WO2004018679A1

WO2004018679A1 - 癌診断のための方法およびキット

Info

Publication number: WO2004018679A1
Application number: PCT/JP2003/010676
Authority: WO
Inventors: Hideaki Shimada; Takeshi Tomonaga; Kazuyuki Matsushita; Takenori Ochiai; Fumio Nomura
Original assignee: Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2002-08-23
Filing date: 2003-08-22
Publication date: 2004-03-04
Anticipated expiration: 2005-02-23
Also published as: JPWO2004018679A1; WO2004018518A1; AU2003235316A1

Abstract

本発明は、癌の診断に有効な複数の新規抗原ペプチドと、この抗原ペプチドに対する抗体、これらを用いた癌（例えば、直腸癌または結腸癌）診断方法を提供する。より詳細には、配列番号２または４などのアミノ酸配列を有するヒト癌抗原ペプチドと、被験体の血清中に、前記の抗原ペプチドと結合する抗体が存在するか否かを試験する癌診断方法。前記の抗原ペプチドと結合する抗体と、被験体の生体試料中に、その抗体と結合する抗原ペプチドが存在するか否か試験する癌診断方法ならびに関連方法が提供される。

Description

癌診断のための方法およびキット技術分野

本願の発明は、癌の分野に関する。より詳細には、本発明は、癌の診断のための方法およびキットに関する。本発明はさらに詳細には、ヒト大腸癌の抗原ペプチドと、大腸癌診断方法に関し、ヒト大腸癌細胞で発現する新規 2種の抗原ペプチドと、これらペプチドの 1種類以上を用いて大腸癌を高精度で診断する方法に関する。背景技術

種々の癌に関し、種々のマ一カーを用いて診断が行われているが、確定診断を行うことはかなり難しいとされる。

例えば、癌のうち代表的な例である大腸癌（直腸癌および結腸癌）は、加齢と共に増加し、 60歳代をピ一クとする悪性腫瘍である。リンパ行性、血行性、腹膜播種性などの転移を生じ、特に血行性転移によっては肝臓癌に進行することが多い。

他の悪性腫瘍と同様に、大腸癌に対する対策としては癌腫の早期発見が最も重要な課題である。特に大腸上部に発生した癌は自覚症状に乏しいため、発見時には病状が進行している危険性が高い。従来、大腸癌に対しては、主に便潜血反応によるスクリーニングと、 CEAあるいは CA19- 9等の血清マ一カーによる診断、並びに治療経過の診断が行われている。しかしながら、これらの方法はいずれも進行癌では陽性率が高いものの、早期癌では陽性率が極めて低く、正確な診断が困難であった。悪性腫瘍の簡便かつ確実な早期診断を可能とする方法として、癌組織特異的タンパク質マ一カーを用いた分子生物学的診断方法が提案されている。この方法は大がかりな設備を必要とせず、被験体への負担も少ないため、自覚症状のない多くの被験体に対しても広範囲に実施することが可能である。例えば、特開平 7-51065号公報には、糖タンパク質 39 の腫瘍マーカーとしての利用が開示されている。しかし、特開平 7-51065号公報に記載される糖タンパク質は、実際に腫瘍マ一力一として使用されることは記載されておらず、したがって、その精度が高いとはいえない。また、確定診断に使用できるとも記載されていない。

このように、診断精度をさらに向上させるためには、より多くの、しかも精度の高い抗原タンパク質マ一力一を準備し、それらを組合せて使用することが不可欠である。

本願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、癌（例えば、大腸癌）の診断に有効な新規抗原ペプチドを提供することを課題としている。

また本願の発明は、前記の抗原ペプチドに対する抗体と、それらを用いた癌診断方法を提供することを課題としている。発明の要旨

本発明は、 F I Rと C E N P- Aとが、予想外に癌の指標として使用することができることを発見したことによって達成された。また、本発明は、 F I R において正常型およびその数種の改変体が存在しており、それらの識別により癌の確定診断を行うことができることが判明したことによってより優れた効果を達成する。従って、本発明は、以下を提供する。 1. (a) 配列番号 1に記載の塩基配列もしくはその相補体またはそのフラグメント配列を有する、ポリヌクレオチド；

( ) 配列番号 2に記載のァミノ酸配列またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド、

(C) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも 1つの変異を有する改変体ポリぺプチドであって、生物学的活性を有する改変体ポリぺプチドをコードする、ポリヌクレオチド；

(d) (a) 〜（c) のいずれか 1つのポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイプリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリぺプチドをコードするポリヌクレオチド；または

(e) (a) 〜（c) のいずれか 1つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも 70%である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリぺプチドをコ一ドするポリヌクレオチド、

を含む、核酸分子。

2. 少なくとも 8の連続するヌクレオチド長を有する、請求項 1に記載の核酸分子。

3. 前記生物学的活性は、 FBPに結合する能力である、請求項 1に記載の核酸分子。

4. 前記 F BPに結合する能力は、配列番号 2における 372位〜 442位に記載される配列によって規定される、請求項 3に記載の核酸分子。

5. 請求項 1に記載の核酸分子に対して特異的な因子。

6. 前記因子は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子からなる群より選択される、請求項 5に記載の因子。

7. 前記因子は、少なくとも 8の連続するヌクレオチド長を有する核酸分子である、請求項 6に記載の因子。 8. 前記因子は、核酸分子であり、プライマーとして使用される、請求項 5に記載の因子。

9. 前記因子は、プローブとして使用される、請求項 5に記載の因子。

10. 前記因子は、標識されているかまたは標識され得る、請求項 5に記載の因子。

11. 前記標識は、蛍光、リン光、化学発光、放射能、酵素基質反応および抗原抗体反応からなる群より選択される技法を利用する、請求項 10に記載の因子。

12. 配列番号 1で示される配列またはその相補体を含む、請求項 1に記載の核酸分子。

13. (a) 配列番号 1またはその相補体において置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも 1つの改変を含む配列；または

(b) 配列番号 11、 13および 15からなる群より選択される少なくとも 1つの配列もしくはその相補体、または該少なくとも 1つの配列もしくはその相補体において置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも 1 つの改変を含む配列、

を含む、請求項 1に記載の核酸分子。

14. 前記改変は、置換；配列番号 1の 369位と 370位との間もしくは配列番号 15の 176位と 177位との間への付加；あるいは配列番号 1の 36 9位までもしくは配列番号 11の 305位までまたは配列番号 13もしくは配列番号 15の 176位までにおける欠失；あるいはそれらの組合せである、請求項 13に記載の核酸分子。

15. 前記改変は、配列番号 1の 5' 末端から約 400塩基までの範囲内に存在する、請求項 13に記載の核酸分子。

16. 前記改変は、配列番号 1における約 150位〜約 360位の範囲内における改変である、請求項 13に記載の核酸分子。 17. 前記改変は、配列番号 1において、コードするアミノ酸の非保存的置換を含む、請求項 13に記載の核酸分子。

18. 配列番号 11、 13、 15、 17、 19および 21からなる群より選択される配列を含む、請求項 13に記載の核酸分子。

19. 請求項 12に記載の核酸分子に対して特異的な因子。

20. 請求項 13に記載の核酸分子には特異的に反応しない、請求項 19に記載の因子。

21. 前記因子は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子からなる群より選択される、請求項 19に記載の因子。

22. 前記因子は、少なくとも 8の連続するヌクレオチド長を有する核酸分子である、請求項 19に記載の因子。

23. 前記因子は、核酸分子であり、プライマ一として使用される、請求項 1 9に記載の因子。

24. 前記因子は、プローブとして使用される、請求項 19に記載の因子。 25. 前記因子は、標識されているかまたは標識され得る、請求項 19に記載の因子。

26. 前記標識は、蛍光、リン光、化学発光、放射能、酵素基質反応および抗原抗体反応からなる群より選択される技法を利用する、請求項 25に記載の因子。

27. 請求項 13に記載の核酸分子に対して特異的な因子。

28. 請求項 12に記載の核酸分子には特異的に反応しない、請求項 27に記載の因子。

29. 前記因子は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子からなる群より選択される、請求項 27に記載の因子。

30. 前記因子は、少なくとも 8の連続するヌクレオチド長を有する核酸分子である、請求項 27に記載の因子。 3 1 . 前記因子は、核酸分子であり、プライマ一として使用される、請求項 2 7に記載の因子。

3 2 . 前記因子は、プローブとして使用される、請求項 2 7に記載の因子。 3 3 . 前記因子は、標識されているかまたは標識され得る、請求項 2 7に記載の因子。

3 4 . 前記標識は、蛍光、リン光、化学発光、放射能、酵素基質反応および抗原抗体反応からなる群より選択される技法を利用する、請求項 3 3に記載の因子。

3 5 . A) 請求項 1に記載の第一核酸分子に対して特異的な第一の因子；およぴ

B ) 該第一の因子に起因するシグナルを用いて該第一核酸分子の発現量を測定するための手段であって、癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分における該第一核酸分子の発現量に比較して対象の被験体の対象部分における該第一核酸分子の発現が高い場合、該対象の被験体は癌の八ィリスク者であると診断する、手段、

を備える、癌診断キット。

3 6 . 前記癌は、 C - m y c高発現癌を含む、請求項 3 5に記載のキット。 3 7 . 前記癌は、直腸癌および結腸癌を含む、請求項 3 5に記載のキット。 3 8 . 癌診断方法であって、

A) 対象の被験体の対象部分からの試料を提供する工程；

B ) 該試料中における、請求項 1に記載の第一核酸分子の存在量を測定する工程；

C ) 該第一核酸分子の存在量と、癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分からの試料における同一核酸分子の存在量とを比較し、該対象の被験体の対象部分からの試料における該第一核酸分子の量が増加している場合、該対象の被験体は癌のハイリスク者であると診断する、工程、を包含する、方法。

3 9 . A) 請求項 1 2に記載の第二核酸分子に対して特異的な第二の因子；

B ) 該第二の因子に起因するシグナルを用いて該第二核酸分子の発現量を測定するための手段であって、癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分における該第二核酸分子の発現量と、対象の被験体の対象部分における該第二核酸分子の発現量とが異なる場合、該対象の被験体は癌の八ィリスク者であると診断する、手段、

を備える、癌診断キット。

4 0 . 前記癌は、 c— my c高発現癌を含む、請求項 3 9に記載のキット。 4 1 . 前記癌は、直腸癌および結腸癌を含む、請求項 3 9に記載のキット。

4 2 . 癌診断方法であって、

A) 対象の被験体の対象部分からの試料を提供する工程；

B ) 該試料中において、請求項 1 2に記載の第二核酸分子の存在量を測定する工程；

C ) 該第二核酸分子の存在量と、癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分からの試料における同一核酸分子の存在量とを比較し、両者が異なる場合、該対象の被験体は癌のハイリスク者であると診断する、工程、を包含する、方法。

4 3 . A) 請求項 1 3に記載の第三核酸分子に対して特異的な第三の因子； B ) 該第三の因子に起因するシグナルを用いて該第三核酸分子の発現量を測定するための手段であって、対象の被験体の対象部分において該第三核酸分子が検出される場合、該対象の被験体は癌患者であると確定する、手段、を備える、癌診断キット。

4 4 . 前記対象の被験体の対象部分における前記核酸分子の検出は、癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分における該核酸分子の発現量に比較して対象の被験体の対象部分における該核酸分子の発現が高いことを検出することである、請求項 4 3に記載のキット。

4 5 . 前記癌は、 c一 m y c高発現癌を含む、請求項 4 3に記載のキット。

4 6 . 前記癌は、直腸癌および結腸癌を含む、請求項 4 3に記載のキット。

4 7 . 癌診断方法であって、

A) 対象の被験体の対象部分からの試料を提供する工程；

B) 該試料中において、請求項 1 3に記載の第三核酸分子を検出する工程；

C ) 該第三核酸分子が検出される場合、該対象の被験体は癌患者であると確定する、工程、

を包含する、方法。

4 8 . 前記 C) 工程は、前記第三核酸分子の存在量と、癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分からの試料における同一核酸分子の存在量とを比較し、前記対象の被験体の対象部分からの試料における該核酸分子の量が増加している場合、該対象の被験体は癌患者であると確定することである、請求項 4 7に記載の方法。

4 9 . A) 請求項 1 2に記載の第二核酸分子に対して特異的な第二の因子；

B) 請求項 1 3に記載の第三核酸分子に対して特異的な第三の因子；

C) 該第二の因子および該第三の因子に起因するシグナルを識別可能に検知して、該第二核酸分子と該第三核酸分子のそれぞれの発現量を測定するための手段であって、癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分における該第二核酸分子の発現に比較して対象の被験体の対象部分における該第二核酸分子の発現が高く、かつ、癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分における該第三核酸分子の発現に比較して対象の被験体の対象部分における該第三核酸分子の発現が高い場合、該対象の被験体は癌患者であると確定する、手段、

を備える、癌診断キット。 5 0 . 前記 C ) 手段は、前記第二核酸分子と前記第三核酸分子との相対存在比を比較する手段を包含する、請求項 4 9に記載のキット。

5 1 . 前記癌は、 c一 my c高発現癌を含む、請求項 4 9に記載のキット。

5 2 . 前記癌は、直腸癌および結腸癌を含む、請求項 4 9に記載のキット。

5 3 . 前記第二の因子は請求項 1 3に記載の核酸分子に特異的に反応しないか、前記第三の因子は請求項 1 2に記載の核酸分子に特異的に反応しないか、またはその両方である、請求項 4 9に記載のキット。

5 4. 前記第二の因子と、前記第三の因子とは、識別可能に標識されているかまたは標識され得る、請求項 4 9に記載のキット。

5 5 . 前記第二の因子と、前記第三の因子とを、識別可能に標識する因子をさらに含む、請求項 4 9に記載のキット。

5 6 . 癌診断方法であって、

A) 対象の被験体の対象部分からの試料を提供する工程；

B ) 該試料中において、請求項 1 2に記載の第二核酸分子および請求項 1 3 に記載の第三核酸分子の存在量を測定する工程； '

C) 該第二核酸分子の存在量と、癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分からの試料における同一核酸分子の存在量とを比較し、該対象の被験体の対象部分からの試料における該第二核酸分子の発現量が変動しており、かつ、該第三核酸分子の存在量と、癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分からの試料における同一核酸分子の存在量とを比較し、該対象の被験体の対象部分からの試料における該第三核酸分子の発現量が増加している場合、該対象の被験体は癌患者であると確定する工程、

を包含する、方法。

5 7 . A) 請求項 1に記載の第一核酸分子に対して特異的な第一の因子；

B) 請求項 1 3に記載の第 Ξ核酸分子に対して特異的な第三の因子； C ) 該第一の因子および該第三の因子に起因するシグナルを識別可能に検知して、該第一核酸分子と該第三核酸分子のそれぞれの発現量を測定するための手段であって、癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分における該第一核酸分子の発現量における該第三核酸分子の発現量の割合が、対象の被験体の対象部分における該第一核酸分子の発現量における該第三核酸分子の発現量の割合よりも高い場合、該対象の被験体は癌患者であると確定する、手段、

を備える、癌診断キット。

5 8 . 前記 C ) 手段は、前記第三核酸分子との相対存在比または絶対存在量を比較する手段を包含する、請求項 5 7に記載のキッ卜。

5 9 . 前記癌は、 c—my c高発現癌を含む、請求項 5 7に記載のキット。

6 0 . 前記癌は、直腸癌および結腸癌を含む、請求項 5 7に記載のキット。

6 1 . 前記第一の因子は請求項 1 3に記載の核酸分子に特異的に反応しないか、または該第一の因子は請求項 1 3に記載の核酸分子および請求項 1 2に記載の核酸分子の両方に特異的に反応する、請求項 5 7に記載のキット。

6 2 . 前記第一の因子と、前記第三の因子とは、識別可能に標識されているかまたは標識され得る、請求項 5 7に記載のキット。

6 3 . 前記第一の因子と、前記第三の因子とを、識別可能に標識する因子をさらに含む、請求項 5 7に記載のキット。

6 4 . 癌診断方法であって、

A) 対象の被験体の対象部分からの試料を提供する工程；

B ) 該試料中において、請求項 1に記載の第一核酸分子および請求項 1 3に記載の第三核酸分子の存在量を測定する工程；

C ) 該第一核酸分子と該第三核酸分子のそれぞれの発現量を測定する工程であって、癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分における該第一核酸分子の発現量における該第三核酸分子の発現量の割合が、対象の被験体の対象部分における該第一核酸分子の発現量における該第三核酸分子の発現量の割合よりも高い場合、該対象の被験体は癌患者であると確定する、工程、を包含する、方法。

6 5. (a) 配列番号 1に記載の塩基配列もしくはその相補体またはそのフラグメント配列を有する、ポリヌクレオチド；

(c) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも 1つの変異を有する改変体ポリペプチドであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；

(d) (a) 〜 (c) のいずれか 1つのポリヌクレオチドにストリンジェン卜な条件下でハイプリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリぺプチドをコードするポリヌクレオチド；または

(e) (a) 〜（c) のいずれか 1つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも 7 0%である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリぺプチドをコ一ドするポリヌクレオチド、

を含む、核酸分子の、癌の診断剤の製造のための使用。

6 6. (a) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；

(b) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも 1つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；

(c) 配列番号 1に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコ一ドされる、ポリペプチド； (d) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または

(e) (a) 〜（d) のいずれか 1つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも 70%であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、

を含む、ポリペプチド。

67. 少なくとも 3の連続するアミノ酸長を有する、請求項 66に記載のポリペプチド。

68. 前記生物学的活性は、 FBPに結合する能力である、請求項 66に記載のポリペプチド。

69. 前記 F BPに結合する能力は、配列番号 2における 372位〜 442位に記載される配列によって規定される、請求項 68に記載のポリペプチド。

70. ポリペプチドは、標識されているかまたは標識され得る、請求項 66に記載のポリペプチド。

71. 請求項 66に記載のポリペプチドに対して特異的な因子。

72. 前記因子は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子からなる群より選択される、請求項 71に記載の因子。

73. 前記因子は、抗体またはその誘導体である、請求項 71に記載の因子。 74. 前記因子は、プローブとして使用される、請求項 71に記載の因子。 75. 前記因子は、標識されているかまたは標識され得る、請求項 71に記載の因子。

76. 前記標識は、蛍光、リン光、化学発光、放射能、酵素基質反応および抗原抗体反応からなる群より選択される技法を利用する、請求項 75に記載の因子。

77. 配列番号 2で示される配列を含む、請求項 66に記載のポリペプチド。 78. (a) 配列番号 2において、置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも 1つの改変を含むアミノ酸配列；

(b) 配列番号 12、 14および 16からなる群より選択される少なくとも 1つの配列、または該少なくとも 1つの配列において置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも 1つの改変を含む配列、

を含む、請求項 66に記載のポリペプチド。

79. 前記改変は、置換；配列番号 2の 102位と 103位との間もしくは配列番号 16の 59位と 60位との間への付加；あるいは配列番号 2もしくは配列番号 12の 102位までまたは配列番号 14もしくは配列番号 16の 59位までにおける欠失；あるいはそれらの組合せである、請求項 78に記載のポリペプチド。

80. 前記改変は、配列番号 2の N末端から約 135アミノ酸までの範囲内に存在する、請求項 78に記載のポリペプチド。

8 1. 前記改変は、配列番号 2における約 50位〜約 120位の範囲内における改変である、請求項 78に記載のポリペプチド。

82. 前記改変は、配列番号 2における非保存的置換を含む、請求項 78に記載のポリペプチド。

83. 配列番号 1 2、 14、 16、 18、 20および 22からなる群より選択される配列を含む、請求項 78に記載のポリペプチド。

84. 請求項 77に記載のポリペプチドに対して特異的な因子。

85. 請求項 78に記載のポリペプチドに対して特異的に反応しない、請求項 84に記載の因子。

86. 前記因子は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子からなる群より選択される、請求項 84に記載の因子。

87. 前記因子は、抗体またはその誘導体である、請求項 84に記載の因子。 88. 前記因子は、プローブとして使用される、請求項 84に記載の因子。 89. 前記因子は、標識されているかまたは標識され得る、請求項 84に記載の因子。

90. 前記標識は、蛍光、リン光、化学発光、放射能、酵素基質反応および抗原抗体反応からなる群より選択される技法を利用する、請求項 89に記載の因子。

91. 請求項 78に記載のポリペプチドに対して特異的な因子。

92. 請求項 77に記載のポリペプチドに対して特異的に反応しない、請求項

91に記載の因子。

93. 前記因子は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子からなる群より選択される、請求項 91に記載の因子。

94. 前記因子は、抗体またはその誘導体である、請求項 91に記載の因子。 95. 前記因子は、プローブとして使用される、請求項 91に記載の因子。 96. 前記因子は、標識されているかまたは標識され得る、請求項 91に記載の因子。

97. 前記標識は、蛍光、リン光、化学発光、放射能、酵素基質反応および抗原抗体反応からなる群より選択される技法を利用する、請求項 96に記載の因子。

98. A) 請求項 66に記載の Aポリペプチドに対して特異的な A因子；および

B) 該 A因子に起因するシグナルを用いて該 Aポリペプチドの発現量を測定するための手段であって、癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分における該 Aポリペプチドの発現量に比較して対象の被験体の対象部分における該 Aポリぺプチドの発現が高い場合、該対象の被験体は癌のハイリスク者であると診断する、手段、

を備える、癌診断キット。

99. 前記癌は、 c- my c高発現癌を含む、請求項 98に記載のキット。 1 0 0 . 前記癌は、直腸癌および結腸癌を含む、請求項 9 8に記載のキット。 1 0 1 . 癌診断方法であって、

A) 対象の被験体の対象部分からの試料を提供する工程；

B ) 該試料中において、請求項 6 6に記載の Aポリペプチドの存在量を測定する工程；

C ) 該 Aポリペプチドの存在量と、癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分からの試料における同一核酸分子の存在量とを比較し、該対象の被験体の対象部分からの試料における該 Aポリペプチドの量が増加している場合、該対象の被験体は癌のハイリスク者であると診断する、工程、を包含する、方法。

1 0 2 . A) 請求項 7 7に記載の Bポリペプチドに対して特異的な B因子；および

B ) 該 B因子に起因するシグナルを用いて該 Bポリペプチドの発現量を測定するための手段であって、癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分における該 Bポリペプチドの発現量と、対象の被験体の対象部分における該 Bポリペプチドの発現量とが異なる場合、該対象の被験体は癌のハイリスク者であると診断する、手段、

を備える、癌診断キット。

1 0 3 . 前記癌は、 c -my c高発現癌を含む、請求項 1 0 2に記載のキット。 1 0 4 . 前記癌は、直腸癌および結腸癌を含む、請求項 1 0 2に記載のキット。 1 0 5 . 癌診断方法であって、

A) 対象の被験体の対象部分からの試料を提供する工程；

B ) 該試料中において、請求項 7 7に記載の Cポリペプチドの存在量を測定する工程； C) 該 cポリペプチドの存在量と、癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分からの試料における同一核酸分子の存在量とを比較し、両者が異なる場合、該対象の被験体は癌のハイリスク者であると診断する、工程、を包含する、方法。

1 0 6 . A) 請求項 7 8に記載のポリペプチドに対して特異的な C因子；および

B ) 該 C因子に起因するシグナルを用いて該 Cポリペプチドの発現量を測定するための手段であつて、対象の被験体の対象部分において該 Cポリぺプチドが検出される場合、該対象の被験体は癌患者であると確定する、手段、を備える、癌診断キット。

1 0 7 . 対象の被験体の対象部分における前記 Cポリペプチドの検出は、前記癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分における該ポリべプチドの発現量に比較して対象の被験体の対象部分における該ポリペプチドの発現が高いことを検出することである、請求項 1 0 6に記載のキット。

1 0 8 . 前記癌は、 c一 my c高発現癌を含む、請求項 1 0 6に記載のキット。 1 0 9 . 前記癌は、直腸癌および結腸癌を含む、請求項 1 0 6に記載のキット。

1 1 0 . 癌診断方法であって、

A) 対象の被験体の対象部分からの試料を提供する工程；

B ) 該試料中において、請求項 7 8に記載の Cポリペプチドを検出するェ程；

C) 該 Cポリペプチドが検出される場合、該対象の被験体は癌患者であると確定する、工程、

を包含する、方法。

1 1 1 . 前記 C) 工程は、前記 Cポリペプチドの存在量と、癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分からの試料における同一核酸分子の存在量とを比較し、該対象の被験体の対象部分からの試料における該ポリぺプチドの量が増加している場合、該対象の被験体は癌患者であると確定することである、請求項 1 1 0に記載の方法。

1 1 2. A) 請求項 7 7に記載の Bポリペプチドに対して特異的な B因子； B) 請求項 7 8に記載の Cポリペプチドに対して特異的な C因子；

C) 該 B因子および該 C因子に起因するシグナルを識別可能に検知して、該 Bポリぺプチドと該 Cポリぺプチドのそれぞれの発現量を測定するための手段であって、癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分における該 Bポリペプチドの発現に比較して対象の被験体の対象部分における該 Bポリペプチドの発現が高く、かつ、癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分における該 Cポリペプチドの発現に比較して対象の被験体の対象部分における該 Cポリペプチドの発現が高い場合、該対象の被験体は癌患者であると確定する、手段、

を備える、癌診断キット。

1 1 3. 前記 C) 手段は、前記 Bポリペプチドと前記 Cポリペプチドとの相対存在比を比較する手段を包含する、請求項 1 1 2に記載のキット。

1 14；前記癌は、直腸癌および結腸癌を含む、請求項 1 1 2に記載のキット。

1 1 5. 前記癌は、 c一 my c高発現癌を含む、請求項 1 1 2に記載のキット。

1 1 6. 前記 B因子は請求項 7 8に記載の核酸分子に特異的に反応しないか、前記 C因子は請求項 7 7に記載の核酸分子に特異的に反応しないか、またはその両方である、請求項 1 1 2に記載のキット。

1 1 7. 前記 B因子と、前記 C因子とは、識別可能に標識されているかまたは標識され得る、請求項 1 1 2に記載のキット。

1 1 8. 前記 B因子と、前記 C因子とを、識別可能に標識する因子をさらに含む、請求項 1 1 2に記載のキッ卜。

1 1 9. 癌診断方法であって、

A) 対象の被験体の対象部分からの試料を提供する工程； B ) 該試料中において、請求項 7 7に記載の Bポリペプチドおよび請求項 7 8に記載の Cポリペプチドの存在量を測定する工程；

C) 該 Bポリペプチドの存在量と、癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分からの試料における同一ポリペプチドの存在量とを比較し、該対象の被験体の対象部分からの試料における該 Bポリぺプチドの発現量が増加しており、かつ、該 Cポリペプチドの存在量と、癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分からの試料における同一ポリペプチドの存在量とを比較し、該対象の被験体の対象部分からの試料における該 Cポリべプチドの発現量が増加している場合、該対象の被験体は癌患者であると確定する、工程、

を包含する、方法。

1 2 0 . A) 請求項 6 6に記載の Aポリペプチドに対して特異的な A因子；

B ) 請求項 7 8に記載の Cポリペプチドに対して特異的な C因子；

C ) 該 A因子および該 C因子に起因するシグナルを識別可能に検知して、該 Aポリぺプチドと該 Cポリぺプチドのそれぞれの発現量を測定するための手段であって、癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分における該 Aポリペプチドの発現量における該 Cポリペプチドの発現量の割合が、対象の被験体の対象部分における該 Aポリペプチドの発現量における該 Cポリべプチドの発現量の割合よりも高い場合、該対象の被験体は癌患者であると確定する、手段、

を備える、癌診断キット。

1 2 1 . 前記 C ) 手段は、前記 Aポリペプチドと前記 Cポリペプチドとの相対存在比または絶対存在量を比較する手段を包含する、請求項 1 2 0に記載のキッ卜。

1 2 2 . 前記癌は、 c— m y c高発現癌を含む、請求項 1 2 0に記載のキット。 1 2 3 . 前記癌は、直腸癌および結腸癌を含む、請求項 1 2 0に記載のキット。 1 2 4. 前記第 A因子は請求項 7 8に記載のポリペプチドに特異的に反応しないか、または請求項 7 7に記載のポリペプチドおよび請求項 7 8に記載のポリペプチドに特異的に反応する、請求項 1 2 0に記載のキッ卜。

1 2 5 . 前記第 A因子と、前記 C因子とは、識別可能に標識されているかまたは標識され得る、請求項 1 2 0に記載のキット。

1 2 6 . 前記 A因子と、前記 C因子とを、識別可能に標識する因子をさらに含む、請求項 1 2 0に記載のキット。

1 2 7 . 癌診断方法であって、

A) 対象の被験体の対象部分からの試料を提供する工程；

B ) 該試料中において、請求項 6 6に記載の Aポリペプチドおよび請求項 7

8に記載の Cポリペプチドの存在量を測定する工程；

C ) 該 Aポリぺプチドと該 Cポリぺプチドのそれぞれの発現量を測定するェ程であって、癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分における該 Aポリぺプチドの発現量における該 Cポリぺプチドの発現量の割合が、対象の被験体の対象部分における該 Aポリペプチドの発現量における該 Cポリぺプチドの発現量の割合よりも高い場合、該対象の被験体は癌患者であると確定する、工程、

を包含する、方法。

1 2 8 . ( a ) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；

( b ) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも 1つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；

( c ) 配列番号 1に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド； (d) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または

を含む、ポリペプチドの、癌の診断剤の製造のための使用。

129. (a) 配列番号 3に記載の塩基配列もしくはその相補体またはそのフラグメント配列を有する、ポリヌクレオチド；

(b) 配列番号 4に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントをコ一ドする、ポリヌクレオチド、

(c) 配列番号 4に記載のアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも 1つの変異を有する改変体ポリぺプチドであって、生物学的活性を有する改変体ポリべプチドをコードする、ポリヌクレオチド；

(d) (a) 〜 (c) のいずれか 1つのポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイプリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリぺプチドをコードするポリヌクレオチド；または

を含む、核酸分子。

130. 少なくとも 8の連続するヌクレオチド長を有する、請求項 129に記載の核酸分子。

131. 前記生物学的活性は、セントロメァクロマチンへの結合である、請求項 129に記載の核酸分子。

132. 請求項 129に記載の核酸分子に対して特異的な因子。 1 3 3 . 前記因子は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子からなる群より選択される、請求項 1 3 2に記載の因子。 1 3 4 . 前記因子は、少なくとも 8の連続するヌクレオチド長を有する核酸分子である、請求項 1 3 2に記載の因子。

1 3 5 . 前記因子は、核酸分子であり、プライマーとして使用される、請求項 1 3 2に記載の因子。

1 3 6 . 前記因子は、プロ一ブとして使用される、請求項 1 3 2に記載の因子。 1 3 7 . 前記因子は、標識されているかまたは標識され得る、請求項 1 3 2に記載の因子。

1 3 8 . 前記標識は、蛍光、リン光、化学発光、放射能、酵素基質反応および抗原抗体反応からなる群より選択される技法を利用する、請求項 1 3 7に記載の因子。

1 3 9 . A) 請求項 1 2 9に記載の核酸分子に対して特異的な因子；および

B ) 該因子に起因するシグナルを用いて該核酸分子の発現量を測定するための手段であって、癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分における該核酸分子の発現量に比較して対象の被験体の対象部分における該核酸分子の発現が高い場合、該対象の被験体は癌の八ィリスク者であると診断する、手段、

を備える、癌診断キット。

1 4 0 . 前記癌は、直腸癌および結腸癌を含む、請求項 1 3 9に記載のキット。

1 4 1 . 癌診断方法であって、

A) 対象の被験体の対象部分からの試料を提供する工程；

B) 該試料中において、請求項 1 2 8に記載の核酸分子の存在量を測定する工程；

C) 該核酸分子の存在量と、癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分からの試料における同一核酸分子の存在量とを比較し、該対象の被験体の対象部分からの試料における該核酸分子の量が増加している場合、該対象の被験体は癌のハイリスク者であると診断する、工程、

を包含する、方法。

142. (a) 配列番号 3に記載の塩基配列もしくはその相補体またはそのフラグメント配列を有する、ポリヌクレオチド；

( b ) 配列番号 4に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントをコ一ドする、ポリヌクレオチド、

(c) 配列番号 4に記載のアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも 1つの変異を有する改変体ポリペプチドであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；

(d) (a) 〜（c) のいずれか 1つのポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下で八イブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリべプチドをコードするポリヌクレオチド；または

(e) (a) 〜（c) のいずれか 1つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも 70%である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリぺプチドをコードするポリヌクレオチド、

を含む、核酸分子の、癌の診断剤の製造のための使用。

143. (a) 配列番号 4に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；

(b) 配列番号 4に記載のアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも 1つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；

( c ) 配列番号 3に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド； (d) 配列番号 4に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または

を含む、ポリペプチド。

144. 少なくとも 3の連続するアミノ酸長を有する、請求項 142に記載のポリペプチド。

145. 前記生物学的活性は、セントロメァクロマチンへの結合である、請求項 142に記載のポリペプチド。

146. 前記ポリペプチドは、標識されているかまたは標識され得る、請求項 142に記載のポリペプチド。

147. 請求項 142に記載のポリペプチドに対して特異的な因子。

148. 前記因子は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子からなる群より選択される、請求項 147に記載の因子。

149. 前記因子は、抗体またはその誘導体である、請求項 147に記載の因子。

150. 前記因子は、プローブとして使用される、請求項 147に記載の因子。 151. 前記因子は、標識されているかまたは標識され得る、請求項 147に記載の因子。

152. 前記標識は、蛍光、リン光、化学発光、放射能、酵素基質反応および抗原抗体反応からなる群より選択される技法を利用する、請求項 151に記載の因子。

153. A) 請求項 143に記載のポリペプチドに対して特異的な因子；および B ) 該因子に起因するシグナルを用いて該ポリペプチドの発現量を測定するための手段であって、癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分における該ポリペプチドの発現量に比較して対象の被験体の対象部分 itおける該ポリペプチドの発現が高い場合、該対象の被験体は癌のハイリスク者であると診断する、手段、

を備える、癌診断キット。

1 5 4 . 前記癌は、直腸癌および結腸癌を含む、請求項 1 5 3に記載のキット。 1 5 5 . 癌診断方法であって、

A) 対象の被験体の対象部分からの試料を提供する工程；

B ) 該試料中において、請求項 1 4 2に記載のポリペプチドの存在量を測定する工程；

C) 該ポリペプチドの存在量と、癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分からの試料における同一核酸分子の存在量とを比較し、該対象の被験体の対象部分からの試料における該ポリぺプチドの量が増加している場合、該対象の被験体は癌のハイリスク者であると診断する、工程、

を包含する、方法。

1 5 6 . ( a ) 配列番号 4に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；

( b ) 配列番号 4に記載のアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも 1つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；

( c ) 配列番号 3に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；

( d ) 配列番号 4に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または ( e ) ( a ) 〜（d ) のいずれか 1つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも 7 0 %であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、

を含む、ポリペプチドの、癌の診断剤の製造のための使用。本願はまた、上記課題を解決するために、以下の（S1)〜（S26)の発明を提供する。

(51)配列番号 1のアミノ酸配列を有するヒト大腸癌抗原べプチド。

(52)配列番号 4のアミノ酸配列を有するヒト大腸癌抗原ペプチド。

(S3)上記発明（S1)のべプチドをコ一ドする遺伝子 DNAから転写された mRNA。

(54)上記発明（S2)のべプチドをコ一ドする遺伝子 DNAから転写された mRNA。

(55)上記発明（S3)の mRNAを铸型として合成され、配列番号 1 の塩基配列またはその一部連続配列からなる DNA断片。

(56)上記発明（S4)の mRNAを铸型として合成され、配列番号 3 の塩基配列またはその一部連続配列からなる DNA断片。

(57)上記発明（S5)の DNA断片を保有する組換え発現ベクター。

(58)上記発明（S6)の DNA断片を保有する組換え発現べク夕一。

(59)上記発明（S7)の組換え発現べクタ一による形質転換細胞。

(S10)上記発明（S 8)の組換え発現べクタ一による形質転換細胞。

(S11)上記発明（S1)の抗原ペプチドと結合する抗体。

(512)上記発明（S2)の抗原べプチドと結合する抗体。

(513)上記発明（S1)の抗原べプチドと結合する標識抗体。

(514)上記発明（S2)の抗原ペプチドと結合する標識抗体。

(515)被験体の血清中に、上記発明（S1)および/または（S2)の抗原ペプチドと結合する抗体が存在するか否かを試験し、血清中にその抗体が存在する被験体を大腸癌患者または大腸癌ハイリスク者と判定することを特徴とするヒト大腸癌診断方法。

(S16)抗原ペプチドを固定化したプレート上において被験体血清の抗体と抗原ペプチドとの結合を試験する上記発明（S15)の診断方法。

(S17)被験体の生体試料に、上記発明（S11)およびノまたは（S12)の抗体、もしくは上記発明（S13)および Zまたは（S14)の標識抗体と結合する抗原べプチドが存在するか否かを試験し、試料中にその抗原べプチドが存在する被験体を大腸癌患者または大腸癌八ィリスク者と判定することを特徴とするヒト大腸癌診断方法。

(S18)抗体を固定化したプレート上において、抗体と抗原ペプチドの結合を試験する上記発明（S17)の診断方法。

(S19)被験体の生体試料に、上記発明（S3)およびノまたは（S4)の mRNAが存在するか否かを試験し、試料中にその mRNAが存在する被験体を大腸癌患者または大腸癌ハイリスク者と判定することを特徴とするヒト大腸癌診断方法。 (S20)少なくとも以下の要素：（a)上記発明（S1)および Zまたは（S2)の抗原ペプチド；および（b)血清中抗体に特異的に結合する標識抗体からなることを特徴とする大腸癌診断キット。

(521)少なくとも以下の要素：（a)上記発明（S1)および Zまたは（S2)の抗原ペプチドを固定化したプレート；および（b) 血清中抗体に特異的に結合する標識抗体からなることを特徴とする大腸癌診断キット。

(522)少なくとも、上記発明（S13)および Zまたは（S14)の標識抗体を含むことを特徴とする大腸癌診断キット。

(523)少なくとも以下の要素：（a)上記発明（S11)および Zまたは（S12)の抗体；および（W上記（a)の抗体と同一の抗原ペプチドと結合する上記発明 (S13)および Zまたは（S14)の標識抗体からなることを特徴とする大腸癌診断キッ卜。 (S24)少なくとも以下の要素：（a)上記発明（S11)および Zまたは（S12)の抗体を固定化したプレート；および（b)上記（a)のプレートに固定化した抗体と同一の抗原ペプチドと結合する上記発明（S13)およびまたは（S14)の標識抗体からなることを特徴とする大腸癌診断キット。

(S25)上記発明（S3)の mRNAを PCR増幅するためのプライマ一セット。

(S26)上記発明（S4)の mRNAを PCR増幅するためのプライマーセット。

1 つの局面において、本発明者らは、大腸癌患者の手術標本の正常部および癌部から本人の了解を得てタンパク質および mRNA を抽出し、それらを解析することによって、大腸癌細胞において特異的に発現し、従来は腫瘍マ一カーとしての機能が知られていなかった 2種の抗原べプチドを見出した。

本願の発明は、以上のとおりの新規抗原ペプチド（配列番号 2、 4など）と、それらをコードする遺伝子 DMから転写された mRNA、およびそれらの mRNAから合成された DNA断片（cDNA :配列番号 1、 3など）を基礎とするものである。なお、本発明は、配列番号 1一 4などにそれぞれ示した塩基配列およびアミノ酸配列については、 1以上の塩基の付加、欠失、他の塩基への置換、あるいはこれらの塩基変異に基づく 1以上のアミノ酸残基の付加、欠失および他のアミノ酸への置換をも包含するものである。

また、「血清中抗体」とは、特定の実施形態において、癌患者（例えば、大腸癌患者）の血清中に存在し、発明（S1) (S2)の抗原ペプチドと結合する抗体 IgG を意味する。また、発明（Sl l) (S12)の「抗体」および発明（S13) (S14)の「標識抗体」は、発明（S1) (S2)の抗原ペプチドを免疫原として作成されたポリクローナル抗体またはモノク口一ナル抗体を意味する。

以下に、本発明の好ましい実施形態を示すが、当業者は本発明の説明および当該分野における周知慣用技術からその実施形態などを適宜実施することができ、本発明が奏する作用および効果を容易に理解することが認識されるべきである。以下、各発明について、実施形態を詳しく説明する。図面の簡単な説明

図 1は、本発明の抗原ペプチド（配列番号 2) の癌組織および正常組織における発現を分析したウエスタンブロットの結果である。

図 2は、本発明の抗原ペプチドをコードする遺伝子 mRNA の癌組織および正常組織における発現を分析した RT-PCRの結果である。

図 3は、本発明の抗原ペプチド（配列番号 4) の癌組織および正常組織における発現を分析したウエスタンブロットの結果である。 CENP— Aタンパク質は、原発性結腸直腸癌において増加していた。総タンパク質溶解物を、腫瘍組織（T) および近傍の正常組織（N) の対応する試料から調製した。各々の対からの等量のタンパク質を、 7. 5%〜15%勾配のポリアクリルアミドゲル上で分離し、いくつかの抗体を用いて免疫プロットした。 A. CENP-A タンパク質を矢印で示す。免疫ブロッテイングはまた、ローデイングコント口ールとして ]3—ァクチン抗体を用いて実施した。各バンドの強度を、 NI H画像により測定し、 i3—ァクチンを用いて正規化した腫瘍組織と正常組織との間の相対的な平均 C E N P— Aタンパク質レベルを、少なくとも 3回の実験から算出した。 *は、非特異的なバンドを示す。各腫瘍のデューク分類の段階を示す。 B. CENP— Aタンパク質レベルを、 ANA血清の代わりに抗 CENP 一 A抗体を用いて検出した。 C. ANA血清により検出した CENP— Bタンパク質。 D. 結腸直腸癌組織における PCNAタンパク質レベル。

図 4は、本発明の抗原ぺプチドをコ一ドする遺伝子 mRNAの癌組織および正常組織における発現を分析した RT-PCR の結果である。 CENP— A遺伝子は、結腸直腸癌において過剰発現されるが、増幅されない。 A. 総 RNAを、腫瘍組織 (T) および近傍の正常組織（N) の対応する試料から調製し、 RT— P CRを実施した。各バンドの強度を N I H画像により測定し、 GAPDH m RN Aレベルを用いて正規化した腫瘍組織と正常組織との間の相対的な平均 C ENP-A mRNAレベルを少なくとも 3回の実験から算出した。ほとんどの症例において、腫瘍における CENP— A mRNAは、正常組織と比較して増大していた。 B. リアルタイム定量 RT— PCRによる腫瘍組織と近傍正常組織との間の CENP— A mRNAレベルの比較。 C. リアルタイム定量 PCRによる腫瘍組織および正常組織における CENP— A遺伝子コピ一数の定量：バ一、士 SD。

図 5は、抗 CENP— A抗体によるヒト結腸組織の免疫染色を示す。正常結腸上皮（Aおよび B) ならびに結腸癌組織（Cおよび D) を 4%パラホルムァルデヒドで固定し、 H&E (Aおよび C) または抗 CENP— A抗体（Bおよび D) で染色した。 CENP— A染色は、正常上皮細胞と比較した場合、癌細胞において増大していた。最初の倍率は 40倍である。より高倍率での表示 (63倍）を Bおよび Dに差し込みで示す。

図 6は、抗 CENP— A抗体および抗 CENP— B抗体によるヒト結腸組織の同時免疫染色を示す。 A. 正常結腸上皮組織および結腸癌組織をアセトンで固定し、抗 CENP— Aおよび抗 CENP— B抗体で染色した。矢じりは、 C ENP— Bと共存しない CENP— Aを示す。矢印は C EN P— Aと共存しない C E N P— Bを示す。 CENP— Aおよび CENP— Bの全てが正常細胞において共存したのに対して、 C ENP— Aおよび CENP— Bのいくつかのシグナルは腫瘍細胞において共存しない。 B. 正常細胞および腫瘍細胞において共存するかまたは共存しない CENP— Aおよび CENP— Bドットの数

(%) 。少なくとも 300ドッ卜の細胞を、それぞれ計数した。

図 7は、 F I Rのァミノ末端が、 c一 my cプロモ一夕一からの転写の抑制に重要であることを示す。 HA— F I Rおよび HA— F I R厶 N77を、 He L a細胞において c一 my cプロモ一夕一によって駆動される CATレポ一夕一プラスミド 75 Ongとコトランスフエクトし、そして CAT活性を測定した。各レーンは、それぞれ、 36 f mo 1の HAベクター単独（レーン 1) 、 18 f mo 1および 36 f mo 1の HA— F I R (レ一ン 2、 3) 、 18 f m o 1および 36 f mo 1の HA— F I RAN 77 (レ一ン 4、 5) である。下のパネルは、複数の実験における平均 CAT活性のヒストグラムを示す。レ一ン 2 (18 imo lの HA— F I R) 、 3 (36 f mo 1の HA— F I R) 、 4 (18 f mo 1の HA— F I RAN 77) 、および 5 (36 f mo 1の HA 一 F I R厶 N 77) の相対的な CAT活性は、レーン 1 (36 ί mo 1の HA ベクター）と比較して、それぞれ、 0. 25、 0. 16、 0. 52、および 0. 43である。

図 8 Aは、 F I Rが、 c一 My cを抑制し、そしてそのアミノ末端が抑制に必要であることを示す。 100 f mo 1の HA— F I Rまたは HA— F I R厶 N77を、 6ゥエルプレート中で He L a細胞にトランスフエクトした。細胞を、 c一 My c (左、緑色）抗体または HA (中央、赤）抗体に対して免疫染色した。矢じりおよび矢印は、それぞれ、 HA—F I Rおよび HA— F I R厶 N 77が発現された細胞を示す。 c— My c発現は、 HA— F I RAN77発現細胞（矢印）と比較した場合、ほとんどの HA— F I R発現細胞（矢じり）において顕著に減少していた。

図 8Bは、 F I Rが、 c— My cを抑制し、そしてそのアミノ末端が抑制に必要であることを示す。 HA— F I Rまたは HA— F I RAN77のトランスフエクシヨンによる c一 My c抑制を、フロ一サイトメトリー分析によって定量した。トランスフエクトした細胞を、 X軸に沿って示される PEポジティブ細胞として同定した。 y軸に沿った F I TCポジティブ細胞は、 c一 My c発現を示す。 HA— F I Rは、 c— My c発現を抑制するが（左）、 HAベクタ一単独では c一 My c発現を抑制しない（右）。下のパネルは、上のパネル中で囲んだ領域中の c一 My c発現のヒストグラムを示す。この囲んだ領域中の 0676

c— My cレベルの平均（Ge o—平均）（HA— F I Rについては 48. 4 (16. 1) および HA空ベクターについては 87. 0 (67. 0) ) を示す。図 9 Aは、 F I Rがアポトーシスを誘導したが、ァミノ末端が欠失した F I Rはそのアポト一シス活性を消滅させたことを示す。図 9Aは、 TUNELァッセィによるアポトーシス細胞の試験を示す。 150 f mo 1の HA— F I R、 HA-F I RAN 77, および空ベクタープラスミドを、 6ゥエルプレート中で He L a細胞にトランスフエクトし、そして 24時間後に TUN E Lアツセィを実行した。上段のパネルは、 He L a細胞への HA— F I Rトランスフエクシヨン後のアポトーシス細胞（矢印）を示す。中段および下段のパネルは、それぞれ、 HA— F I RAN77および HA空べクタ一をトランスフエクトした細胞である。

図 9Bは、 F I Rがアポト一シスを誘導したが、ァミノ末端が欠失した F I Rはそのアポト一シス活性を消滅させたことを示す。図 9 Bは、二色分析によるアポトーシス細胞の定量を示す。細胞を、 X軸に沿って示される P Iポジテイブ細胞および y軸に沿って示される F I TCポジティブ細胞として同定した。アポト一シス細胞は、図中に示される各パネルにおいて、上段の囲んだ領域中に示される。 HA—F I Rトランスフエクシヨンにおける 10， 000事象あたりのアポトーシス細胞のパーセンテージは、 16. 5%である一方で、 HA 一 F I RAN 77、 HA空ベクター、および DNa s e I処理細胞（ポジテイブコントロール、材料および方法を参照のこと）においては、それぞれ、 6. 6%、 2. 0%, および 75. 6%である。

図 1 OAは、 F I Rが結腸直腸癌組織中で過剰発現されることを示す。総夕ンパク質溶解物を、対応する腫瘍試料（T) および近傍の正常上皮組織（N) から調製した。各対からの等量のタンパク質を、 8%ポリアクリルアミドゲルで分離し、抗 F I R抗体を用いてィムノブロットした。ィムノブロッテイングをまた、口一ディングコントロールとして i3—ァクチン抗体を用いて実行した。各バンドの強度を、 N IH画像によって測定し、そして /3—ァクチンで正規化した腫瘍と正常上皮組織との間の F I Rタンパク質レベルの相対平均を、図の下に計算した。 F I R発現は、対応する非腫瘍上皮よりも腫瘍組織においてかなり活性化されている。デュークス分類の段階もまた、図の上部に列挙する。図 10Bは、 F I Rが結腸直腸癌組織中で過剰発現されることを示す。総 R NAを、（T) および（N) の対応する試料から調製し、そして RT— FCR を実行した。（T) 中の F I R mRNAレベルは、ケース 5を除いて、

(N) 中の F I R mRNAレベルよりも高い。 GAPDH mRNAレベルもまた、内部コントロールとして示す。

図 10Cは、 F I Rが結腸直腸癌組織中で過剰発現されることを示す。図 1 0Cは、定量リアルタイム PC Rによって検出した（T) および（N) における F I R mRNA発現のヒストグラムである。（T) における F I R mR NA発現は、（N) における F I R mRNA発現よりも有意に高い（t検定に対して pく 0. 0056 ； W i 1 c o X o n検定に対して ρく 0. 008) 。図 10Dは、 F I Rが結腸直腸癌組織中で過剰発現されることを示す。各結腸直腸癌組織における F I R mRNAおよび c一 myc mRNAの（T) / (N) の発現比は、有意に相関していた。 F I R発現レベルの平均は、 c一 my c発現レベルの平均と有意に相関し、明確に、 Y=0. 72 + 0. 22Χ

(ここで、 Υは F I R発現比 (Τ/Ν) であり、 Xは c一 myc発現比 (T/ N) である）である。相関係数は、 0. 70であり、 p値は、 0. 00019 である。

図 11は、本発明の F I Rの 4つの種類の長さの改変体の比較模式図である。

配列の説明

配列番号 1 : F I R542をコ一ドする核酸配列。配列番号 2 ： F I R542のアミノ酸配列。

配列番号 3 ： CENP— Aをコードする核酸配列。

配列番号 4 ： CENP— Aのアミノ酸配列。

配列番号 5 ： F I Rアミノ酸配列の特異的抗原性ペプチド（配列番号 2の 31-45アミノ酸配列) 。

配列番号 6 ： F I Rァミノ酸配列の別の特異的抗原性べプチド（配列番号 2 の 528 - 542アミノ酸配列）。

配列番号 7 F I Rを同定するための PC R順方向プライマー例。

配列番号 8 F I Rを同定するための PC R逆方向プライマ一例。

配列番号 9 CENP— Aを同定するための PCR順方向プライマー例。配列番号 10 CENP— Aを同定するための PC R逆方向プライマー例。配列番号 1 1 F I R 559 (PUF 60とも称される）をコードする核酸配列。

配列番号 12 F I R 559のアミノ酸配列。

配列番号 13 F I R516をコ一ドする核酸配列。

配列番号 14 F I R 516のアミノ酸配列。

配列番号 1 5 F I R499をコ一ドする核酸配列。

配列番号 16 F I R499のアミノ酸配列。

配列番号 17 F I R 542の変異例の核酸配列（ 1 18 K) 。

配列番号 18 F I R 542の変異例のアミノ酸配列（ 1 18 K) 。

配列番号 19 F I R 542の変異例の核酸配列（ 1 K) 。

配列番号 20 F I R 542の変異例のアミノ酸配列（ 1 K) 。

配列番号 21 F I R 542の変異例の核酸配列（ 28 K) 。

配列番号 22 F I R 542の変異例のアミノ酸配列（ 28 K) 。

配列番号 23 コントロール配列順方向プライマ一 1

配列番号 24 コントロール配列逆方向プライマ一 1 配列番号 2 5 ：コントロール配列順方向プライマー 2

配列番号 2 6 ：コントロール配列逆方向プライマー 2

配列番号 2 7 ：コントロール配列順方向プライマー 3

配列番号 2 8 ：コントロール配列逆方向プライマ一 3

配列番号 2 9 ： F I Rゲノム D N A順方向プライマー

配列番号 3 0 ： F I Rゲノム D NA逆方向プライマー

配列番号 3 1 ： c -m y c D NA順方向プライマ一

配列番号 3 2 ： c -m y c D NA逆方向プライマ一

配列番号 3 3 ： βァクチン D NA順方向プライマ一

配列番号 3 4 ： β了クチン D NA逆方向プライマー発明の詳細な説明

以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従つて、単数形の冠詞または形容詞（例えば、英語の場合は「a」、「a n」、「t h e」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。

( F I Rの背景説明）

本明細書において「F I R」とは、 F B P相互作用リブレッサ一のことをいレ代表的に、配列番号 1および 2で特定される因子をいう。 F I Rは、以下のようないきさつで見出された。 F I Rの具体的な配列などの形態は、本明細書において以下に詳述される。

c— Mycは、細胞の増殖および腫瘍形成に重要な役割を果たす。 c一 my cプロトオンコジーンは、種々の腫瘍中で活性化され、そしてその異所性発現は、細胞の成長、増殖およびトランスフォーメーションを誘導する。逆に、 c -My cの過少発現および過剰発現の両方は、アポトーシス細胞死を導き得る (F I R参考文献 1) 。 c一 My cのダウンレギュレーションは、ヒト白血病細胞においてダルココルチコィド誘導性アポト一シスに必須であり（F I R参考文献 2〜 5) 、そして B細胞における c一 my cの減少は、アポト一シス誘導剤の作用を二倍にする（F I R参考文献 6〜9) 。 c -my cに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた処理は、種々の細胞においてアポトーシスを増強する（F I R参考文献 1) 。一方、 c— my c発現の上昇はまた、特定の状況下においてプロアポ 1 ^一シス（p r o— ap op t o t i c ;すなわちアポトーシスの前段階）であることを証明し得る。 I L一 3依存性骨髄性細胞における c一 my cの強制発現は、 I L一 3欠乏による細胞死を促進させる (F I R参考文献 10) 。 c一 My cを過剰発現する血清欠乏 R a t 1線維芽細胞もまた、アポトーシスを引き起こし得る（F I R参考文献 11) 。これらの観察は、不適切な c—My c発現がアポトーシスと関連するようであることを示し、このことから、腫瘍における細胞増殖および細胞死の明確な説明を得るためには、 MYC調節の理解が必要である。

c一 My c発現は、厳重に調節され、そして次に c一 Mycは、広範囲かつ多彩な標的遺伝子のセットの発現を改変する。 c一 my c発現を調節する分子および機構は、完全に列挙されているわけでも、解明されているわけでも、理解されているわけでもない。 Fa r U s t r e am E l emen t (F USE) は、ヒト c一 my c遺伝子の正確な発現のために必要とされる配列である（F I R参考文献 12) 。 FUSEは、 c一 my cプロモーター P 1の 1. 5 kb上流に位置し、 FUSE結合タンパク質（FBP) (FUSE依存様式で c一 my c発現を刺激する転写因子）に結合する（F I R参考文献 13~1 5) 。酵母ツーハイブリッド分析によって、 FBPは FBP相互作用リブレツサー（F I R) と称される転写阻害活性を有するタンパク質に結合することが、明らかになった。 F I Rは、 FBPの中心 DNA結合ドメインと相互作用する (F I R参考文献 16) 。近年、 F I Rは、 TF I I H/p 89ZXPBヘリカーゼに関与し、プロモーターの離脱を遅延することによって転写を抑制することが見出された。？8患者ぉょび？0患者由来の細胞は、 F I R抑制が欠損し、このことは、 TF I IHおける変異が F I Rによる c— my cの調節を減損させ、おそらく腫瘍発生に寄与することを示唆する（F I R参考文献 1 7) 。

本発明において、本発明者らは、 F I Rの過剰発現がネイティブな（内因性） c _my c発現を抑制し、そして He L a細胞および他の細胞においてァポトーシスを誘導することを示す。 F I Rにる c一 my cのこの抑制は、 c 一 my cがアップレギュレーションされている結腸直腸癌においては、 F I R の過剰発現にかかわらす無効である。どのように c一 my cがダウンレギユレートされ、そして発癌および結腸直腸癌において F I R抑制を回避するかが記載される。

(要約）

c一 My cは、細胞の増殖、分化およびアポトーシスを調節する転写因子である。 c—My c発現のアップレギユレーションおよびダウンレギユレーションの両方が、特定の状況下でアポト一シスを誘導し得る。本発明において、本発明者らは、 c一 my c遺伝子のリブレッサーである F I R (FBP相互作用リブレッサ一）が He L a細胞においてアポトーシスを誘導したことを示す。 F I Rのァミノ末端抑制ドメインの欠失によって F I R駆動性のアポトーシスは起こらなくなり、このことは、細胞死が F I Rの転写標的（例えば、 c— m y c) によって媒介されることを示唆する。結腸直腸腫瘍の評価によって、 F I R mRNAレベルおよび F I Rタンパク質レベルの増加に関わらない、 c -my c発現の上昇（結腸直腸癌においてしばしば観察されることであるが）が明らかになった。 F I R媒介 c一 my c抑制の排除および F I R駆動性アポトーシスに対する耐性は、おそらく、最後に悪性結腸直腸癌となる多段階発癌の重要な工程を表す。

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(F I Rの改変体）

本発明によって、 F I Rに少なくとも 4つの種類の長さの改変体があることが判明した。その配列は、配列番号 1、 1 1、 13、 15においてその核酸配列が、配列番号 2、 12、 14、 16においてそのアミノ酸配列が示されている。配列番号 1および 2で特定される F I Rは、本明細書において F I R 54 2とも称され、正常型の配列である。 F I Rの機能は、 c -my cの発現抑制と報告され（FIR参考文献 16) 、この F I R 542が担うとされている。

配列番号 11および 12で特定される F I Rは、 559アミノ酸配列の長さがあることから F I R 559または PUF 60と呼ばれる。 PUF 60は、 R NA Vo l. 5 (12) 、 1548- 1560 (1999) において報告され、 RNAスプライシングに関与しているとされている。この F I R 559は、配列番号 1において 102位と 103位との間に 17アミノ酸が揷入されている。

配列番号 13および 14で特定される F I Rは、 516アミノ酸配列の長さを有することから、 F I R516と呼ばれる。 F I R516は、 F I R559 から欠失された形態を有する。 .したがって、上述の挿入配列が F I R 559と同様に揷入されているが、 N末端は、 43アミノ酸欠失している。配列番号 15および 16で特定される F I Rは、 499アミノ酸配列の長さを有することから、 F I R499と呼ばれる。 F I R499は、 F I R542 から N末端から 43アミノ酸欠失している。

これらの 4つの改変体に加え、そのアミノ酸配列に置換が見られる改変体もまた本発明によって見出された。この置換は、 N末端側の 400塩基の部位に存在する約 135アミノ酸の領域に多く見られる。

これらの、改変体は、大腸癌組織と正常粘膜とを比較すると、いずれも発現が増大していることが見出された。したがって、これらの改変体は、癌の指標として使用することができる。

これらの存在にもかかわらず、正常型の F I R 542を外的に投与することによって c -my c癌細胞にアポトーシスを誘導することができることもまた実証された。したがって、発現増大している F I R 542は、好ましくは、 F I Rの正常な機能を少なくとも 1つは欠いているといえる。ただし、正常な機能を有する F I Rは、治療効果を有することから、 F I Rの改変体のうち、正常な機能（特に、 FBPへの結合機能）を有するものは、治療用に使用することができる。

(CENP— Aの背景説明）

本明細書において「CENP_A」とは、セントロメァ関連タンパク質として同定されたタンパク質の一種のことをいい、代表的に、配列番号 3および 4 で特定される因子をいう。 CENP— Aは、以下のようないきさつで見出された。 CENP— Aの具体的な配列などの形態は、本明細書において以下に詳述される。

ヒト癌における遺伝子の不安定性は、広く認識されているようである。ほとんどの癌において、この不安定性は、主に、全染色体の増加または損失として染色体レベルで観察され、異数性としても知られている（CENP— A参考文献 1) 。異数性は、ほぼ全ての腫瘍型において見出されており、結腸、頸部、および食道の上皮内癌または前癌性病変において見られるように、腫瘍形成の早期に生じる（CENP— A参考文献 2および CENP— A参考文献 3を参照のこと）。さらに、ヒト細胞およびげつ歯類細胞を用いたインビト口での研究は、異数性が腫瘍性トランスフォーメーションに必要とされることを示している（CENP— A参考文献 4、 CENP— A参考文献 5) 。これらの結果は、異数性が、癌の発症および進行に重要な役割を果たしていることを示唆する。異数性は、異常な数の染色体を示すことから、細胞分裂の間の染色体の誤分離が原因であり得る。多くの有糸分裂プロセスにおける潜在的な障害は、染色体の不均等な分離を引き起こし得る。有糸分裂プロセスは、染色体の凝縮、姉妹染色分体の付着、動原体の集合、中心体の複製、微小管の動態、および細胞周期の適切な進行に関するチェックポイントを含む。近年、これらの有糸分裂標的のいくつかの調節遺伝子が、異数性および発癌の誘導に関与していることが、示された。例えば、 STK15/BTAK/a u r o r a 2および脊椎動物セキユリンは、ヒト腫瘍において過剰発現され、そしてインビ卜口でトランスフオーム活性を示した（CENP— A参考文献 6〜 8) 。このチェックボイント遺伝子 hBUB 1および hBUBR 1は、ヒト結腸直腸癌の小画分において変異していることが見出されており、そして変異 BUB 1の外因性の発現は、異常な紡錘体のチェックポイントを与える（CENP— A参考文献 9) 。

動原体は、セントロメァ DN Aにおいて構築される大きな多タンパク質複合体であり、有糸分裂の間の適切な染色体分離に必須の紡錘体微小管に対する付着部位として機能する。その機能障害は、異数性の主要な要因となり得るが、動原体障害と腫瘍形成との間の直接的な関係は知られていない。今日までに発見されたいくつかの動原体タンパク質の中で、 CENP— A³は、ヒトにおいて最初に同定された動原体成分の 1つである（CENP— A参考文献 10) 。

CENP— A³は、活性なセントロメァでのみ見出され、セントロメァの同一性（i d e n t i t y) の後成的な維持における中心的なエレメントであると考えられている、特有のヒストン H 3様タンパク質である（CENP— A参考文献 1 1および CENP—A参考文献 12を参照のこと）。 CENP— Aは、真核生物間で十分に保存されており（CENP— A参考文献 13〜15) 、 C ENP— Aの変異またはノックアウトは、染色体の誤分離を引き起こす（CE NP - A参考文献 16) 。

これらの観察は、腫瘍細胞における CENP— Aの発現の変化、および CE NP— Aの機能障害が異数性を引き起こし、癌を誘導し得るか否かに関する重要な疑問を投げかける。従って、本発明者らは、結腸直腸癌において CENP 一 Aタンパク質レベルを試験した。本発明者らは、 CENP— Aが、近傍の正常粘膜と比較して、ほとんどの癌組織において高度に過剰発現されていることを見出した。さらに、 CENP— Aは、一部、腫瘍細胞において、セントロメァ関連 DNA結合タンパク質 CENP— Bと共存していなかった。我々の結果は、結腸直腸癌における CENP— Aの高レベルの発現が、クロマチンの非セントロメァ領域との結合および動原体複合体の部分的な破壌を引き起こすことを示唆する。

異数性は、多くのヒト癌の特徴である。近年の研究は、有糸分裂時の染色体の誤分離（m i s s e g r e g a t i ο n) が、異数性の主な要因であり、そして腫瘍形成に寄与することを強く示唆している。セントロメァタンパク質 (CENP) —Aは、セントロメァの構造および機能に必須の、セントロメァ特異的ヒストン H 3様改変体である。この改変体は、染色体の等分に必要不可欠な、動原体と呼ばれるタンパク質複合体の形成において中心的な役割を果たしている。本発明において、本発明者らは、動原体タンパク質 CENP— Aが、 1 1個の原発性ヒト結腸直腸癌組織の全てにおいて過剰発現されていたことを実証する。 CENP— A mRN Aもまたアップレギュレートされており、このことは、 CENP— Aの過剰発現が転写レベルで起こっていることを示す。抗 C EN P— A抗体を用いた免疫染色により、これらの腫瘍細胞において CE NP— Aシグナルが増大していることが示された。さらに、 CENP— Aと C ENP-B (セントロメァ関連 DNA結合タンパク質）との同時免疫染色により、これらの腫瘍細胞において、 CENP— Aが非セントロメァクロマチンに誤標的化されていることが示された。これらの結果は、 CENP— Aの過剰発現が、結腸直腸癌における異数性に対して重要な役割を果たし得ることを示唆する。

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(用語の定義）

以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。

本明細書において使用される用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、「ォリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされたものを包含し得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマ一も包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフイド結合形成、グリコシル化、脂質化、ァセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の 1または 2以上のアナログを含むポリペプチド（例えば、非天然のアミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物（例えば、ぺプトイド）および当該分野において公知の他の改変が包含される。 F I R、 C E N P— Aなどの遺伝子産物は、通常ポリペプチド形態をとる。本明細書では、本発明のポリペプチドは、通常、特定の配列（配列番号 2、 4などまたはそれらの改変体）を有する。 F I R、 C E N P— Aなどの遺伝子の遺伝子産物は、通常、このような配列を有するポリべプチド形態をとる。ここで、改変を有する配列は、本発明において、診断目的に使用され得る。

本明細書において使用される用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」を含む。「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか，またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、 2 ' — 0—メチル—リポヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチォエー卜結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合が N 3 ' - P 5 ' ホスホロアミデート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド. ォリゴヌクレオチド中のリポースとリン酸ジエステル結合とがべプチド核酸結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のゥラシルが C一 5プロピニルゥラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のゥラシルが C一 5チアゾールゥラシルで置換された誘導体ォリゴヌクレオチド、ォリゴヌクレオチド中のシトシンが C一 5プロピエルシトシンで置換された誘導体ォリゴヌクレオチド、ンがフェノキサジン修飾シトシン（phenoxaz i ne— mod i f i e d c y t o s i ne) で置換された誘導体オリゴヌクレオチド、 DNA中のリポースが 2 ' — 0—プロピルリポースで置換された誘導体ォリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド中のリポースが 2' —メトキシエトキシリポースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドなどが例示される。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、 1またはそれ以上の選択された（または、すべての）コドンの 3番目の位置が混合塩基および Zまたはデォキシィノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る (Batzer et al.， Nucleic Acid Res.19:5081 (1991) ; Ohtsuka et al.、 J. Biol. Chem.260: 2605-2608 (1985)； Rossolini et al.>Mol. Cell. Probes 8: 91-98 (1994)) 。 F I R、 C ENP— Aなどの遺伝子は、通常、このポリヌクレオチド形態をとる。

本明細書において使用される用語「核酸分子」もまた、本明細書において、核酸、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと互換可能に使用され、 cDNA、 mRNA、ゲノム DNAなどを含む。本明細書では、核酸および核酸分子は、用語「遺伝子」の概念に含まれ得る。ある遺伝子配列をコードする核酸分子はまた、「スプライス変異体（バリアント、改変体）」を包含する。同様に、核酸によりコードされた特定のタンパク質は、その核酸のスプライス改変体によりコードされる任意のタンパク質を包含する。その名が示唆するように「スプライス変異体」は、遺伝子のオルタナティブスプライシングの産物である。転写後、最初の核酸転写物は、異なる（別の）核酸スプライス産物が異なるポリペプチドをコードするようにスプライスされ得る。スプライス変異体の産生機構は変化するが、ェキソンのオルタナティブスプライシングを含む _c 読み過し転写により同じ核酸に由来する別のポリぺプチドもまた、この定義に包含される。スプライシング反応の任意の産物（組換え形態のスプライス産物を含む）がこの定義に含まれる。したがって、本明細書では、たとえば、 F I R、 C E N P—Aなどの遺伝子には、 F I R、 C E N P— Aなどのスプライス変異体もまた包含され得る。このような変異体は、本発明の診断および治療において有用である。

本明細書において「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいう。タンパク質の一次構造を規定するものを構造遺伝子といい、その発現を左右するものを調節遺伝子（たとえば、プロモー夕一）という。本明細書では、遺伝子は、特に言及しない限り、構造遺伝子および調節遺伝子を包含する。したがって、 F I R、 C E N P— Aなどの遺伝子というときは、通常、 F I R、 C E N P— Aなどの構造遺伝子および F I R、 C E N P— Aなどのプロモーターなどの転写または翻訳の調節配列の両方を包含する。本発明では、これらの調節配列もまた、診断に使用することができる。本明細書では、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」ならびに Zまたは「夕ンパク質」「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」を指すことがある。本明細書においてはまた、「遺伝子産物」は、遺伝子によって発現された「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」ならびにノまたは「タンパク質」「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」を包含する。当業者であれば、遺伝子産物が何たるかはその状況に応じて理解することができる。

本明細書において遺伝子（例えば、核酸配列、アミノ酸配列など）の「相同性」とは、 2以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、ある 2つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。 2種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイプリダイゼーション法によって調べられ得る。 2つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間で D NA配列が、代表的には少なくとも 5 0 %同一である場合、好ましくは少なくとも 7 0 %同一である場合、より好ましくは少なくとも 8 0 %、 9 0 %、 9 5 %、 9 6 %、 9 7 %、 9 8 %または 9 9 %同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。本明細書において、遺伝子（例えば、核酸配列、アミノ酸配列など）の「類似性」とは、上記相同性において、保存的置換をポジティブ (同一）とみなした場合の、 2以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、保存的置換がある場合は、その保存的置換の存在に応じて同一性と類似性とは異なる。また、保存的置換がない場合は、同一性と類似性とは同じ数値を示す。

本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールである F A S T Aを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。

本明細書において「アミノ酸」は、本発明の目的を満たす限り、天然のものでも非天然のものでもよい。「誘導体アミノ酸」または「アミノ酸アナログ」とは、天然に存在するアミノ酸とは異なるがもとのアミノ酸と同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体アミノ酸およびアミノ酸アナログは、当該分野において周知である。

本明細書において「天然のアミノ酸」とは、天然のアミノ酸の L—異性体を意味する。天然のアミノ酸は、グリシン、ァラニン、パリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、メチォニン、トレオニン、フエ二ルァラニン、チロシン、トリブトファン、システィン、プロリン、ヒスチジン、ァスパラギン酸、ァスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、ァ一力ルポキシグルタミン酸、アルギニン、オル二チン、およびリジンである。特に示されない限り、本明細書でいう全てのアミノ酸は L体であるが、 D体のアミノ酸を用いた形態もまた本発明の範囲内にある。本明細書において「非天然アミノ酸」とは、タンパク質中で通常は天然に見出されないアミノ酸を意味する。非天然アミノ酸の例として、ノルロイシン、パラーニトロフエ二ルァラニン、ホモフエ二ルァラニン、パラーフルオロフェ二ルァラニン、 3—アミノー 2—べンジルプロピオン酸、ホモアルギニンの D 体または L体および D—フエ二ルァラニンが挙げられる。

本明細書において「アミノ酸アナログ」とは、アミノ酸ではないが、ァミノ酸の物性および Zまたは機能に類似する分子をいう。アミノ酸アナログとしては、例えば、ェチォニン、カナバニン、 2—メチルグルタミンなどが挙げられるがそれらに限定されない。アミノ酸アナログの例としてのアミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様な様式で機能する化合物をいう。

本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。「誘導体ヌクレオチド」または「ヌクレオチドアナログ」とは、天然に存在するヌクレオチドとは異なるがもとのヌクレオチドと同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログは、当該分野において周知である。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログの例としては、ホスホロチォェ一ト、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネー卜、 2— O—メチルリポヌクレオチド. ペプチド一核酸（PNA) が含まれるが、これらに限定されない。

アミノ酸は、その一般に公知の 3文字記号か、または IUPAC— IUB B i o c hemi c a l Nomenc l a t u r e Co mm i s s i o n により推奨される 1文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に認知された 1文字コードにより言及され得る。本明細書において「対応する」アミノ酸および核酸とは、それぞれあるポリペプチドおよび核酸分子において、比較の基準となるポリペプチドおよび核酸分子における所定のアミノ酸および核酸と同様の作用を有するか、または有することが予測されるアミノ酸および核酸をいい、特に酵素分子にあっては、活性部位中の同様の位置に存在し触媒活性に同様の寄与をするアミノ酸およびそれをコードする核酸をいう。例えば、アンチセンス分子であれば、そのアンチセンス分子の特定の部分に対応するオルソログにおける同様の部分であり得る < 本明細書において「対応する」遺伝子（例えば、ポリペプチド、核酸分子など）とは、ある種において、比較の基準となる種における所定の遺伝子と同様の作用を有するか、または有することが予測される遺伝子をいい、そのような作用を有する遺伝子が複数存在する場合、進化学的に同じ起源を有するものをいう。従って、ある遺伝子の対応する遺伝子は、その遺伝子のオルソログであり得る。したがって、ヒト F I R、 C EN P— Aなどの遺伝子に対応する遺伝子は、他の動物（マウス、ラット、ブ夕、ゥシなど）においても見出すことができる。そのような対応する遺伝子は、当該分野において周知の技術を用いて同定することができる。したがって、例えば、ある動物における対応する遺伝子は、対応する遺伝子の基準となる遺伝子（例えば、ヒト F I R、 CENP- Aなどの遺伝子）の配列をクエリ配列として用いてその動物（例えばマウス、ラット）の配列データベースを検索することによって見出すことができる。本明細書において「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さが n) に対して、 l〜n— 1までの配列長さを有するポリべプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリぺプチドの場合、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 1 5， 20、 25、 30、 40、 50およびそれ以上のアミノ酸が挙げちれ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、 1 1など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 15， 2 0、 25、 30、 40、 50、 75、 100およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、 1 1 など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの長さは、上述のようにそれぞれアミノ酸または核酸の個数で表すことができるが、上述の個数は絶対的なものではなく、同じ機能を有する限り、上限または加減としての上述の個数は、その個数の上下数個 (または例えば上下 1 0 %) のものも含むことが意図される。そのような意図を表現するために、本明細書では、個数の前に「約」を付けて表現することがある。しかし、本明細書では、「約」のあるなしはその数値の解釈に影響を与えないことが理解されるべきである。

本明細書において生物学的因子（例えば、ポリヌクレオチドまたはポリぺプチド）に対して「特異的に相互作用する因子」または「特異的な因子」とは、交換可能に使用され、その生物学的因子（例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）に対する親和性が、他の無関連の（特に、同一性が 3 0 %未満のもの。あるいは、ある特定の場合、同一性 9 9 %未満のもの。さらに別の実施形態では、点変異のみの相違を有するものなど）生物学的因子（例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）に対する親和性よりも、代表的には同等またはより高いか、好ましくは有意に高いものをいう。そのような親和性は、例えば、ハイブリダィゼ一シヨンアツセィ、結合アツセィなどによって測定することができる。生物学的因子がポリペプチドの場合、そのポリペプチドに特異的な因子には、特異的抗体が含まれ、特定の実施形態では、本発明の特異的な因子には、この特異的抗体に対して特異的な因子を含み得ることが理解される _c このような特異的抗体に対して特異的な因子には、目的とするポリペプチド自体が含まれることが理解される。

本明細書において「因子」としては、意図する目的を達成することができる限りどのような物質または他の要素（例えば、エネルギー）でもあってもよい _£ そのような物質としては、例えば、タンパク質（例えば、抗体を含む）、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、 c D NA、ゲノム D NAのような D NA、 mR NAのような R N Aを含む）、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、有機低分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンピナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子 (例えば、低分子リガンドなど）など）、これらの複合分子（例えば、糖タンパク質、糖脂質など）が挙げられるがそれらに限定されない。ポリヌクレオチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリヌクレオチドの配列に対して一定の配列相同性を（例えば、 7 0 %以上の配列同一性）もって相補性を有するポリヌクレオチド、プロモーター領域に結合する転写因子のようなポリペプチドなどが挙げられるがそれらに限定されない。したがって、そのような因子としては、例えば、アンチセンス、 R NA iなどが挙げられるがそれらに限定されない。ポリペプチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリペプチドに対して特異的に指向された抗体またはその誘導体あるいはその類似物（例えば、単鎖抗体）、そのポリペプチドがレセプターまたはリガンドである場合の特異的なリガンドまたはレセプター、そのポリペプチドが酵素である場合、その基質などが挙げられるがそれらに限定されない。

本明細書において「有機低分子」とは、有機分子であって、比較的分子量が小さなものをいう。通常有機低分子は、分子量が約 1 0 0 0以下のものをいうが、それ以上のものであってもよい。有機低分子は、通常当該分野において公知の方法を用いるかそれらを組み合わせて合成することができる。そのような有機低分子は、生物に生産させてもよい。有機低分子としては、例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子（例えば、低分子リガンドなど）などが挙げられるがそれらに限定されない。

本明細書において「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、多重特異性抗体、キメラ抗体、および抗ィディォ夕ィ 2003/010676

プ抗体、ならびにそれらの断片、例えば F (a b' ) ₂および F ab断片、ならびにその他の組換えにより生産された結合体を含む。さらにこのような抗体を、酵素、例えばアルカリホスファタ一ゼ、西洋ヮサビペルォキシダーゼ、 0；ガラクトシダ一ゼなど、に共有結合させまたは組換えにより融合させてよい。本明細書中で使用される「モノクロ一ナル抗体 j は、同質な抗体集団を有する抗体組成物をいう。この用語は、それが作製される様式では限定されない。この用語は、全免疫グロブリン分子ならびに Fab分子、 F (ab' ) ₂フラグメント、 Fvフラグメント、およびもとのモノクローナル抗体分子の免疫学的結合特性を示す他の分子を含む。ポリク口一ナル抗体およびモノク口一ナル抗体を作製する方法は当該分野で公知であり、そして以下でより十分に記載される。

モノクローナル抗体は、当該分野で周知の標準的な技術（例えば、 Koh l e rおよび M i 1 s t e i n, Na t u r e (1975) 256 : 495) またはその改変（例えば、 Buc kら（1982) I n V i t r o 18 : 3 77) を使用して調製される。代表的には、マウスまたはラットを、タンパク質キャリアに結合したタンパク質で免疫化し、追加免疫し、そして脾臓（および必要に応じていくつかの大きなリンパ節）を取り出し、そして単一細胞を解離する。必要に応じて、この脾臓細胞は、非特異的接着細胞の除去後、抗原でコ一ティングされたプレートまたはゥエルに細胞懸濁液を適用することによりスクリーニングされ得る。抗原に特異的なィムノグロブリンを発現する B細胞がプレートに結合し、そして懸濁液の残渣でもリンス除去されない。次いで、得られた B細胞（すなわちすべての剥離した脾臓細胞）をミエローマ細胞と融合させて、ハイプリドーマを得、この八イブリドーマを用いてモノクローナル抗体を産生させる。

本明細書において「抗原」（an t i g e n) とは、抗体分子によって特異的に結合され得る任意の基質をいう。本明細書において「免疫原」（immu n o g e n ) とは、抗原特異的免疫応答を生じるリンパ球活性化を開始し得る抗原をいう。

本明細書において「単鎖抗体」とは、 F v領域の重鎖フラグメントおよび軽鎖フラグメントがアミノ酸架橋を介して連結されれることによって形成され、単鎖ポリペプチドを生じたものをいう。

本明細書において「複合分子」とは、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、脂質、糖、低分子などの分子が複数種連結してできた分子をいう。そのような複合分子としては、例えば、糖脂質、糖ペプチドなどが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書では、 F I R、 C E N P— Aなどの遺伝子またはその産物あるいは本発明の因子と同様の機能を有する限り、それぞれ F I R、 C E N P— Aなどの遺伝子またはその産物あるいは本発明の因子としてそのような複合分子も使用することができる。

本明細書において「単離された」物質（例えば、核酸またはタンパク質などのような生物学的因子）とは、その物質が天然に存在する環境（例えば、生物体の細胞内）の他の物質（好ましくは、生物学的因子）（例えば、核酸である場合、核酸以外の因子および目的とする核酸以外の核酸配列を含む核酸；タンパク質である場合、タンパク質以外の因子および目的とするタンパク質以外のアミノ酸配列を含むタンパク質など）から実質的に分離または精製されたものをいう。「単離された」核酸およびタンパク質には、標準的な精製方法によつて精製された核酸およびタンパク質が含まれる。したがって、単離された核酸およびタンパク質は、化学的に合成した核酸およびタンパク質を包含する。本明細書において「精製された」物質（例えば、核酸またはタンパク質などのような生物学的因子）とは、その物質に天然に随伴する因子の少なくとも一部が除去されたものをいう。したがって、通常、精製された物質におけるその物質の純度は、その物質が通常存在する状態よりも高い（すなわち濃縮されている）。 6

本明細書において「精製された」および「単離された」とは、好ましくは少なくとも 7 5重量％、より好ましくは少なくとも 8 5重量％、よりさらに好ましくは少なくとも 9 5重量％、そして最も好ましくは少なくとも 9 8重量％の、同型の物質が存在することを意味する。

本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなど遺伝子産物の「発現」とは、その遺伝子（通常は、 D NA形態）などがインビポで一定の作用を受けて、別の形態になることをいう。好ましくは、遺伝子、ポリヌクレォチドなどが、転写および翻訳されて、ポリペプチドの形態になることをいうが、転写されて mR NAが作製されることもまた発現の一形態であり得る。別の実施形態では、そのようなポリペプチドの形態は、翻訳後プロセシングを受けたものであり得る。

従って、本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」の「減少」とは、本発明の因子を作用させたときに、作用させないときよりも、発現の量が有意に減少することをいう。好ましくは、発現の減少は、ポリペプチドの発現量の減少を含む。本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」の「増加」とは、本発明の因子を作用させたときに、作用させないときよりも、発現の量が有意に増加することをいう。好ましくは、発現の増加は、ポリペプチドの発現量の増加を含む。本明細書において遺伝子の「発現」の「誘導」とは、ある細胞にある因子を作用させてその遺伝子の発現量を増加させることをいう。したがって、発現の誘導は、まつたくその遺伝子の発現が見られなかった場合にその遺伝子が発現するようにすること、およびすでにその遺伝子の発現が見られていた場合にその遺伝子の発現が増大することを包含する。

本明細書において、遺伝子が「特異的に発現する」とは、その遺伝子が、植物の特定の部位または時期において他の部位または時期とは異なる（好ましくは高い）レベルで発現されることをいう。特異的に発現するとは、ある部位 (例えば、癌罹患部位などの特異的部位）にのみ発現してもよく、それ以外の部位においても発現していてもよい。好ましくは特異的に発現するとは、ある部位においてのみ発現することをいう。

本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子（例えば、ポリペプチドまたはタンパク質）が、生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能（例えば、転写促進活性）を発揮する活性が包含される。例えば、 2つの因子が相互作用する（例えば、 F I R、 C E N P— Aなどとその受容体とが結合する）場合、その生物学的活性は、 F I R、 C E N P— Aなどとその受容体との間の結合およびそれによつて生じる生物学的変化（例えば、アポト一シス）などを包含する。 F I Rでは、 F B Pとの結合などが挙げられる。 C E N P— Aでは、セントロメァクロマチンとの結合などが挙げられるがそれらに限定されない。例えば、ある因子が酵素である場合、その生物学的活性は、その酵素活性を包含する。別の例では、ある因子がリガンドである場合、そのリガンドが対応するレセプタ一への結合を包含する。そのような生物学的活性は、当該分野において周知の技術によって測定することができる。あるいは、本発明においては、生体内にある改変体分子と同様の活性を有する場合もまた、生物学的活性を有するとの定義に含め得る。

本明細書において「アンチセンス（活性）」とは、標的遺伝子の発現を特異的に抑制または低減することができる活性をいう。アンチセンス活性は、通常、目的とする遺伝子（例えば、 F I R、 C E N P— Aなど）の核酸配列と相補的な、少なくとも 8の連続するヌクレオチド長の核酸配列によって達成される。そのような活性を有する核酸分子をアンチセンス分子という。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも 9の連続するヌクレオチド長の、より好ましく 1 0の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは 1 1の連続するヌクレォチド長の、 1 2の連続するヌクレオチド長の、 1 3の連続するヌクレオチド長の、 1 4の連続するヌクレオチド長の、 1 5の連続するヌクレオチド長の、 20の連続するヌクレオチド長の、 25の連続するヌクレオチド長の、 30の連続するヌクレオチド長の、 40の連続するヌクレオチド長の、 50の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。そのような核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも 70%相同な、より好ましくは、少なくとも 80% 相同な、さらに好ましくは、 90%相同な、もっとも好ましくは 95%相同な核酸配列が含まれる。そのようなアンチセンス活性は、目的とする遺伝子の核酸配列の 5' 末端の配列に対して相捕的であることが好ましい。そのようなァンチセンスの核酸配列には、上述の配列に対して、 1つまたは数個あるいは 1 つ以上のヌクレオチドの置換、付加および Zまたは欠失を有するものもまた含まれる。

本明細書において「RNA i」とは、 RNA i n t e r f e r enc eの略称で、二本鎖 RNA (d s RNAともいう）のような RNA iを引き起こす因子を細胞に導入することにより、相同な mRNAが特異的に分解され、遺伝子産物の合成が抑制される現象およびそれに用いられる技術をいう。本明細書において RNA iはまた、場合によっては、 RNA iを引き起こす因子と同義に用いられ得る。

本明細書において「RNA iを引き起こす因子」とは、 RNA iを引き起こすことができるような任意の因子をいう。本明細書において「遺伝子」に対して「RNA iを引き起こす因子」とは、その遺伝子に関する RNA iを引き起こし、 RNA iがもたらす効果（例えば、その遺伝子の発現抑制など）が達成されることをいう。そのような RNA iを引き起こす因子としては、例えば、標的遺伝子の核酸配列の一部に対して少なくとも約 70%の相同性を有する配列またはストリンジェントな条件下でハイプリダイズする配列を含む、少なくとも 10ヌクレオチド長の二本鎖部分を含む RN Aまたはその改変体が挙げられるがそれに限定されない。ここで、この因子は、好ましくは、 3' 突出末端を含み、より好ましくは、 3' 突出末端は、 2ヌクレオチド長以上の DNA (例えば、 2〜4ヌクレオチド長の DN Aであり得る。

理論に束縛されないが、； NA iが働く機構として考えられるものの一つとして、 d s RNAのような RNA iを引き起こす分子が細胞に導入されると、比較的長い（例えば、 40塩基対以上） RNAの場合、ヘリカーゼドメインを持つダイサー（D i c e r) と呼ばれる RN a s e l l I様のヌクレアーゼが ATP存在下で、その分子を 3' 末端から約 20塩基対ずつ切り出し、短鎖 d s RNA (s i RNAとも呼ばれる）を生じる。本明細書において「_s i RN A」とは、 s ho r t i n t e r f e r i ng RNAの略称であり、人工的に化学合成されるかまたは生化学的に合成されたものか、あるいは生物体内で合成されたものか、あるいは約 40塩基以上の二本鎖 RN Aが体内で分解されてできた 10塩基対以上の短鎖二本鎖 RNAをいい、通常、 5' —リン酸、 3 ' 一 OHの構造を有しており、 3 ' 末端は約 2塩基突出している。この s i RNAに特異的なタンパク質が結合して、 R I SC (RNA- i ndu c e d 一 s i 1 e n c i n g— c omp 1 e x) が形成される。この複合体は、 s i RNAと同じ配列を有する mRN Aを認識して結合し、 RNa s e I I I様の酵素活性によって s i RNAの中央部で mRNAを切断する。 s i RNAの配列と標的として切断する mRNAの配列の関係については、 100%—致することが好ましい。しかし、 s i RN Aの中央から外れた位置についての塩基の変異については、完全に RNA iによる切断活性がなくなるのではなく、部分的な活性が残存する。他方、 s i RNAの中央部の塩基の変異は影響が大きく RNA iによる mRNAの切断活性が極度に低下する。このような性質を利用して、変異をもつ mRNAについては、その変異を中央に配した s i RNAを合成し、細胞内に導入することで特異的に変異を含む mRN Aだけを分解することができる。従って、本発明では、 s i RNAそのものを RNA iを引き起こす因子として用いることができるし、 s i RNAを生成するような因子（例えば、代表的に約 40塩基以上の d s RNA) をそのような因子として用いることができる。

また、理論に束縛されることを希望しないが、 s i RNAは、上記経路とは別に、 s i RNAのアンチセンス鎖が mRNAに結合して RNA依存性 RNA ポリメラーゼ（RdRP) のプライマーとして作用し、 d sRNAが合成され、この d s RNAが再びダイサ一の基質となり、新たな s i RNAを生じて作用を増幅することも企図される。従って、本発明では、 s i RNA自体および s i RNAが生じるような因子もまた、有用である。実際に、昆虫などでは、例えば 35分子の d s RNA分子が、 1， 000コピ一以上ある細胞内の mRN Aをほぼ完全に分解することから、 s i RNA自体および s i RNAが生じるような因子が有用であることが理解される。

本発明において s i RNAと呼ばれる、約 20塩基前後（例えば、代表的には約 2；!〜 23塩基長）またはそれ未満の長さの二本鎖 RNAを用いることができる。このような s i RNAは、細胞に発現させることにより遺伝子発現を抑制し、その s i RNAの標的となる病原遺伝子の発現を抑えることから、疾患の治療、予防、予後などに使用することができる。

本発明において用いられる s i RNAは、 RNA iを引き起こすことができる限り、どのような形態を採っていてもよい。

別の実施形態において、本発明の RNA iを引き起こす因子は、 3' 末端に突出部を有する短いヘアピン構造（s hRNA； s h ο r t h a i r p i n RNA) であり得る。本明細書において「s hRNA」とは、一本鎖 RNAで部分的に回文状の塩基配列を含むことにより、分子内で二本鎖構造をとり、へァピンのような構造となる約 20塩基対以上の分子をいう。そのような s hR NAは、人工的に化学合成される。あるいは、そのような s hRNAは、センス鎖およびアンチセンス鎖の DN A配列を逆向きに連結したヘアピン構造の D NAを T7 RNAポリメラーゼによりインビト口で; NAを合成することによって生成することができる。理論に束縛されることは希望しないが、そのような s hRNAは、細胞内に導入された後、細胞内で約 20塩基（代表的には例えば、 21塩基、 22塩基、 23塩基）の長さに分解され、 s i RNAと同様に RNA iを引き起こし、本発明の処置効果があることが理解されるべきである。このような効果は、昆虫、植物、動物（哺乳動物を含む）など広汎な生物において発揮されることが理解されるべきである。このように、 s hRNA は、 s i RNAと同様に RNA iを引き起こすことから、本発明の有効成分として用いることができる。 s hRNAはまた、好ましくは、 3' 突出末端を有し得る。二本鎖部分の長さは特に限定されないが、好ましくは約 10ヌクレオチド長以上、より好ましくは約 20ヌクレオチド長以上であり得る。ここで、 3' 突出末端は、好ましくは DNAであり得、より好ましくは少なくとも 2ヌクレオチド長以上の D N Aであり得、さらに好ましくは 2〜4ヌクレオチド長の DNAであり得る。

本発明において用いられる RNA iを引き起こす因子は、人工的に合成した (例えば、化学的または生化学的）ものでも、天然に存在するものでも用いることができ、この両者の間で本発明の効果に本質的な違いは生じない。化学的に合成したものでは、液体クロマトグラフィーなどにより精製をすることが好ましい。

本発明において用いられる RNA iを引き起こす因子は、インビトロで合成することもできる。この合成系において、 T7 RNAポリメラーゼおよび T 7プロモーターを用いて、铸型 DNAからアンチセンスおよびセンスの RNA を合成する。これらをインビトロでアニーリングした後、細胞に導入すると、上述のような機構を通じて RNA iが引き起こされ、本発明の効果が達成される。ここでは、例えば、リン酸カルシウム法でそのような RNAを細胞内に導入することができる。本発明の: NA iを引き起こす因子としてはまた、 mRNAとハイブリダィズし得る一本鎖、あるいはそれらのすべての類似の核酸アナログのような因子も挙げられる。そのような因子もまた、本発明の処置方法および組成物において有用である。

本明細書において「ストリンジェントな条件でハイブリダィズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプロ一ブとして、コロニー ·ハイブリダイゼ一シヨン法、プラーク ·ハイプリダイゼーシヨン法あるいはサザンプロットハイプリダイゼーション法等を用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、ストリンジエンドな条件でハィブリダイズするポリヌクレオチドは、コロニーあるいはプラーク由来の D N Aを固定化したフィルターを用いて、 0. 7〜1. 0Mの NaC l存在下、 6 5 °Cでハイブリダィゼ一シヨンを行った後、 0. 1〜2倍濃度の S SC (s a l i ne— s o d i um c i t r a t e) 溶液（1倍濃度の S S C溶液の組成は、 150mM 塩化ナトリウム、 1 5mM クェン酸ナトリウムである）を用い、 65で条件下でフィルタ一を洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダィゼーシヨンは、 Molecular Cloning 2nd ed.， Current Protocols in Molecular Biology, Sup lement 1-38 , DNA Cloning 1 :Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995)等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダィズする配列からは、好ましくは、 A配列のみまたは T配列のみを含む配列が除外される。「ハイブリダィズ可能なポリヌクレオチド」とは、上記八イブリダィズ条件下で別のポリヌクレオチドにハイプリダイズすることができるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダィズ可能なポリヌクレオチドとして具体的には、本発明で具体的に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする DNAの塩基配列と少なくとも 60%以上の相同性を有するポリヌクレオチド、好ましくは 80%以上の相同性を有するポリヌクレオチド、さらに好ましくは 95%以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。

本明細書において「プローブ」とは、インビトロおよび/またはインビポなどのスクリーニングなどの生物学的実験において用いられる、検索の対象となる物質をいい、例えば、特定の塩基配列を含む核酸分子または特定のアミノ酸配列を含むペプチドなどが挙げられるがそれに限定されない。

通常プロ一ブとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列と相同なまたは相補的な、少なくとも 8の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも 9の連続するヌクレオチド長の、より好ましく 10の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは 1 1の連続するヌクレオチド長の、 12の連続するヌクレオチド長の、 13の連続するヌクレオチド長の、 14の連続するヌクレォチド長の、 15の連続するヌクレオチド長の、 20の連続するヌクレオチド長の、 25の連続するヌクレオチド長の、 30の連続するヌクレオチド長の、 40の連続するヌクレオチド長の、 50の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも 70%相同な、より好ましくは、少なくとも 80%相同な、さらに好ましくは、 90%相同な、 95%相同な核酸配列が含まれる。

本明細書において「検索」とは、電子的にまたは生物学的あるいは他の方法により、ある核酸塩基配列を利用して、特定の機能および/または性質を有する他の核酸塩基配列を見出すことをいう。電子的な検索としては、 BLAST (Altschul et al., J. Mol, Biol. 215: 403-410 (1990)) > FASTA (Pearson S Li man, Pro Natl. Acad. Sci.， USA 85: 2444-2448(1988)), Sm i t h and Wa t e r ma n法 (Smith and Waterman, J. Mol. Biol. 1 7: 195-197 (1981))、および N e e d 1 ema n a n d Wu n s c h法 (Needleman and Wunsch, J. ol. Biol . 8: 443-453 (1970))などが挙げられるがそれらに限定されない。生物学的な検索としては、ストリンジェント八ィブリダィゼーシヨン、ゲノム D NAをナイロンメンブレン等に貼り付けたマクロアレイまたはガラス板に貼り付けたマイクロアレイ（マイクロアレイアツセィ）、 P C Rおよび i n s i t 11ハイブリダィゼーシヨンなどが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書において、 F I R、 C E N P— Aなどには、このような電子的検索、生物学的検索によって同定された対応遺伝子も含まれるべきであることが意図される。

本明細書における「プライマ一」とは、高分子合成酵素反応において、合成される高分子化合物の反応の開始に必要な物質をいう。核酸分子の合成反応では、合成されるべき高分子化合物の一部の配列に相補的な核酸分子（例えば、

D NAまたはR NAなど）が用いられ得る。

通常プライマーとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列と相補的な、少なくとも 8の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも 9の連続するヌクレオチド長の、より好ましく 1 0の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは 1 1の連続するヌクレオチド長の、 1 2の連続するヌクレオチド長の、 1 3の連続するヌクレオチド長の、 1 4の連続するヌクレオチド長の、 1 5の連続するヌクレオチド長の、 1 6の連続するヌクレオチド長の、 1 7の連続するヌクレオチド長の、 1 8の連続するヌクレオチド長の、 1 9の連続するヌクレオチド長の、 2 0の連続するヌクレオチド長の、 2 5の連続するヌクレオチド長の、 3 0の連続するヌクレオチド長の、 4 0の連続するヌクレオチド長の、 5 0の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも 7 0 %相同な、より好ましくは、少なくとも 8 0 %相同な、さらに好ましくは、 9 0 %相同な、 9 5 %相同な核酸配列が含まれる。プライマーとして適切な配列は、合成（増幅）が意図される配列の性質によって変動し得るが、当業者は、意図される配列に応じて適宜プライマ一を設計することができる。そのようなプライマーの設計は当該分野において周知であり、手動でおこなってもよくコンピュータプログラム（例えば、 LASERGENE, P r ime r S e l e c t, DNA S t a r) を用いて行ってもよい。

本明細書において「ェピトープ」とは、抗原を決定する構造を構成する基のことをいう。従って、ェピト一プには特定の免疫グロブリンによる認識に関与するアミノ酸残基のセット、または、 T細胞の場合は、 T細胞レセプタータンパク質および Zもしくは主要組織適合性複合体 (MHC) レセプ夕一による認識について必要であるアミノ酸残基のセットが包含される。この用語はまた、

「抗原決定基」または「抗原決定部位」と交換可能に使用される。免疫系分野において、インビポまたはインビトロで、ェピトープは、分子の特徴（例えば、一次ペプチド構造、二次ペプチド構造または三次ペプチド構造および電荷）であり、免疫グロブリン、 T細胞レセプターまたは HLA分子によって認識される部位を形成する。ペプチドを含むェピトープは、ェピトープに独特な空間的コンフオメーシヨン中に 3つ以上のアミノ酸を含み得る。一般に、ェピト一プは、少なくとも 5つのこのようなアミノ酸からなり、代表的には少なくとも 6 つ、 7つ、 8つ、 9つ、または 10のこのようなアミノ酸からなる。ェピ! プの長さは、より長いほど、もとのペプチドの抗原性に類似することから一般的に好ましいが、コンフオメーシヨンを考慮すると、必ずしもそうでないことがある。アミノ酸の空間的コンフオメ一シヨンを決定する方法は、当該分野で公知であり、例えば、 X線結晶学、および 2次元核磁気共鳴分光法を含む。さらに、所定のタンパク質におけるェピトープの同定は、当該分野で周知の技術を使用して容易に達成される。例えば、 Ge y s enら（1984) P r o c. Na t l . Ac ad. S c i . USA 81 : 3998 (所定の抗原における免疫原性ェピトープの位置を決定するために迅速にペプチドを合成する一般的な方法）；米国特許第 4， 708， 871号（抗原のェピトープを同定し、そして化学的に合成するための手順）；および Ge y s enら（1986) Mo 1 e c u 1 a r I mmu n o 1 o gy 23 : 709 (所定の抗体に対して高い親和性を有するペプチドを同定するための技術）を参照されたい。同じェピトープを認識する抗体は、単純な免疫アツセィにおいて同定され得る。このように、ペプチドを含むェピトープを決定する方法は、当該分野において周知であり、そのようなェピトープは、核酸またはアミノ酸の一次配列が提供されると、当業者はそのような周知慣用技術を用いて決定することができる。

従って、ペプチドを含むェピトープとして使用するためには、少なくとも 3 アミノ酸の長さの配列が必要であり、好ましくは、この配列は、少なくとも 4 アミノ酸、より好ましくは 5アミノ酸、 6アミノ酸、 7アミノ酸、 8アミノ酸、 9アミノ酸、 10アミノ酸、 15アミノ酸、 20アミノ酸、 25アミノ酸の長さの配列が必要であり得る。 (遺伝子の改変）

本発明の F I R、 CENP— Aは、人為的に改変して用いることができる。あるタンパク質分子において、配列に含まれるあるアミノ酸は、相互作用結合能力の明らかな低下または消失なしに、例えば、カチオン性領域または基質分子の結合部位のようなタンパク質構造において他のアミノ酸に置換され得る。あるタンパク質の生物学的機能を規定するのは、タンパク質の相互作用能力および性質である。従って、特定のアミノ酸の置換がアミノ酸配列において、またはその DNAコード配列のレベルにおいて行われ得、置換後もなお、もとの性質を維持するタンパク質が生じ得る。従って、生物学的有用性の明らかな損失なしに、種々の改変が、本明細書において開示されたペプチドまたはこのべプチドをコードする対応する核酸分子において行われ得る。上記のような改変を設計する際に、アミノ酸の疎水性指数が考慮され得る。タンパク質における相互作用的な生物学的機能を与える際の疎水性アミノ酸指数の重要性は、一般に当該分野で認められている（Ky t e. Jおよび Doo l i t t l e, R. F. J. Mo 1. B i o l. 157 (1) : 105 - 13 2, 1982) 。アミノ酸の疎水的性質は、生成したタンパク質の二次構造に寄与し、次いでそのタンパク質と他の分子（例えば、酵素、基質、レセプ夕一、 DNA、抗体、抗原など）との相互作用を規定する。各アミノ酸は、それらの疎水性および電荷の性質に基づく疎水性指数を割り当てられる。それらは：ィソロイシン（+4. 5) ；バリン（+4. 2) ；ロイシン（+3. 8) ；フエ二ルァラニン（+2. 8) ；システィン Zシスチン（+2. 5) ；メチォニン

(+1. 9) ァラニン（+1. 8) ；グリシン（一 0. 4) ；スレオニン (― 0. 7) セリン（一 0. 8) ；トリブトファン（一0. 9) ；チロシン (一 1. 3) プロリン（一 1. 6) ；ヒスチジン（—3. 2) ；グルタミン酸（—3. 5) ；グルタミン（—3. 5) ；ァスパラギン酸（一 3. 5) ；ァスパラギン（一 3. 5) ；リジン（—3. 9) ；およびアルギニン（一 4. 5) ) である。

あるアミノ酸を、同様の疎水性指数を有する他のアミノ酸により置換して、そして依然として同様の生物学的機能を有するタンパク質（例えば、酵素活性において等価なタンパク質）を生じさせ得ることが当該分野で周知である。このようなァミノ酸置換において、疎水性指数が土 2以内であることが好ましく ± 1以内であることがより好ましく、および ±0. 5以内であることがさらにより好ましい。疎水性に基づくこのようなアミノ酸の置換は効率的であることが当該分野において理解される。

ポリペプチドはまた、親水性指数を考慮して改変され得る。米国特許第 4, 554, 101号に記載されるように、以下の親水性指数がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（+ 3. 0) ；リジン（+3. 0) ；ァスパラギン酸（+3. 0±1) ；グルタミン酸（+3. 0±1) ；セリン（+0.

3) ；ァスパラギン（+0. 2) ；グルタミン（+0. 2) ；グリシン

(0) ；スレオニン（一 0. 4) ；プロリン（一 0. 5±1) ；ァラニン（一 0. 5) ；ヒスチジン（一 0. 5) ；システィン（一 1. 0) ；メチォニン (—1. 3) ；バリン（一 1. 5) ；ロイシン（一 1. 8) ；ィソロイシン

(- 1. 8) ；チロシン（一 2. 3) ；フエ二ルァラニン（一2. 5) ；およびトリブトファン（一 3. 4) 。アミノ酸が同様の親水性指数を有しかつ依然として生物学的等価体を与え得る別のものに置換され得ることが理解される。このようなァミノ酸置換において、親水性指数が土 2以内であることが好ましく、 ± 1以内であることがより好ましく、および ±0. 5以内であることがさらにより好ましい。

本明細書において「保存的置換」とは、アミノ酸置換において、元のアミノ酸と置換されるアミノ酸との親水性指数または Zおよび疎水性指数が上記のように類似している置換をいう。保存的置換の例としては、例えば、親水性指数または疎水性指数が、 ±2以内のもの同士、好ましくは ± 1以内のもの同士、より好ましくは ± 0. 5以内のもの同士のものが挙げられるがそれらに限定されない。従って、保存的置換の例は、当業者に周知であり、例えば、次の各グループ内での置換：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびァスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびァスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシン、などが挙げられるがこれらに限定されない。

本明細書において「改変体」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、欠失改変体、短縮（ t r u n c a t e d) 改変体、対立遺伝子変異体などが挙げられる。そのような改変体としては、基準となる核酸分子またはポリペプチドに対して、 1または数個の置換、付加 6

および Zまたは欠失、あるいは 1つ以上の置換、付加およびノまたは欠失を含むものが挙げられるがそれらに限定されない。対立遺伝子（a l l e l e) とは、同一遺伝子座に属し、互いに区別される遺伝的改変体のことをいう。従つて、「対立遺伝子変異体」とは、ある遺伝子に対して、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。そのような対立遺伝子変異体は、通常その対応する対立遺伝子と同一または非常に類似性の高い配列を有し、通常はほぼ同一の生物学的活性を有するが、まれに異なる生物学的活性を有することもある。「種相同体またはホモログ（homo 1 og) 」とは、ある種の中で、ある遺伝子とァミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルで、相同性（好ましくは、 60%以上の相同性、より好ましくは、 80%以上、 85%以上、 90%以上、 95%以上の相同性）を有するものをいう。そのような種相同体を取得する方法は、本明細書の記載から明らかである。「オルソログ（o r t ho 1 og) 」とは、オルソロガス遺伝子（o r t ho l ogou s gene) ともいい、二つの遺伝子がある共通祖先からの種分化に由来する遺伝子をいう。例えば、多重遺伝子構造をもつヘモグロビン遺伝子ファミリ一を例にとると、ヒトおよびマウスのひヘモグロビン遺伝子はオルソログであるが，ヒトの αヘモグロビン遺伝子および /3ヘモグロビン遺伝子はパラログ（遺伝子重複で生じた遺伝子）である。オルソログは、分子系統樹の推定に有用である。オルソログは、通常別の種において、もとの種と同様の機能を果たしていることがあり得ることから、本発明のオルソログもまた、本発明において有用であり得る。

本明細書において「保存的（に改変された）改変体」は、アミノ酸配列およぴ核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体とは、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をいい、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一な配列をいう。遺伝コードの縮重のため、多数の機能的に同一な核酸が任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドン GCA、 GCC、 GCG、および GCU はすべて、アミノ酸ァラニンをコードする。したがって、ァラニンがコドンにより特定される全ての位置で、そのコドンは、コードされたポリペプチドを変更することなく、記載された対応するコドンの任意のものに変更され得る。このような核酸の変動は、保存的に改変された変異の 1つの種である「サイレント改変（変異）」である。ポリペプチドをコードする本明細書中のすべての核酸配列はまた、その核酸の可能なすべてのサイレント変異を記載する。当該分野において、核酸中の各コドン（通常メチォニンのための唯一のコドンである AUG, および通常トリブトファンのための唯一のコドンである TGGを除く）が、機能的に同一な分子を産生するために改変され得ることが理解される。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレン卜変異は、記載された各配列において暗黙に含まれる。サイレント変異もまた、本発明の診断の指標であり得る。好ましくは、そのような改変は、ポリペプチドの高次構造に多大な影響を与えるアミノ酸であるシスティンの置換を回避するようになされ得る。このような塩基配列の改変法としては、制限酵素などによる切断、 DNA ポリメラーゼ、 K 1 e n owフラグメント、 DNAリガーゼなどによる処理等による連結等の処理、合成オリゴヌクレオチドなどを用いたき 15位特異的塩基置換法（特定部位指向突然変異法； Ma r k Z o l l e r and Mi c h a e 1 Smi t h, Me t h o d s i n E n z ymo l o gy, 100， 468- 500 (1983) ) が挙げられるが、この他にも通常分子生物学の分野で用いられる方法によって改変を行うこともできる。

本明細書中において、機能的に等価なポリペプチドを作製するために、アミノ酸の置換のほかに、アミノ酸の付加、欠失、または修飾もまた行うことができる。アミノ酸の置換とは、もとのペプチドを 1つ以上、例えば、 1〜1 0個、好ましくは 1〜5個、より好ましくは 1〜3個のアミノ酸で置換することをいう。アミノ酸の付加とは、もとのペプチド鎖に 1つ以上、例えば、 1〜10個、好ましくは 1~5個、より好ましくは 1〜3個のアミノ酸を付加することをいう。アミノ酸の欠失とは、もとのペプチドから 1つ以上、例えば、 1 ~ 1 0個、好ましくは 1〜 5個、より好ましくは 1〜3個のアミノ酸を欠失させることをいう。アミノ酸修飾は、アミド化、カルボキシル化、硫酸化、ハロゲン化、ァルキル化、グリコシル化、リン酸化、水酸化、ァシル化（例えば、ァセチル化）などを含むが、これらに限定されない。置換、または付加されるアミノ酸は、天然のアミノ酸であってもよく、非天然のアミノ酸、またはアミノ酸アナログでもよい。天然のアミノ酸が好ましい。

本明細書において使用される用語「ペプチドアナログ」または「ペプチド誘導体」とは、ペプチドとは異なる化合物であるが、ペプチドと少なくとも 1つの化学的機能または生物学的機能が等価であるものをいう。したがって、ぺプチドアナログには、もとのペプチドに対して、 1つ以上のアミノ酸アナログまたはアミノ酸誘導体が付加または置換されているものが含まれる。ぺプチドアナログは、その機能が、もとのペプチドの機能（例えば、 p K a値が類似していること、官能基が類似していること、他の分子との結合様式が類似していること、水溶性が類似していることなど）と実質的に同様であるように、このような付加または置換がされている。そのようなペプチドアナログは、当該分野において周知の技術を用いて作製することができる。したがって、ペプチドァナログは、アミノ酸アナログを含むポリマーであり得る。

同様に、「ポリヌクレオチドアナログ」、「核酸アナログ」は、ポリヌクレォチドまたは核酸とは異なる化合物であるが、ポリヌクレオチドまたは核酸と少なくとも 1つの化学的機能または生物学的機能が等価であるものをいう。したがって、ポリヌクレオチドアナログまたは核酸アナログには、もとのぺプチドに対して、 1つ以上のヌクレオチドアナログまたはヌクレオチド誘導体が付加または置換されているものが含まれる。

本明細書において使用される核酸分子は、発現されるポリペプチドが天然型のポリぺプチドと実質的に同一の活性を有する限り、上述のようにその核酸の配列の一部が欠失または他の塩基により置換されていてもよく、あるいは他の核酸配列が一部挿入されていてもよい。あるいは、 5 ' 末端および Zまたは 3，末端に他の核酸が結合していてもよい。また、ポリペプチドをコードする遺伝子をストリンジェントな条件下でハイプリダイズし、そのポリぺプチドと実質的に同一の機能を有するポリペプチドをコードする核酸分子でもよい。このような遺伝子は、当該分野において公知であり、本発明において利用することができる。

このような核酸は、周知の P C R法により得ることができ、化学的に合成することもできる。これらの方法に、例えば、部位特異的変位誘発法、ハイプリダイゼーション法などを組み合わせてもよい。

本明細書において、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「置換」、「付加」および「欠失」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、それぞれアミノ酸もしくはその代替物、またはヌクレオチドもしくはその代替物が、置き換わること、付け加わること、および取り除かれることをいう。このような置換、付加または欠失の技術は、当該分野において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが挙げられる。置換、付加または欠失は、 1つ以上であれば任意の数でよく、そのような数は、その置換、付加または欠失を有する改変体において目的とする機能（例えば、 F B Pとの結合機能、セン卜ロメァとの結合機能、ホルモン、サイト力インの情報伝達機能など）が保持される限り、多くすることができる。例えば、そのような数は、 1または数個であり得、そして好ましくは、全体の長さの 2 0 %以内、 1 0 %以内、または 1 0 0個以下、 5 0個以下、 2 5個以下などであり得る。

(一般技術）

本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、 Sambrook J. et al. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor およびその 3rd Ed. (2001)； Ausubel, F, M. (1987). Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. AssociatESand iley-Interscience; Ausubel, F. M. (1989) . Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Innis, M A. (1990). PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press; Ausubel, F. M. (】992). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates； Ausubel, F. 1 (1995). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates; Innis, M. A. et al. (1995). PCR Strategies, Academic Press; Ausubel, F. M. (1999) . Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, and annual updates; Sninsky, J. J. et al. (1999) . PCR Applications: Protocols for Functional Genomics, Academic Press, 別冊実験医学「遺伝子導入 &発現解析実験法」羊土社、 1997などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。

人工的に合成した遺伝子を作製するための DN A合成技術および核酸化学については、例えば、 Gait, M. J. (1985). Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Gait, M. J. (1990) . Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press； Eckstein, F. (1991). Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press; Adams, R. L. et al. (1992).. The Biochemistry of the Nucleic Acids, Chapman & Hall ; Shabarova, Z. et al. (1994) . Advanced Organic Chemistry of Nucleic Acids, Weinheim; Blackburn, G. M. et al. (1996) . Nucleic Acids in Chemistry and Biology, Oxford University Press; Henanson, G. T. (1996). Bioconjugate Techniques, Academic Press などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。

本明細書において遺伝子発現（たとえば、 mRNA発現、ポリペプチド発現）の「検出」または「定量」は、例えば、 mRNAの測定および免疫学的測定方法を含む適切な方法を用いて達成され得る。分子生物学的測定方法としては、例えば、ノ一ザンブロット法、ドットプロット法または P C R法などが例示される。免疫学的測定方法としては、例えば、方法としては、マイクロタイタープレートを用いる EL I S A法、 R I A法、蛍光抗体法、ウエスタンプロット法、免疫組織染色法などが例示される。また、定量方法としては、 EL I S A法または R I A法などが例示される。アレイ（例えば、 DNAアレイ、プ口ティンアレイ）を用いた遺伝子解析方法によっても行われ得る。 DNAァレィについては、（秀潤社編、細胞工学別冊「DNAマイクロアレイと最新 PC R法」）に広く概説されている。プロテインアレイについては、 Nat Genet.2002 Dec ;32 Suppl :526-32に詳述されている。遺伝子発現の分析法としては、上述に加えて、 RT— PCR、 RACE法、 SSCP法、免疫沈降法、 two— hyb r i dシステム、インビトロ翻訳などが挙げられるがそれらに限定されない。そのようなさらなる分析方法は、例えば、ゲノム解析実験法' 中村祐輔ラボ ·マニュアル、編集 ·中村祐輔羊土社（2002) などに記載されており、本明細書においてそれらの記载はすべて参考として援用される。本明細書において「発現量」とは、対象となる細胞などにおいて、ポリぺプチドまたは mRNAが発現される量をいう。そのような発現量としては、本発明の抗体を用いて EL I SA法、 R I A法、蛍光抗体法、ウエスタンプロット法、免疫組織染色法などの免疫学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明ポリぺプチドの夕ンパク質レベルでの発現量、またはノーザンプロット法、ドットプロット法、 P C R法などの分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明のポリぺプチドの mR N Aレベルでの発現量が挙げられる。「発現量の変化」とは、上記免疫学的測定方法または分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明のポリペプチドのタンパク質レベルまたは m R N Aレベルでの発現量が増加あるいは減少することを意味する。

(ポリペプチドの製造方法）

本発明のポリペプチドをコードする D N Aを組み込んだ組換え体べクタ一を保有する微生物、動物細胞などに由来する形質転換体を、通常の培養方法に従つて培養し、本発明のポリペプチドを生成蓄積させ、本発明の培養物より本発明のポリぺプチドを採取することにより、本発明のポリぺプチドを製造することができる。

本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、本発明の生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、.形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。

炭素源としては、それぞれの微生物が資化し得るものであればよく、ダルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類を用いることができる。

窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニゥム、硫酸アンモニゥム、酢酸アンモニゥム、リン酸アンモニゥム等の各種無機酸または有機酸のアンモニゥム塩、その他含窒素物質、ならびに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等を用いることができる。

無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシゥム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。

培養温度は 1 5〜40°Cがよく、培養時間は、通常 5時間〜 7日間である。培養中 pHは、 3. 0〜9. 0に保持する。 pHの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。また培養中必要に応じて、アンピシリンまたはテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。

プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサ一を培地に添加してもよい。例えば、 1 a cプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはィソプロピル一 3— D—チォガラクトピラノシド等を、 t r pプロモータ一を用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。遺伝子を導入した植物の細胞または器官は、ジャーフアーメンターを用いて大量培養することができる。培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ'アンド ' スクーグ（MS) 培地、ホワイト（Wh i t e) 培地、またはこれら培地にォ —キシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。

例えば、動物細胞を用いる場合、本発明の細胞を培養する培地は、一般に使用されている RPM I 1640培地 [Th e J ou r n l o f t h e Am e r i c an Me d i c a l As s o c i a t i on, 199, 51 9 (1967) ] , Eag l eの MEM培地 [S c i e n c e, 122， 50 1 (1952) ] 、 DMEM培地 [V i r i l ogy, 8， 396 (195 9) ] 、 199培地 [P r o c e e d i n g s o f t he Soc i e t y f o r t he B i o l og i c a l Me d i c i ne, 73， 1 (1950) ] またはこれら培地にゥシ胎児血清等を添加した培地等が用いられる。

培養は、通常 pH6〜8、 25〜40°C、 5 % C O 2存在下等の条件下で 1 〜7日間行う。また培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。

本発明のポリペプチドをコードする核酸配列で形質転換された形質転換体の培養物から、本発明のポリペプチドを単離または精製するためには、当該分野で周知慣用の通常の酵素の単離または精製法を用いることができる。例えば、本発明のポリぺプチドが本発明のポリぺプチド製造用形質転換体の細胞外に本発明のポリペプチドが分泌される場合には、その培養物を遠心分離等の手法により処理し、可溶性画分を取得する。その可溶性画分から、溶媒抽出法、硫安等による塩析法脱塩法、有機溶媒による沈澱法、ジェチルアミノエチル（DE AE) -S e ph a r o s e, D I A I ON HP A— 75 ( 菱化成）等樹脂を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、 S— S e pha r o s e F F (Pha rma c i a) 等の樹脂を用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、プチルセファロース、フエ二ルセファロース等の樹脂を用いた疎水性クロマトグラフィ一法、分子篩を用いたゲルろ過法、ァフィ二ティーク口マトダラフィ一法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を用い、精製標品を得ることができる。

本発明のポリぺプチドが本発明のポリぺプチド製造用形質転換体の細胞内に溶解状態で蓄積する場合には、培養物を遠心分離することにより、培養物中の細胞を集め、その細胞を洗浄した後に、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモジナイザー、ダイノミル等により細胞を破碎し、無細胞抽出液を得る。その無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、溶媒抽出法、硫安等による塩析法脱塩法、有機溶媒による沈澱法、ジェチルアミノエチル（DEAE) — Se pha r o s e、 D I A I ON HPA- 75 (三菱化成）等樹脂を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、 S— S e p ha r o s e F F (P h a r m a c i a) 等の樹脂を用いた陽イオン交換ク口マトグラフィ一法、ブチルセファロース、フエ二ルセファロ一ス等の樹脂を用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、ァフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を用いることによって、精製標品を得ることができる。本発明のポリペプチドが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈澱画分より、通常の方法により本発明のポリぺプチドを回収後、そのポリぺプチドの不溶体をポリペプチド変性剤で可溶化する。この可溶化液を、ポリペプチド変性剤を含まないあるいはポリペプチド変性剤の濃度がポリペプチドが変性しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、本発明のポリペプチドを正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。また、通常のタンパク質の精製方法 [J. Evan. Sadler et al.： Methods in Enzymology, 83, 458] に準じて精製できる。また、本発明のポリペプチドを他のタンパク質との融合タンパク質として生産し、融合したタンパク質に親和性をもつ物質を用いたァフィ二ティークロマトグラフィーを利用して精製することもできる [山川彰夫，実験医学（Experimental Medicine), 13, 469- 474(1995)] 例えば、 Loweらの方法 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86， 8227-8231 (1989), Genes Develop., 4, 1288 (1990)] に記載の方法に準じて、本発明のポリペプチドをプロテイン Aとの融合タンパク質として生産し、ィムノグロブリン Gを用いるァフィ二ティ一クロマトグラフィーにより精製することができる。また、本発明のポリぺプチドを F L A Gぺプチドとの融合夕ンパク質として生産し、抗 FLAG抗体を用いるァフイエティークロマトグラフィーにより精製することができる [Pro atl. Acad. Sci.， USA, 86, 8227 (1989)， Genes Develop., 4, 1288 (1990)]。

さらに、本発明のポリぺプチド自身に対する抗体を用いたァフィ二ティ一ク口マトグラフィ一で精製することもできる。本発明のポリペプチドは、公知の方法 [J. Biomolecular NMR, 6， 129-134, Science, 242, 1162-1164, J. Biochem., 110, 166-168 (1991)] に準じて、 i n v i 1： 1" 0転写 '翻訳系を用いてを生産することができる。

上記で取得されたポリペプチドのアミノ酸情報を基に、 Fmo c法（フルォレニルメチルォキシカルポニル法）、 t B o c法（ t一ブチルォキシカルボ二ル法）等の化学合成法によっても本発明のポリペプチドを製造することができる。また、 Advanc e d C h emT e c h、 App l i e d B i o s y s t ems、 Pha rma c i a B i o t e ch、 P r o t e i n T e c h n o 1 o g y I n s t r umen t：、 Syn t he c e l 1 -Ve g a, P e r S e p t i ve、島津製作所等のぺプチド合成機を利用し化学合成することもできる。

精製した本発明のポリペプチドの構造解析は、タンパク質化学で通常用いられる方法、例えば遺伝子クローニングのためのタンパク質構造解析（平野久著、東京化学同人発行、 1993年）に記載の方法により実施可能である。本発明の新規 P s 20様ポリペプチドの生理活性は、公知の測定法 [Cell, 75, 1389 (1993)、 J. Cell Bio. 1146， 233 (1999)、 Cancer Res. 58, 1238 (1998), Neuron 17, 1157 (1996)， Science 289, 1197 (2000)] に準じて測定することができる。

(変異型ポリぺプチドの作製方法）本発明ポリペプチドのアミノ酸の欠失、置換もしくは付加は、出願前周知技術である部位特異的変異誘発法により実施することができる。かかる 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加は、 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、 Current Protocols in Molecular Biology, Sup lement 1-38, John Wiley & Sons (1987-1997) > Nucleic Acids Research, 10, 6487(1982), Proc. Natl. Acad. Sci.， USA, 79, 6409 (1982) , Gene, 34, 315 (1985) > Nucleic Acids Research, 13， 4431 (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)， Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81, 5662 (1984), Science, 224, 1431 (應）、PCT W0 85/00817 (1985), Nature, 316, 601 (1985)等に記載の方法に準じて調製することができる。

(免疫化学）

本発明のポリペプチドを認識する抗体の作製もまた当該分野において周知である。例えば、ポリクローナル抗体の作製は、取得したポリペプチドの全長または部分断片精製標品、あるいは本発明のタンパク質の一部のアミノ酸配列を有するペプチドを抗原として用い、動物に投与することにより行うことができる。

抗体を生産する場合、投与する動物として、ゥサギ、ャギ、ラット、マウス、ハムスター等を用いることができる。その抗原の投与量は動物 1匹当たり 5 0 〜1 0 0 gが好ましい。ペプチドを用いる場合は、ペプチドをスカシガイへモシァニン（keyhole limpet haemocyanin) またはゥシチログロブリン等のキャリアタンパク質に共有結合させたものを抗原とするのが望ましい。抗原とするペプチドは、ペプチド合成機で合成することができる。その抗原の投与は、 1回目の投与の後 1〜2週間おきに 3〜1 0回行う。各投与後、 3〜7日目に眼底静脈叢より採血し、その血清が免疫に用いた抗原と反応することを酵素免疫測定法 [酵素免疫測定法（E L I S A法）：医学書院刊 1 9 7 6年、 Ant ibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lavoratory (1988) ] 等で確認することができる。

免疫に用いた抗原に対し、その血清が充分な抗体価を示した非ヒト哺乳動物より血清を取得し、その血清より、周知技術を用いてポリクローナル抗体を分離、精製することができる。モノクローナル抗体の作製もまた当該分野において周知である。抗体産性細胞の調製のために、まず、免疫に用いた本発明のポリぺプチドの部分断片ポリぺプチドに対し、その血清が十分な抗体価を示したラットを抗体産生細胞の供給源として使用し、骨髄腫細胞との融合により、八イブリドーマの作製を行う。その後、酵素免疫測定法になどより、本発明のポリぺプチドの部分断片ポリぺプチドに特異的に反応するハイプリドーマを選択する。このようにして得たハイプリドーマから産生されたモノクローナル抗体は種々の目的に使用することができる。

本発明の抗体は、抗体の合成のために当該分野で公知の任意の方法によって、化学合成によって、または、好ましくは、組換え発現技術によって産生され得る。

本発明の抗体、またはそのフラグメント、誘導体もしくはアナログ（例えば、本発明の抗体の重鎖もしくは軽鎖または本発明の単鎖抗体）の組換え発現は、その抗体をコ一ドするポリヌクレオチドを含有する発現べクターの構築を必要とする。一旦、本発明の抗体分子または抗体の重鎖もしくは軽鎖、あるいはそれらの部分（好ましくは、重鎖または軽鎖の可変ドメインを含有する）をコードするポリヌクレオチドが得られると、抗体分子の産生のためのベクターは、当該分野で周知の技術を用いる組換え D N A技術によって生成され得る。従つて、抗体をコードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドの発現によってタンパク質を調製するための方法は、本明細書に記載される。当業者に周知の方法は、抗体をコードする配列ならびに適切な転写制御シグナルおよび翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターの構築のために使用され得る。これらの方法としては、例えば、インビトロの組換え D NA技術、合成技術、およびインビボの遺伝子組換えが挙げられる。従って、本発明は、プロモーターに作動可能に連結された、本発明の抗体分子、あるいはその重鎖もしくは軽鎖、または重鎖もしくは軽鎖の可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む、複製可能なベクターを提供する。このようなベクタ一は、抗体分子の定常領域 (例えば、 P C T公開 W086/05807； P C T公開 W089/01036；および米国特許第 5， 1 2 2 , 4 6 4号を参照のこと）をコードするヌクレオチド配列を含み得、そしてこの抗体の可変ドメインは、重鎖または軽鎖の全体の発現のためにこのようなベクターにクローユングされ得る。

この発現べクタ一は、従来技術によって宿主細胞へと移入され、次いで、このトランスフエクトされた細胞は、本発明の抗体を産生するために、従来技術によって培養される。従って、本発明は、異種プロモーターに作動可能に連結された、本発明の抗体、あるいはその重鎖もしくは軽鎖、または本発明の単鎖抗体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を含む。二重鎖抗体の発現についての好ましい実施形態において、重鎖および軽鎖の両方をコードするべクタ一は、免疫グロプリン分子全体の発現のために宿主細胞中に同時発現され得る。

このような抗体は、例えば、本発明のポリペプチドの免疫学的検出方法に使用することができ、本発明の抗体を用いる本発明のポリペプチドの免疫学的検出法としては、マイクロタイタープレートを用いる E L I S A法 ·蛍光抗体法、ウェスタンブロッ卜法、免疫組織染色法等を挙げることができる。

また、本発明ポリぺプチドの免疫学的定量方法にも使用することができる。本発明ポリぺプチドの定量方法としては、液相中で本発明のポリぺプチドと反応する抗体のうちェピト一プが異なる 2種類のモノクローナル抗体を用いたサンドイッチ E L I S A法、 ^{1 2 6} I等の放射性同位体で標識した本発明のタンパク質と本発明のタンパク質を認識する抗体とを用いるラジオィムノアツセィ法等を挙げることができる。

本発明ポリぺプチドの m R N Aの定量方法もまた、当該分野において周知である。例えば、本発明のポリヌクレオチドあるいは D NAより調製した上記ォリゴヌクレオチドを用い、ノーザンハイブリダィゼ一シヨン法または P C R法により、本発明のポリペプチドをコードする D N Aの発現量を mRN Aレベルで定量することができる。このような技術は、当該分野において周知であり、本明細書において列挙した文献にも記載されている。

当該分野で公知の任意の方法によって、これらのポリヌクレオチドが得られ得、そしてこれらポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、決定され得る。例えば、抗体のヌクレオチド配列が公知である場合、この抗体をコードするポリヌクレオチドは、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドからアセンブルされ得（例えば、 Kutmeier et al . , BioTechniques 17 : 242 (1994)に記載されるように）、これは、手短に言えば、抗体をコードする配列の部分を含むオーバ一ラップするヌクレオチドの合成、それらのオリゴヌクレオチドのアニーリングおよび連結、ならびに次いで P C Rによるこの連結されたォリゴヌクレオチドの増幅を含む。

抗体をコードするポリヌクレオチドは、適切な供給源由来の核酸から作製することができる。ある抗体をコードする核酸を含むクローンは入手不可能だが、その抗体分子の配列が既知である場合、免疫グロブリンをコードする核酸は、化学的に合成され得るか、あるいは適切な供給源（例えば、抗体 c D NAライブラリーまたは抗体を発現する任意の組織もしくは細胞（例えば、本発明の抗体の発現のために選択されたハイプリドーマ細胞）から生成された c D NAライブラリー、またはそれから単離された核酸（好ましくはポリ A + R NA) ) から、例えば、抗体をコードする c D NAライブラリーからの c D NAクロ一ンを同定するために、その配列の 3 ' 末端および 5 ' 末端にハイブリダィズ可能な合成プライマ一を使用する P C R増幅によって、またはその特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用するクローニングによって得ることができる。 P C Rによって作製された増幅された核酸は、当該分野で周知の任意の方法を用いて、複製可能なクローニングベクターにクローニングされ得る。

一旦、抗体のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列が決定されると、抗体のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の操作について当該分野で周知の方法（例えば、組換え D NA技術、部位指向性変異誘発、 P C Rなど（例えば、 Sambrook et al .，前出および Ausubel et al .編、前出に記載の技術を参照のこと。これらは両方がその全体において本明細書に参考として援用される。 ) ) を用いて操作され、例えば、アミノ酸の置換、欠失、および /または挿入を生成するように異なるアミノ酸配列を有する抗体を作製し得る。

特定の実施形態において、重鎖可変ドメインおよび/または軽鎖可変ドメィンのアミノ酸配列は、相補性決定領域（C D R) の配列の同定のために、当該分野において周知の方法によって（例えば、配列超可変性の領域を決定するために、他の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の既知のアミノ酸配列と比較することによって）調べられ得る。慣用的な組換え D NA技術を用いて、 1つ以上の C D Rが、前述のようにフレームワーク領域内に（例えば、非ヒト抗体をヒト化するために、ヒトフレームワーク領域中に）揷入され得る。このフレームワーク領域は天然に存在し得るか、またはコンセンサスフレームワーク領域であり得、そして好ましくはヒトフレームワーク領域であり得る（例えば、列挙したヒトフレームワーク領域については、 Chothia ら、； ί· Mol. Biol . 278 : 457-479 (1998)を参照のこと）。好ましくは、フレームワーク領域および C D Rの組み合わせによって生成されたポリヌクレオチドは、本発明のポリべプチドに特異的に結合する抗体をコードする。好ましくは、上記に議論されるように、 1つ以上のアミノ酸置換は、フレームワーク領域内で作製され得、そして好ましくは、そのアミノ酸置換は、抗体のその抗原への結合を改善する。さらに、このような方法は、 1つ以上の鎖内ジスルフイド結合が欠如した抗体分子を生成するように、鎖内ジスルフィド結合に関与する 1つ以上の可変領域のシスティン残基のァミノ酸置換または欠失を作製するために使用され得る。ポリヌクレオチドへの他の変更は、本発明によって、および当該分野の技術において包含される。

さらに、適切な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子を、適切な生物学的活性のヒト抗体分子由来の遺伝子と共にスプライシングさせることによって、「キメラ抗体」の産生のために開発された技術（Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 851-855 (1984)； Neuberger et al., Nature 312: 604-608 (1984)； Takeda et al., Nature 314: 452-454 (1985)) が使用され得る。上記のように、キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に由来する分子であり、このような分子は、マウス mAbおよびヒト免疫グロブリンの定常領域由来の可変領域を有する（例えば、ヒ卜化抗体）。

単鎖抗体を製造する場合、単鎖抗体の産生に関する記載された公知の技術 (米国特許第 4， 946, 7 7 8号； Bird, Science 242: 423-42 (1988)； Huston etal., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883 (1988)；および Ward et al., Nature 334: 544-54 (1989)) が、利用され得る。単鎖抗体は、 Fv領域の重鎖フラグメントおよび軽鎖フラグメントがアミノ酸架橋を介して連結されれることによって形成され、単鎖ポリペプチドを生じる。 E. c o 1 iにおける機能性 Fvフラグメントのアセンブリのための技術もまた、使用され得る (Skerra et al., Science 242: 1038-1041 (1988)) 。

(スクリーニング）

本明細書において「スクリーニング」とは、目的とするある特定の性質をもつ生物または物質などの標的を、特定の操作 Z評価方法で多数を含む集団の中から選抜することをいう。スクリーニングのために、本発明の因子（例えば、抗体）、ポリペプチドまたは核酸分子を使用することができる。スクリーニングは、インビトロ、インビポなど実在物質を用いた系を使用してもよく、インシリコ（コンピュータを用いた系）の系を用いて生成されたライブラリ一を用いてもよい。本発明では、所望の活性を有するスクリーニングによって得られた化合物もまた、本発明の範囲内に包含されることが理解される。また本発明では、本発明の開示をもとに、コンピュータモデリングによる薬物が提供されることも企図される。 (診断）

本明細書において「診断」とは、被験体における疾患の種類、障害の種類と程度、身体状態などに関連する種々のパラメ一夕を同定し、そのような疾患、障害、状態の現状、薬物反応性予測、病態変化予測または原因を判定することをいう。本発明の方法、装置、システムを用いることによって、疾患を分析し，疾患の状態と相関付けることができ、そのような情報を用いて、被験体における疾患、障害、状態、投与すべき薬物の種類や量など処置または予防のための処方物または方法などの種々のパラメータを選定することができる。

本発明の診断方法は、原則として、身体から出たものを利用することができることから、医師などの医療従事者の手を離れて実施することができることから、産業上有用である。

本明細書において「ハイリスク」であるとは、ある疾患について用いられるとき、被験体がその疾患に罹患している可能性が高いこと（例えば、約 2 5 % , 約 5 0 %、約 7 5 %など）をいう。ハイリスク診断を受けた被験体は、別の診断法によって確定診断を行うことができる。

本明細書において「確定診断」とは、ある疾患について用いられるとき、ある被験体がその疾患に罹患していると確定的に診断することをいう。本発明の因子、ポリペプチド、核酸分子、方法およびキットを用いることによって、癌

(特に、 c一 my c高発現癌（例えば、直腸癌、結腸癌））の確定診断を行うことができる。 (遺伝子治療）

特定の実施形態において、本発明の正常な遺伝子の核酸配列、抗体またはその機能的誘導体をコードする配列を含む核酸は、本発明のポリペプチドの異常な発現および Zまたは活性に関連した疾患または障害を処置、阻害または予防するために、遺伝子治療の目的で投与される。遺伝子治療とは、発現されたか、または発現可能な核酸の、被験体への投与により行われる治療をいう。本発明のこの実施形態において、核酸は、それらのコードされたタンパク質を産生し、そのタンパク質は治療効果を媒介する。

当該分野で利用可能な遺伝子治療のための任意の方法が、本発明に従って使用され得る。例示的な方法は、以下のとおりである。

遺伝子治療の方法の一般的な概説については、 Goldspiel et al.， Clinical Pharmacy 12: 488-505 (1993)； Wu and Wu, Biotherapy 3: 87-95 (1991)； Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32: 573-596 (1993)； Mulligan, Science 260: 926-932 (1993);ならびに Morgan and Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62: 191-217 (1993)； May, TIBTECH 11 (5) : 155-215 (1993)を参照のこと。遺伝子治療において使用される一般的に公知の組換え DNA技術は、 Ausubel ら (編)， Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993)；および Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990)に記載される。 (治療活性または予防活性の証明）本発明の化合物または薬学的組成物は、好ましくは、ヒトでの使用の前にィンビトロで、そして次いでインビポで、所望の治療活性または予防活性について試験される。例えば、化合物または薬学的組成物の、治療有用性または予防有用性を証明するためのインビトロアツセィとしては、細胞株または患者組織試料に対する化合物の効果が挙げられる。細胞株および/または組織試料に対する化合物または組成物の効果は、当業者に公知である技術（細胞溶解アツセィが挙げられるがこれらに限定されない）を利用して決定され得る。本発明に従って、特定の化合物の投与が示されるか否かを決定するために用いられ得るインビトロアツセィとしては、インピトロ細胞培養アツセィが挙げられ、このアツセィでは、患者組織試料が培養物において増殖し、そして化合物に曝されるか、そうでなければ化合物が投与され、そして、組織試料に対するそのような化合物の効果が観察される。

本明細書において「予防」（p r o p h y l a x i sまたは p r e v e n t i o n) とは、ある疾患または障害について、そのような状態が引き起こされる前に、そのような状態が起こらないように処置することをいう。

本明細書において「治療」とは、ある疾患または障害について、そのような状態になった場合に、そのような疾患または障害の悪化を防止、好ましくは、現状維持、より好ましくは、軽減、さらに好ましくは消長させることをいう。本明細書において「癌」または「がん」は、互換可能に用いられ、異型性が強く、増殖が正常細胞より速く、周囲組織に破壊性に浸潤し得あるいは転移をおこし得る悪性腫瘍またはそのような悪性腫瘍が存在する状態をいう。本発明においては、癌は固形癌および造血器腫瘍を含むがそれらに限定されない。本明細書において「固形癌」は、固形の形状がある癌をいい、白血病などの造血器腫瘍とは対峙する概念である。そのような固形癌としては、例えば、乳癌、肝癌、胃癌、肺癌、頭頸部癌、子宮頸部癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、悪性リンパ腫、食道癌、脳腫瘍、骨腫瘍が挙げられるがそれらに限定されない。本明細書において「被験体」とは、本発明の処置が適用される生物をいい、「患者」ともいわれる。患者または被験体は好ましくは、ヒトであり得る。

(治療 Z予防のための投与および組成物）

本発明は、被験体への有効量の本発明の化合物または薬学的組成物の投与による処置、阻害および予防の方法を提供する。好ましい局面において、化合物は実質的に精製されたものであり得る（例えば、その効果を制限するかまたは望ましくない副作用を生じる物質が実質的に存在しない状態が挙げられる）。本発明が対象とする動物は、神経系または類似の系を有するものであれば、どの生物（例えば、動物（たとえば、脊椎動物、無脊椎動物））でもよい。好ましくは、脊椎動物（たとえば、メクラウナギ類、ャッメゥナギ類、軟骨魚類、硬骨魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物など）であり、より好ましくは、哺乳動物（例えば、単孔類、有袋類、貧歯類、皮翼類、翼手類、食肉類、食虫類、長鼻類、奇蹄類、偶蹄類、管歯類、有鱗類、海牛類、クジラ目、霊長類、齧歯類、ゥサギ目など）であり得る。例示的な被験体としては、例えば、ゥシ、ブ夕、ゥマ、ニヮトリ、ネコ、ィヌなどの動物が挙げられるがそれらに限定されない。さらに好ましくは、霊長類（たとえば、チンパンジー、二ホンザル、ヒ卜）由来の細胞が用いられる。最も好ましくはヒト由来の細胞が用いられる本発明の核酸分子またはポリペプチドが医薬として使用される場合、そのような組成物は、薬学的に受容可能なキャリアなどをさらに含み得る。本発明の医薬に含まれる薬学的に受容可能なキヤリアとしては、当該分野において公知の任意の物質が挙げられる。

そのような適切な処方材料または薬学的に受容可能なキヤリアとしては、抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および Zまたは薬学的アジュパント挙げられるがそれらに限定されない。代表的には、本発明の医薬は、有効成分を、 1つ以上の生理的に受容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤とともに含む組成物の形態で投与される。例えば、適切なビヒクルは、注射用水、生理的溶液、または人工脳脊髄液であり得、これらには、非経口送達のための組成物に一般的な他の物質を補充することが可能である。

本明細書で使用される受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤は、レシピエントに対して非毒性であり、そして好ましくは、使用される投薬量および濃度において不活性であり、例えば、リン酸塩、クェン酸塩、または他の有機酸；ァスコルビン酸、ひ—トコフエロール；低分子量ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、ダル夕ミン、ァスパラギン、アルギニンまたはリジン）；モノサッカリド、ジサッカリドおよび他の炭水化物 (グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、 EDTA) ；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；ならびに Zあるいは非イオン性表面活性化剤（例えば、 Twe en、プル口ニック (p 1 u r on i c) またはポリエチレングリコール（PEG) ) などが挙げられるがそれらに限定されない。

例示の適切なキャリアとしては、中性緩衝化生理食塩水、'または血清アルブミンと混合された生理食塩水が挙げられる。好ましくは、その生成物は、適切な賦形剤（例えば、スクロース）を用いて凍結乾燥剤として処方される。他の標準的なキャリア、希釈剤および賦形剤は所望に応じて含まれ得る。他の例示的な組成物は、 PH7. 0-8. 5の Tr i s緩衝剤または p H 4. 0-5.

5の酢酸緩衝剤を含み、これらは、さらに、ソルビトールまたはその適切な代替物を含み得る。

本発明の医薬は、経口的または非経口的に投与され得る。あるいは、本発明の医薬は、静脈内または皮下で投与され得る。全身投与されるとき、本発明において使用される医薬は、発熱物質を含まない、薬学的に受容可能な水溶液の形態であり得る。そのような薬学的に受容可能な組成物の調製は、 P H、等張性、安定性などを考慮することにより、当業者は、容易に行うことができる。本明細書において、投与方法は、経口投与、非経口投与（例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、粘膜投与、直腸内投与、膣内投与、患部への局所投与、皮膚投与など）であり得る。そのような投与のための処方物は、任意の製剤形態で提供され得る。そのような製剤形態としては、例えば、液剤、注射剤、徐放剤が挙げられる。

本発明の医薬は、必要に応じて生理学的に受容可能なキャリア、賦型剤または安定化剤（日本薬局方第 1 4版またはその最新版（追補を含む）、 Remington' s Pharmaceut ical Sc iences, 18th Edi t ion, A. R. Gennaro, ed. , Mack Publ i shing Co即 any, 1990 などを参照）と、所望の程度の純度を有する糖鎖組成物とを混合することによって、凍結乾燥されたケーキまたは水溶液の形態で調製され保存され得る。

なお、タンパク質またはポリペプチドの治療的有効量（すなわち、有効量）は、約 0. 001〜30mg/lig体重の範囲、好ましくは約 0. 01〜25mg/kg体重、より好ましくは約 0. 1〜20 mg/kg体重、さらにより好ましくは約 l〜10mg/kg、 2〜 9mg/kg, 3〜8mg/kg、 4〜7 mg/kgまたは 5〜6 mg/kg体重の範囲である。また夕ンパク質をコードするポリヌクレオチドを遺伝子治療等の方法によつて導入する場合は、上記の範囲量のタンパク質を発現しうるポリヌクレオチドを投与すればよい。

本発明の処置方法において使用される糖鎖組成物の量は、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、細胞の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。本発明の処置方法を被験体（または患者）に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患

(種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。頻度としては、例えば、毎日—数ケ月に 1回（例えば、 1週間に 1回ー1ヶ月に 1回）の投与が挙げられる。 1週間一 1ヶ月に 1回の投与を、経過を見ながら施すことが好ましい。本明細書において「指示書」は、本発明の医薬などを投与する方法または診断する方法などを医師、患者など投与を行う人、診断する人（患者本人であり得る）に対して記載したものである。この指示書は、本発明の診断薬、医薬などを投与する手順を指示する文言が記載されている。この指示書は、本発明が実施される国の監督官庁（例えば、日本であれば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局（F D A) など）が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書（p a c k a g e i n s e r t ) であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、電子媒体（例えば、インタ一ネットで提供されるホームページ (ウェブサイト）、電子メール、 S M S、 P D F文書など）のような形態でも提供され得る。好ましい実施形態の説明

以下に本発明の最良の形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の '記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。

(発明の概説）

配列番号 2 のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、 c-myc遺伝子のプロモ一ターの 1. 5kb上流に結合する転写因子 FBP (Far Ups tream Binding Protein : EMBO J. 19 (5) : 1034-1044, 2000 ) と相互作用する転写因子 FIR ( FBP W 200

Interac t ing Receptor： Cel l 104 (3) : 343-363, 2001 ) として知られている夕ンパク質であるが、癌との関連性は全く知られていなかった。

また、配列番号 4のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、動原体タンパク質（centromere- spec i f ic protein) の一種である CENP - A (Proc. Nat l . Acad. Sc i . USA 88 (9) : 3734-3738, 1991 ) として知られているタンパク質であるが、この CEMP- 1も癌との関連性は全く知られていなかった。

これら配列番号 2のァミノ酸配列を有するポリペプチドおよびその改変体 (例えば、配列番号 1 2、 1 4、 1 6、 1 8、 2 0、 2 2など）ならびに配列番号 4のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、被験体の血清中に、本発明の抗原ペプチドと結合する抗体が存在するか否かを試験し、血清中にその抗体が存在する被験体を大腸癌患者または大腸癌八ィリスク者と判定することを特徴とするヒ卜大腸癌診断方法（好ましくは、抗原ペプチドを固定化したプレート上において被験体血清の抗体と抗原ペプチドとの結合を試験する）に関連する大腸癌診断に使用することができる。

これらの抗原ペプチドは、例えば、配列番号 2または 4のアミノ酸配列を有するペプチドをコードする遺伝子 DNAから転写された mRNA を铸型として合成され、配列番号 1または 3の塩基配列またはその一部連続配列からなる D N A 断片を有する組換え発現ベクター（これらも本発明に包含される）からインビトロ転写によって RNA を調製し、これを铸型としてインピトロ翻訳を行うことによりインビトロでペプチドを発現できる。また組換え発現べクタ一を大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞に導入して形質転換細胞（これも本発明に包含される）を作成すれば、この形質転換細胞から DNA断片がコードしているペプチドを発現させることができる。

抗原ペプチドをインビトロ翻訳で発現させる場合には、'上記の DNA断片を、 RNAポリメラーゼプロモーターを有するベクターに挿入して組換え発現べクタ一を作製し、このベクターを、プロモーターに対応する RMポリメラ一ゼを含むゥサギ網状赤血球溶解物や小麦胚芽抽出物などのィンビトロ翻訳系に添加すれば、抗原ペプチドをインビトロで生産することができる。 RNAポリメラーゼプロモーターとしては、 T7、 T3、 SP6 などが例示できる。これらの RNAポリメラーゼプロモ一夕一を含むベクターとしては、 pKAl、 pCDM8 , ρΤ3/Τ7 18 , ρΤ7/3 19、 pBluescr ipt I Iなどが例示できる。

抗原ペプチドを、大腸菌などの微生物で発現させる場合には、微生物中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、 DNA クローニング部位、夕一ミネ一夕一等を有する発現べクタ一に上記の DNA断片を組換えた発現ベクターを作成し、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すれば、この DNA断片がコードしている抗原ペプチドを微生物から発現させることができる。この際、他のタンパク質との融合タンパク質として発現させることもできる。大腸菌用発現ベクターとしては、 PUC 系、 pBluescr ipt I I、 pET発現システム、 pGEX発現システムなどが例示できる。

抗原ペプチドを、真核細胞で発現させる場合には、上記の DNA断片を、プロモー夕一、スプライシング領域、ポリ（A)付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターに挿入して組換えベクターを作成し、真核細胞内に導入すれば、抗原ぺプチドを形質転換真核細胞で発現させることができる。発現ベクターとしては、 pKAK pC画、 pSVK3、 pMSG、 pSVL、 pBK-CMV, pBK-RSV, EBVベクター、 pRS、 pcDNA3, pMSG、 pYES2 などが例示できる。また、 pIND/V5- Hi s、 pFLAG-CMV-2, pEGFP-NL pEGFP- CIなどを発現ベクターとして用いれば、 Hi sタグ、 FLAGタグ、 iyc タグ、 HAタグ、 GFPなど各種タグを付加した融合タンパク質として抗原べプチドを発現させることもできる。真核細胞としては、サル腎臓細胞 C0S7、チャィニーズ八ムスター卵巣細胞 CH0などの哺乳動物培養細胞、出芽酵母、分裂酵母、カイコ細胞、アフリカッメガエル卵細胞などが一般に用いられるが、この発明の抗原ペプチドを発現できるものであれば、いかなる真核細胞でもよい。発現ベクターを真核細胞に導入するには、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リボソーム法、 DEAEデキストラン法など公知の方法を用いることができる。抗原べプチドを原核細胞や真核細胞で発現させたのち、培養物から目的ぺプチドを単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば、尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消ィ匕、塩析ゃ溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、 SDS-PAGE、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ァフィ二ティ一クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィ一などが挙げられる。

なお、以上の方法によって得られる組換え抗原ペプチドには、他の任意のタンパク質との融合タンパク質も含まれる。例えば、ダル夕チン一 S—トランスフェラーゼ（GST) や緑色蛍光蛋白質（GFP) との融合蛋白質などが例示できる。さらに、形質転換細胞で発現されたペプチドは、翻訳された後、細胞内で各種修飾を受ける場合がある。したがって、修飾されたペプチドも本発明の抗原べプチドの範囲に含まれる。このような翻訳後修飾としては、 N末端メチォニンの脱離、 N末端ァセチル化、糖鎖付加、細胞内プロテアーゼによる限定分解、ミリストイル化、イソプレニル化、リン酸化などが例示できる。

本発明の fflRNAは、それぞれ大腸癌抗原ペプチドをコードする遺伝子 DNAから転写された mRNAである。これらの mRNAは例えぱ大腸癌細胞から単離したト一夕ル RNAから公知の方法で分離することができる。これらの mRNAは、被験体の生体試料に、本発明の mRNAが存在するか否かを試験し、試料中にその mRNAが存在する被験体を大腸癌患者または大腸癌ハイリスク者と判定することを特徴とするヒト大腸癌診断方法の対象となる。

本発明の mRNA を铸型として合成され、配列番号 1 の塩基配列またはその一部連続配列からなる DNA断片は、本発明の mRNAから合成され、配列番号 1 および 3の塩基配列、またはその一部連続配列からなる DNA断片である。ここで、「一部連続配列」とは、例えば各塩基配列において抗原ペプチドをコードする領域（0RFまたは CDS領域）をカバーする塩基配列である。

配列番号 1 および 3 の塩基配列は、例えば、公知の方法（Mol. Cell Biol. 2， 161-170, 1982 ； J. Gene 25, 263-269, 1983 ； Gene, 150, 243-250, 1994) を用いて cDNAを合成し、配列番号 1 または 3の塩基配列に基づいて作成したプローブ DNA を用いて、それぞれの cDNAを単離する方法によって取得することができる。また、本発明の mRNA を PCR増幅するためのプライマ一セッ卜を用い、ヒト細胞から単離した mRNAを铸型とする RT-PCR法によっても各 cDNA を得ることができる。得られた cDNA は、例えば、 PCR (Polymerase Chain Reaction) 法、 ASBN (Nucleic acid sequence based amplification) 法、 T A (Transcription-mediated amplification) 法および SDA (Strand Displacement Amplification) 法などの通常行われる遺伝子増幅法により増幅することができる。

本発明のぺプチドと結合する抗体はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得、それぞれ本発明の抗原ペプチドのェピトープに結合することができる全体分子、および Fab、 F(ab')₂、 Fv断片等が全て含まれる。このような抗体は、例えばポリクローナル抗体の場合には、抗原ペプチドやその一部断片を免疫原として動物を免疫した後、血清から得ることができる。あるいは、上記の真核細胞用発現ベクターを注射や遺伝子銃によって、動物の筋肉や皮膚に導入した後、血清を採取することによって作製することができる。動物としては、マウス、ラット、ゥサギ、ャギ、ニヮトリなどが用いられる。

また、モノクローナル抗体は、公知のモノクローナル抗体作成法（「単クローン抗体」、長宗香明、寺田弘共著、廣川書店、 1990 年； "Monoclonal Antibody" James W. Goding, third edition, Academic Press, 1996) に従い、例えば以下の様な手順で作製することができる。 1 ：ハイブリドーマ細胞群の作製本発明の抗原ペプチドのそれぞれ、またはその一部断片を含む免疫原を用いて哺乳動物を免疫し、必要に応じて適宜に追加免疫して動物を充分に感化する。次いでこの動物から抗体産生細胞（リンパ細胞または脾臓細胞）を摘出し、これとミエローマ（骨髄種）細胞株との融合細胞を得る。そして、これらの融合細胞株から、目的とするモノクローナル抗体をそれぞれに産生する複数の細胞を選択し、培養することによって、ハイプリドーマ細胞群を得ることができる。以下、各工程を詳しく説明する。 a ) 免疫原の調製例えば、本発明の組換え発現ベクターから in vi tro転写で発現させた抗原ペプチド、または本発明のの形質転換細胞から発現させた抗原べプチドを免疫原とすることができる。あるいは、その一部断片（10-20 アミノ酸）の場合には、配列番号 2 または 4 のアミノ酸配列に基づいて作成した合成ペプチドであってもよい。これらの免疫原は、他のタンパク質（例えば、ダル夕チオン—S—トランスフェラ —ゼ： GST) との融合タンパク質の形で使用することもできる。このような融合タンパク質の使用は、宿主一ベクター系の発現産物からの目的タンパク質の単離、および後記するハイプリドーマ細胞のスクリーニング工程を容易かつ確実とする点において特に好ましい。 b ) 動物の免疫被免疫動物としては、公知のハイプリド一マ作製法に用いられる哺乳動物を使用することができる。具体的には、たとえばマウス、ラット、ャギ、ヒッジ、ゥシ、ゥマ等である。ただし、摘出した抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞の入手容易性等の観点からは、マウスまたはラットを被免疫動物とするのが好ましい。また、実際に使用するマウスおよびラットの系統は特に制限はなく、マウスの場合には、たとえば各系統 A、 AKR、 BALB/c、 BDP、 BA、 CE、 C3H、 57BL、 C57BR、 C57L、職、 FL、 HTH、 HT1、 LP、鼠 NZW RF、 RI I I、 SJL、 SWR、 WB、 129等が、またラットの場合には、たとえば、、 Low、 Lewi s, Spraque, Daweley ACI、 BN、 Fi scher 等を用いることができる。このうち、後述のミエローマ細胞との融合適合性を勘案すれば、マウスでは BALB/c系統が、ラットでは low系統が被免疫動物として特に好ましい。なお、これらマウスまたはラットの免疫時の週齢は 5〜12 週齢が好ましい。

動物の免疫は、免疫原の溶液を動物の皮内または腹腔内に投与することによつて行うことができる。免疫原の投与スケジュールは被免疫動物の種類、個体差等により異なるが、一般には、抗原投与回数 2〜6回、投与間隔 1〜2週間が好ましい。また、抗原の投与量は動物の種類、個体差等により異なるが、一般には、 ΙΟ-100 xg/ 程度とする。 c) 細胞融合上記の投与スケジュールの最終免疫日から 1〜5 日後に被免疫動物から抗体産生細胞を含む脾臓細胞またはリンパ細胞を無菌的に取り出す。これらの脾臓細胞またはリンパ細胞からの抗体産生細胞の分離は、公知の方法に従って行うことができる。

次いで、抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合する。このミエ口一マ細胞には特段の制限はなく、公知の細胞株から適宜に選択して用いることができる。ただし、融合細胞からハイプリドーマを選択する際の利便性を考慮して、その選択手続が確立している HGPRT (Hpoxan thine- guanine phosphoribosyl transferase) 欠損株を用いるのが好ましい。すなわち、マウス由来の X63- Ag8 (X63)、 NSl-Ag4/l (NS-1)、 P3X63-Ag8. Ul (P3U1)、 X63- Ag8.653 (X63.653)、 SP2/0- Agl4(SP2/0)、 MPC11- 45.6TG1.7(45.6TG)、 F0、 S149/5XX0, BU.1 等、ラット由来の 210.RSY3.Ag.l.2.3(Y3)等、ヒト由来の U266AR(SKO-007) , GM1500 · GTG-A12(GM1500), UC729-6, LICR-LOW- HMy2 (HMy2)、 8226AR/NIP4-1 (NP41)等である。

抗体産生細胞とミエローマ細胞との融合は、公知の方法に従い、細胞の生存率を極度に低下させない程度の条件下で適宜実施することができる。そのような方法は、例えば、ポリエチレングリコール等の高濃度ポリマー溶液中で抗体産生細胞とミエローマ細胞とを混合する化学的方法、電気的刺激を利用する物理的方法等を用いることができる。一融合細胞と非融合細胞の選択は、例えば、公知の HAT (ヒポキサンチン ·ァミノプテリン ·チミジン）選択法により行うのが好ましい。この方法は、アミノプテリン存在下で生存し得ない HGPRT欠損株のミエローマ細胞を用いて融合細胞を得る場合に有効である。すなわち、未融合細胞および融合細胞を HAT培地で培養することにより、アミノプテリンに対する耐性を持ち合わせた融合細胞のみを選択的に残存させ、かつ増殖させることができる。 d ) 八イブリドーマのスクリーニング目的とするモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマ細胞のスクリーニングは、公知の酵素免疫検定法（EIA ： Enzyme Immunoassay) 、放射線免疫測定法 (RIA： Radio Iimunoassay) 、蛍光抗体法等により行うことができる。また、融合タンパク質を免疫原とした場合には、融合パートナーであるタンパク質について上記の各スクリーニング方法を併せて実施することによって、より確実にハイプリドーマ細胞をスクリーニングすることができる。

このようなスクリーニングによって、抗原ペプチドと特異的に結合するモノクロ一ナル抗体をそれぞれに産生するハイプリドーマ細胞群が得られる。

なお、スクリーニング後のハイプリドーマ細胞は、メチルセルロース法、軟ァガロース法、限界希釈法等の公知の方法によりクローニングし、抗体産生に用いる。

以上の通りの方法によって得たハイプリドーマ細胞は、液体窒素中または - 80°C以下の冷凍庫中に凍結状態で保存することができる。 2 :モノクローナル抗体の取得および精製上記 1で作成したハイプリドーマ細胞を公知の方法で培養することによって、抗原べプチドと特異的に結合するモノクローナル抗体を得ることができる。

培養は、例えば、上記のクローニング法で使用した同じ組成の培地中で培養してもよく、あるいはモノクローナル抗体を大量に産生するためには、マウス腹腔内にハイプリドーマ細胞を注射し、腹水からモノクローナル抗体を採取してもよい。

このようにして得たモノクローナル抗体は、例えば硫安塩析法、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー法、ァフィ二ティ一クロマトグラフィー法等により精製することができる。

本発明の標識抗体は、本発明の抗体と同一のポリクローナル抗体またはモノクロ一ナル抗体であって、標識物質によって標識されている抗体である。標識物質は、酵素、放射性同位体または蛍光色素を使用することができる。酵素は、 turnover number が大であること、抗体と結合させても安定であること、基質を特異的に着色させる等の条件を満たすものであれば特段の制限はなく、通常の EIAに用いられる酵素、例えば、ペルォキシダーゼ、 |8 _ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースォキシダーゼ、ァセチルコリンエステラーゼ、グルコース _ 6—リン酸化脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素等を用いることもできる。また、酵素阻害物質や補酵素等を用いることもできる。これら酵素と抗体との結合は、マレイミド化合物等の架橋剤を用いる公知の方法によって行うことができる。基質としては、使用する酵素の種類に応じて公知の物質を使用することができる。例えば酵素としてペルォキシダーゼを使用する塲合には、 3， 3'，5， 5'—テトラメチルベンジシンを、また酵素としてアルカリフォスファターゼを用いる場合には、パラニトロフエノール等を用いることができる。放射性同位体としては、 Iや³ H等の通常の RIAで用いられているものを使用することができる。蛍光色素としては、フルォレツセンスイソチオシァネ一ト（FITC) ゃテトラメチルローダミンイソチオシァネート（TRITC) 等の通常の蛍光抗体法に用いられるものを使用することができる。本発明の癌診断方法は、被験体の血清中に、本発明の抗原ペプチドと結合する抗体が存在か否かを試験し、血清中にその抗体が存在する被験体を癌患者または癌ハイリスク者と判定する。すなわち、本発明の抗原ペプチドは、患者の血清中の抗体（IgG) と結合するペプチドであるから、被験体の血清と反応させ、これらの抗原ペプチドと結合する抗体を含む血清を、癌患者またはその八ィリスク患者の血清として判定することができる。なおその際に、 2種類の抗原ペプチドについて血清中抗体との結合を判定することが好ましい。

具体的な診断は、例えば抗原ペプチドに被験体血清を接触させ、抗原べプチドと被験体血清中の IgG抗体とを液相中において反応させる。さらに血清中の IgG抗体と特異的に結合する標識 IgG抗体を反応させて、標識 IgG抗体のシグナルを検出すればよい。標識 IgG抗体の標識物質は、上記の標識抗体において例示したような酵素、放射性同位体または蛍光色素を使用することができる。酵素を用いる場合には、酵素作用によって分解して発色する基質を加え、基質の分解量を光学的に測定することによって酵素活性を求め、これを結合抗体量に換算し、標準値との比較から抗体量が算出される。放射生同位体を用いる場合には、放射性同位体の発する放射線量をシンチレーションカウンタ一等により測定する。また、蛍光色素を用いる場合には、蛍光顕微鏡を組み合わせた測定装置によって蛍光量を測定すればよい。

シグナルの検出は、実施例に示したようなウェスタンブロット分析を採用することができる。あるいは、抗原ペプチド +血清中抗体 +標識 IgG抗体の結合体を、公知の分離手段（クロマト法、塩析法、アルコール沈殿法、酵素法、固相法等）によって分離し、標識 IgG抗体のシグナルを検出するようにしてもよい。

なお、このような診断方法の簡便かつ広範囲な実施を可能とするものとして、本発明の診断キットが提供される。本発明の診断方法はまた、抗原べプチドの 1種類以上をプレー卜上に固定化し、この基板上において被験体血清の抗体との結合を試験する方法（これもまた本発明に包含される）として実施することもできる。抗原ペプチドを基板上に固定化することによって、未結合の標識結合分子を容易に除去することができる。また、このような診断方法の簡便かつ広範囲な実施を可能とするものとして、本発明の診断キットが提供される。

本発明の診断方法は、被験体の生体試料中に、本発明の抗体、もしくは本発明の標識抗体と結合する抗原べプチドが存在するか否かを試験し、試料中にその抗原ペプチドが存在する被験体を大腸癌患者またはそのハイリスク者と判定する。すなわち、ここで使用する抗体または標識抗体は、大腸癌細胞で発現している抗原ペプチドと特異的に結合する抗体であるから、この抗体と結合する抗原ペプチドを含む生体試料を、大腸癌患者または大腸癌ハイリスク患者の試料として判定することができる。なおその際に、好ましくは 2種の抗体について試料中の抗原ペプチドとの結合を判定することが好ましい。また、生体試料としては、血液や血液細胞（単核球等）を対象とすることができる。

本発明の診断方法における一つの態様は、抗体と抗原べプチドとの結合を液相系において行う方法である。例えば、本発明の標識抗体と生体試料とを接触させて標識抗体と抗原ペプチドを結合させ、この結合体を本明細書において記載されるような方法で分離し、標識シグナルを同様の方法で検出する。このような診断方法の簡便かつ広範囲な実施を可能とするものとして、本発明の診断キッ卜が提供される。

液相系での診断の別の方法は、本発明の抗体（一次抗体）と生体試料とを接触させて一次抗体と抗原べプチドを結合させ、この結合体に本発明の標識抗体 (二次抗体）を結合させ、この三者の結合体における標識シグナルを検出する。あるいは、さらにシグナルを増強させるためには、非標識の二次抗体を先ず抗体 +抗原べプチド結合体に結合させ、この二次抗体に標識物質を結合させるようにしてもよい。このような二次抗体への標識物質の結合は、例えば二次抗体をピオチン化し、標識物質をアビジン化しておくことによって行うことができる。あるいは、二次抗体の一部領域（例えば、 Fc領域）を認識する抗体（三次抗体）を標識し、この三次抗体を二次抗体に結合させるようにしてもよい。なお、一次抗体と二次抗体は、両方ともモノクローナル抗体を用いることもでき、あるいは、一次抗体と二次抗体のいずれか一方をポリクローナル抗体とすることもできる。液相からの結合体の分離やシグナルの検出は、本明細書において記載されるように行うことができる。また、このような診断方法の簡便かつ広範囲な実施を可能とするものとして、本発明の診断キットが提供される。

本発明の診断方法における別の態様は、抗体と抗原ペプチドとの結合を固相系において試験する方法である。この固相系における方法は、極微量の抗原べプチド検出と操作の簡便化のため好ましい方法である。すなわちこの固相系の方法は、本発明の抗体（一次抗体）を樹脂プレート等に固定化し、この固定化抗体に抗原ペプチドを結合させ、非結合ペプチドを洗浄除去した後、プレート上に残った抗体 +抗原ペプチド結合体に標識抗体（二次抗体）を結合させ、この二次抗体のシグナルを検出する方法である。この方法は、いわゆる「サンドイッチ法」と呼ばれる方法であり、マ一カーとして酵素を用いる場合には、

「ELISA (enzyme l inked immunosorbent assay) 」として広く用いられている方法である。一次抗体と二次抗体は、両方ともモノクローナル抗体を用いることもでき、あるいは、一次抗体と二次抗体のいずれか一方をポリクローナル抗体とすることもできる。シグナルの検出は、本明細書に記載されるように行うことができる。また、このような診断方法の簡便かつ広範囲な実施を可能とするものとして、本発明の診断キットが提供される。

本発明の診断キットは、本発明の診断方法を行うための試薬キットである。このようなキットは、被検成分の種類に応じて各種のものが市販されており、この発明の診断キットも、この発明によって提供される抗原ペプチド、抗体および/または標識抗体を用いることを除き、公知のキットに用いられている各要素によつて構 ^¾することができる。

本発明の診断方法は、被験体の生体試料中に、本発明の mRNAが存在するか否かを試験し、試料中にその mRNAが存在する被験体を大腸癌患者またはそのハイリスク者と判定する。生体試料としては、便や血液、血液細胞（単核球等）を対象とすることができる。 mRNAの検出、測定は公知の RT-PCR法や定量的 RT-PCT法によって行うことができ、その場合の PCRは本発明のプライマーセットを用いることができる。これらのプライマーセットは、配列番号 1または 3の塩基配列に基づき設計し、合成 ·精製の各工程を経て調製することができる。なお、プライマ一設計の留意点として、例えば以下を指摘することができる。プライマーのサイズ（塩基数）は、踌型 DNA との間の特異的なァニ一リングを満足させることを考慮し、 15-40塩基、望ましくは 15-30塩基である。ただし、 LA (l ong accurate) PCR を行う場合には、少なくとも 30塩基が効果的である。センス鎖（5'末端側）とアンチセンス鎖（3'末端側）からなる 1組あるいは 1対（2本）のプライマーが互いにァニールしないよう、両プライマ一間の相補的配列を避けると共に、プライマ一内のヘアピン構造の形成を防止するため自己相補配列をも避けるようにする。さらに、铸型 DNA との安定な結合を確保するため GC含量を約 50%にし、プライマー内において GC- r ichあるいは AT- r i ch が偏在しないようにする。ァニ一リング温度は Tm del t ing temperature) に依存するので、特異性の高い PCR産物を得るため、 Tm値が 55 - 65°Cで互いに近似したプライマーを選定する。また、 PCRにおけるプライマ一使用の最終濃度が約 0. 1〜約 1 M になるよう調整する等を留意することも必要である。また、プライマー設計用の市販のソフトウェア、例えば Ol igo™ [ Nat ional Biosci ence Inc. (米国）製] 、 GENETYX [ソフトウェア開発 (株）（日本）製] 等を用いることもできる。本発明の診断方法は、本発明によつて提供されるポリヌクレオチドまたはォリゴヌクレオチドを備えたマイクロアレイによっても実施することができる。マイクロアレイの作製方法としては、固相担体表面で直接オリゴヌクレオチドを合成する方法（オン ·チップ法）と、予め調製したオリゴヌクレオチドを固相担体表面に固定する方法とが知られている。この発明で使用するマイクロアレイは、このいずれの方法でも作製することができる。オン 'チップ法としては、光照射で選択的に除去される保護基の使用と、半導体製造に利用されるフォトリソグラフィー技術および固相合成技術とを組み合わせて、微少なマトリックスの所定の領域での選択的合成を行う方法（マスキング技術：例えば、 Fodor, S. et al. Science251: 767, 1991) 等によって行うことができる。一方'予め調製したオリゴヌクレオチドを固相担体表面に固定する場合には、官能基を導入したオリゴヌクレオチドを合成し、表面処理した固相担体表面にォリゴヌク iレオチドを点着し、共有結合させる（例えば、 Lamture, J. B. et al. Nucl. Acids Res. 22: 2121-2125, 1994; Guo, ZI et al. Nucl. Acids Res. 22: 5456-5465, 1994) 。オリゴヌクレオチドは、一般的には、表面処理した固相担体にスぺーサ一やクロスリンカーを介して共有結合させる。ガラス表面にポリアクリルアミドゲルの微小片を整列させ、そこに合成オリゴヌクレオチドを共有結合させる方法も知られている（Yershov, G， et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4913, 1996) 。また、シリカマイクロアレィ上に微小電極のアレイを作製し、電極上にはストレブトァピジンを含むァガロースの浸透層を設けて反応部位とし、この部位をプラスに荷電させることでピオチン化オリゴヌクレオチドを固定し、部位の荷電を制御することで、高速で厳密なハイプリダイゼーションを可能にする方法も知られている (Sosno ski, R、 G. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 1119-1123, 1997) 。このマイクロアレイを使用して固形癌を診断する場合には、例えば被験者の細胞から単離した mRNAを铸型として、 cDNAを合成し、 PCR増幅する。その際に、標識 dNTPを取り込ませて標識 cDNAとする。この標識 c DN Aをマクロアレイに接蝕させ、マイクロアレイのキヤブチヤ 5—プローブ（オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド）にハイブリダィズした c DNAを検出する。ハイブリダィゼ一シヨンは、 96穴もしくは 384穴ブラスチックプレー卜に分注して標識 cDNA水性液を、マイクロアレイ上に点着することによって実施することができる。点着の量は、 l〜0 n l程度とすることができる。ハイブリダィゼーシヨンは、室温〜 7 O の温度範囲で、 6〜時間の範囲で実施することが好ましい。八イブリダィゼーシヨン終了後、界面活性剤と緩衝液との混合溶液を用いて洗浄を行い、未反応の標識 c DNAを除去する。界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS) を用いることが好ましい。緩衝液としては、クェン酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等を用いることができるが、クェン酸緩衝液を用いることが好ましい。このように、本発明は、アレイを用いても診断することが可能である。 DNAアレイについては、（秀潤社編、細胞工学別冊「D NAマイクロアレイと最新 PC R法」）に広く概説されている。プロテインァレイについては、 Na t Ge ne t. 2002 D e c ； 32 S u p p 1 ： 526— 32に詳述されている。遺伝子発現の分析法としては、上述に加えて、 RT— PCR、 RACE法、 SSCP法、免疫沈降法、 two— hyb r i dシステム、インビトロ翻訳などが挙げられるがそれらに限定されない。そのようなさらなる分析方法は、例えば、ゲノム解析実験法 ·中村祐輔ラボ · マニュアル、編集 ·中村祐輔羊土社（2002) などに記載されており、本明細書においてそれらの記載はすべて参考として援用される。以下に、本発明をより詳細に説明する。

(F I Rの核酸形態） 1つの局面において、本発明は、 F I Rをコードする核酸分子を含む、癌 (例えば、直腸癌または結腸癌（これらを総称して大腸癌とも言う）を含む c 一 my c高発現癌）の、処置、予防、診断または予後のための組成物を提供する。ここで、診断、予防、処置または予後上有効な量は、当該分野において周知の技法を用いて当業者が種々のパラメータを参酌しながら決定することができ、そのような量を決定するためには、例えば、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、細胞の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる（例えば、がん診療レジデントマニュアル第 2版、編集：国立がんセンタ一中央病院内科レジデント、医学書院、 2 0 0 0を参照）。本発明では、癌の発症が、 F I Rの異常発現と予想外に関連していること、および正常型 F I Rを投与すると癌が治癒され得ることが明らかになった。このような関連、ならびにそれを利用した診断および治療効果は従来知られておらず、したがって、本発明の F I Rの核酸形態およびそれに関連する発明は、従来技術より優れた効果を示す。

従って、 1つの実施形態において、本発明は、（a ) 配列番号 1 ( F I R 5 4 2をコードする）に記載の塩基配列もしくはその相補体またはそのフラグメント配列を有する、ポリヌクレオチド； ( b ) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド；（c ) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも 1つの変異を有する改変体ポリべプチドであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド； ( d ) ( a ) 〜 ( c ) のいずれか 1つのポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイプリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリべプチドをコードするポリヌクレオチド；または（e ) ( a ) 〜（c ) のいずれか 1つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも 7 0 %である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、を含む、核酸分子を提供する。

1つの好ましい実施形態において、上記（c ) における置換、付加および欠失の数は、限定され、例えば、 5 0以下、 4 0以下、 3 0以下、 2 0以下、 1 5以下、 1 0以下、 9以下、 8以下、 7以下、 6以下、 5以下、 4以下、 3以下、 2以下であることが好ましい。より少ない数の置換、付加および欠失が好ましいが、生物学的活性を保持する（好ましくは、 F I Rと類似するかまたは実質的に同一の活性を有する、あるいは F I Rの異常型活性（例えば、 F B P との結合不良など））限り、多い数であってもよい。

別の好ましい実施形態において、上記ポリぺプチドが有する生物学的活性としては、例えば、配列番号 2に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントに対して特異的な抗体との相互作用、 F B Pとの相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。これらは例えば、免疫学的アツセィ、リン酸化定量などによって測定することができる。ここで、 F B Pに結合する能力は、配列番号 2における 3 7 2位〜 4 4 2位に記載される配列によつて規定され、 F B Pを用いて測定することができる。

別の好ましい実施形態において、（d ) に記載の対立遺伝子変異体は、配列番号 1に示す核酸配列と少なくとも 9 9 %の相同性を有することが有利である。上 Ϊ3種相同体は、その種の遺伝子配列データベースが存在する場合、そのデ —夕ベースに対して、本発明の F I R (またはより好ましくは F I R 5 4 2 ) をクエリ配列として検索することによって同定することができる。あるいは、本発明の F I R (またはより好ましくは F I R 5 4 2 ) の全部または一部をプローブまたはプライマーとして、その種の遺伝子ライブラリーをスクリーニングすることによって同定することができる。そのような同定方法は、当該分野において周知であり、本明細書において記載される文献にも記載されている。種相同体は、例えば、配列番号 1に示す核酸配列と少なくとも約 3 0 %の相同性を有することが好ましい。好ましくは、種相同体は、上記基準配列と、少なくとも約 40%、少なくとも約 50%、少なくとも約 60%、少なくとも約 7 0%、少なくとも約 80%、少なくとも約 90%、少なくとも約 95%、少なくとも約 98%、相同であり得る。

好ましい実施形態において、上記（a) 〜（e) のいずれか 1つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性は、少なくとも約 80%であり得、より好ましくは少なくとも約 90 %であり得、さらに好ましくは少なくとも約 98%であり得、もっとも好ましくは少なくとも約 99%であり得る。最も好ましくは、本発明の F I Rは、 F I R542である。

好ましい実施形態において、本発明の F I Rをコードする核酸分子またはそのフラグメントおよび改変体は、少なくとも 8の連続するヌクレオチド長であり得る。本発明の核酸分子は、本発明の使用目的によってその適切なヌクレオチド長が変動し得る。より好ましくは、本発明の核酸分子は、少なくとも 10 の連続するヌクレオチド長であり得、さらに好ましくは少なくとも 15の連続するヌクレオチド長であり得、なお好ましくは少なくとも 20の連続するヌクレオチド長であり得る。これらのヌクレオチド長の下限は、具体的に挙げた数字のほかに、それらの間の数（例えば、 9、 1 1、 1 2、 13、 14、 16など）あるいは、それ以上の数（例えば、 21、 22, . . . 30、など）であつてもよい。本発明の核酸分子は、目的とする用途（例えば、アンチセンス、 RNA i、マーカー、プライマ一、プローブ、所定の因子と相互作用し得ること）として使用することができる限り、その上限の長さは、配列番号 1に示す配列の全長であってもよく、それを超える長さであってもよい。あるいは、プライマーとして使用する場合は、通常少なくとも約 8のヌクレオチド長であり得、好ましくは約 1 0ヌクレオチド長であり得る。プローブとして使用する場合は、通常少なくとも約 1 5ヌクレオチド長であり得、好ましくは約 17ヌクレオチド長であり得る。 W

1つの実施形態において、 F I Rをコードする核酸分子は、配列番号 1の核酸配列の全範囲を含む。より好ましくは、 F I Rをコードする核酸分子は、配列番号 1の核酸配列の全範囲からなる。 (特定の F I R核酸形態）

別の好ましい実施形態において、本発明は、配列番号 1で示される配列またはその相補体を含む核酸分子を提供する。このような配列は、正常な組織でも発現しており、正常であることの指標として使用され得る。あるいは、その発現レベルが異常であれば、癌の発症リスクがあると判断され得る。このような正常な F I R核酸形態は、外部から投与することによって、 c— m y c発現細胞に対してアポトーシスを起こさせることができ、従って、抗癌剤として使用することができる。

他の好ましい実施形態において、本発明は、（a ) 配列番号 1またはその相補体において置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも 1つの改変を含む配列；または（b ) 配列番号 1 1、 1 3および 1 5からなる群より選択される少なくとも 1つの配列もしくはその相補体、または該少なくとも 1つの配列もしくはその相補体において置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも 1つの改変を含む配列、を含む核酸分子を提供する。このような配列は、正常な組織では発現していないかまたはほとんど発現しておらず、しかも癌組織に特異的に発現していることから、その発現自体が癌の診断の指標として使用することができる。これらの核酸分子は、いずれも、癌組織に特異的であることから、癌の確定診断としても使用可能である。あるいは、これらの発現を、癌に罹患していない組織における発現と比較することによつて（好ましくは統計学的処理による）癌の確定診断を行うこともできる。このような癌は、好ましくは、 c一 m y c高発現癌（例えば、直腸癌および Zまたは結腸癌などを含む）である。このような核酸分子を減少させるような因子は、治療薬として使用することができる可能性がある。従って、そのような因子もまた、本発明の範囲内にあることが理解される。

別の好ましい実施形態において、本発明の上記核酸分子における上記改変は、核酸の置換；配列番号 1の 3 6 9位と 3 7 0位との間もしくは配列番号 1 5の 1 7 6位と 1 7 7位との間への核酸の付加；あるいは配列番号 1の 3 6 9位までもしくは配列番号 1 1の 3 0 5位までまたは配列番号 1 3もしくは配列番号 1 5の 1 7 6位までにおける核酸の欠失；あるいはそれらの組合せであることが好ましい。理論に束縛されることは望まないが、このような特定の改変は、本発明の F I Rの正常な機能を変化させ、好ましくは悪化させることによって、癌細胞の異常発生を引き起こす原因または結果であり得る。したがって、このような特定の配列を有するかまたは含む核酸分子を検出することによって、癌の診断の使用することができるという有用性を有する。

1つの好ましい実施形態において、本発明の F I R核酸分子における好ましい改変は、配列番号 1の 5 ' 末端から約 4 0 0塩基までの範囲内に存在する。この範囲の改変が癌との関係が深いと考えられるからであるが、それに限定されない。より好ましくは、この改変は、配列番号 1における約 1 5 0位〜約 3 6 0位の範囲内における改変であり得る。この範囲の改変がより癌との関連が高いと考えられる症例が見出されたからであるが、本発明は、それに限定されないことが理解される。したがって、 F I Rの異常発現または機能異常を引き起こすような改変である限り、本発明の診断に使用され得ることが理解される。別の好ましい実施形態において、本発明の F I R核酸分子における改変は、配列番号 1において、コードするアミノ酸の非保存的置換を含む。このような、非保存的置換を含むことによって、コードされるァミノ酸配列によつて担われるポリペプチドの機能に異常が生じ得るからである。 F I Rの正常な機能の一つは、 c—m y c発現細胞にアポトーシスを引き起こすことであり、その機能が異常になっていること、あるいは、正常な F I Rの機能を阻害するような分子の存在は、癌の発症と密接に関連すると考えられる。

他の好ましい実施形態において、改変を含む本発明の F I R核酸分子（改変体とも言う）は、配列番号 1 1、 1 3、 1 5、 1 7、 1 9および 2 1からなる群より選択される配列を含む。これらの具体的な配列は、正常な組織では発現されておらず、癌組織において特異的に発現していることから、本発明の F I Rの改変体の具体的配列の例示としてあげることができるがそれらに限定されない。 ( F I Rの核酸形態に特異的な因子）

1つの局面において、本発明は、 F I Rをコードする核酸分子に対して特異的に相互作用する因子を含む、癌（例えば、直腸癌または結腸癌 (これらを総称して大腸癌とも言う）を含む c一 m y c高発現癌）の、処置、予防、診断または予後のための組成物を提供する。したがって、本発明は、本明細書に記載される任意の F I Rをコードする核酸分子またはその改変体もしくはフラグメントに対して特異的な因子を提供する。ここで、診断、予防、処置または予後上有効な量は、当該分野において周知の技法を用いて当業者が種々のパラメ一夕を参酌しながら決定することができ、そのような量を決定するためには、例えば、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、細胞の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる（例えば、がん診療レジデントマニュアル第 2版、編集：国立がんセンタ一中央病院内科レジデント、医学書院、 2 0 0 0を参照）。本発明では、癌の発症が、 F I Rの異常発現と予想外に関連していること、および正常型 F I Rを投与すると癌が治癒され得ることが明らかになった。このような関連、ならびにそれを利用した診断および治療効果は従来知られておらず、したがつて、本発明の因子は、従来技術により提供されるものより優れた効果を示す。好ましい実施形態において、本発明の因子は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子からなる群より選択される因子であり得る。このような因子は、本発明の核酸分子に特異的に結合するものであれば、どのようなものでもよいことが理解され得る。

好ましい実施形態では、本発明の因子は、核酸分子である。本発明の因子が核酸分子である場合、そのような核酸分子は、少なくとも 8の連続するヌクレォチド長であり得、好ましくは F I Rの核酸配列（例えば、配列番号 1 ) に対して特異的に結合し得る。本発明の核酸分子は、本発明の使用目的によってその適切なヌクレオチド長が変動し得る。より好ましくは、本発明の核酸分子は、少なくとも 1 0の連続するヌクレオチド長であり得、さらに好ましくは少なくとも 1 5の連続するヌクレオチド長であり得、なお好ましくは少なくとも 2 0 の連続するヌクレオチド長であり得る。これらのヌクレオチド長の下限は、具体的に挙げた数字のほかに、それらの間の数（例えば、 9、 1 1、 1 2、 1 3、 1 4、 1 6など）あるいは、それ以上の数（例えば、 2 1、 2 2、 . . . 3 0、など）であってもよい。本発明の核酸分子は、目的とする用途（例えば、アンチセンス、 R N A i、マーカー、プライマ一、プロ一ブ）として使用することができるかまたは所定の因子と相互作用することができる限り、その上限の長さは、配列番号 1、 1 1などに示す配列またはその相補体の全長であってもよく、それを超える長さであってもよい。あるいは、プライマ一として使用する場合は、通常少なくとも約 8のヌクレオチド長であり得、好ましくは約 1 0ヌクレオチド長であり得る。プローブとして使用する場合は、通常少なくとも約 1 5ヌクレオチド長であり得、好ましくは約 1 7ヌクレオチド長であり得る。従って、 1つの例示的な実施形態において、本発明の因子は、上記（a ) 〜 ( e ) のいずれかの F I Rポリヌクレオチドの核酸配列に対して相補的な配列またはそれに対して少なくとも 7 0 %の同一性を有する配列を有する核酸分子であり得る。別の例示的な実施形態において、本発明の因子は、（a ) 配列番号 1に記載の塩基配列もしくはその相補体またはそのフラグメント配列を有する、ポリヌクレオチド；（b ) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド；（c ) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも 1つの変異を有する改変体ポリペプチドであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；（d ) ( a ) 〜（c ) のいずれか 1つのポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハィブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または（e ) ( a ) 〜（c ) のいずれか 1つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも 7 0 %である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、のいずれかの F I Rポリヌクレオチドの核酸配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダィズする核酸分子であり得る。ストリンジエンシーは、高くても、中程度であっても、低くてもよく、程度は、当業者が適宜状況に応じて決定することができる。

あるいは、本発明の因子は、配列番号 1で示される配列またはその相補体を含む核酸分子に対して特異的な因子であることが好ましい。このような配列は、正常な組織において存在する形態の F I Rを同定することができることから、ある組織または個体の癌化の程度を調べるために有用である。

好ましくは、配列番号 1で示される配列またはその相補体を含む核酸分子に対して特異的な因子は、（a ) 配列番号 1またはその相補体において置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも 1つの改変を含む配列；または（b ) 配列番号 1 1、 1 3および 1 5からなる群より選択される少なくとも 1つの配列もしくはその相補体、または該少なくとも 1つの配列もしくはその相補体において置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも 1つの改変を含む配列、を含む核酸分子には特異的に反応しないことが好ましい。このように弁別可能に反応することによって、 F I Rの改変体と正常な F I Rとを弁別して検出することができるからである。そのような検出によって、癌（特に、（直腸癌または結腸癌（これらを総称して大腸癌とも言う）を含む c一 m y c高発現癌）の従来不可能であった正確な診断を行うことができるという優れた効果および有用性を達成する。

別の好ましい実施形態において、本発明の因子は、（a ) 配列番号 1またはその相補体において置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも 1つの改変を含む配列；または（b ) 配列番号 1 1、 1 3および 1 5からなる群より選択される少なくとも 1つの配列もしくはその相補体、または該少なくとも 1つの配列もしくはその相補体において置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも 1つの改変を含む配列、を含む核酸分子に特異的に反応することが好ましい。このような改変体に対して特異的な因子を使用することによって、癌に罹患した個体または組織部分を検出することが容易となるという有用性が提供される。この因子は、好ましくは、配列番号 1で示される配列またはその相補体を含む核酸分子に対しては特異的に反応しないことが有利である。このように弁別可能に反応することによって、 F I Rの改変体と正常な F I Rとを弁別して検出することができるからである。そのような検出によって、癌（特に、（直腸癌または結腸癌（これらを総称して大腸癌とも言う）を含む c一 m y c高発現癌）の従来不可能であった正確な診断を行うことができるという優れた効果および有用性を達成する。

別の好ましい実施形態では、本発明の因子は、 F I Rの核酸分子のアンチセンスまたは R NA iである。 R NA iは、 s i R N Aであっても s h R NAであってもよく、そのような例としては、たとえば、約 2 0塩基前後（例えば、代表的には約 2 1〜2 3塩基長）またはそれ未満の長さの二本鎖 R N Aであつて、好ましくは、 5 ' —リン酸、 3 ' — O Hの構造を有しており、 3 ' 末端は約 2塩基突出している。 s h R NAはまた、好ましくは、 3，突出末端を有し得る。二本鎖部分の長さは特に限定されないが、好ましくは約 1 0ヌクレオチド長以上、より好ましくは約 2 0ヌクレオチド長以上であり得る。ここで、 3 ' 突出末端は、好ましくは D N Aであり得、より好ましくは少なくとも 2ヌクレオチド長以上の D N Aであり得、さらに好ましくは 2〜4ヌクレオチド長の D NAであり得る。

別の好ましい実施形態において、本発明の因子は、核酸分子であり、 P C R などの核酸増幅反応などにおけるプライマーとして使用され得、あるいは、サザンブロットなどのプローブとして使用され得る。

好ましい実施形態において、本発明の因子は、標識されているかまたは標識と結合し得るものであることが有利であり得る。そのように標識がされている場合、本発明の因子によって測定することができる種々の状態を直接および Z または容易に測定することができる。そのような標識は、識別可能に標識される限り、どのような標識でもよく、例えば、蛍光、リン光、化学発光、放射能、酵素基質反応および抗原抗体反応などの技法が挙げられるがそれらに限定されない。あるいは、その因子が抗体などの免疫反応を利用して相互作用する場合、ピオチン—ストレプトアビジンのような免疫反応においてよく利用される系を用いてもよい。 (F I R核酸形態を用いた診断キットおよび方法）

別の局面において、本発明は、 A) ( a ) 配列番号 1 ( F I R 5 4 2をコードする）に記載の塩基配列もしくはその相補体またはそのフラグメント配列を有する、ポリヌクレオチド；（b ) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド；（c ) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも 1つの変異を有する改変体ポリペプチドであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；

( d ) ( a ) 〜（c ) のいずれか 1つのポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または（e ) ( a ) 〜（c ) のいずれか 1つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも 7 0 %である塩基配列からなり、かつ、 .生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、を含む、核酸分子に対して特異的な第一の因子；および B ) 該第一の因子に起因するシグナルを用いて該核酸分子の発現量を測定するための手段であって、癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分における該核酸分子の発現量に比較して対象の被験体の対象部分における該核酸分子の発現が高い場合、該対象の被験体は癌のハイリスク者であると診断する、手段、を備える、癌診断キットを提供する。ここで、診断対象となる癌は、 c 一 m y c高発現癌であることが好ましいが、それに限定されない。理論に束縛されることは望まないが、本発明の F I Rは、 c -m y cとの関連が高いことが指摘されているからである。このような c一 m y c高発現癌としては、例えば、直腸癌および結腸癌が挙げられるがそれらに限定されない。このような F I Rに特異的な因子としては、本明細書において記載されるような任意の因子を使用することができる。第一の因子は、 F I Rの正常型および改変体のいずれとも特異的に反応してもよく、あるいは、 F I Rの正常型または改変体のいずれか一方と特異的に反応してもよい。その反応特異性さえ理解して提供される限り、どのような特異性を有する因子であっても本発明において利用することができ、したがって、そのような因子およびそれを含むキットは、本発明の範囲内にあることが理解される。 1つの実施形態では、正常型と改変体との共通の配列（例えば、配列番号 1、 1 1、 1 3、 1 5、 1 7、 1 9、 2 1などの 3 ' 末端側の配列であって、例えば、 1 0 0ヌクレオチド長の配列など）に対して特異的な因子が挙げられるがそれらに限定されない。ここで、第一核酸分子の発現量の測定は、第一の因子に起因する任意のシグナルを用いて行うことができる。そのようなシグナルとしては、例えば、物理的信号（例えば、蛍光、発光など）、化学的信号（例えば、染色など）、生化学的信号（例えば、酵素反応）、生物学的信号（例えば、微生物の生存の判定）などが挙げられるがそれらに限定されない。このようなシグナルは、被験体の生体試料中に、本発明の mRNAが存在するか否かを直接または間接的に試験することが判定できるようなものであれば、どのようなものでも使用することができる。この場合、そのようなシグナルが検出される場合、試料中にその iRNAの存在量に異常が存在する被験体を癌患者またはそのハイリスク者と判定することができる。

特定の実施形態において、本発明は、 A) 配列番号 1で示される配列またはその相補体を含む核酸分子（第二核酸分子）に対して特異的な第二の因子； B ) 該第二の因子に起因するシグナルを用いて該核酸分子の発現量を測定するための手段であって、癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分における該核酸分子の発現量と、対象の被験体の対象部分における該核酸分子の発現量とが異なる場合、該対象の被験体は癌の Λィリスク者であると診断する、手段、を備える、癌診断キットを提供する。この特定の実施形態において、このような F I Rに特異的な因子としては、本明細書において記載されるような任意の第二の因子を使用することができる。第二の因子は、正常型 F I Rと特異的に反応する限り、どのようなものを使用してもよい。好ましくは、第二の因子は、改変体とは特異的に反応しないことが有利であり得る。このような性質さえ有する限り、任意の第二の因子がその反応特異性さえ理解して提供され、どのような特異性を有する因子であっても本発明において利用することができ、したがって、そのような因子およびそれを含むキットは、本発明の範囲内にあることが理解される。 1つの実施形態では、正常型と改変体との改変配列（例えば、 5 ' 末端側の配列であって、例えば、約 4 0 0ヌクレオチド長における任意の配列など）に対して特異的な因子が挙げられるがそれらに限定されない。

ここで、第二核酸分子の発現量の測定は、第二の因子に起因する任意のシグナルを用いて行うことができる。そのようなシグナルとしては、例えば、物理的信号（例えば、蛍光、発光など）、化学的信号（例えば、染色など）、生化学的信号（例えば、酵素反応）、生物学的信号（例えば、微生物の生存の判定）などが挙げられるがそれらに限定されない。このようなシグナルは、被験体の生体試料中に、本発明の mRNAが存在するか否かを直接または間接的に試験することが判定できるようなものであれば、どのようなものでも使用することができる。この場合、そのようなシグナルが検出される場合、試料中にその mRNAの発現量に異常が存在する被験体を癌患者またはそのハイリスク者と判定することができる。

特定の実施形態において、本発明は、 A) ( a ) 配列番号 1またはその相補体において置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも 1つの改変を含む配列；または（b ) 配列番号 1 1、 1 3および 1 5からなる群より選択される少なくとも 1つの配列もしくはその相補体、または該少なくとも 1 つの配列もしくはその相補体において置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも 1つの改変を含む配列、を含む第三核酸分子に対して特異的な第三の因子；ならびに B ) 該第三の因子に起因するシグナルを用いて該第三核酸分子の発現量を測定するための手段であって、対象の被験体の対象部分において該核酸分子が検出される場合、該対象の被験体は癌患者であると確定する、手段、を備える、癌診断キットを提供する。この第三の因子は、 F I R の改変体に対して特異的であり、その検出を行うことができることから、第三の因子に起因するシグナルを測定することによって、癌の診断を行うことが可能となる。ここで、第三の因子は、本明細書における上記「F I Rの核酸形態に特異的な因子」節において説明されるような任意の形態をとることができる。第三の因子は、 F I Rの改変体と特異的に反応し、 F I Rの正常型とは特異的に反応してもそうでなくてもよい。好ましくは、第二の因子は、正常型とは反応しないことが好ましい。ただし、その反応特異性さえ理解して提供される限り、どのような特異性を有する因子であっても本発明において利用することができ、したがって、そのような因子およびそれを含むキットは、本発明の範囲内にあることが理解される。 1つの実施形態では、改変体に特異的な部分（例えば、配列番号 1 1、 1 3、 1 5、 1 7、 1 9、 2 1の 5 ' 末端側の配列であつて、例えば、 1 0 0ヌクレオチド長の配列など）に対して特異的な因子が挙げられるがそれらに限定されない。

ここで、第三核酸分子の発現量の測定は、第三の因子に起因する任意のシグナルを用いて行うことができる。そのようなシグナルとしては、例えば、物理的信号（例えば、蛍光、発光など）、化学的信号（例えば、染色など）、生化学的信号（例えば、酵素反応）、生物学的信号（例えば、微生物の生存の判定）などが挙げられるがそれらに限定されない。このようなシグナルは、被験体の生体試料中に、本発明の第三核酸分子に対応する mRNAが存在するか否かを直接または間接的に試験することが判定できるようなものであれば、どのようなものでも使用することができる。この場合、そのようなシグナルが検出される場合、試料中にその mRNA の発現が存在する被験体を癌患者またはそのハィリスク者と判定することができる。

本発明の癌診断キットまたは方法において好ましい実施形態では、上記対象の被験体の対象部分における上記第三核酸分子の検出は、癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分における該核酸分子の発現量に比較して対象の被験体の対象部分における該第 S核酸分子の発現が高いことを検出することであり得る。

別の特定の実施形態において、本発明は、 A) 配列番号 1で示される配列またはその相補体を含む核酸分子（第二核酸分子）に対して特異的な第二の因子； B ) ( a ) 配列番号 1またはその相補体において置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも 1つの改変を含む配列；または（b ) 配列番号 1 1、 1 3および 1 5からなる群より選択される少なくとも 1つの配列もしくはその相補体、または該少なくとも 1つの配列もしくはその相補体において置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも 1つの改変を含む配列、を含む核酸分子（第三核酸分子）に対して特異的な第三の因子； C ) 該第二の因子および該第三の因子に起因するシグナルを識別可能に検知して、第二核酸分子と第三核酸分子のそれぞれの発現量を測定するための手段であつて、癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分における第二核酸分子の発現に比較して対象の被験体の対象部分における第二核酸分子の発現が高く、かつ、癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分における第三核酸分子の発現に比較して対象の被験体の対象部分における第三核酸分子の発現が高い場合、該対象の被験体は癌患者であると確定する、手段、を備える、癌診断キットを提供する。

ここで、好ましくは、 C) 手段は、第二核酸分子と第三核酸分子との相対存在比を比較する手段を包含する。好ましい実施形態では、第二の因子は第三核酸分子に特異的に反応しないか、または、第三の因子は第二核酸分子に特異的に反応しないことが有利である。識別可能に両方の核酸分子を検出することができるからである。より好ましい実施形態では、第二の因子は第三核酸分子に特異的に反応しせず、かつ、第三の因子は第二核酸分子に特異的に反応しないことの両方であることが有利である。これらの因子によって検出されるシグナル強度が、対象とする核酸分子の量により正確に反映されるからである。これらの第二の因子と、第三の因子とは、識別可能に標識されているかまたは標識され得ることが好ましい。ここで、識別可能に標識されている因子は、その因子が、すでに、識別可能な標識を有していることを意味し、 2つ以上の因子が識別可能に標識され得るとは、別の処理をその因子に行うことによって、その 2つ以上の因子を識別することができるようになることをいう。このような場合、本発明のキットは、第二の因子と、第三の因子とを、識別可能に標識する因子をさらに含む。このような識別可能な標識の識別は、物理的様式（例えば、蛍光、発光など）、化学的様式（例えば、特定の化学的切断、染色など）、生化学的様式（例えば、酵素反応）、生物学的様式（例えば、微生物の生存の判定）などによって行うことができる。

他の特定の実施形態において、本発明は、 A) ( a ) 配列番号 1に記載の塩基配列もしくはその相補体またはそのフラグメント配列を有する、ポリヌクレォチド；（b ) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド；（c ) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも 1つの変異を有する改変体ポリぺプチドであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；（d ) ( a ) 〜 ( c ) のいずれか 1つのポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または（e ) ( a ) 〜（c ) のいずれか 1つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも 7 0 %である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、を含む、核酸分子（第一核酸分子）に対して特異的な第一の因子； B ) ( a ) 配列番号 1またはその相補体において置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも 1つの改変を含む配列；または（b ) 配列番号 1 1、 1 3および 1 5からなる群より選択される少なくとも 1つの配列もしくはその相補体、または該少なくとも 1つの配列もしくはその相補体において置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも 1つの改変を含む配列、を含む核酸分子（第三核酸分子）に対して特異的な第三の因子； C ) 第一の因子および第三の因子に起因するシグナルを識別可能に検知して、第一核酸分子と第三核酸分子のそれぞれの発現量を測定するための手段であって、癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分における第一核酸分子の発現量における第三核酸分子の発現量の割合が、対象の被験体の対象部分における第一核酸分子の発現量における第三核酸分子の発現量の割合よりも高い場合、該対象の被験体は癌患者であると確定する、手段、を備える、癌診断キットを提供する。ここで、診断対象となる癌は、 c一 my c高発現癌であることが好ましいが、それに限定されない。理論に束縛されることは望まないが、本発明の F I Rは、 c -my cとの関連が高いことが指摘されているからである。このような c一 my c高発現癌としては、例えば、直腸癌および結腸癌が挙げられるがそれらに限定されない。上記核酸分子の検出は、そのような核酸分子に対して特異的な因子を用いて行うことができる。そのような因子としては、本明細書に記載される F I Rの核酸形態に対して特異的な任意の因子を用いることができる。ここで、第一の因子は、第一核酸分子に特異的であり、第三の因子は、第三核酸分子に特異的である。第一核酸分子は、 F I Rの正常型およびその改変体の両方を包含し得ることから、 F I R関連分子の総量を検出することができる。従って、好ましくは、第一の因子は、 F I Rの正常型および改変体の両方に特異的に反応し得ることが有利である。第三核酸分子は F I Rの改変体であり、癌の組織に特異的に存在することから、癌の指標として使用することができる。これらの第一核酸分子および第三核酸分子の両方を測定することによって、相対的な測定を行うことができる。従って、上記 C) 手段は、第三核酸分子との相対存在比または絶対存在量を比較する手段を包含することが好ましい。相対存在比は、因子に起因するシグナル（例えば、蛍光強度）を直接対比することによって算出することができる。従って、絶対量を算出する必要がないことから、そのような状況において好ましい。絶対存在量を算出する場合、既知量の標準試料をもとに、各因子を用いて検量線を作成し、それによつて絶対量を算出することができる。そのような方法は、当該分野において周知である。別の好ましい実施形態において、本発明の診断キットにおいて使用される第一の因子は第三核酸分子に特異的に反応しないか、または第一の因子は第三核酸分子および第二核酸分子の両方に特異的に反応することが有利であり得る。第三核酸分子に特異的に反応しない場合、この第一の因子と第三の因子とを使用して、特定の F I R改変体とそうでない F I R分子との存在比を検出することができる。あるいは、第一の因子が第二核酸分子および第二核酸分子の両方に特異的に反応する場合、 F I Rの発現量の総量と改変体の発現量とを比較することができる。好ましくは、第一の因子と、第三の因子とは、識別可能に標識されているかまたは標識され得る。このような場合、本発明のキットは、第一の因子と、第三の因子とを、識別可能に標識する因子をさらに含む。このような識別可能な標識の識別は、物理的様式（例えば、蛍光、発光など）、化学的様式（例えば、特定の化学的切断、染色など）、生化学的様式（例えば、酵素反応）、生物学的様式（例えば、微生物の生存の判定）などによって行うことができる。

本発明の F I Rの検出のために、生体試料としては、便、尿、汗、生検組織、唾液、血液（例えば、全血、血清、血漿など）、血液細胞（単核球等）、他の体液、罹患した部分の細胞などを対象とすることができる。 mRNAの検出、測定は公知の RT- PCR法、定量的 RT- PCT法によって行うことができ、その場合の PCR は本発明のプライマーセットを用いることができる。これらのプライマーセットは、配列番号 1、 1 1、 1 3、 1 5、 1 7、 1 9の塩基配列またはその改変体に基づき設計し、合成 ·精製の各工程を経て調製することができる。なお、プライマー設計の留意点として、例えば以下を指摘することができる。プライマーのサイズ（塩基数）は、铸型 DNA との間の特異的なアニーリングを満足させることを考慮し、 15-40塩基、望ましくは 15-30塩基である。ただし、 LA (long accurate) PCRを行う場合には、少なくとも 30塩基が効果的である。 -の設計の際には、センス鎖（5'末端側）とアンチセンス鎖（3'末端側）からなる 1組あるいは 1対（2本）のプライマーが互いにァニールしないよう、両プライマ一間の相補的配列を避けると共に、プライマー内のへアビン構造の形成を防止するため自己相補配列をも避けるようにする。本発明では、正常型とその改変体とを識別する必要がある場合、正常型と改変体との間で識別可能な部位に由来するプライマ一を少なくとも 1つ使用することが好ましい。このような識別可能な部位は、配列番号 1の約 4 0 0位までの塩基配列により多く存在しており、好ましくは、そのような識別可能な部位は、配列番号 1の約 1 5 0位〜約 3 6 0位の範囲に存在する。測定対象が、付加型または欠失型 (例えば、配列番号 1および配列番号 1 1 (これは、配列番号 1に示す配列において 1 0 2位と 1 0 3位とをコードするアミノ酸の間にアミノ酸残基が挿入

(付加）されている）、あるいは、配列番号 1および配列番号 1 7 (これは、配列番号 1に示す配列から 4 3アミノ酸分をコードする核酸が欠失している））である場合、一方に存在し、他方には存在しないような配列（例えば、欠失または付加部分の配列）をプライマ一の少なくとも一方として使用することが好ましく、プライマー対の両方として使用することがより好ましい。

さらに、铸型 DNAとの安定な結合を確保するため GC含量を約 50%にし、プライマ一内において GC-r i chあるいは AT- r i chが偏在しないようにする。ァニ一リング温度は Tm (me l t ing t e即 era ture) に依存するので、特異性の高い PCR産物を得るため、 Tm値が 55-65°Cで互いに近似したプライマ一を選定する。また、 PCRにおけるプライマー使用の最終濃度が約 0. 1〜約 1 Mになるよう調整する等を留意することも必要である。また、プライマー設計用の市販のソフトウエア、例えば Ol igo™ [Nat i onal Bi osc i ence Inc. (米国）製] 、 GENETYX [ソフトウェア開発（株）（日本）製] 等を用いることもできる。

あるいは、本発明のキットまたは診断法は、アレイを用いて実行することができる。アレイの実行方法は、上述したとおりである。別の局面において、本発明は、癌診断方法を提供する。この癌診断方法は、

A) 対象の被験体の対象部分からの試料を提供する工程； B) 該試料中における、（a ) 配列番号 1に記載の塩基配列もしくはその相補体またはそのフラグメント配列を有する、ポリヌクレオチド；（b ) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド、（c ) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも 1つの変異を有する改変体ポリぺプチドであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；（d ) ( a ) 〜（c ) のいずれか 1つのポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイプリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または（e ) ( a ) 〜（c ) のいずれか 1つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも 7 0 %である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコ一ドするポリヌクレオチド、を含む、核酸分子の存在量を測定する工程； C) 該核酸分子の存在量と、癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分からの試料における同一核酸分子の存在量とを比較し、該対象の被験体の対象部分からの試料における該核酸分子の量が増加している場合、該対象の被験体は癌のハイリスク者であると診断する、工程、を包含する。この癌診断方法で使用される試料としては、便、尿、汗、生検組織、唾液、血液（例えば、全血、血清、血漿など）、血液細胞（単核球等）、他の体液、罹患した部分の細胞などを対象とすることができる。比較の対象のために、罹患していないことが明らかな部位、または罹患していない他の被験体からの試料を利用することができる。罹患していない他の被験体からの試料を使用する場合、好ましくは、そのような試料は、対象となる被験体の対象部位と同様の部位に由来する試料を利用することができる。ここで、診断対象となる癌は、 c— mv C高発現癌であることが好ましいが、それに限定されない。理論に束縛されることは望まないが、本発明の F I Rは、 c—my cとの関連が高いことが指摘されているからである。このような c— my c高発現癌としては、例えば、直腸癌および結腸癌が挙げられるがそれらに限定されない。上記核酸分子の検出は、そのような核酸分子に対して特異的な因子を用いて行うことができる。そのような因子としては、本明細書に記載される F I Rの核酸形態に対して特異的な任意の因子を用いることができる。

特定の実施形態において、本発明は、 A) 対象の被験体の対象部分からの試料を提供する工程； B ) 該試料中において、配列番号 1で示される配列またはその相補体を含む第二核酸分子の存在量を測定する工程； C) 該第二核酸分子の存在量と、癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分からの試料における同一核酸分子の存在量とを比較し、両者が異なる場合、該対象の被験体は癌のハイリスク者であると診断する、工程、を包含する、癌診断方法を提供する。配列番号 1で示される配列またはその相補体を含む第二核酸分子は、正常組織において通常に発現しており、 c一 my cを高発現する細胞にアポトーシスを起こすことが知られており、その変異（例えば、置換、決失、付加など）によって、正常な機能が損なわれ得る。したがって、このような変異は、アポトーシス異常（例えば、癌など）の原因および指標であり得る。あるいは、その正常型の発現量の異常もまた、アポトーシス異常（例えば、癌など）の原因および指標であり得る。したがって、このような異常型の検出および正常型の発現量の異常の検出は、アポトーシス異常の診断指標として有用である。第二の因子は、本明細書における上記「F I Rの核酸形態に特異的な因子」節において説明されるような任意の形態をとることができる。第二の因子は、正常型の F I Rと特異的に反応し、その改変体とは特異的に反応してもそうでなくてもよい。好ましくは、第二の因子は、改変体とは反応しないことが好ましい。ただし、その反応特異性さえ理解して提供される限り、どのような特異性を有する因子であっても本発明において利用することができ、したがつて、そのような因子およびそれを含むキットは、本発明の範囲内にあることが理解される。 1つの実施形態では、正常型に特異的な部分（例えば、配列番号 1の 5 ' 末端側の配列であって、例えば、 1 0 0ヌクレオチド長の配列など）に対して特異的な因子が挙げられるがそれらに限定されない。

特定の実施形態において、本発明は、 A) 対象の被験体の対象部分からの試料を提供する工程； B ) 該試料中において、（a ) 配列番号 1またはその相補体において置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも 1つの改変を含む配列；または（b ) 配列番号 1 1、 1 3および 1 5からなる群より選択される少なくとも 1つの配列もしくはその相補体、または該少なくとも 1 つの配列もしくはその相補体において置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも 1つの改変を含む配列、を含む核酸分子を検出する工程； C) 該核酸分子が検出される場合、該対象の被験体は癌患者であると確定する、工程、を包含する、癌診断方法を提供する。この癌診断方法で使用される試料としては、便、尿、汗、生検組織、唾液、血液（例えば、全血、血清、血漿など）、血液細胞（単核球等）、他の体液、罹患した部分の細胞などを対象とすることができる。比較の対象のために、罹患していないことが明らかな部位、または罹患していない他の被験体からの試料を利用することができる。罹患していない他の被験体からの試料を使用する場合、好ましくは、そのような試料は、対象となる被験体の対象部位と同様の部位に由来する試料を利用することができる。ここで、診断対象となる癌は、 c— m y c高発現癌であることが好ましいが、それに限定されない。理論に束縛されることは望まないが、本発明の F I Rは、 c一 my cとの関連が高いことが指摘されているからである。このような c一 my c高発現癌としては、例えば、直腸癌および結腸瘙が挙げられるがそれらに限定されない。上記核酸分子の検出は、そのような核酸分子に対して特異的な因子を用いて行うことができる。そのような因子としては、本明細書に記載される F I Rの核酸形態に対して特異的な任意の因子を用いることができる。ここで、好ましくは、 C) 工程では、上記核酸分子の存在量と、癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分からの試料における同一核酸分子の存在量とを比較し、上記対象の被験体の対象部分からの試料における該核酸分子の量が増加している場合、該対象の被験体は癌患者であると確定することであるとすることができる。

他の特定の実施形態において、本発明は、 A) 対象の被験体の対象部分からの試料を提供する工程； B ) 該試料中において、第二核酸分子および第三核酸分子の存在量を測定する工程； C ) この第二核酸分子の存在量と、癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分からの試料における同一核酸分子の存在量とを比較し、該対象の被験体の対象部分からの試料における第二核酸分子の発現量が変動（例えば、増加または減少）しており、かつ、第三核酸分子の存在量と、癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分からの試料における同一核酸分子の存在量とを比較し、該対象の被験体の対象部分からの試料における第三核酸分子の発現量が増加している場合、該対象の被験体は癌患者であると確定する工程、を包含する、癌診断方法を提供する。ここで、診断対象となる癌は、 c—my c高発現癌であることが好ましいが、それに限定されない。理論に束縛されることは望まないが、本発明の F I Rは、 c -my cとの関連が高いことが指摘されているからである。このような c一 m y c高発現癌としては、例えば、直腸癌および結腸癌が挙げられるがそれらに限定されない。上記核酸分子の検出は、そのような核酸分子に対して特異的な因子を用いて行うことができる。そのような因子としては、本明細書に記載される F I Rの核酸形態に対して特異的な任意の因子を用いることができる。他の特定の実施形態において、本発明は、 A) 対象の被験体の対象部分からの試料を提供する工程； B ) 該試料中において、（a ) 配列番号 1に記載の塩基配列もしくはその相補体またはそのフラグメント配列を有する、ポリヌクレォチド；（b ) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントをコ —ドする、ポリヌクレオチド；（c ) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも 1つの変異を有する改変体ポリぺプチドであつて、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコ一ドする、ポリヌクレオチド；（d ) ( a ) 〜 ( c ) のいずれか 1つのポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または（e ) ( a ) 〜（c ) のいずれか 1つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも 7 0 %である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、を含む、核酸分子（第一核酸分子）および（a ) 配列番号 1またはその相補体において置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも 1つの改変を含む配列；または（b ) 配列番号 1 1、 1 3および 1 5からなる群より選択される少なくとも 1つの配列もしくはその相補体、または該少なくとも 1つの配列もしくはその相補体において置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも 1つの改変を含む配列、を含む核酸分子（第ミ核酸分子）の存在量を測定する工程； C ) 第一核酸分子と第三核酸分子のそれぞれの発現量を測定する工程であって、癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分における第一核酸分子の発現量における第三核酸分子の発現量の割合が、対象の被験体の対象部分における第一核酸分子の発現量における第三核酸分子の発現量の割合よりも高い場合、該対象の被験体は癌患者であると確定する、工程、を包含する、癌診断方法を提供する。ここで、診断対象となる癌は、 c _m y c高発現癌であることが好ましいが、それに限定されない。理論に束縛されることは望まないが、本発明の F I Rは、 c—m y cとの関連が高いことが指摘されているからである。このような c _ m y c高発現癌としては、例えば、直腸癌および結腸癌が挙げられるがそれらに限定されない。上記核酸分子の検出は、そのような核酸分子に対して特異的な因子を用いて行うことができる。そのような因子としては、本明細書に記載される F I Rの核酸形態に対して特異的な任意の因子を用いることができる。

別の局面において、本発明は、（a ) 配列番号 1に記載の塩基配列もしくはその相補体またはそのフラグメント配列を有する、ポリヌクレオチド；（b ) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド；（c ) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列において、 1以上のァミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも 1つの変異を有する改変体ポリペプチドであつて、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；（d ) ( a ) 〜（c ) のいずれか 1つのポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または ( e ) ( a ) 〜（c ) のいずれか 1つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも 7 0 %である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、を含む、核酸分子の、癌の診断剤の製造のための使用を提供する。ここで、診断対象となる癌は、 c一 my c高発現癌であることが好ましいが、それに限定されない。理論に束縛されることは望まないが、本発明の F I Rは、 c -m y cとの関連が高いことが指摘されているからである。このような c一 my c高発現癌としては、例えば、直腸癌および結腸癌が挙げられるがそれらに限定されない。上記核酸分子の検出は、そのような核酸分子に対して特異的な因子を用いて行うことができる。そのような因子としては、本明細書に記載される F I Rの核酸形態に対して特異的な任意の因子を用いることができる。 ( F I Rの核酸形態を用いた治療方法および治療剤）別の局面において、本発明は、 A) (a) 配列番号 1 (F I R 542をコードする）に記載の塩基配列もしくはその相補体またはそのフラグメント配列を有する、ポリヌクレオチド；（b) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド；（c) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも 1つの変異を有する改変体ポリぺプチドであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド； (d) (a) 〜（c) のいずれか 1つのポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または（e) (a) 〜（c) のいずれか 1つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも 70 %である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、を含む、核酸分子を含む、癌治療剤を提供する。ここで、治療対象となる癌は、 c一 my c高発現癌であることが好ましいが、それに限定されない。理論に束縛されることは望まないが、本発明の F I Rは、 c— myc との関連が高いことが指摘されているからである。このような c一 my c高発現癌としては、例えば、直腸癌および結腸癌が挙げられるがそれらに限定されない。このような F I Rの核酸形態としては、本明細書において記載されるような任意の核酸分子を使用することができる。好ましくは、 F I Rの正常型を発現することができる核酸分子が使用される。 1つの実施形態では、例えば、配列番号 1、 11、 13、 15、 17、 19、 21に示される配列またはその改変体であって、配列番号 1と同等の機能を有する分子または配列番号 2と同等の機能を有する分子を発現する分子を利用することができる。より好ましくは、本発明の治療剤に含まれる核酸分子は、配列番号 2で示される配列を含むポリペプチド（Bポリペプチド）をコードする核酸分子を含む。別の局面において、本発明は、上記癌治療剤を用いた癌治療法を提供する。この治療法は、本明細書において説明される任意の治療技術を用いることができる。 (F I Rのポリペプチド形態）

別の局面において、本発明は、本発明は、ポリペプチド形態の F I Rを含む、癌（例えば、直腸癌または結腸癌（これらを総称して大腸癌とも言う）のような c一 my c高発現癌）の状態の、処置、予防、診断または予後のための組成物'を提供する。ここで、診断、予防、処置または予後上有効な量は、当該分野において周知の技法を用いて当業者が種々のパラメ一夕を参酌しながら決定することができ、そのような量を決定するためには、例えば、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、細胞の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる（例えば、がん診療レジデントマニュアル第 2版、編集：国立がんセンタ一中央病院内科レジデント、医学書院、 2 0 0 0を参照）。本発明では、本発明では、癌の発症が、 F I Rの異常発現と予想外に関連していること、および正常型 F I Rを投与すると癌が治癒され得ることが明らかになった。このような関連、ならびにそれを利用した診断および治療効果は従来知られておらず、したがって、本発明の F I Rのポリペプチド形態およびそれに関連する発明は、従来技術より優れた効果を示す。

従って、 1つの実施形態において、本発明は、（a ) 配列番号 2に記載のァミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；（b ) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも 1つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；（C ) 配列番号 1に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；（d ) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または (e) (a) 〜（d) のいずれか 1つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも 70%であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリべプチド、を含む、ポリペプチドを提供する。

1つの好ましい実施形態において、上記（b) における置換、付加および欠失の数は限定されていてもよく、例えば、 50以下、 40以下、 30以下、 2 0以下、 15以下、 10以下、 9以下、 8以下、 7以下、 6以下、 5以下、 4 以下、 3以下、 2以下であることが好ましい。より少ない数の置換、付加および欠失が好ましいが、生物学的活性を保持する（好ましくは、配列番号 2に示される配列からなる正常型 F I Rと類似するかまたは実質的に同一の活性を有する、あるいは F I Rの異常型活性（例えば、 FBPとの結合不良など） ) 限り、多い数であってもよい。

別の好ましい実施形態において、上記（c) におけるスプライス変異体または対立遺伝子変異体は、配列番号 2に示すアミノ酸配列と少なくとも 99 %の相同性を有することが好ましい。

別の好ましい実施形態において、上記種相同体は、本明細書中上述のように同定することができ、配列番号 2に示すアミノ酸配列と少なくとも約 30%の相同性を有することが好ましい。好ましくは、種相同体は、上記基準配列と、少なくとも約 40%、少なくとも約 50%、少なくとも約 60%、少なくとも約 70%、少なくとも約 80%、少なくとも約 90%、少なくとも約 95%、少なくとも約 98%、相同であり得る。

上記種相同体は、その種の遺伝子配列データベースが存在する場合、そのデ一夕ベースに対して、本発明の F I R (またはより好ましくは F I R 542) をクエリ配列として検索することによって同定することができる。あるいは、本発明の F I R (またはより好ましくは F I R 542) の全部または一部をプローブまたはプライマーとして、その種の遺伝子ライブラリ一をスクリーニン W

グすることによって同定することができる。そのような同定方法は、当該分野において周知であり、本明細書において記載される文献にも記載されている。種相同体は、例えば、配列番号 1に示す核酸配列または配列番号 2に示すアミノ酸配列と少なくとも約 30 %の相同性を有することが好ましい。好ましくは、種相同体は、上記基準配列と、少なくとも約 40 %、少なくとも約 5 0%、少なくとも約 6 0%、少なくとも約 7 0 %、少なくとも約 8 0%、少なくとも約 90%、少なくとも約 9 5%、少なくとも約 98%、相同であり得る。

別の好ましい実施形態において、上記（e) における上記改変体ポリべプチドが有する生物学的活性としては、例えば、配列番号 2に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントに対して特異的な抗体との相互作用、 FBPとの相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。これらは例えば、免疫学的アツセィ、リン酸化定量などによって測定することができる。ここで、 FBPに結合する能力は、配列番号 2における 3 7 2位〜 442 位に記載される配列によって規定され、 F B Pを用いて測定することができる。好ましい実施形態において、上記（a) 〜（d) のいずれか 1つのポリぺプチドに対する相同性は、少なくとも約 8 0 %であり得、より好ましくは少なくとも約 9 0 %であり得、さらに好ましくは少なくとも約 9 8 %であり得、もつとも好ましくは少なくとも約 9 9 %であり得る。最も好ましくは、本発明の F I Rポリペプチドは、 F I R 542である。

本発明のポリペプチドは、通常、少なくとも 3の連続するアミノ酸配列を有する。本発明のポリペプチドが有するアミノ酸長は、目的とする用途に適合する限り、どれだけ短くてもよいが、好ましくは、より長い配列が使用され得る。従って、好ましくは、少なくとも 4アミノ酸長、より好ましくは少なくとも 5 アミノ酸長、少なくとも 6アミノ酸長、少なくとも 7アミノ酸長、少なくとも 8アミノ酸長、少なくとも 9アミノ酸長、少なくとも 1 0アミノ酸長であってもよい。さらに好ましくは少なくとも 1 5アミノ酸長であり得、なお好ましくは少なくとも 2 0アミノ酸長であり得る。これらのアミノ酸長の下限は、具体的に挙げた数字のほかに、それらの間の数（例えば、 1 1、 1 2、 1 3、 1 4、 1 6など）あるいは、それ以上の数（例えば、 2 1、 2 2、 . . . 3 0、など）であってもよい。本発明のポリペプチドは、ある因子と相互作用することができる限り、その上限の長さは、配列番号 2に示す配列の全長と同一であつてもよく、それを超える長さであってもよい。

本発明のポリペプチド形態の F I Rは、標識されているかまたは標識され得ることが好ましい。このような標識されているかまたは標識され得る F I Rを用いて、体内にある F I Rに対する抗体量を測定することができ、それにより、 F I Rの発現量を間接的に測定することができるからである。

(特定の F I Rポリペプチド形態）

別の実施形態において、本発明は、配列番号 2で示される配列を含むポリべプチドを提供する。このような配列は、正常な組織でも発現しており、正常であることの指標として使用され得る。あるいは、その発現レベルが異常であれば、癌の発症リスクがあると判断され得る。このような正常な F I Rポリぺプチド形態は、外部から投与することによって、 c—my c発現細胞に対してァポトーシスを起こさせることができ、従って、抗癌剤として使用することができる。

他の好ましい実施形態において、本発明は、（a ) 配列番号 2において、置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも 1つの改変を含むァミノ酸配列；（b ) 配列番号 1 2、 1 4および 1 6からなる群より選択される少なくとも 1つの配列、または該少なくとも 1つの配列において置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも 1つの改変を含む配列を含むポリペプチドを提供する。このような配列は、正常な組織では発現していないかまたはほとんど発現しておらず、しかも癌組織に特異的に発現していることから、その発現自体が癌の診断の指標として使用することができる。これらのポリペプチドは、いずれも、癌組織に特異的であることから、癌の確定診断としても使用可能である。あるいは、これらの発現を、癌に罹患していない組織における発現と比較することによって（好ましくは統計学的処理による）癌の確定診断を行うこともできる。このような癌は、好ましくは、 c一 my c高発現癌（例えば、直腸癌および/または結腸癌などを含む）である。このようなポリペプチドを減少させるような因子は、治療薬として使用することができる可能性がある。従って、そのような因子もまた、本発明の範囲内にあることが理解される。

別の好ましい実施形態において、本発明の上記ポリペプチドにおける上記改変は、置換；配列番号 2の 1 0 2位と 1 0 3位との間もしくは配列番号 1 6の 5 9位と 6 0位との間への付加；あるいは配列番号 2もしくは配列番号 1 2の 1 0 2位までまたは配列番号 1 4もしくは配列番号 1 6の 5 9位までにおける欠失；あるいはそれらの組合せであることが好ましい。理論に束縛されることは望まないが、このような特定の改変は、本発明の F I Rの正常な機能を変化させ、好ましくは悪化させることによって、癌細胞の異常発生を引き起こす原因または結果であり得る。したがって、このような特定の配列を有するかまたは含むポリぺプチドを検出することによって、癌の診断の使用することができるという有用性を有する。

1つの好ましい実施形態において、本発明の F I Rポリペプチドにおける好ましい改変は、配列番号 2の N末端から約 1 3 5アミノ酸までの範囲内に存在する（これは、 T F I I H結合部位とも呼ばれる。 M o l e c u l a r C e 1 1 V o l . 5 , 3 3 1 - 3 4 1 . 2 0 0 0 ) 。この範囲の改変が癌との関係が深いと考えられるからであるが、それに限定されない。より好ましくは、この改変は、配列番号 2における約 5 0位〜約 1 2 0位の範囲内における改変であり得る。この範囲の改変がより癌との関連が高いと考えられる症例が見出されたからであるが、本発明は、それに限定されないことが理解される。したがって、 F I Rの異常発現または機能異常を引き起こすような改変である限り、本発明の診断に使用され得ることが理解される。

別の好ましい実施形態において、本発明の F I Rポリペプチドにおける改変は、配列番号 2における非保存的置換を含む。このような非保存的置換を含むことによって、 F I Rポリペプチドの機能に異常が生じ得るからである。 F I Rの正常な機能の一つは、 c— m y c発現細胞にアポトーシスを引き起こすことであり、その機能が異常になっていること、あるいは、正常な F I Rの機能を阻害するような分子の存在は、癌の発症と密接に関連すると考えられる。

他の好ましい実施形態において、改変を含む本発明の F I Rポリペプチド (改変体とも言う）は、配列番号 1 2、 1 4、 1 6、 1 8、 2 0および 2 2からなる群より選択される配列を含む。これらの具体的な配列は、正常な組織では発現されておらず、癌組織において特異的に発現していることから、本発明の F I Rの改変体の具体的配列の例示としてあげることができるがそれらに限定されない。

(F I Rのポリペプチド形態に特異的な因子）

1つの局面において、本発明は、 F I Rのポリペプチド形態に対して特異的な因子を含む、癌（例えば、直腸癌または結腸癌（これらを総称して大腸癌とも言う）を含む c一 m y c高発現癌）の、処置、予防、診断または予後のための組成物を提供する。したがって、本発明は、本明細書に記載される任意の F I Rのポリペプチドまたはその改変体もしくはフラグメントに対して特異的な因子を提供する。ここで、診断、予防、処置または予後上有効な量は、当該分野において周知の技法を用いて当業者が種々のパラメータを参酌しながら決定することができ、そのような量を決定するためには、例えば、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、細胞の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる（例えば、がん診療レジデントマニュアル第 2版、編集：国立がんセンター中央病院内科レジデント、医学書院、 2 0 0 0を参照）。本発明では、癌の発症が、 F I Rの異常発現と予想外に関連していること、および正常型 F I Rを投与すると癌が治癒され得ることが明らかになった。このような関連、ならびにそれを利用した診断および治療効果は従来知られておらず、したがって、本発明の因子は、従来技術により提供されるものより優れた効果を示す。

好ましい実施形態において、本発明の因子は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子からなる群より選択される因子であり得る。このような因子は、本発明のポリペプチドに特異的に結合するものであれば、どのようなものでもよいことが理解され得る。より好ましくは、本発明の因子は、抗体またはその誘導体（例えば、単鎖抗体）である。従って、本発明の因子は、プローブおよび Zまたはインヒビターとして使用することができる。

好ましい実施形態において、本発明の因子は、標識されているかまたは標識と結合し得るものであることが有利であり得る。そのように標識がされている場合、本発明の因子によって測定することができる種々の状態を直接および Z または容易に測定することができる。そのような標識は、識別可能に標識される限り、どのような標識でもよく、例えば、蛍光、リン光、化学発光、放射能、酵素基質反応および抗原抗体反応などの技法が挙げられるがそれらに限定されない。あるいは、その因子が抗体などの免疫反応を利用して相互作用する場合、ピオチン—ストレプトアビジンのような免疫反応においてよく利用される系を用いてもよい。

別の例示的な実施形態において、本発明の因子は、（a ) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；（b ) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも 1つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；（c ) 配列番号 1に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；

( d ) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または（e ) ( a ) 〜（d ) のいずれか 1つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも 7 0 %であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、を含む、ポリペプチドに特異的な因子（たとえば、抗体またはその誘導体）であり得る。

あるいは、本発明の因子は、配列番号 2で示されるポリペプチドに対して特異的な因子であることが好ましい。このような配列は、正常な組織において存在する形態の F I Rを同定することができることから、ある組織または個体の癌化の程度を調べるために有用である。

好ましくは、配列番号 2で示される配列を含むポリベプチドに対して特異的な因子は、（a ) 配列番号 2において、置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも 1つの改変を含むアミノ酸配列；（b ) 配列番号 1 2、 1 4および 1 6からなる群より選択される少なくとも 1つの配列、または該少なくとも 1つの配列において置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも 1つの改変を含む配列を含むポリべプチドに対して特異的に反応しないことが有利である。このように弁別可能に反応することによって、 F I R の改変体と正常な F I Rとを弁別して検出することができるからである。そのような検出によって、癌（特に、（直腸癌または結腸癌 (これらを総称して大腸癌とも言う）を含む c一 my c高発現癌）の従来不可能であった正確な診断を行うことができるという優れた効果および有用性を達成する。

別の好ましい実施形態において、本発明の因子は、（a ) 配列番号 2において、置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも 1つの改変を含むアミノ酸配列；（b ) 配列番号 1 2、 1 4および 1 6からなる群より選択される少なくとも 1つの配列、または該少なくとも 1つの配列において置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも 1つの改変を含む配列を含むポリぺプチドに特異的に反応することが好ましい。このような改変体に対して特異的な因子を使用することによって、癌に罹患した個体または組織部分を検出することが容易となるという有用性が提供される。この因子は、好ましくは、配列番号 2で示される配列を含むポリぺプチドに対しては特異的に反応しないことが有利である。このように弁別可能に反応することによって、 F I Rの改変体と正常な F I Rとを弁別して検出することができるからである。そのような検出によって、癌（特に、（直腸癌または結腸癌（これらを総称して大腸癌とも言う）を含む c一 my c高発現癌）の従来不可能であった正確な診断を行うことができるという優れた効果および有用性を達成する。

( F I Rのポリペプチド形態を用いた診断キットおよび方法）

別の局面において、本発明は、 A) ( a ) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；（b ) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも 1つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；（ c ) 配列番号 1に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；（d ) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または（e ) ( a ) 〜 ( d ) のいずれか 1つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも 7 0 %であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、を含む、ポリペプチド（Aポリペプチド）に対して特異的な A因子；および B) 該 A 因子に起因するシグナルを用いて該ポリペプチドの発現量を測定するための手段であって、癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分における該ポリペプチドの発現量に比較して対象の被験体の対象部分における該ポリペプチドの発現が高い場合、該対象の被験体は癌のハイリスク者であると診断する、手段、を備える、癌診断キットを提供する。ここで、診断対象となる癌は、 c一 m y c高発現癌であることが好ましいが、それに限定されない。理論に束縛されることは望まないが、本発明の F I Rは、 c -m y cとの関連が高いことが指摘されているからである。このような c一 m y c高発現癌としては、例えば、直腸癌および結腸癌が挙げられるがそれらに限定されない。このような F I Rに特異的な因子としては、本明細書において記載されるような任意の因子を使用することができる。 A因子は、 F I Rの正常型および改変体のいずれとも特異的に反応してもよく、あるいは、 F I Rの正常型または改変体のいずれか一方と特異的に反応してもよい。その反応特異性さえ理解して提供される限り、どのような特異性を有する因子であっても本発明において利用することができ、したがって、そのような因子おょぴそれを含むキットは、本発明の範囲内にあることが理解される。 1つの実施形態では、正常型と改変体との共通の配列（例えば、配列番号 2、 1 2、 1 4、 1 6、 1 8、 2 0、 2 2などの C末端側の配列であって、例えば、 3 0アミノ酸長の配列など）に対して特異的な因子が挙げられるがそれらに限定されない。あるいは、 A因子として、 Aポリペプチド自体を用いることができる。 Aポリペプチドを用いた場合、 A ポリぺプチドに特異的な抗体を認識することができることから、生体内の Aポリペプチドに特異的な抗体量を算出し、それにより、 Aポリペプチドの体内における存在を同定することが可能であるからである。

ここで、ポリペプチドの発現量の測定は、 A因子に起因する任意のシグナルを用いて行うことができる。

別の特定の実施形態において、本発明は、 A) 配列番号 2で示される配列を含むポリペプチド（Bポリペプチド）に対して特異的な B因子；および B ) 該 B因子に起因するシグナルを用いて該ポリぺプチドの発現量を測定するための手段であって、癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分における該ポリペプチドの発現量と、対象の被験体の対象部分における該ポリペプチドの発現量とが異なる場合、該対象の被験体は癌のハイリスク者であると診断する、手段、を備える、癌診断キットを提供する。ここで、診断対象となる癌は、 c一 my c高発現癌であることが好ましいが、それに限定されない。理論に束縛されることは望まないが、本発明の F I Rは、 c一 my cとの関連が高いことが指摘されているからである。このような c—m y c高発現癌としては、例えば、直腸癌および結腸癌が挙げられるがそれらに限定されない。このような F I Rに特異的な因子としては、本明細書において記載されるような任意の因子を使用することができる。 B因子は、正常型 F I Rと特異的に反応する限り、どのようなものを使用してもよい。好ましくは、 B因子は、改変体とは特異的に反応しないことが有利であり得る。このような性質さえ有する限り、任意の B因子がその反応特異性さえ理解して提供され、どのような特異性を有する因子であっても本発明において利用することができ、したがって、そのような因子およびそれを含むキットは、本発明の範囲内にあることが理解される。 1つの実施形態では、正常型と改変体との改変配列（例えば、配列番号 2の N末端側の配列であって、例えば、約 1 3 5アミノ酸長における任意の配列など）に対して特異的な因子が挙げられるがそれらに限定されない。あるいは、 B因子として、 Bポリペプチド自体を用いることができる。 Bポリべプチドを用いた場合、 Bポリぺプチドに特異的な抗体を認識することができることから、生体内の Bポリペプチドに特異的な抗体量を算出し、それにより、 Bポリペプチドの体内における存在を同定することが可能であるからである。

ここで、ポリペプチドの発現量の測定は、 B因子に起因する任意のシグナルを用いて行うことができる。

別の特定の実施形態において、本発明は、 A) 配列番号 2で示される配列を含むポリペプチド（Cポリペプチド）に対して特異的な C因子；および B) 該 C因子に起因するシグナルを用いて該ポリペプチドの発現量を測定するための手段であって、対象の被験体の対象部分において該ポリペプチドが検出される場合、該対象の被験体は癌患者であると確定する、手段、を備える、癌診断キッ卜を提供する。この方法において、対象の被験体の対象部分における上記ポリぺプチドの検出は、上記癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分における該ポリペプチドの発現量に比較して対象の被験体の対象部分における該ポリぺプチドの発現が高いことを検出することであることが好ましいがそれに限定されない。ここで、診断対象となる癌は、 c一 m y c高発現癌であることが好ましいが、それに限定されない。理論に束縛されることは望まないが、本発明の F I Rは、 c -my cとの関連が高いことが指摘されているからである。このような c—my c高発現癌としては、例えば、直腸癌および結腸癌が挙げられるがそれらに限定されない。このような F I Rに特異的な因子としては、本明細書において記載されるような任意の因子を使用することができる。 C因子は、 F I Rの改変体と特異的に反応する限り、どのようなものを使用してもよい。好ましくは、 C因子は、 F I R正常型とは特異的に反応しないことが有利であり得る。このような性質さえ有する限り、任意の C因子がその反応特異性さえ理解して提供され、どのような特異性を有する因子であつても本発明において利用することができ、したがって、そのような因子およびそれを含むキットは、本発明の範囲内にあることが理解される。 1つの実施形' 態では、正常型と改変体との改変配列（例えば、 N末端側の配列であって、例えば、約 1 3 5アミノ酸長における任意の配列など）に対して特異的な因子が挙げられるがそれらに限定されない。あるいは、 C因子として、 Cポリべプチド自体を用いることができる。 Cポリペプチドを用いた場合、 Cポリペプチドに特異的な抗体を認識することができることから、生体内の Cポリぺプチドに特異的な抗体量を算出し、それにより、 Cポリペプチドの体内における存在を同定することが可能であるからである。ここで、ポリペプチドの発現量の測定は、 C因子に起因する任意のシグナルを用いて行うことができる。

別の特定の実施形態において、本発明は、配列番号 2で示される配列を含むポリペプチド（Bポリペプチド）に対して特異的な B因子； B ) ( a ) 配列番号 2において、置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも 1 つの改変を含むアミノ酸配列；（b ) 配列番号 1 2、 1 4および 1 6からなる群より選択される少なくとも 1つの配列もしくはその相補体、または該少なくとも 1つの配列において置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも 1つの改変を含む配列を含むポリペプチド（Cポリペプチド）に対して特異的な C因子；ならびに C) 該 B因子および該 C因子に起因するシグナルを識別可能に検知して、 Bポリペプチドと Cポリぺプチドのそれぞれの発現量を測定するための手段であって、癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分における Bポリべプチドの発現に比較して対象の被験体の対象部分における Bポリペプチドの発現が高く、かつ、癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分における Cポリペプチドの発現に比較して対象の被験体の対象部分における Cポリぺプチドの発現が高い場合、該対象の被験

ノ体は癌患者であると確定する、手段、を備える、癌（例えば、直腸癌または結腸癌（これらを総称して大腸癌とも言う）の診断キットを提供する。

ここで、好ましくは、 C) 手段は、 Bポリペプチドと Cポリペプチドとの相対存在比を比較する手段を包含する。好ましい実施形態では、 B因子は Cポリペプチドに特異的に反応しないか、, または、 C因子は Bポリペプチドに特異的に反応しないことが有利である。識別可能に両方のポリペプチドを検出することができるからである。より好ましい実施形態では、 B因子は Cポリペプチドに特異的に反応しせず、かつ、 C因子は Bポリペプチドに特異的に反応しないことの両方であることが有利である。これらの因子によって検出されるシグナル強度が、対象とするポリペプチドの量により正確に反映されるからである。これらの B因子と、 C因子とは、識別可能に標識されているかまたは標識され得ることが好ましい。ここで、識別可能に標識されている因子は、その因子が、すでに、識別可能な標識を有していることを意味し、 2つ以上の因子が識別可能に標識され得るとは、別の処理をその因子に行うことによって、その 2っ以上の因子を識別することができるようになることをいう。このような場合、本発明のキットは、 B因子と、 C因子とを、識別可能に標識する因子をさらに含む。このような識別可能な標識の識別は、物理的様式（例えば、蛍光、発光など）、化学的様式（例えば、特定の化学的切断、染色など）、生化学的様式 (例えば、酵素反応）、生物学的様式（例えば、微生物の生存の判定）などによって行うことができる。

別の特定の実施形態において、本発明は、 A) ( a ) 配列番号 2に記載のァミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；（b ) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも 1つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；（C ) 配列番号 1に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；（d ) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または ( e ) ( a ) 〜（d ) のいずれか 1つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも 7 0 %であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリべプチド、を含む、ポリペプチド（Aポリペプチド）に対して特異的な A因子； B ) ( a ) 配列番号 2において、置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも 1つの改変を含むアミノ酸配列；（b ) 配列番号 1 2、 1 4および 1 6からなる群より選択される少なくとも 1つの配列、または該少なくとも 1つの配列において置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも 1つの改変を含む配列を含むポリペプチド（Cポリペプチド）に対して特異的な C因子； C ) 該 A因子および該 C因子に起因するシグナルを識別可能に検知して、 Aポリぺプチドと Bポリぺプチドのそれぞれの発現量を測定するための手段であって、癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分における Aポリぺプチドの発現量における Cポリペプチドの発現量の割合が、対象の被験体の対象部分における Aポリぺプチドの発現量における Cポリペプチドの発現量の割合よりも高い場合、該対象の被験体は癌患者であると確定する、手段、を備える、癌診断キットを提供する。ここで、診断対象となる癌は、 c一 my c高発現癌であることが好ましいが、それに限定されない。理論に束縛されることは望まないが、本発明の F I Rは、 c -m y cとの関連が高いことが指摘されているからである。このような c一 my c高発現癌としては、例えば、直腸癌および結腸癌が挙げられるがそれらに限定されない。ここで、 A因子は、 Aポリペプチドに特異的であり、 C因子は、 Cポリペプチドに特異的である。 Aポリペプチドは、 F I Rの正常型およびその改変体の両方を包含し得ることから、 F I R関連分子の総量を検出することができる。従って、好ましくは、 A因子は、 F I Rの正常型および改変体の両方に特異的に反応し得ることが有利である。 Cポリペプチドは F I Rの改変体であり、. 癌の組織に特異的に存在することから、癌の指標として使用することができる。これらの Aポリペプチドおよび Cポリペプチドの両方を測定することによって、相対的な測定を行うことができる。従って、上記 C) 手段は、 Cポリペプチドとの相対存在比または絶対存在量を比較する手段を包含することが好ましい。相対存在比は、因子に起因するシグナル（例えば、蛍光強度）を直接対比することによって算出することができる。従って、絶対量を算出する必要がないことから、そのような状況において好ましい。絶対存在量を算出する場合、既知量の標準試料をもとに、各因子を用いて検量線を作成し、それによつて絶対量を算出することができる。そのような方法は、当該分野において周知である。

好ましい実施形態において、 A因子は Cポリペプチドに特異的に反応しないか、 A因子は Bポリペプチドにも Cポリペプチドにも特異的に反応することが有利であり得る。 Cポリペプチドに特異的に反応しない楊合、この A因子と C 因子とを使用して、特定の F I R改変体とそうでない F I R分子との存在比を検出することができる。あるいは、 A因子が Cポリペプチドおよび Bポリぺプチドの両方に特異的に反応する場合、 F I Rの発現量の総量と改変体の発現量とを比較することができる。好ましくは、 A因子と、 C因子とは、識別可能に標識されているかまたは標識され得る。このような場合、本発明のキットは、 A因子と、 C因子とを、識別可能に標識する因子をさらに含む。このような識別可能な標識の識別は、物理的様式（例えば、蛍光、発光など）、化学的様式 (例えば、特定の化学的切断、染色など）、生化学的様式（例えば、酵素反応）、生物学的様式（例えば、微生物の生存の判定）などによって行うことができる。

別の局面において、本発明は、 A) 対象の被験体の対象部分からの試料を提供する工程； B ) 該試料中において、（a ) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；（b ) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも 1つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；（c ) 配列番号 1に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；（d ) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または（e ) ( a ) 〜 ( d ) のいずれか 1つのポリぺプチドに対する同一性が少なくとも 7 0 %であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、を含む、ポリペプチド（Aポリペプチド）の存在量を測定する工程； C ) 該ポリべプチの存在量と、癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分からの試料における同一核酸分子の存在量とを比較し、該対象の被験体の対象部分からの試料における該ポリペプチドの量が増加している場合、該対象の被験体は癌のハイリスク者であると診断する、工程、を包含する、癌診断方法を提供する。この癌診断方法で使用される試料としては、便、尿、汗、生検組織、唾液、血液（例えば、全血、血清、血漿など）、血液細胞（単核球等）、他の体液、罹患した部分の細胞などを対象とすることができる。比較の対象のために、罹患していないことが明らかな部位、または罹患していない他の被験体からの試料を利用することができる。罹患していない他の被験体からの試料を使用する場合、好ましくは、そのような試料は、対象となる被験体の対象部位と同様の部位に由来する試料を利用することができる。ここで、診断対象となる癌は、 c一 my c高発現癌であることが好ましいが、それに限定されない。理論に束縛されることは望まないが、本発明の F I Rは、 c一 my cとの関連が高いことが指摘されているからである。このような c—my c高発現癌としては、例えば、直腸癌および結腸癌が挙げられるがそれらに限定されない。上記ポリペプチドの検出は、そのようなポリペプチド（Aポリペプチド）に対して特異的な因子（例えば、 A因子）を用いて行うことができる。そのような因子としては、本明細書に記載される F I Rのポリペプチド形態に対して特異的な任意の因子を用いることができる。 A因子は、 F I Rと特異的に反応する限り、どのようなものを使用してもよい。好ましくは、 A因子は、正常型 F I Rおよびその改変体の両方に特異的に反応することが有利であり得る。あるいは、 A 因子は、改変体のみに対して特異的であっても、正常型のみに対して特異的であってもよい。このような性質さえ有する限り、任意の A因子がその反応特異性さえ理解して提供され、どのような特異性を有する因子であっても本発明において利用することができ、したがって、そのような因子およびそれを含むキットは、本発明の範囲内にあることが理解される。 1つの実施形態では、正常型と改変体との改変配列（例えば、配列番号 2の N末端側の配列であって、例えば、約 1 3 5アミノ酸長における任意の配列など）に対して特異的な因子が挙げられるがそれらに限定されない。別の特定の実施形態において、本発明は、 A) 対象の被験体の対象部分からの試料を提供する工程； B ) 該試料中において、配列番号 2で示される配列を含むポリペプチド（Bポリペプチド）の存在量を測定する工程； C) 該ポリべプチドの存在量と、癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分からの試料における同一核酸分子の存在量とを比較し、両者が異なる場合、該対象の被験体は癌のハイリスク者であると診断する、工程、を包含する、癌診断方法を提供する。配列番号 2で示される配列を含むポリペプチドは、正常組織において通常に発現しており、 c一 my cを高発現する細胞にアポト一シスを起こすことが知られており、その変異（例えば、置換、決失、付加など）によって、正常な機能が損なわれ得る。したがって、このような変異は、アポトーシス異常（例えば、癌など）の原因および指標であり得る。あるいは、その正常型の発現量の異常もまた、アポトーシス異常（例えば、癌など）の原因および指標であり得る。したがって、このような異常型の検出および正常型の発現量の異常の検出は、アポ卜一シス異常の診断指標として有用である。上記ポリペプチドの検出は、そのようなポリペプチドに対して特異的な因子を用いて行うことができる。そのような因子としては、本明細書に記載される F I R のポリペプチド形態（Bポリペプチド）に対して特異的な任意の因子（例えば、 B因子）を用いることができる。 B因子は、本明細書における上記「F I Rのポリべプチド形態に特異的な因子」節において説明されるような任意の形態をとることができる。 B因子は、正常型の F I Rと特異的に反応し、その改変体とは特異的に反応してもそうでなくてもよい。好ましくは、第二.の因子は、改変体とは反応しないことが好ましい。ただし、その反応特異性さえ理解して提供される限り、どのような特異性を有する因子であっても本発明において利用することができ、したがって、そのような因子およびそれを含むキットは、本発明の範囲内にあることが理解される。 1つの実施形態では、正常型に特異的な部分（例えば、配列番号 1の 5 ' 末端側の配列であって、例えば、 1 0 0ヌクレオチド長の配列など）に対して特異的な因子が挙げられるがそれらに限定されない。

別の特定の実施形態において、本発明は、 A) 対象の被験体の対象部分からの試料を提供する工程； B) 該試料中において、（a ) 配列番号 2において、置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも 1つの改変を含むアミノ酸配列；（b ) 配列番号 1 2、 1 4および 1 6からなる群より選択される少なくとも 1つの配列、または該少なくとも 1つの配列において置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも 1つの改変を含む配列を含むポリペプチド（Cポリペプチド）を検出する工程； C) 該ポリペプチドが検出される場合、該対象の被験体は癌患者であると確定する、工程、を包含する、癌診断方法を提供する。この癌診断方法で使用される試料としては、便、尿、汗、生検組織、唾液、血液（例えば、全血、血清、血漿など）、血液細胞（単核球等）、他の体液、罹患した部分の細胞などを対象とすることができる。比較の対象のために、罹患していないことが明らかな部位、または罹患していない他の被験体からの試料を利用することができる。罹患していない他の被験体からの試料を使用する場合、好ましくは、そのような試料は、対象となる被験体の対象部位と同様の部位に由来する試料を利用することができる。ここで、診断対象となる癌は、 c一 my c高発現癌であることが好ましいが、それに限定されない。理論に束縛されることは望まないが、本発明の F I Rは、 c一 m y cとの関連が高いことが指摘されているからである。このような c一 m y c 高発現癌としては、例えば、直腸癌および結腸癌が挙げられるがそれらに限定されない。上記ポリペプチドの検出は、そのようなポリペプチドに対して特異的な因子を用いて行うことができる。そのような因子としては、本明細書に記載される F I Rのポリペプチド形態（Cポリペプチド）に対して特異的な任意の因子（例えば、 C因子）を用いることができる。ここで、好ましくは、 C) 工程では、上記ポリペプチドの存在量と、癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分からの試料における同一核酸分子の存在量とを比較し、該対象の被験体の対象部分からの試料におけるそのポリべプチドの量が増加している場合、該対象の被験体は癌患者であると確定することであるとすることができる。

別の特定の実施形態において、本発明は、 A) 対象の被験体の対象部分からの試料を提供する工程； B ) 該試料中において、 Bポリペプチドおよび Cポリペプチドの存在量を測定する工程； C ) Bポリペプチドの存在量と、癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分からの試料における同一ポリペプチドの存在量とを比較し、該対象の被験体の対象部分からの試料における Bポリペプチドの発現量が増加しており、かつ、 Cポリペプチドの存在量と、癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分からの試料における同一ポリペプチドの存在量とを比較し、該対象の被験体の対象部分からの試料における Cポリぺプチドの発現量が増加している場合、該対象の被験体は癌患者であると確定する、工程、癌（例えば、直腸癌または結腸癌（これらを総称して大腸癌とも言う）の診断方法を提供する。ここで、診断対象となる癌は、 c一 m y c高発現癌であることが好ましいが、それに限定されない。理論に束縛されることは望まないが、本発明の F I Rは、 c一 m y cとの関連が高いことが指摘されているからである。このような c一 m y c高発現癌としては、例えば、直腸癌および結腸癌が挙げられるがそれらに限定されない。上記ポリべプチドの検出は、そのようなポリペプチドに対して特異的な因子を用いて行うことができる。そのような因子としては、本明細書に記載される F I Rのポリペプチド形態に対して特異的な任意の因子を用いることができる。

別の局面において、本発明は、 A) 対象の被験体の対象部分からの試料を提供する工程； B ) 該試料中において、（a ) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリべプチド；（ b ) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも 1つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；（c ) 配列番号 1に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；（d ) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または（e ) ( a ) 〜 ( d ) のいずれか 1つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも 7 0 %であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、を含む、ポリペプチド（Aポリペプチド）および（a ) 配列番号 2において、置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも 1つの改変を含むアミノ酸配列；（b ) 配列番号 1 2、 1 4および 1 6からなる群より選択される少なくとも 1つの配列、または該少なくとも 1つの配列において置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも 1つの改変を含む配列を含むポリぺプチド（Cポリペプチド）の存在量を測定する工程； C ) Aポリペプチドと Cポリぺプチドのそれぞれの発現量を測定する工程であって、癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分における Aポリぺプチドの発現量における Cポリペプチドの発現量の割合が、対象の被験体の対象部分における Aポリペプチドの発現量における Cポリペプチドの発現量の割合よりも高い場合、該対象の被験体は癌患者であると確定する、工程、を包含する、癌診断方法を提供する。ここで、診断対象となる癌は、 c一 m y c高発現癌であることが好ましいが、それに限定されない。理論に束縛されることは望まないが、本発明の F I Rは、 c一 m y cとの関連が高いことが指摘されているからである。このような c一 m y c高発現癌としては、例えば、直腸癌および結腸癌が挙げられるがそれらに限定されない。上記ポリペプチドの検出は、そのようなポリべプチドに対して特異的な因子を用いて行うことができる。そのような因子としては、本明細書に記載される F I Rのポリペプチド形態に対して特異的な任意の因子を用いることができる。別の特定の実施形態において、本発明は、（a ) 配列番号 2に記載のァミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；（b ) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも 1つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；（c ) 配列番号 1に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；（d ) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または（e ) ( a ) 〜（d ) のいずれか 1つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも 7 0 %であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、を含む、ポリペプチドの、癌の診断剤の製造のための使用を提供する。ここで、診断対象となる癌は、 c一 m y c高発現癌であることが好ましいが、それに限定されない。理論に束縛されることは望まないが、本発明の F I Rは、 c一 m y cとの関連が高いことが指摘されているからである。このような c一 my c 高発現癌としては、例えば、直腸癌および結腸癌が挙げられるがそれらに限定されない。上記ポリペプチドの検出は、そのようなポリペプチドに対して特異的な因子を用いて行うことができる。そのような因子としては、本明細書に記載される F I Rのポリペプチド形態に対して特異的な任意の因子を用いることができる。

本発明の癌診断方法では、被験体の血清中に、本発明の抗原ペプチドと結合する抗体が存在するか否かを試験し、血清中にその抗体が存在する被験体を癌患者または癌ハイリスク者と判定することもできる。すなわち、本発明の抗原ペプチドは、患者の血清中の抗体（IgG) と結合するペプチドであるから、被験体の血清と反応させ、これらの抗原べプチドと結合する抗体を含む血清を、癌患者またはそのハイリスク患者の血清として判定することができる。なおその際に、 2種類の抗原ペプチドについて血清中抗体との結合を判定することが好ましい。具体的な診断は、例えば抗原ペプチドに被験体血清を接触させ、抗原べプチドと被験体血清中の IgG抗体とを液相中において反応させる。さらに血清中の IgG抗体と特異的に結合する標識 IgG抗体を反応させて、標識 IgG抗体のシグナルを検出すればよい。標識 IgG抗体の標識物質は、上記の標識抗体において例示したような酵素、放射性同位体または蛍光色素を使用することができる。酵素を用いる場合には、酵素作用によって分解して発色する基質を加え、基質の分解量を光学的に測定することによって酵素活性を求め、これを結合抗体量に換算し、標準値との比較から抗体量が算出される。放射生同位体を用いる場合には、放射性同位体の発する放射線量をシンチレ一シヨンカウンタ一等により測定する。また、蛍光色素を用いる場合には、蛍光顕微鏡を組み合わせた測定装置によって蛍光量を測定すればよい。

シグナルの検出は、実施例に示したようなウエスタンブロット分析を採用することができる。あるいは、抗原ペプチド +血清中抗体 +標識 IgG抗体の結合体を、公知の分離手段（クロマト法、塩析法、アルコール沈殿法、酵素法、固相法等）によって分離し、標識 IgG抗体のシグナルを検出するようにしてもよい。

このような診断方法の簡便かつ広範囲な実施を可能とするものとして、本発明の診断キッ卜が提供される。

本発明の診断方法はまた、抗原べプチドの 1種類以上をプレー卜上に固定化し、この基板上において被験体血清の抗体との結合を試験する方法（これもまた本発明の包含される）として実施することもできる。抗原ペプチドを基板上に固定化することによって、未結合の標識結合分子を容易に除去することができる。また、このような診断方法の簡便かつ広範囲な実施を可能とするものとして、本発明の診断キットの 1つの実施形態が提供される。

あるいは、本発明の診断方法は、被験体の生体試料中に、本発明の抗体、もしくは本発明の標識抗体と結合する抗原べプチドが存在するか否かを試験し、試料中にその抗原べプチドが存在する被験体を癌患者またはそのハイリスク者と判定する。すなわち、ここで使用する抗体または標識抗体は、大腸癌細胞で発現している抗原ペプチドと特異的に結合する抗体であるから、この抗体と結合する抗原ペプチドを含む生体試料を、大腸癌患者または大腸癌ハイリスク患者の試料として判定することができる。なおその際に、好ましくは 2種の抗体について試料中の抗原ペプチドとの結合を判定することが好ましい。また、生体試料としては、血液、血液細胞（単核球等）を対象とすることができる。本発明の診断方法における一つの態様は、抗体と抗原ペプチドとの結合を液相系において行う方法である。例えば、本発明の標識抗体と生体試料とを接触させて標識抗体と抗原ペプチドを結合させ、この結合体を本明細書において記載されるような方法で分離し、標識シグナルを同様の方法で検出する。このような診断方法の簡便かつ広範囲な実施を可能とするものとして、本発明の診断キッ卜が提供される。

液相系での診断の別の方法は、本発明の抗体（一次抗体）と生体試料とを接触させて一次抗体と抗原ペプチドを結合させ、この結合体に本発明の標識抗体 (二次抗体）を結合させ、この三者の結合体における標識シグナルを検出する。あるいは、さらにシグナルを増強させるためには、非標識の二次抗体を先ず抗体 +抗原ペプチド結合体に結合させ、この二次抗体に標識物質を結合させるようにしてもよい。このような二次抗体への標識物質の結合は、例えば二次抗体をピオチン化し、標識物質をアビジン化しておくことによって行うことができる。あるいは、二次抗体の一部領域（例えば、 Fc領域）を認識する抗体（三次抗体）を標識し、この三次抗体を二次抗体に結合させるようにしてもよい。なお、一次抗体と二次抗体は、両方ともモノクローナル抗体を用いることもでき、あるいは、一次抗体と二次抗体のいずれか一方をポリクローナル抗体とすることもできる。液相からの結合体の分離やシグナルの検出は、本明細書において記載されるように行うことができる。また、このような診断方法の簡便かつ広範囲な実施を可能とするものとして、本発明の診断キットの一つの実施形態が提供される。

本発明の診断方法における別の態様は、抗体と抗原ペプチドとの結合を固相系において試験する方法である。この固相系における方法は、極微量の抗原べプチド検出と操作の簡便化のため好ましい方法である。すなわちこの固相系の方法は、本発明の抗体（一次抗体）を樹脂プレート等に固定化し、この固定化抗体に抗原ペプチドを結合させ、非結合ペプチドを洗浄除去した後、プレート上に残った抗体 +抗原ペプチド結合体に標識抗体（二次抗体）を結合させ、この二次抗体のシグナルを検出する方法である。この方法は、いわゆる「サンドイッチ法」と呼ばれる方法であり、マーカーとして酵素を用いる場合には、 I ELISA (enzyme l inked immunosorbent assay) 」として広く用レられてレる方法である。一次抗体と二次抗体は、両方ともモノクローナル抗体を用いることもでき、あるいは、一次抗体と二次抗体のいずれか一方をポリクローナル抗体とすることもできる。シグナルの検出は、本明細書に記載されるように行うことができる。また、このような診断方法の簡便かつ広範囲な実施を可能とするものとして、本発明の診断キッ卜の一つの実施形態が提供される。

本発明の診断キットは、本発明の診断方法を行うための試薬キットであり得る。このようなキットは、被検成分の種類に応じて各種のものが市販されており、この発明の診断キットも、この発明によって提供される抗原ペプチド、抗体および Zまたは標識抗体を用いることを除き、当該分野において公知のキッ卜に用いられている各要素によって構成することができる。

あるいは、本発明のキットまたは診断法は、アレイを用いて実行することができる。アレイを用いた診断の実行方法は、上述したとおりである。 (F I Rのポリペプチド形態を用いた治療方法および治療剤）別の局面において、本発明は、 A) (a) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；（b) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも 1つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；（c) 配列番号 1に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；（d) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または（e) (a) 〜 (d) のいずれか 1つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも 70 %であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、を含む、ポリペプチド（Aポリペプチド）を含む、癌治療剤を提供する。ここで、治療対象となる癌は、 c一 my c高発現癌であることが好ましいが、それに限定されない。理論に束縛されることは望まないが、本発明の F I Rは、 c一 my c との関連が高いことが指摘されているからである。このような c一 my c高発現癌としては、例えば、直腸癌および結腸癌が挙げられるがそれらに |5艮定されない。このような F I Rに特異的な因子としては、本明細書において記載されるような任意の因子を使用することができる。 Aポリペプチドは、 F I Rの正常型な機能を少なくとも 1つ有し、好ましくは、 FBPに結合する能力およびノまたは c一 my c抑制活性を有する。 1つの実施形態では、例えば、配列番号 2、 12、 14、 16、 18、 20、 22に示される配列またはその改変体であって、配列番号 2と同等の機能を有する分子を利用することができる。より好ましくは、本発明の治療剤に含まれるポリペプチドは、配列番号 2で示される配列を含むポリペプチド（Bポリペプチド）を含む。

別の局面において、本発明は、上記癌治療剤を用いた癌治療法を提供する。この治療法は、本明細書において説明される任意の治療技術を用いることができる。 (CENP— Aの核酸形態）

1つの局面において、 .本発明は、 CENP— Aをコードする核酸分子を含む、癌（例えば、直腸癌または結腸癌（これらを総称して大腸癌とも言う）を含む c一 my c高発現癌）の、処置、予防、診断または予後のための組成物を提供する。ここで、診断、予防、処置または予後上有効な量は、当該分野において周知の技法を用いて当業者が種々のパラメータを参酌しながら決定することができ、そのような量を決定するためには、例えば、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、細胞の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる（例えば、がん診療レジデントマニュアル第 2版、編集：国立がんセンター中央病院内科レジデント、医学書院、 2000を参照）。本発明では、癌の発症が、 CENP—Aの異常発現と予想外に関連していることが明らかになった。このような関連、ならびにそれを利用した診断および治療効果は従来知られておらず、したがって、本発明の CENP— Aの核酸形態およびそれに関連する発明は、従来技術より優れた効果を示す。

従って、 1つの実施形態において、本発明は、 a) 配列番号 3に記載の塩基配列もしくはその相補体またはそのフラグメント配列を有する、ポリヌクレオチド；（b) 配列番号 4に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド；（c) 配列番号 4に記載のアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも 1つの変異を有する改変体ポリペプチドであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；（d) (a) 〜（c) のいずれか 1つのポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または（e) (a) 〜（c) のいずれか 1つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも 70%である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリぺプチドをコードするポリヌクレオチド、を含む、核酸分子を提供する。

1つの好ましい実施形態において、上記（c ) における置換、付加および欠失の数は、限定され、例えば、 5 0以下、 4 0以下、 3 0以下、 2 0以下、 1 5以下、 1 0以下、 9以下、 8以下、 7以下、 6以下、 5以下、 4以下、 3以下、 2以下であることが好ましい。より少ない数の置換、付加および欠失が好ましいが、生物学的活性を保持する（好ましくは、 C E N P— Aと類似するかまたは実質的に同一の活性を有する、あるいはその異常型の活性（例えば、非セントロメァクロマチンへの結合））限り、多い数であってもよい。

別の好ましい実施形態において、上記ポリペプチドが有する生物学的活性としては、例えば、配列番号 4に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントに対して特異的な抗体との相互作用、セントロメァクロマチンとの相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。これらは例えば、免疫学的ァッセィ、標識ァッセィなどによつて測定することができる。

別の好ましい実施形態において、（d ) に記載の対立遺伝子変異体は、配列番号 1に示す核酸配列と少なくとも 9 9 %の相同性を有することが有利である。上記種相同体は、その種の遺伝子配列データベースが存在する場合、そのデ一夕べ一スに対して、本発明の C E N P— Aをクエリ配列として検索することによって同定することができる。あるいは、本発明の C E N P— Aの全部または一部をプローブまたはプライマ一として、その種の遺伝子ライブラリーをスクリーニングすることによって同定することができる。そのような同定方法は、当該分野において周知であり、本明細書において記載される文献にも記載されている。種相同体は、例えば、配列番号 3に示す核酸配列と少なくとも約 3 0 %の相同性を有することが好ましい。好ましくは、種相同体は、上記基準配列と、少なくとも約 4 0 %、少なくとも約 5 0 %、少なくとも約 6 0 %、少なくとも約 70%、少なくとも約 80%、少なくとも約 90%、少なくとも約 9 5%、少なくとも約 98%、相同であり得る。

好ましい実施形態において、上記（a) 〜（e) のいずれか 1つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性は、少なくとも約 80%であり得、より好ましくは少なくとも約 90 %であり得、さらに好ましくは少なくとも約 98%であり得、もっとも好ましくは少なくとも約 99%であり得る。最も好ましくは、本発明の CENP— Aは、配列番号 3に記載される配列と 100% 同一の配列を有する。

好ましい実施形態において、本発明の CENP— Aをコードする核酸分子またはそのフラグメントおよび改変体は、少なくとも 8の連続するヌクレオチド長であり得る。本発明の核酸分子は、本発明の使用目的によってその適切なヌクレオチド長が変動し得る。より好ましくは、本発明の核酸分子は、少なくとも 10の連続するヌクレオチド長であり得、さらに好ましくは少なくとも 15 の連続するヌクレオチド長であり得、なお好ましくは少なくとも 20の連続するヌクレオチド長であり得る。これらのヌクレオチド長の下限は、具体的に挙げた数字のほかに、それらの間の数（例えば、 9、 1 1、 12、 13、 14、 16など）あるいは、それ以上の数（例えば、 21、 22、 . . . 30、など）であってもよい。本発明の核酸分子は、目的とする用途（例えば、アンチセンス、 RNA i、マーカ一、プライマー、プロ一ブ、所定の因子と相互作用し得ること）として使用することができる限り、その上限の長さは、配列番号 1に示す配列の全長であってもよく、それを超える長さであってもよい。あるいは、プライマーとして使用する場合は、通常少なくとも約 8のヌクレオチド長であり得、好ましくは約 10ヌクレオチド長であり得る。プローブとして使用する場合は、通常少なくとも約 15ヌクレオチド長であり得、好ましくは約 17ヌクレオチド長であり得る。 1つの実施形態において、 C E N P— Aをコードする核酸分子は、配列番号 3の核酸配列の全範囲を含む。より好ましくは、 C E N P— Aをコ一ドする核酸分子は、配列番号 3の核酸配列の全範囲からなる。 (C E N P— Aに対して特異的な因子）

1つの局面において、本発明は、 C E N P— Aをコードする核酸分子に対して特異的に相互作用する因子を含む、癌（例えば、直腸癌または結腸癌（これらを総称して大腸癌とも言う））の、処置、予防、診断または予後のための組成物を提供する。したがって、本発明は、本明細書に記載される任意の C E N P— Aをコードする核酸分子またはその改変体もしくはフラグメントに対して特異的な因子を提供する。ここで、診断、予防、処置または予後上有効な量は、当該分野において周知の技法を用いて当業者が種々のパラメータを参酌しながら決定することができ、そのような量を決定するためには、例えば、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、細胞の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる（例えば、がん診療レジデントマニュアル第 2版、編集：国立がんセンター中央病院内科レジデント、医学書院、 2 0 0 0を参照）。本発明では、癌の発症が、 C E N P— Aの異常発現と予想外に関連していることが明らかになった。このような関連、ならびにそれを利用した診断および治療効果は従来知られておらず、したがって、本発明の因子は、従来技術により提供されるものより優れた効果を示す。

好ましい実施形態において、本発明の因子は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子からなる群より選択される因子であり得る。このような因子は、本発明の核酸分子に特異的に結合するものであれば、どのようなものでもよいことが理解され得る。好ましい実施形態では、本発明の因子は、核酸分子である。本発明の因子が核酸分子である場合、そのような核酸分子は、少なくとも 8の連続するヌクレォチド長であり得、好ましくは CENP— Aの核酸配列（例えば、配列番号 3) に対して特異的に結合し得る。本発明の核酸分子は、本発明の使用目的によってその適切なヌクレオチド長が変動し得る。より好ましくは、本発明の核酸分子は、少なくとも 1 0の連続するヌクレオチド長であり得、さらに好ましくは少なくとも 1 5の連続するヌクレオチド長であり得、なお好ましくは少なくとも 2 0の連続するヌクレオチド長であり得る。これらのヌクレオチド長の下限は、具体的に挙げた数字のほかに、それらの間の数（例えば、 9、 1 1、 1 2、 1 3、 1 4、 1 6など）あるいは、それ以上の数（例えば、 2 1、 2 2、 . . . 30、など）であってもよい。本発明の核酸分子は、目的とする用途（例えば、アンチセンス、 RNA i、マ一カー、プライマー、プロ一ブ）として使用することができるかまたは所定の因子と相互作用することができる限り、その上限の長さは、配列番号 3などに示す配列またはその相補体の全長であってもよく、それを超える長さであってもよい。あるいは、プライマーとして使用する場合は、通常少なくとも約 8のヌクレオチド長であり得、好ましくは約 1 0ヌクレオチド長であり得る。プローブとして使用する場合は、通常少なくとも約 1 5ヌクレオチド長であり得、好ましくは約 1 7ヌクレオチド長であり得る。

従って、 1つの例示的な実施形態において、本発明の因子は、上記（a) 〜 ( e ) のいずれかの C E N P— Aポリヌクレオチドの核酸配列に対して相補的な配列またはそれに対して少なくとも 7 0 %の同一性を有する配列を有する核酸分子であり得る。

別の好ましい実施形態では、本発明の因子は、 CENP— Aの核酸分子のァンチセンスまたは RNA iである。 RNA iは、 s i RNAであっても s h R NAであってもよく、そのような例としては、たとえば、約 2 0塩基前後（例えば、代表的には約 21〜23塩基長）またはそれ未満の長さの二本鎖 RN A であって、好ましくは、 5' —リン酸、 3' — OHの構造を有しており、 3' 末端は約 2塩基突出している。 s hRNAはまた、好ましくは、 3' 突出末端を有し得る。二本鎖部分の長さは特に限定されないが、好ましくは約 10ヌクレオチド長以上、より好ましくは約 20ヌクレオチド長以上であり得る。ここで、 3' 突出末端は、好ましくは DNAであり得、より好ましくは少なくとも 2ヌクレオチド長以上の DN Aであり得、さらに好ましくは 2〜4ヌクレオチド長の DNAであり得る。

別の好ましい実施形態において、本発明.の因子は、核酸分子であり、 PCR などの核酸増幅反応などにおけるプライマーとして使用され得、あるいは、サザンブロットなどのプローブとして使用され得る。

好ましい実施形態において、本発明の因子は、標識されているかまたは標識と結合し得るものであることが有利であり得る。そのように標識がされている場合、本発明の因子によって測定することができる種々の状態を直接および Z または容易に測定することができる。そのような標識は、識別可能に標識される限り、どのような標識でもよく、例えば、蛍光、リン光、化学発光、放射能、酵素基質反応および抗原抗体反応などの技法が挙げられるがそれらに限定されない。あるいは、その因子が抗体などの免疫反応を利用して相互作用する場合、ピオチン一ストレプトアビジンのような免疫反応においてよく利用される系を用いてもよい。

好ましい実施形態では、本発明の CENP— Aに対して特異的な因子は、配列番号 3に示す配列からなるポリヌクレオチド（あるいは、正常な被検体に存在する改変体）に対して特異的な因子であることが有利である。このような因子は、 CENP— Aの正常型を検出することができる。あるいは、本発明の C ENP— Aに対して特異的な因子は、配列番号 3に示す配列からなるポリヌクレオチド（あるいは、正常な被検体に存在する改変体）以外の CENP— Aの改変体に対して特異的な因子であることが有利である。このような因子は、 C ENP— Aの改変体を検出することができる。

(CENP— A核酸形態を用いた診断キットおよび方法）

別の局面において、本発明は、 A) a) 配列番号 3に記載の塩基配列もしくはその相補体またはそのフラグメント配列を有する、ポリヌクレオチド；

(b) 配列番号 4に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド；（c) 配列番号 4に記載のアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも 1 つの変異を有する改変体ポリペプチドであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；（d) (a) 〜（c) のいずれか 1つのポリヌクレオチドにストリンジェン卜な条件下でハイプリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または（e) (a) 〜（c) のいずれか 1つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも 70%である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、を含む、核酸分子に対して特異的な因子；および B) 該因子に起因するシグナルを用いて該核酸分子の発現量を測定するための手段であって、癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分における該核酸分子の発現量に比較して対象の被験体の対象部分における該核酸分子の発現が高い場合、該対象の被験体は癌のハイリスク者であると診断する、手段、を備える、癌診断キットを提供する。ここで、診断対象となる癌は、直腸癌および結腸癌が挙げられるがそれらに限定されない。 CENP— Aに特異的な因子としては、本明細書において記載されるような任意の因子を使用することができる。このような因子としては、その反応特異性さえ理解して提供される限り、どのような特異性を有する因子であっても本発明において利用することができ、したがって、そのような因子およびそれを含むキットは、本発明の範囲内にあることが理解される。 1つの実施形態では、配列番号 3中の任意の 2 0ヌクレオチド長を含む配列に対して特異的な因子が挙げられるがそれらに限定されない。

ここで、核酸分子の発現量の測定は、 C E N P— Aの核酸形態に対して特異的な因子に起因する任意のシグナルを用いて行うことができる。そのようなシグナルとしては、例えば、物理的信号（例えば、蛍光、発光など）、化学的信号（例えば、染色など）、生化学的信号（例えば、酵素反応）、生物学的信号 (例えば、微生物の生存の判定）などが挙げられるがそれらに限定されない。このようなシグナルは、被験体の生体試料中に、例えば、本発明の mRNAが存在するか否かを直接または間接的に試験することが判定できるようなものであれば、どのようなものでも使用することができる。この場合、そのようなシグナルが検出される場合、試料中にその mRNAが存在する被験体を癌患者またはそのハイリスク者と判定することができる。

本発明の C E N P— Aの検出のために、生体試料としては、便、尿、汗、生検組織、唾液、血液（例えば、全血、血清、血漿など）、血液細胞（単核球等）、他の体液、罹患した部分の細胞などを対象とすることができる。 mRNAの検出、測定は公知の RT- PCR法、定量的 RT- PCT法によって行うことができ、その場合の PCRは本発明のプライマ一セットを用いることができる。これらのプライマ—セットは、配列番号 3の塩基配列またはその改変体に基づき設計し、合成 ·精製の各工程を経て調製することができる。なお、プライマー設計の留意点として、例えば以下を指摘することができる。プライマーのサイズ（塩基数）は、铸型 DNA との間の特異的なアニーリングを満足させることを考慮し、 15-40塩基、望ましくは 15-30塩基である。ただし、 LA ( long accurate) PCR を行う場合には、少なくとも 30塩基が効果的である。

プライマーの設計の際には、センス鎖（5'末端側）とアンチセンス鎖（3'末端側）からなる 1組あるいは 1対（2本）のプライマーが互いにァニールしないよう、両プライマー間の相補的配列を避けると共に、プライマ一内のへアビン構造の形成を防止するため自己相補配列をも避けるようにする。本発明では、正常型とその改変体とを識別する必要がある場合、正常型と改変体との間で識別可能な部位に由来するプライマーを少なくとも 1つ使用することが好ましい。このような場合、一方に存在し、他方には存在しないような配列（例えば、欠失または付加部分の配列）をプライマーの少なくとも一方として使用することが好ましく、プライマー対の両方として使用することがより好ましい。

さらに、铸型 DNAとの安定な結合を確保するため GC含量を約 50%にし、プライマ一内において GC- r ichあるいは AT-richが偏在しないようにする。ァニ一リング温度は Tm (mel t ing temperature) に依存するので、特異性の高い PCR産物を得るため、 Tm値が 55- 65°Cで互いに近似したプライマーを選定する。また、 PCRにおけるプライマー使用の最終濃度が約 0. 1〜約 1 Mになるよう調整する等を留意することも必要である。また、プライマー設計用の市販のソフトウエア、例えば Ol i o™ [Nat ional Bioscience Inc. (米国) 製] 、 GENETYX [ソフトウェア開発（株）（日本）製] 等を用いることもできる。

あるいは、本発明のキットまたは診断法は、アレイを用いて実行することができる。アレイの実行方法は、上述したとおりである。別の局面において、本発明は、 A) 対象の被験体の対象部分からの試料を提供する工程； B ) 該試料中において、 a ) 配列番号 3に記載の塩基配列もしくはその相補体またはそのフラグメント配列を有する、ポリヌクレオチド；

( b ) 配列番号 4に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド；（c ) 配列番号 4に記載のアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも 1 つの変異を有する改変体ポリペプチドであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；（d ) ( a ) 〜（c ) のいずれか 1つのポリヌクレオチドにストリンジエンドな条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または（e ) ( a ) ( c ) のいずれか 1つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも 7 0 %である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有す^)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、を含む、核酸分子の存在量を測定する工程； C) 該核酸分子の存在量と、癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分からの試料における同一核酸分子の存在量とを比較し、該対象の被験体の対象部分からの試料における該核酸分子の量が増加している場合、該対象の被験体は癌のハイリスク者であると診断する、工程、を包含する、癌診断方法を提供する。この癌診断方法で使用される試料としては、便、尿、汗、生検組織、唾液、血液（例えば、全血、血清、血漿など）、血液細胞（単核球等）、他の体液、罹患した部分の細胞などを対象とすることができる。比較の対象のために、罹患していないことが明らかな部位、または罹患していない他の被験体からの試料を利用することができる。罹患していない他の被験体からの試料を使用する場合、好ましくは、そのような試料は、対象となる被験体の対象部位と同様の部位に由来する試料を利用することができる。ここで、診断対象となる癌としては、直腸癌および結腸癌が挙げられるがそれらに限定されない。上記核酸分子の検出は、そのような核酸分子に対して特異的な因子を用いて行うことができる。そのような因子としては、本明細書に記載される C E N P— Aの核酸形態に対して特異的な任意の因子を用いることができる。別の局面において、本発明は、（a ) 配列番号 3に記載の塩基配列もしくはその相補体またはそのフラグメント配列を有する、ポリヌクレオチド；（b ) 配列番号 4に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド；（c ) 配列番号 4に記載のアミノ酸配列において、 1以上のァミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも 1つの変異を有する改変体ポリぺプチドであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；（d) (a) ~ (c) のいずれかつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または (e) (a) 〜（c) のいずれか 1つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも 7 0 %である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、を含む、核酸分子の、癌の診断剤の製造のための使用を提供する。ここで、診断対象となる癌としては、直腸癌および結腸癌が挙げられるがそれらに限定されない。上記核酸分子の検出は、そのような核酸分子に対して特異的な因子を用いて行うことができる。そのような因子としては、本明細書に記載される CENP— Aの核酸形態に対して特異的な任意の因子を用いることができる。 (CENP一 Aの核酸形態を用いた治療方法および治療剤）

別の局面において、本発明は、 A) (a) 配列番号 3に記載の塩基配列もしくはその相補体またはそのフラグメント配列を有する、ポリヌクレオチド； ( b ) 配列番号 4に記載のァミノ酸配列またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド；（c) 配列番号 4に記載のアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも 1 つの変異を有する改変体ポリペプチドであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；（d) (a) 〜（c) のいずれか 1つのポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイプリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または（e) (a) 〜（c) のいずれか 1つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも 7 0%である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、を含む、核酸分子を含む、癌治療剤を提供する。ここで、治療対象となる癌としては、例えば、直腸癌および結腸癌が挙げられるがそれらに限定されない。このような F I R の核酸形態としては、本明細書において記載されるような任意の核酸分子を使用することができる。好ましくは、 C E N P— Aの正常型を発現することができる核酸分子が使用される。 1つの実施形態では、例えば、配列番号 3に示される配列またはその改変体であって、配列番号 3と同等の機能を有する分子または配列番号 2と同等の機能を有する分子を発現する分子を利用することができる。より好ましくは、本発明の治療剤に含まれる核酸分子は、配列番号 3で示される配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子を含む。

別の局面において、本発明は、上記癌治療剤を用いた癌治療法を提供する。この治療法は、本明細書において説明される任意の治療技術を用いることがでさる。 (C E N P— Aのポリペプチド形態）

別の局面において、本発明は、本発明は、ポリペプチド形態の C E N P— A を含む、癌（例えば、直腸癌または結腸癌（これらを総称して大腸癌とも言う））の状態の、処置、予防、診断または予後のための組成物を提供する。ここで、診断、予防、処置または予後上有効な量は、当該分野において周知の技法を用いて当業者が種々のパラメータを参酌しながら決定することができ、そのような量を決定するためには、例えば、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、細胞の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる（例えば、がん診療レジデントマニュアル第 2版、編集：国立がんセンタ一中央病院内科レジデント、医学書院、 2 0 0 0を参照）。本発明では、本発明では、癌の発症が、 C E N P— Aの異常発現と予想外に関連していることが明らかになった。このような関連、ならびにそれを利用した診断および治療効果は従来知られておらず、したがって、本発明の CENP— Aのポリペプチド形態およびそれに関連する発明は、従来技術より優れた効果を示す。

従って、 1つの実施形態において、本発明は、（a) 配列番号 4に記載のァミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；（b) 配列番号 4に記載のアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも 1つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；（c) 配列番号 3に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；（d) 配列番号 4に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または (e) (a) 〜（d) のいずれか 1つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも 70%であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリべプチド、を含む、ポリペプチドを提供する。

1つの好ましい実施形態において、上記（b) における置換、付加および欠失の数は限定されていてもよく、例えば、 50以下、 40以下、 30以下、 2 0以下、 15以下、 10以下、 9以下、 8以下、 7以下、 6以下、 5以下、 4 以下、 3以下、 2以下であることが好ましい。より少ない数の置換、付加および欠失が好ましいが、生物学的活性を保持する（好ましくは、配列番号 4に示される配列からなる正常型 CENP— Aと類似するかまたは実質的に同一の活性を有する、あるいは CENP— Aの異常型活性（例えば、非セントロメァクロマチンへの結合））限り、多い数であってもよい。

別の好ましい実施形態において、上記（c) におけるスプライス変異体または対立遺伝子変異体は、配列番号 4に示すアミノ酸配列と少なくとも 99 %の相同性を有することが好ましい。

別の好ましい実施形態において、上記種相同体は、本明細書中上述のように同定することができ、配列番号 4に示すアミノ酸配列と少なくとも約 30%の相同性を有することが好ましい。好ましくは、種相同体は、上記基準配列と、少なくとも約 40%、少なくとも約 50%、少なくとも約 60%、少なくとも約 70%、少なくとも約 80%、少なくとも約 90%、少なくとも約 95%、少なくとも約 98%、相同であり得る。

上記種相同体は、その種の遺伝子配列デ一タベースが存在する場合、そのデ一夕べ一スに対して、本発明の CENP— Aをクエリ配列として検索することによって同定することができる。あるいは、本発明の CENP— Aの全部または一部をプローブまたはプライマ一として、その種の遺伝子ライブラリーをスクリーニングすることによって同定することができる。そのような同定方法は、当該分野において周知であり、本明細書において記載される文献にも記載されている。種相同体は、例えば、配列番号 3に示す核酸配列または配列番号 4に示すアミノ酸配列と少なくとも約 30 %の相同性を有することが好ましい。好ましくは、種相同体は、上記基準配列と、少なくとも約 40%、少なくとも約 50%、少なくとも約 60%、少なくとも約 70%、少なくとも約 80%、少なくとも約 90%、少なくとも約 95%、少なくとも約 98%、相同であり得る。

別の好ましい実施形態において、上記（e) における上記改変体ポリべプチドが有する生物学的活性としては、例えば、配列番号 4に記載のアミノ酸配列からなるポリぺプチドまたはそのフラグメントに対して特異的な抗体との相互作用、セントロメァクロマチンとの相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。これらは例えば、免疫学的アツセィ、蛍光アツセィなどによって測定することができる。

好ましい実施形態において、上記（a) 〜（d) のいずれか 1つのポリぺプチドに対する相同性は、少なくとも約 80%であり得、より好ましくは少なくとも約 90%であり得、さらに好ましくは少なくとも約 98%であり得、もつとも好ましくは少なくとも約 99%であり得る。最も好ましくは、本発明の C E N P— Aポリペプチドは、配列番号 4からなる配列を有する。

本発明のポリペプチドは、通常、少なくとも 3の連続するアミノ酸配列を有する。本発明のポリペプチドが有するアミノ酸長は、目的とする用途に適合する限り、どれだけ短くてもよいが、好ましくは、より長い配列が使用され得る。従って、好ましくは、少なくとも 4アミノ酸長、より好ましくは少なくとも 5 アミノ酸長、少なくとも 6アミノ酸長、少なくとも 7アミノ酸長、少なくとも 8アミノ酸長、少なくとも 9アミノ酸長、少なくとも 10アミノ酸長であってもよい。さらに好ましくは少なくとも 1 5アミノ酸長であり得、なお好ましくは少なくとも 20アミノ酸長であり得る。これらのアミノ酸長の下限は、具体的に挙げた数字のほかに、それらの間の数（例えば、 1 1、 12、 1 3、 14、 1 6など）あるいは、それ以上の数（例えば、 2 1、 22, . . . 30、など）であってもよい。本発明のポリペプチドは、ある因子と相互作用することができる限り、その上限の長さは、配列番号 4に示す配列の全長と同一であつてもよく、それを超える長さであってもよい。

本発明のポリペプチド形態の CENP— Aは、標識されているかまたは標識され得ることが好ましい。このような標識されているかまたは標識され得る C ENP— Aを用いて、体内にある CENP— Aに対する抗体量を測定することができ、それにより、 CENP— Aの発現量を間接的に測定することができるからである。

(C E N P— Aのポリべプチド形態に特異的な因子）

1つの局面において、本発明は、 CENP— Aのポリペプチド形態に対して特異的な因子を含む、癌（例えば、直腸癌または結腸癌 (これらを総称して大腸癌とも言う））の、処置、予防、診断または予後のための組成物を提供する。したがって、本発明は、本明細書に記載される任意の CENP— Aのポリぺプチドまたはその改変体もしくはフラグメントに対して特異的な因子を提供する。ここで、診断、予防、処置または予後上有効な量は、当該分野において周知の技法を用いて当業者が種々のパラメ一夕を参酌しながら決定することができ、そのような量を決定するためには、例えば、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、細胞の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる（例えば、がん診療レジデントマニュアル第 2版、編集：国立がんセンター中央病院内科レジデント、医学書院、 2 0 0 0を参照）。本発明では、癌の発症が、 C E N P— Aの異常発現と予想外に関連していることが明らかになった。このような関連、ならびにそれを利用した診断および治療効果は従来知られておらず、したがって、本発明の因子は、従来技術により提供されるものより優れた効果を示す。

好ましい実施形態において、本発明の因子は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子からなる群より選択される因子であり得る。このような因子は、本発明のポリペプチドに特異的に結合するものであれば、どのようなものでもよいことが理解され得る。より好ましくは、本発明の因子は、抗体またはその誘導体（例えば、単鎖抗体）である。従って、本発明の因子は、プローブおよびノまたはインヒビターとして使用することができる。

好ましい実施形態において、本発明の因子は、標識されているかまたは標識と結合し得るものであることが有利であり得る。そのように標識がされている場合、本発明の因子によって測定することができる種々の状態を直接および/ または容易に測定することができる。そのような標識は、識別可能に標識される限り、どのような標識でもよく、例えば、蛍光、リン光、化学発光、放射能、酵素基質反応および抗原抗体反応などの技法が挙げられるがそれらに限定されない。あるいは、その因子が抗体などの免疫反応を利用して相互作用する場合、 3010676

ピオチン一ストレプトアビジンのような免疫反応においてよく利用される系を用いてもよい。

好ましい実施形態では、本発明の CENP— Aに対して特異的な因子は、配列番号 4に示す配列からなるポリぺプチド（あるいは正常な被検体に存在する改変体）に対して特異的な因子であることが有利である。このような因子は、 CENP— Aの正常型を検出することができる。あるいは、本発明の CENP 一 Aに対して特異的な因子は、配列番号 4に示す配列からなるポリペプチド (あるいは正常な被検体に存在する改変体）以外の CENP— Aの改変体に対して特異的な因子であることが有利である。このような因子は、 CENP— A の改変体を検出することができる。

( C E N P— Aポリぺプチド形態を用いた診断キットおよび方法）

別の局面において、本発明は、 A) (a) 配列番号 4に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；（b) 配列番号 4に記載のアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも 1つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；（c) 配列番号 3に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；（d) 配列番号 4に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または（e) (a) 〜 (d) のいずれか 1つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも 70%であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、を含む、ポリペプチドに対して特異的な因子；および B) 該因子に起因するシグナルを用いて該ポリペプチドの発現量を測定するための手段であって、癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分における該ポリペプチドの発現量に比較して対象の被験体の対象部分における該ポリぺプチドの発現が高い場合、該対象の被験体は癌のハイリスク者であると診断する、手段、を備える、癌診断キットを提供する。ここで、診断対象となる癌としては、例えば、直腸癌および結腸癌が挙げられるがそれらに限定されない。このような C E N P— Aに特異的な因子としては、本明細書において記載されるような任意の因子を使用することができる。このような因子は、 C E N P— Aの正常型および改変体のいずれとも特異的に反応してもよく、あるいは、 F I Rの正常型または改変体のいずれか一方と特異的に反応してもよい。その反応特異性さえ理解して提供される限り、どのような特異性を有する因子であっても本発明において利用することができ、したがって、そのような因子およびそれを含むキットは、本発明の範囲内にあることが理解される。 1つの実施形態では、正常型と改変体との共通の配列（例えば、配列番号 4中の、 3 0アミノ酸長の配列など）に対して特異的な因子が挙げられるがそれらに限定されない。あるいは、この因子として、 C E N P— Aポリペプチド自体を用いることができる。 Bポリぺプチドを用いた場合、 C E N P _ Aポリペプチドに特異的な抗体を認識することができることから、生体内の C E N P— Aポリぺプチドに特異的な抗体量を算出し、それにより、 C E N P— Aポリペプチドの体内における存在を同定することが可能であるからである。

ここで、 C E N P— Aのポリペプチドの発現量の測定は、本発明の C E N P _ Aのポリペプチド形態に特異的な因子に起因する任意のシグナルを用いて行うことができる。

あるいは、本発明の癌診断方法では、被験体の血清中に、本発明の抗原ぺプチドと結合する抗体が存在するか否かを試験し、血清中にその抗体が存在する被験体を癌患者または癌ハイリスク者と判定することもできる。すなわち、本発明の抗原ペプチドは、患者の血清中の抗体（IgG) と結合するペプチドであるから、被験体の血清と反応させ、これらの抗原ペプチドと結合する抗体を含む血清を、癌患者またはそのハイリスク患者の血清として判定することができる。なおその際に、 2種類の抗原ペプチドについて血清中抗体との結合を判定することが好ましい。

具体的な診断は、例えば抗原ペプチドに被験体血清を接触させ、抗原べプチドと被験体血清中の IgG抗体とを液相中において反応させる。さらに血清中の IgG抗体と特異的に結合する標識 IgG抗体を反応させて、標識 IgG抗体のシグナルを検出すればよい。標識 IgG抗体の標識物質は、上記の標識抗体において例示したような酵素、放射性同位体または蛍光色素を使用することができる。酵素を用いる場合には、酵素作用によって分解して発色する基質を加え、基質の分解量を光学的に測定することによって酵素活性を求め、これを結合抗体量に換算し、標準値との比較から抗体量が算出される。放射生同位体を用いる場合には、放射性同位体の発する放射線量をシンチレ一シヨンカウンタ一等により測定する。また、蛍光色素を用いる場合には、蛍光顕微鏡を組み合わせた測定装置によつて蛍光量を測定すればよい。

なお、このような診断方法の簡便かつ広範囲な実施を可能とするものとして、本発明の診断キッ卜が提供される。

本発明の診断方法はまた、抗原ペプチドの 1種類以上をプレート上に固定化し、この基板上において被験体血清の抗体との結合を試験する方法（これもまた本発明の包含される）として実施することもできる。抗原ペプチドを基板上に固定化することによって、未結合の標識結合分子を容易に除去することができる。また、このような診断方法の簡便かつ広範囲な実施を可能とするものとして、本発明の診断キットの 1つの実施形態が提供される。あるいは、本発明の診断方法は、被験体の生体試料中に、本発明の抗体、もしくは本発明の標識抗体と結合する抗原べプチドが存在するか否かを試験し、試料中にその抗原べプチドが存在する被験体を癌患者またはそのハイリスク者と判定する。すなわち、ここで使用する抗体または標識抗体は、大腸癌細胞で発現している抗原ペプチドと特異的に結合する抗体であるから、この抗体と翁合する抗原べプチドを含む生体試料を、大腸癌患者または大腸癌ハイリスク患者の試料として判定することができる。なおその際に、好ましくは 2種の抗体について試料中の抗原ペプチドとの結合を判定することが好ましい。また、生体試料としては、血液、血液細胞（単核球等）を対象とすることができる。

本発明の診断方法における一つの態様は、抗体と抗原ペプチドとの結合を液相系において行う方法である。例えば、本発明の標識抗体と生体試料とを接触させて標識抗体と抗原ペプチドを結合させ、この結合体を本明細書において記載されるような方法で分離し、標識シグナルを同様の方法で検出する。このような診断方法の簡便かつ広範囲な実施を可能とするものとして、本発明の診断キットが提供される。

液相系での診断の別の方法は、本発明の抗体（一次抗体）と生体試料とを接触させて一次抗体と抗原ペプチドを結合させ、この結合体に本発明の標識抗体 (二次抗体）を結合させ、この三者の結合体における標識シグナルを検出する。あるいは、さらにシグナルを増強させるためには、非標識の二次抗体を先ず抗体 +抗原ペプチド結合体に結合させ、この二次抗体に標識物質を結合させるようにしてもよい。このような二次抗体への標識物質の結合は、例えば二次抗体をビォチン化し、標識物質をアビジン化しておくことによって行うことができる。あるいは、二次抗体の一部領域（例えば、 Fc領域）を認識する抗体（三次抗体）を標識し、この三次抗体を二次抗体に結合させるようにしてもよい。なお、一次抗体と二次抗体は、両方ともモノクロ一ナル抗体を用いることもでき、あるいは、一次抗体と二次抗体のいずれか一方をポリクローナル抗体とすることもできる。液相からの結合体の分離やシグナルの検出は、本明細書において記載されるように行うことができる。また、このような診断方法の簡便かつ広範囲な実施を可能とするものとして、本発明の診断キットの一つの実施形態が提供される。

本発明の診断方法における別の態様は、抗体と抗原ペプチドとの結合を固相系において試験する方法である。この固相系における方法は、極微量の抗原べプチド検出と操作の簡便化のため好ましい方法である。すなわちこの固相系の方法は、本発明の抗体（一次抗体）を樹脂プレート等に固定化し、この固定化抗体に抗原ペプチドを結合させ、非結合ペプチドを洗浄除去した後、プレート上に残った抗体 +抗原ペプチド結合体に標識抗体（二次抗体）を結合させ、この二次抗体のシグナルを検出する方法である。この方法は、いわゆる「サンドイッチ法」と呼ばれる方法であり、マーカーとして酵素を用いる場合には、厂 EL ISA (enzyme 1 inked immunosorbent assay) 」としてムぐ用レられてレる方法である。一次抗体と二次抗体は、両方ともモノクローナル抗体を用いることもでき、あるいは、一次抗体と二次抗体のいずれか一方をポリクローナル抗体とすることもできる。シグナルの検出は、本明細書に記載されるように行うことができる。また、このような診断方法の簡便かつ広範囲な実施を可能とするものとして、本発明の診断キッ卜の一つの実施形態が提供される。

本発明の診断キットは、本発明の診断方法を行うための試薬キットであり得る。このようなキットは、被検成分の種類に応じて各種のものが市販されており、この発明の診断キットも、この発明によって提供される抗原ペプチド、抗体および Zまたは標識抗体を用いることを除き、当該分野において公知のキットに用いられている各要素によつて構成することができる。

あるいは、本発明のキットまたは診断法は、アレイを用いて実行することができる。アレイの実行方法は、上述したとおりである。別の局面において、本発明は、 A) 対象の被験体の対象部分からの試料を提供する工程； B ) 該試料中において、請求項 1 4 2に記載のポリペプチドの存在量を測定する工程； C) 該ポリペプチドの存在量と、癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分からの試料における同一核酸分子の存在量とを比較し、該対象の被験体の対象部分からの試料における該ポリペプチドの量が増加している場合、該対象の被験体は癌のハイリスク者であると診断する、工程、を包含する、癌診断方法を提供する。この癌診断方法で使用される試料としては、便、尿、汗、生検組織、唾液、血液（例えば、全血、血清、血漿など）、血液細胞（単核球等）、他の体液、罹患した部分の細胞などを対象とすることができる。比較の対象のために、罹患していないことが明らかな部位、または罹患していない他の被験体からの試料を利用することができる。罹患していない他の被験体からの試料を使用する場合、好ましくは、そのような試料は、対象となる被験体の対象部位と同様の部位に由来する試料を利用することができる。ここで、診断対象となる癌としては、例えば、直腸癌および結腸癌が挙げられるがそれらに限定されない。上記ポリペプチドの検出は、そのようなポリペプチド（C E N P— Aポリペプチド）に対して特異的な因子（例えば、抗体）を用いて行うことができる。そのような因子としては、本明細書に記載される C E N P— Aのポリペプチド形態に対して特異的な任意の因子を用いることができる。好ましくは、このような因子は、配列番号 4に示される配列を有する正常型 C E N P— Aおよびその改変体の両方に特異的に反応することが有利であり得る。あるいは、この因子は、改変体のみに対して特異的であっても、正常型のみに対して特異的であってもよい。このような性質さえ有する限り、任意の因子がその反応特異性さえ理解して提供され、どのような特異性を有する因子であっても本発明において利用することができ、したがって、そのような因子およびそれを含むキットは、本発明の範囲内にあることが理解される。 1つの実施形態では、正常型と改変体とにおいて相違がある配列部分に対して特異的な因子が挙げられるがそれらに限定されない。別の局面において、本発明は、（a ) 配列番号 4に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；（b ) 配列番号 4に記載のアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも 1つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；（c ) 配列番号 3に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；（d ) 配列番号 4に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または（e ) ( a ) 〜 ( d ) のいずれか 1つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも 7 0 %であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、を含む、ポリペプチドの、癌の診断剤の製造のための使用を提供する。ここで、診断対象となる癌としては、例えば、直腸癌および結腸癌が挙げられるがそれらに限定されない。上記ポリペプチドの検出は、そのようなポリペプチドに対して特異的な因子を用いて行うことができる。そのような因子としては、本明細書に記載される C E N P— Aのポリぺプチド形態に対して特異的な任意の因子を用いることができる。 (F I Rのポリペプチド形態を用いた治療方法および治療剤）

別の局面において、本発明は、 A) ( a ) 配列番号 4に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；（b ) 配列番号 4に記載のアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも 1つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；（c ) 配列番号 3に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；（d ) 配列番号 4に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または（e ) ( a ) 〜 ( d ) のいずれか 1つのポリぺプチドに対する同一性が少なくとも 7 0 %であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、を含む、ポリペプチドを含む、癌治療剤を提供する。ここで、治療対象となる癌としては、例えば、直腸癌および結腸癌が挙げられるがそれらに限定されない。このような F I Rに特異的な因子としては、本明細書において記載されるような任意の因子を使用することができる。このポリペプチドは、 C E N P— Aの正常型な機能を少なくとも 1つ有し、好ましくは、セントロメァクロマチンに結合する能力を有する。 1つの実施形態では、例えば、配列番号 4に示される配列またはその改変体であって、配列番号 4と同等の機能を有する分子を利用することができる。より好ましくは、本発明の治療剤に含まれるポリペプチドは、配列番号 4で示される配列を含むポリぺプチドを含む。

別の局面において、本発明は、上記癌治療剤を用いた癌治療法を提供する。この治療法は、本明細書において説明される任意の治療技術を用いることができる。

以下、実施例を示して本願の発明についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、本願の発明は以下の例によって限定されるものではない。従って、本発明の範囲は、実施例のみに限定されるものではなく、特許請求の範囲によってのみ限定される。実施例

実施例 1

本発明の抗原ペプチド FIR (配列番号 2 ) の癌組織および正常組織での発現をウエスタンブロットによって分析した。 (1)材料と方法

(1-1)抗 FIR抗体

事前に FIRペプチドのアミノ酸配列（配列番号 2) から抗原性、疎水性、反応性、ペプチドの特異性を BLASTサーチし、特異的抗原性ペプチドとして以下の 2つのペプチドを Fmoc/t-Bocによる固相法で合成した。

NH₂-CDKWKPPQGTDS I KME-C00H₂ (配列番号 5)

NH_rCEVYDQE FDNSDLSA-COOH₂ (配列番号 6 )

なお、下線はそれぞれ配列番号 2の 31-45アミノ酸配列および 528-542アミノ酸配列と一致する。

合成したペプチドは、純度を保証するため HPLC により分析し、質量分析装置により分子量を同定した。

この合成べプチドを用いて、無菌帝王切開を受けた二ュ一ジ一ランド産

S.P.F基準（無病原菌）のゥサギを常法により免疫し、血清を抽出し、ァファ二ティ一精製した抗 FIR抗体を作成した。

(卜 2)ウエスタンプロット分析

患者の了解のもと、大腸癌摘出直後の癌部および非癌部組織のそれぞれから凍結標本を採取し、 - 80°Cに保存した。この凍結標本の適量を、 9.5 M Uera， 2% CHAPS, 1% DTT溶液中でホモジェナイズした後、卓上高速遠心器（ベックマン社）で 15,000gにて遠心し、上清（タンパク質溶液）を週出し、吸光度により夕ンパク質濃度を同定した。

癌部および非癌部組織から得られたタンパク質それぞれ SO g を 8% Tris/Glycine SDS-Polyacrylamide gel にて電気泳動した。泳動されたタンパク質をニトロセルロース膜にトランスファ一し、上記（1-2)の抗体を用いてゥエスタンブロットを行った。

ω結果結果は図 1に示したとおりである。 8例の大腸癌患者の癌組織（T) および正常組織（N) を比較したところ、癌組織において FIR タンパク質の特異的発現が確認された。実施例 2

本発明の抗原ペプチド FIR をコードする遺伝子の転写産物（mRNA) の癌組織および正常組織での転写を RT- PCRによって分析した。

(1)材料と方法

大腸癌摘出直後の癌部および非癌部組織のそれぞれから採取した凍結標本から、 RNeasy Mini Kit (Qiagen 社）を用いて mRNA を抽出した。この mRNA (5 g/20 1) を、 1st Strand cDNA Synthesis Kit for RT-PCR (AMV, cat no. 1 483 188, Roche社）により cDNAに変換し、これを PCR増幅した。

PCRに使用したプライマーセットは以下のとおりである。

順方向フライマ一： b -ggccccatcaagagcatc-3' (配歹 ij番号 7)

逆方向プライマ一： 5' -ggggctgggccagggtcag-3' (配列番号 8)

PCR条件は以下のとおりである。

95°C/10分間

(94°C/ 1分間； 54 / 1分間； 72°C/ 1分間） X 30

72°C/ 7分間

(2)結果

結果は図 2に示したとおりである。 8例の大腸癌患者の癌組織（T) および正常組織 (N) からの FIR mRNAの転写を比較したところ、癌組織細胞において FIR mRMの特異的発現が確認された。実施例 3 本発明の CENP- A (配列番号 4 ) の癌組織および正常組織での発現をウェス夕ンブロッ卜によって分析した。

(1)材料と方法

(1 - 1)被検組織

市販の抗セントロメァ抗体 [Human ANA Centromere Autoant ibody ： The Binding Si t e社（英国）製] を用いたことを除き、実施例 1と同様の方法により、ウエスタンプロット分析を行った。

以下に具体的な手法を示す。

(ヒト組織試料）

1 1症例の原発性結腸直腸癌由来の組織を、外科切除した（表 1 ) 。表 1 結腸直腸瘙の患者の臨床的特徴

' S: S状結腸，C:'盲腸，R:直腸，Α·上行結腸—

書面でのインフォームドコンセントを、手術前に各患者から得た。切除試料を. 腫瘍組織およびこの腫瘍から 5〜 1 0 c m離れた対応する非腫瘍組織から術後 1時間以内に獲得した。切除した組織の全てを、直ちに液体窒素中に入れ、さらに分析するまで一 8 0 °Cにて保存した。 (夕ンパク質抽出および免疫：

凍結組織試料を、 4°Cにて 1時間の遠心分離（100， 000 X g) 後に、溶解緩衝液（7M尿素、 2Mチォ尿素、 2% 3— [ (3—コラミドプロピル）ジメチルアンモニォ] 一 1一プロパンスルホネート、 0. 1M DTT、 2 % I PG緩衝液（Ame r s h am Ph a rma c i a B i o t e c h, Buc k i nghams h i r e, Un i t e d K i ngdom) 、および 4 OmM T r i s) 中で、 P o 1 y t r o nホモジナイザー（K i n e ma t i c a, L i t t au— Lu z e r n, Sw i t z e r l and) を用いて溶解した。上清のタンパク質を、 7. 5〜1 5%勾配ゲル（N i kkyo Te c hno s DRC, Tokyo, J a p a n) 上での電気泳動により分離した。タンパク質を、タンクトランスファー装置（B i o— Rad, He r c u 1 e s, CA) 中で、フッ化ポリビニリデンメンブレン（M i 1 1 i p o r e, Be d f o r d, MA) に移し、そしてこのメンブレンを、 5%スキムミルクを含有する PBSでブロックした。ブロッキング緩衝液中に、 1 : 10 00希釈した核セントロメァ自己抗体ポジティブコント口一ル（ANA血清； T e B i nd i ng S i t e, B i rmi ngh am, Un i t e d K i ngd om) 、 1 ： 500希釈した抗ヒト CENP— Aモノクローナル抗体（Ando， S. e t a 1. ， Mo 1. Ce l l . B i o l . , 22 : 2 229-2241, 2002) 、 1 : 100希釈したゥサギ抗 P C N A (F L - 261) 抗体（S an t a C r u z, S an t a C r u z, CA) 、および 1 ： 500希釈したャギ抗 |3—ァクチン抗体（S an t a C r u z) を，一次抗体として使用した。ブロッキング緩衝液中に、 1 : 10， 000希釈したャギ抗ヒト I gG HRP結合体（ J a c k s o n， We s t Gr ov e, PA) 、 1 : 3, 000希釈したャギ抗ゥサギ I gG HRP (B i o-R a d) 、および 1 : 500希釈したゥサギ抗ャギ I gG HRP (C a p p e 1 , We s t Ch e s t e r, PA) を、二次抗体として使用した。メンブレン上の抗原を、強化化学発光検出試薬（Ame r s h am Ph a rma c i a B i o t e c h) により検出した。各バンドの強度を、 N IH画像により測定した。

(免疫組織学）

室温にて 5分間、 4%パラホルムアルデヒドを含有する PBSを用いて組織をスライドガラス上に固定した。 PBSで 3回洗浄した後、試料を、 0 5% Tr i t on X- 100を含有する P B Sで 5分間透過化処理し、そして 4%パラホルムアルデヒド ZPBSで 5分間再固定した。いくつかの実験では、アセトンを用いて 4t:にて 10分間、組織を固定した。抗体の非特異的結合を、ブロッキング緩衝液（1% BSAまたは 10%ゥシ胎仔血清/ PBS) で 1 時間ブロックした。試料を、ブロッキング緩衝液中に 1 ： 500希釈した抗ヒト CENP— Aモノクローナル抗体および Zまたは 1 ： 25希釈したャギ抗ヒト CENP— B (Y— 17) 抗体（S an t a C r u z) と共に、 1時間ィンキュペートした。 PBSで洗浄した後、試料を、 1 ： 500希釈した A 1 e x a F l uo r 488または 568結合ャギ抗マウス I g G二次抗体および A l e x a F l uo r 594結合ロバ抗ャギ I g G二次抗体（Mo l e c u l a r P r ob e s, Eug en e, OR) と共に、 1時間インキュべートした。 DNAを、 DAP I I I I Coun t e r s t a i n (Vy s i s, Abb o t t P a r k, I L) を用いて対比染色した。試料を、蛍光顕微鏡（L e i c a QF I SH； L e i c a M i c r o s y s t ems, Tokyo, J a p a n) により観察した。

(RT— PC Rおよびリアルタイム定量 PC R)

総 RNAおよびゲノム DNAを、 RNe a s y M i n i k i tおよび D Ne a s y T i s s u e k i t (Q i a g e n) を用いて腫瘍組織および非腫瘍組織から抽出した。 f i r s t— s t r and cDNA Syn t e s i s k i t f o r PT-PCR (Ro c h e, Mannhe im, Ge rmany) を用いて、総 RNAから c DNAを合成した。この cDNA をテンプレートとして使用し、以下の適切なプライマ一を用いて CENP— A c DNAを増幅した（順方向： 5 ' - TAGGCGCTTCCTCCCATCAA - 3 ' (配列番号 9) 、逆方向： 5 ' -GCCGAGTCCCTCCTCAAG- 3 ' (配列番号 1 0) ) 。

コントロールのために、 GAPDH cDNAを増幅した。 PCR反応のためにテンプレート c DNAの連続希釈を行い、直線範囲内で P C R産物を最適化した。 L i gh t Cy c 1 e r機器（Ro c h e) を用いた CENP— A cDNAのリアルタイム定量 PCRを、 L i gh t Cy c 1 e r DNA M a s t e r SYBR G r e e n I (F a s t S t a r t T a q DN - Aポリメラーゼ、デォキシヌクレオチド三リン酸、緩衝液、 SYBR G r e e n I) 、 3. OmM MgC l ₂、ならびに各 0. 5 Mの順方向プライマー（5，一 ACAAGGTTGGCTAAAGGA— 3，（配列番号 2 3) ) および逆方向プライマ一 (5 ' -ATGCTTCTGCTGCCTCT T一 3 ' (配列番号 24) ) を含有する 2 0 1の反応混合物を含む L i g h t Cy c 1 e rキヤビラリ一中で実施した。 C ENP— Aゲノム DNAもまた，上記のようにしてリアルタイム PCRにより定量した。しかし、以下のプライマーも使用した（順方向： 5 ' —ACGCCTATCTCCTCACCTT— 3，（配列番号 2 5) 、および逆方向： 5 ' -TGGCTGAGCAGGAA AGAC- 3 ' (配列番号 2 6) ) 。 L i gh t Cy c l e rソフトウェアバ —ジョン 3. 3 (Ro c h e) を、定量 P C Rの分析に使用した。 N i h o n Ge n e R e s e a r c h L a b o r a t o r i e s , I n c. (S e n d a i , J a p an) にて、プライマーの最適化を実施した。

(F I SH分析）

以前に記載された（P e r s on s, D. L. e t a 1. , C l i n, C an c e r Re s . 2 : 8 8 3— 8 8 8， 1 9 9 6 ; L i n g l e， W。 L. e t a 1. P r o c. Na t l . Ac a d. S c i . USA, 99 : 1 9 7 8 - 1983, 2002) 夕ツチプレパレ一シヨンのための F I S H法を若干改変した。簡単に述べると、新鮮な組織または凍結組織のタツチプレパレ一シヨンのスライドを風乾した。 PBS中で洗浄した後、スライドを、室温にて 1 0分間、 75mM KC 1中でインキュベートし、次いで、メタノール：酢酸 (3 ： 1) 中で 10分間固定した。スライドを、 37°Cにて 30分間、 0. 1 mg/mlの RNa s e Aを含有する 2 X S S Cで処理し、 2XSSC中で洗浄し、そして 37°Cで 5分間、 0. 005 %のペプシン溶液中でインキュべ —トした。 PBS中で洗浄した後、スライドを、 70%、 85%、および 10

0 %のエタノール中で脱水した。次いで、スライドを、 37 °Cにて 30分間、 2 XS S C/0. 1 % NP 40溶液中でインキュベートし、再度脱水した。標的 DNAを、 73°Cにて 5分間、 70%ホルムアミド/ /2XSSC溶液中で変性した。第 7染色体（CEP 7 Sp e c t rum Gr e en) 、第 8染色体（CEP 8 Sp e c t r um O r a n g e ) 、第 12染色体（C E P 12 Sp e c t rum 〇 r a n g e ) 、および第 15染色体（C E P 15 Sp e c t r um Gr e en ; Vy s i s, Downe r s Gr ove,

1 L) のセントロメァ周囲の領域に対する 10 1のプローブもまた、 73°C にて 5分間変性させ、次いで、 37°Cにて一晩インキュベートすることにより標的 DNAにハイブリダィズさせた。ハイブリダィゼ一シヨン後の洗浄を、以前に記載された通り実施した（P e r s on s, D. L. e t a 1. , C I i n. Canc e r Re s. 2 : 883— 888， 1996) 。ハイブリダィゼーションシグナルを、 Le i c a QF I SH (L e i c a) により観察および分析した。各試料の少なくとも 100個の核を、染色体数について評価した。

(結果）

多くの型の癌において見られる異数性は、染色体の分離に関与するタンパク質の異常な機能から生じ得る。従って、本発明者らは、ヒト原発性癌における適切な染色体分離に必須の任意の因子の変化を試験した。動原体集合に必須のタンパク質である CENP— Aが、 1 1症例全ての原発性結腸直腸癌において過剰発現されていたことを、抗セントロメァ抗体を用いたウェスタンブロットにより検出した（ANA血清；図 3A) 。近傍の正常組織と比較すると、腫瘍細胞における CENP— Aタンパク質の相対的な発現レベルは、 1. 5から 3 2. 5の間で変化していた。先に示した結腸直腸腫瘍における CENP— Aの過剰発現もまた、抗ヒト CENP— Aモノクローナル抗体を用いたウェスタンプロットにより確認した（図 3B) 。 CENP— Aは、ヒト動原体複合体の構成成分であるので、他の動原体タンパク質もまた、過剰発現されている可能性がある。

ANA血清は、 CENP—Aに加えて、 C EN P— Bおよび C EN P— Aに対する抗体を含む。従って、これらのタンパク質の発現もまた試験した。図 3 Cに示されるように、 CENP— Bタンパク質の発現レベルは、腫瘍組織と近傍の正常組織とで類似した。 CENP— Cに対応するバンドは、 A N A血清によっては検出できなかった（デ一夕は示していない）。この結腸直腸癌における CENP— Aの過剰発現は、腫瘍細胞の高い率での増殖が原因ではなく、 P CNAタンパク質の相対的な発現レベルが、ほとんどの症例において、腫瘍組織と正常組織との間で匹敵したことが原因である（図 3D) 。

CENP— Aの過剰発現が、転写の増加の結果であるか否かを決定するために、結腸直腸癌細胞および正常結腸上皮の CENP— A mRNAレベルを、 RT— PCRにより試験した（図 4A) 。症例 32を除く全ての症例は、腫瘍細胞において、正常細胞よりも高い CENP— A mRNAレベルを示した。また、腫瘍細胞における相対的な mRNAレベルは、図 3 Aに示される相対的なタンパク質レベルと十分に相関した。結腸直腸癌細胞における増加した CE NP-A mRNAレベルを、リアルタイム定量 R T— P C Rによりさらに確認した（図 4B) 。 CENP— A遺伝子の増幅もまた、上記実験において使用した同一の対応する腫瘍 Z正常試料由来のゲノム DNAを用いたリアルタイム定量 PCRにより試験した。図 4Cに示されるように、腫瘍において、増幅は観察されなかった。これらの結果は、 CENP— Aの過剰発現が、転写レベルで起っていたことを示す。

大部分の癌において、染色体が減少しているかまたは増大していることが示されており、いくつかの結腸直腸癌細胞株は、しばしば多染色体性である（L eng aue r, C. e t a l . , Na t u r e, 396 : 643-64 9, 1998) 。これらの観察は、 CENP— Aの過剰発現が倍数性の結果であり得るかという疑問を投げかける。この疑問に取り組むために、正常細胞および腫瘍細胞の F I SH分析を、いくつかのセントロメァプローブを用いて実施した。 CENP— Aを過剰発現する 3つの結腸直腸癌由来の夕ツチプレパレーシヨンを獲得し、そして第 7、第 8、第 12および第 15染色体に対するセントロメァシグナルの数を計数した（表 2) 。

表 2 直腸結腸癌組織の FISH分析

正常腫瘪 1 . 腫瘍 2 腫瘍 3 染色体数（％) ■ 染色体数（％) 染色体数（％〉染色体数（％)

1 2 ≥3 1 2 ≥3 1 2 ≥3 1 2 >3 第 7染色体 16.5 82.5 1.0 3.7 7,4 88.9 11.6 82.0 6.4 3.1 47.7 49.2 第 8染色体 18.2 77.8 4.0 4.8 14.4 80.8 23.6 71.9 4.5 8.4 77.9 13.7 第 12染色体 13.9 84.5 1.6 2.1 12.3 85.6 12.7 82.6 4.7 10.0 74.3 15.7 第 15染色体 19.4 77.7 2.9 21.8 49.1 29.1 20.3 65.6 14.1 14.9 76.2 8.9 試験しナ::染色体の各々について、染色体数（％) を示す。症例 1は、非常に異数性であるが、症例 2および症 3は、ほぼ 2倍体である。倍数性細胞は、正常組織においてほとんど観察されなかったが（1〜4%) ；対照的に、 3つの腫瘍は全て、少なくとも 1つの染色体において倍数性を示した。腫瘍 1において、第 7、第 8、および第 1 2染色体の 80%より上が倍数性であったのに対し、腫瘍 2においては第 1 5染色体のみ（14. 1 %) 、そして腫瘍 3においては第 7染色体のみ（49. 2%) が倍数性であった。このことは、必ずしも腫瘍細胞の全てが高度に倍数性ではないことを示唆する。これらの結果は、 CENP— Aの過剰発現が、結腸直腸癌における倍数性の結果にとどまらないことを示している。

CENP—Aが、癌細胞において過剰発現され、周囲の間葉細胞において過剰発現されなかったかどうかを調査するために、結腸直腸癌組織および近傍の正常組織の組織切片を、抗ヒト CENP— Aモノク口一ナル抗体を用いて染色した（And o， S. e t a 1. , Mo 1. C e l l . B i o l . , 22 : 222 9 -2241, 20 0 2) 。 CENP— Aは、核において分散したドットとして存在した。これは、正常細胞および腫瘍細胞の両方におけるセント口メァー動原体染色について代表的に見られる。顕微鏡下でのいくつかの組織切片の試験は、正常上皮細胞と比較して、腫瘍細胞において CENP— A染色が増加することを示す。このことは、 CENP— Aが腫瘍細胞において実際に増加していることを示す（図 5 Bおよび図 5 D) 。

上記の観察は、過剰発現された C ENP— Aが腫瘍細胞の何処に局在化しているのかという重要な疑問を投げかける。 CENP— Aは、動原体の中心的な構成成分として知られており、他の動原体タンパク質のサブセットを動員する < 従って、 CENP— Aの誤局在化（m i s 1 0 c a 1 i z a t i o n) は、異所性のセントロメァ形成を引き起こし得、染色体の誤分離の原因となり得る。この仮説を試験するために、組織切片を、抗 CENP— A抗体および抗 CEN P— B抗体で同時染色し、そして個々の細胞を、高倍率で試験した（図 6A) , CENP— Bがセントロメァ αサテライト DN Αに結合することを考慮して、 CENP— Bをセントロメアマ一力一として使用した。ほとんど全ての CEN P— Aシグナルおよび CENP— Bシグナルは、正常細胞において同時に存在したのに対して、 CENP—Aの 10%より多くが、腫瘍細胞において CEN P— Bと同時に存在しなかった（図 6 Aおよび図 6 B) 。この結果は、 CEN P— Aが、非セントロメァ染色体領域と結合することだけでなく、ネイティブのセントロメァから分離することを示唆する。結果のまとめ

本発明の CENP-A (配列番号 4) の癌組織および正常組織での発現をウェス夕ンブロットによって分析した結果は図 3に示したとおりである。 11例の大腸癌患者の癌組織（T) および正常組織（N) を比較したところ、癌組織において CENP-Aタンパク質の特異的発現が確認された。

本発明の CENP- Aをコードする遺伝子の転写産物（mRNA) の癌組織および正常組織での転写を RT-PCRによつて分析した結果のまとめは、図 4に示したとおりである。 11例の大腸癌患者の癌組織 (T) および正常組織（N) からの

CENP-A mRNAの転写を比較したところ、癌組織細胞において CENP- A mRNAの特異的発現が確認された。

この報告の中で、本発明者らは、動原体タンパク質 CENP— Aが原発性結腸直腸癌において過剰発現されている証拠を初めて示した。本発明者らは、腫瘍細胞において過剰発現された CENP _ Aが、染色体の非セントロメァ領域に誤標的化されている可能性があることを見出した。さらに、 CENP— Aは、特定の染色体のセントロメァから消失しており、このことは、ネイティブの動原体複合体の破壊を示唆する。これらの観察は、結腸直腸癌における染色体の不安定性の理解に新たな見識を提供する。近年、多くの遺伝子が、酵母細胞において変異された場合に染色体の誤分離を引き起こすことが同定された（S p e n c e r, F. e t a 1. Ge ne t i c s, 124 ： 237-249, 1990 ; Yanag i da, M. e t a l. , B i o e s s ay s, 17 : 519-526, 1995) 。 STK1 5/BTAKZa u r o r a 2、 Bub l、 Mad 2、および v—セキュリンは、それらの機能障害により異数性を誘導し、それに加えて、染色体の凝縮、姉妹染色分体の付着および動原体の構造を含むいくつかのプロセスにおける欠損もまた、異数性を引き起こし得る。いくつかの動原体タンパク質（例えば、 CENP— Fまたは I NCENP) が、ヒト癌細胞においてアップレギユレ一トされていたが（d e 1 a Gu a r d i a, C. e t a 1. He ad Ne c k, 23 : 104-112, 2001 ； Ad ams, R. R. e t a 1. Ch r omo s oma, 110 : 65-74, 2001) ；これらのタンパク質の真の機能はまだ不明確であった。対照的に、 CENP— Aは、セントロメァ機能に必須のタンパク質である。 CENP— Aは、セントロメァ特異的ヌクレオソームにおいてヒストン H3と置き換わることにより、セントロメァクロマチンと他のクロマチンを区別する（Yod a， K. e t a 1. P r o c . Na t l . Ac ad. S c i. USA, 97 ： 7266-7271, 20 00) 。さらに、 CENP—Aは、セントロメァへの他の動原体タンパク質の動員に必要とされる（Howman, E. V. e t a 1. , P r o c . N a t 1. Ac ad. S c i. USA, 97 : 1148— 1153， 2000) 。従って、 CENP— Aの不適切な発現は、異常な動原体機能および染色体誤分離を誘導し得る。

CENP一 Aの過剰発現が異数性の原因であるならば、それは如何なる機構なのか？ 1つの説明は、異所性のセントロメァ形成であり得る。 Van Ho o s e rら（Van Hoo s e r, A. A. e t a 1. , J . C e 1 1. S c i. , 114 : 3529-3542, 2001) は、近年、 H e L a細胞における C EN P— Aの過剰発現が、全長染色体へのその組込みを生じ、そしてクロマチンの非セントロメァ領域に、セントロメァー動原体構成成分のサブセットを動員し、動原体複合体前駆体を生成することを実証した。結腸直腸癌細胞における状況も同様である。 CENP— Aは、癌細胞において過剰発現され、そして非セントロメァ領域に誤標的された。本発明者らは、有糸分裂細胞が組織切片においてほとんど見られなかったために、 C E N P— Aと染色体全体との結合を観察できなかったことに注意されたい。 He L a細胞における C ENP- A単独での過剰発現は、非セントロメァ染色体領域での完全な動原体集合のために十分ではないけれども、活性な非セントロメァは、いくつかのさらなる機構により結腸直腸癌細胞に集合され得る。従って、結腸直腸癌において変更され得る完全なセン卜ロメァ活性に必須のさらなる因子を見出すことが重要である。

特定のセントロメァからの CENP— Aの欠失は、いくらか予想外のことである。その正確な機構は不明確であるけれども、 CENP— Aの過剰発現は、他のセントロメァー動原体構成成分を枯渴させ、そして動原体複合体を破壊し得る。別の可能性は、クロマチンの非セントロメァ領域への CENP— Aの誤標的化が、染色体のコンホメーシヨンを変更し、それによつて、正常な動原体集合が妨げられ得るということである。実際、 He L a細胞において過剰発現された CENP—Aは、染色体の正染性アーム上で顕著に見出され、特定の染色体の中心付近のへテロクロマチンにおける CENP— Aレベルが減少していた（Van Ho o s e r, A. A. e t a l . , J. Ce l l . S c i . , 1 14 : 3529-3542, 2001) 。結腸直腸癌における C E N P— A の誤標的化の機構および染色体の不安定性への寄与方法を明確にするためには、さらなる調査が必要である。

CENP— Aは、どのようにして結腸直腸癌において過剰発現されるのか？本発明者らは、 CENP— A mRNAもまた増大していることを実証した。このことは、 CENP—Aの過剰発現が、転写レベルで起こることを示す。従つて、いくつかのェンハンサ一タンパク質が活性されているのかもしれないが、このような転写因子またはェンハンサ一エレメントは知られていない。 CEN P— A転写の調節に関する調査が必要である。 CENP— Aの発現はまた、細胞周期において調節されることが知られている。 CENP— Aは、 DNA合成が行なわれた後の G₂期で合成され、セントロメァヌクレオソ一ム集合に重要であり得る（She l by, R. D. e t a 1. ， J. Ce l l . B i o 1. , 151 : 11 13— 1118， 2000) 。 CENP— Aの発現およびセントロメァ集合は、細胞周期の間、緊密に調節されており、この調節の異常は、異数性を誘導し得る。結腸直腸癌細胞株において、細胞周期を通して CE N P— Aの発現レベルを試験することが重要である。

ほとんどの固形腫瘍において見られる染色体の不安定性は、その正確な機構が完全に明らかになった場合、新規の治療標的を提供し得る。潜在的に染色体分離に影響を及ぼす遺伝子は、最も見込みのある候補である。 CENP— Aの過剰発現が腫瘍進行の駆動力であるならば、癌細胞におけるその発現レベルの抑制は、腫瘍の増殖を停止し得る。実際、 CENP— Aに対する抗体の微量注入は、 H e L a細胞を間期で制止する（F i gue r o a, J. e t a 1. Ch r omo s oma, 107 ： 397-405, 1998) 。 CENP - A は、ヒストン H 3に類似の CO OH末端ヒストン折り畳みドメインおよび高度に可変性の NH₂末端ドメインを有する。この独特の NH₂末端ドメインは、抗癌薬を設計するのに有用な標的であり得る。実施例 4 さらなる症例を用いた FIRの解析

次に、さらなる大腸癌患者 3症例（1 18K、 1Κ、 28Κ) から得た試料を用いて、 F I Rを同定し、同定された F I Rについて配列分析を行った。配列決定は、 ΑΒ Iから市販される配列決定機を用いて行った。その結果、症例 1 1 8Kからは、配列番号 1 7および 1 8により特定される配列、症例 1 Kからは、配列番号 1 9および 2 0により特定される配列および症例 2 8Kからは、配列番号 2 1および 2 2により特定される配列が見出された。

これらの配列では、症例 1 1 8 Kにおいて、配列番号 2のアミノ酸配列において、 54位アミノ酸 L e uをコードする CTGが CTTに、 6 7位ァミノ L e u酸をコードする CTTが CTCに、 8 2位アミノ酸 Va 1をコードする G TGが GTAに、 9 0位アミノ酸 H i sをコードする C A Cが C G Cに変異していることが見出された。これらのうち、 9 0位アミノ酸をコードするァミノ酸の変異は、 H i sから A r gに変更されるものであり、機能が障害されていることが予測される。

症例 1 Kにおいては、配列番号 2の 6 9位アミノ酸 Ly sをコードする AA Gが AAAに変異していた。

症例 2 8 Kにおいては、配列番号 2の 1 0 9位アミノ酸 A 1 aをコードする GCCが GCTに、 1 1 3位のアミノ酸 A r gをコードする CGCが CACに変異していた。このうち 1 1 3位の変異は、 A r gが H i sに変異するものであり、機能が障害されていることが示唆される。

このように、配列番号 2のアミノ酸配列において、 1位〜 1 3 5位（配列番号 1の核酸配列では 1位〜約 40 0位）において、癌と関連する変異が多発していることがわかる。従って、この部位における変異を調べることによって、癌診断を行うことが可能である。この知見をもとに、癌診断を別の被験体を用いて行う。 1 0人の被験体を対象に、この実験を行う。これら 1 0人からコンセントを得て血清試料を入手する。血清資料中の F I Rおよび/またはそれに特異的な抗体の存在量を検出する。このうち、配列番号 1 2、 1 4および 1 6の少なくともいずれか 1つの分子の発現が見られる被験体について、大腸組織の生検試料の試験を行うと、癌細胞が認められる。従って、配列番号 12、 14および 16に示される配列を有する分子の存在は、癌の確定診断に使用することができることが示される。同様に、配列番号 2に示される分子について、配列決定を行ってさらなる解析を行ったところ、配列番号 2の 50位〜 120位の間に変異を有する分子を発現している被験体が見出される。この被験体を上記同様に試験試料の試験を行うと、癌細胞が認められる。従って、配列番号 2に示される配列において変異を有する分子の存在は、癌の確定診断に使用することができることが示される。実施例 5 FIRのさらなる解析

次に、 FIRの癌との関連をさらに解析した。

(材料および方法）

(プラスミド）

クロラムフエニコ一ルァセチルトランスフェラ一ゼ (CAT) 遺伝子の上流にじ -my cプロモータ一を含むレポータープラスミドを、 CATアツセィのために使用した（Avigan, M.， I., Strober, B. , and Levens, D. , J. Biol. ■Chem., 265: 18538-18545, 1990) 。全長 F I R cDNA (HA— F I R) および最初の 77アミノ酸が欠失した F I R変異体（HA— F I RAN 77) を、 p C G NM 2ベクタ一プラスミドにクローン化し (Liu, L, Akoulitchev, S. , Weber, A., Ge, H. , C uikov, S. , Libutti, D.， Wang, X. W. , Conaway, J. W., Harris, C. C. , Conaway, R. C.， Reinberg, D.， and Levens, D.， Cell., 104: 353-363, 2001) 、そのァミノ末端に赤血球凝集素（HA) タグを導入した。全てのプラスミドを、 C s C 1超遠心によって調製し、そして配列を確認した。

(ヒト組織試料） ¹ 5症例の原発性結腸直腸癌から、組織を外科的に切除した（表 ₃ ) 。書面でのインフォームドコンセントを手術前に各患者から得た。切除試料を、腫瘍組織およびその腫瘍から 5〜1 0 c mの対応する非腫瘍上皮から、手術によつて切除した後 1時間以内に得た。 2人の病理学者が、全ての組織試料が腺癌であることを顕微鏡によつて確認した。全ての切除組織をすぐに液体窒素に置き、そしてさらなる分析まで一 8 0 °Cで保存した。

|3 おびそれの臨床的、病理学的知見の表

年齢、性別、腫瘍の位置、およびデュークステージを列挙した番号サンプル番号年齢性别位置デュークステージ

1 lc 82 男性 S字笱腸 B

2 5c 46 男性 S字踏腸 A

3 112c 72 男性 s 腸 C

4 117c 49 男性 mh D

5 118c 85 男性 S字結腸 ' B

6 6R 57 男性 S字結腸 ' B

7 17R 68 男-性 S字結腸 D

8 19R 60 女性直腸 B

9 23c 61 女性横行 ¾5 D

10 24c 64 女性 mh C

11 27R 51 男性直腸 D

12 28R 67 男性直腸 C

13 29R 51 男性直腸 C

14 32c 80 男性上行結腸 B

15 35c フ 2 女性 S字結腸 B (トランスフエクシヨンおよびクロラムフエニコールァセチルトランスフエラ一ゼ（CAT) アツセィ）

He L a細胞を、 10% ゥシ胎仔血清を含む D u 1 b e c c o ' s Mo d i f i e d Ea l e' s Me d i um (DMEM, G i b c o-BR L) 中で培養した。細胞を、エレクト口ポレーシヨンによってトランスフエク卜し、トランスフエクシヨンの 48時間後に回収し、そして以前に記載されるように CAT活性についてアツセィした（Tomonaga, T.， and Levens,D., J. Biol. C em. , 270: 4875-4881、 1995) 。

(免疫細胞化学およびフローサイトメトリー分析）

He L a細胞をカバーガラス上でー晚増殖させ、次いで、 L i p o f e c t am i n e P 1 u s試薬（G i b c o B R L) を用いてプラスミドでトランスフェクトした。プラスミドのトランスフエクシヨンの 18時間後、細胞を以前に記載されるように免疫細胞化学のために処理した（He, L.， Liu, J., Collins, I. , Sanford, S. , 0 Connell, B. , Benham, C. J. , and Levens, D.， EMB0 J., 19, 1034-44,2000) 。 HAに対するマウスモノクローナル一次抗体 (S an t a C r u z B i o t e c hno l o gy, CA) および c— My cに対するゥサギポリクローナル一次抗体（Up s t a t e B i o t e c hn o 1 o gy, NY) を、ブロッキング緩衝液中で 1 ： 500および 1 ： 1 , 0 0 0に希釈した（He， L.， Liu, J., Collins, I., Sanford, S,， 0' Connell, B.， Benham, C. J., and Levens, D. , EMB0 J.，19、 1034- 44,2000) 。スライドガラスを室温で 1時間インキュベートした。 PBSでの洗浄後、二次抗体としてローダミン結合体化抗マウス I gG (Ro c h e) またはフルォレセインイソチオシァネート (F I TC) 結合体化抗ゥサギ I gG (S i gma) を、それぞれ、 1 ； 1， 000希釈および 1 ： 500希釈で使用した。 DNAをジアミジノフエニルインドール（DAP I、 1 g/m 1 ) を用いて対比染色し、そして細胞を、免疫蛍光顕微鏡（L e i c a QF I S H ; L e i c a M i c r o s y s t ems, Tokyo, J ap an) の下で観察した。各観察者は、数百個のトランスフエクト細胞を調べ、そして全ての観察者が実験結果に対して合意していた。

細胞を、二色分析のために処理し（He, L., Liu, J., Collins, I., Sanford, S.， 0' Connell, B. , Benham, C. J. , and Levens, D.， EMBO J., 19: 1034-44, 2000) 、 F I Rによる c—my c抑制を定量した。トランスフエクシヨンの 22時間後、細胞を卜リブシン処理し、そして上記と同じ一次抗体を用いて免疫染色した。 PBSでの洗浄後、二次抗体として F I TC結合体化抗ゥサギ I gG (S i gma) および R _ P E -結合体化抗マウス I g G (Ph a rM i n g e n) を、それぞれ 1 ： 200希釈で使用した。各試料の 10， 000個の細胞を、 c—My c— F I TCを FL 1に、そして HA— P Eを FL 2に設定して、フローサイトメトリーを用いて分析した。トランスフェクトした細胞を、 X軸上に示される PEポジティブ細胞として同定した。

(アポトーシスの検出）

アポトーシス細胞を、製造者の指示書（Ap o p t o s i s D e t e c t i on Sy s t em, F l uo r e s c e i n. P r om e g a , W I , U S A) に従って、 TUNELアツセィによって検出した。簡単に言うと、カバ一ガラス上で培養した He L a細胞を、氷上で 1 5分間 4 °Cのパラホルムアルデヒドを用いて固定した。 PBSでの洗浄後、細胞を PBS中の 0. 5% T r i t on— X— 100 (登録商標）溶液を用いて 5分間透過化処理した。 P B Sで 2回洗浄し、 F I TC標識 dUTPを含むターミナルデォキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（TdT) を用いたインサイチュでのニックエンド標識を用いて（MEB STA I N Ap op t o s i s K i t ： M e d i c a 1 & B i o l o g i c a l L ab o r a t o r i e s, J APAN) 、 DNAのヌクレオゾーム内断片化を検出することによって、アポトーシス細胞を可視化した。 1単位/ ml DNa s e I (Ge nHun t e r Co r p o r a t i on, Na s h v i 1 1 e, TN) で処理した He L a細胞をポジティブコントロールとして使用した。 DNAを DAP I I I I Coun t e r s t a i n (Vy s i s, Abb o t t P a r k, I L) を用いて対比染色し、そして蛍光顕微鏡（L e i c a QF I SH ; L e i c a M i c r o s y s t erns, Tokyo, J ap an) の下で観察した。

二色分析のために、細胞をトリプシン処理した後に遠心分離（10分間、 3 00 X g) することによって収集し、そして一 20°Cのェ夕ノ一ルを用いて少なくとも 2時間透過化処理した。細胞を、上記と同じ工程で処理し、そして最終的に、 F I丁標識011；丁？を含む50 1の TdT緩衝液中でインキュべ —トした（MEBSTA I N Ap o p t o s i s K i t ： Me d i c a 1 & B i o l o g i c a l L ab o r a t o r i e s, JAPAN) 。次いで、 250 gの DNa s eフリーの RNa s e Aを含む 0. 5mlのヨウ化プロピジゥム（P I) 溶液（PBS中 5 gZm lに新しく希釈した）中で遠心分離（10分間、 300 Xg) することによって、細胞を回収した。各試料の 10, 000個の細胞を、 F I TCを FL 1に、そして P Iを FL 2に設定して分析した。アポト一シス細胞を、 y軸上に示される高 F I TCポジティブ細胞として同定した。

(タンパク質抽出および免疫プロッティング）

凍結組織試料を、 P o 1 y t r o nホモジナイザ一（K i n ema t i c a, Sw i t z e r l and) を用いて、溶解緩衝液（7M 尿素、 2M チォ尿素、 2% 3— [ (3—コラミドプロピル) ジメチルアンモニォ—] 1一プロパンスルフエ一ト（3— [ (3-Cho l am i d op r o py l) d ime t h y 1 ammo n i o _」 1 _ p r o p a n e s u 1 f a t e ) (CHAP S) 、 0. 1M ジチオトレイトール（DTT) 、 2% I PG緩衝液（Am e r s am Ph a rma c i a B i o t e c h, Bu c k i ngh am p s h i r e, UK) 、 4 OmM T r i s) 中で可溶化し、その後 4°Cで 1 時間遠心分離した（1 0 0, O O O X g) 。上清中のタンパク質量を、タンパク質アツセィ（B i o— R a d， He r c u l e s, CA) によって測定した。タンパク質を、 8 % アクリルアミドゲル上での電気泳動によって分離し、そして転写装置槽（B i o— R a d， He r c u l e s , CA) 中でフッ化ポリビニリデン膜（M i 1 1 i p o r e, B e d f o r d, MA) に転写した。この膜を、 PBS中の 5 % スキムミルクを用いて 1時間ブロックした。それぞれブロッキング緩衝液中に 1 ： 1， 0 0 0ぉょび1 ： 5 0 0に希釈した、ゥサギポリクローナル抗 F I R抗体（Liu, J., He, L. , Collins, I., Ge, H.， Libutti, D. , Li, J., Egly, J., and Levens, D.， Mol. Cell, 5, 331-341, 2000) およびャギポリクローナル抗 j3—ァクチン抗体（S an t a C r u z, S an t a C r u z , C A) を、一次抗体として使用した。 1 : 3, 00 0 に希釈したャギ抗ゥサギ I gG西洋ヮサビペルォキシダーゼ結合体（HRP)

(J a c k s on, We s t G r o v e, PA) および 1 : 5 0 0に希釈したゥサギ抗ャギ I gG HRP (C a p p e 1 , We s t Ch e s t e r, PA) を、二次抗体として使用した。膜上の抗原を、 ECL^TM検出試薬（Am e r s h am P h a rma c i a B i o t e c h) によって検出した。各バンドの強度を、 N I H画像によって測定した。

(逆転写酵素（RT) — PCRおよびリアルタイム定量 PC R)

総 RNAおよびゲノム DNAを RNe a s y^TM M i n i 1^ 1 1:ぉょび0 Ne a s y™ T i s s u e s K i t (Q i a g e n) を用いて、腫瘍および非腫瘍上皮組織から抽出した。 1 ^{s t} s t r a n d c DNA S yn t h e s i s K i t f o r RT-PCR (Ro c h e, Ma nn h e i m, Ge rma ny) を用いて、総 RNAから c DNAを合成した。この c DNA をテンプレートとして使用して、 F I R c DNAを RT— P CRによって適切なプライマーを用いて増幅した：

順方向： 5 ' -GGCCCCATCAAGAGCATC- 3 ' (配列番号 7) 逆方向： 5' -GGGGCTGGGCCAGGGTCAG- 3 ' (配列番号 8) 。

コントロールのために、 GAPDH cDNAを増幅した。

L i gh t Cyc l e r ^TM装置（Ro c he, Mannhe im, Ge rm any) を用いた F I R c DNAのリアルタイム定量 P CRを、 L i gh t Cy c 1 e r ^TMキヤビラリ一中で、 F a s t S t a r t Ta q DNAポリメラーゼ、 dNTP混合物、および緩衝液 (L i gh t Cyc l e r™ DN A Ma s t e r hyb r i d i z a t i on p r ob e、 Ro c he) を含むマスタ一ミックス（L i gh t Cy c 1 e r™-F a s t S t a r t DNA Ma s t e r S YBR Gr e en 1) 、 3. OmM MgC 1 ₂、 0. 5 Mの各センスプライマ一およびアンチセンスプライマー、ならびに 1のテンプレート c DNAからなる 20 1の反応混合物中で実行した。 L i g h t Cy c 1 e r ^TMソフトウェアパージヨン 3. 3 (Ro c he) を、定量 RT— PC Rの分析のために使用した。プライマ一および L i gh t Cy c 1 e r ^TM条件の最適化を、 N i hon Gene Re s e a r c h L a bo r a t o r i e s I nc. (S end a i , J ap an) にて実行した。リアルタイム定量 PC Rによる F I R c DNA増幅のためのプライマ一は、以下の通りであった（PC R産物のサイズは、 275塩基対である）：

順方向： 5 ' -GCACCTGGAGTCATCACA- 3 ' (配列番号 27 )

逆方向： 5 ' -CGCAGAACCATCACTGTAG- 3， (配列番号 28) 。

これらのプライマーによる PCR産物を、 L i gh t Cy c 1 e r^TMの定量曲線を決定するために精製した（Q i a g e n PCR p r oduc t p u r i f i c a t i on k i t) 。 F I Rゲノム DNAもまた、以下のプライマ一を用いてリアルタイム PCRによって定量した：

順方向： 5， - GGAGTCTACAGTGATGGTTC - 3 ' (配列番号 29 )

逆方向： 5' -TCCTGGTCGTACACTTCA- 3 ' (配列番号 30) 。ヒト c一 my c cDNAおよびヒト j3—ァクチン cDNAに対するプライマーは以下の通りであった：

順方向： 5 ' -GCCTCAGAGTGCATCGAC- 3，（ c一 my c ) (配列番号 31) 、逆方向： 5 ' — TCCACAGAAACAACATCG - 3， (c -my c) (配列番号 32) 、順方向： 5 ' — TGGAGAAAATCTGGCACCAC - 3 ' (j3—ァクチン）（配列番号 3

3) 、

逆方向： 5，一 AATGGTGATGACCTGGCCGT一 3' ( 3—ァクチン）（配列番号 3

4) 。

(結果）

(F I Rのァミノ末端抑制ドメインは、 c一 my c発現を抑制するのに必要である）

これまでの研究によって、 F I Rがァクチべ一夕一依存性の転写リブレッサ一であることが明らかになつている。 F I Rが、 FBPの力ルポキシル末端領域中に見出される強力な転写ァクチべ一夕一およびウィルスタンパク質 E 1 a によって刺激される転写をブロックするのに対し、別のウィルス因子（VP 1 6) による転写活性化を鈍らせない。 F I Rの最初の 55アミノ酸が、活性化された転写を抑制するのに必要とされた。全長 F I Rもまた、トランスフエク卜されたレポ一夕一プラスミドの c一 my cプロモータ一からの転写を抑制した。 c -my cプロモーターの F I R抑制に対するァミノ末端の必要性を確認するために、全長 F I R (1 - 542) またはそのアミノ末端抑制ドメインが欠失した F I Rである F I RAN77 (78〜542) を、 c— my cプロモ一夕一によつて駆動される CATレポ一夕一プラスミドと共にコトランスフエク卜し、そして CAT活性についてアツセィした。全長 F I Rは用量依存様式で CAT発現を強力に阻害したが、そのアミノ末端を欠失させることによって (F I RAN77) リブレッサー活性が減弱した（図 7) 。従って、ネィティブな F I Rは c -my c転写のァクチベータ一依存性転写リプレッサ一のようであるが、 c一 my cレポーターは、信頼できないことが知られている（Liu， J., He, L.， Collins, I.， Ge， H. , Libutti, D.， Li, J., Egly, L， and Levens, D.， Mol. Cell, 5: 331-341, 2000 ; ならびに He, L, , Liu, J., Collins, I. , Sanford, S. , 0' Connel 1, B. ,Benham, C. J. , and Levens, D. , EMB0 J.，19、 1034-44,2000) 。従って、内因性 c— M y c発現の F I R抑制を調べた。 HAでタグ化した全長 F I R (HA— F I R) を、 He L a細胞および U— 2 OS細胞中で発現させ、そして c— My c発現を、抗 c— My c抗体を用いた免疫染色によって可視化した（図 8 A： HA-F I Rまたは HA— F I RAN 77は赤色であり； c一 My cは緑色である）。 c -My cレベルは、 HA— F I R発現細胞（矢印）中で大きく減少したが、 HA— F I RAN 77細胞（矢じり）においては変化がなく、このことは、 F I Rが細胞自律機構を介して内因性 c—My c発現を抑制することを実証する。内因性 c一 My cのこの抑制を裏付けるために、 HA— F I Rを HeL a細胞にトランスフエク卜した。二色 FAC S分析を用いて c -My cレベルおよび HA— F I Rレベルを調べることによって、 F I Rが、広範囲の細胞集団において（図 8B、上段の囲んだ領域） c _My cを効果的に低下させたことを実証した。 HA— F I Rポジティブ集団内において、 c -My cレベルは、この囲んだ領域において明らかに 2つのモードを有した（図 8B、上段左）。 c一 My cレベルは、 HA-F I Rをトランスフエクトした細胞中で急激に抑制された。 HAベクタ —プラスミドにおいて、 c一 My cレベルは、トランスフエクト細胞と非トランスフェクト細胞との間で一様に識別不可能であった（図 8B、上段右）。

(F I Rのァミノ末端は、アポトーシスの誘導に必要とされる）

c一 my c発現のダウンレギュレーションは、細胞アポトーシスを誘導することが報告されている（Tho即 son, E. Β·， Ann. Rev. Physiol., 60, 575-600, 1998; Thulasi, R.， Harbor, D. V. , and Tho即 son, E. B.， J. Biol. Chem. , 268, 18306-18312, 1993; Zhou, F., Med , R. D.， and Tho即 son, E. B.， J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 73, 195-202, 2000; Thompson, E. A. Cancer Res., 51, 5544-5550, 1991; Helmberg, A. Auphan, N. , Caelles, C. and Karin, M. , E BO J., 14 452-60, 1995; McCormack, J., E, Pepe, V., H Kent, R. , B. , and Dean, M. , Marshak-Rothstein, A. , Sonenshein, G, E" Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 81, 5546-5550, 1984; Sonenshein,

G. , E. J. Immunol., 158 1994-1997, 1997; Fischer, G. , Kent, S. , C. , Joseph, L. Green, D. , R. , and Scott, D. W. , J. Exp. Med., 179, 221- 228, 1994; u, M. , Arsura, M. Bellas, R. , E. , FitzGerald, M. , J., Lee,

H, Schauer, S. L. Sherr, D. H. and Sonenshein, G. , E. , Mol. Cell. Biol., 16 > 5015-5025, 1996; ならびに、 D' Agnano, I., Valentini, A.

Fornari, C. , Bucci, B. , Starace, G. Felsani, A., and Citro, G. , Oncogene. , 20, 2814-2825, 2001) F I Rはネイティブな c—my c発現を抑制するので、本発明者らは、 F I Rの強制発現もまたアポトーシスを誘導するか否かを試験した。全長 F I R (HA-F I R) およびそのアミノ末端欠失 (HA-F I RAN 77) を、 H e L a細胞にトランスフエクトし、そしてァポトーシス活性を TUNE Lアツセィによって調べた（図 9A) 。予想したように、 HA— F I Rは、 DNAの断片化を伴なうアポトーシスを誘導し（図 9 A；矢印のある上段のパネル）、一方で HA— F I Ι ΔΝ77をトランフエクトした細胞（図 9 A；中段）および HA空ベクターをトランスフエクトした細胞（図 9A ;下段、コントロール）においてアポトーシスはほとんど生じなかった。全長 HA— F I Rによって駆動されるアポト一シスの程度は、フローサイトメトリ一分析で評価した場合 16. 5%であったが、 HA— F I RA 7 7および HA空ベクターをトランスフエクトした場合、それぞれたった 6. 6%および 2. 0%に低下しなかった（図 9B) ？161^ &細胞中の^1八—？ I Rタンパク質および HA— F I RAN 77タンパク質の同等な発現は、ゥェスタンプロットによって確認した（データには示さない）。これらの結果は、 F I Rの強制発現が、おそらく c— my c抑制に起因して、アポトーシスを誘発することを証明する。

(F I Rは、 c—My cの増加と関連する結腸直腸癌において逆にアップレギュレートされる）

c—My cが、調節されない c一 my c発現に起因して大多数の結腸直腸癌において増大していることは、周知である（Erisman, M. D.， Rothberg, P. G., Diehl, R. E.， Morse, C. C.， Spandorfer, J. M.，および Astrin, S. M.， Mol. Cell. Biol., 5, 1969-1976, 1985; Imaseki, H.， Hayashi, H.， Taira, M.， Ito, Y. , Tabata, Y.， Onoda, S.， Isono, K. , および Tatibana, M.， Cancer., 64, 704-709； 1989; および、 Tsuboi, K. , Hirayoshi, L, Takeuchi, K.， Sabe, H.， Shimada, Y. , Ohshio, G.， Tobe, T. , ならびに、 Hatanaka, M. , Biochem. Biophys. Res. Co腿 un. , 146, 699-704, 1987) 。従って、本発明者らは、癌細胞中の c一 my c発現は F I Rの抑制性の影響を回避する必要があるとの仮説を立てた。 F I R自体は、癌においてダウンレギュレートされ得るか；あるいは、転写およびアポトーシスにおける F I Rのエフェクター作用は、無効とされ得る。 F I Rが結腸直腸癌中でダウンレギュレートされるか否かを試験するために、 10症例からの腫瘍組織および正常組織中の F I Rタンパク質レベルを、免疫プロットによって調べた。驚くべきことに、 F I Rレベルは、対応する非腫瘍上皮と比較して、ほとんどの結腸直腸癌組織において実際に増大していた（図 10A) 。これらの F I Rレベルの増加が F I R mRNAレベルの増加から生じたか否かを決定するために、結腸直腸癌細胞および正常結腸上皮由来の RNAを、 RT— PC Rによって調べた（図 10B) 。症例 5を除く全ての症例において、非腫瘍組織と比較して腫瘍においてより高い F I R mRNAレベルが示された。 F I Rの mRNAレベルおよびタンパク質レベルは、全ての症例において互いに対応していた。結腸直腸癌細胞中の F I R m RNAレベルの増加を、リアルタイム定量 RT— PC Rによってさらに確認した（図 10 C) 。 F I R遺伝子の増幅もまた評価したが、増幅観察されなかつた。ゆえに、 F I Rタンパク質の増加は、結腸直腸癌における F I R mRN Aの転写の増加または安定性の増加のいずれかを反映する。

これらの結果は、結腸直腸癌における c -my cの調節不全が、 F I Rのダゥンレギュレーションによるのではなく、おそらく、欠損した F I R機能を反映するということを示唆する。従って、結腸直腸癌において観察された F I R の過剰発現は、無益なネガティブフィードバック機構を表し得る。実際、 F I R mRNA発現のレベルは、 c一 my cのレベルと有意に相関する（図 10 D) 。 c一 My cの過剰発現は、細胞の成長、増殖および不死化を促進することが長い間知られている。さらに、 c— My cの減少は、アポトーシスを誘導する。本発明は、 F I Rが内因性 c一 my cの転写を強力に抑制し、そしてアポトーシスを誘導することを実証する。 F I Rァミノ末端リブレッサ一ドメインの欠失は、そのプロアポトーシス作用を抑止し、このことは、 F I Rがおそらく、 c—my cを含むその標的の転写ダウンレギユレーションを介して細胞を死滅させることを示す。 c— Mycは、 F I Rレベルの増加にかかわらず、ほとんどの結腸直腸癌腫において上昇している。従って、おそらく c一 mycは、いくつかの遺伝的な変化または後成的な変化によって、 F I Rによるダウンレギユレ一シヨンを回避することが可能となる。おそらく、これらのいくつかの変化は、腫瘍細胞における F I R誘導性アポト一シスを減弱することによって、腫瘍進行に寄与する。

特定の状況下で、 c一 my cの過剰発現または c一 my cの過少発現は、ァポト一シスを誘導する。持続的な高レベルの c—my c発現は、血清中の有糸分裂促進因子のシグナルを除去するか、または規定された増殖因子を欠損させると、アポト一シスを誘発する（Tho即 son, E. B. ， Ann. Rev. Physiol., 60:575-600, 1998)。逆に、例えば、ダルココルチコイド（Thulasi, R.， Harbor, D. V., and Tho即 son, E. B,， J. Biol. Chem. , 268， 18306-18312, 1993;Z ou, F.， Medh, R. D. , and Tho即 son, E. B.， J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 73, 195-202, 2000;Tho即 son, E. A.， Cancer Res., 51， 5544- 5550, 1991;ならびに、 Helmberg, A., Auphan, N. , Caelles, C, , and Karin, M.， EMBO J., 14， 452-60, 1995)、表面レセプターの活性化 (McCormack, J.， E, Pepe, V. , H, Kent, R. , B.， and Dean, M. , arshak-Rothstein, A.， Sonenshein, G, E. , Pro Natl. Acad. Sci. U S A., 81、 5546-5550, 1984;Sonenshein, G. , E.， J. Immunol., 158, 1994-1997, 1997;Fischer, G. , Kent, S.， C. , Joseph, L. , Green, D. , R.， and Scott, D.， W. , J. Exp. Med., 179, 221-228, 1994;ならびに、 Wu, M Arsura, M., Bellas, R. , E. , FitzGerald, M. , J., Lee, H. , Schauer, S. , L. , Sherr, D. , H. , and Sonenshein, G. , E.， Mol. Cell. Biol., 16, 5015-5025, 1996) 、または他の化学物質（Ayala-Torres, S.， Zhou, F.， and Tho即 son, E. B.， Exp. Cell. Res., 246, 193-202, 1999; Lerga, A., Belandia, B. , Delgado, M. D.， Cuadrado, M. A.， Richard, ， Ortiz, J. M. , Martin-Perez, J. , and Leon, J.， Biochem. Biophys. Res. Commun. , 215, 889—895， 1995; Ohta, H.， Sweeney, E. A.， Masamune, A. , Yatomi, Y. , Hakomori, S. , and Igarashi, Y.， Cancer Res., 55, 691-697, 1995; Davidoff, A. N. , and Mendelow, B. V., Anticancer Res., 13:2257-2260, 1993; Sumitani, K. , Kami jo, R. , and Nagumo, M. , Anticancer Res. , 17, 865-871, 1997; ならびに、 Fornari, F. A. Jr, Jarvis, W. D.， Grant, S. , Orr, M. S. , Randolph, J. K. , White, F. K. , Mumaw, V. R. , Lovings, E. T. , Freeman, R. H. , and Ge irtz, D. A., Cell. Growth. Differ., 5, 723-733, 1994) による c—my cのダウンレギユレーシヨンもまた、アポトーシスを誘導し得る。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドによる c -my c mRNAの直接的な低下がアポトーシスを引き起こし、このことは、 Bリンパ球細胞株および Tリンパ球細胞株において最も調べられている（Th omp s on, E. B. , Ann. Re v. P h y s i o l . 60 ： 575-600, 1998) 。本明細書中において、本発明者らは、 c— My cの抑制が He L a細胞においてアポトーシスを誘導することを報告し、このことは、 c一 My cが細胞増殖を促進し、そして細胞死をブロックするという考えを支持するものである。

本発明者らは、 F I Rが c一 My c抑制を介して直接アポト一シスを誘導するか否かに興味を持った。 F I Rは XPBZp 89ZERCC 3に結合するので、 F I Rのアポ] ^一シス活性は、 XPB/p 89ZERCC 3を介して媒介され得る。実際、 XPBZp 89ZERCC 3および XPDZERCC 2は、両方とも TF I I Hの DN Aヘリカーゼーサブュニットであり、そして p 53 媒介アポ! ^一シス経路に関与すると考えられている（Wang, X. W. , Vermeulen, W. , Coursen, J. D. , Gibson, . , Lupoid, S. E., Forrester, K. , XU, G. , Elmore, L. , Yeh, H. Hoei jmakers, J. H. , and Harris, C. ， Genes Dev. , 10, 1219-1232, 1996 ) X P B Z p 8 9 Z E R C C 3 は、 p 5 3 (Leveillard, T. , Andera, L. , Bissonnette,N. , Schaef fer,L. , Bracco.L. , Egly, J.M., and asylyk, B. , EMBO J. , 15, 1615-1624, 1996) と相互作用し、そして p 53媒介アポ! ^一シスは、 XPB/p 89 /E R C C 3に変異を保有する色素性乾皮症（XP) の個体由来の初代ヒト繊維芽細胞において減弱される（Wang, X.W. , Vermeulen, W. , Coursen, J. D. , Gibson, M. , Lupoid, S. E Forrester, K. , XU, G. , Elmore, L. , Yeh, H. , Hoeijmakers, J. H. , and Harris, C. C. Genes Dev. , 10, 1219-1232, 1996) p 53は、 TF I I Hへリ力一ゼ活性を阻害し、そして損傷を受けた D N Aの修復を停止させてアポト —シスを誘導する（Robles, A. I., Wang, X. W. , and Harris, C. ， Oncogene. , 18: 4681-4688, 1999) F I Rが TF I I Hに直接作用してアポトーシスを誘発するのか、または細胞死が F I Rによる転写抑制の二次的な結果であるのかを決定するために、さらなる研究が必要である。

F I Rは、 c -my cと共に結腸直腸癌組織中で過剰発現し、このことは、 F I R抑制がこれらの癌において欠けていることを示す。本発明者らは、この抑制の欠損の機構について興味をもった。その 1つの可能性としては、異常な事象が、直接または F I Rが機能するために必要とされる経路もしくは補助因子を無能にすることによって、 F I Rのリブレッサー機能を無能にするという可能性が考えられる。そして高レベルの c—My cは、 F I Rをアップレギュレーシヨンすることによって、 c _my c発現を適切なレベルまで低下させるための、無益な試みを誘発する。例えば、腫瘍リブレッサーである遺伝子 p 5 3は、癌において高度に変異され、そして変異 p 5 3タンパク質は、多くの腫瘍細胞において蓄積している (Bazan,V., Migliavacca, M.， Tubiolo, C. , Macaluso, M.， Zanna, I. , Corsale, S. , Amato, A., Calo, V. , Dardanoni, G, Morel lo， V. , La Farina, M.， Albanese, I. , Tomasino, R. M. , Gebbia, N., and Russo, A. , J. Cell. Physiol. , 191 :237-246, 2002) 。 WT 1は、いくつかの腫瘍細胞におけるその変異がタンパク質の蓄積を導く別の例である（Loeb, D. M., and Sukumar, S. , Int. J. Hemotol., 76, 117-126, 2002;ならびに、 Oj'i, Y., Ogawa, H. , Tamaki, H.， Oka, Y. , Tsuboi, A., Kim, E. H. , Soma, T. , Takekawa, T. , Kawakami, M. , Asada, M. , Kishimoto, T.， and Sugiyama, H.， Jpn. J. Cancer res. , 90, 194-204, 1999) 。別の可能性としては、 TF I I Hの機能が、結腸直腸癌において損傷し、その結果、 F I Rが c -my cを抑制し得ないという可能性である。 TF I I Hは、 2つの独立した機能（基礎的な転写の開始および DN A修復）を有することが知られている（Lehmann, A.R., Genes Dev. , 15, 15-23, 2001) 。 TF I I Ηの遺伝的な変異を有する X Ρ 患者は、皮膚癌の高い危険性を有することが、周知である。さらに、近年の研究によって、 XPD遺伝子における多型が、正常な集団であっても、皮膚癌の危険性を増大させることが実証された（Dybdahl, M., Vogel, U.， Frentz, G. , Wall in, H. , and Nexo, B. A.， Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. ,8:77- 81, 1999 ；ならびに、 Tomescu, D. , Kavanag , G. , Ha, T.， C卿 bell, H" and Melton, D. W. , Corcinogenesis. , 22, 03-408, 2001) 。 DNA損傷の修復ができないことは X P患者において癌の危険性が高いことの主要な原因であるが、転写調節の欠損が癌発生に寄与し得る。

これらの結果は、結腸直腸癌腫における c一 my c活性化の機構についての新しい考察を提供するだけでなく、腫瘍の処置のための新規治療標的を明らかにし得る。非腫瘍細胞において、 c_mycは、一般的に腫瘍細胞と比較して発現が低く、このことは、 F I Rによる c _ m y c抑制に起因する副作用が正常細胞において少ないことを示す。腫瘍の処置に加えて、 c— Mycはまた、動脈硬化の進行の観点から心血管疾患において、中枢となる役割を果たす。 F I Rによる c一 My c抑制は、新生物疾患および心血管疾患の両方に対する治療のための手がかりを本発明者らに提供し得る。

(実施例 7)

次に、正常型 FIR (配列番号 2) に示す配列を有するポリペプチドを、任意の公知の方法を用いて組換え産生する。このポリペプチドを、 5mgZkgの投与量で結腸直腸癌の細胞を有する被験体にコンセントを得て投与する。

被験体の経過観察を行うと、癌が退行していくことがわかる。従って、本発明の正常型の F I Rは、癌治療剤として有用なことがわかる。以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。産業上の利用可能性

以上詳しく説明したとおり、本願の発明によって、大腸癌の診断用マーカ一として有用な新規抗原ペプチド 2種と、これらを用いた大腸癌診断方法が提供される。これによつて、大腸癌の早期かつ高精度の診断が可能となる。これらは、製薬業界のみならず、種々のサービス業において利用可能であり、有用性に富む。

Claims

請求の範囲

1. (a) 配列番号 1に記載の塩基配列もしくはその相補体またはそのフラグメント配列を有する、ポリヌクレオチド；

(b) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド、

(e) (a) 〜（c) のいずれか 1つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも 7 0 %である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリぺプチドをコ一ドするポリヌクレオチド、

を含む、核酸分子。

3. 前記生物学的活性は、 FBPに結合する能力である、請求項 1に記載の核酸分子。 4. 前記 F B Pに結合する能力は、配列番号 2における 3 72位〜 442位に記載される配列によって規定される、請求項 3に記載の核酸分子。

5. 請求項 1に記載の核酸分子に対して特異的な因子。

7. 前記因子は、少なくとも 8の連続するヌクレオチド長を有する核酸分子である、請求項 6に記載の因子。 8. 前記因子は、核酸分子であり、プライマ一として使用される、請求項 5に記載の因子。

9. 前記因子は、プローブとして使用される、請求項 5に記載の因子。 10. 前記因子は、標識されているかまたは標識され得る、請求項 5に記載の因子。

1 1. 前記標識は、蛍光、リン光、化学発光、放射能、酵素基質反応および抗原抗体反応からなる群より選択される技法を利用する、請求項 10に記載の因子。

12. 配列番号 1で示される配列またはその相補体を含む、請求項 1に記載の核酸分子。 13. (a) 配列番号 1またはその相補体において置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも 1つの改変を含む配列；または (b) 配列番号 1 1、 13および 15からなる群より選択される少なくとも 1つの配列もしくはその相補体、または該少なくとも 1つの配列もしくはその相補体において置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも 1 つの改変を含む配列、

を含む、請求項 1に記載の核酸分子。

14. 前記改変は、置換；配列番号 1の 369位と 370位との間もしくは配列番号 1 5の 176位と 1 77位との間への付加；あるいは配列番号 1の 36 9位までもしくは配列番号 1 1の 305位までまたは配列番号 13もしくは配列番号 1 5の 176位までにおける欠失；あるいはそれらの組合せである、請求項 13に記載の核酸分子。

1 5. 前記改変は、配列番号 1の 5' 末端から約 400塩基までの範囲内に存在する、請求項 13に記載の核酸分子。

16. 前記改変は、配列番号 1における約 1 50位〜約 360位の範囲内における改変である、請求項 13に記載の核酸分子。

17. 前記改変は、配列番号 1において、コードするアミノ酸の非保存的置換を含む、請求項 13に記載の核酸分子。

18. 配列番号 1 1、 13、 1 5、 17、 1 9および 2 1からなる群より選択される配列を含む、請求項 13に記載の核酸分子。 19. 請求項 12に記載の核酸分子に対して特異的な因子。

20. 請求項 1 3に記載の核酸分子には特異的に反応しない、請求項 19に記載の因子。

22. 前記因子は、少なくとも 8の連続するヌクレオチド長を有する核酸分子である、請求項 19に記載の因子。 23. 前記因子は、核酸分子であり、プライマ一として使用される、請求項 1 9に記載の因子。

27. 請求項 1 3に記載の核酸分子に対して特異的な因子。

28. 請求項 1 2に記載の核酸分子には特異的に反応しない、請求項 27に記載の因子。

2 9 . 前記因子は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子からなる群より選択される、請求項 2 7に記載の因子。

3 0 . 前記因子は、少なくとも 8の連続するヌクレオチド長を有する核酸分子である、請求項 2 7に記載の因子。

3 1 . 前記因子は、核酸分子であり、プライマーとして使用される、請求項 2 7に記載の因子。 3 2 . 前記因子は、プロ一ブとして使用される、請求項 2 7に記載の因子。

3 3 . 前記因子は、標識されているかまたは標識され得る、請求項 2 7に記載の因子。 3 4 . 前記標識は、蛍光、リン光、化学発光、放射能、酵素基質反応および抗原抗体反応からなる群より選択される技法を利用する、請求項 3 3に記載の因子。

3 5 . A) 請求項 1に記載の第一核酸分子に対して特異的な第一の因子；および

B ) 該第一の因子に起因するシグナルを用いて該第一核酸分子の発現量を測定するための手段であって、癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分における該第一核酸分子の発現量に比較して対象の被験体の対象部分における該第一核酸分子の発現が高い場合、該対象の被験体は癌のハイリスク者であると診断する、手段、

を備える、癌診断キット。

3 6 . 前記癌は、 c -my c高発現癌を含む、請求項 3 5に記載のキット。 3 7。前記癌は、直腸癌および結腸癌を含む、請求項 3 5に記載のキット。

3 8 . 癌診断方法であって、

A) 対象の被験体の対象部分からの試料を提供する工程；

B ) 該第二の因子に起因するシグナルを用いて該第二核酸分子の発現量を測定するための手段であって、癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分における該第二核酸分子の発現量と、対象の被験体の対象部分における該第二核酸分子の発現量とが異なる場合、該対象の被験体は癌のハイリスク者であると診断する、手段、

を備える、癌診断キット。

4 0 . 前記癌は、 c一 my c高発現癌を含む、請求項 3 9に記載のキット。 4 1 . 前記癌は、直腸癌および結腸癌を含む、請求項 3 9に記載のキット。

4 2 . 癌診断方法であって、

A) 対象の被験体の対象部分からの試料を提供する工程；

C) 該第二核酸分子の存在量と、癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分からの試料における同一核酸分子の存在量とを比較し、両者が異なる場合、該対象の被験体は癌のハイリスク者であると診断する、工程、を包含する、方法。

4 3 . A) 請求項 1 3に記載の第三核酸分子に対して特異的な第三の因子；

B) 該第三の因子に起因するシグナルを用いて該第三核酸分子の発現量を測定するための手段であって、対象の被験体の対象部分において該第三核酸分子が検出される場合、該対象の被験体は癌患者であると確定する、手段、を備える、癌診断キット。

4 4. 前記対象の被験体の対象部分における前記核酸分子の検出は、癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分における該核酸分子の発現量に比較して対象の被験体の対象部分における該核酸分子の発現が高いことを検出することである、請求項 4 3に記載のキット。

4 5 . 前記癌は、 c一 my c高発現癌を含む、請求項 4 3に記載のキット。

4 7 . 癌診断方法であって、 A) 対象の被験体の対象部分からの試料を提供する工程；

B ) 該試料中において、請求項 1 3に記載の第三核酸分子を検出する工程；

を包含する、方法。

4 8 . 前記 C ) 工程は、前記第三核酸分子の存在量と、癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分からの試料における同一核酸分子の存在量とを比較し、前記対象の被験体の対象部分からの試料における該核酸分子の量が増加している場合、該対象の被験体は癌患者であると確定することである、請求項 4 7に記載の方法。

4 9 . A) 請求項 1 2に記載の第二核酸分子に対して特異的な第二の因子； B ) 請求項 1 3に記載の第三核酸分子に対して特異的な第三の因子；

C ) 該第二の因子および該第三の因子に起因するシグナルを識別可能に検知して、該第二核酸分子と該第三核酸分子のそれぞれの発現量を測定するための手段であって、癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分における該第二核酸分子の発現に比較して対象の被験体の対象部分における該第二核酸分子の発現が高く、かつ、癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分における該第三核酸分子の発現に比較して対象の被験体の対象部分における該第三核酸分子の発現が高い場合、該対象の被験体は癌患者であると確定する、手段、

5 3 . 前記第二の因子は請求項 1 3に記載の核酸分子に特異的に反応しないか、前記第三の因子は請求項 1 2に記載の核酸分子に特異的に反応しないか、またはその両方である、請求項 4 9に記載のキット。 '

5 4. 前記第二の因子と、前記第三の因子とは、識別可能に標識されているかまたは標識され得る、請求項 4 9に記載のキッ卜。

5 6 . 癌診断方法であって、

A) 対象の被験体の対象部分からの試料を提供する工程；

B ) 該試料中において、請求項 1 2に記載の第二核酸分子および請求項 1 3 に記載の第三核酸分子の存在量を測定する工程；

C) 該第二核酸分子の存在量と、癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分からの試料における同一核酸分子の存在量とを比較し、該対象の被験体の対象部分からの試料における該第二核酸分子の発現量が変動しており、かつ、該第三核酸分子の存在量と、癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分からの試料における同一核酸分子の存在量とを比較し、該対象の被験体の対象部分からの試料における該第三核酸分子の発現量が増加している場合、該対象の被験体は癌患者であると確定する工程、を包含する、方法。

B ) 請求項 1 3に記載の第三核酸分子に対して特異的な第三の因子；

C ) 該第一の因子および該第三の因子に起因するシグナルを識別可能に検知して、該第一核酸分子と該第三核酸分子のそれぞれの発現量を測定するための手段であって、癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分における該第一核酸分子の発現量における該第三核酸分子の発現量の割合が、対象の被験体の対象部分における該第一核酸分子の発現量における該第三核酸分子の発現量の割合よりも高い場合、該対象の被験体は癌患者であると確定する、手段、

を備える、癌診断キット。

5 9 . 前記癌は、 c一 m y c高発現癌を含む、請求項 5 7に記載のキット。

6 1 . 前記第一の因子は請求項 1 3に記載の核酸分子に特異的に反応しないか、または該第一の因子は請求項 1 3に記載の核酸分子および請求項 1 2に記載の核酸分子の両方に特異的に反応する、請求項 5 7に記載のキッ卜。 6 2 . 前記第一の因子と、前記第三の因子とは、識別可能に標識されているかまたは標識され得る、請求項 5 7に記載のキット。

6 3 . 前記第一の因子と、前記第三の因子とを、識別可能に標識する因子をさらに含む、請求項 5 7に記載のキット。 6 4. 癌診断方法であって、

A) 対象の被験体の対象部分からの試料を提供する工程；

B) 該試料中において、請求項 1に記載の第一核酸分子および請求項 1 3に記載の第三核酸分子の存在量を測定する工程；

C) 該第一核酸分子と該第三核酸分子のそれぞれの発現量を測定する工程であって、癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分における該第一核酸分子の発現量における該第三核酸分子の発現量の割合が、対象の被験体の対象部分における該第一核酸分子の発現量における該第三核酸分子の発現量の割合よりも高い場合、該対象の被験体は癌患者であると確定する、工程、を包含する、方法。

6 5 . ( a) 配列番号 1に記載の塩基配列もしくはその相補体またはそのフラグメント配列を有する、ポリヌクレオチド；

( b ) 配列番号 2に記載のァミノ酸配列またはそのフラグメントをコ一ドする、ポリヌクレオチド、

( c ) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも 1つの変異を有する改変体ポリぺプチドであつて、生物学的活性を有する改変体ポリぺプチドをコードする、ポリヌクレオチド；

( d ) ( a ) 〜（c ) のいずれか 1つのポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、力つ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または (e) (a) 〜（c) のいずれか 1つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも 70%である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリぺプチドをコ一ドするポリヌクレオチド、

を含む、核酸分子の、癌の診断剤の製造のための使用。

66. (a) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；

(c) 配列番号 1に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；

(d) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または

を含む、ポリペプチド。

71. 請求項 66に記載のポリペプチドに対して特異的な因子。

72. 前記因子は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子からなる群より選択される、請求項 7 1に記載の因子。

73. 前記因子は、抗体またはその誘導体である、請求項 71に記載の因子。

74. 前記因子は、プローブとして使用される、請求項 71に記載の因子。

75. 前記因子は、標識されているかまたは標識され得る、請求項 71に記載の因子。

77. 配列番号 2で示される配列を含む、請求項 66に記載のポリペプチド。 78. (a) 配列番号 2において、置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも 1つの改変を含むアミノ酸配列； (b) 配列番号 12、 14および 16からなる群より選択される少なくとも 1つの配列、または該少なくとも 1つの配列において置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも 1つの改変を含む配列、

を含む、請求項 66に記載のポリペプチド。

79, 前記改変は、置換；配列番号 2の 1 02位と 103位との間もしくは配列番号 16の 59位と 60位との間への付加；あるいは配列番号 2もしくは配列番号 12の 1 02位までまたは配列番号 14もしくは配列番号 16の 59位までにおける欠失；あるいはそれらの組合せである、請求項 78に記載のポリペプチド。

80. 前記改変は、配列番号 2の N末端から約 135アミノ酸までの範囲内に存在する、請求項 78に記載のポリペプチド。 81. 前記改変は、配列番号 2における約 50位〜約 120位の範囲内における改変である、請求項 78に記載のポリペプチド。

83. 配列番号 12、 14、 16、 18、 20および 22からなる群より選択される配列を含む、請求項 78に記載のポリペプチド。

84. 請求項 77に記載のポリペプチドに対して特異的な因子。

8 5 . 請求項 7 8に記載のポリペプチドに対して特異的に反応しない、請求項 8 4に記載の因子。

8 6 . 前記因子は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子からなる群より選択される、請求項 8 4に記載の因子。

8 7 . 前記因子は、抗体またはその誘導体である、請求項 8 4に記載の因子。

8 8 . 前記因子は、プローブとして使用される、請求項 8 4に記載の因子。

8 9 . 前記因子は、標識されているかまたは標識され得る、請求項 8 4に記載の因子。

9 0 . 前記標識は、蛍光、リン光、化学発光、放射能、酵素基質反応および抗原抗体反応からなる群より選択される技法を利用する、請求項 8 9に記載の因子。

9 1 . 請求項 7 8に記載のポリペプチドに対して特異的な因子。 9 2 . 請求項 7 7に記載のポリペプチドに対して特異的に反応しない、請求項 9 1に記載の因子。

9 3 . 前記因子は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子からなる群より選択される、請求項 9 1に記載の因子。

9 4 . 前記因子は、抗体またはその誘導体である、請求項 9 1に記載の因子。

95. 前記因子は、プローブとして使用される、請求項 91に記載の因子。

96. 前記因子は、標識されているかまたは標識され得る、請求項 91に記載の因子。

B) 該 A因子に起因するシグナルを用いて該 Aポリペプチドの発現量を測定するための手段であつて、癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分における該 Aポリペプチドの発現量に比較して対象の被験体の対象部分における該 Aポリペプチドの発現が高い場合、該対象の被験体は癌の八ィリスク者であると診断する、手段、

を備える、癌診断キット。 99. 前記癌は、 c-my c高発現癌を含む、請求項 98に記載のキット。

100. 前記癌は、直腸癌および結腸癌を含む、請求項 98に記載のキット。

101. 癌診断方法であって、

A) 対象の被験体の対象部分からの試料を提供する工程； B ) 該試料中において、請求項 6 6に記載の Aポリペプチドの存在量を測定する工程；

C ) 該 Aポリペプチドの存在量と、癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分からの試料における同一核酸分子の存在量とを比較し、該対象の被験体の対象部分からの試料における該 Aポリぺプチドの量が増加している場合、該対象の被験体は癌の八ィリスク者であると診断する、工程、を包含する、方法。

B ) 該 B因子に起因するシグナルを用いて該 Bポリぺプチドの発現量を測定するための手段であって、癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分における該 Bポリペプチドの発現量と、対象の被験体の対象部分における該 Bポリペプチドの発現量とが異なる場合、該対象の被験体は癌のハイリスク者であると診断する、手段、

を備える、癌診断キット。

1 0 3 . 前記癌は、 c一 m y c高発現癌を含む、請求項 1 0 2に記載のキット。 1 0 4 . 前記癌は、直腸癌および結腸癌を含む、請求項 1 0 2に記載のキット。

1 0 5 . 癌診断方法であって、

A) 対象の被験体の対象部分からの試料を提供する工程；

1 0 7 . 対象の被験体の対象部分における前記 Cポリペプチドの検出は、前記癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分における該ポリべプチドの発現量に比較して対象の被験体の対象部分における該ポリペプチドの発現が高いことを検出することである、請求項 1 0 6に記載のキッ卜。

1 1 0 . 癌診断方法であって、

A) 対象の被験体の対象部分からの試料を提供する工程；

B ) 該試料中において、請求項 7 8に記載の Cポリペプチドを検出するェ程； C ) 該 cポリペプチドが検出される場合、該対象の被験体は癌患者であると確定する、工程、

を包含する、方法。

1 1 2 . A) 請求項 7 7に記載の Bポリペプチドに対して特異的な B因子；

B) 請求項 7 8に記載の Cポリペプチドに対して特異的な C因子；

C) 該 B因子および該 C因子に起因するシグナルを識別可能に検知して、該 Bポリペプチドと該 Cポリペプチドのそれぞれの発現量を測定するための手段であって、癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分における該 Bポリペプチドの発現に比較して対象の被験体の対象部分における該 Bポリぺプチドの発現が高く、かつ、癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分における該 Cポリペプチドの発現に比較して対象の被験体の対象部分における該 Cポリぺプチドの発現が高い場合、該対象の被験体は癌患者であると確定する、手段、

を備える、癌診断キット。 '

1 1 3 . 前記 C) 手段は、前記 Bポリペプチドと前記 Cポリペプチドとの相対存在比を比較する手段を包含する、請求項 1 1 2に記載のキット。

1 1 4 . 前記癌は、直腸癌および結腸癌を含む、請求項 1 1 2に記載のキッ卜。

1 1 5 . 前記癌は、 c一 my c高発現癌を含む、請求項 1 1 2に記載のキット。

1 1 6 . 前記 B因子は請求項 7 8に記載の核酸分子に特異的に反応しないか、前記 C因子は請求項 7 7に記載の核酸分子に特異的に反応しないか、またはその両方である、請求項 1 1 2に記載のキット。

1 1 7 . 前記 B因子と、前記 C因子とは、識別可能に標識されているかまたは標識され得る、請求項 1 1 2に記載のキット。

1 1 8 . 前記 B因子と、前記 C因子とを、識別可能に標識する因子をさらに含む、請求項 1 1 2に記載のキッ卜。

1 1 9 . 癌診断方法であって、

A) 対象の被験体の対象部分からの試料を提供する工程；

B ) 該試料中において、請求項 7 7に記載の Bポリペプチドおよび請求項 7 8に記載の Cポリぺプチドの存在量を測定する工程；

C) 該 Bポリペプチドの存在量と、癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分からの試料における同一ポリペプチドの存在量とを比較し、該対象の被験体の対象部分からの試料における該 Bポリぺプチドの発現量が増加しており、かつ、該 Cポリペプチドの存在量と、癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分からの試料における同一ポリぺプチドの存在量とを比較し、該対象の被験体の対象部分からの試料における該 Cポリべプチドの発現量が増加している場合、該対象の被験体は癌患者であると確定する、工程、

を包含する、方法。

を備える、癌診断キット。

1 2 2 . 前記癌は、 c一 m y c高発現癌を含む、請求項 1 2 0に記載のキット。 1 2 3 . 前記癌は、直腸癌および結腸癌を含む、請求項 1 2 0に記載のキット。

1 2 4 . 前記第 A因子は請求項 7 8に記載のポリペプチドに特異的に反応しないか、または請求項 7 7に記載のポリペプチドおよび請求項 7 8に記載のポリペプチドに特異的に反応する、請求項 1 2 0に記載のキット。 1 2 5 . 前記第 A因子と、前記 C因子とは、識別可能に標識されているかまたは標識され得る、請求項 1 2 0に記載のキット。

1 2 6 . 前記 A因子と、前記 C因子とを、識別可能に標識する因子をさらに含む、請求項 1 2 0に記載のキット。 1 2 7 . 癌診断方法であって、

A) 対象の被験体の対象部分からの試料を提供する工程；

B) 該試料中において、請求項 6 6に記載の Aポリペプチドおよび請求項 7 8に記載の Cポリペプチドの存在量を測定する工程；

C) 該 Aポリぺプチドと該 Cポリぺプチドのそれぞれの発現量を測定するェ程であって、癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分における該 Aポリぺプチドの発現量における該 Cポリぺプチドの発現量の割合が、対象の被験体の対象部分における該 Aポリペプチドの発現量における該 Cポリペプチドの発現量の割合よりも高い場合、該対象の被験体は癌患者であると確定する、工程、

を包含する、方法。

1 8 . ( a ) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；

( c ) 配列番号 1に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；

( d ) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または (e) (a) 〜（d) のいずれか 1つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも 7 0%であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、

1 2 9. (a) 配列番号 3に記載の塩基配列もしくはその相補体またはそのフラグメント配列を有する、ポリヌクレオチド；

( b ) 配列番号 4に記載のァミノ酸配列またはそのフラグメントをコ一ドする、ポリヌクレオチド、

(c) 配列番号 4に記載のアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも 1つの変異を有する改変体ポリぺプチドであって、生物学的活性を有する改変体ポリぺプチドをコードする、ポリヌクレオチド；

(d) (a) 〜（c) のいずれか 1つのポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または

(e) (a) 〜（c) のいずれか 1つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも 70 %である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリぺプチドをコードするポリヌクレオチド、

を含む、核酸分子。

1 3 0. 少なくとも 8の連続するヌクレオチド長を有する、請求項 1 2 9に記載の核酸分子。 1 3 1. 前記生物学的活性は、セントロメァクロマチンへの結合である、請求項 1 2 9に記載の核酸分子。

132. 請求項 129に記載の核酸分子に対して特異的な因子。

133. 前記因子は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子からなる群より選択される、請求項 132に記載の因子。

134. 前記因子は、少なくとも 8の連続するヌクレオチド長を有する核酸分子である、請求項 132に記載の因子。 135. 前記因子は、核酸分子であり、プライマーとして使用される、請求項 132に記載の因子。

136. 前記因子は、プローブとして使用される、請求項 132に記載の因子。 137. 前記因子は、標識されているかまたは標識され得る、請求項 132に記載の因子。

138. 前記標識は、蛍光、リン光、化学発光、放射能、酵素基質反応および抗原抗体反応からなる群より選択される技法を利用する、請求項 137に記載の因子。

139. A) 請求項 129に記載の核酸分子に対して特異的な因子；および

B) 該因子に起因するシグナルを用いて該核酸分子の発現量を測定するための手段であって、癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分における該核酸分子の発現量に比較して対象の被験体の対象部分における該核酸分子の発現が高い場合、該対象の被験体は癌のハイリスク者であると診断する、手段、

を備える、癌診断キット。 1 4 0 . 前記癌は、直腸癌および結腸癌を含む、請求項 1 3 9に記載のキット。

1 4 1 . 癌診断方法であって、

A) 対象の被験体の対象部分からの試料を提供する工程；

B ) 該試料中において、請求項 1 2 8に記載の核酸分子の存在量を測定する工程；

を包含する、方法。

1 4 2 . ( a ) 配列番号 3に記載の塩基配列もしくはその相補体またはそのフラグメント配列を有する、ポリヌクレオチド；

( ) 配列番号 4に記載のァミノ酸配列またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド、

( c ) 配列番号 4に記載のアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される少なくとも 1つの変異を有する改変体ポリぺプチドであつて、生物学的活性を有する改変体ポリぺプチドをコードする、ポリヌクレオチド； (d) (a) 〜（c) のいずれか 1つのポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチド ' をコードするポリヌクレオチド；または

を含む、核酸分子の、癌の診断剤の製造のための使用。

1 3. (a) 配列番号 4に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；

(c) 配列番号 3に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；

(d) 配列番号 4に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または

を含む、ポリペプチド。

145. 前記生物学的活性は、セントロメァクロマチンへの結合である、請求項 142に記載のポリぺプチド。

146. 前記ポリペプチドは、標識されているかまたは標識され得る、請求項 142に記載のポリぺプチド。

147. 請求項 142に記載のポリぺプチドに対して特異的な因子。

148。前記因子は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子からなる群より選択される、請求項 147に記載の因子。

149. 前記因子は、抗体またはその誘導体である、請求項 147に記載の因子。 1 50. 前記因子は、プロ一ブとして使用される、請求項 147に記載の因子。

1 51. 前記因子は、標識されているかまたは標識され得る、請求項 147に記載の因子。 1 52. 前記標識は、蛍光、リン光、化学発光、放射能、酵素基質反応および抗原抗体反応からなる群より選択される技法を利用する、請求項 1 5 1に記載の因子。

153. A) 請求項 143に記載のポリペプチドに対して特異的な因子；および B ) 該因子に起因するシグナルを用いて該ポリペプチドの発現量を測定するための手段であって、癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分における該ポリペプチドの発現量に比較して対象の被験体の対象部分における該ポリぺプチドの発現が高い場合、該対象の被験体は癌のハイリスク者であると診断する、手段、

を備える、癌診断キット。

1 5 4 . 前記癌は、 JS腸癌および結腸癌を含む、請求項 1 5 3に記載のキット。 1 5 5 . 癌診断方法であって、

A) 対象の被験体の対象部分からの試料を提供する工程；

C ) 該ポリペプチドの存在量と、癌に罹患していない被験体もしくは癌に罹患していない部分からの試料における同一核酸分子の存在量とを比較し、該対象の被験体の対象部分からの試料における該ポリペプチドの量が増加している場合、該対象の被験体は癌のハイリスク者であると診断する、工程、

を包含する、方法。 1 5 6 . ( a ) 配列番号 4に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；

( c ) 配列番号 3に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド； ( d ) 配列番号 4に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリぺプチド；または

(e) (a) 〜（d) のいずれか 1つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも 70%であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリぺプチド、