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WO2004050125A1 - 腫瘍細胞の増殖及び／又は浸潤の抑制剤 - Google Patents

腫瘍細胞の増殖及び／又は浸潤の抑制剤 Download PDF

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WO2004050125A1
WO2004050125A1 PCT/JP2003/010631 JP0310631W WO2004050125A1 WO 2004050125 A1 WO2004050125 A1 WO 2004050125A1 JP 0310631 W JP0310631 W JP 0310631W WO 2004050125 A1 WO2004050125 A1 WO 2004050125A1
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WO
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gene
collagen
cells
polynucleotide
tumor cells
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PCT/JP2003/010631
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English (en)
French (fr)
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Kimi Honma
You Aso
Masaaki Terada
Takahiro Ochiya
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Koken Co Ltd
Original Assignee
Koken Co Ltd
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Publication date
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a novel antitumor agent, and more particularly, to an antitumor agent having a function of suppressing the growth and / or invasion of tumor cells. More specifically, an inhibitor of tumor cell growth and / or invasion comprising a composition for gene therapy containing a collagen gene and a homolog thereof, and a tumor cell growth and / or The present invention relates to a method for suppressing invasion, and a method for treating a tumor using the method.
  • Collagen a major component of extracellular matrix and abundant in vivo, has been studied for changes in the amount of collagen produced by cell carcinogenesis.
  • neuroblastoma Kuga et al.
  • hepatoblastoma Inagaki et al.
  • thyroid cancer Diohlma et al.
  • Non-Patent Document 1 Journal of the Nissho Gaijikai, Vol. 36, No. 2, April 2000 p 41-47
  • Non-Patent Document 2 Biochem. Biophys. Res.Commun. 1987 Oct 29; 148 (2 ): 8697
  • Non-Patent Document 3 Int.J. Cancer.2002 Mar 10; 98 (2): 186
  • An object of the present invention is to provide a novel antitumor agent, and to provide a means for gene therapy supporting a novel mechanism. That is, the present invention provides a means for controlling extracellular matrices for tumor cells, controlling cell proliferation and / or invasion, and treating cancer.
  • the present inventors have conducted intensive studies and found that, by introducing a collagen gene into tumor cells, it was possible to suppress the growth and / or invasion of tumor cells, thereby completing the present invention.
  • the present inventors have conducted intensive studies and found that, by introducing a collagen gene into tumor cells, it was possible to suppress the growth and / or invasion of tumor cells, thereby completing the present invention.
  • An agent for suppressing growth and / or invasion of tumor cells comprising a composition for gene therapy containing a collagen gene.
  • the amino acid sequence encoded by the gene of 1) or 2) has a mutation such as deletion, substitution, addition or insertion of one or several amino acids, and has an ability to suppress the growth and / or invasion of tumor cells. And a phase capture chain thereof
  • a polynucleotide represented by at least about 15 consecutive nucleotide sequences of the polynucleotide or the complementary strand thereof according to the above 1) to 3), and which has an ability to inhibit tumor cell growth and / or invasion;
  • composition for gene therapy is a recombinant vector.
  • the proliferation and / or invasion of a tumor cell which comprises introducing a collagen gene and a homolog thereof into a tumor cell in a living body using the inhibitor according to any one of the above items 1 to 9. How to control.
  • FIG. 1 shows an expression vector (PCXN2 / HC0L1A1).
  • FIG. 2 shows the established cell line expressing type I collagen ⁇ 1 chain (T98G / HCOL1A1).
  • FIG. 3 shows a comparison of proliferation between cells into which a collagen gene has not been introduced (control cells) and cells into which a collagen gene has been introduced.
  • FIG. 4 shows a comparison of the migratory and invasive properties of cells into which a collagen gene has not been introduced (control cells) and cells into which a collagen gene has been introduced.
  • control cells for ⁇ (comparison of migration), transwell was used, and for B (comparison of invasion), Matrigel chamber was used.
  • FIG. 5 shows a comparison of tumorigenicity in nude mice between cells into which a collagen gene has not been introduced (control cells) and cells into which a collagen gene has been introduced.
  • FIG. 6 shows a comparison of apoptosis induction between cells into which a collagen gene has not been introduced (control cells) and cells into which a collagen gene has been introduced.
  • collagen gene refers to a gene that broadly encodes collagen, and its fragment, mutant, and derivative can be used for tumor cell growth and proliferation.
  • the collagen gene can suppress the growth and / or invasion of tumor cells according to the present invention, and easily prepares fragments, mutants, and derivatives thereof, and can also prepare a target substance. is there.
  • the origin of the collagen gene used in the present invention is not particularly limited, but is preferably the same as that of the tumor cell carrier. When a person is a carrier, it is preferably the same or homologous to a human.
  • the peptide chain encoded by the collagen gene is not particularly limited, but is large Type I, type II, type III, or types IV and XVIII which are considered to be involved in metastasis.
  • type I was selected as a suitable case.
  • type I collagen is composed of two types, ⁇ 1 chain and two chains, but it is not necessary to introduce two types of genes in the present invention, and it is possible to use either ⁇ 1 or ⁇ 2. Good, both, or their fragments, or their homologs.
  • the ⁇ 1 chain will be described as a preferable representative case.
  • the following homologues of the collagen gene of the present invention are also objects of the present invention, with the marker that intracellular introduction of the gene enables the growth and / or invasion of tumor cells.
  • polynucleotide according to 1) to 3 which is represented by at least about 15 consecutive nucleotide sequences of the polynucleotide or a complementary strand thereof and which has an ability to inhibit tumor cell growth and / or invasion.
  • PCR polymerase chain amplification
  • homologous amino acids polar amino acids, non-polar amino acids
  • Mutual substitution between amino acids, hydrophobic amino acids, hydrophilic amino acids, positively charged amino acids, negatively charged amino acids, aromatic amino acids, etc. is easily assumed.
  • the polynucleotide of the present invention and its complementary strand also include a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions to its corresponding region.
  • Eve redidation conditions can be in accordance with, for example, Sambrook et al. [Molecular Cloning,, Laboratory Manual, 2nd Edition] Cold Spring Harbor Laboratory, (1989).
  • These polynucleotides need not necessarily be complementary sequences as long as they hybridize to the target polynucleotide.
  • the homology is at least about 40%, for example, about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and still more preferably about 95% or more.
  • polynucleotide of the present invention may be a polynucleotide or an oligonucleotide having a sequence of 10 or more nucleotides, preferably 15 or more, more preferably 20 or more corresponding to the designated base sequence region. And their complementary strands.
  • these polynucleotides can be provided by selecting using the activity of inhibiting the growth and / or invasion of the tumor as an index.
  • the polynucleotide of the present invention can be provided by selecting according to the present invention, using the ability to induce apoptosis of tumor cells as an index.
  • Recombinant vectors used for gene transfer can be prepared by any means known per se, for example, using lepicon, episomes, chromosomes, non-infectious viruses, etc. It is.
  • the recombinant vector is a bacterial plasmid-derived vector, a bacteriophage-derived vector, a transposon-derived vector, a yeast episomal-derived vector, an insertion element-derived vector, a yeast chromosome element-derived vector, a baculovirus-papovavirus SV40 Vectors derived from viruses such as vaccinia virus, adenovirus, fowlpox virus, pseudorabies virus, and retrovirus, and vectors derived from genetic elements of plasmid and batteriophage (cosmid and phagemid).
  • the vector is selected according to the type of the selected host, and comprises a gene sequence to be expressed and a gene sequence carrying information on replication and control as components.
  • the combination is classified into prokaryotic cells and eukaryotic cells, and a drug resistance marker gene, a promoter, a ribosome binding site, a terminator, a signal sequence, an enhancer, and the like can be used in combination by a method known per se.
  • the vector is not particularly limited as long as it can be expressed in eukaryotic cells.
  • pCXN2 is shown as a suitable expression vector, but is not limited thereto.
  • a method for integrating a gene into a vector a method known per se can be applied. For example, a method is used in which an appropriate restriction enzyme is selected and treated, the DNA is cleaved at a specific site, then mixed with a similarly treated DNA to be used as a vector, and religated with ligase.
  • the integration method into the chromosome for example, ribosome method, phosphoric acid solution method, electoral poration method, etc.
  • Transient ribosome method, calcium phosphate method, electroporation method, virus vector method, atelocollagen It may be a method such as a method.
  • the gene therapy composition comprising the vector containing the collagen gene of the present invention is generally administered parenterally to a subject.
  • the tumor cells are treated directly or by targeting techniques.
  • the dose is not particularly limited, but is appropriately adjusted depending on the size of the tumor cell.
  • a vector containing a collagen gene is administered to a tumor cell lg in an amount of 20 to 440 ⁇ ⁇ , preferably about 40 to 110 / xg.
  • the administration timing is more efficient during the growth phase of the tumor cells, but is not particularly limited.
  • the tumor targeted by the present invention is not particularly limited, but a tumor whose collagen production is reduced by malignant tumors such as neuroblastoma, hepatoblastoma, and thyroid cancer is preferable.
  • malignant tumors such as neuroblastoma, hepatoblastoma, and thyroid cancer.
  • collagen gene transfer was particularly effective for Darioplastoma cells (T98G) and breast cancer cells (MCF-7).
  • T98G Glioblastoma cells (ATCC-derived cell line purchased from Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) were used as tumor cells.
  • the gene to be introduced into the cell is a human type I procollagen single chain gene, and a full-length cDNA having a propeptide at both ends of the helical region is inserted under the CAG promoter of the expression vector pCXN2 for expression.
  • a vector (pCXN2 / HCOLlAl) was constructed (FIG. 1).
  • PCXN2 / HCOL1A1 was introduced into T98G cells by the liposome method using the gene transfer reagent Lipofectamine 2000 reagent (GIBCO).
  • the calorie content is about 50% confluent cells (approximately 4 l.OxlO) in a petri dish (diameter 10cm).
  • 20 ⁇ l of Lipofectamine 2000 reagent and 10 ⁇ g of pCXN2 / HCOLlAl were used.
  • the selective drug G418 for the drug resistance marker (Neo R) is added to the culture solution to a final concentration of 800 ⁇ // ⁇ 1, and the colonies of cells with the stable phenotype are added. Was formed and collected.
  • the recovered cells were further cultured and subjected to cell immunostaining with an anti-type I collagen chain antibody to confirm their expression, and a type I collagen-1 chain-expressing cell line (T98G / HCOL1A1) was established (Fig. 2 ).
  • the transmigration and invasiveness were examined by Transwell Atsushi.
  • the migratory activity was compared by counting the number of cells that passed through the membrane after adding 2.5 to 10 5 cells to an 8-micron pore size transwenore (Becton Deutskinson) and culturing for 24 hours. .
  • the migratory activity of the transfected cells was reduced to 30% of the control cells.
  • the invasiveness was compared by adding 2.5 to 10 5 cells to one Matrigel chamber (Betaton 'Dickinson), culturing for 24 hours, and counting the number of cells passing through the cells.
  • the invasiveness of the transfected cells was 1/10 or less of the control cells (Fig. 4). Test example 3
  • Each cell was implanted subcutaneously in a nude mouse to examine its tumorigenicity.
  • the tumor grew rapidly after 50 days.
  • the group transplanted with collagen gene-transfected cells no tumor growth was observed and tumorigenicity was lost (Fig. 5).
  • Darioblastoma cells T98G
  • breast cancer cells MCF-7: ATCC-derived cell line purchased from Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.
  • the introduced gene and the method of introducing the gene were performed in the same manner as in Example 1 except for the following.
  • the difference from Example 1 is that the amount of gene transfer reagent used was 20 ⁇ l of Lipofectamine 2000 reagent and 17.5 ⁇ g of pCXN2 / HCOLlAl for tumor cells, and Lipofectamine 2000 was used for tumor cells used as a control.
  • the reagent was 20 ⁇ 20 and pCXN2 lO.O ⁇ g.
  • the cells are passaged to another dish, and the selection drug G418 is adjusted to a final concentration of 600 ⁇ g / ml.
  • the culture solution was added to form a cell colony, which was collected.
  • the cells collected by the above method were used to determine the percentage of colonies in which pCXN2 / HCOLlAl-introduced tumor cells were introduced relative to control cells in which pCXN2 was introduced.
  • Both glioblastoma cells (T98G) and breast cancer cells (MCF-7) had a colony generation rate of 25% in tumor cells into which a collagen gene had been introduced. From the above results, it was found that the introduction of collagen gene into Darioblastoma cells (T98G) and breast cancer cells (MCF-7) has a remarkable cell growth inhibitory effect. Industrial applicability.
  • the introduction of a collagen gene into tumor cells by the method of the present invention has been confirmed to have an effect of significantly suppressing tumor cell invasion and / or metastasis, and can be a useful antitumor means.
  • a collagen gene has been confirmed to have an effect of significantly suppressing tumor cell invasion and / or metastasis, and can be a useful antitumor means.

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Abstract

本発明の課題は新規な抗腫瘍剤を提供することであり、新規なメカニズムを保持する遺伝子治療の手段を提供するものである。即ち、腫瘍細胞に対する細胞外マトリックスの制御を行い、細胞の増殖及び／又は浸潤の制御を行い癌を治療する手段を提供することを課題とする。具体的には、コラーゲン遺伝子を腫瘍細胞内に導入することによって、腫瘍細胞の増殖及び／又は浸潤の抑制が可能になることを見出し、本発明を完成するに至った。

Description

明細書 腫瘍細胞の増殖及び/又は浸潤の抑制剤 本出願は、 参照によりここに援用されるところの、 日本特許出願番号 2002-351599からの優先権を請求する。 技術分野
本発明は新規な抗腫瘍剤に関し、 より詳しくは、腫瘍細胞の増殖及び/又は浸潤 を抑制させる機能を担持する抗腫瘍剤に関する。 更に具体的には、 コラーゲン遺 伝子及ぴその相同物を含む遺伝子治療用組成物からなる腫瘍細胞の増殖及び/又 は浸潤の抑制剤、この抑制剤を利用した腫瘍細胞の増殖及び/又は浸潤の抑制方法、 並びにこの抑制方法を利用した腫瘍の治療方法に関する。 背景技術
ガンの浸潤、 転移は細胞外マトリックスとの相互作用によって進行するために、 その制御は悪性ガン治療の重要な手段の一つである。 従来腫瘍細胞は細胞外マト リックスについては、 例えば Reillyらの Endostatin、 Standerらの Decorin、 Maeshimaらの Tumstatin、 Akamatsuらの Fibronectin等の接着因子が腫瘍細 胞の遊走、 浸潤、 転移に大きく係わっていることが明らかにされている。 また細 胞外マトリッタスの主成分であって、 生体内に多量に存在するタンパク質である コラーゲンについては、 細胞のガン化に伴う産生量の変化が調べられており、 例 えば神経芽腫 (Kugaら） （非特許文献 1 )、 肝芽腫 (Inagakiら） （非特許文献 2 )、 甲状腺ガン (Dahlmaら） （非特許文献 3 ) は悪性化によってコラーゲンの産生量 は減少するとされている。 このように細胞外マトリックスと腫瘍細胞には何らか の相互作用が存在するが、 それを制御することで、 ガンの遊走、 浸潤、 転移、 増 殖に対する抑制、 さらにはガン細胞を消失させることは未だ成し得ていない。 一方、 ガンを抑制すると考えられるぺプチドを産生させ、 腫瘍細胞の増殖、 浸 潤を制御することも試みられている。 例えば p 5 3遺伝子等ガン抑制遺伝子の導 入、 IFN遺伝子等抑制効果のあるサイトカイン類の遺伝子導入等が行われている。 しカゝし、 これらの方法はターゲットとする細胞にのみに発現させる必要がある、 あるいはその産生量をコントロールする必要があるといった問題が残っていた。 (非特許文献 1 ) 日小外会誌 第 3 6巻 2号 2 0 0 0年 4月 p 4 1— 4 7 (非特許文献 2 ) Biochem. Biophys. Res. Commun. 1987 Oct 29 ;148(2):869·7 (非特許文献 3 ) Int. J. Cancer. 2002 Mar 10;98(2):186·92 発明の開示
本発明の課題は、 新規な抗腫瘍剤を提供することであり、 新規なメカニズムを 担持する遺伝子治療の手段を提供するものである。 即ち、 腫瘍細胞に対する細胞 外マトリッタスの制御を行い、 細胞の増殖及び/又は浸潤の制御を行い癌を治療 する手段を提供するものである。
本発明者らは、 鋭意研究を重ねた結果、 コラーゲン遺伝子を腫瘍細胞内に導入 することによって、 腫瘍細胞の増殖及び 又は浸潤の抑制が可能になることを見 出し、 本発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明は、
1 . コラーゲン遺伝子を含む遺伝子治療用組成物からなる腫瘍細胞の増殖及び/ 又は浸潤の抑制剤。
2 . コラーゲン遺伝子が、 I型コラーゲン遺伝子である前項 1の抑制剤。
3 . コラーゲン遺伝子が、 I型コラーゲンの 1鎖の遺伝子である、 前項 2に記 載の抑制剤。
4 . コラーゲン遺伝子が、 下記の群より選ばれる遺伝子である前項 1に記載の抑 制剤。
1 ) I型コラーゲンの α 1鎖の遺伝子を含むポリヌクレオチド及びその相補鎖
2 ) I型コラーゲンの α 1鎖の遺伝子と少なくとも約 7 0 %のアミノ酸配列上の 相同性を有し、かつ腫瘍細胞の増殖及び/又は浸潤の抑制能を担持するポリヌタレ ォチド、 及びその相補鎖
3) 前記 1) 及ぴ 2) の遺伝子がコードするアミノ酸配列において 1ないし数個 のアミノ酸の欠失、 置換、 付加あるいは挿入といった変異を有し、 かつ腫瘍細胞 の増殖及び/又は浸潤の抑制能を担持するポリヌクレオチド、 及びその相捕鎖
4) 前記 1) 〜3) に記載のポリヌクレオチドまたはその相補鎖とストリンジェ ントな条件下でハイプリダイゼーシ aンするポリヌクレオチド
5) 前記 1) 〜3) に記載のポリヌクレオチドまたはその相補鎖の少なくとも約 15個の連続する塩基配列で示され、かつ腫瘍細胞の増殖及び/又は浸潤の抑制能 を担持するポリヌクレオチド
5. 遺伝子治療用組成物が、 組換えベクターである前項 1〜4の何れか一に記载 の抑制剤。
6. コラーゲン遺伝子を、 腫瘍細胞内に導入することを特徴とする前項 1〜5の 何れか一に記載の抑制剤。
7. 腫瘍細胞のアポトーシスの誘発をマーカーとする前項 1〜6の何れか一に記 載の抑制剤。
8. 腫瘍細胞が、 コラーゲンの発現量が減少していることを特徴とする前項 1〜 7の何れか一に記載の抑制剤。
9. 腫瘍細胞が、 以下の少なくとも 1から選ばれる前項 1〜 8の何れか一に記載 の抑制剤。
1) ダリオブラストーマ細胞 （T98G)
2) 乳癌細胞 （MCF-7)
10. 前項 1〜 9の何れか一に記載の抑制剤を用い、 生体内の腫瘍細胞内に、 コ ラーゲン遺伝子及びその相同物を導入することを特徴とする腫瘍細胞の増殖及 び/又は浸潤の抑制方法。
11. 前項 10の抑制方法を使用する腫瘍の治療方法。
からなる。 図面の簡単な説明
図 1は、 発現ベクター（PCXN2/HC0L1A1)を構示す。
図 2は、 樹立した I型コラーゲン α 1鎖発現細胞株 (T98G/HCOL1A1)を示す。 図 3は、 コラーゲン遺伝子を導入していない細胞 （コントロール細胞） とコラ 一ゲン遺伝子導入細胞の増殖の比較を示す。
図 4は、 コラーゲン遺伝子を導入していない細胞 （コントロール細胞） とコラ 一ゲン遺伝子導入細胞の遊走性および浸潤性の比較を示す。 Α (遊走性の比較） はトランスゥエル、 B (浸潤性の比較） はマトリゲルチヤンバーを用いた。
図 5は、 コラーゲン遺伝子を導入していない細胞 （コントロール細胞） とコラ 一ゲン遺伝子導入細胞のヌードマウスにおける造腫瘍性の比較を示す。
図 6は、 コラーゲン遺伝子を導入していない細胞 （コントロール細胞） とコラ 一ゲン遺伝子導入細胞のアポトーシス誘導の比較を示す。
(符号の説明）
〇 △ □ 遺伝子導入細胞 （図 3 ) (図 5 )
• 園 コントローノレ （図 3、 図 5 ) 発明を実施するための最良の形態
本発明において 「コラーゲン遺伝子」 とは、 所謂広くコラーゲンをコードする 遺伝子を対象とし、 その断片、 変異体、 誘導体であっても、 腫瘍細胞の増殖及び
Z又は浸潤を可能とする限りは利用可能である。 当業者は、 本発明により、 コラ 一ゲン遺伝子が腫瘍細胞の増殖及び/又は浸潤の抑制を可能とすることを知り 容易にその断片、 変異体、 誘導体を調製 ·そして目的物質の調製も可能である。 本発明で使用されるコラーゲン遺伝子の由来は、 特に制限されるものではない 力 腫瘍細胞担持体と同種であることが好ましい。 人が担持体である場合は、 人 由来と同じ又は相同であることが好適である。
コラーゲン遺伝子がコードするぺプチド鎖についても特に制限はないが、 多量 に存在する I型、 II型、 III型、 あるいは転移に関与されるとされる IV型、 XVIII 型等が望ましい。 本発明の実施例では好適な事例として、 I型を選別した。
ヒ トの場合、 I型コラーゲンは α 1鎖と 2鎖の 2種類から構成されているが、 本発明においては 2種類の遺伝子を導入する必要はなく、 α 1あるいは α 2のい ずれかでも良いし、 両方でも良いし、 それらの断片でもよいし、 さらにそれらの 相同物でもよい。
本努明の実施例では α 1鎖を好適な代表事例として説明する。 そして、 本発明 のコラーゲン遺伝子は、 当該遺伝子の細胞内導入が腫瘍細胞の増殖及び/又は浸 潤を可能とすることをマーカーにして以下のような相同物も本発明の対象とす る。
1 ) I型コラーゲンの α 1鎖の遺伝子を含むポリヌクレオチド及びその相補鎖
2 ) I型コラーゲンの α 1鎖の遺伝子と少なくとも約 7 0 %のアミノ酸配列上の 相同性を有し、かつ腫瘍細胞の増殖及び/又は浸潤の抑制能を担持するポリヌクレ ォチド、 及ぴその相補鎖
3 ) 前記 1 ) 及び 2 ) の遺伝子がコードするアミノ酸配列において 1ないし数個 のアミノ酸の欠失、 置換、 付カ卩あるいは挿入といった変異を有し、 かつ腫瘍細胞 の増殖及び/又は浸潤の抑制能を担持するポリヌクレオチド、 及びその相補鎖 4 ) 前記 1 ) 〜3 ) に記載のポリヌクレオチドまたはその相補鎖とストリンジェ ントな条件下でハイブリダイゼーシヨンするポリヌクレオチド
5 ) 前記 1 ) 〜3 ) に記載のポリヌクレオチドまたはその相補鎖の少なくとも約 1 5個の連続する塩基配列で示され、かつ腫瘍細胞の増殖及び/又は浸潤の抑制能 を担持するポリヌクレオチド
欠失、 置換、 付加あるいは揷入の手段は自体公知であり、 例えば、 部位特異的 変異導入法、 遺伝子相同組換え法、 プライマー伸長法またはポリメラーゼ連鎖増 幅法 （P C R) を単独または適宜組み合わせて、 例えばサムブルック等編 [モレ キュラークロー-ング， ァ ラボラトリーマニュアル 第 2版] コールドスプリ ングハーバーラボラトリー， 1 9 8 9、村松正實編 [ラボマニュアル遺伝子工学] 丸善株式会社， 1 988、 エールリツヒ， HE. 編 [PCRテクノロジー， DN A増幅の原理と応用] ス トック トンプレス， 1 989等の成書に記載の方法に準 じて、 あるいはそれらの方法を改変して実施することができ、 例えば U 1 me r の技術（S c i e n c e, 21 9, 666, 1 983) を利用することができる。 上記のような変異の導入において、 当該発現されるコラーゲン蛋白質の基本的 な性質（物性、活性、または免疫学的活性等） を変化させないという観点からは、 例えば、 同族アミノ酸 （極性アミノ酸、 非極性アミノ酸、 疎水性アミノ酸、 親水 性アミノ酸、 陽性荷電アミノ酸、 陰性荷電アミノ酸、 芳香族アミノ酸等） の間で の相互置換は容易に想定される。
本発明のポリヌクレオチドおよびその相補鎖は、 その対応する領域にストリン ジェントな条件下でハイブリダィズするポリヌクレオチドをも包含する。 ノ、イブ リダイゼーションの条件は、 例えばサムブルック等編 [モレキュラークローニンク、、, ァ ラボラトリーマニュアル 第 2版] コールドスプリングハーバーラボラ トリー， （1 989) 等に従うことができる。 これらのポリヌクレオチドは目的 のポリヌクレオチドにハイプリダイズするものであれば必ずしも相補的配列で なくともよレ、。例えば、相同性において、少なくとも約 40 %、例えば、約 70 % 以上、 好ましくは約 80 %以上、 より好ましくは約 90 %以上、 さらに好ましく は約 95 %以上である。 また本発明のポリヌクレオチドは、 指定された塩基配列 の領域に対応する連続する 1 0個以上のヌクレオチド、 好ましくは 1 5個以上、 より好ましくは 20個以上の配列からなるポリヌクレオチド、 オリゴヌクレオチ ドぉよびそれらの相補鎖を包含する。
これらのポリヌクレオチドは、 本発明の提供により、 その腫瘍の増殖抑制及ぴ /又は浸潤抑制の活性を指標にして選別することにより提供することができる。ま た、 本発明のポリヌクレオチドは、 本発明の提供により、 腫瘍細胞のアポトーシ スの誘発能を指標にして選別することによつて提供することができる。
遺伝子の導入に使用する組換えベクターは、 自体公知の手段が応用され、 例え ばレブリコンとして、 ェピソーム、 染色体、 非感染化ウィルス等を利用して行わ れる。
糸且換えベクターは、 細菌プラスミ ド由来ベクター、 パクテリオファージ由来べ クタ一、 トランスポゾン由来ベクター、 酵母ェピソ一ム由来ベクター、 挿入エレ メント由来ベクター、 酵母染色体エレメント由来ベクター、 バキュロウィルス - パポバウィルス · SV40 ·ワクシニアウィルス ·アデノウィルス ·鶏痘ウィルス · 仮狂犬病ウィルス · レトロウィルス等のウィルス由来のベクター、 プラスミ ドと バタテリオファージの遺伝学的エレメント由来のベクター （コスミ ド及びファー ジミ ド） 等があげられる。
' ベクターは、 選択した宿主の種類により選別され、 発現目的の遺伝子配列と複 製そして制御に関する情報を担持した遺伝子配列とを構成要素とする。 組合せは 原核細胞、真核細胞によって分別され、薬剤耐性マーカー遺伝子、プロモーター、 リボソーム結合部位、 ターミネータ一、 シグナル配列、 ェンハンサ一等を自体公 知の方法によって組合せて利用できる。 べクターは真核細胞で発現できるものな らば特に制限はない。
本発明の具体例では好適な発現ベクターとして pCXN2を示したが、 これに限 定されるものではない。
ベクターへの遺伝子の組み込み方法は、 自体公知の方法を適用できる。例えば、 適当な制限酵素を選択、 処理して DNAを特定部位で切断し、 次いで同様に処理 したベクターとして用いる DNAと混合し、 リガーゼによって再結合する方法が 用いられる。
腫瘍細胞への導入は、 例えば、 サムブルック編 〔モレキュラークローニング， ァ ラボラトリーマニュアル〕 コールド'スプリング'ハーバー'ラボラトリー ' プレス （1989) 等に記載の標準的な方法により実施できる。 遺伝子の安定性を考 慮するならば、 染色体内へのインテグレート法 （例えばリボソーム法、 リン酸力 ルシゥム法、 エレク ト口ポレーシヨン法等） であるが、 簡便には核外遺伝子を利 用した自律複製系の利用である。 一過性に発現させるリボソーム法、 リン酸カル シゥム法、 エレク トロポレーション法、 ウィルスベクター法、 ァテロコラーゲン 法等の方法でも良い。
本発明のコラーゲン遺伝子を含むベクターからなる遺伝子治療組成物は、 一般 的には非経口的に対象に投与される。 好適には、 腫瘍細胞に直接或はターゲッテ イング手法によって処置される。 投与量は、 特に制限されないが、 腫瘍細胞の大 きさによって適宜調整される。 一般的には、 腫瘍細胞 lgに対して、 コラーゲン 遺伝子を含むベクターは、 20〜440 μ ^、 好ましくは 40〜110 /x g程度が投与され る。 投与時期は、 腫瘍細胞の増殖期におこなうことがより効率的であるが、 特に 限定されるものではない。
本発明の対象とする腫瘍は、 特に限定されないが、 神経芽腫、 肝芽腫、 甲状腺 ガン等の悪性腫瘍ィヒによってコラーゲン産生量が減少する腫瘍が好適である。 本 発明では、 特にダリオプラストーマ細胞 （T98G)、 乳癌細胞 （MCF-7) に対する コラーゲン遺伝子導入の特有の優位な効果を確認した。 実施例
以下本発明を実施例により具体的に説明するが、 本発明は以下の実施例に限定 されるものではない。 実施例 1 腫瘍細胞へのコラーゲン遺伝子の導入
腫瘍細胞として、 グリオブラストーマ細胞 （T98G) (ATCC由来株細胞を大日 本製薬株式会社より購入） を使用した。
細胞内に導入する遺伝子は、 ヒ ト I型プロコラーゲンひ 1鎖遺伝子を使用し、 ヘリックス領域の両端にプロペプチド部をもつ完全長 cDNAを、 発現ベクター pCXN2の CAGプロモーター下に挿入して、 発現ベクター (pCXN2/HCOLlAl) を構築した （図 1 )。
遺伝子導入試薬 Lipofectamine 2000 reagent (GIBCO)を用いたリポソーム法 により PCXN2/HCOL1A1を T98G細胞に導入した。 添カロ量は、 シャーレ （直径 10cm) に約 50%程度集密 （confluent) にさせた細胞 （略 l.OxlO4個） に対して Lipofectamine 2000 reagent 20 μ 1と pCXN2/HCOLlAl 10 ^ g とした。 安定形 質発現体を獲得するため、薬剤耐性マーカー (Neo R)に対する選択薬剤 G418を終 濃度 800 μ §/πι1となるように培養液に添カ卩し、安定形質発現体による細胞のコロ ニーを形成させ、 それを回収した。 回収した細胞をさらに培養し、 抗 I型コラー ゲン 鎖抗体による細胞免疫染色を行い、 その発現を確認して、 I型コラーゲ ンひ 1鎖発現細胞株 (T98G/HCOL1A1)を樹立した （図 2 )。
試験例 1
〔コラーゲン遺伝子を導入していない細胞 （コントロール細胞） とコラーゲン遺 伝子導入細胞の増殖の比較〕
96穴プレートに 1穴あたり 5χ105個の細胞を播種し、 5日間の細胞増殖を、 テ トラカラーワン試薬 （生化学工業） を用いて測定した。 3つの遺伝子導入細胞株 は、 コントロール細胞にくらべ、 有意に増殖が抑制されていた （図 3 )。
試験例 2
〔コラーゲン遺伝子を導入していない細胞 （コントロール細胞） とコラーゲン遺 伝子導入細胞の遊走性および浸潤性の比較〕
トランスゥエルアツセィにより遊走性と浸潤性を調べた。 遊走性は、 2.5χ105 個の細胞をポァサイズ 8 ミクロンのメンブランのトランスウエノレ (べク トン ·デ イツキンソン)に添加して 24時間培養後、 メンブランを通過した細胞数をカウン トして比較した。 遺伝子導入細胞の遊走性は、 コントロール細胞の 30%に減少し ていた。 浸潤性は、 2.5χ105個の細胞をマトリゲルチャンバ一 (ベタ トン 'ディッ キンソン） に添加して 24時間培養後、それを通過した細胞数を力ゥントして比較 した。遺伝子導入細胞の浸潤性は、コントロール細胞の 1/10以下であった（図 4 )。 試験例 3
〔コラーゲン遺伝子を導入していない細胞 （コントロール細胞） とコラーゲン遺 伝子導入細胞のヌードマゥスにおける造腫瘍性の比較〕
ヌードマウスの皮下に各細胞を移植し、 その造腫瘍性をしらべた。 コントロー ル細胞を移植した群では、 50日以降に急激に腫瘍が大きくなつた。 しかし、 コラ 一ゲン遺伝子導入細胞を移植した群では、 腫瘍の増殖が認められず、 造腫瘍性が 消失していた （図 5 )。
試験例 4
〔コラーゲン遺伝子を導入していない細胞 （コントロール細胞） とコラーゲン遺 伝子導入細胞のアポトーシス誘導の比較〕
コラーゲン遺伝子の発現による培養細胞におけるアポトーシス誘導について、 In Situ Cell Death Detection Kit, POD (ロシュ 'ダイァグノスティック）を用い た TUNELアツセィで検討した。 各細胞をコンフルェントになるまで培養し、無 血清培地に交換して十数日後にアツセィした。 コントロールではアポトーシス細 胞がほとんど検出されなかったが、 I型コラーゲン発現細胞では、 多くの細胞が アポトーシス誘導されていた （図 6 )。
' 試験例 5
〔コラーゲン遺伝子を導入していない細胞 （コントロール細胞） とコラーゲン遺 伝子導入細胞のコ口ニー生成率の比較〕
腫瘍細胞として、 ダリオブラストーマ細胞（T98G)、乳癌細胞（MCF-7： ATCC 由来株細胞を大日本製薬株式会社より購入） を使用した。
導入した遺伝子及び該遺伝子導入方法は、 以下に示す以外は実施例 1と同様な 方法で行った。 実施例 1と異なる点は、 遺伝子導入試薬の添加量は、 腫瘍細胞に 対して Lipofectamine 2000 reagent 20 μ 1 と pCXN2/HCOLlAl 17.5 μ g とし、 またコント口一ルとして使用した腫瘍細胞には Lipofectamine 2000 reagent 20 μ ΐと pCXN2 lO.O ^ g とした。 さらに腫瘍細胞に遺伝子を導入後、その細胞を別 のディッシュにパッセージ後、選択薬剤 G418を終濃度 600 μ g/mlとなるように 培養液に添カ卩し、 細胞のコロニーを形成させ、 それを回収した。
上記方法で回収した細胞をコロニーフォーメーションアツセィ法により、 コン ト口ールの pCXN2を導入した腫瘍細胞に対して pCXN2/HCOLlAlを導入した 腫瘍細胞が何％の割合でコロニーが出来るかを調べた。 グリオブラストーマ細胞 (T98G)、乳癌細胞（MCF-7)にコラーゲン遺伝子を導入した腫瘍細胞では共に、 2 5 %のコロニーの生成率であった。 以上の結果により、 ダリオブラストーマ細 胞 （T98G)、 乳癌細胞 （MCF-7) に対するコラーゲン遺伝子導入は、 著しく細胞 増殖抑制効果があることがわかった。 産業上の利用可能性 .
以上説明したように、 本発明の方法により、 コラーゲン遺伝子の腫瘍細胞への 導入は、腫瘍細胞の浸潤及び/又は転移を有意に抑制する効果が確認され、有用な 抗腫瘍の手段になりうることが達成された。

Claims

請求の範囲
1. コラーゲン遺伝子を含む遺伝子治療用組成物からなる腫瘍細胞の増殖及び/ 又は浸潤の抑制剤。
2. コラーゲン遺伝子が、 I型コラーゲン遺伝子である請求項 1の抑制剤。
3. コラーゲン遺伝子が、 I型コラーゲンの α 1鎖の遺伝子である、 請求項 2に 記載の抑制剤。
4. コラーゲン遺伝子が、 下記の群より選ばれる遺伝子である請求項 1に記載の 抑制剤。
1) I型コラーゲンの α 1鎖の遺伝子を含むポリヌクレオチド及びその相補鎖
2) I型コラーゲンの α 1鎖の遺伝子と少なくとも約 70%のアミノ酸配列上の 相同性を有し、かつ腫瘍細胞の増殖及び/又は浸潤の抑制能を担持するポリヌクレ ォチド、 及びその相補鎖
3) 前記 1) 及ぴ 2) の遺伝子がコードするアミノ酸配列において 1ないし数個 のアミノ酸の欠失、 置換、 付加あるいは揷入といった変異を有し、 かつ腫瘍細胞 の増殖及び/又は浸潤の抑制能を担持するポリヌクレオチド、 及ぴその相捕鎖
4) 前記 1) 〜3) に記載のポリヌクレオチドまたはその相補鎖とストリンジェ ントな条件下でハイブリダイゼーシヨンするポリヌクレオチド
5) 前記 1) 〜3) に記載のポリヌクレオチドまたはその相補鎖の少なくとも約 1 5個の連続する塩基配列で示され、かつ腫瘍細胞の増殖及び/又は浸潤の抑制能 を担持するポリヌクレオチド
5. 遺伝子治療用組成物が、 組換えベクターである請求項 1〜4の何れか一に記 載の抑制剤。
6. コラーゲン遺伝子を、 腫瘍細胞内に導入することを特徴とする請求項 1〜 5 の何れか一に記載の抑制剤。
7. 腫瘍細胞のアポトーシスの誘発をマーカーとする請求項 1〜 6の何れか一に 記載の抑制剤。
8. 腫瘍細胞が、 コラーゲンの発現量が減少していることを特徴とする請求項 1 〜 7の何れか一に記載の抑制剤。
9. 腫瘍細胞が、 以下の少なくとも 1から選ばれる請求項 1〜 8の何れか一に記 載の抑制剤。
1) グリオブラストーマ細胞 （T98G)
2) 乳癌細胞 (MCF-7)
10. 請求項 1〜 9の何れか一に記載の抑制剤を用い、 生体内の腫瘍細胞内に、 コラーゲン遺伝子及びその相同物を導入することを特徴とする腫瘍細胞の増殖 及び/又は浸潤の抑制方法。
1 1. 請求項 10の抑制方法を使用する腫瘍の治療方法。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8765709B2 (en) 2004-11-12 2014-07-01 Asuragen, Inc. Methods and compositions involving miRNA and miRNA inhibitor molecules
US9080215B2 (en) 2007-09-14 2015-07-14 Asuragen, Inc. MicroRNAs differentially expressed in cervical cancer and uses thereof
US9365852B2 (en) 2008-05-08 2016-06-14 Mirna Therapeutics, Inc. Compositions and methods related to miRNA modulation of neovascularization or angiogenesis
US9644241B2 (en) 2011-09-13 2017-05-09 Interpace Diagnostics, Llc Methods and compositions involving miR-135B for distinguishing pancreatic cancer from benign pancreatic disease
US10047388B2 (en) 2004-05-28 2018-08-14 Asuragen, Inc. Methods and compositions involving MicroRNA

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999049885A2 (en) * 1998-03-27 1999-10-07 University Of Kansas Medical Center The use of isolated domains of type iv collagen to modify cell and tissue interactions
JP2000511511A (ja) * 1996-04-22 2000-09-05 ハエモペップ ファルマ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 腫瘍成長阻害及び毛細管増殖のための生物学的活性タンパク質、コラーゲンフラグメントＨＦ―ＣＯＬＬ―１８／５１４ｃｆ
WO2000054801A1 (en) * 1999-03-17 2000-09-21 Entremed, Inc. Compositions and methods of use of ldl-like receptor ligands for the treatment of cancer and angiogenic-based disease
JP2002173446A (ja) * 2000-08-30 2002-06-21 Morisuke Yokoyama 健康食品等の飲食物・医薬品

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000511511A (ja) * 1996-04-22 2000-09-05 ハエモペップ ファルマ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 腫瘍成長阻害及び毛細管増殖のための生物学的活性タンパク質、コラーゲンフラグメントＨＦ―ＣＯＬＬ―１８／５１４ｃｆ
WO1999049885A2 (en) * 1998-03-27 1999-10-07 University Of Kansas Medical Center The use of isolated domains of type iv collagen to modify cell and tissue interactions
WO2000054801A1 (en) * 1999-03-17 2000-09-21 Entremed, Inc. Compositions and methods of use of ldl-like receptor ligands for the treatment of cancer and angiogenic-based disease
JP2002173446A (ja) * 2000-08-30 2002-06-21 Morisuke Yokoyama 健康食品等の飲食物・医薬品

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10047388B2 (en) 2004-05-28 2018-08-14 Asuragen, Inc. Methods and compositions involving MicroRNA
US8765709B2 (en) 2004-11-12 2014-07-01 Asuragen, Inc. Methods and compositions involving miRNA and miRNA inhibitor molecules
US8946177B2 (en) 2004-11-12 2015-02-03 Mima Therapeutics, Inc Methods and compositions involving miRNA and miRNA inhibitor molecules
US9447414B2 (en) 2004-11-12 2016-09-20 Asuragen, Inc. Methods and compositions involving miRNA and miRNA inhibitor molecules
US9506061B2 (en) 2004-11-12 2016-11-29 Asuragen, Inc. Methods and compositions involving miRNA and miRNA inhibitor molecules
US9080215B2 (en) 2007-09-14 2015-07-14 Asuragen, Inc. MicroRNAs differentially expressed in cervical cancer and uses thereof
US9365852B2 (en) 2008-05-08 2016-06-14 Mirna Therapeutics, Inc. Compositions and methods related to miRNA modulation of neovascularization or angiogenesis
US9644241B2 (en) 2011-09-13 2017-05-09 Interpace Diagnostics, Llc Methods and compositions involving miR-135B for distinguishing pancreatic cancer from benign pancreatic disease
US10655184B2 (en) 2011-09-13 2020-05-19 Interpace Diagnostics, Llc Methods and compositions involving miR-135b for distinguishing pancreatic cancer from benign pancreatic disease

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