KR100959199B1 - 신규한 피53 타겟 유전자 에스아이에스피-1 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 암 억제 유전자인 p53에 의해 전사가 유도되는 신규한 p53 타겟 유전자 SISP-1 (Stress Induced Secreted Protein-1) 및 SISP-1 단백질에 관한 것이다. 본 발명의 발명자는 SISP-1가 p53과의 상호작용을 통하여 아폽토시스를 유도한다는 것을 최초로 밝혔다. 본 발명은 종양 등과 같은 비정상적인 아폽토시스와 관련된 질병들을 치료하기 위한 상기 유전자 또는 단백질의 용도를 제공한다.

SISP-1, p53, 아폽토시스

Description

신규한 피53 타겟 유전자 에스아이에스피-1 및 그의 용도{SISP-1, a novel p53 target gene and use thereof}

도1은 SISP-1의 cDNA 의 뉴클레오티드 서열이다.

도2는 SISP-1의 아미노산 서열(A) 및 일차 구조의 기능적 도메인을 개략적으로 나타낸 것(B)이다.

도3은 SISP-1 프로모터 서열에서의 p53 결합부위를 보여준다.

도4A는 유전자독성 스트레스 또는 암 억제자 p53에 대응한 SISP-1의 유도를, 도4B는 SISP-1의 전사적 활성이 암 억제자 p53에 의해 자극된다는 것을 보여주는 노던 블로팅 실험의 결과이다.

도5는 C-말단 또는 N-말단에 myc 또는 HA로 표지한 SISP-1을 발현시킨 후, 세포 용출액 및 세포배양배지를 웨스턴 블로팅 분석을 한 결과이다. 결과는 SISP-1 이 분비단백질임을 보여준다.

도6은 SISP-1 함유 배지가 인간 백혈병 세포(Jurkat cell line)를 사멸시킨다는 것을 보여주는 세포 사멸 엘리사(Cell Death Elisa) 분석의 결과이다.

도7은 SISP-1이 캐스파제-8, PARP를 포함하는 프로-아폽토시스 마커를 활성화시키고, 프로-생존 단백질 AKT의 발현을 감소시킨다는 것을 보여주는 웨스턴 블로팅 실험의 결과이다.

도8은 SISP-1 과발현이 인간결장암세포(HCT116; 도8A) 및 유방암세포(MDAMB435; 도8B)에서 아폽토시스를 유도하고, 에토포사이드 (ETO)-유도 아폽토시스를 민감하게 한다는 것을 보여주는 세포 사멸 엘리사(Cell Death Elisa) 분석의 결과이다.

도9는 테트라사이클린-조절된 SISP-1의 유도성 발현이 화학요법에 내성을 갖는 골육종세포(USO5)에서의 에토포사이드-유도 아폽토시스를 유의하게 민감화시킨다는 것을 보여주는 세포 사멸 엘리사(Cell Death Elisa) 분석 및 생존분석(크리스탈바이올렛 염색)의 결과이다.

도10은 테트라사이클린-조절된 SISP-1의 유도성 발현이 골육종세포(USO5)와 인간방광암세포(EJ)에서 에토포사이드-유도 아폽토시스를 유의하게 민감화시킨다는 것을 보여주는 세포 사멸 엘리사(Cell Death Elisa) 분석의 결과이다.

도11은 정상적인 섬유아세포(IMR90)이 SISP-1 유도 아폽토시스에 대항적임을 보여주는 세포 사멸 엘리사(Cell Death Elisa) 분석 결과이다.

도12는 인간 정상 조직 및 암세포에서의 SISP-1의 발현 정도를 노던블럿분석 결과를 통하여 보여준다. SISP-1의 발현이 정상적인 유방세포와 비교하여 인간 유방암세포에서 유의하게 감소되었다.

도13 내지 도20은 SISP-1의 gDNA의 뉴클레오티드 서열이다. 엑손의 뉴클레오티드들은 굵은 글씨체로 표시되었으며, 비번역부분 (untranslated region) 은 이탤릭체로 나타내었다.

도21는 SISP-1의 mRNA 서열이다. 밑줄친 부분은 p53 결합부위이다.

도22는 비번역부분이 포함되지 않은 SISP-1 mRNA의 서열이다.

도23 및 도24는 비번역부분을 포함하는 SISP-1 mRNA의 서열이다. 비번역부분의 뉴클레오티드는 이탤릭체로 나타내었다.

본 발명은 암 억제 유전자인 p53에 의해 전사가 유도되는 신규한 p53 타겟 유전자 SISP-1 (Stress Induced Secreted Protein-1) 및 SISP-1 단백질에 관한 것이다. 또한 본 발명은 아폽토시스를 조절하여 종양 등과 같은 비정상적인 아폽토시스와 관련된 질병들을 치료하기 위한 상기 유전자 또는 단백질의 용도에 관한 것이다.

아폽토시스는 '프로그램화된 세포사멸'이라고도 불리는데, 일련의 프로그램화된 사건에 의하여 주위에 해로운 물질이 방출되지 않고 세포가 제거되는 세포사멸의 한 형태이다. 아폽토시스는 늙은 세포나 불필요한 세포, 건강하지 못한 세포를 제거함으로써 생명체의 생명 유지에 결정적인 역할을 한다. 아폽토시스 과정은 발생, 분화, 증식/항상성유지, 면역계의 기능 및 조절, 결함이 있는 세포의 제거 등 광범위한 생물학적 현상과 관련이 있다. 그러나 아폽토시스가 너무 적게 일어나거나 또는 과다하게 일어날 경우 많은 질병을 초래하게 된다. 아폽토시스 과정에 결함이 생길 경우엔 종양, 자가면역질환 또는 박테리아 감염을 초래할 수 있으 며, 과도한 아폽토시스는 알쯔하이머, 헌팅톤, 파킨슨씨 병과 같은 신경퇴행성 질병, 후천성 면역결핍증(AIDS), 허혈성 질환(ischemic diseases)을 초래하거나 악화시킨다(Fadeel B, Orrenius S, Zhivotovsky B. Apoptosis in human disease: a new skin for the old ceremony? Biochem Biophys Res Commun . 266(3), 699-717(1999)). 따라서 아폽토시스의 조절은 아폽토시스와 관련된 질병들을 치료하거나 예방하는데 있어 매우 중요하다.

종양은 통제할 수 없는 세포 분열에 의한 비정상적인 조직의 성장을 특징으로 하는 질병군을 총칭한다. 세포증식은 거의 모든 조직에서 일어나며, 상처나 면역반응에 대응하기 위하여, 또는 피부나 소화기관의 점막과 같은 조직에서 일어나는 생리주기의 한 부분으로써, 죽거나 떨어져 나온 세포를 대체하기 위하여 일어나는 정상적인 생리과정이다. 정상적으로는 기관이나 조직의 유지를 위하여 세포증식과 세포사멸 사이의 균형이 엄격하게 조절된다. 그러나, 세포가 통제되지 않고 빠르게 증식하게 되면 양성 종양 또는 악성종양(암)을 초래할 수 있다. 통제되지 않은 세포의 성장은 DNA의 손상으로 인하여 세포의 분열을 조절하는 단백질을 암호화하는 유전자의 변성을 가져옴으로써 유발된다.

종양은 유전자 변성이 서서히 쌓임으로써 생기는 다단계 과정에 의하여 진전된다. 이러한 변성은 다양한 정상적인 세포기능의 통제를 불가능하게 하여 종양의 발병과 진전을 초래할 수 있다. 많은 종양의 경우에 있어서, 아폽토시스를 촉진하는 프로-아폽토틱 단백질들(pro-apoptotic proteins)에 돌연변이가 일어나 불활성화되거나 또는 항-아폽토틱 단백질들 (anti-apoptotic proteins)의 발현이 증가된 다. 이로 인하여 많은 종양세포에서 아폽토시스가 적절히 진행되지 못하게 되어 종양의 성장을 억제할 수 없게 된다. 또한 화학요법에도 반응을 할 수 없게 된다.

p53은 모든 세포 내에 존재하는 아폽토시스를 촉진하는 프로-아폽토틱 (pro-apoptotic) 유전자이다. '종양억제유전자' 라고도 불리는 p53은 세포주기의 진행이나 아폽토시스를 조절함으로써 세포의 항상성을 유지하고 생명체에 종양이 발병되지 않고 생존할 수 있도록 하는데 결정적인 역할을 한다 (Vogelstein et al. Surfing the p53 network. Nature 408:307-310 (2000)). p53은 정상적일 경우 카스파제 9, 8, 7 및 3을 활성화함으로써 아폽토시스를 유도한다. p53이 불활성화되면 카스파제의 활성화이 감소되며 따라서 세포가 필요한 아폽토시스 과정을 수행하지 못하게 된다. 그러므로 p53 유전자의 불활성화는 암 발생과 밀접한 관련이 있다. 실제로, p53 유전자의 돌연변이는 암에 있어서 가장 흔히 나타나는 돌연변이로써, 모든 암종양의 절반, 모든 결장암 종양의 80%, 폐암 종양의 50%, 유방암 종양의 40%세포에 존재한다.

p53 종양억제 유전자는 스트레스 자극에 대응하여 활성화되며, 세포 주기 검문체계(checkpoint) 및 아폽토시스를 포함하는 항증식성 반응을 촉진하는 전사인자로서 기능한다 (Ko, L. J. & Prives, C. p53: puzzle and paradigm. Genes Dev. 10, 1054-72 (1996); Levine, A. J. p53, the cellular gatekeeper for growth and division. Cell 88, 323-331 (1997); Oren, M. Decision making by p53: life, death and cancer. Cell Death Differ . 10, 431-442 (2003); Benchimol, S. p53-an examination of sibling support in apoptosis control. Cancer Cell 6, 3-4 (2004); Harms, K., Nozell, S. & Chen, X. The common and distinct target genes of the p53 family transcription factors. Cell Mol . Life Sci . 61, 822-842 (2004)). p53 종양억제유전자는 유전독성제 또는 화학요법제에 대응하여 아폽토시스를 강력하게 유도하여 잠재적으로 암으로 될 수 있는 세포들을 제거하는 전사인자 p53 단백질을 코딩한다. p53 단백질은 DNA 손상이나 저산소증에 대응하여 특정 DNA 타겟 서열에 높은 친화력을 갖는 전사인자로서 기능하며, 스트레스를 받은 세포나 비정상적인 세포들을 선택적으로 파괴하여 이들이 암으로 발전하는 것을 막는다.

p53에 의하여 활성화되는 유전자들이 많이 있으며, 이러한 활성화는 세포의 세포주기를 G1이나 G2에서 정지시키거나 아폽토시스를 일으킨다. p53의 G1 정지기를 활성화하는 기전은 잘 밝혀져 있으며, 사이클린-의존성 키나아제 저해제인 p21^waf1의 전사적 활성을 일차적으로 포함하는 것으로 알려져 있다. 그러나 p53에 의하여 일어나는 아폽토시스에 대한 p53 전사 프로그램에 대하여는 아직 명확하게 밝혀지지 않다.　 종전에 동정되었던 아폽토시스를 촉진하는 p53 프로-아폽토틱 타겟 유전자들 중에서, TNFR 수퍼패밀리 멤버인 Fas/Apo1/CD95 및 DR5/KILLER는 유전독성 약물에 대응하여 p53-의존적 방식으로 조절된다는 것이 보고된 바 있다 (Wu, G. S. et al . KILLER/DR5 is a DNA damage-inducible p53-regulated death receptor gene. Nat . Genet . 17, 141-143 (1997); Owen-Schaub, L. B. et al . Wild-type human p53 and a temperature-sensitive mutant induce Fas/APO-1 expression. Mol . Cell. Biol . 15, 3032-3040 (1995); Zalcenstein, A. et al . Mutant p53 gain of function: repression of CD95(Fas/APO-1) gene expression by tumor-associated p53 mutants. Oncogene 22, 5667-5676 (2003)). 이는 아폽토시스가 일어나는 경로인, p53가 매개된 내인적 경로와 TNF에 의하여 유도되는 외인적 경로 간의 연결 가능성을 제시한다.　 TNF-α는 숙주 면역 반응뿐만 아니라 세포 증식, 분화 및 아폽토시스의 조절에 있어서 다면발현성 기능을 조절하는 중요한 사이토카인이다 (Ashkenazi, A. & Dixit, V. M. Death receptors: signaling and modulation. Science 281, 1305-1308 (1998); Baud, V. & Karin, M. Signal transduction by tumor necrosis factor and its relatives. Trends Cell Biol. 11, 372-377 (2001); Chen, G. & Goeddel, D. V. TNF-R1 signaling: a beautiful pathway. Science 296, 1634-1635 (2002); Wajant, H., Pfizenmaier, K. & Scheurich, P. Tumor necrosis factor signaling. Cell Death Differ . 10, 45-65 (2003); Fesik, S.W. Promoting apoptosis as a strategy for cancer drug discovery. Nat Rev Cancer 5:876-885 (2005); Rowinsky, E.K. Targeted induction of apoptosis in cancer management: the emerging role of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor activating agents. J. Clin . Oncol. 23:9394-9407, (2005)).　 생리학적으로, TNF-α의 분비는 매우 국소적이며 일시적이나, 독성이 있는 것으로 보인다.　 그러나 TNF-α 를 효율적으로 생산할 수 있도록 하는 조절 메카니즘에 대하여는 아직 명확하게 알려져 있지 않다.　 아폽토시스와 관련된 질병의 효과적인 예방 또는 치료방법을 찾아 내기 위해서는 아폽토 시스와 관련된 메커니즘을 명확하게 밝히는 것이 중요하다.

비정상적인 아폽토시스 경로를 정상적인 아폽토시스 경로로 회복시킬 수 있는 약물은 아폽토시스 경로를 이탈하여 생기는 질병을 효율적으로 치료할 수 있는 잠재력이 있다. 최근, 많은 잠재적인 아폽토시스 유도제들이 암치료제로 사용될 가능성이 있는지 여부를 알아내기 위하여 연구되고 있으나, 대부분의 약물들은 정상세포에 대하여 독성을 나타내며, 심각한 부작용이 있는 실정이다. 따라서 새로운 암치료용 아폽토시스 타겟 또는 아폽토시스 유도제를 찾아내고 개발하는데 많은 노력을 기울일 필요가 있다.

이곳에 기재된 정보들은 단지 본 발명의 기술적 배경에 대한 이해를 돕고자 하는 것으로서, 본 발명에 대한 선행기술로써 작용할 수 없음은 당연한 일이다.

p53이 매개된 아폽토시스의 메커니즘은 아직도 많은 면에 있어서 완전히 이해되지 않고 있다. 아폽토시스와 관련된 질병의 효율적인 치료법을 찾아 내기 위해서는 아폽토시스의 메커니즘을 명확히 이해하는 것이 필요하다. 따라서 본 발명에서는 p53이 매개된 아폽토시스의 메커니즘을 보다 명확히 밝히고자 한다. 또한 본 발명에서는 p53 과 상호작용하여 아폽토시스를 조절 또는 촉진하는 새로운 인자를 찾아 내고, 아폽토시스의 조절과 관련된 용도, 예를 들어 종양의 예방, 치료, 진단방법 등을 위한 새로운 방안으로 상기 인자를 활용하는 방법을 제공하고자 한다.

본 발명은 종양세포의 아폽토시스를 촉진하는p53 타겟 유전자 SISP-1(Stress Induced Secreted Protein 1)의 발견에 기초한 것이다. 본 발명의 발명자는 SISP-1이 아폽토시스를 유도한다는 것을 최초로 밝혀 내었다. 이로부터 본 발명은 SISP-1 단백질 및 이를 암호화하는 유전자를 제공한다. 또한 본 발명은 아폽토시스의 조절, 비정상적인 아폽토시스와 관련된 질병, 특히 p53과 관련된 종양의 진단, 모니터링, 치료 및 예방 등의 넓은 범위에의 적용 용도를 제공한다.

본 발명의 SISP-1은 본 특허출원의 우선권 주장의 기초가 되는 미국 가출원 60/767,047에 기재된 TSSP-1과 동일한 것으로서, 이는 상기 가출원의 도1과 본 출원의 도2의 아미노산 서열이 동일한 것으로부터 명확히 확인된다.

본 발명은 다음 기재된 사항들을 제공한다.

[1] 세포에서 아폽토시스를 유도하는 하기 기재된 서열로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 폴리펩티드, 이의 유도체, 단편 또는 종 특이 상동체.

(a) 서열번호 2의 아미노산 서열;

(b) 서열번호 2의 서열과 75% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열;

(c) 서열번호 2의 서열과 90% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및

(d) 서열번호 2의 서열에서 1개 내지 10개의 아미노산이 결실, 부가, 삽입 또는 치환된 아미노산 서열.

[2] 하기 기재된 서열로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자, 이의 유도체, 단편 또는 종 특이 상동체.

(a) [1]의 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 또는 그의 상보체;

(b) 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열 또는 그의 상보체;

(c) 서열번호 3, 서열번호 4 또는 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열 또는 그의 상보체; 및

(d) 엄격한 조건에서 상기 (a) 내지 (c)에 기재된 서열로 이루어지는 핵산 분자에 혼성화하는 핵산분자의 뉴클레오티드 서열.

[3] [1]의 폴리펩티드에 특이적인 항체, 그의 단편, 유도체 또는 상동체.

[4] [2]의 핵산분자를 포함하는 재조합 발현 벡터.

[5] [2]의 핵산분자를 포함하는 바이러스성 수송체.

[6] [2]의 핵산분자를 포함하는 비바이러스성 수송체.

[7] [2]의 핵산분자로 형질전환된 숙주세포.

[8] [1]의 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 상보적으로 결합하며, 상기 폴리펩티드의 발현을 억제할 수 있는 뉴클레오티드로 이루어진 안티센스 올리고뉴클레오티드.

[9] 비정상적으로 증식하는 세포에서 아폽토시스를 유도하기 위하여 치료적 유효량의 [1]의 폴리펩티드, [2]의 핵산분자, [2]의 핵산 분자를 포함하는 바이러스성 수송체 및/또는 [2]의 핵산분자를 포함하는 비바이러스성 수송체를 환자에게 투여하는 것을 포함하는 비정상적인 세포증식과 관련된 질병의 치료 또는 예방방법.

[10] [9]에 있어서, 상기 질병이 종양인 것인 치료 또는 예방방법

[11] [10]에 있어서, 상기 종양이 담낭암, 혈액 및 골수의 혈액 악성 종양, 백혈병, 림프종, 호지킨씨병, 비호지킨씨병, 다발성골수종, 뇌암, 유방암, 경부암, 결장암, 직장암, 항문암, 충수암, 식도암, 자궁암, 간암, 위암, 후두암, 폐암, 늑막암, 심막암, 구강암, 골육종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신장암, 폐포횡문근육종, 피부암, 고환암 및 갑상선암으로 구성된 군에서 선택된 것인 치료 또는 예방 방법.

[12] 치료적 유효량의 [1]의 폴리펩티드, [2]의 핵산분자, [2]의 핵산분자를 포함하는 바이러스성 수송체 및/또는 [2]의 핵산분자를 포함하는 비바이러스성 수송체, 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물.

[13] 치료적 유효량의 [1]의 폴리펩티드, [2]의 핵산분자, [2]의 핵산분자를 포함하는 바이러스성 수송체 및/또는 [2]의 핵산분자를 포함하는 비바이러스성 수송체, 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 비정상적인 세포 증식과 관련된 질병의 치료 또는 예방용 약학 조성물.

[14] [13]에 있어서, 상기 질병이 종양인 것인 약학 조성물.

[15] [14]에 있어서, 상기 종양이 담낭암, 혈액 및 골수의 혈액 악성 종양, 백혈병, 림프종, 호지킨씨병, 비호지킨씨병, 다발성골수종, 뇌암, 유방암, 경부암, 결장암, 직장암, 항문암, 충수암, 식도암, 자궁암, 간암, 위암, 후두암, 폐암, 늑막암, 심막암, 구강암, 골육종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신장암, 폐포횡문근육종, 피부암, 고환암 및 갑상선암으로 구성된 군에서 선택된 것인 약학 조성물.

[16] 질병과 관련된 조직이나 대상에 치료적 유효량의 [1]의 폴리펩티드, [2]의 핵산분자, [2]의 핵산 분자를 포함하는 바이러스성 수송체 및/또는 [2]의 핵산분자를 포함하는 비바이러스성 수송체를 투여하는 것을 포함하는 세포에서 아폽토시스를 유도하는 방법.

[17] [16]에 있어서, 상기 질병이 종양인 것인 아폽토시스를 유도하는 방법.

[18] [17]에 있어서, 상기 종양이 담낭암, 혈액 및 골수의 혈액 악성 종양, 백혈병, 림프종, 호지킨씨병, 비호지킨씨병, 다발성골수종, 뇌암, 유방암, 경부암, 결장암, 직장암, 항문암, 충수암, 식도암, 자궁암, 간암, 위암, 후두암, 폐암, 늑막암, 심막암, 구강암, 골육종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신장암, 폐포횡문근육종, 피부암, 고환암 및 갑상선암으로 구성된 군에서 선택된 것인 아폽토시스를 유도하는 방법.

[19] 치료적 유효량의 [1]의 폴리펩티드, [2]의 핵산분자, [2]의 핵산분자를 포함하는 바이러스성 수송체 및/또는 [2]의 핵산분자를 포함하는 비바이러스성 수송체, 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 목표 포유동물 조직에서 아폽토시스를 유도하기 위한 약학 조성물.

[20] [19]에 있어서, 상기 목표 포유동물 조직이 종양과 관련이 있는 것인 아폽토시스를 유도하기 위한 약학 조성물.

[21] [20]에 있어서, 상기 종양이 담낭암, 혈액 및 골수의 혈액 악성 종양, 백혈병, 림프종, 호지킨씨병, 비호지킨씨병, 다발성골수종, 뇌암, 유방암, 경부암, 결장암, 직장암, 항문암, 충수암, 식도암, 자궁암, 간암, 위암, 후두암, 폐암, 늑 막암, 심막암, 구강암, 골육종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신장암, 폐포횡문근육종, 피부암, 고환암 및 갑상선암으로 구성된 군에서 선택된 것인 약학 조성물.

[22] 환자의 시료에서 SISP-1 단백질의 발현 또는 SISP-1 mRNA의 유도 정도를 분석하고, 이 때 SISP-1 단백질 또는 SISP-1 mRNA의 수준이 정상보다 낮게 감소되었으면 종양이 발생할 가능성이 높거나, 종양이 발생된 것으로 판단하는 것을 포함하는, 종양발생가능예측방법 또는 종양 발생여부의 판단방법.

[23] (a) SISP-1 단백질과 반응하는 적어도 하나의 물질 및 (b) SISP-1 단백질의 발현 또는 SISP-1 mRNA의 유도를 측정하기에 적합한 반응물을 포함하는 종양 발병가능성 예측용 또는 종양 진단용 키트.

[24] [23]에 있어서, SISP-1 단백질과 반응하는 적어도 하나의 물질이 SISP-1 단백질에 선택적인 항체 또는 그의 단편인 키트.

[25] [23]에 있어서, SISP-1 mRNA와 반응하는 적어도 하나의 물질이 SISP-1 mRNA의 상보체 또는 그의 단편인 키트.

[26] [23] 내지 [25] 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 물질이 검출가능한 마커로 표지된 것인 키트.

[27] 치료를 받고 있는 환자로부터의 시료에서 SISP-1 단백질의 발현 또는 SISP-1 mRNA의 유도를 분석하며, 이 때 SISP-1 단백질 또는 SISP-1 mRNA의 수준이 정상이거나 또는 치료 전보다 증가되었음이 관찰되면 종양치료가 효과적인 것으로 판단하고, SISP-1 단백질 또는 SISP-1 mRNA의 수준이 정상보다 낮은 것이 관찰되면 종양 치료를 계속할 필요가 있는 것으로 판단하는 것을 포함하는, 종양 치료를 받 았거나 받고 있는 환자에서 종양 치료의 효과를 모니터링하는 방법.

[28] (a) [2]의 핵산분자를 갖는 세포를 배양하여 상기 핵산 분자의 발현 수준을 측정하는 단계; (b) (a)와는 별도로 [2]의 핵산분자를 갖는 세포를 후보물질을 포함하는 시료와 함께 (a)와 같은 조건에서 배양하여 상기 핵산 분자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 발현수준이 (a) 단계의 발현수준 보다 감소 또는 증가된 시료 내의 후보물질을 선택하는 단계를 포함하는 아폽토시스 조절제로 사용하기 위한 화합물을 스크리닝하는 방법.

[29] [28]에 있어서, 상기 핵산분자를 갖는 세포가 핵산분자와 리포터유전자가 작동가능하게 연결된 구조를 갖는 벡터를 함유하는 세포이고, 상기 핵산분자의 발현 수준을 측정하는 단계가 리포터 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계인 아폽토시스 조절제로 사용하기 위한 화합물을 스크리닝하는 방법.

[30] (a) 후보물질을 포함하는 시료를 [1]의 폴리펩티드 또는 [2]의 핵산 분자와 접촉시키는 단계; (b) 상기 폴리펩티드 또는 핵산 분자에 대한 후보물질의 결합능을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 단백질이나 핵산 분자에의 결합능을 갖는 화합물을 선택하는 단계를 포함하는 아폽토시스 조절제로 사용하기 위한 화합물을 스크리닝 하는 방법.

[31] (a) [1]의 폴리펩티드 또는 [2]의 핵산 분자에 의하여 아폽토시스가 민감하게 일어나는 종양세포를 포함하는 시험관내 시스템을 제조하는 단계; (b) [1]의 폴리펩티드 또는 [2]의 핵산 분자와 후보물질을 포함하는 시료를 함께 상기 시험관 내 시스템과 접촉시키는 단계; (c) 상기 종양 세포의 아폽토시스 정도를 측정 하는 단계; 및 (d) (c)에서 측정한 아폽토시스 정도가 후보물질을 포함하는 시료없이 [1]의 폴리펩티드 또는 [2]의 핵산 분자 만을 상기 시험관 내 시스템과 접촉시켰을 때의 종양 세포의 아폽토시스 정도에 비하여 증가되거나 감소된 시료의 후보물질을 선택하는 단계를 포함하는 아폽토시스 조절제로 사용하기 위한 화합물을 스크리닝하기 위한 방법.

[32] [31]에 있어서, 아폽토시스 조절제가 종양치료제인 방법.

[33] (a) [1]의 폴리펩티드 또는 [2]의 핵산 분자에 의하여 아폽토시스가 민감하게 일어나는 종양세포; (b) [1]의 폴리펩티드 또는 [2]의 핵산 분자; 및 (c) 상기 종양세포의 아폽토시스 정도를 측정할 수 있는 반응물을 포함하는 아폽토시스 조절제로 사용하기 위한 화합물의 스크리닝용 키트.

[34] [2]의 핵산분자를 갖는 세포 및 (b) 상기 핵산 분자의 발현 수준을 측정할 수 있는 반응물을 포함하는 아폽토시스 조절제로 사용하기 위한 화합물의 스크리닝용 키트.

[35] [2]의 핵산분자와 리포터 유전자가 작동가능하게 연결된 구조를 갖는 벡터를 함유하는 세포 및 (b) 상기 리포터 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 반응물을 포함하는 아폽토시스 조절제로 사용하기 위한 화합물의 스크리닝용 키트.

[36] [34] 또는 [35] 중 어느 하나에 있어서, 상기 리포터 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 반응물이 측정가능한 마커로 표지되어 있는 것인 키트.

[37] [34] 또는 [35] 중 어느 하나에 있어서, 상기 리포터 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 반응물이 [1]의 폴리펩티드에 특이적인 항체 또는 그의 단편, 유도체, 또는 상동체인 키트.

[38] [34] 또는 [35] 중 어느 하나에 있어서, 상기 발현 수준을 측정하기 위한 반응물이 SISP-1 mRNA의 상보체 또는 그의 단편인 키트.

[39] 화학요법제를 투여받는 환자에 치료적 유효량의 [1]의 폴리펩티드 또는 [2]의 핵산 분자, [2]의 핵산분자를 포함하는 바이러스성 수송체 및/또는 [2]의 핵산분자를 포함하는 비바이러스성 수송체를 투여하는 단계를 포함하는, 화합요법제에 대한 종양세포의 감수성을 민감화 시키는 방법.

[40] 치료적 유효량의 [1]의 폴리펩티드 또는 [2]의 핵산 분자, [2]의 핵산분자를 포함하는 바이러스성 수송체 및/또는 [2]의 핵산분자를 포함하는 비바이러스성 수송체, 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 화학요법제에 대한 종양세포의 감수성을 민감화 시키기 위한 약학 조성물.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명하고자 한다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다.

본 발명은 p53에 의해 전사가 유도되는 신규한 p53 타겟 유전자 SISP-1(Stress Induced Secreted Protein 1) 및 상기 유전자에 의하여 코딩되는 SISP-1 단백질에 관한 것이다. 본 발명의 발명자는 암세포에서의 SISP-1의 과발현이 세포사멸을 유도하기에 충분하다는 것을 발견하였다.

본 발명자는 아폽토시스 과정 동안 p53에 의해 조절되는 전사 표적을 동정하기 위해, p53-유도가능 세포주 (p53-inducible)를 이용하여 유전자 발현 배열 분석을 수행하였으며, p53이 존재할 때와 존재하지 않을 때의 유전자발현 정도를 비교하였다. 그 결과 p53에 의해 발현이 증가되는 신규한 유전자 SISP-1(Stress Induced Secreted Protein-1)이 동정되었다. SISP-1의 cDNA(도1; 서열번호 1)은 약 35kDa의 예상분자질량을 갖는 311개의 아미노산으로 구성된 단백질, 즉 서열번호 2의 아미노산 서열(도2A)을 갖는 SISP-1 단백질을 코딩한다. 아미노산 서열분석으로부터, SISP-1의 N-말단부위 (제29번 내지 제148번 아미노산)가 아폽토시스와 관련된 단백질들에 종종 나타나는 IG-like/death 도메인 모티프(도2B)와 서열 상동성이 높다는 것이 확인되었다.

본 발명의 발명자는 또한 SISP-1의 게놈 DNA 서열 내의 잠재적인p53 결합 사이트를 검색하였다. 프로모터 지역에서 4개의 잠재적 결합 사이트가 확인되었으며(도3, 도4B), 이들은 p53-공통 결합 부위(p53-consensus binding sites)에 대하여 85% 이상이 대응(match) 된다는 것이 밝혀졌다. 그러나 이들 4개의 잠재적인 p53 결합부위에 대하여 기능분석을 한 결과, 그 중에서 하나의 잠재적 결합 부위 즉 전사개시부위로부터 475bp 업스트림 부위가 활성을 갖는다는 것을 밝혔다(도3). 또한 본 발명의 발명자는 SISP-1이 정상세포에서는 아폽토시스를 유도하지 않으나 종양세포에서 발현되면 아폽토시스를 유도한다는 것을 발견하였다.

따라서 본 발명은 아폽토시스를 유도하는 SISP-1 단백질, 이를 암호화하는 서열을 포함하는 핵산 분자 및 기능적으로 동등한 변이체, 유도체, 단편 및 종 특 이 상동체를 제공한다. SISP-1 단백질로는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 예로 들 수 있다. 본 발명은 아폽토시스를 유도하는 기능이 있는 한 SISP-1 단백질과 구조적으로 유사한 모든 단백질들을 포함한다. 이러한 유사체에는 SISP-1 단백질 돌연변이체 및 다른 종으로부터 유래한 SISP-1 단백질을 포함한다. 세포에 아폽토시스가 일어났는지의 여부는 본 기술 분야의 당업자들이 통상 사용하는 방법으로 확인할 수 있다. 예를 들어 실시예 6 내지 8에서와 같이 상업적으로 구입가능한 키트를 사용하여 세포사멸엘리사(Cell-Death Elisa) 방법이 수행될 수 있다.

본 발명은 천연의 SISP-1 단백질의 아미노산이 자연적인 또는 인위적인 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입에 의하여 변화된 서열을 갖으며, 아폽토시스를 유도할 수 있는 활성을 갖는 단백질을 포함한다. 바람직하기로는, 치환되는 아미노산은 아래 분류된 바와 같이 치환될 아미노산과 유사한 성질을 갖는 것으로 치환될 수 있다. 예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 메티오닌, 페닐알라닌 및 트립토판은 모두 비극성 아미노산으로 분류되며, 이들은 서로 비슷한 성질을 갖는다. 전하를 띄지 않는 아미노산으로는 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라진, 글루타민을 들 수 있으며, 산성 아미노산으로는 아스파르산, 글루타민산을, 염기성 아미노산으로는 리신, 아르기닌, 히스티딘을 들 수 있다. 인위적으로 단백질을 변형시킬 때는 보통 30개 이하의 아미노산을, 바람직하게는 10개 이하의 아미노산을, 보다 바람직하게는 5개 이하의 아미노산을 변형시킨다.

본 발명은 또한 SISP-1 단백질 서열(예를 들어 서열번호 2의 서열)과 50% 이 상의 동일성, 바람직하게는 75% 이상의 동일성, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.

상기 단백질들은 공지의 돌연변이 방법, 예를 들어 결실-돌연변이 방법 (Kowalski D. et al., J. Biochem., 15, 4457), PCT 법, 쿤켈법 (Kunkel method)등을 사용하여 제조할 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 단백질의 단편을 포함한다. 이들 단편은 천연의 전장 단백질과 비교할 때, 예를 들어, N-말단, C-말단 또는 내부의 아미노산 잔기가 잘려 나간 것일 수 있다. 어떤 단편들은 SISP-1 단백질의 생물학적 활성에 지장을 주지 않는 아미노산 잔기가 결실된 것일 수 있다. 이들 단편은 당해 기술 분야에서 잘 알려진 방법, 예를 들어 유전공학적 기법, 고체상기술(solid-phase technique)을 사용하는 펩티드 합성 방법(Merrifield, J. Am. Chem.Soc., 85 : 2149-2154 (1963)) 또는 본 발명의 단백질을 적당한 펩티다제로 절단하는 등의 방법으로 제조할 수 있다.

본 발명의 단백질은 천연 단백질로서 제조할 수도 있고, 아래 기술되는 것과 같이 SISP-1을 암호화하는 DNA로 형질전환시킨 세포를 배양하여 회수하는 재조합 방법에 의하여 제조할 수도 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 단백질을 암호화하는 핵산분자에 관한 것이다. 상기 본 발명의 단백질을 암호화하는 핵산 분자의 형태는 본 발명의 단백질을 암호화하는 한 제한되지 않으며, 게놈DNA (gDNA), cDNA, mRNA, 합성 또는 재조합방법으로 생산된 핵산분자, 유전코드의 축퇴(degeneracy)에 의한 핵산분자를 포함하며, 이들 은 모두 이 기술 분야에 잘 알려진 방법으로 제조가 가능하다. 예를 들어 SISP-1의 gDNA는 SISP-1 유전자를 가지는 세포로부터 게놈 DNA를 추출하고, 플라스미드, 파지, 코스미드, BAC, PAC 등을 벡터로 사용하여 게놈라이브러리를 구축하고, 상기 라이브러리를 본 발명의 단백질을 암호화하는 DNA를 기초로 제작한 프로브를 이용하여 콜로니 또는 플라그 혼성화를 수행하거나, 본 발명의 단백질을 암호화하는 DNA에 특이적인 프라이머를 작성하여, 이를 이용한 폴리머라제 연쇄반응(PCR)을 행함으로써 제조할 수 있다. SISP-1의 cDNA는 SISP-1 유전자를 가지는 세포에서 추출한 mRNA를 기초로 역전사에 의하여cDNA를 합성하고, 상기와 같이cDNA라이브러리를 제작한 후, 콜로니 또는 플라그 혼성화를 수행하거나 또는 PCR을 수행하여 제조할 수 있다.

서열번호 1, 및 서열번호 3 및 4, 그리고 서열번호 6은 각각 본 발명의 SISP-1의 cDNA, gDNA 및 mRNA이다. 본 발명은 또한 본 발명의 단백질을 암호화하는 핵산분자, 또는 이의 상보체에 대한 상보체를 포함한다. 바람직하게는 상기 핵산분자는 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호4 또는 서열번호 6의 서열을 포함하는 핵산, 또는 SISP-1 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 핵산 분자에 선택적으로 혼성화(hybridize)하는 서열을 포함한다. 여기서 '선택적으로 혼성화한다'는 의미는 통상의 혼성화 조건, 바람직하게는 엄격한 혼성화 조건에서 다른 단백질을 암호화하는 DNA와는 의미있는 상호-혼성화가 일어나지 않는다는 것을 말한다. 혼성화 반응의 "엄격도"는 당업자가 용이하게 결정할 수 있으며, 일반적으로 프로브 길이, 세척 온도 및 염 농도에 따라 달라지는 실험적 계산값이다. 일반적으로 보다 긴 프 로브일수록 적합한 어닐링에 보다 높은 온도를 필요로 하며, 보다 짧은 프로브일수록 보다 낮은 온도를 필요로 한다. 혼성화는 일반적으로 상보적 가닥이 용융 온도보다 낮은 환경에 존재할 때 재어닐링되는 변성된 DNA의 능력에 따라 달라진다. 프로브와 혼성화가능한 서열 사이의 목적하는 상동성의 정도가 높을수록, 사용할 수 있는 상대적인 온도가 높아진다. 따라서, 상대적 온도보다 높아질수록 반응 조건은 더욱 엄격해지는 반면, 상대적 온도가 낮을수록 반응조건은 덜 엄격해진다. 혼성화 반응의 엄격도와 관련한 더 자세한 정보 및 설명은 문헌 (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers (1995))을 참조한다.

본 발명에서 정의된 "엄격한 조건"이란 (1) 세척시 이온 세기가 낮고 온도가 높은 조건, 예를 들어 50℃에서 0.015 M 염화나트륨/0.0015 M 시트르산 나트륨/0.1％ 소듐 도데실 술페이트를 사용하는 조건, (2) 혼성화시에 포름아미드, 예를 들어 42℃, 750 mM 염화나트륨, 75 mM 시트르산 나트륨이 함유된 50 mM 인산나트륨 완충액 (pH6.5)/0.1％ 소혈청 알부민/0.1％ 피콜/0.1％ 폴리비닐피롤리돈으로 제조한 50％(부피/부피) 포름아미드와 같은 변성제를 사용하는 조건, 또는 (3) 50％ 포름아미드, 5×SSC (0.75 M NaCl, 0.075 M 시트르산나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH6.8), 0.1％ 피로인산 나트륨, 5×덴하르트 (Denhardt) 용액, 초음파처리된 연어 정자 DNA (50<RTI/, tg/㎖), 0.1％ SDS, 및 10％ 덱스트란 술페이트를 42℃에서 사용하고, 42℃에서 0.2×SSC (염화나트륨/시트르산나트륨), 그리고 55℃에서 50％ 포름아미드로 세척하며, 55℃에서 EDTA가 함유된 0.1×SSC를 이용한 세척을 수행하 는 것이다.

본 발명의 핵산 분자는 천연 SISP-1 핵산분자에서 염기의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입이 일어난 분자도 포함하며, 이러한 핵산분자는 당업자에게 잘 알려져 있는 방법, 예를 들어, “프라이머 유도 PCR (Primer - directed PCR)(Kramer, W. & Fritz, HJ. Methods in Enzymology (1987) 154:350-367), "error-prone" PCR (Cadwell, R. C. and G. F. Joyce, PCR methods Appl (1992) 2:28-33), 유전자 셔플링 (gene-shuffling) 등에 의해 제조될 수 있다.

본 발명의 핵산 분자는 본 발명의 단백질을 재조합적인 방법으로 제조하는데 유용하다. 본 발명의 단백질을 암호화하는 핵산 분자 (예를 들어, 서열번호 1, 3, 4의 DNA 혹은 서열번호 6의 mRNA)를 적절한 발현벡터로 삽입하고, 상기 벡터를 적절한 세포로 전달하여 만든 형질전환체를 배양하고, 상기 형질전환체에 의하여 발현된 단백질을 정제함으로써, 본 발명의 단백질을 생산할 수 있다.

상기 벡터는, 예를 들어, 플라스미드, 코스미드, 바이러스입자 또는 파아지의 형태일 수 있다. 상기 벡터 내의 DNA를 클로닝하거나 발현시키기 위한 숙주세포에는 원핵세포, 효모, 고등진핵세포가 포함된다. 배지, 온도, pH 등과 같은 배양 조건은 이 기술 분야의 당업자에 의하여 과도한 실험없이도 적절하게 선택할 수 있다. 일반적으로, 세포배양의 생산성을 최대한으로 하기 위한 원리, 프로토콜, 테크닉은 Mammalian Cell Biotechnology : a Practical Approach, M. Butler, ed.(IRL Press, 1991)에서 참조할 수 있다.

발현 및 클로닝 벡터는 일반적으로 mRNA 합성을 유도하는 SISP-1코딩 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유한다. 숙주세포에 의해 인식되는 다양한 프로모터가 공지되어 있다. 원핵생물 숙주에 사용하기에 적합한 프로모터에는 β-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템, 알칼리 포스파타제, 트립토판 (trp) 프로모터시스템, 및 하이브리드 프로모터, 예를 들어 tac 프로모터가 포함된다. 또한, 세균 시스템에서 사용되는 프로모터는 SISP-1을 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된 샤인-달가노(S.D.) 서열을 함유할 수 있다.

효모 숙주에 사용하기 적합한 프로모터 서열의 예에는 3-포스포글리세레이트 키나아제 또는 다른 당분해 효소들이 포함된다. 포유동물 숙주세포내의 벡터에서 SISP-1의 전사는 바이러스, 예를 들어 폴리오마 바이러스, 계두(fowlpox) 바이러스, 아데노바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 싸이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 원숭이 바이러스 40 (Simian Virus 40) (SV40)의 게놈으로부터 얻어진 프로모터 등에 의해 조절된다.

본 발명의 단백질을 암호화하는 핵산 분자는 그의 돌연변이로 인하여 발생되는 질병의 유전자치료에 사용될 수 있다. 이 때 상기 핵산 분자를 전달하기 위하여 사용되는 벡터의 예로는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 알파바이러스 벡터, EB 바이러스 벡터, 파필로마바이러스 벡터, 포오미바이러스 벡터와 같은 바이러스성 수송체가 포함된다. 또한 양이온 리포좀, 리간드 DNA 복합체 및 유전자총(gene gun)과 같은 비바이러스성 수송체를 포함한다. 유전 자의 형질도입은 in vivo 또는 ex vivo로 수행할 수 있으며, 또한 다른 사이토카인의 유전자와 함께 도입시킬 수도 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 단백질에 선택적으로 결합하는 항체를 제공한다. 본 발명의 항체에는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 인간항체 및 인간화항체를 포함한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디 (diabody); 선형 항체 (Zapata et al., Protein Eng. 8 (10):1057-1062(1995)); 단일쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이성 항체 등이 포함된다. 항체를 파파인 (papain)으로 분해하면 2개의 동일한 항원 결합 단편, 즉 단일 항원 결합 부위가 있는 각 "Fab" 단편, 및 그 나머지인 "Fc" 단편이 생성된다. 펩신을 처리하면, 2개의 항원 결합 부위가 있으며 여전히 항원에 교차결합할 수 있는 F(ab ')2 단편이 생성된다. Fv는 완전한 항원인식 및 결합 부위를 포함하는 최소한의 항체 단편이다. 이 부위는 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 영역의 이합체로 구성되며 비공유결합으로 단단히 결합되어 있다.

폴리클로날 항체의 제조 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 폴리클로날 항체는 포유동물에 1회 이상 면역화제를 주입, 필요한 경우 면역보강제와 함께 주입하여 제조할 수 있다. 통상, 면역화제 및(또는) 면역보강제는 포유동물에 피하 주사 또는 복강내 주사로 수회 주입된다. 면역화제는 본 발명의 단백질 또는 이의 융합 단백질일 수 있다. 면역화되는 포유동물에 면역원성이 있는 것으로 공지된 단백질과 함께 면역화제를 주사하는 것이 효과적일 수 있다.

상기 면역원성 단백질의 예에는 키홀 림펫 (keyhole limpet) 헤모시아닌, 혈 청 알부민, 소의 티로글로불린 및 대두 트립신 억제제가 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 사용할 수 있는 면역보강제에는 프로인트 완전 보조제 (Freund's complete adjuvant) 및 MPL-TDM 보조제 (모노포스포릴 지질 A (monophosphoryl Lipid A), 합성 트레할로오스 디코리노미콜레이트)가 포함된다. 면역화 방법은 과도한 실험없이 당업자가 선택할 수 있다.

본 발명에 따른 모노클로날 항체는 문헌 (Kohler et al.,Nature, 256:495 (1975))에 기재된 하이브리도마 방법으로 제조할 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국특허 제4,816,576호 참조)으로 제조할 수 있다. 모노클로날 항체는 또한 예를 들어, 문헌 (Clackson et al., Nature,352:624-628 (1991) 및 Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991))에 기재된 기술을 이용하여 파지항체 라이브러리로부터 단리할 수 있다.

본원에서의 모노클로날 항체는 구체적으로, 목적하는 활성을 발휘한다면 중쇄 및(또는) 경쇄의 일부분이 특정 종으로부터 유래된 항체 또는 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이 있지만, 쇄(들)의 나머지는 다른 종으로부터 유래된 항체 또는 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체 또는 그러한 항체의 단편과 동일하거나 상동성이 있는 "키메라" 항체를 포함한다 (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)).

비-인간 (예를 들어, 쥐과 동물) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유도된 최소 서열을 포함하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 쇄 또는 그의 단편 (예를 들어, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원 결합 서열) 이다. 대부분의 경우 인간화 항체는 수용자의 상보성 결정 영역 (CDR)의 잔기를 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 마우스, 쥐 또는 토끼와 같은 인간 이외의 종 (공여자 항체)의 CDR 잔기로 치환시킨 인간 면역글로불린 (수용자 항체)을 포함한다. 몇몇 경우에, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 치환된다. 또한, 인간화항체는 수용 항체, 또는 도입되는 CDR 또는 프레임워크 서열에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 하나 이상, 일반적으로 둘 이상의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함하며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비-인간 면역글로불린의 영역에 대응하며, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 서열의 영역에 해당한다. 또한, 인간화 항체는 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 일반적으로 인간면역글로불린 영역의 일부를 포함한다 (Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)).

"단일쇄 Fv" 또는 "sFv" 항체 단편은 단일 폴리펩티드 쇄에 존재하는 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함한다. 바람직하게는, Fv 폴리펩티드는 sFv가 항원 결합에 필요한 구조를 형성하도록 하는 VH 및 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커도 포함한다.

"디아바디(diabody)"라는 용어는 동일한 폴리펩티드 쇄 내에 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함하는, 2개의 항원 결합 부위가 있는 작은 항체 단편 (VH-VL)을 말한다. 동일한 쇄에 있는 2개의 도메인을 결합시키 기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인을 다른 쇄의 상보성 도메인과 강제로 결합시켜 2개의 항원 결합부위를 생성시킨다.

본 발명은 또한 본 발명의 단백질을 암호하하는 핵산의 안티센스 올리고 뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 본 발명의 단백질의 발현을 억제하며, p53과 연관된 아폽토시스의 메커니즘을 밝히는데 사용하기 위한 시약이나 아폽토시스와 관련된 질병 치료를 위한 유전자치료용 약물을 개발하는데 유용하게 사용될 수 있다. 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 1, 3 또는 4의 뉴클레오티드 서열에서 연속적으로 적어도 15개 이상, 30개 이상, 또는 15-30개의 서열에 대한 안티센스이며, 상기 연속적인 뉴클레오티드는 전사개시 코돈을 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명의 발명자는 SISP-1이 아폽토시스, 특히 p53 의존성 아폽토시스 또는 화학요법 약물로 인한 아폽토시스를 유도한다는 것을 발견하였다. SISP-1 mRNA의 유도를 p53 이소 발현 (ectopic p53 expression) 된 세포주에서 노던블럿분석으로 확인하였다. 이 실험을 통하여 발견한 중요한 점은 암치료제에 노출될 때 일어나는 SISP-1 mRNA의 유도는 p53 기능을 갖는 세포에서 유의하게 일어나나, p53부재세포 (p53-null cell) 또는 p53이 돌연변이된 세포(p53 mutated cell)에서는 그렇지 않다는 것이다.

또한 본 발명자는 SISP-1이 캐스파제-8, PARP 등의 아폽토시스를 촉진하는 프로-아폽토시스 마커를 활성화시키고, 세포의 생존에 유리한 프로-생존 단백질 AKT의 발현을 감소시킨다는 것을 알아 내었다.

본 발명의 발명자는 다양한 세포 (예를 들어, tet-inducible-SISP-1 U2OS 세포, 아데노바이러스성 SISP1 감염된 HCT116 및 EJ 세포)에서 SISP-1 발현이 아폽토시스를 유발한다는 것을 확인하여 SISP-1가 아폽토시스를 촉진한다는 것을 보여주었다. 또한 정상세포에서는 SISP-1이 아폽토시스를 유도하지 않는다는 것을 밝혔다.

본 발명자는 또한 SISP-1의 N-말단의 절단은 프로-아폽토틱 사이토카인으로서 기능하고, DR5/TRAIL(Tumor Necrosis Factor-related apoptosis-inducing ligand) 수용체의 삼량체화 및 활성화와 관련이 있는 것으로 보이는 분비단백질을 생산한다는 것을 밝히고, SISP-1이 TRAIL-유도성 아폽토시스에 대한 U2OS 세포의 민감도를 증가시킨다는 것을 확인하였다.

본 발명자에 의한 이러한 발견들을 근거로 하여, 본 발명은 SISP-1 유전자/단백질를 사용한 아폽토시스 유발, 비정상적인 아폽토시스와 관련된 질병의 진단, 예방, 치료, 아폽토시스 조절제의 스크리닝방법 등에의 용도를 제공한다.

따라서 본 발명에서는 비정상적으로 증식하는 세포에서 아폽토시스를 유도하기 위하여 치료적 유효량의 본 발명의 단백질 (예를 들어 SISP-1폴리펩티드, 이의 유도체, 단편, 상동체), 본 발명의 핵산분자(예를 들어 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산분자, SISP-1의 gDNA, cDNA, mRNA, 이들의 유도체, 단편 및 상동체), 본 발명의 핵산분자를 포함하는 바이러스성 수송체 및/또는 본 발명의 핵산분자를 포함하는 비바이러스성 수송체를 환자에게 투여하는 것을 포함하는 비정상적인 세포증식과 관련된 질병의 치료 또는 예방방법을 제공한다. 상기 질병은 종양일 수 있다. 본 발명에 사용된 "종양"은 악성이든 양성이든 모든 신생물성 세포 성장 및 증식, 및 모든 전암성 및 암성 세포 및 조직을 포함한다.

악성 종양에는 담낭암, 혈액 및 골수의 혈액 악성 종양, 백혈병, 림프종, 호지킨씨병, 비호지킨씨병, 다발성골수종, 뇌암, 유방암, 경부암, 결장암, 직장암, 항문암, 충수암, 식도암, 자궁암, 간암, 위암, 후두암, 폐암, 늑막암, 심막암, 구강암, 골육종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신장암, 폐포횡문근육종, 피부암, 고환암 및 갑상선암이 포함될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

또한 본 발명은 치료적 유효량의 본 발명의 단백질, 본 발명의 핵산분자, 본 발명의 핵산분자를 포함하는 바이러스성 수송체 및/또는 본 발명의 핵산분자를 포함하는 비바이러스성 수송체 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 상기 약학 조성물은 비정상적인 세포 증식과 관련된 질병치료 또는 예방용 약학 조성물, 예를 들어 종양 치료 및 예방용 약학 조성물을 포함한다.

본 발명은 또한 질병과 관련된 조직이나 대상에 치료적 유효량의 본 발명의 단백질, 본 발명의 핵산분자, 본 발명의 핵산분자를 포함하는 바이러스성 수송체 및/또는 본 발명의 핵산분자를 포함하는 비바이러스성 수송체를 투여하는 것을 포함하는 세포에서 아폽토시스를 유도하는 방법을 제공하며, 상기 질병으로 종양을 포함한다.

본 발명은 또한 치료적 유효량의 본 발명의 단백질, 본 발명의 핵산분자, 본 발명의 핵산분자를 포함하는 바이러스성 수송체 및/또는 본 발명의 핵산분자를 포 함하는 비바이러스성 수송체, 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 목표 포유동물 조직에서 아폽토시스를 유도하기 위한 약학 조성물을 포함한다.

하기 실시예6 및 7에서 확인할 수 있는 바와 같이, SISP-1 유전자 또는 SISP-1 단백질을 포함하는 본 발명의 조성물은 에토포사이드 또는 캄프토세신 등의 화학요법제에 대하여 암세포를 더욱 민감하게 하여 아폽토시스를 증가시킨다.

따라서 본 발명은 화학요법제를 투여받는 환자에 치료적 유효량의 본 발명의 단백질 또는 본 발명의 핵산 분자, 본 발명의 핵산분자를 포함하는 바이러스성 수송체 및/또는 본 발명의 핵산분자를 포함하는 비바이러스성 수송체를 투여하는 단계를 포함하는, 화학요법제에 대한 종양세포의 감수성을 민감화 시키는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 치료적 유효량의 본 발명의 단백질 또는 본 발명의 핵산 분자, 본 발명의 핵산분자를 포함하는 바이러스성 수송체 및/또는 본 발명의 핵산분자를 포함하는 비바이러스성 수송체, 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는, 화학요법제에 대한 종양세포의 감수성을 민감화시키기 위한 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 종양치료 또는 아폽토시스를 민감화하기 위한 방법 및 약학조성물은 다른 종양치료방법이나 약학조성물과 병행하여 실시하거나 투여할 수 있다.

본 발명의 약학조성물은 약물의 투여 형태와 치료학적 유효량에 적합한 방법으로, 예를 들어 정맥 내, 복강내, 피하 또는 국소 투여한다. 상기 조성물은 또한 당해 기술 분야에 공지되어 있는 다른 방법 (예를 들어 Remington's Pharmaceutical Science 최신판에 기재된 방법들)을 사용할 수도 있다. 예를 들어 주사제의 경우는 이에 한정되는 것은 아니나, 한크액 (Hank's solution), 링거액(Ringer's solution), 생리식염완충액과 같은 생리학적으로 적합한 완충액을 사용하여 제조할 수 있다. 상기 용액은 현탁제, 안정제 및/또는 분산제를 포함할 수 있다. 또는 본 발명의 조성물은 분말형태로 제조되어, 사용 전에 멸균수와 같은 적당한 담체와 함께 사용될 수 있다. 또한 본 발명의 약학 조성물은 당해 기술 분야에 잘 알려진 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 부형제와 함께 만들어진 적절한 형태로 경구투여 할 수 있다. 또는 리포좀이나 현탁액, 서방성 제제 형태로 제조될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 종양의 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물의 투여량 및 투여시기는 투여대상의 나이, 성별, 상태, 체중, 투여경로, 투여 횟수, 약의 형태에 따라서 달라진다. 일일 투여량은 약 0.01 ug/kg 내지 10g/kg이고, 바람직하게는 0.01 mg/kg 내지 100mg/kg 이다.

본 발명의 약학조성물이 유전자치료제로 사용될 경우는 핵산을 직접 주사하거나 또는 핵산이 포함된 수송체(벡터)를 투여할 수 있다. 핵산분자의 경우 투여량은 발현벡터, 투여대상 등에 좌우된다. 바이러스 벡터의 경우, 바이러스 벡터를 함유하는 재조합 바이러스의 양은 10³ 내지 10¹² pfu/kg 범위이다.

본 발명은 또한 환자의 시료에서 SISP-1 단백질의 발현 또는 SISP-1 mRNA의 유도 정도를 분석하며, 이 때 SISP-1 단백질 또는 SISP-1 mRNA의 수준이 정상보다 낮게 감소되었으면 종양이 발생할 가능성이 높거나, 종양이 발생한 것으로 판단하는 방법을 포함한다. 본 발명에서 '환자'는 인간 및 동물 환자를 포함한다. 또한 본 발명은 (a) SISP-1 단백질과 반응하는 적어도 하나의 물질 및 (b) SISP-1 단백질의 발현 또는 SISP-1 mRNA의 유도를 측정하기에 적합한 반응물을 포함하는 종양 진단 키트를 제공한다.

상기 종양 진단 키트에는 SISP-1 단백질과 반응하는 적어도 하나의 물질로서 SISP-1 단백질에 선택적인 항체 또는 그의 단편 또는 SISP-1 mRNA의 상보체 또는 그의 단편이 포함될 수 있으며, 이들은 검출 가능한 마커로 표지될 수 있다.

SISP-1 유전자는 정상 조직에서는 높은 발현을 나타내는 반면 종양세포 조직에서는 감소된 발현을 나타낸다. 따라서 정상인과 비교하여 대상자에서 상기 유전자가 저발현된 상태인지를 조사하면 암의 발생 여부 또는 앞으로 암이 발생할 확률이 높은지 여부를 판단할 수 있다.

유전자의 발현은 mRNA의 전사량을 정량하는 서던블롯팅 또는 노던블롯팅 방법 (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201 5205 (1980)), DNA를 분석하는 돗트 블롯팅법, SISP-1유전자 서열을 기초로 하며 적절하게 표지된 프로브를 사용하는 인시튜 하이브리다이제이션법을 사용하여 직접적으로 측정이 가능하다. 또는 DNA 이중가닥 (DNA duplex), RNA 이중가닥 (RNA duplex), DNA-RNA 혼성화 이중가닥 또는 DNA-단백질 이중가닥을 포함하는 특정 이중가닥를 인식할 수 있는 항체를 사 용할 수도 있다. 또한 세포나 조직의 절편을 면역조직화학적 염색을 하거나, 세포배양물이나 체액을 항체를 사용하여 분석하는 등의 면역학적 방법도 사용가능하다. 상기 면역조직화학적 염색이나 세포배양물이나 체액을 분석하는데 사용되는 항체는 천연의 SISP-1 단백질이나 SISP-1유전자를 기초로 하는 합성 펩티드를 동물에 투여하여 제조할 수 있다.

본 발명은 또한 치료를 받고 있는 환자로부터의 시료에서 SISP-1 단백질의 발현 또는 SISP-1 mRNA의 유도 정도를 분석하여, 이 때 SISP-1 단백질 또는 SISP-1 mRNA의 수준이 정상이거나 또는 치료 전보다 증가되었음이 관찰되면 종양치료가 효과적인 것으로 판단하고, SISP-1 단백질 또는 SISP-1 mRNA의 수준이 정상보다 낮은 것이 관찰되면 종양 치료를 계속할 필요가 있는 것으로 판단하는 것을 포함하는, 종양 치료를 받았거나 받고 있는 환자에서 종양 치료의 효과를 모니터링하는 방법을 제공한다.

본 발명은 종양치료제 등을 포함하는 아폽토시스 조절제로 사용하기 위한 화합물을 스크리닝하기 위한 방법 또는 키트를 제공한다. 여기에는 (a) 본 발명의 핵산분자를 갖는 세포를 배양하여 상기 핵산 분자의 발현 수준을 측정하는 단계; (b) (a)와는 별도로 본 발명의 핵산분자를 갖는 세포를 후보물질을 포함하는 시료와 함께 (a)와 같은 조건에서 배양하여 상기 핵산 분자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 발현수준이 (a) 단계의 발현수준 보다 감소 또는 증가된 시료 내의 후보물질을 선택하는 단계를 포함하는 아폽토시스 조절제로 사용하기 위한 화합물을 스크리닝하는 방법이 포함된다. 또한 상기 핵산분자를 갖는 세포가 핵산분자와 리포터유전자가 작동가능하게 연결된 구조를 갖는 벡터를 함유하는 세포이고, 상기 핵산분자의 발현 수준을 측정하는 단계가 리포터 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계인 아폽토시스 조절제로 사용하기 위한 화합물을 스크리닝하는 방법도 포함된다.

추가로, 본 발명에는 (a) 후보물질을 포함하는 시료를 본 발명의 폴리펩티드, 본 발명의 핵산 분자와 접촉시키는 단계; (b) 상기 폴리펩티드 또는 핵산 분자에 대한 후보물질 결합능을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 단백질이나 핵산 분자에의 결합능을 갖는 화합물을 선택하는 단계를 포함하는 아폽토시스 조절제로 사용하기 위한 화합물을 스크리닝 하는 방법이 포함된다.

또한 (a) 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 핵산 분자에 의하여 아폽토시스가 민감하게 일어나는 종양세포를 포함하는 시험관내 시스템을 제조하는 단계; (b) 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 핵산 분자와 후보물질을 포함하는 시료를 함께 상기 시험관 내 시스템과 접촉시키는 단계; (c) 상기 종양 세포의 아폽토시스 정도를 측정하는 단계; (d) (c)에서 측정한 아폽토시스 정도가 후보물질을 포함하는 시료없이 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 핵산 분자 만을 상기 시험관 내 시스템과 접촉시켰을 때의 종양 세포의 아폽토시스 정도에 비하여 증가되거나 감소된 시료의 후보물질을 선택하는 단계를 포함하는 아폽토시스 조절제로 사용하기 위한 화합물을 스크리닝하기 위한 방법이 포함된다. 아폽토시스 조절제가 종양치료제일 수 있다.

본 발명은 (a) 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 핵산 분자에 의하여 아 폽토시스가 민감하게 일어나는 종양세포; (b) 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 핵산 분자; 및 (c) 상기 종양세포의 아폽토시스 정도를 측정할 수 있는 반응물을 포함하는 아폽토시스 조절제로 사용하기 위한 화합물의 스크리닝용 키트가 포함된다.

본 발명은 본 발명의 핵산분자를 갖는 세포 및 (b) 상기 핵산 분자의 발현 수준을 측정할 수 있는 반응물을 포함하는 아폽토시스 조절제로 사용하기 위한 화합물의 스크리닝용 키트를 제공한다.

또한 본 발명은 본 발명의 핵산분자와 리포터 유전자가 작동가능하게 연결된 구조를 갖는 벡터를 함유하는 세포 및 (b) 상기 리포터 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 반응물을 포함하는 아폽토시스 조절제로 사용하기 위한 화합물의 스크리닝용 키트를 제공한다. 상기 키트의 상기 리포터 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 반응물은 측정가능한 마커로 표지되어 있을 수 있으며, 상기 리포터 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 반응물은 본 발명의 폴리펩티드에 특이적인 항체 또는 그의 단편, 유도체, 또는 상동체일 수 있다. 또는 상기 발현 수준을 측정하기 위한 반응물이 SISP-1 mRNA의 상보체 또는 그의 단편일 수도 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1: SISP -1( Stress Induced Secreted Protein 1)의 동정

DNA 칩 발현 어레이를 사용하여 p53의 존재 유무에 따라 발현되는 유전자들을 비교함으로써, 종양 억제자인 p53에 반응하는 유전자를 분리하였으며, 이를 SISP-1(Stress Induced Secreted Protein-1)로 명명하였다.

아피메트릭스사의 GeneChips을 사용하여 혼성화 실험을 하였다.　 두 세트의 사람 발현 어레이 (human genome U95A, Affimatrix Inc.)를 테트라사이클린이 있을 때와 없을 때 1일 또는 2일 동안 키운 EJ-p53 세포로부터 각각 추출된 총 RNAs 추출물로부터 유래된 형광물질이 표지된 cRNA프로브와 혼성화 시켰다.　 발현이 증가된 것으로 검출된 유전자 중에서, SISP1 전사체가 p53에 의한 유도에 대응하여 증가된다는 것을 발견하였다.　

EJ-53 세포는 다음과 같이 제조하였다. tTA 발현 카세트를 함유하는 pUHD 15-1 (하이델버그 ZMBH 의 H. Bujard로부터 얻음)로부터의 DNA 단편 (XhoI-HindIII)을 Hyg^r 유전자를 갖는 발현벡터 pSV40-Hyg에 연결시켜 pETH를 제조하였다. Tet-regulated 프로모터의 야생형 (wt)p53 cDNA 하류(down stream)을 neo^r을 함유하는pUHD 10-3(H. Bujard로부터 얻음)으로 서브클로닝하여 제조하였다. EJ 세포를 칼슘포스페이트법으로 사용하여 각각의 플라스미드로 순차적으로 트랜스펙션시켰다. 하이그로마이신 (100 μg/ml) 및 겐타마이신 (750 μg/ml)의 존재하에 트랜스펙트된 것들을 선택하였다. 안정한 EJ-ETH 클론들을 표준 클로람페니콜을 아세틸트랜스퍼라제 (CAT) 분석법을 사용하여 전사활성화제 활성을 테스트하였다. 가장 높은 CAT 활성을 보인 EJ-ETH-9 을 pTet-p53 으로 감염시켰다. 안정하게 두 가지가 트랜스펙트된 클론을 EJ-p53이라 명명하였다.

상기 혼성화 후, 전장 SISP-1 단백질을 암호화하는 완전한 mRNA 서열을 찾기 위하여, 상기 GeneChips으로부터 얻은 혼성화 서열을 사용하여 잠재적인 전장 오픈리딩프레임(orf)을 찾았다. 이 orf를 근거로 공공의 데이터베이스에 존재하는 EST 서열을 찾아내었다. 이들 EST서열들을 근거로 하여 EST 서열들을 다시 시퀀싱하여 빠진 (missing) 서열들을 보강하고, 이들을 조합한 잠재적인 orf를 근거로 게놈상에서의 위치(AL 731541.6; 크로모좀 10 상의Human DNA sequence from clone RP11-472K8) 및 전장서열을 찾아내었다. 이 게놈 서열 상에서 조합한 잠재적인 SISP-1 mRNA를 근거로 엑손과 인트론을 추정하였다.

SISP-1의 cDNA(서열번호 1)는 약 35kDa의 예상분자질량을 갖는 311개의 아미노산으로 구성된 단백질, 즉 서열번호 2의 아미노산 서열(도2A)을 갖는 SISP-1 단백질을 코딩한다. 아미노산 서열분석으로부터, SISP-1의 N-말단부위 (제29번 내지 제148번 아미노산)가 IG-like/death 도메인 모티프(도2B)와 서열 상동성이 높다는 것이 확인되었다.

SISP-1의 프로모터 지역의 잠재적인 p53 결합부위를 찾기 위하여 MARTINSPECTOR 컴퓨터 프로그램을 사용하였다 (Quandt, K. , Frech, K. , Karas, H. , Wingender, E. & Werner, T. (1995) Nucleic Acids Res . 23, 4878-4884). 프로모터 지역 내에서 잠재적인 p53 결합공통모티프 (p53 binding consensus motif) 5'-RRRCWWGYYY-3' (R = G or A, W = T or A, Y = C or T) (el-Deiry WS, Kern SE, Pietenpol JA, Kinzler KW, Vogelstein B, Definition of a consensus binding site for p53. Nat Genet 1992;1:45-9) 을 찾은 후, 결과를 직접 확인하였다.

SISP-1의 게놈 DNA는 프로모터 지역에서 4개의 잠재적 결합 사이트 (도3, 도4A)를 갖으며, 이들은 p53-공통 결합 부위(p53-consensus binding sites)에 대하여 85% 이상이 대응(match) 된다. 이 중에서 전사 부위와 가까운 부분, 즉 전사개시부위로부터 475bp 상류 부분이 기능분석에서 활성을 나타내는 것으로 확인되었다.

실시예 2: 암 억제자 p53 또는 유전자독성 스트레스에 의해 SISP -1 가 유도된다.

본 발명자들은 RNA 블로팅 (노던블랏 분석)을 통하여 p53 또는 유전자독성약물(genotoxic drugs)에 반응하여 SISP-1이 유도되는지 조사하였다.

아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)로부터 구입한 IMR90 정상 이배수체 섬유아세포를 10% 우태아 혈청(fetal bovine serum; FBS; Hyclone으로부터 구입), 100 units/ml의 페니실린, 및 100 μg/ml의 스트렙토마이신을 함유하는 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM; 인비트로겐)에서 37^oC로 배양하였다. 약물 처치를 위해, 화학요법 치료제인 에토포사이드(etoposide, 50μM) 또는 CPT(camptothecin, 600nM; Sigma)의 존재 또는 부재 하에 IMR90 세포를 24-48 시간 동안 배양하였다. 그 후, 총 RNA를 추출하여, 변성(denaturation)시키고, 1% 아가로스-포름알데히드 겔을 통해 전기영동시키고, 나일론 멤브레인으로 옮겼다. Random primed DNA 레이블링 방법에 의해 제조된 ³²P-표지된 프로브, SISP-1, p21 또는 36B4 (a loading control)로 혼성화를 수행하였다.

또한, 내인성 p53이 변성되어 기능을 하지 않으나 테트라사이클린 조절에 의해 발현이 유도되는 시스템인 p53의 기능이 회복될 수 있는 EJ 세포 (EJ-p53)를 테트라사이클린(1 μg/ml; Sigma)의 존재 또는 부재 중에서 배양하였다. 상기 EJ-p53 세포로부터 총 RNA를 지시된 시간(12-48시간)에 추출하였다. 노던 블롯 분석 (RNA 블롯팅 분석)을 동일한 프루브로 수행했다.

도 4A의 노던 블롯 분석에서 볼 수 있는 바와 같이, 에토포사이드 또는 CPT를 처리한 IMR90 세포에서 SISP-1은 시간에 따라 유도가 증가하였으며(도 4A 좌측), 테트라사이클린에 의하여 p53이 발현되지 않는 EJ-p53 세포에서는 SISP-1의 유도가 미미하나, 테트라사이클린을 처리하지 않아 p53이 발현될 경우는 SISP-1 유도가 일어남을 확인할 수 있었다(도 4A 우측). 이상의 결과로부터 SISP-1의 유도는 유전독성 스트레스나 p53에 의하여 일어난다는 것을 확인할 수 있었다.

<p53에 의한 SISP-1의 전사활성 자극>

SISP-1이 p53의 직접적인 타겟인지 결정하기 위하여, 본 발명의 발명자는 SISP-1의 게놈서열 내의 잠재적인 p53 결합부위를 탐색하였다. SISP-1의 게놈 DNA는 프로모터 지역에서 4개의 잠재적 결합 사이트를 갖으며, 이들은 p53-공통 결합 부위(p53-consensus binding sites)에 대하여 85% 이상이 대응(match) 됨을 알았다.

다음 본 발명자는 이종리포터분석(heterologous reporter assay)을 사용하여 약2kb의 게놈 단편을 포함하는 SISP-1 프로모터 지역의 p53-의존성 전사활성을 평가하였다. pGL3 기본 벡터의 루시퍼라제 리포터 유전자의 상류에 연결된 SISP-1 프로모터 서열을 결실시키고 리포터분석을 하였다.

SISP-1 프로모터 내의 추정적인 p53-인식 서열을 함유하는 리포터 플라스미드 pGL3-SISP을 야생형 p53 또는 변이 p53(V143A) 발현 구조물과 함께 Saos-2 세포 (ATCC로부터 얻음) 내로 코-트랜스펙션(co-transfection)시켰다. pGL3는 프로메가로부터 구입하였으며, pGL3-SISP는 pGL3 프로모터 벡터 (제품번호 E1761)의 KpnI/XhoI 부위에 SISP-1의 프로모터 지역(비번역 지역을 포함하여)을 PCR로 증폭하여 KpnI, XhoI 부위를 첨가하여 서브클로닝하여 얻었다. PRL-TK (Renilla plasmid; 프로메가) 또한 루시퍼라아제 신호의 정상화를 위해 코-트랜스펙션시켰다. 세포를 트랜스펙션 시킨 후 48시간에 수확하고, 듀얼-루시퍼라아제 리포터 에세이 시스템(프로메가)을 이용하여 분석을 수행하였다. p21 프로모터-루시퍼라아제 구조물이 양성 대조군으로서 사용되었다.

야생형 wt-p53 발현 플라스미드와 함께 4개의 잠재적인 p53-결합 부위(p53-binding site, p53-BS)를 포함하는 SISP-1 프로모터의 루시퍼라제 구조물을 wt-p53이 결실된 Saos2 세포 내로 코트랜스펙션(Co-transfection)하자 루시퍼라제 활성이 유의하게 증가된 반면, 대조군 벡터인 pcDNA3 벡터 (Invitron으로부터 구입)로의 코트랜스펙션은 그렇지 못했다(도 4B 하단). SISP-1 프로모터에서의 하나의 잠정적 p53-결합 부위를 포함하는 582 bp 단편의 결실은 wt-p53에 대응하여 프로모터 활성을 유지했다(도 4B. S1). 이들 결과는 SISP-1이 야생형 wt-p53의 전사적 표적임을 제시한다.

실시예 3: SISP -1 단백질의 위치/분포 확인

SISP-1의 위치/분포를 결정하기 위해, C-말단 또는 N-말단에 HA(헤마글루티닌; hemaglutinin)-에피토프 태그 또는 mcy-태그된 SISP-1을 발현하는 플라스미드를 293 인간 신장 상피 세포 (293 human kidney epithelial cells; ATCC로부터 구입)로 트랜스펙션시키고, 전체 세포 분해물 및 배지를 모아 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다.

먼저 C-말단 또는 N-말단에 HA(hemaglutinin) 에피토프 태그를 함유하는 SISP-1 발현 플라스미드를 293 인간 신장 상피 세포 (ATCC로부터 구입) 내로 트랜스펙션하고, myc-태그가 붙여진 SISP-1 (C-말단) 발현 플라스미드 또한 293 인간 신장 상피 세포 (ATCC로부터 구입) 내로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션시킨 후 36시간 후, 세포를 용해 완충액(20 mM Tris [pH7.4]. 5 mM EDTA, 10 mM Na₄P₂O₇, 100mM NaF, 2 mM Na₃VO₄, 1% NP-40, 1 mM PMSF, 10μg/ml aprotinin, 및 10 μg/ml leupeptin) 중의 얼음 상에서 수확하였다. 세포 배양 배지를 또한 웨스턴 블롯 분석(단백질 분석)을 위해 수집했다. 샘플당 동일한 양의 총 세포 단백질에 대해 SDS-PAGE를 수행하고 니트로셀룰로스막으로 옮겼다. 웨스턴 블로팅을 위해　항-HA 태그, 항-myc 태그 및 항-베타-액틴 항체(시그마로부터 구입)를 사용하였다. 세포 배양 배지는 또한 SDS-PAGE 수행하기 전에　ProteoSeek 알부민/IgG 제거 키트 (BioRad로부터 구입)로 세척하였다.

웨스턴 블로팅의 결과, N-말단에 HA가 클로닝된 HA-SISP-1의 발현은 배양 배지뿐만 아니라 세포 내에서 어떠한 발현도 보이지 않았다.　 그러나, 이소적으로 발현된(ectopically expressed) C-말단에 HA가 융합된 SISP-1-HA는 세포 분해물 및 배양 배지 내에서 강하게 나타났다 (도5).　 SISP-HA 또는 SISP-myc의 그러한 발현 패턴은 SISP-1가 분비 단백질임을 강력하게 시사한다.

실시예 4: 인간 백혈병 세포주, Jurkat 에서의 SISP -1에 의한 아폽토시스

상기 실시예 1 내지 3에서 살펴본 바와 같이 SISP-1은 p53에 의해 유도되는 유전자로서 동정되었으며, p53매개 아폽토시스에 관련이 있다. 또한 SISP-1 단백질이 잠재적인 사멸 도메인을 가진다는 점에서, 이러한 관찰들은 SISP-1이 세포 사멸 과정에서 중요한 역할을 할 수 있는 가능성이 높다.　

따라서, 우선 SISP-1의 이소적 발현이 인간 조혈 종양 세포주, Jurkat에서의 세포 성장에 영향을 미치는지를 조사하였다. SISP-1의 orf (atg 부터 tag)를 PCR로 증폭한 후 NheI과 XbaI를 삽입하여 pcDNA3.1(+) (Invitrogen, V790-20)의 NheI과 XbaI 부위에 서브클로닝하여 제조한 SISP-1 발현 플라스미드 또는 대조군 벡터(pcDNA3.1(+))를 단독으로 Jurkat 세포(ATCC로부터 구입) 내로 트랜스펙션시켰 다. 세포 배양물을 원심분리하여 배지를 수집하고 이를 세포 사멸 분석에 이용하였다. 24시간 후 대조군 벡터로 트랙스펙션된 세포 또는 SISP-1으로 트랜스펙션된 세포로부터의 배지를 모 Jurkat 세포로 옮기고, CELL Death Elisa (Roche로부터 구입)를 이용하여 SISP-1 함유 배지의 세포 사멸 포텐셜 (cell death potential)에 대해 분석했다. 그 결과, 도 6에서 볼 수 있는 바와 같이, SISP-1이 트랜스펙션된 Jurkat 세포로부터의 배지가 대조군 벡터로 트랜스펙션된 Jurkat 세포로부터의 배지와 비교하여 상당히 높은 아폽토시스를 야기함을 알 수 있었다.

실시예 5:　 SISP -1은 프로아폽토틱 마커(pro-apoptotic marker)를 활성화하고, pro - survial 단백질을 하향조절( down - regulate )한다.

모 Jurkat 세포뿐만 아니라 대조군 벡터(pcDNA3.1)로 트랜스펙션된 세포와 pcDNA3.1-SISP-1로 트랜스펙션된 세포로부터 세포 분해물을 분리하였다. 캐스파제-8 항체(NEB로부터 구입), PARP항체(Santa Cruz로부터 구입), AKT 항체(NEB로부터 구입) 및 베타-액틴에 대한 항체(Sigma로부터 구입)를 이용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다. 그 결과, 도 7에서 볼 수 있는 바와 같이 SISP-1 트랜스펙션된 Jurkat 세포에서 캐스파제-8 및 PARP를 포함하는 프로아폽틱 마커(pro-apoptotic marker)는 활성화된 반면 pro-survial 단백질인 AKT의 발현은 감소되었음을 확인할 수 있었다.

실시예 6: SISP - 1 의 과발현은 인간 결장 암 세포 및 유방 암종 세포의 아폽 토시스와 유전독성 약물에 유도되는 아폽토시스를 민감화시킨다 .

다음은, 본 발명의 발명자는 인간 결장암 세포 및 유방암세포에서 SISP-1을 발현하는 아데노바이러스를 이용하여 SISP-1 발현의 아폽토시스에 대하 효과를 조사하였다. 아데노바이러스 매개된 SISP-1 의 과발현은 인간 결장암세포 (HCT116)과 인간 유방암세포 (MDAMB435; ATCC로부터 구입)에서 아폽토시스를 유도하고, 유전자독성 약물일 에토포사이드에 의해 유도된 아폽토시스를 민감하게 한다. HA-태그된 SISP-1를 발현하는 아데노바이러스(Ad-DD1) 또는 GFP를 발현하는 아데노바이러스(Ad-GFP; 대조군)를 생성하여 증식시키고, 역가를 측정하였다(titrated). HCT 116 인간 결장 암종 세포(ATCC로부터 구입) 및 MDAMB435 인간 유방암 세포(ATCC로부터 구입)를 50-70% 컨플루언시(confluency)로 키우고, 15-30의 감염 다중도로 재조합 아데노바이러스로 감염시켰다. 감염 후 12시간 후, 세포를 24시간 동안 에토포사이드(ETO, 30 mM 시그마로부터 구입)로 처리했다. 다음, 세포 사멸률을 DNA 단편 분석(Rpche의 Cell-Death Elisa kit 사용)을 통해 수행했다.

도 8A 및 8B에서 볼 수 있는 바와 같이, 이들 세포에서의 이소적 SISP-1 과발현은 대조군 아데노바이러스를 발현하는 세포와 비교하여 세포 사멸이 눈에 띄게 증가하였다. 또한 화학치료제인 에포토사이드는 SISP-1을 과다발현하는 암세포를 선택적으로 민감하게 하였다.

실시예 7: SISP -1은 화학요법약물로 유도된 아폽토시스를 민감화시킨다 .

추가로 SISP-1이 화학요법 약물에 상당히 내성이 있는 것으로 알려진 U2OS 세포에서도 아폽토시스에 민감화시킬 수 있는지 시험하였다.　 SISP-1 의 테트라사이클린 조절 유도 발현은 화학물질에 내성인 골육종 세포 (U2OS) 및 인간방광암종세포 (EJ)에 대하여 화학물질(에토포사이드) 유도 아폽토시스를 상당히 민감하게 한다. 테트라사이클린 (독시사이클린, 시그마로부터 구입)을 부가하여 SISP-1을 발현하는 테트라사이클린으로 조절되는 안정한 클론을 분리하여 U2OS-tet-on-SISP-1 세포를 만들었다. U2OS-SISP-1 세포를 독시사이클린 존재 (1μg/ml) 또는 부존재하에 24시간 동안 배양하였다.　 다음, 세포를 15μM의 낮은 에토포시드 농도에 노출시키고, Roche의 Cell-Death Elisa를 포함한 세포사멸분석 및 세포생존분석(크리스탈-바이올렛 염색)을 하여 아폽토시스률을 측정하였다.　

도 9A에서 볼 수 있는 바와 같이, 테트라사이클린-조절 발현 시스템에 의해 유도가능한 SISP-1 발현은 에토포사이드-매개 아폽토시스를 3배 이상 증가시킨 반면, SISP-1 또는 에토포사이드 자체만을 처리는 U2OS 세포에서의 세포사멸을 유도하지 않았다.　 SISP-1 매개된 민감화 효과는 또한 에토포사이드의 낮은 농도(5μM 및 10μM)에서의 생존 분석에 의해도 확인되었다(도 9B).

SISP-1이 화학적 약물의 독성을 최소화하고 치료적 효율성을 개선하기 위한 새로운 민감화시키는 분자로서 강력한 후보 물질로 이용될 수 있으므로, 급속하게 자라나는 인간 방광 암종 세포주 EJ에서 이 효과를 재평가하였다. 화학적 약물의 배합에서의 SISP-1 발현의 민감화 효과를 추가적으로 확인하기 위해, 본 발명자들은 U2OS 및 EJ 세포주를 이용하여 SISP-1의 테트라사이클린-조절된 유도가능한 발현을 포함하는 종양 세포를 생성시켰다.　 SISP-1 유도 시, 2.5μM 내지 10μM의 에 토포사이드로의 치료에서 에토포사이드-유도 세포 사멸이 매우 효과적으로 향상되었다(도 10).　 그러나, 에토포사이드 그 자체는 48 시간에 걸쳐 제한된 세포 사멸을 유도하였다.

실시예 8: 정상세포는 SISP -1 가 유도하는 아폽토시스에 저항적이다.

SISP-1이 정상 또는 정상 유사 세포에서 세포사멸을 유도하는지 시험하였다.　

정상적인 이배수체섬유아 세포인IMR90 세포를 24시간 동안 GFP (대조군, Ad-GFP) 또는 SISP-1 (Ad-SISP-1)를 발현하는 재조합 아데노바이러스로 감염시켰다. IMR 세포들 중의 세포자멸성 세포의 수를 세포 사멸 탐지 ELISA를 이용하여 측정하였다.

암 세포 상에서의 SISP-1의 효과와는 달리, 아데노바이러스-매개된 SISP-1의 과발현은 유의한 세포사멸을 유도하지 않았으며(도 11), 이는 정상 섬유아세포가 SISP-1의 아폽토시스 효과에 대항함을 제시한다(도 11에서 오차 표시선은 각 샘플을 2개씩 포함하도록 디자인된 실험을 독립적으로 세 번 실험한 결과로부터 얻은 ±SD를 나타낸다).

실시예 9: 정상적인 인간 조직과 인간 암세포에서의 SISP -1의 발현

SISP-1 발현은 인간 암 세포 상에서의 세포-사멸 유도 효과를 가지나, 정상 세포에서는 제한된 세포 사멸을 유도하므로, 정상적인 인간 조직에서의 SISP-1의 발현을 조사하였다.　

노던블롯 분석:

QIA shredder 및 Qiagen RNeasy 키트를 사용하여 제조사(Qiagen)의 프로토콜에 따라 총 RNA를 추출하였다. 시료를 260nm에서의 흡광도를 측정하여 정량하고, 1% 아가로즈 겔을 사용하여 전기영동한 동량을 포름알데히드 변성법으로 변성시켰다.　 RNA를 나일론막(BioRad에서 구입) 으로 옮기고, Stratagene의 UV-crosslinke를 사용하여 UV crosslink시키고, 80^oC에서 1시간 동안 구었다. Randomly primed DNA 표지법 (Invitroge)을 사용하여 제조된 SISP-1(DD1)과 35B4(로딩 대조군)를 포함하는 P³²가 표지된 프로브로 혼성화하였다. 2-0.5%SSC/0.1% SDS로 세척 후, 각 블럿을 Kodak의 BioMax MS 필름을 사용하여 방사선 자동사진법 (autoradiography)으로 측정하였다.

도 12A에서 볼 수 있는 바와 같이, SISP-1 발현은 폐, 태반, 소장 및 신장, 비장를 포함한 대부분의 기관에서 폭넓게 발현되나, 혈액 백혈구에서 우세하게 발현되고, 심장 및 태반에서는 보다 약하게 발현된다.　 이는 SISP-1이 정상적인 세포 기능을 유지하기 위해 요구되며, 치료학의 측면에서 정상적인 세포에 독성이 갖지 않을 것이라는 것을 제시한다.　

또한 SISP-1 발현이 정상적인 유방 상피 세포와 비교할 때, 인간 유방 암 세포에서 유의하게 감소됨을 발견하였다(도 12B).

본 발명을 통해 p53의 신규한 타겟 유전자로서 SISP-1을 동정하였으며 p53에서 SISP-1으로 진행되는 새로운 아폽토시스 경로를 처음으로 밝힘으로써, 앞으로의 아폽토시스에 대한 기전 및 아폽토시스를 조절하는 방법에 대한 연구에 활용될 수 있는 기틀을 제공하였다. 또한 본 발명은 SISP-1을 이용한 새로운 아폽토시스의 조절방법, 아폽토시스와 관련된 질병, 예를 들어 종양의 예방, 치료, 진단 방법을 제공하였다.　　

<110> CURONIX CO., LTD. <120> SISP-1, A NOVEL P53 TARGET GENE AND USE THEREOF <150> US 60/767,047 <151> 2006-02-28 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1950 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (54)..(986) <400> 1 gcgtcccgcc cgctccccgg caccagaagt tcctctgcgc gtccgacggc gac 53 atg ggc gtc ccc acg gcc ctg gag gcc ggc agc tgg cgc tgg gga tcc 101 Met Gly Val Pro Thr Ala Leu Glu Ala Gly Ser Trp Arg Trp Gly Ser 1 5 10 15 ctg ctc ttc gct ctc ttc ctg gct gcg tcc cta ggt ccg gtg gca gcc 149 Leu Leu Phe Ala Leu Phe Leu Ala Ala Ser Leu Gly Pro Val Ala Ala 20 25 30 ttc aag gtc gcc acg ccg tat tcc ctg tat gtc tgt ccc gag ggg cag 197 Phe Lys Val Ala Thr Pro Tyr Ser Leu Tyr Val Cys Pro Glu Gly Gln 35 40 45 aac gtc acc ctc acc tgc agg ctc ttg ggc cct gtg gac aaa ggg cac 245 Asn Val Thr Leu Thr Cys Arg Leu Leu Gly Pro Val Asp Lys Gly His 50 55 60 gat gtg acc ttc tac aag acg tgg tac cgc agc tcg agg ggc gag gtg 293 Asp Val Thr Phe Tyr Lys Thr Trp Tyr Arg Ser Ser Arg Gly Glu Val 65 70 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His His Ser Glu His Arg Val 145 150 155 160 His Gly Ala Met Glu Leu Gln Val Gln Thr Gly Lys Asp Ala Pro Ser 165 170 175 Asn Cys Val Val Tyr Pro Ser Ser Ser Gln Glu Ser Glu Asn Ile Thr 180 185 190 Ala Ala Ala Leu Ala Thr Gly Ala Cys Ile Val Gly Ile Leu Cys Leu 195 200 205 Pro Leu Ile Leu Leu Leu Val Tyr Lys Gln Arg Gln Ala Ala Ser Asn 210 215 220 Arg Arg Ala Gln Glu Leu Val Arg Met Asp Ser Asn Ile Gln Gly Ile 225 230 235 240 Glu Asn Pro Gly Phe Glu Ala Ser Pro Pro Ala Gln Gly Ile Pro Glu 245 250 255 Ala Lys Val Arg His Pro Leu Ser Tyr Val Ala Gln Arg Gln Pro Ser 260 265 270 Glu Ser Gly Arg His Leu Leu Ser Glu Pro Ser Thr Pro Leu Ser Pro 275 280 285 Pro Gly Pro Gly Asp Val Phe Phe Pro Ser Leu Asp Pro Val Pro Asp 290 295 300 Ser Pro Asn Phe Glu Val Ile 305 310 <210> 3 <211> 13194 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> exon <222> (89)..(222) <223> Nucleotides 89-141 are an untranslaed region. <220> <221> exon <222> (11550)..(11979) <220> <221> exon <222> (12653)..(12709) <400> 3 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ctaggctgcc tggcagcagt gagccctggg cctgtggcta 2580 cagccaggga accccacctg gacacatggc cctgcttcta agccccccag ttaggcccaa 2640 aggaatggtc cactgagggc ctcctgctct gcctgggctg ggccaggggc tttgaggaga 2700 gggtaaacat aggcccggag atggggctga cacctcgagt ggccagaata tgcccaaacc 2760 ccggcttctc ccttgtccct aggcagaggg gggtcccttc ttttgttccc tctggtcacc 2820 acaatgcttg atgccagctg ccataggaag agggtgctgg ctggccatgg tggcacacac 2880 ctgtcctccc agcactttgc agggctgagg tggaaggacc gcttaagccc aggtgttcaa 2940 ggctgctgtg agctgtgttc gagccactac actccagcct ggggacggag caaaactttg 3000 cctcaaaaca aattttaaaa agaaagaaag aaggaaagag ggtatgtttt tcacaattca 3060 tgggggcctg catggcagga gtggggacag gacacctgct gttcctggag tcgaaggaca 3120 agcccacagc ccagattccg gttctcccaa ctcaggaaga gcatgccctg ccctctgggg 3180 aggctggcct ggccccagcc ctcagctgct gaccttgagg cagagacaac ttctaagaat 3240 ttggctgcca gaccccaggc ctggctgctg ctgtgtggag agggaggcgg cccgcagcag 3300 aacagccacc gcacttcctc ctcagcttcc tctggtgcgg ccctgccctc tcttctctgg 3360 acccttttac aactgaacgc 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acctgcacca tggaggccac caggctgcca acaccagcca cgacctggct cagcgccacg 11820 ggctggagtc ggcctccgac caccatggca acttctccat caccatgcgc aacctgaccc 11880 tgctggatag cggcctctac tgctgcctgg tggtggagat caggcaccac cactcggagc 11940 acagggtcca tggtgccatg gagctgcagg tgcagacagg tgagggcatc ctgcacgtga 12000 cagcctggcg tgtgtggagg gctgcctgtc tgatggtgtg accattcatg acactgtgct 12060 gggcagagtg tgaggctgca tgggtaacac tggcactcca gggagtgtgt gggtgagatg 12120 gggtggtcaa gggtgtgtgg agtgtgggtt tgtagttagc tggagtgatg gagagggagg 12180 gtgtacctgg ctccatttgt gacagtgaga ctttttaatg tgtgaggctg taggtacctg 12240 ggctgggagt gtgactgctc atgatgacat catggctgct gtgggtatag gcatcagtgg 12300 gactgattgg tgccctgggg catgactcag tggatggctg aatggctgtt ggagaatata 12360 tgcgtgtgtg tgtctgtctg ttcaggtgag agtgcaaggg cccatggttc ggatagaggt 12420 gtgggcacca gcgggtattc acatgcccct gggagtggca tgaaaatggg cagggtgaga 12480 acatgccagg gtgtgtgtgg gtgcaaacgt gtgcaggctg ccactgggcc aacactgccg 12540 agtaggcact agcgtgagaa cctggggcag gagggggaca ctggcctgga 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tttttccttc ttggttgtaa ggagccagag agaaaacgat tgagcagtgt tctcaagaca 60 acttccctgt cagtaaaaca ccaaaaagga ggccaaatgt ggtggctcat gcctataatc 120 ccaacacttt gggaggccag gtgggcctga ggtcaggagc tcgagagcag tctgggcaac 180 cgtctctact aaaaatgcaa aacaattagc tgagtggcca ggcacggtgg ctcacaccta 240 gaatcccagc actttgggag gccaaggcag gcgtatcatc tgaggtcaga agtttgagac 300 cagcctggct aacagggtga aaccccattt ctataaaaat acaaaaaaat tagccaggca 360 tggtggtgca cgcctgtagt cccagctact caagaggctg aggcaagaga atcgcttgaa 420 cccgggagtc agaggttaca gtgagccgag atcgcgccac tgcactccag cctgctgata 480 gagcaagact ccatctcaaa aaaaaaacaa cccaaaattt gcctggcatg gtggcaggca 540 tctgtaatcc cagctactcg ggaggctgag acatgagagc tgcttgaacc tgggaggcag 600 aagttgcagt gagccgagat cacaccactg cactccagcc tgggtgacag agcgagactc 660 tgtcccaaaa aatcaaaaaa atcacttttg gtagagatgc actctcgcta tgttgcccag 720 gctggtcttg aactcctggg ctcaattgat cttcccacct tgacctccaa agtgctggga 780 ttacaggtgt gagccaccat gcctagcctc agggaattct tataagaact ctatgaagta 840 ggcatcacca tcttctctgt atccatggaa agagaggcct agagatgtat gctaacttgc 900 ccaagctcac atagcccagg gtagcatagc tgggatctgg ctgcaggcct gcttagctct 960 gcatactcac cttcttccca gcttggggca gtgcagtggg tagcagttag ccccccggtg 1020 cttgccagag aggtgcccta cagggtaaga gggcactgcc ctaagggtgc ctggcgctga 1080 gaggttgggt gagaataccc agcagcttgg agacaaaatg caagggcacc tccctcttct 1140 gagaagaggt cttggcttcc acacccctct ataccctgta tgtgtcagac atccagtggg 1200 gaccagcccc tgctaggccc tggagataca aaggcatcca ggaggacatg cacgaggacc 1260 taagccggaa tggggatcag ctaaaccacg gacccaacaa aacccaactc aaaggctaca 1320 gtgacttttt actcagctac ccttttttca aaccaacaaa caggccaaga gcaaaattag 1380 aacatgcatt ttggtcagag ccatgttggt caggctggtc tcgaactcct gggctcaagt 1440 gatctacccg ccttggctcc ccaaagtgct gggattacag gattgagcca ctatgcccag 1500 ccccagtgcc agcctcttaa tgttatcctt gggaagtaag agtgtagctt gactatgaaa 1560 taacatgaaa gtacaagtta acctgaggta ggggaatgag actagagaag ttggtgccca 1620 aggagctcct gcattgctga ggggctgtgg tttctcagtg agctcagaga aggggtctag 1680 gcagctcatc tccctttgaa 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gaauuaggag gggagagaca uuccaguggu gccagcagug 240 cugggugugg gugcaagagc agaggcacua gaaguuaggg ugcaucagag uguccugcag 300 auauccaggc accagggagg gagggcgggu gcacagccag gcggacagcu gaggccucug 360 ccggagggga gcuugcagga ugugcugugg ggcacgccaa cagguguugc cugcauaucu 420 gugugugucc cgggguaggg augugcugau cuuggcgugu aguccugcac cuguucugug 480 ugugugugug ugugugugug ugugugugug ugugcgcgcg cgcaugcacu cagggugcuc 540 caggcucuga aucuacaguu aaacuggcuc cagcuugccu agcucuucac aaugucagau 600 uucauucauu cacucauuua cucacucauu ccacagcugg gagugccuac cacauaccaa 660 gcccuggucu ggcuggagga uguaggguac aagucucugu ccccagauca cucaaaggcu 720 gguggcugag ggcagaugca agccauggua acgucuauca cgcuguuaga gguagaucua 780 cuucuuaggc ugcgcagcaa uaauaauuuc ucuccaaaag gacuggggga cgguagaacg 840 ggcuuuaaac ugccgaucaa guggagcuga cucgcuggga cgcacgcugg cuccccaccc 900 acggggccgg ccuccgggaa gccccuccca cgcggcccuc ggagaggcag uucccccaca 960 cggccccccg ggggcgcugc gcgaaggggg cgggugccug gagcacggcg cuggggccgc 1020 ccgcagcgcu cacucgcucg cacucagucg cgggaggcuu ccccgcgccg gccgcguccc 1080 gcccgcuccc cggcaccaga aguuccucug cgcguccgac ggcgacaugg gcguccccac 1140 ggcccuggag gccggcagcu ggcgcugggg aucccugcuc uucgcucucu uccuggcugc 1200 gucccuaggu ccgguggcag ccuucaaggu cgccacgccg uauucccugu augucugucc 1260 cgaggggcag aacgucaccc ucaccugcag gcucuugggc ccuguggaca aagggcacga 1320 ugugaccuuc uacaagacgu gguaccgcag cucgaggggc gaggugcaga ccugcucaga 1380 gcgccggccc auccgcaacc ucacguucca ggaccuucac cugcaccaug gaggccacca 1440 ggcugccaac accagccacg accuggcuca gcgccacggg cuggagucgg ccuccgacca 1500 ccauggcaac uucuccauca ccaugcgcaa ccugacccug cuggauagcg gccucuacug 1560 cugccuggug guggagauca ggcaccacca cucggagcac aggguccaug gugccaugga 1620 gcugcaggug cagacaggca aagaugcacc auccaacugu gugguguacc cauccuccuc 1680 ccaggagagu gaaaacauca cggcugcagc ccuggcuacg ggugccugca ucguaggaau 1740 ccucugccuc ccccucaucc ugcuccuggu cuacaagcaa aggcaggcag ccuccaaccg 1800 ccgugcccag gagcuggugc ggauggacag caacauucaa gggauugaaa accccggcuu 1860 ugaagccuca ccaccugccc aggggauacc cgaggccaaa gucaggcacc cccuguccua 1920 uguggcccag cggcagccuu cugagucugg gcggcaucug cuuucggagc ccagcacccc 1980 ccugucuccu ccaggccccg gagacgucuu cuucccaucc cuggacccug ucccugacuc 2040 uccaaacuuu gaggucaucu agcccagcug ggggacagug ggcuguugug gcugggucug 2100 gggcaggugc auuugagcca gggcuggcuc ugugaguggc cuccuuggcc ucggcccugg 2160 uucccucccu ccugcucugg gcucagauac ugugacaucc cagaagccca gccccucaac 2220 cccucuggau gcuacauggg gaugcuggac ggcucagccc cuguuccaag gauuuugggg 2280 ugcugagauu cuccccuaga gaccugaaau ucaccagcua cagaugccaa augacuuaca 2340 ucuuaagaag ucucagaacg uccagcccuu cagcagcucu cguucugaga caugagccuu 2400 gggauguggc agcaucagug ggacaagaug gacacugggc cacccuccca ggcaccagac 2460 acagggcacg guggagagac uucucccccg uggccgccuu ggcucccccg uuuugcccga 2520 ggcugcucuu cugucagacu uccucuuugu accacagugg cucuggggcc aggccugccu 2580 gcccacuggc caucgccacc uuacccagcu gccuccuacc agcaguuucu cugaagaucu 2640 gucaacaggu uaagucaauc uggggcuucc acugccugca uuccaguccc cagagcuugg 2700 uggucccgaa acgggaagua cauauugggg caugguggcc uccgugagca aauggugucu 2760 ugggcaaucu gaggccagga cagauguugc cccacccacu ggagauggug cugagggagg 2820 uggguggggc cuucugggaa ggugagugga gaggggcacc ugccccccgc ccuccccauc 2880 cccuacuccc acugcucagc gcgggccauu gcaagggugc cacacaaugu cuuguccacc 2940 cugggacacu ucugaguaug aagcgggaug cuauuaaaaa cuacaugggg aaacaggugc 3000 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 3023

Claims (40)

1. 삭제
2. 하기 기재된 서열로 구성된 군으로부터 선택된 서열로 구성된 단리된 핵산분자 또는 그의 상보체.

   (a) 서열번호 3 및 서열번호 4, 또는 도13에 기재된 뉴클레오티드 서열;

   (b) 서열번호 6 또는 도21에 기재된 뉴클레오티드 서열로서 p53 결합부위인 AAACTGGCTCCAGCTTGCCTA 서열을 포함하는 서열
3. 삭제
4. 제2항의 핵산분자를 포함하는 재조합 발현 벡터.
5. 제2항의 핵산분자를 포함하는 바이러스성 수송체.
6. 제2항의 핵산분자를 포함하는 비바이러스성 수송체.
7. 제2항의 핵산분자로 형질전환된 숙주세포.
8. 삭제
9. 삭제
10. 삭제
11. 삭제
12. 삭제
13. 삭제
14. 치료적 유효량의 서열번호2의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드, 서열번호2의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드를 암호화하는 핵산분자, 서열번호1의 뉴클레오티드 서열로 구성된 핵산분자, 제2항의 핵산분자, 서열번호1의 뉴클레오티드 서열로 구성된 핵산분자를 포함하는 바이러스성 수송체, 서열번호1의 뉴클레오티드 서열로 구성된 핵산분자를 포함하는 비바이러스성 수송체, 서열번호2의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드를 암호화하는 핵산분자를 포함하는 바이러스성 수송체, 서열번호2의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드를 암호화하는 핵산분자를 포함하는 비바이러스성 수송체, 제2항의 핵산분자를 포함하는 바이러스성 수송체 및 제2항의 핵산분자를 포함하는 비바이러스성 수송체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 것, 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 종양의 치료 또는 예방용 약학 조성물.
15. 제14항에 있어서, 상기 종양이 담낭암, 혈액 및 골수의 혈액 악성 종양, 백 혈병, 림프종, 호지킨씨병, 비호지킨씨병, 다발성골수종, 뇌암, 유방암, 경부암, 결장암, 직장암, 항문암, 충수암, 식도암, 자궁암, 간암, 위암, 후두암, 폐암, 늑막암, 심막암, 구강암, 골육종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신장암, 폐포횡문근육종, 피부암, 고환암 및 갑상선암으로 구성된 군에서 선택된 것인 약학 조성물.
16. 삭제
17. 삭제
18. 삭제
19. 삭제
20. 치료적 유효량의 서열번호2의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드, 서열번호1의 뉴클레오티드 서열로 구성된 핵산분자, 서열번호2의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드를 암호화하는 핵산분자, 제2항의 핵산분자, 서열번호1의 뉴클레오티드 서열로 구성된 핵산분자를 포함하는 바이러스성 수송체, 서열번호1의 뉴클레오티드 서열로 구성된 핵산분자를 포함하는 비바이러스성 수송체, 서열번호2의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드를 암호화하는 핵산분자를 포함하는 바이러스성 수송체, 서열번호2의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드를 암호화하는 핵산분자를 포함하는 비바이러스성 수송체, 제2항의 핵산분자를 포함하는 바이러스성 수송체 및 제2항의 핵산분자를 포함하는 비바이러스성 수송체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 것, 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 종양과 관련이 있는 목표 포유동물 조직에서 아폽토시스를 유도하기 위한 약학 조성물.
21. 제20항에 있어서, 상기 종양이 담낭암, 혈액 및 골수의 혈액 악성 종양, 백혈병, 림프종, 호지킨씨병, 비호지킨씨병, 다발성골수종, 뇌암, 유방암, 경부암, 결장암, 직장암, 항문암, 충수암, 식도암, 자궁암, 간암, 위암, 후두암, 폐암, 늑막암, 심막암, 구강암, 골육종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신장암, 폐포횡문근육종, 피부암, 고환암 및 갑상선암으로 구성된 군에서 선택된 질병과 관련이 있는 것인 약학 조성물.
22. 환자의 시료에서 SISP-1(Stress Induced Secreted Protein -1) 단백질의 발현 또는 SISP-1 mRNA의 유도 정도를 분석하고 이 때 SISP-1 단백질 또는 SISP-1 mRNA의 수준이 정상보다 낮게 감소되었으면 종양이 발생할 가능성이 높거나 종양이 발생된 것으로 판단하는 것을 포함하는, 종양 발생 가능성 예측방법 또는 종양 발생여부의 판단 방법.
23. (a) SISP-1 단백질 또는 SISP-1 mRNA와 반응하는 물질 및 (b) SISP-1 단백질의 발현 또는 SISP-1 mRNA의 유도를 측정하기에 적합한 반응물을 포함하는 종양 발생 가능성 예측용 또는 종양 진단용 키트.
24. 제23항에 있어서, SISP-1 단백질과 반응하는 물질이 SISP-1 단백질에 선택적인 항체, 그의 Fab, Fab', F(ab)2, Fv 단편, 디아바디, 선형항체 및 단일쇄항체로 이루어진 군에서 선택되는 것인 키트.
25. 제23항에 있어서, SISP-1 mRNA와 반응하는 물질이 SISP-1 mRNA의 상보체인 키트.
26. 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 물질이 검출가능한 마커로 표지된 것인 키트.
27. 치료를 받고 있는 환자로부터의 시료에서 SISP-1 단백질의 발현 또는 SISP-1 mRNA의 유도 정도를 분석하며, 이 때 SISP-1 단백질 또는 SISP-1 mRNA 수준이 정상이거나 증가되었음이 관찰되면 종양치료가 효과적인 것으로 판단하고, SISP-1 단백질 또는 SISP-1 mRNA의 수준이 정상보다 낮은 것이 관찰되면 종양 치료를 계속할 필요가 있는 것으로 판단하는 것을 포함하는, 종양 치료를 받았거나 받고 있는 환자에서 종양 치료의 효과를 모니터링하는 방법.
28. (a) 서열번호1의 뉴클레오티드 서열로 구성된 핵산분자, 서열번호2의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드를 암호화하는 핵산분자 또는 제2항의 핵산분자를 갖는 세포를 배양하여 상기 핵산 분자의 발현 수준을 측정하는 단계; (b) (a)와는 별도로 서열번호1의 뉴클레오티드 서열로 구성된 핵산 분자, 서열번호2의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드를 암호화하는 핵산분자 또는 제2항의 핵산분자를 갖는 세포를 후보물질을 포함하는 시료와 함께 (a)와 같은 조건에서 배양하여 상기 핵산 분자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 발현수준이 (a) 단계의 발현수준 보다 감소 또는 증가된 시료 내의 후보물질을 선택하는 단계를 포함하는 아폽토시스 조절제로 사용하기 위한 화합물을 스크리닝하는 방법.
29. 제28항에 있어서, 상기 핵산분자를 갖는 세포가 핵산분자와 리포터유전자가 작동가능하게 연결된 구조를 갖는 벡터를 함유하는 세포이고, 상기 핵산분자의 발현 수준을 측정하는 단계가 리포터 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계인 아폽토시스 조절제로 사용하기 위한 화합물을 스크리닝하는 방법.
30. (a) 후보물질을 포함하는 시료를 서열번호2의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드, 서열번호2의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드를 암호화하는 핵산분자, 서열번호1의 뉴클레오티드 서열로 구성된 핵산분자 또는 제2항의 핵산 분자와 접촉시키는 단계; (b) 상기 폴리펩티드 또는 핵산 분자에 대한 후보물질의 결합능을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 폴리펩티드나 핵산 분자에의 결합능을 갖는 화합물을 선택하는 단계를 포함하는 아폽토시스 조절제로 사용하기 위한 화합물을 스크리닝 하는 방법.
31. (a) 서열번호2의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드, 서열번호2의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드를 암호화하는 핵산분자, 서열번호1의 뉴클레오티드 서열로 구성된 핵산분자 또는 제2항의 핵산 분자에 의하여 아폽토시스가 민감하게 일어나는 종양세포를 포함하는 시험관내 시스템을 제조하는 단계; (b) 서열번호2의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드, 서열번호2의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드를 암호화하는 핵산분자, 서열번호1의 뉴클레오티드 서열로 구성된 핵산분자 또는 제2항의 핵산 분자와 후보물질을 포함하는 시료를 함께 상기 시험관 내 시스템과 접촉시키는 단계; (c) 상기 종양 세포의 아폽토시스 정도를 측정하는 단계; 및 (d) (c)에서 측정한 아폽토시스 정도가 후보물질을 포함하는 시료없이 서열번호2의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드, 서열번호2의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드를 암호화하는 핵산분자, 서열번호1의 뉴클레오티드 서열로 구성된 핵산분자 또는 제2항의 핵산 분자 만을 상기 시험관 내 시스템과 접촉시켰을 때의 종양 세포의 아폽토시스 정도에 비하여 증가되거나 감소된 시료의 후보물질을 선택하는 단계를 포함하는 아폽토시스 조절제로 사용하기 위한 화합물을 스크리닝하기 위한 방법.
32. 제31항에 있어서, 아폽토시스 조절제가 종양치료제인 방법.
33. (a) 서열번호2의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드, 서열번호2의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드를 암호화하는 핵산분자, 서열번호1의 뉴클레오티드 서열로 구성된 핵산분자 또는 제2항의 핵산 분자에 의하여 아폽토시스가 민감하게 일어나는 종양세포; (b) 서열번호2의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드, 서열번호2의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드를 암호화하는 핵산분자, 서열번호1의 뉴클레오티드 서열로 구성된 핵산분자 또는 제2항의 핵산 분자; 및 (c) 상기 종양세포의 아폽토시스 정도를 측정할 수 있는 반응물을 포함하는 아폽토시스 조절제로 사용하기 위한 후보물질의 스크리닝용 키트.
34. (a)서열번호1의 뉴클레오티드 서열로 구성된 핵산분자, 서열번호2의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드를 암호화하는 핵산분자 또는 제2항의 핵산분자를 갖는 세포 및 (b) 상기 핵산 분자의 발현 수준을 측정할 수 있는 반응물을 포함하는 아폽토시스 조절제로 사용하기 위한 후보물질의 스크리닝용 키트.
35. (a)서열번호1의 뉴클레오티드 서열로 구성된 핵산분자, 서열번호2의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드를 암호화하는 핵산분자 또는 제2항의 핵산분자와 리포터 유전자가 작동가능하게 연결된 구조를 갖는 벡터를 함유하는 세포 및 (b) 상기 리포터 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 반응물을 포함하는 아폽토시스 조절제로 사용하기 위한 후보물질의 스크리닝용 키트.
36. 제35항에 있어서, 상기 리포터 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 반응물이 측정가능한 마커로 표지되어 있는 것인 키트.
37. 제35항에 있어서, 상기 리포터 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 반응물이 서열번호2의 폴리펩티드에 특이적인 항체, 그의 Fab, Fab', F(ab)2, Fv 단편, 디아바디, 선형항체 및 단일쇄 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 키트.
38. 제34항 또는 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 수준을 측정하기 위한 반응물이 SISP-1 mRNA의 상보체인 키트.
39. 삭제
40. 치료적 유효량의 서열번호2의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드, 서열번호2의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드를 암호화하는 핵산분자, 서열번호1의 뉴클레오티드 서열로 구성된 핵산분자, 제2항의 핵산 분자, 서열번호1의 뉴클레오티드 서열로 구성된 핵산분자를 포함하는 바이러스성 수송체, 서열번호1의 뉴클레오티드 서열로 구성된 핵산분자를 포함하는 비바이러스성 수송체, 서열번호2의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드를 암호화하는 핵산분자를 포함하는 바이러스성 수송체, 서열번호2의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드를 암호화하는 핵산분자를 포함하는 비바이러스성 수송체, 제2항의 핵산분자를 포함하는 바이러스성 수송체 및 제2항의 핵산분자를 포함하는 비바이러스성 수송체로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 것, 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 화학요법제에 대한 종양세포의 감수성을 민감화 시키기 위한 약학 조성물.

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