での乱れなどを観察することができるため、細胞診より発見の度合いが高いが、生検の採取には痛みを伴うため、単なる健康診断レベルには適用できな、。

[0005] 一方、細胞診であっても、癌細胞に特異的なマーカーが存在すればより適格な診断が可能となる。子宮癌に関する腫瘍マーカーとしては、従来より SCC (squamous cell carcinoma)がよく知られている。 SCCは、扁平上皮癌組織より抽出された S CC抗原であり、この SCC抗原に対する SCC抗体は、扁平上皮癌の検出に対して有効である。しかしながら、 SCC抗体は腺癌に対する陽性率は低ぐまた腺癌に対して特異的ではないため、扁平上皮癌と区別することはできない。また、早期癌に対する陽性率も高くないので、早期発見を主目的とする検診用診断薬としては、有効とは言い難い。

[0006] この他、細胞内に存在する繊維状タンパクであるサイトケラチンをマーカーとして、このケラチンマーカーに直接結合できるサイトケラチン抗体を診断薬として利用することが提案されてヽる (特許文献 1)。

[0007] 例えば、非特許文献 1には、サイトケラチン 8抗体を用いて大腸癌を検出することが開示されている。また、特許文献 2には、サイトケラチン 19と結合するモノクローナル抗体を用いる子宮癌検出試薬が開示されている。しかし、サイトケラチン 19は、腺癌細胞のみならず、扁平上皮癌とも反応するため、扁平上皮癌と腺癌の区別には用いることができない。

[0008] 特許文献 1： USP4775620

特許文献 2 :USP5288614

非特許文献 l : Makin CA, Bobrow LG, Bodmer WF. Monoclonal ant ibody to cytokeratin for use in routine histopathology. J Clin Pat hoi. 1984 ; 37 (9) : 975-983.

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0009] 本発明は、以上のような事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、細胞診用に採取された子宮頸部細胞群から、腺癌細胞の有無を判定できる診断薬、特に扁平上皮癌細胞と区別して腺癌を特異的に検出できる診断薬又は診断薬キット、及び腺癌細胞の検出方法を提供することにある。

課題を解決するための手段

[0010] 本発明の腺癌診断薬は、子宮頸部細胞群の検体から腺癌の有無を診断するための試薬であって、サイトケラチン 8抗体を含有する。さらに HIK1083抗体を含有してちょい。

[0011] 本発明の子宮腺癌の試薬キットは、サイトケラチン 8抗体を含有する第 1試薬、及びサイトケラチン 8抗体に結合可能で且つ標識されている 2次抗体を含有する第 2試薬を含む。 [0012] 本発明の腺癌細胞の検出方法は、子宫頸部細胞群の検体から腺癌細胞を検出する方法であって、前記細胞群とサイトケラチン 8抗体とを反応させる工程を含む。さらに、未反応液を除去して、細胞群を回収する工程;及び回収された細胞群から、前記サイトケラチン 8抗体と腺癌細胞の複合体を検出する工程を含んでもょ、。前記検体は、子宫頸部組織であってもよいし、個々に分散された細胞群であってもよい。

[0013] 本発明の分別方法は、扁平上皮癌細胞と腺癌細胞を含む子宮頸部細胞群の検体から、腺癌細胞を分別する方法であって、前記細胞群と標識されたサイトケラチン 8 抗体とを反応させる工程;及び前記サイトケラチン 8抗体と腺癌細胞の複合体を検出する工程を含む。

発明の効果

[0014] 本発明の診断薬及び診断薬キットは、腺癌細胞に特異的なマーカーであるサイトケラチン 8と結合できるサイトケラチン 8抗体を含有しているので、細胞形態的に類似している正常腺細胞と腺癌細胞を区別することができ、また扁平上皮癌細胞とも区別することができる。よって、本発明の診断薬又は診断薬キットを用いれば、組織診断はもちろん、個々の分散された細胞群力も腺癌細胞を特異的に検出することができる。

図面の簡単な説明

[0015] [図 1]子宮頸部腺癌を有する組織検体の蛍光顕微鏡写真 (200倍)である。

[図 2]子宮頸部腺癌を有する組織検体をへマトキシリンェォジン染色した顕微鏡写真 (200倍)である。

[図 3]正常子宮頸部扁平上皮組織の蛍光顕微鏡写真 (200倍)である。

[図 4]正常子宮頸部腺組織の蛍光顕微鏡写真 (200倍)である。

[図 5]子宫頸部腺癌細胞 (HeLa細胞）の蛍光顕微鏡写真 (400倍)である。

[図 6]子宫頸部扁平上皮癌細胞 (C33A細胞）の蛍光顕微鏡写真 (400倍)である。

[図 7]口腔粘膜の扁平上皮細胞の蛍光顕微鏡写真 (400倍)である。

発明を実施するための最良の形態

[0016] 本発明の子宮頸部腺癌診断薬は、サイトケラチン 8抗体を含む。

サイトケラチンは細胞質内繊維状構造物の一つで、その中の中間径フィラメントを形成するタンパク質群に属する。サイトケラチン 8は、腺癌細胞の他、扁平上皮癌細胞、正常な腺細胞、扁平上皮細胞にも含まれるが、その含有量は、腺癌細胞が圧倒的に多い。従って、サイトケラチン 8抗体は、腺癌細胞に優先特異的に結合するので、正常細胞、扁平上皮癌細胞の中から、腺癌細胞を検出することができる。

[0017] 本発明に用いられるサイトケラチン 8抗体は、サイトケラチン 8と結合できる部位を有する抗体であればよぐ Fcフラグメントの構造、 Fabの不変領域などは特に限定しない。例えば、ダコ 'サイトメーシヨン社から市販されている「抗ヒトサイトケラチン 8、 35H 11マウスモノクローナル抗体」を使用することができる。

[0018] 本発明の腺癌診断薬には、サイトケラチン 8抗体の溶媒として、生理食塩水、リン酸系緩衝液等が含有されることが好ましぐ具体的には、リン酸緩衝化生理食塩水（PB S)、界面活性剤入り PBS (例えば PBST)が好ましく用いられる。

[0019] また、本発明の診断薬には、サイトケラチン 8抗体の他、 HIK1083抗体を含有することができる。サイトケラチン 8抗体のみを用いた場合でも子宮頸部腺癌を検出できる力特に検体に粘液が大量に含まれている場合などには、サイトケラチン 8抗体と反応しにくい場合がある。この点、 HIK1083抗体は、卵巣癌細胞及び子宫頸部腺癌細胞の産生する粘液 (特殊なムチン）に対して特異的に反応する。よって、サイトケラチン 8抗体と HIK1083抗体との併用により、子宫頸部腺癌をほぼ 100%近く検出することが可能となる。

[0020] 本発明の診断薬は、サイトケラチン 8をマーカーとして腺癌細胞を検出するために、サイトケラチン 8抗体自体を標識してもよ!/、し、サイトケラチン 8抗体を一次抗体とし、この一次抗体と結合する二次抗体を標識してもよい。この場合、本発明の試薬は、サイトケラチン 8抗体を含有する第 1試薬、及び標識された二次抗体を含有する第 2試薬の組合わせ力もなる診断薬キットとなる。

[0021] 一次抗体 (サイトケラチン 8抗体)、二次抗体の標識としては、特に限定せず、蛍光物質、放射性物質、酵素など、従来より公知の標識ィ匕合物を用いることができる。

[0022] 本発明の診断薬又は診断薬キットは、サイトケラチン 8抗体と腺癌細胞との反応の特異性を高めるために、予め検体の組織表面を、特異性のないタンパク質 (例えば血清)で覆ってしまうことが好ましい。従って、本発明の診断薬又は診断薬キットは、サイトケラチン 8抗体の標的となるタンパク質以外のタンパク質に対する非特異的反応をブロックするための試薬 (ブロック試薬）と組合わせて用いることが好まし、。

[0023] ブロック試薬としては、特異性のな!、タンパク質、すなわち血清、 IgG、 BSA、スキムミルクなどを用いることができ、適宜生理食塩水等で希釈したものであってもよい。

[0024] 次に、本発明の腺癌検出方法について説明する。

本発明の腺癌細胞の検出方法は、検体をサイトケラチン 8抗体と反応する工程を含む。

[0025] 本発明の腺癌検出方法の対象となる検体は、子宮頸部細胞群であって、採取した組織であってもよ、し、個々の細胞に分散させた細胞群であってもよ、。

ここで、組織は粘液除去処理の必要はないが、分散された細胞群においては粘液除去処理を行うことが好ま U、。

[0026] 粘液除去方法としては特に限定しないが、細胞の形態等に影響を与えることがないようにすることが好ましい。例えば、本発明者が提案しているシスティン系化合物を用 V、て粘液を除去する方法を適用してもよ!、。

[0027] ここで、システィン系化合物としては、メチルシスティン、ァセチルシスティン、 L—システィンなどを用いることができ、システィン系化合物の溶媒として、水、生理食塩水、 P BS (リン酸緩衝ィ匕生理食塩水）、トリス等の緩衝液を用いることができる。システィン系化合物含有率は、 5質量％以上が好ましぐより好ましくは 10— 20質量％である。 5質量％未満では粘液除去作用が不十分だ力である。

[0028] 個々の細胞に分散する方法しては、細胞の形態を壊すことなく分散させることが好ましい。例えば、本発明者が提案している方法、アルデヒドィ匕合物等で安定ィ匕した後、プロテアーゼで処理することが好ましい。

[0029] アルデヒド化合物としては、パラホルムアルデヒド、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、またはこれらの混合物を用いることができ、アルデヒドィ匕合物の溶媒としては、アルデヒド基と反応しない溶媒であればよいが、好ましくは蒸留水、イオン交換水、精製水等の水が用いられる。他の成分として、ピクリン酸を 0. 1-0. 4質量％程度含有することが好ましい。ピクリン酸は、アルデヒド化合物の組織浸透性を増強することができる。 [0030] プロテアーゼとしては、トリプシン、プロナーゼ、ペプシン、エラスターゼ、コラゲナーゼなどが挙げられ、 1種又は 2種以上の組合わせを用いてもょ、。

これらのうち、コラゲナーゼが好ましく用いられる。消化力が弱い酵素では、分散化に必要な時間を比較的広い範囲内で決めることができるため、検体個々人の差異による適切な消化時間の差異が問題にならずに済む。コラゲナーゼの種類は特に限定せず、細菌性、動物性のいずれであってもよぐまた動物性コラゲナーゼについて、その基質特異性は特に限定しない。プロテアーゼの溶媒としては、プロテア一ゼを変性させない溶媒であればよいが、好ましくは、蒸留水、イオン交換水、精製水等の水が用いられる。プロテアーゼの濃度は、酵素の種類に応じて適宜決定される。一般に、トリプシンのように消化力の高い酵素では、 0. 05-0. 1質量％程度が好ましぐコラゲナーゼでは 0. 1-1. 0質量％程度が好ましい。

[0031] 検体をサイトケラチン 8抗体と反応させるにあたり、前処理として、ブロック試薬で非特異的反応が生じ得る検体のタンパク質をブロックしておくことが好ましい。

[0032] ブロック試薬としては、上記本発明の診断薬で挙げたような、血清、 IgG、 BSA、スキムミルク等を用いることができる。

[0033] 非特異的反応をブロックした検体を、サイトケラチン 8抗体と反応させる。ここで、検体が組織の場合には、組織表面にサイトケラチン 8抗体含有液と組織を接触させた状態で、 30分ほど、静置しておくだけでよい。

[0034] 検体が個々に分散された細胞群の場合には、サイトケラチン 8抗体含有液と細胞群とが均一になるように混和することにより反応させる。

反応後、過剰な抗体含有液を除去する。

[0035] サイトケラチン 8抗体自体が標識付けられて、る場合には、未反応のサイトケラチン

8抗体を除去した後、腺癌細胞とサイトケラチン 8抗体の結合物を、サイトケラチン 8抗体の標識に基づ、て検出すればょ、。

[0036] 一方、サイトケラチン 8抗体が標識されて、な、場合、別途標識化合物と反応させる必要がある。サイトケラチン 8抗体との結合部位を有し且つ標識ィ匕合物が結合された二次抗体と反応させ、標識に基づ!、てサイトケラチン 8抗体と腺癌細胞の複合体を検出する。 [0037] 本発明で用いることができる標識ィ匕合物は、特に限定しないが、 Cy3 (Amersham Life Science社の登録商標）等のシァニン系色素、フルォレセインイソチアシネー HFITC)、ローダミン、量子ドットなどの蛍光物質;金粒子などの光散乱物質;フェライトなどの吸光物質；ョード (¹²¾等の放射性物質；ペルォキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、 DAB (3, 3'—ジァミノベンチジンテトラヒドロクロライド）、グルコースォキシダーゼ等の酵素などが挙げられる。

[0038] 標識化合物 (二次抗体)を反応させた後、余分な標識液を除外し、標識に適した方法で観察する。例えば、蛍光標識であれば、蛍光を検出すればよい。

なお、各工程と工程の間で、適宜検体を洗浄することが好ましい。

[0039] 本発明の検出方法において、さらに HIK1083抗体と反応させる工程を含んでいてもよい。サイトケラチン 8抗体は、細胞骨格に対する抗体であり、粘液を産生する一部の細胞とは反応しにくい。一方、 HIK1083抗体は、癌細胞から産生される粘液と特異的に反応する。よって、サイトケラチン 8抗体と HIK1083抗体を併用することにより、癌細胞を 100%の効率で検出することが可能となる。また、サイトケラチン 8抗体と H IK1083抗体との併用により、検体たる細胞や組織の粘液除去状況等にそれ程、影響されることなぐ腺癌細胞を、高感度で検出することができる。

[0040] ここで、 HIK1083抗体とサイトケラチン 8抗体を併用する場合、サイトケラチン 8抗体との反応工程と、 HIK1083抗体との反応工程の順番は、特に限定しない。 HIK1 083抗体と反応させ、洗浄後、サイトケラチン 8抗体と反応させてもよいし、まずサイトケラチン 8抗体と反応させ、洗浄後、 HIK1083抗体と反応させてもよい。また、サイトケラチン 8抗体と HIK1083抗体の双方を含有する試薬を用いて、これを検体と反応させてちょい。

実施例

[0041] 〔サイトケラチン 8抗体の特異性〕

(1)免疫組織化学での検定

ヒト子宫腺癌の生検サンプルで、ホルマリンで固定したパラフィン包埋薄切標本の脱パラフィン処理を行った後、 100%キシレン中に、室温で 10分間静置した。次いで 100%エタノール中に、室温で 30秒間静置した後、 80%エタノール、続いて 70%ェタノール中で、それぞれ室温で 30秒間静置した。次に、蒸留水中に、室温で 30秒間静置した。

[0042] 1%ャギ血清を含む PBST(0. 05%Tween20を含有する PBS (リン酸緩衝生理食塩水)液）中で、室温で 10分間静置することにより、非特異的タンパク質をブロックした。

5 μ gZmlのサイトケラチン 8抗体含有液 (溶媒は 1%ャギ血清を含む PBST)を、サンプル上に静置し、室温にて 30分間静置して、抗体反応をさせた。

[0043] 反応後、未反応の抗体反応液を吸引除去した後、 PBST中で、室温で 5分間の振盪洗浄を 3回繰り返した。

[0044] 蛍光色素 Alexa488 (Molecular Probes社の商品名）で標識されたャギ由来の抗マウス IgGの F (ab)フラグメント（溶媒は 1%ャギ血清を含む PBST) 5 μ gZmlを

2

組織上に静置し、抗体反応をさせた。反応終了後、未反応の抗体含有液を吸引除去した後、 PBST中で、室温で 5分間の振盪洗浄を 3回行った。洗浄後、 50%マウンティングメディウムを含む PBSTを重層し、カバーグラスをかけて、蛍光顕微鏡で観察したところ、図 1に示す写真をえた。

[0045] 参考のために、同生検サンプルをへマトキシリンェォジンで染色した場合の写真を図 2に示す。

図 2からわ力るように、異常部位 (腺癌部分)では、核が大きくなつている。これと対応する図 1において、異常部位には蛍光で染色されたことが確認された。従って、サイトケラチン 8抗体は、正常な組織には反応せず、腺癌部分にだけ反応することがわかる。

[0046] (2)正常扁平上皮組織及び正常腺組織とサイトケラチン 8抗体での検定

採取した生検サンプルで、正常扁平上皮組織及び正常腺組織について、上記と同様の操作を行った。

蛍光染色した正常扁平上皮組織の蛍光顕微鏡写真を図 3に示す。

蛍光染色した正常腺組織の蛍光顕微鏡写真を図 4に示す。

[0047] (3)免疫細胞化学での検定

検体として、正常扁平上皮細胞である口腔粘膜扁平上皮細胞の培養細胞 (ネガテイブコントロール）、子宫頸部扁平上皮癌細胞由来の培養細胞系である C33A、及び子宫頸部腺癌由来の培養細胞系である HeLa細胞を用ヽた。

[0048] 各培養細胞サンプル液を 100%メタノールで固定した後、遠心分離（10000rpm、 1分、 4°C)にかけて、上清を除去して、細胞を回収した。

回収した細胞を、 PBSおよび PBSTを各 lml添加し、洗浄する。再度遠心分離（10 OOOrpm、 1分、 4°C)に掛け、上清を分離して、細胞を回収した。続けて、 1%ャギ血清を含む PBSTを lml添加し、室温にて 10分間振盪混和して、細胞表面の非特異的タンパクのブロックを行った。ブロック後、遠心分離（10000rpm、 1分、 4°C)にかけて、余分なブロッキング液を除去した。

[0049] 次に、 5 gZmlのサイトケラチン 8抗体含有液 (溶媒は 1%ャギ血清を含む PBST )を添加し、室温にて 30分間振盪混和して、抗体反応をさせた。反応後、遠心分離（ 10000rpm、 1分、 4°C)にかけて、未反応の抗体液を除去した。

PBSTを lml添加して細胞を洗浄し、上清を除去して、細胞を回収した。

[0050] 蛍光色素 Alexa488で標識されたャギ由来の抗マウス IgGの F (ab)フラグメント含

2

有液 (溶媒は 1%ャギ血清を含む PBST) 5 μ gZmlを添加し、室温にて 30分間振盪混和して、抗体反応をさせた。反応後、遠心分離（10000rpm、 1分、 4°C)にかけ、上清を除去して細胞を回収した。

[0051] PBSTを lml添カ卩して細胞を洗浄し、遠心分離（10000rpm、 1分、 4°C)に力 4ナ、上清を除去して、細胞を回収した。

50%グリセロールを含む PBS液中に再懸濁して、蛍光顕微鏡で観察した。結果を図 5— 7に示す。

[0052] 図 6及び図 7より、扁平上皮細胞にはサイトケラチン 8抗体は反応しないことが認められた。一方、子宮頸部腺癌細胞に対しては、蛍光部分が観察され、サイトケラチン 8抗体と腺癌細胞が反応することが確認できた（図 5)。

産業上の利用可能性

[0053] 本発明の腺癌診断薬は、子宮頸部細胞群の組織及び個々に分散した細胞群から、腺癌を特異的に検出できるので、子宮頸部腺癌、特に扁平上皮癌と腺癌とを区別したい診断薬、診断に利用できる。本発明の腺癌細胞検出方法は、子宮頸部細胞群の組織及び個々に分散した細胞群から、腺癌を特異的に検出したい場合に利用できる。

Claims

請求の範囲

[1] 子宮頸部細胞群の検体力腺癌の有無を診断するための試薬であって、サイトケラチン 8抗体を含有する診断薬。

[2] さらに HIK1083抗体を含有する請求項 1に記載の診断薬。

[3] サイトケラチン 8抗体を含有する第 1試薬、及び

サイトケラチン 8抗体に結合可能で且つ標識されている 2次抗体を含有する第 2試薬を含む子宮腺癌の試薬キット。

[4] 子宫頸部細胞群の検体力腺癌細胞を検出する方法であって、

前記細胞群とサイトケラチン 8抗体とを反応させる工程を含む検出方法。

[5] 子宫頸部細胞群の検体力腺癌細胞を検出する方法であって、

前記細胞群とサイトケラチン 8抗体を含む試薬とを反応させる工程；

未反応液を除去して、細胞群を回収する工程;及び

回収された細胞群から、前記サイトケラチン 8抗体と腺癌細胞の複合体を検出する工程

を含む腺癌細胞の検出方法。

[6] 前記検体は、子宫頸部組織又は個々に分散された細胞群である請求項 4に記載の検出方法。

[7] 前記検体は、子宫頸部組織又は個々に分散された細胞群である請求項 5に記載の検出方法。

[8] 扁平上皮癌細胞と腺癌細胞を含む子宮頸部細胞群の検体から、腺癌細胞を分別する方法であって、

前記細胞群と標識されたサイトケラチン 8抗体とを反応させる工程;及び前記サイトケラチン 8抗体と腺癌細胞の複合体を検出する工程

を含む分別方法。