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WO2004041301A1 - 抗利尿剤 - Google Patents

抗利尿剤

Info

Publication number
WO2004041301A1
WO2004041301A1 PCT/JP2003/014102 JP0314102W WO2004041301A1 WO 2004041301 A1 WO2004041301 A1 WO 2004041301A1 JP 0314102 W JP0314102 W JP 0314102W WO 2004041301 A1 WO2004041301 A1 WO 2004041301A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
seq
amino acid
acid sequence
polypeptide
salt
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2003/014102
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hirokazu Matsumoto
Koh Takagi
Masaaki Mori
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Takeda Chemical Industries Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Takeda Pharmaceutical Co Ltd, Takeda Chemical Industries Ltd filed Critical Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority to AU2003277553A priority Critical patent/AU2003277553A1/en
Publication of WO2004041301A1 publication Critical patent/WO2004041301A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
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    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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    • A61P7/12—Antidiuretics, e.g. drugs for diabetes insipidus
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    • A61P9/12—Antihypertensives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Definitions

  • the present invention relates to an antidiuretic agent or a diuretic agent or a screening thereof.
  • the mechanism of urine production in animals is crucial for maintaining the homeostasis of body water and electrolyte metabolism, which accounts for 45-70% of total body weight. Accordingly, many diuretics and antidiuretics are used in the treatment setting based on various mechanisms of controlling urine production.
  • sulfanilamide or acetazolamide which is a carbonic anhydrase inhibitor that inhibits the Na + -H + exchange system in tubular cells
  • benzothiadiazine diuretics which are tubular reabsorption inhibitors
  • Na + / Cl— active in Henle's ascending leg Diuretics such as phenoxyacetic acid derivatives' or sulfamoylbenzoic acid derivatives, which eliminate the medulla osmotic gradient by suppressing transport, are known.
  • an antidiuretic there is vasopressin, an antidiuretic hormone, or a derivative thereof.
  • the present inventors have conducted intensive studies, and as a result, have found that the GPR8 ligand peptide described in WO01 / 98494 has an antidiuretic effect on rabbits, and further studies have been carried out. As a result, the present invention has been completed.
  • an antidiuretic agent comprising a polypeptide having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or an amide thereof, an ester thereof or a salt thereof,
  • An antidiuretic agent characterized by using a polypeptide having an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or an amide thereof, an ester thereof or a salt thereof. Or a diuretic screening method,
  • (6) a protein having an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77 or SEQ ID NO: 79, or a partial peptide thereof Or a method of screening for an antidiuretic or diuretic, which comprises using a salt thereof.
  • An antidiuretic agent comprising a polypeptide having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a amide, an ester thereof, or a salt thereof. Or a diuretic screening kit,
  • a polynucleotide containing a polypeptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a polynucleotide containing a polynucleotide encoding the amide or ester thereof An antidiuretic or diuretic screening kit, characterized by the fact that
  • a method for suppressing urine production which comprises administering an effective amount;
  • Sequence identifier identical to the amino acid sequence represented by 1 A polypeptide containing one or substantially the same amino acid sequence or an amide or an ester or a salt thereof; (ii) a compound or a compound thereof which promotes the activity of the polypeptide or an amide or an ester thereof or a salt thereof A salt, or (iii) an effective amount of a polynucleotide encoding the polypeptide or its amide or ester thereof, which is characterized by polyuria, diabetes insipidus, hypernatrimuemia, metabolism Prevention and treatment of alkalosis, hypokalemia or Cushing syndrome,
  • Renal edema or an antidiuretic hormone characterized by administering an effective amount of an antisense polynucleotide containing a nucleotide sequence complementary or substantially complementary to a nucleotide sequence of DNA or a portion thereof.
  • SEQ ID NO: 1 for producing a prophylactic or therapeutic agent for polyuria, diabetes insipidus, hypernatremia, metabolic alkalosis, hypotension rheumatism or Cushing's syndrome
  • a polypeptide or an amide or ester thereof or a salt thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence (ii) promoting the activity of the polypeptide or the amide or ester thereof or a salt thereof (Iii) use of a compound or a salt thereof, or (iii) use of a polynucleotide encoding the polypeptide or an amide or an ester thereof;
  • a compound or a salt thereof that inhibits the activity of tide or an amide or an ester thereof or a salt thereof (ii) an antibody against the above-mentioned polypeptide or an amide or an ester thereof or a salt thereof, (iii) SEQ ID NO: 73 An antibody against a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77 or SEQ ID NO: 79, a partial peptide thereof, or a salt thereof; (iv) an antisense polynucleotide containing a base sequence complementary to or substantially complementary to the base sequence of DNA encoding the above polypeptide, its amide, its ester, or its salt, or a part thereof, or V) Complementary or complementary to the nucleotide sequence of DNA encoding the above protein, its partial peptide, or a salt thereof Use of an antisense polynucleotide containing a substantially complementary nucleotide sequence or
  • (32) a polynucleotide having a base sequence represented by SEQ ID NO: 82 or SEQ ID NO: 84,
  • an antisense polynucleotide having a base sequence complementary to or substantially complementary to the polynucleotide of (30) or a part thereof,
  • an antisense polynucleotide having a base sequence complementary or substantially complementary to the polynucleotide according to (45) or a part thereof,
  • a polypeptide having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is a human warm-blooded animal (eg, ' Guinea pig, rat, mouse, chick, egret, porcupine, sheep, pigeon, monkey, etc.
  • cells eg, retinal cells, hepatocytes, spleen cells, nerve cells, glial cells, kidney iS cells, bone marrow
  • Cells mesangial cells, Langer's cells, epidermal cells, epithelial cells, endothelial cells, fibroblasts, fiber cells, muscle cells, adipocytes, immune cells (eg, macrophages, T cells, B cells, natural killer cells) , Mast cells, neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes), megakaryocytes, synovial cells, chondrocytes, bone cells, osteoblasts, osteoclasts, mammary cells, hepatocytes Kuha Stromal cells, or their precursors, stem cells or cancer cells, etc.) or any tissue where these cells are present, such as the brain, parts of the brain (eg, retina, olfactory bulb, amygdala, basal sphere of the cerebrum) , Hippocampus, thal
  • amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is, for example, about 70% or more, preferably about 80% or more, preferably the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 includes, in addition to the above amino acid sequence,
  • amino acid sequence obtained by adding 1 to 5 (preferably 1 to 3, more preferably 1 to 2, and more preferably 1) amino acids to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 ,
  • amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 are amino acids
  • polypeptide having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 examples include, for example, a polypeptide having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by the aforementioned SEQ ID NO: 1 Preferred is a polypeptide having substantially the same activity as the polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the substantially equivalent activity includes, for example, the activity of the polypeptide of the present invention (eg, antidiuretic action, etc.).
  • Substantially the same activity indicates that the activity is qualitatively (eg, physicochemically or pharmacologically) granular.
  • the measurement of the antidiuretic effect can be carried out according to a known method. For example, the method described in Modern Urine Chemistry (Bayer Corporation, New York, 1996) or a method based thereon, described in Examples below. It can be measured according to the method described above.
  • amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 include, for example, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 , SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, Sequence SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58 or SEQ ID NO: 50
  • polypeptide of the present invention include, for example, a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21
  • a polypeptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7; a polypeptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8; and a polypeptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 A polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10, a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11, a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11, Polypeptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 24; polypeptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25; amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 30
  • polypeptide of the present invention is used in a sense that it includes a precursor polypeptide of the polypeptide of the present invention.
  • the precursor polypeptide include, for example, a polypeptide characterized by containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6.
  • amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 is about 80% or more, preferably about 90% or more, more preferably about 9% or more of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6.
  • Examples include amino acid sequences having a homology of 5% or more. .
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 is substantially the same as the above amino acid sequence
  • amino acids 1 to 15 (preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and more preferably 1 to 3) amino acids are inserted into the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6.
  • amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 include, for example, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 29 or SEQ ID NO: 35 And the like.
  • the precursor polypeptide include, for example, a polypeptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, a polypeptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20; Having the amino acid sequence represented A polypeptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 29; a polypeptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 35; a polypeptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 116; can give.
  • the receptor for the polypeptide of the present invention has a binding activity to the polypeptide of the present invention, and the polypeptide of the present invention stimulates the cell stimulating activity of cells expressing the receptor (for example, arachidonic acid).
  • the receptor for example, arachidonic acid.
  • (1) contains an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by GPR8 (SEQ ID NO: 73; Genomics, 28, 84-91, 1995) or SEQ ID NO: 73 Protein
  • mouse TGR26 SEQ ID NO: 77; WO 02/44368
  • GPR7 SEQ ID NO: : 79; Genomics, 28, 84-91, 1995
  • Egret GPR8 SEQ ID NO: 81
  • an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 81 A protein containing the same or substantially the same amino acid sequence
  • a protein having an amino acid sequence a protein having an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 81, a protein identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 83 Proteins containing the same amino acid sequence (hereinafter sometimes referred to as the receptor of the present invention) are human warm blood animals (eg, guinea pigs, rats, mice, chickens, egrets, bushes, and sheep).
  • human warm blood animals eg, guinea pigs, rats, mice, chickens, egrets, bushes, and sheep.
  • Cells eg, retinal cells, liver cells, spleen cells, nerve cells, glial cells, kidney i6 cells, bone marrow cells, mesangial cells, Langerhans cells, epidermal cells, epithelial cells, endothelial cells
  • Fibroblasts fiber cells, muscle cells, adipocytes, immune cells (eg, macrophages, T cells, B cells, natural killer cells, fat cells, Neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes), megakaryocytes, synovial cells, chondrocytes, osteocytes, osteoblasts, osteoclasts, breast cells, hepatocytes or stromal cells, or Progenitor cells, stem cells or cancer cells, etc.) or any tissue in which those cells reside, such as the brain, various parts of the brain (eg, retina, olfactory bulb, amygdala, basal cerebrum, hippocampus, thalamus, Hypothalamus
  • amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 73 is about 70% or more, preferably about 80% or more, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 73 ⁇
  • amino acid sequence having about 90% or more homology is exemplified.
  • amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 75 for example, 85% or more, preferably about 90%, of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 75 Amino acid sequence having at least about 95% homology Column.
  • amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 77 is, for example, 86% or more, preferably about 90% or more, more preferably the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 77 Include amino acid sequences having about 95% or more homology.
  • amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 79 about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 79 Amino acid sequences having the above homology are exemplified.
  • amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 81 is about 82% or more, preferably about 90% or more, more preferably about 95% of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 73. Amino acid sequences having the above homology are exemplified.
  • amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 83 for example, 92% or more, preferably about 95% or more, more preferably the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 83 Include amino acid sequences having about 98% or more homology. '
  • a protein containing an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81 or SEQ ID NO: 83 For example, an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81 or SEQ ID NO: 83 Substantially the same as the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81 or SEQ ID NO: 83 Proteins having activity are preferred.
  • the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81 or SEQ ID NO: 83 includes: (i) SEQ ID NO: No .: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81 or amino acid represented by SEQ ID NO: 83 An amino acid sequence in which 1 to 15 (preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and more preferably 1 to 3) amino acids have been deleted from the acid sequence; (ii) sequence number : 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81 or 1 to 15 (preferably 1 to 15) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 83 (Iii) ⁇ SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: (10, more preferably
  • amino acid sequence represented by 1 to 15 (preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, Preferably 1 to 3) amino acids, (iv) SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, 1 to 15 (preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and more preferably 1 to 3) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 81 or SEQ ID NO: 83 And (V) an amino acid sequence obtained by combining the above (i) to (iv).
  • Specific examples of the receptor of the present invention include, for example, a protein containing an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 73, a protein containing an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 75, A protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 77; a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 79; a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 81; A protein containing the amino acid sequence represented by No. 83 is used.
  • the partial peptide of the receptor for the polypeptide of the present invention may be any partial peptide that can be used in a method for screening a drug or the like described below.
  • a partial peptide having an ability to bind to the polypeptide of the present invention a partial peptide containing an amino acid sequence corresponding to an extracellular membrane region, and the like are used.
  • Peptides having an amino acid sequence of 20 or more, preferably 50 or more, more preferably 100 or more of the constituent amino acid sequences of the receptor of the present invention are preferred.
  • Specific examples include (a) a partial amino acid sequence consisting of the 1st (Met) to 123rd (Phe) amino acid residues or a part thereof in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 73, Partial amino acid sequence consisting of the 31st (Asn) to 358th (Lys) amino acid residues or a part thereof, from the 548th (Tyr) to 59th (Arg) 'amino acid residues Or a partial amino acid sequence consisting of a partial amino acid sequence consisting of amino acid residues 843 (Ala) to 895 (lie) or one or more selected from the partial amino acid sequence A partial peptide containing a partial amino acid sequence; (b) a partial amino acid sequence consisting of the 1st (Met) to 85th (Asp) amino acid residues in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 75, or one thereof; Or a portion consisting of the 2 '2nd (Cys) to 329th (Ala) amino acid residue
  • polypeptide, receptor or partial peptide thereof of the present invention the left end is the N-terminus (amino terminus) and the right end is the C-terminus (carboxyl terminus) according to the convention of peptide labeling.
  • R in the ester e.g., methyl, Echiru, n- propyl Le, alkyl groups such as isopropyl, n- butyl, cyclo pentyl, C 3 _ 8 cycloalkyl group such as cyclohexyl, for example, phenyl , such as ⁇ - naphthyl C 6 -
  • a pivaloyloxymethyl group commonly used as an oral ester is used.
  • the polypeptide, receptor or its partial peptide of the present invention When it has a poxyl group (or a carboxylate), a polypeptide in which the carboxyl group is amidated or esterified is also included in the polypeptide of the present invention.
  • the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester and the like are used.
  • polypeptides of the present invention are those, which glutamine residue N-terminal region is cleaved in vivo to form pyroglutamic acid, the side chain of an intramolecular amino acid substituents (e.g.
  • ⁇ _H, - SH amino group, imidazole group, indole group, Guanijino group, etc.
  • protecting groups for example, c such Arukanoiru group such as a formyl group, Asechiru group, _ 6 Ashiru Or complex proteins such as so-called glycoproteins to which sugar chains are bound.
  • Salts of the polypeptide, receptor or partial peptide thereof of the present invention include salts with physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids, organic acids) and bases (eg, alkali metal salts). And especially preferred are physiologically acceptable acid addition salts.
  • physiologically acceptable acids eg, inorganic acids, organic acids
  • bases eg, alkali metal salts
  • physiologically acceptable acid addition salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, Salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc. are used.
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric
  • the polypeptide, the receptor or its partial peptide of the present invention can be produced from the above-mentioned human or warm-blooded animal cells or tissues by a known method for purifying polypeptides, or the polypeptide described below. It can also be produced by culturing a transformant transformed with DNA encoding the peptide. Also, it can be produced according to the peptide synthesis method described later. For example, it can be produced according to the method described in WO 01/98494, WO 0 274 368, and the like.
  • the human or mammalian tissues or cells are homogenized, and then extracted with an acid or the like. Purification and isolation can be achieved by a combination of chromatography such as mouth chromatography and ion exchange chromatography.
  • a commercially available resin for polypeptide synthesis can be generally used.
  • a resin include chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM resin, 4-hydroxymethylmethylphenylacetamidomethyl resin, polyacrylamide resin, 4- (2 ', 4'-dimethoxyphenylhydroxymethyl) phenoxy resin, 4- (2', 4'-dimethoxyphenyl) Fmocaminoethyl) phenoxy resin and the like.
  • amino acids having a suitably protected amino group and side chain functional group are condensed on the resin in accordance with the sequence of the desired polypeptide according to various known condensation methods.
  • the polypeptide is cleaved from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed.
  • an intramolecular disulfide bond formation reaction is carried out in a highly diluted solution, and the desired polypeptide, receptor, partial peptide or To obtain the amide form of
  • various activating reagents that can be used for the synthesis of polypeptides can be used, and carbodiimides are particularly preferable.
  • carbopimides examples include DCC, N, N'-diisopropyl carbopimide, N-ethyl-N '-(3-dimethylaminoprolyl) carbopimide, and the like. Activation by these involves the addition of a protected amino acid directly to the resin along with a racemization inhibitor additive (eg, H ⁇ B t, HOOB t), or a symmetrical acid anhydride or HOB t ester or H ⁇ B t ester Can be added to the resin after activation of the protected amino acid in advance.
  • a racemization inhibitor additive eg, H ⁇ B t, HOOB t
  • the solvent used for activating the protected amino acid or for condensing with the resin can be appropriately selected from solvents known to be usable for the polypeptide condensation reaction.
  • acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride, chloroform, and trifluoroethanol Alcohols such as dimethyls Sulfoxides such as rufoxide, ethers such as pyridine, dioxane, and tetrahydrofuran, nitriles such as acetonitrile and propionitrile, esters such as methyl acetate and ethyl acetate, or an appropriate mixture thereof are used.
  • the reaction temperature is appropriately selected from a range known to be usable for a polypeptide bond formation reaction, and is usually appropriately selected from a range of about ⁇ 20 ° C. to 50.
  • the activated amino acid derivative is usually used in a 1.5 to 4-fold excess.
  • Examples of the protecting group for the amino group of the starting material include Z, Boc, t-pentyloxycarbonyl, isoporonyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxyl-ponyl, C11Z, Br_Z, a Damantyloxycarponyl, trifluoroacetyl, 'phthaloyl, formyl, 2-ditrophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, Fmoc and the like are used.
  • the lipoxyl group may be, for example, alkyl esterified (eg, methyl, ethyl, propyl, butyl, t-butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl, etc.) Alkyl esterification), aralkyl esterification (for example, benzyl ester, 4-nitrobenzyl ester, 4-methoxybenzyl ester, 4-cyclobenzyl ester, benzhydryl esterification), phenacyl esterification, benzyl ester It can be protected by xycarbonyl hydrazide, t-butoxycarbonyl hydrazide, trityl hydrazide, or the like.
  • alkyl esterified eg, methyl, ethyl, propyl, butyl, t-butyl, cyclopentyl, cycl
  • the hydroxyl group of serine can be protected, for example, by esterification or etherification.
  • esterification for example, a group derived from carbonic acid such as a lower (C ⁇ ) alkanol group such as an acetyl group, an aroyl group such as a benzoyl group, a benzyloxycarbonyl group, and an ethoxycarbonyl group is used.
  • groups suitable for etherification include, for example, a benzyl group, Tedrahydrovinylil group, tributyl group and the like.
  • the protecting group of the phenolic hydroxyl group of tyrosine for example, Bz 1, C 1 2 one B zl, 2-two Torobenjiru, B r- Z, such as t one-butyl is used.
  • protecting group for imidazole of histidine for example, Tos, 4-methoxy2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, Fmoc and the like are used.
  • Examples of the raw material in which the hydroxyl group of the raw material is activated include the corresponding acid anhydride, azide, active ester [alcohol (eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichloromouth phenol, 2,4 —Esters with dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, HOB t)].
  • alcohol eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichloromouth phenol, 2,4 —Esters with dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, HOB t
  • the activated amino group of the raw material for example, a corresponding phosphoramide is used. .
  • Methods for removing (eliminating) protecting groups include, for example, catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, or hydrogen fluoride anhydride, methanesulfonic acid, trifluoromethane, or the like.
  • the elimination reaction by the above acid treatment is generally performed at a temperature of about 120 ° C. to 40 ° C.
  • anisol for example, anisol, phenol, thioanisole, methacrylol, paracresol, dimethylsulfur
  • a cation scavenger such as ido, 1,4-butanedithiol or 1,2-ethanedithiol.
  • the 2,4 ⁇ dinitrophenyl group used as an imidazole protecting group of histidine is removed by thiophenol treatment, and the formyl group used as an indole protecting group of tributofan is 1,2-ethanedithiol, 1,4 —In addition to deprotection by acid treatment in the presence of butanedithiol, etc., it is also removed by alkali treatment with dilute sodium hydroxide solution or dilute ammonia.
  • Protection of functional groups that should not participate in the reaction of The elimination of the protecting group, the activation of the functional group involved in the reaction, and the like can be appropriately selected from known groups or known means.
  • the receptor or the partial peptide thereof of the present invention for example, first, after protecting the carboxy-terminal amino acid at the amino group side with a peptide ( After extending the chain to the desired length, only the polypeptide except the N-terminal a-amino group protecting group of the peptide chain was removed, and only the C-terminal carboxyl group protecting group was removed. A polypeptide is produced, and both polypeptides are condensed in a mixed solvent as described above. Details of the condensation reaction are the same as described above. After purifying the protected polypeptide obtained by the condensation, all the protecting groups are removed by the above-mentioned method, and a desired crude polypeptide can be obtained. The crude polypeptide is purified by using various known purification means, and the main fraction is lyophilized to obtain a desired polypeptide, receptor or an amide of a partial peptide thereof.
  • the receptor or its partial peptide of the present invention for example, after condensing an ⁇ -hydroxyl group of a carboxyl-terminal amino acid with a desired alcohol to form an amino acid ester, in the same manner as the amide of a peptide, a receptor or a partial peptide thereof, an ester of a desired polypeptide, a receptor or a partial peptide thereof can be obtained.
  • the polypeptide, receptor or partial peptide thereof of the present invention can be produced by a known peptide synthesis method, or, for a partial peptide of the receptor, by cleaving the receptor with an appropriate peptide. can do.
  • a method for synthesizing a peptide for example, either a solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method may be used. That is, the partial peptide or amino acid which can constitute the polypeptide, receptor or its partial peptide of the present invention is condensed with the remaining portion, and when the product has a protecting group, the protecting group is removed.
  • Known methods for condensation and elimination of protecting groups include, for example, the methods described in the following (a) to (e).
  • polypeptide, receptor or partial peptide thereof of the present invention can be purified and isolated by combining crystals and the like.
  • the polypeptide, receptor or its partial peptide obtained by the above method is a free form, it can be converted to an appropriate salt by a known method or a method analogous thereto, and conversely, it can be obtained as a salt. In such a case, it can be converted to a free form or another salt by a known method or a method analogous thereto.
  • the DNA encoding the polypeptide of the present invention, the receptor or the partial peptide thereof may be any DNA containing the above-described nucleotide sequence encoding the polypeptide of the present invention, the receptor or the partial peptide thereof. There may be. In addition, any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the above-mentioned cells and tissues, cDNA library derived from the above-described cells and tissues, and synthetic DNA may be used.
  • the vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. Alternatively, it can also be directly amplified by Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR) using a preparation of a total RNA or mRNA fraction from the cells and tissues described above.
  • RT-PCR Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction
  • DNA encoding the polypeptide of the present invention examples include (a) SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: : 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 59, 'SEQ ID NO: 60, Sequence No .: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: No .: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 86 Or a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 88,
  • SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, Sequence SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 86 or SEQ ID NO: 88 Or (ii) hybridized with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 28 or SEQ ID NO:
  • DNA containing a nucleotide sequence having a homology of about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and even more preferably about 95% or more with the nucleotide sequence represented by 34 is used.
  • Hybridization is performed by a known method or a method based thereon, for example,
  • High stringency conditions refer to, for example, sodium concentration of about 19 to 4: 0 mM, preferably about 19 to 20 mM, temperature of about 50 to 70, and preferably about 60 to 65 ° C. .
  • the case where the sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 ° C is most preferable.
  • the DNA encoding the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 includes a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3, and a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 88 DNA etc. are used,
  • the DNA encoding the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 includes a DN containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 13. A and so on.
  • DNA encoding the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 16 or the like is used,
  • DNA encoding the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 is, for example, DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 17;
  • the DNA encoding the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 is a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 18.
  • DNA encoding the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25 includes DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 27, and the like.
  • DNA encoding the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 30 includes DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 32, and the like.
  • the DNA encoding the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 31 contains the base sequence represented by SEQ ID NO: 33.
  • the DNA encoding the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 41 is a DNA encoding the polypeptide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 59.
  • the DNA encoding the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 46 is a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 64.
  • DNA encoding the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 47 DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 65, or the like is used.
  • DNA encoding the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 48 a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 26 or the like is used,
  • DNA encoding the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 50 includes DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 ′, and the like.
  • DNA encoding the polypeptide containing the amino 9-noic acid sequence represented by SEQ ID NO: 51 DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 or the like is used,
  • DNA containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 54: ⁇ -dose is used as DNA, such as DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 68,
  • DNA encoding the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 55 includes, for example, DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 69,
  • DNA As the DNA encoding the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21, DNA such as' DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 70 is used,
  • DNA encoding the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 56 contains the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 66 DNA etc. are used, ⁇
  • DNA encoding the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 71 includes DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 72, and the like.
  • DNA encoding the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 85 DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 86, DNA and the like are used.
  • Examples of the DNA encoding the receptor of the present invention include: (1) DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 74, or the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 74 and under conditions of high stringency. DNA encoding a protein having a nucleotide sequence that hybridizes with: and having substantially the same activity as the protein containing the amino acid represented by SEQ ID NO: 73; (2) SEQ ID NO: 76 Or a protein having a base sequence that hybridizes under high stringent conditions to a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 76 or a protein containing the amino acid represented by SEQ ID NO: 75 (3) DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 78, or DNA encoding the protein having the same activity, Gent DNA encoding a protein having a nucleotide sequence that hybridizes under the conditions and having substantially the same activity as the amino acid-containing protein represented by SEQ ID NO: 77; (4) SEQ ID NO
  • SEQ ID NO: 81 A DNA encoding a protein having substantially the same activity as a protein containing an amino acid represented by (6), (6) a DNA containing a base sequence represented by SEQ ID NO: 84, or a SEQ ID NO: 84 A nucleotide sequence that hybridizes under high stringent conditions with a nucleotide sequence represented by the following: and encodes a protein having substantially the same activity as the protein containing the amino acid represented by SEQ ID NO: 83 Any material such as A may be used.
  • DNAs that can hybridize with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78 or SEQ ID NO: 80 under high stringent conditions include, for example, SEQ ID NO: 74 and SEQ ID NO: 76, respectively. About 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and still more preferably about 95% or more with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 78 or SEQ ID NO: 80. DNA having a base sequence having the same is used.
  • Examples of the DNA that can hybridize with the base sequence represented by SEQ ID NO: 82 under high stringency conditions include, for example, the base sequence represented by SEQ ID NO: 82 and 82% or more, preferably about 85% or more, more preferably
  • DNA containing a nucleotide sequence having a homology of about 90% or more, more preferably about 95% or more is used.
  • Examples of the DNA that can hybridize with the base sequence represented by SEQ ID NO: 84 under high stringency conditions include, for example, 92% or more, preferably about 95% or more, more preferably the base sequence represented by SEQ ID NO: 84.
  • DNA containing a base sequence having about 98% or more homology is used.
  • Hybridization can be performed by a known method or a method analogous thereto, for example, Molecular Cloning 2nd (J. Sarabrook et al., Cold Spring Harbor Lab.
  • High stringency conditions include, for example, a sodium concentration of about 19 to 40 mM, preferably about 19 to 2 OmM, and a temperature of about 50 to 70 ° C, preferably about
  • the DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 73 includes a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 74, and an amino acid represented by SEQ ID NO: 75.
  • Examples of the DNA encoding the protein containing the sequence include DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 76, and DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 77 include: DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 78; DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 79; DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 80;
  • SEQ ID NO: DNA containing the base sequence represented by 84 is used
  • the DNA encoding the partial peptide of the receptor of the present invention may be any as long as it contains the nucleotide sequence encoding the partial peptide of the receptor of the present invention described above. Further, it may be any of genomic DNA, genomic DNA library, the above-described cell / tissue-derived cDNA, the above-described cell / tissue-derived cDNA library, and synthetic DNA.
  • Examples of the DNA encoding the partial peptide of the receptor of the present invention include: (1) a DNA having a partial nucleotide sequence of a DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 74, or a nucleotide represented by SEQ ID NO: 74 Has a nucleotide sequence that hybridizes with the sequence under eight stringent conditions, and has a partial nucleotide sequence of a DNA encoding a protein having substantially the same activity as the protein containing the amino acid represented by SEQ ID NO: 73 DNA, (2) DNA having a partial nucleotide sequence of DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 76, or SEQ ID NO:
  • DNAs capable of hybridizing with the base sequence represented by SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82 or SEQ ID NO: 84 have the same significance as described above.
  • the DNA encoding the polypeptide, receptor or partial peptide thereof of the present invention may be labeled by a known method, and specifically, isotope-labeled DNA, fluorescently-labeled DNA (for example, Fluorescent labeling with fluorescein), biotinylated or enzyme-labeled ones.
  • isotope-labeled DNA for example, Fluorescent labeling with fluorescein
  • biotinylated for example, Biotinylated or enzyme-labeled ones.
  • a polypeptide of the present invention labeled with isotop is used.
  • the polypeptide, the receptor or its partial peptide of the present invention (hereinafter, in the description of the cloning and expression of DNA encoding these polypeptides, etc., when these polypeptides, etc. are simply abbreviated as the polypeptides of the present invention.
  • a DNA is amplified by a known PCR method using a synthetic DNA primer having a partial nucleotide sequence of the polypeptide of the present invention, or an appropriate method is used.
  • the DNA incorporated into the vector can be selected by hybridization with a DNA fragment encoding a part or the entire region of the polypeptide of the present invention or a DNA fragment labeled with a synthetic DNA. The method of hybridization is described, for example, in Molecul ar Cloning 2nd (J.
  • Conversion of the DNA base sequence can be performed using a known kit, for example, Mutan TM -super Express Km (Takara Shuzo Co., Ltd.), Mutan TM -K (Takara Shuzo Co., Ltd.), etc., using the OM-LA PCR method and the Gapped method. It can be carried out according to a known method such as the duplex method and the Kunkel method, or a method analogous thereto.
  • the DNA encoding the cloned polypeptide can be used as it is depending on the purpose, or it can be used after digesting with a restriction enzyme or adding a linker, if desired.
  • the DNA has ATG as a translation initiation codon at its 5, terminal end. It may also have TAA, TGA or TAG as a translation stop codon on the 3 'end side. These translation initiation codon and translation termination codon can be added using an appropriate synthetic DNA adapter.
  • the expression vector of the polypeptide of the present invention can be prepared, for example, by (a) cutting out a DNA fragment of interest from DNA encoding the polypeptide of the present invention, and (mouth) placing the DNA fragment in an appropriate expression vector. Can be produced by ligating downstream of this promoter.
  • the vector examples include a plasmid derived from Escherichia coli (eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13), a plasmid derived from Bacillus subtilis (eg, pUBll0, TP5, pC194), a plasmid derived from yeast (eg, SH19, pSH15), bacteriophages such as ⁇ phage, animal viruses such as retrovirus, vaccinia virus, baculovirus, etc., pAl-11, pXT1, Rc / CMV, pRc / RSV And pc DNA I / Neo. , 1
  • Escherichia coli eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13
  • Bacillus subtilis eg, pUBll0, TP5, pC194
  • yeast eg, SH19, pSH15
  • bacteriophages such as
  • the promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is suitable for the host used for expression of the gene.
  • examples include the SRa promoter, SV40 promoter, HIV / LTR promoter, CMV promoter, and HSV-TK promoter.
  • CMV cytomegalovirus
  • SRCK promoter cytomegalovirus promoter
  • the host is Escherichia, trp promoter, lac promoter, recA promoter, ⁇ PL promoter, lpp promoter, T7 promoter, etc., and if the host is Bacillus, SP ⁇ 1 promoter
  • yeast such as SPO2 promoter, penP promoter overnight, PH05 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH. Promoter and the like are preferable.
  • a polyhedrin promoter, a P10 promoter and the like are preferable.
  • expression vectors include enhancers and splicing if desired.
  • a signal containing a signal, a polyA addition signal, a selection marker, an SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV40 ori '), or the like can be used.
  • selectable markers include dihydrofolate reductase (hereinafter sometimes abbreviated as dhfr) gene (methotrexate (MTX) resistance), ampicillin resistance gene (hereinafter sometimes abbreviated as Amp 37 ), neomycin Syn-resistance gene (hereinafter sometimes abbreviated as Neor., G418 resistance) and the like.
  • dh fr gene when used as a selection marker using Chinese hamster cells deficient in the dh fr gene, the target gene can be selected using a thymidine-free medium.
  • a signal sequence suitable for the host is added to the N-terminal side of the polypeptide of the present invention.
  • the PhoA * signal sequence and the 0-A signal sequence are used.
  • the amylase-signal sequence and subtilisin-signal sequence are used.
  • the host is yeast, MFcK signal sequence, SUC2 signal sequence, etc.
  • the host is an animal cell, insulin signal sequence, ⁇ - ⁇ f interferin signal sequence, antibody molecule, signal sequence, etc. Are available respectively.
  • a transformant can be produced using the thus constructed vector containing the DNA encoding the polypeptide of the present invention.
  • Escherichia bacteria for example, Bacillus bacteria, yeast, insect cells, insects, animal cells, and the like are used.
  • Escherichia bacteria include, for example, Escherichia coli
  • Bacillus bacteria include, for example, Bacillus subtilis (Bacillus subtilis) MI 114 [Gene, 24, 255 (1983)], 207-21 [Journal of Biochemistry, Vol. 95] , 8.7 (1 984)].
  • yeast examples include Saccharomyces cerevisiae AH 22, AH 22 R ⁇ , NA87-11A, DKD-5D, 20B-12 and Schizosaccharomyces pombe N CYC 1913. , NCYC 2036, Pichia astoris KM 71 and the like.
  • Insect cells include, for example, 'If the virus is Ac NPV, cell lines derived from night larvae of moth larvae (Spodoptera frugiperda cells; S f cells), MG1 cells derived from the midgut of Trichoplusia ni, and eggs derived from eggs of Trichoplusia ni High Five TM cells,
  • Cells derived from Mamestra brassicae or cells derived from Estigmena acrea are used.
  • a silkworm-derived cell line (Bombyx mori cell; BmN cell) is used.
  • Sf cells include Sf9 cells (ATCC CRL1711) and Sf21 cells (Vaughn, JL et al., In Vivo, 13, 213-217, (1977)). Are used.
  • insects for example, silkworm larvae and the like are used [Maemura, Nature, Vol. 315, 592 (1985)].
  • animal cells examples include monkey cell COS-7, Vero, Chinese hamster cell CHO (hereinafter abbreviated as CHO cell), dh ⁇ r gene-deficient Chinese hamster cell CHO (hereinafter, CHO (dh fr—) cell Abbreviations), mouse L cells, mouse AtT-'20, mouse myeloma cells, rat GH3, human FL cells, and the like. '
  • Insect cells or insects can be transformed, for example, according to the method described in Bio / Technology, 6, 47-55 (1988). ,
  • a liquid medium is suitable as a medium for cultivation, and a carbon source necessary for the growth of the transformant is contained therein.
  • Carbon sources include, for example, glucose, dextrin, soluble starch, sucrose, etc.
  • Nitrogen sources include, for example, ammonium salts, nitrates, corn chips.
  • the inorganic or organic substance such as a liquid and the inorganic substance include calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, and magnesium chloride.
  • yeast extract, vitamins, growth promoting factors and the like may be added.
  • the pH of the medium is preferably about 5-8.
  • Examples of a medium for culturing Escherichia bacteria include, for example, M9 medium containing glucose and casamino acids (Miller, Journal of Journal of Experiments in Molecular Genetics). Molecular Genetics), 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972].
  • a drug such as 3i3-indolylacrylic acid can be added.
  • the cultivation is usually performed at about 15 to 43 ° C for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring may be added.
  • the cultivation is usually carried out at about 30 to 40 ° C for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring can be applied.
  • the medium used is Grace s Insect Medium (Grace, T.,
  • the pH of the medium is preferably adjusted to about 6.2 to 6.4. Culture is usually performed at about 27 ° C for about 3 to 5 days, with aeration and agitation as necessary. ,
  • the medium When culturing a transformant in which the host is an animal cell, the medium may be, for example, a MEM medium containing about 5 to 20% fetal bovine serum [Science, 122, 501 (1952)], a DMEM medium [Virology, 8, 396 (1959)], RPMI 1640 medium [Journal of the American Medical Association 'Yon (The Journal of the American Medical Association) 199, 519 ( 1967) 3, 199 medium [Proceding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)]. pH is about 6-8 It is preferred that Cultivation is usually carried out at about 30 ° C to 40 ° C for about 15 to 60 hours, and aeration and stirring are added as necessary.
  • polypeptide of the present invention can be produced in the cells, in the cell membrane, or outside the cells of the transformant.
  • polypeptide of the present invention can be separated and purified from the culture by, for example, the following method. '
  • the cells or cells are collected by a known method, suspended in an appropriate buffer, and subjected to ultrasonication, lysozyme and / or lysozyme. After the cells or cells are destroyed by freeze-thawing or the like, a method of obtaining a crude extract of the polypeptide by centrifugation or filtration is appropriately used.
  • the buffer may contain a protein denaturant such as urea or guanidine hydrochloride, or a surfactant such as Triton X-100 TM .
  • Purification of the polypeptide contained in the thus obtained culture supernatant or extract can be carried out by appropriately combining known separation and purification methods.
  • known separation and purification methods include methods using solubility such as salting out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
  • a method utilizing a difference in hydrophobicity such as isoelectric focusing
  • a method utilizing an isoelectric point difference such as isoelectric focusing, and the like are used.
  • the polypeptide thus obtained when obtained in a free form, it can be converted to a salt by a known method or a method analogous thereto, and conversely, when the polypeptide is obtained as a salt, a known method or analogous method Depending on the method, it can be converted into a free form or another salt.
  • the polypeptide produced by the recombinant can be arbitrarily modified or treated with a suitable protein-modifying enzyme before or after purification. It can also be partially removed.
  • a suitable protein-modifying enzyme for example, trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like are used.
  • an antibody against the polypeptide or the receptor of the present invention may be a polyclonal antibody, a monoclonal antibody if it can recognize the polypeptide or the receptor of the present invention. Any of antibodies may be used.
  • An antibody against the polypeptide or the receptor of the present invention can be produced by using the polypeptide or the receptor of the present invention as an antigen according to a known method for producing an antibody or an antiserum.
  • the polypeptide or receptor of the present invention is administered to a warm-blooded animal itself or together with a carrier or diluent at a site where antibody production is possible by administration.
  • Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered to enhance the antibody-producing ability upon administration. Administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, for a total of about 2 to 10 times.
  • Examples of the warm-blooded animal to be used include monkeys, rabbits, rabbits, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep, goats, and chickens, and mice and ruds are preferably used.
  • a warm-blooded animal immunized with the antigen for example, an individual with an antibody titer from a mouse is selected, and spleen or lymph nodes are collected 2 to 5 days after the final immunization.
  • a monoclonal antibody-producing hybridoma can be prepared by fusing the antibody-producing cells contained with myeloma cells of the same or different species.
  • the measurement of the antibody titer in the antiserum can be performed, for example, by reacting a labeled polypeptide described below with the antiserum, and then measuring the activity of the labeling agent bound to the antibody.
  • the fusion operation can be performed according to a known method, for example, the method of Keller and Milstein [Nature, 256, 495 (1975)].
  • the fusion promoter include polyethylene daricol (PEG) and Sendai virus, and PEG is preferably used.
  • PEG polyethylene daricol
  • myeloma cells include myeloma cells of warm-blooded animals such as NS-1, P3U1, SP 2/0, and AP-1, but P3U1 is preferably used.
  • the preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of myeloma cells used is about 1: 1 to 20: 1, and PEG (preferably PEG 1000 to PEG 6000) is used at a concentration of about 10 to 80%.
  • Cell fusion can be carried out efficiently by adding the mixture and incubating at 20 to 40 ° C, preferably 30 to 37 ° C, for 1 to 10 minutes.
  • hybridomas can be cultured on a solid phase (eg, microplate) onto which a polypeptide (protein) antigen is directly or adsorbed together with a carrier. Then, an anti-immunoglobulin antibody labeled with a radioactive substance or an enzyme (if the cell used for cell fusion is a mouse, a mouse immunoglobulin antibody is used) or protein A, is added.
  • a solid phase eg, microplate
  • an anti-immunoglobulin antibody labeled with a radioactive substance or an enzyme if the cell used for cell fusion is a mouse, a mouse immunoglobulin antibody is used
  • protein A protein A
  • a method for detecting a monoclonal antibody bound to a solid phase adding a hybridoma culture supernatant to a solid phase to which an anti-immunoglobulin antibody or protein A is adsorbed, adding a polypeptide labeled with a radioactive substance, an enzyme, or the like, A method for detecting a monoclonal antibody bound to a solid phase is exemplified.
  • the selection of the monoclonal antibody can be performed according to a known method or a method analogous thereto. Usually, it can be performed in a medium for animal cells supplemented with HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine).
  • any medium can be used as long as it can grow a hybridoma.
  • RPMI 1640 medium containing 1-20%, preferably 10-20% fetal bovine serum
  • GIT medium containing 1-10% fetal bovine serum (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
  • the culture temperature is usually 20-40 ° C, preferably about 37 ° C.
  • the culturing time is usually between 5 days and 3 days, preferably between 1 week and 2 weeks. Culture can be usually performed under 5% carbon dioxide gas.
  • the antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above.
  • Monoclonal antibodies can be separated and purified by known methods, for example, immunoglobulin separation and purification methods (eg, salting out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis method, ion exchanger (eg, DEAE)). Adsorption / desorption method, ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen-binding solid phase or specific purification method in which only the antibody is collected using an active adsorbent such as protein A or protein G and the bond is dissociated to obtain the antibody). You can do it.
  • immunoglobulin separation and purification methods eg, salting out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis method, ion exchanger (eg, DEAE)
  • the polyclonal antibody of the present invention can be produced according to a known method or a method analogous thereto.
  • an immunogen polypeptide antigen itself or a complex thereof with a carrier protein is formed, and immunization is performed on a warm-blooded animal in the same manner as in the above-described method for producing a monoclonal antibody.
  • the antibody can be produced by collecting an antibody-containing substance for the peptide and separating and purifying the antibody.
  • the type of the carrier protein and the mixing ratio of the carrier and the hapten depend on the hapten immunized by cross-linking with the carrier. As long as ⁇ can be efficiently formed, any kind may be cross-linked at any ratio.For example, serum serum albumin, thyroglobulin, hemocyanin, etc. are used in a weight ratio of about 0.1 to 1 for hapten. A method of coupling at a rate of 1 to 20, preferably about 1 to 5 is used. In addition, various condensing agents can be used for force coupling between the hapten and the carrier.
  • daltaraldehyde carbodiimide, a maleimide active ester, an active ester reagent containing a thiol group or a dithioviridyl group, or the like is used.
  • the condensation product is administered to a warm-blooded animal at a site where antibody production is possible or together with a carrier or diluent.
  • Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production ability upon administration.
  • the administration is usually performed once every about 2 to 6 weeks, for a total of about 3 to 10 times.
  • the polyclonal antibody can be collected from the blood, ascites, etc., preferably from the blood, of the warm-blooded animal immunized by the above method.
  • the measurement of the polyclonal antibody titer in the antiserum is based on the measurement of the antibody titer in the antiserum described above. Can be measured in the same manner as described above. Separation and purification of the polyclonal antibody can be carried out according to the same immunoglobulin separation and purification method as the above-described separation and purification of the monoclonal antibody.
  • Bases complementary to or substantially complementary to DNA encoding the polypeptide, receptor or partial peptide thereof of the present invention may be abbreviated as the DNA of the present invention.
  • An antisense polynucleotide preferably DNA having a sequence (hereinafter sometimes abbreviated as antisense DNA) has a base sequence complementary to or substantially complementary to the DNA of the present invention.
  • any antisense DNA may be used as long as it has an action of suppressing the expression of the DNA.
  • the nucleotide sequence substantially complementary to the DNA of the present invention refers to, for example, the entire nucleotide sequence or a partial nucleotide sequence of the nucleotide sequence complementary to the DNA of the present invention (that is, the complementary strand of the DNA of the present invention). Nucleotide sequences having about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more homology.
  • an antisense DNA having a homology of preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more is suitable. These antisenses can be produced using a known DNA synthesizer or the like.
  • the antisense DNA of the present invention may contain altered or modified sugars, bases, or bonds, and may be provided in a special form such as ribosome or microsphere, applied by gene therapy, or added. Can be given in a written form.
  • polycations such as polylysine, which acts to neutralize the charge of the phosphate skeleton
  • lipids which increase the interaction with the cell membrane or increase the uptake of nucleic acids (
  • hydrophobic substances such as phospholipid and cholesterol
  • Preferred lipids for addition include cholesterol and its derivatives (eg, cholesteryl chromate formate, cholic acid, etc.).
  • nucleic acids Can be attached to the 3 'end or 5' end of the protein, and can be attached via a base, sugar, or intramolecular nucleoside bond.
  • Other groups include cap groups specifically arranged at the 3 'end or 5' end of a nucleic acid for preventing degradation by nucleases such as exonuclease and RNase.
  • capping groups include, but are not limited to, hydroxyl-protecting groups known in the art, including glycols such as polyethylene glycol and tetraethylene glycol.
  • the antisense DNA inhibitory activity is examined using the transformant of the present invention, the in vivo or in vitro gene expression system of the present invention, or the in vivo or in vitro translation system of the peptide or receptor of the present invention. be able to.
  • the following are (a) the polypeptide of the present invention, (b) the receptor of the present invention (hereinafter also including a partial peptide thereof), (c) the DNA of the present invention, (d) the antibody of the present invention, and (e) The use of the antisense DNA and the like of the present invention will be described.
  • the polypeptide of the present invention has a cell stimulating activity on an expression cell such as the receptor of the present invention (eg, GPR8, GPR7, rat TGR26, mouse TGR26, ⁇ sher GPR8, Gsher GPR7), and the like. Is an endogenous ligand.
  • the receptor of the present invention eg, GPR8, GPR7, rat TGR26, mouse TGR26, ⁇ sher GPR8, Gsher GPR7, and the like. Is an endogenous ligand.
  • the polypeptide of the present invention or the DNA of the present invention is abnormal or defective, or when the receptor of the present invention or the DNA encoding the receptor is abnormal or defective.
  • urinary storage disorders eg, frequent urination, urinary incontinence (eg, urge incontinence, stress urinary incontinence, functional urinary incontinence, etc.)
  • polyuria eg, diabetes insipidus (eg, pituitary urine) Dyspnea, renal diabetes insipidus, etc.), hypernatremia, metabolic allolysis, hypokalemia, Gushing syndrome and the likelihood is high.
  • the polypeptide of the present invention and the DNA of the present invention can be used, for example, as an antidiuretic, for example, for urinary storage disorders [eg, frequent urination, urinary incontinence (eg, urge incontinence, bariatric urine) Incontinence, functional urinary incontinence, etc.), polyuria, diabetes insipidus (eg, pituitary diabetes insipidus, renal diabetes insipidus, etc.), hypernatremia, metabolic alkalosis, low potassium. It can be used as a preventive 'treatment for muemia, Cushing's syndrome, etc.
  • urinary storage disorders eg, frequent urination, urinary incontinence (eg, urge incontinence, bariatric urine) Incontinence, functional urinary incontinence, etc.
  • polyuria eg, diabetes insipidus (eg, pituitary diabetes insipidus, renal diabetes insipidus, etc.
  • urinary incontinence eg, urge incontinence, stress urinary incontinence, functional urinary incontinence, etc.
  • polyuria e.g, diabetes insipidus (eg, pituitary insipidus, renal insipidus, etc.)
  • Hypernatremia e.g., metabolic alkalosis, hypokalemia, Cushing syndrome and other prophylactic treatment.
  • the polypeptide of the present invention and the DNA of the present invention can be obtained, for example, by administering the DNA of the present invention to a patient when the polypeptide of the present invention is reduced or deleted in vivo.
  • the DNA of the present invention By expressing the polypeptide of the present invention in vivo, (oral) the DNA of the present invention is inserted into cells, and after expressing the polypeptide of the present invention, the cells are transplanted into a patient.
  • C By administering the polypeptide of the present invention to the patient, the role of the polypeptide of the present invention in the patient can be sufficiently or normally exerted.
  • the DNA of the present invention is used as the above-mentioned prophylactic or therapeutic agent
  • the DNA is used alone or in an appropriate vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus-associated virus vector, or the like. After that, it can be administered to humans or warm-blooded animals according to conventional means.
  • the DN N of the present invention can be administered as it is or as a formulation with a physiologically acceptable carrier such as an adjuvant for promoting uptake, and administered by a catheter such as a gene gun or a hydrogel catheter. '
  • polypeptide of the present invention When used as the above prophylactic / therapeutic agent, it is purified to at least 90%, preferably at least 95%, more preferably at least 98%, and even more preferably at least 99%. It is preferred to use
  • the polypeptide of the present invention can be used, for example, as a sugar-coated tablet, capsule, elixir, microcapsule or the like, if necessary, orally, or water or other pharmaceutically acceptable liquid. It can be used parenterally (preferably subcutaneous administration) in the form of an injection such as a sterile solution or suspension.
  • the polypeptides of the present invention can be combined with physiologically acceptable carriers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, and the like, in the form of unit dosages generally required for accepted pharmaceutical practice. It can be manufactured by mixing. The amount of active ingredient in these preparations is such that a suitable dosage in the specified range can be obtained. You. .
  • Additives that can be incorporated into tablets, capsules, etc. include, for example, binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, Swelling agents such as gelatin, alginic acid and the like, lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, and flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or cherry.
  • the unit dosage form is a capsule
  • the above-mentioned ingredients of the evening may further contain a liquid carrier such as oil and fat.
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to standard pharmaceutical practice, such as dissolving or suspending the active substance in a vehicle such as water for injection, or naturally occurring vegetable oils such as sesame oil or coconut oil. .
  • aqueous liquids for injection include physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium salt, etc.) and the like.
  • Solubilizers for example, alcohols (eg, ethanol, etc.), polyalcohols (eg, propylene glycol, polyethylene glycol, etc.), nonionic surfactants (eg, Polysorbate 80 TM, HCO-50, etc.) ) May be used together.
  • the oily liquid include sesame oil and soybean oil, and may be used in combination with benzyl benzoate, benzyl alcohol and the like as a solubilizing agent.
  • buffers for example, phosphate buffer, sodium acetate buffer, etc.
  • soothing agents for example, benzalkonium chloride ,: pro-protein hydrochloride, etc.
  • stabilizers for example, human serum albumin, polyethylene glycol: Alcohol, etc.
  • preservatives eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • antioxidants antioxidants and the like.
  • the prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
  • the vector into which the DNA of the present invention is inserted is also formulated in the same manner as described above, and is usually used parenterally.
  • the preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, and are therefore useful, for example, in humans or warm-blooded animals (eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, birds, higgs, bushes, dogs, dogs, Cats, dogs, monkeys, etc.).
  • the dose of the polypeptide of the present invention may vary depending on the target disease, the subject of administration, the administration route, and the like.For example, when the polypeptide of the present invention is administered subcutaneously for the purpose of treating diabetes insipidus, it is generally In adults (as 60 kg), about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg of the polypeptide is administered per day. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of 60 kg.
  • the polypeptide of the present invention has a function as a ligand of the receptor of the present invention
  • the polypeptide of the present invention or the present invention Compounds or salts thereof that promote the function of the receptor are useful, for example, as antidiuretics, etc., and have impaired urinary storage [eg, urinary frequency, urinary incontinence (eg, urge incontinence, stress urinary incontinence, functional Urinary incontinence, etc.), polyuria, diabetes insipidus (eg, pituitary diabetes insipidus, renal diabetes insipidus, etc.), hypernatremia, metabolic alkalosis, hypokalemia, Cushing syndrome, etc.
  • urinary storage eg, urinary frequency, urinary incontinence (eg, urge incontinence, stress urinary incontinence, functional Urinary incontinence, etc.)
  • polyuria eg, diabetes insipidus (eg, pituitary diabetes insipid
  • incontinence eg, urge incontinence, stress urinary incontinence, functional urinary incontinence, etc.
  • polyuria e.g, diabetes insipidus (eg, pituitary insipidus, renal insipidus, etc.)
  • hypernatremia e.g, metabolic alkalosis, hypokalemia, Cushing syndrome. It is a therapeutic agent.
  • the polypeptide of the present invention or a compound or a salt thereof that inhibits the function of the receptor of the present invention is useful as, for example, a diuretic, and produces renal edema, urinary excretion disorder (eg, , Dysuria, urinary pain, urinary tract obstruction, etc.), hyponatremia, antidiuretic hormone inadequate syndrome (SIADH), hypertension, etc. can be used as preventive and therapeutic agents.
  • the screening can be performed by using the polypeptide of the present invention or constructing a recombinant expression system of the polypeptide of the present invention, and using a receptor binding assay system using the expression system.
  • Compounds that alter the binding between the polypeptide and its receptor a compound that promotes or inhibits the activity of the polypeptide of the present invention, a compound that promotes or inhibits the activity of the receptor of the present invention
  • a compound that promotes or inhibits the activity of the receptor of the present invention eg, peptide, protein, etc.
  • Such compounds and through the receptor of the present invention cell stimulating activity (e.g., Arakidon acid release, acetylcholine release, intracellular C a 2 + release, intracellular AM P generated Z suppression, intracellular c GM P Production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, activation of c-fos, decrease in pH, activity to promote GTPTS binding activity, etc. (ie, the polypeptide of the present invention) Receptor agonist) and a compound having no cell stimulating activity (ie, a receptor antagonist of the polypeptide of the present invention).
  • "Altering the binding to the polypeptide of the present invention” includes both cases of inhibiting the binding to the polypeptide of the present invention and promoting the binding to the polypeptide of the present invention. Things.
  • a method for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of the polypeptide of the present invention or the receptor of the present invention characterized by using the polypeptide and the receptor of the present invention or the receptor of the present invention.
  • a method for screening for a compound that alters the binding property of the polypeptide of the present invention to the receptor of the present invention a compound that promotes or inhibits the activity of the polypeptide of the present invention or a salt thereof, characterized in that: No.
  • a labeled polypeptide of the present invention When a labeled polypeptide of the present invention is brought into contact with a cell having the receptor of the present invention or a membrane fraction of the cell, a labeled polypeptide of the present invention and a test compound are compared with each other. Measuring and comparing the amount of the labeled polypeptide of the present invention bound to the cell or the membrane fraction when the cell is contacted with the cell containing the receptor of the present invention or the membrane fraction of the cell. A method for screening a compound (a compound that promotes or inhibits the activity of the polypeptide of the present invention) or a salt thereof, which alters the binding between the polypeptide of the present invention and the receptor of the present invention,
  • a compound activating the receptor of the present invention for example, the polypeptide of the present invention
  • a compound activating the receptor of the present invention When a test compound is brought into contact with a cell containing the receptor of the present invention, cell stimulating activity via the receptor of the present invention (for example, araki'donic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ Release, Intracellular CAMP production Z suppression, Intracellular cGMP production, Inositol phosphate production, Cell membrane potential fluctuation, Intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, pH decrease, GTP r S
  • a compound that alters the binding property between the polypeptide of the present invention and the receptor of the present invention which is characterized by measuring and comparing the activity of promoting or suppressing the binding activity and the like (the polypeptide of the present invention) Promotes or inhibits the activity of Compounds) or screening method of
  • a compound that activates the receptor of the present invention for example, And the like, when a transformant containing DNA encoding the receptor of the present invention is contacted with the receptor of the present invention expressed on the cell membrane by culturing the transformant.
  • the activating compound and the test compound are brought into contact with the receptor of the present invention expressed on the cell membrane by culturing a transformant containing the DNA encoding the receptor of the present invention
  • Cell stimulating activity mediated by the receptor of the invention e.g., arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, inhibition of intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular Protein phosphorylation, activation of c: fos, decrease in pH, activity to promote or inhibit GTPaS binding activity, etc.
  • Peptide and the present invention Compounds that alter the binding property between receptor or screening method of a compound represented by the formula (compound promoting or inhibiting the activity of the polypeptide of the present invention), and the like.
  • SEQ ID NO were respectively-labeled with [125 1]: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO : 37, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO .: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO :
  • the receptor of the present invention used in the screening method of the present invention may be any receptor that recognizes the polypeptide of the present invention as a ligand. And the like are preferred. However, since it is particularly difficult to obtain human-derived organs, the receptor of the present invention, etc., which is expressed in large amounts using recombinants, is suitable for screening. You.
  • the preparation method described later when cells containing the receptor of the present invention or the cell membrane fraction are used, the preparation method described later may be followed.
  • the cells When cells containing the receptor of the present invention are used, the cells may be immobilized with dartartaldehyde, formalin, or the like.
  • the immobilization method can be performed according to a known method. ⁇
  • the cell containing the receptor of the present invention refers to a host cell expressing the receptor of the present invention.
  • the host cell include the aforementioned Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, insect cells, animal cells, and the like.
  • Can be The host cell that has expressed the receptor of the present invention includes the same method as the above-described method for producing a transformant that has been transformed with the expression vector containing the polypeptide of the present invention.
  • the membrane fraction refers to a fraction containing a large amount of cell membrane obtained by a known method after cell disruption.
  • Cells can be disrupted by crushing cells with a Potter-Elvehj em-type homogenizer, such as a Warinda blender or Polytron.
  • centrifugal fractionation methods such as differential centrifugation and density gradient centrifugation are mainly used.
  • the cell lysate is centrifuged at a low speed (500-3000 ⁇ 111) for a short time (typically about 1-10 minutes), and the supernatant is further centrifuged at a higher speed (15000-30000 rpm) for 30 minutes to 2 hours.
  • the resulting precipitate is used as the membrane fraction.
  • the membrane fraction is rich in the expressed receptor of the present invention and membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins.
  • the amount of the receptor of the present invention in the cell or membrane fraction containing the receptor of the present invention is preferably 10 3 to 10 8 molecules per cell, and more preferably 10 5 to 10 7 molecules per cell. It is suitable.
  • the receptor fraction of the present invention is preferably a natural receptor fraction of the present invention or a recombinant receptor fraction of the present invention having an activity equivalent thereto.
  • equivalent activity refers to equivalent ligand binding activity and the like.
  • the labeled polypeptide for example [3 ⁇ 4], [125 1], and the like can be used [14 C], C 35 S] labeled polypeptide or the like. Of these, a polypeptide labeled with [ 125 1] is preferable.
  • a cell containing the receptor of the present invention or a membrane fraction of the cell is used. Is prepared in a buffer suitable for screening to prepare a receptor preparation.
  • the buffer may be any buffer, such as a phosphate buffer having a pH of 4 to 10 (preferably pH 6 to 8) or a buffer such as a tris-monohydrochloride buffer, which does not inhibit the binding between the ligand and the receptor.
  • a surfactant such as CHAPS, Tween-80 TM (Kao-Atlas), digitonin, and dexcholate can be added to the buffer.
  • a protease inhibitor such as PMS F, leptin, E-64 (manufactured by Peptide Research Institute), or pepstatin is added to suppress the degradation of the receptor of the present invention or the polypeptide of the present invention by a protease.
  • One NSB obtained by subtracting the non-specific binding amount (NSB) from the count when there is no antagonist (B.) is defined as 100%, the specific binding amount (B—NSB) ) Is, for example, 50% or less. It is selected as auxiliary material Can be
  • the methods (d) to (e) for screening for a compound that changes the binding property of the polypeptide of the present invention to the receptor of the present invention to carry out the fine ⁇ intense activity mediated by the receptor of the present invention (e.g., Arakidon acid release, acetylcholine release, intracellular C a 2 + release, intracellular c AM P generated Z suppression, intracellular c GM P generated Inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, activation of c-fos, decrease in pH, activity to promote or inhibit GTPaS binding activity, etc.) It can be measured using a commercially available measurement kit.
  • cells containing the receptor of the present invention are cultured in a multiwell plate or the like. Before conducting screening, replace the cells with fresh medium or an appropriate buffer that is not toxic to cells, add test compounds, etc., incubate for a certain period of time, and then extract cells or collect supernatant.
  • the products produced are quantified according to the respective methods.
  • a substance for example, arachidonic acid
  • an inhibitor for the degrading enzyme may be added to perform the assay.
  • activities such as inhibition of cAMP production can be detected as production inhibiting effects on cells whose basic production has been increased with forskolin or the like.
  • cells expressing an appropriate receptor of the present invention are required.
  • the above-described cell lines expressing the receptor of the present invention and the like are desirable.
  • Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and the like.
  • a screening kit for a compound that changes the binding property of the polypeptide of the present invention to the receptor of the present invention comprises the receptor of the present invention or the salt thereof.
  • Examples of the screening kit of the present invention include the following.
  • CHO cells expressing the receptor of the present invention were subcultured on a 12-well plate at 5 ⁇ 10 5 cells / well and cultured for 2 days in 37, 5% CO 2 , 95% air.
  • a solution of the polypeptide of the present invention labeled with [ ⁇ ], [I], [ 14C ], [], etc. in a suitable solvent or buffer solution is stored at 4 ° C or -20, and stored at the time of use. Dilute to 1 M with assay buffer.
  • polypeptide of the present invention is dissolved in P'BS containing 0.1% Pserum serum albumin (manufactured by Sigma) so as to be ImM, and stored at ⁇ 20 ° C.
  • a compound or a salt thereof obtained by using the above-described screening method or screening kit is a compound that alters (inhibits or promotes the binding) the binding between the polypeptide of the present invention and the receptor of the present invention (the present invention).
  • a compound which promotes or inhibits the activity of the polypeptide of the present invention specifically, a compound having a cell stimulating activity via the receptor of the present invention or a salt thereof (a so-called receptor agonist of the present invention), or The compound does not have the stimulating activity (so-called receptor antagonist of the present invention).
  • the compound include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, and fermentation products. These compounds may be novel compounds or known compounds.
  • the specific method of evaluating whether the receptor agonist of the present invention is an antagonist or an antagonist may be according to the following (i) or (ii).
  • the binding assay shown in the screening methods (a) to (c) is performed to change the binding between the polypeptide of the present invention and the receptor of the present invention (particularly, the binding is inhibited).
  • the compound having no activity or a salt thereof is the receptor antagonist of the present invention.
  • test compound is brought into contact with a cell containing the receptor of the present invention, and the cell stimulating activity via the receptor of the present invention is measured.
  • the compound having a cell stimulating activity or a salt thereof is the receptor agonist of the present invention.
  • a compound that activates the receptor of the present invention for example, the polypeptide of the present invention or the receptor agonist of the present invention
  • the cell stimulating activity mediated by the receptor of the present invention when a compound activating the receptor of the present invention and a test compound are brought into contact with cells containing the receptor of the present invention is measured and compared.
  • the compound capable of reducing the cell stimulating activity of the compound that activates the receptor of the present invention or a salt thereof is the receptor agonist of the present invention.
  • the receptor agonist of the present invention has the same activity as the physiological activity of the polypeptide of the present invention on the receptor of the present invention, it can be used as an antidiuretic like the polypeptide of the present invention.
  • urinary storage disorders eg, frequent urination, urinary incontinence (eg, urge incontinence, stress urinary incontinence, functional urinary incontinence, etc.) etc.
  • polyuria eg, diabetes insipidus ( Eg, pituitary diabetes insipidus, renal diabetes insipidus, etc.), hypernatremia, metabolic alkalosis, hypokalemia, Cushing syndrome, etc. It can be used as a preventive and therapeutic agent.
  • urinary incontinence eg, urge incontinence, stress urinary incontinence, functional urinary incontinence, etc.
  • polyuria e.g., a preterm evolution, a preterm evolution, a preterm evolution, a preterm evolution, a preterm evolution, a preterm evolution, etc.
  • diabetes insipidus e.g, pituitary insipidus, renal insipidus, etc.
  • hypernatremia eg, metabolic alkalosis, hypokalemia, Cushing's syndrome, etc.
  • the receptor antagonist of the present invention can suppress the physiological activity of the polypeptide of the present invention with respect to the receptor of the present invention, it is useful as a diuretic, and is safe and low toxic.
  • Edema urinary discharge disorder (eg, bladder contraction disorder, urethral passage disorder, difficulty urinating, urinary pain, urinary obstruction, etc.), hyponatremia, antidiuretic hormone secretion inadequate syndrome (SIADH), prevention of hypertension, etc.
  • SIADH antidiuretic hormone secretion inadequate syndrome
  • ⁇ Can be used as a therapeutic agent.
  • Compounds or salts thereof obtained using the screening method or screening kit of the present invention include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, and animals.
  • salt of the compound those similar to the aforementioned salts of the polypeptide of the present invention can be used. Used.
  • a compound obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, it can be carried out in a conventional manner.
  • tablets, capsules, elixirs, microcapsules, sterile solutions, suspensions, and the like can be prepared in the same manner as the above-mentioned drug containing the polypeptide of the present invention.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic and can be used, for example, in humans or in warm-blooded animals (eg, mice, rats, puppies, higgs, bushus, puppies, pumas, birds, cats, dogs). , Monkeys, chimpanzees, etc.).
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on its action, target disease, subject to be administered, route of administration, and the like.For example, it promotes the activity of the polypeptide of the present invention for the treatment of diabetes insipidus.
  • the compound is administered subcutaneously, in general, for adults (per 60 kg body weight), about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1 to 50 mg of the compound is used per day. Administer 0-20 mg. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of 60 kg.
  • a compound that inhibits the activity of the polypeptide of the present invention when administered subcutaneously for the purpose of treating renal edema, generally, in an adult (per 60 kg body weight), the compound is used in an amount of about 0.
  • the antibody of the present invention can specifically recognize the polypeptide or receptor of the present invention, it can be used for quantification of the polypeptide or receptor of the present invention in a test wave, particularly for quantification by sandwich immunoassay. Can be used.
  • the present invention is a.
  • one antibody is an antibody that recognizes the N-terminal of the polypeptide or the receptor of the present invention, and the other antibody is a C-terminal of the polypeptide or the receptor of the present invention. It is desirable that the antibody be reactive.
  • the polypeptide or the receptor of the present invention can be quantified using a monoclonal antibody against the polypeptide or the receptor of the present invention, and can also be detected by tissue staining or the like.
  • the antibody molecule itself may be used, or F (ab ') 2 , Fab', or Fab fraction of the antibody molecule may be used.
  • the method for quantifying the polypeptide or the receptor of the present invention using the antibody of the present invention is not particularly limited, and may be an antibody, an antigen or an antibody corresponding to the amount of an antigen (for example, the amount of a polypeptide) in a test solution. Any method that detects the amount of one antigen complex by chemical or physical means and calculates it from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen can be used. Is also good. For example, nephelometry, a competition method, an immunometric method and a sandwich method are preferably used, but the sandwich method described later is particularly preferable in terms of sensitivity and specificity.
  • a labeling agent used in a measurement method using a labeling substance for example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance and the like are used.
  • the radioisotope e.g., [125 1], [131 1], [3 ⁇ 4], and the like are used [14 c].
  • the enzyme those which are stable and have a large specific activity are preferable.
  • 3-galactosidase, / 3-dalcosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase and the like are used.
  • fluorescent substance for example, fluorescamine, fluorescein isothiosinate and the like are used.
  • luminescent substances include luminol, luminol derivatives, luciferin, lucigenin, etc. You can.
  • a biotin-avidin system can be used for binding the antibody or antigen to the labeling agent.
  • the carrier include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose; synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon; and glass.
  • the test solution is reacted with the insoluble monoclonal antibody of the present invention (primary reaction), and further reacted with another labeled monoclonal antibody of the present invention (secondary reaction).
  • primary reaction the insoluble monoclonal antibody of the present invention
  • secondary reaction another labeled monoclonal antibody of the present invention
  • the primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, may be performed simultaneously, or may be performed at staggered times.
  • the labeling agent and the method of insolubilization can be in accordance with those described above.
  • the antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody does not necessarily need to be one kind, and a mixture of two or more kinds of antibodies is used for the purpose of improving measurement sensitivity and the like. May be used.
  • the monoclonal antibody of the present invention used in the primary reaction and the secondary reaction an antibody having a different site to which the polypeptide of the present invention binds is preferably used. That is, the antibody used in the primary reaction and the secondary reaction is, for example, when the antibody used in the secondary reaction recognizes the C-terminal of the polypeptide of the present invention, the antibody used in the primary reaction is Preferably, an antibody that recognizes other than the C-terminal, for example, the N-terminal, is used.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be used in a measurement system other than the sandwich method, for example, a competition method, an immunometric method, or a nephrometry method.
  • the antigen in the test solution and the labeled antigen are allowed to react competitively with the antibody, and then the unreacted labeled antigen (F) and the labeled antigen (B) bound to the antibody are separated.
  • BZF separation The amount of labeling of either B or F is measured, and the amount of antigen in the test wave is quantified.
  • B / F separation was performed using polyethylene as a soluble antibody.
  • Liquid phase method using a glycol, a second body against the above-mentioned body, and using an immobilized antibody as the first antibody, or using a soluble first antibody as the second antibody And an immobilization method using an antibody.
  • the antigen in the test solution and the immobilized antigen are subjected to a competitive reaction with a certain amount of the labeled antibody, and then the solid phase and the liquid phase are separated. Then, the unreacted labeled antibody is bound to the solid phase, and the solid phase and the liquid phase are separated. Next, the amount of the label in either phase is measured to determine the amount of the antigen in the test wave.
  • nephrometry the amount of insoluble sediment generated as a result of an antigen-antibody reaction in a gel or in a solution is measured. Even when the amount of antigen in the test solution is small and only a small amount of sediment is obtained, laser nephrometry utilizing laser scattering is preferably used.
  • the measurement system for the polypeptide of the present invention may be constructed by adding ordinary technical considerations of those skilled in the art to ordinary conditions and operation methods in each method. For details of these general technical means, reference can be made to reviews, written documents, and the like.
  • the polypeptide or receptor of the present invention can be quantified with high sensitivity by using the antibody of the present invention.
  • a decrease in the concentration of the polypeptide or the receptor of the present invention is detected by quantifying the concentration of the polypeptide or the receptor of the present invention using the antibody of the present invention, for example, a urinary storage disorder (eg, frequent urination) , Urinary incontinence (eg, urge incontinence, stress urinary incontinence, functional urinary incontinence, etc.), etc., polyuria, diabetes insipidus (eg, pituitary insipidus, renal insipidus, etc.) It can be diagnosed as a disease such as hypernatremia, metabolic alkalosis, hypokalemia, Cushing's syndrome, or is likely to be affected in the future.
  • a urinary storage disorder eg, frequent urination
  • Urinary incontinence eg, urge incontinence, stress urinary incontinence, functional urinary incontinence, etc.
  • polyuria eg, diabetes insipidus (eg,
  • renal edema e.g., renal contraction disorder, urethral passage disorder, dysuria, dysuria, urinary tract
  • Obesity e.g., hyponatremia, antidiuretic hormone inadequate syndrome (SIADH), hypertension, etc.
  • SIADH antidiuretic hormone inadequate syndrome
  • the antibody of the present invention can be used for detecting the polypeptide or the receptor of the present invention present in a subject such as a body fluid or a tissue. Further, preparation of an antibody column used for purifying the polypeptide or the receptor of the present invention, detection of the polypeptide or the receptor of the present invention in each fraction at the time of purification, and detection of the polypeptide or the receptor in the test cells For analysis of the behavior of the polypeptide or the receptor of the present invention.
  • the DNA of the present invention can be used as a probe, for example, in humans or warm-blooded animals (eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, birds, higgies, pigs, pigs, dogs, cats, dogs, Abnormalities (genetic abnormalities) of the DNA or the mRNA encoding the polypeptide of the present invention in monkeys, etc.), for example, damage, mutation or reduced expression of the DNA or mRNA. Or a gene diagnostic agent for increasing or overexpressing the DNA or mRNA. It is useful.
  • the above-described genetic diagnosis using the DNA of the present invention can be performed, for example, by the known Northern hybridization or the PCR-SSCP method (Genomics, Vol. 5, pp. 874-879).
  • the expression of the polypeptide or receptor gene of the present invention when the expression of the polypeptide or receptor gene of the present invention is detected to be decreased by Northern hybridization, it may be, for example, a urinary storage disorder [eg, frequent urination, urinary incontinence (eg, urge incontinence) , Stress urinary incontinence, functional urinary incontinence, etc.), polyuria, diabetes insipidus (eg, pituitary diabetes insipidus, renal insipidus, etc.), hypernatremia, metabolic alkalosis, low It can be diagnosed that the disease is likely to be a disease such as kalemia or Cushing's syndrome, or is likely to be affected in the future.
  • a urinary storage disorder eg, frequent urination, urinary incontinence (eg, urge incontinence) , Stress urinary incontinence, functional urinary incontinence, etc.
  • polyuria eg, diabetes insipidus (e
  • the polypeptide or receptor gene of the present invention when overexpression of the polypeptide or receptor gene of the present invention is detected by Northern hybridization, for example, renal edema, urinary excretion disorder (eg, bladder contraction disorder, transurethral passage) Disorders, difficulty urinating, urinary pain, urinary tract obstruction, etc.), hyponatremia, anti-diuretic hormone secretion syndrome (SIADH), hypertension, etc. It can be diagnosed. (5) Pharmaceuticals containing antisense DNA
  • the antisense DNA of the present invention can be used as a diuretic and the like, for example, renal edema, urinary discharge disorder (eg, bladder contraction disorder, urethral passage disorder, dysuria, dysuria, urinary tract obstruction, etc. ), Hyponatremia, antidiuretic hormone secretion inadequate syndrome (SIADH), hypertension and other prophylactic and therapeutic agents can be used.
  • urinary discharge disorder eg, bladder contraction disorder, urethral passage disorder, dysuria, dysuria, urinary tract obstruction, etc.
  • Hyponatremia eg, antidiuretic hormone secretion inadequate syndrome (SIADH), hypertension and other prophylactic and therapeutic agents
  • SIADH antidiuretic hormone secretion inadequate syndrome
  • the antisense DNA when used, the antisense DNA may be used alone or after being inserted into an appropriate vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus associated virus vector, or the like, and then used in a conventional manner.
  • an appropriate vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus associated virus vector, or the like
  • the antisense DNA may be used as it is or together with a physiologically acceptable carrier such as an adjuvant to promote uptake. It can be formulated and administered via a catheter such as a gene gun or hydrogel catheter.
  • the antisense DNA can also be used as a diagnostic oligonucleotide probe for examining the presence and expression of the DNA of the present invention in tissues and cells.
  • the antibody of the present invention having the action of neutralizing the polypeptide of the present invention can be used, for example, as a diuretic.
  • a diuretic for example, renal edema, urinary excretion disorder (eg, bladder contraction disorder, urethral passage disorder, urination) It is useful as a prophylactic / therapeutic agent for hyponatremia, antidiuretic hormone inadequate syndrome (SIADH), hypertension, etc.
  • SIADH antidiuretic hormone inadequate syndrome
  • the agent for the above-mentioned diseases containing the antibody of the present invention can be used as it is as a liquid preparation or as a pharmaceutical composition in an appropriate dosage form, in humans or mammals (eg, rat, puppies, sheep, pigs, puppies, cats, cats). Can be administered orally or parenterally.
  • the dosage varies depending on the administration subject, target disease, symptoms, administration route, and the like.For example, when used for the treatment of renal edema in adults, the antibody of the present invention is usually administered in a single dose.
  • the antibodies of the present invention can be administered by themselves or as a suitable pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition used for the above administration contains the above or a salt thereof and a pharmacologically acceptable carrier, diluent or excipient.
  • Such compositions are provided in dosage forms suitable for oral or parenteral administration.
  • compositions for oral administration include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including sugar-coated tablets and film-coated tablets), pills, granules, powders, capsules (soft capsules and the like). Including), syrup, emulsion, suspension Agents and the like.
  • Such a composition is produced by a known method and contains a carrier, diluent or excipient commonly used in the pharmaceutical field. For example, lactose, starch, sucrose, magnesium stearate and the like are used as carriers and excipients for tablets.
  • injections for example, injections, suppositories, etc. are used.
  • Injections are in the form of intravenous injections, subcutaneous injections, intradermal injections, intramuscular injections, drip injections, etc. Is included.
  • Such injections are prepared according to known methods, for example, by dissolving, suspending or emulsifying the antibody or a salt thereof in a sterile aqueous or oily solution usually used for injections.
  • aqueous solution for injection for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants, and the like, suitable solubilizing agents, for example, alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, Propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants [eg, polysorbate 80, HCO-50 (polyoxyethylene (50 mol) adduc t of hydrogenated castor oil)], etc.
  • suitable solubilizing agents for example, alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, Propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants [eg, polysorbate 80, HCO-50 (polyoxyethylene (50 mol) adduc t of hydrogenated castor oil)], etc.
  • oily liquid for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and benzyl benzoate, benzyl alcohol and the like may be used in combination as a solubilizing agent.
  • the above-mentioned oral or parenteral pharmaceutical composition is conveniently prepared in the form of a dosage unit so as to conform to the dose of the active ingredient.
  • the dosage unit include tablets, pills, capsules, injections (ampoules), suppositories, etc., and usually 5 to 500 mg, especially 5 to 100 mg for each dosage unit.
  • other dosage forms preferably contain 10 to 250 mg of the above antibody.
  • compositions may contain another active ingredient as long as the composition does not cause an undesirable interaction with the above-mentioned antibody.
  • DNA encoding an exogenous polypeptide or receptor of the present invention (hereinafter referred to as A non-human mammal having the exogenous DNA of the present invention or its mutant DNA (sometimes abbreviated as the foreign mutant DNA of the present invention) is also used for screening diuretics and the like.
  • Non-human mammals having the exogenous DNA of the present invention or the mutant DNA thereof include unfertilized eggs, fertilized eggs, germ cells including spermatozoa and their progenitor cells, and the like.
  • the calcium phosphate method, the electric pulse method, and the ribofection method It can be produced by transferring the desired DNA by a coagulation method, microinjection method, particle gun method, DEAE-dextran method or the like.
  • the exogenous DNA of the present invention can be transferred to somatic cells, organs of living organisms, tissue cells, and the like, and used for cell culture, tissue culture, and the like. Can be fused with the above-mentioned germinal cells by a known cell fusion method to produce the DNA transgenic animal of the present invention.
  • mice for example, porcupines, pigs, higgins, goats, magpies, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, mice, rats and the like are used.
  • rodents that have relatively short ontogeny and biological cycles in terms of the creation of disease animal model systems and are easy to breed, especially mice (for example, pure strains such as C57BLZ6 and DBA2 strains, , BSCSFi strain, BDF 1 strain, BeDSFi strain, BALBZc strain, ICR strain, etc.) or rat (for example, Wistar, SD etc.) is preferable.
  • “Mammals” in a recombinant vector that can be expressed in mammals include humans and the like in addition to the above-mentioned non-human mammals.
  • the exogenous DNA of the present invention is not the DNA of the present invention originally possessed by a non-human mammal, but refers to the DNA of the present invention once isolated and extracted from a mammal.
  • Examples of the mutant DNA of the present invention include those having a mutation (for example, mutation) in the base sequence of the original DNA of the present invention, specifically, addition or deletion of bases, or other bases.
  • a DNA having substitution with a DNA is used, and an abnormal DNA is also included.
  • the abnormal DNA means a DNA that expresses an abnormal polypeptide or receptor of the present invention, and for example, expresses a polypeptide that suppresses the function of the normal polypeptide or receptor of the present invention. DNA or the like is used.
  • the exogenous DNA of the present invention may be derived from a mammal that is the same or different from the animal of interest.
  • the human DNA of the present invention when transferred, it is derived from various mammals (eg, egrets, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.) having the DNA of the present invention having high homology thereto.
  • a DNA construct eg, a vector, etc.
  • a DNA construct comprising the human DNA of the present invention downstream of various promoters capable of expressing the DNA of the present invention into a fertilized egg of a target mammal, for example, a mouse fertilized egg.
  • a DNA-transferred mammal that highly expresses the DNA of the present invention can be created.
  • expression vectors for the polypeptide or receptor of the present invention include plasmids derived from Escherichia coli, plasmids derived from Bacillus subtilis, plasmids derived from yeast, bacteriophages such as phage ⁇ , retroviruses such as Moroni monoleukemia virus, and xinia viruses. Alternatively, animal viruses such as baculovirus are used. Among them, a plasmid derived from Escherichia coli, a plasmid derived from Bacillus subtilis or a plasmid derived from yeast are preferably used.
  • Examples of the promoter that regulates DNA expression include: (a) DNA promoter derived from virus (eg, Simian virus, cytomegalovirus, Moroni monoleukemia virus, JC virus, breast cancer virus, poliovirus, etc.). Motors, (b) Promoters from various mammals (humans, egrets, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.), such as albumin, insulin II, perobrakin II, elastase, erythropoietin, Endothelin, muscle creatine kinase, glial fibrillary acidic protein, dalyuthion S-transferase, platelet-derived growth factor j3, keratin K1,10, W 200
  • Collagen type I and type II cyclic AMP-dependent protein kinase / 31 subunit, dystrophin, tartrate-resistant alkaline phosphatase, atrial natriuretic factor, endothelial receptor thymic synkinase (generally abbreviated as Tie.2) ), Sodium potassium adenosine 3-phosphatase (Na, K-ATPase), neurofilament light chain, meta-oral thionein I and II, A, meta-oral proteinase 1 tissue inhibitor, MHC class II (H—2L) ), H-ras, renin, dopamine j8-hydroxylase, thyroid peroxidase (TPO), polypeptide chain elongation factor 1 (EF-1), ⁇ -actin, a and / 3 myosin heavy chain, myosin Light chains 1 and 2, myelin basic protein, thyroglobulin, Thy-1, immunoglobulin, heavy chain variable region (VNP
  • the vector preferably has a sequence that terminates transcription of the messenger RNA of interest in the DNA-transferred mammal (generally referred to as "Yuichi Mineta-1").
  • a sequence of each DNA can be used, and preferably, SV40 terminator of simian virus or the like is used.
  • the splicing signal of each DNA, the enhancer region, a part of the intron of eukaryotic DNA, etc. are placed 5 'upstream of the promoter region, between the promoter region and the translation region, in order to further express the target exogenous DNA.
  • it can be connected to the 3 'downstream of the translation area depending on the purpose.
  • the normal translation region of the polypeptide or receptor of the present invention may be a liver, kidney, thyroid cell, or the like derived from humans or various mammals (eg, egrets, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.). All or part of genomic DNA from fibroblast-derived DNA and various commercially available genomic DNA libraries, or by known methods from liver, kidney, thyroid cells, or fibroblast-derived RNA The prepared complementary DNA can be obtained as a raw material.
  • the exogenous abnormal DNA can produce a translation region obtained by mutating the translation region of a normal polypeptide obtained from the above cells or tissues by point mutagenesis.
  • the translation region can be prepared as a DNA construct that can be expressed in a transposed animal by a conventional DNA engineering technique in which it is ligated downstream of the above-mentioned promoter and, if desired, upstream of the transcription termination site.
  • Transfer of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target mammal.
  • the presence of the exogenous DNA of the present invention in the germ cells of the produced animal after DNA transfer means that the progeny of the produced animal retains the exogenous DNA of the present invention in all of its germ cells and somatic cells Means to do.
  • the progeny of such an animal that inherits the exogenous DNA of the present invention has the exogenous DNA of the present invention in all of its germ cells and somatic cells.
  • the non-human mammal to which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred is confirmed to stably retain the exogenous DNA by mating, and is subcultured as an animal having the DNA in a normal breeding environment. You can do it.
  • Transfer of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in excess in all germinal and somatic cells of the target mammal.
  • Excessive presence of the exogenous DNA of the present invention in the germinal cells of the animal after transfer of DNA indicates that the offspring of the animal in which the foreign DNA of the present invention is present in excess of the foreign DNA of the present invention in all of its germinal and somatic cells. Means to have. Progeny of this type of animal that has inherited the exogenous DNA of the present invention have an excess of the exogenous DNA of the present invention in all of its germinal and somatic cells.
  • the non-human mammal having the normal DNA of the present invention expresses the normal DNA of the present invention at a high level, and eventually promotes the function of endogenous normal DNA to thereby finally produce the polypeptide of the present invention.
  • Hyperfunction may develop, and its pathological model It can be used as a thing. For example, using the normal DNA-transferred animal of the present invention, elucidation of the hyperfunction of the polypeptide of the present invention and the pathological mechanism of diseases associated with the polypeptide of the present invention, and examination of treatment methods for these diseases. It is possible to do so.
  • the non-human mammal having the foreign abnormal DNA of the present invention should be subcultured in a normal breeding environment as an animal having the DNA after confirming that the foreign DNA is stably retained by the crossing. Can be done. Furthermore, the desired foreign DNA can be incorporated into the above-mentioned plasmid and used as a raw material.
  • a DNA construct with a promoter can be prepared by ordinary DNA engineering techniques. The transfer of the abnormal DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target mammal.
  • the presence of the abnormal DNA of the present invention in the germinal cells of the animal produced after transfer of the DNA means that the offspring of the animal produced have the abnormal DNA of the present invention in all of the germinal and somatic cells.
  • the progeny of this type of animal that has inherited the exogenous DNA of the present invention has the abnormal DNA of the present invention in all of its germinal and somatic cells.
  • the non-human mammal having the abnormal DNA of the present invention expresses the abnormal DNA of the present invention at a high level, and finally inhibits the function of the endogenous normal DNA to thereby finally produce the polypeptide of the present invention. In some cases, it becomes functionally inactive refractory, and can be used as a model animal for the disease. For example, it is possible to elucidate the pathological mechanism of a functionally inactive refractory state of the polypeptide of the present invention and to examine a method for treating this disease using the abnormal DNA transgenic animal of the present invention.
  • the abnormal DNA-highly expressing animal of the present invention can be used for the abnormal polypeptide of the present invention in the function-inactive refractory disease of the polypeptide of the present invention.
  • the mammal into which the foreign abnormal DNA of the present invention has been transferred has an increased symptom of the released polypeptide of the present invention
  • the therapeutic agent for the polypeptide of the present invention or a functionally inactive refractory disease thereof is used. It can also be used for screening tests.
  • other possible uses of the above two types of DNA transgenic animals of the present invention include, for example,
  • the DNA-transferred animal of the present invention it is possible to examine the clinical symptoms of a disease associated with the polypeptide or the receptor of the present invention, including the inactive refractory type of the polypeptide of the present invention, etc.
  • a more detailed pathological finding in each organ of the disease model related to the polypeptide or receptor of the present invention can be obtained, a new treatment method can be developed, and a secondary disease caused by the disease can be studied. And contribute to treatment.
  • the present invention ⁇ ) It is possible to take out each organ from a DNA-transferred animal, cut it into small pieces, and then use a protease such as trypsin to obtain free DNA-transferred cells, culture them, or systematize the cultured cells. It is possible. Furthermore, the specification of the polypeptide or receptor-producing cells of the present invention, the relationship with apoptosis, differentiation or proliferation, or the signal transduction mechanism therein, and their abnormalities are examined. Thus, it becomes an effective research material for elucidating the polypeptide or receptor of the present invention and its action.
  • a protease such as trypsin
  • a therapeutic agent for a disease associated with the polypeptide or the receptor of the present invention including the inactive refractory type of the polypeptide or the receptor of the present invention, is developed. Therefore, it is possible to provide an effective and rapid screening method for the therapeutic agent for the disease by using the above-mentioned test method and quantitative method. Further, using the DNA transgenic animal of the present invention or the exogenous DNA expression vector of the present invention, it is possible to examine and develop a method for treating a DNA associated with the polypeptide of the present invention.
  • the non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention has been inactivated and the non-human mammal deficient in the expression of the DNA of the present invention are also used for screening an antidiuretic agent.
  • the non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention has been inactivated refers to whether the DNA of the present invention possessed by the non-human mammal is artificially mutated to suppress the DNA expression ability.
  • the DNA substantially does not have the ability to express the polypeptide of the present invention (hereinafter, the present invention Knockout DNA) (referred to as ES cells) of a non-human mammal embryo.
  • the non-human mammal the same one as described above is used.
  • the method of artificially mutating the DNA of the present invention can be performed, for example, by deleting a part or all of the DNA sequence and inserting or substituting another DNA by a genetic engineering technique.
  • the knockout DNA of the present invention may be produced by, for example, shifting the reading frame of a codon or disrupting the function of a promoter or exon by these mutations.
  • non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention has been inactivated include, for example, The DNA of the present invention possessed by a non-human mammal And its exon portion is represented by the neomycin resistance gene, the drug resistance gene represented by the hygromycin resistance gene, or lac Z (3-galactosidase-ze gene) and cat (chloramphenico-l-acetyltransferase gene)
  • the exon function may be disrupted by inserting a repo overnight gene, or a DNA sequence that terminates gene transcription (for example, a polyA addition signal) may be inserted into the introns between the exons.
  • a DNA chain (hereinafter abbreviated as targeting vector 1) having a DNA sequence constructed so as to disrupt the gene by disabling the synthesis of a novel messenger RNA, for example, by homologous recombination.
  • the resulting ES cells are transferred to or near the DNA of the present invention.
  • PCR using as primers the DNA sequence of the neighboring region other than the DNA sequence of the present invention used for Southern hybridization analysis or targeting vector preparation and targeting vector preparation It can be obtained by selecting the knockout ES cells of the present invention by analysis according to the method.
  • the original ES cells for inactivating the DNA of the present invention by the homologous recombination method or the like for example, those already established as described above may be used, and the method of the known Evans and Kaufma may be used. It may be newly established according to. For example, in the case of mouse ES cells, currently, 129 ES cells are generally used, but since the immunological background is not clear, it is an alternative pure immunological and genetic background.
  • BDFi mice C57BLZ6 and DBA / 2 BDI ⁇ mice can be used satisfactorily because they have a high number of eggs collected and their eggs are robust, and they have C57BLZ6 mice as their background.
  • the ES cells obtained as described above can be advantageously used when a pathological model mouse is produced, because the genetic background can be replaced by C57BLZ6 mice by backcrossing with C57BLZ6 mice.
  • blastocysts 3.5 days after fertilization are generally used, but it is also effective to collect 8-cell stage embryos and culture them to blastocysts. A large number of early embryos can be obtained efficiently.
  • male ES cells are generally more convenient for producing a germ line chimera. It is also desirable to discriminate between males and females as soon as possible in order to reduce the complexity of culturing.
  • An example of a method for determining the sex of ES cells is a method of amplifying and detecting a gene in the sex-determining region on the Y chromosome by PCR.
  • this method conventionally, for example G-banding method, requires about 10 6 cells for karyotype analysis, than suffices ES cell number of about 1 colony (about 50),
  • the primary selection of ES cells in the early stage of culture can be performed by discriminating between male and female, and the early stage of culture can be greatly reduced by enabling early selection of male cells.
  • Embryonic stem cell lines obtained in this way usually have very good proliferative potential, but must be carefully subcultured because they tend to lose their ontogenetic potential.
  • a suitable feeder cell such as STO fibroblast
  • a carbon dioxide incubator preferably 5% carbon dioxide
  • trypsin ZEDTA solution usually 0.001 to 0.5% trypsin Z0.
  • a single cell is obtained by treatment with 5 mM EDTA (preferably about 0.1% trypsin ZlmM EDTA), and the cells are seeded on a freshly prepared feeder cell.
  • Such subculture is usually performed every 1 to 3 days. At this time, it is desirable to observe the cells, and if morphologically abnormal cells are found, discard the cultured cells.
  • ES cells can be cultured in a monolayer up to high density, or in suspension culture until cell clumps are formed, under appropriate conditions, for example, parietal muscle, visceral muscle, myocardium, etc. [MJ Evans and MH Kaufman, Nature 292, 154, 1981; GR Martin Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 7634; 1981; TC Doetschman et al., Journal of Embryology and Experimental Morphology, Vol. 87, p. 27, 1985], DNA of the present invention obtained by differentiating the ES cell of the present invention. Expression-deficient cells are useful in in vitro cell biology studies of the polypeptides of the invention or the receptors of the invention.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention can be distinguished from a normal animal by measuring the mRNA amount of the animal using a known method and indirectly comparing the expression level. . .
  • non-human mammal those similar to the above can be used.
  • the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention can be obtained, for example, by introducing the evening-getting vector prepared as described above into a mouse embryonic stem cell or a mouse egg cell, and introducing the DNA of the evening-getting vector of the present invention. Knocking out the DNA of the present invention by homologous recombination of the inactivated DNA sequence with the DNA of the present invention on the chromosome of mouse embryonic stem cells or mouse egg cells by gene homologous recombination Can be.
  • the cells in which the DNA of the present invention has been knocked out can be obtained by combining the DNA sequence on the DNA of the present invention or a DNA sequence on a nearby DNA with a DNA sequence on or near the DNA, and a DNA sequence on a vector.
  • the DNA can be determined by PCR analysis using the DNA sequence of a mouse-derived neighboring region other than the DNA sequence of the present invention as a primer.
  • a cell line in which the DNA of the present invention has been inactivated is cloned by homologous gene recombination, and the cell is cloned at an appropriate time, for example, at the 8-cell stage.
  • the chimeric embryo is injected into a non-human mammal embryo or blastocyst, and the resulting chimeric embryo is transplanted into the uterus of the pseudo-pregnant non-human mammal.
  • the produced animal is a chimeric animal composed of both a cell having a normal DNA locus of the present invention and a cell having an artificially mutated DNA locus of the present invention.
  • the individual obtained in this manner is usually an individual lacking heterologous expression of the polypeptide of the present invention, and mated with individuals lacking heterologous expression of the polypeptide of the present invention or the receptor of the present invention.
  • An individual deficient in homoexpression of the polypeptide of the present invention or the receptor of the present invention can be obtained from the offspring.
  • a transgenic non-human mammal having a chromosome into which a gettering vector has been introduced can be obtained by injecting a DNA solution into the nucleus of an egg by a microinjection method. It can be obtained by selecting a gene having a mutation in the DNA locus of the present invention by gene homologous recombination as compared with a transgenic non-human mammal.
  • the germline can be obtained and maintained according to a conventional method. That is, by crossing male and female animals having the inactivated DNA, a homozygous animal having the inactivated DNA on both homologous chromosomes can be obtained. The obtained homozygous animal can be efficiently obtained by rearing the mother animal in such a manner that one normal individual and a plurality of homozygous animals are obtained. By crossing male and female heterozygous animals, homozygous and heterozygous animals having the inactivated DNA are bred and subcultured.
  • the non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention has been inactivated are extremely useful for producing the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention lacks various biological activities that can be induced by the polypeptide of the present invention or the receptor of the present invention. It can be used as a model for diseases caused by inactivation of the biological activity of the receptor of the present invention, and is useful for investigating the causes of these diseases and studying treatment methods.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention can be used for screening for a compound having a therapeutic / preventive effect against diseases caused by DNA deficiency or damage of the present invention.
  • the present invention comprises administering a test compound to a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention, and observing and measuring changes in the animal.
  • a method for screening a compound or a salt thereof having a therapeutic or preventive effect on a disease caused by the disease is provided.
  • Examples of the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention used in the screening method include those described above.
  • Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and plasma.These compounds are novel compounds. Or a known compound.
  • a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention is treated with a test compound and compared with a non-treated control animal, and the change in each organ, tissue, symptom of disease or the like of the animal is used as an index.
  • the therapeutic and prophylactic effects of the test compound can be tested.
  • Methods for treating a test animal with a test compound include, for example, oral administration and intravenous injection, which are appropriately selected according to the symptoms of the test animal, properties of the test compound, and the like.
  • the dose of the test compound can be appropriately selected according to the administration method, properties of the test compound, and the like.
  • a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention is subjected to a drinking water treatment, and a test compound is administered before or after the drinking water treatment, and the urine output of the animal is changed. Is measured over time.
  • the urine output of the test animal decreases by about 10% or more, preferably about 30% or more, more preferably about 50% or more.
  • Therapeutic and prophylactic effects of compounds on the above diseases Can be selected as the compound having
  • the compound obtained by using the screening method is a compound selected from the test compounds described above, and has a therapeutic / preventive effect against a disease caused by deficiency or damage of the polypeptide of the present invention. It can be used as a safe and low toxic preventive and therapeutic agent for the disease. Furthermore, compounds derived from the compounds obtained by the above screening can be used in the same manner.
  • the compound obtained by the screening method may form a salt.
  • the salt of the compound include physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids, organic acids, etc.) and bases (eg, And the like, and salts with alkali metals and the like are used, and especially preferred are physiologically acceptable acid addition salts.
  • salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.) and organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid) Succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc.).
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid
  • Succinic acid tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc.
  • a medicament containing the compound or a salt thereof obtained by the screening method can be produced in the same manner as the aforementioned medicament containing the polypeptide of the present invention.
  • the preparations obtained in this way are safe and of low toxicity and can be used, for example, in humans or mammals (eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, sheep, pigs, pigs, dogs, cats, dogs). , Monkeys, etc.).
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, the administration subject, the administration route, and the like.
  • the compound when administered subcutaneously, it is generally used in an adult patient (assuming a body weight of 60 kg). About 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg of the compound is administered per day.
  • the single dose of the compound when administered parenterally, the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, and the like.
  • the compound of the present invention that promotes promoter-one activity on DNA may be in the form of an injection.
  • the compound when administered to an adult (with a body weight of 60 kg) anorexia nervosa patient, the compound is administered in an amount of about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 30 mg per day. It is convenient to administer about 0.1 to about 10 mg by intravenous injection. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of weight per 60 kg.
  • the present invention provides a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention, which comprises administering a test compound and detecting the expression of a repo overnight gene. To provide a method for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits cell growth.
  • the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention includes, among the aforementioned non-human mammals deficient in the expression of the DNA of the present invention, the DNA of the present invention obtained by introducing a repo overnight gene. Those inactivated and capable of expressing the repo overnight gene under the control of the promoter for the DNA of the present invention are used.
  • test compound examples include the same compounds as described above.
  • reporter gene the same as those described above are used, / 3-galactosidase gene (1 a c Z), soluble alkaline phosphatase gene or luciferase gene and the like.
  • the polypeptide of the present invention when a part of the DNA region encoding the polypeptide of the present invention is replaced with a 3-galactosidase gene (1acZ) derived from Escherichia coli, the polypeptide of the present invention is originally expressed. In tissues, j3-galactosidase is expressed instead of the polypeptide of the invention.
  • a reagent that is a substrate for 3-galactosidase such as 5-bromo-4-monocloth-3-indolyl / 3-galactopyranoside (X-gal) is more convenient.
  • the expression state of the polypeptide of the present invention in an animal body can be easily observed.
  • the polypeptide-deficient mouse of the present invention or a tissue section thereof is treated with daltaraldehyde.
  • PBS phosphate-buffered saline
  • X-gal staining solution containing X-gal at room temperature or around 37 ° C for about 30 minutes to 1 hour.
  • the ⁇ -galactosidase reaction can be stopped by washing the sample with an ImM EDT AZPBS solution, and the color can be observed.
  • mRNA encoding 1 ac ⁇ ⁇ may be detected according to a conventional method.
  • the compound or a salt thereof obtained by the above-mentioned screening method is a compound selected from the above-mentioned test compounds, and is a compound that promotes or inhibits the promoter activity for DNA of the present invention.
  • the compound obtained by the screening method may form a salt.
  • the salt of the compound include physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids) and bases (eg, organic acids). And the like, and a physiologically acceptable acid addition salt is particularly preferable.
  • such salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.) and organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid) , Succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc.).
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid
  • Succinic acid tart
  • the compound or a salt thereof that promotes the promoter activity for the DNA of the present invention can promote the expression of the polypeptide or the receptor of the present invention and promote the function of the polypeptide or the receptor. It is useful as an antidiuretic, etc., for example, urinary storage disorders [eg, frequent urination, urinary incontinence (eg, urge incontinence, stress urinary incontinence, functional urinary incontinence, etc.)], polyuria, diabetes insipidus ( Eg, pituitary diabetes insipidus, renal diabetes insipidus, etc.), hypernatremia, metabolic alkalosis, hypokalemia,
  • urinary storage disorders eg, frequent urination, urinary incontinence (eg, urge incontinence, stress urinary incontinence, functional urinary incontinence, etc.)
  • polyuria eg, diabetes insipidus ( Eg, pituitary diabetes insipidus, renal diabetes ins
  • It can be used as an agent for preventing and treating Cushing's syndrome.
  • the compound of the present invention or a salt thereof that inhibits the promoter activity on DNA can inhibit the expression of the polypeptide or receptor of the present invention and inhibit the function of the polypeptide or receptor.
  • a diuretic for example, for example, renal edema, urinary drainage disorder (eg, bladder contraction disorder, urethral passage disorder, difficulty urinating, urinary pain, urinary tract obstruction, etc.), hyponatremia, antidiuretic hormone It can be used as a preventive and remedy for secretory improper syndrome (SIADH), hypertension, etc.
  • SIADH secretory improper syndrome
  • a compound derived from the compound obtained by the above screening can be used in the same manner.
  • a drug containing the compound or a salt thereof obtained by the screening method can be produced in the same manner as the above-mentioned drug containing the polypeptide of the present invention or a salt thereof.
  • the preparations obtained in this way are safe and of low toxicity and can be used, for example, in humans or mammals (eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, sheep, pigs, pigs, dogs, cats, dogs). , Monkeys, etc.).
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, the administration subject, the administration route, and the like.
  • the compound of the present invention which promotes the promoter activity against DNA is administered orally
  • the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease and the like.
  • the compound for promoting the promoter activity for DNA of the present invention is usually in the form of an injection.
  • the compound When administered to an adult patient (assuming 60 kg), the compound may be administered intravenously at a dose of about O.Ql to about 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg per day. It is convenient to administer by injection. For other animals, the equivalent amount per 60 kg can be administered.
  • the compound of the present invention that inhibits the promoter activity for DNA is orally administered, generally, in an adult patient (with a body weight of 60 kg), the compound is used in an amount of about 0.1 to 100 mg per day, preferably About 1.0-50 mg, more preferably about
  • the single dose of the compound may vary depending on the administration subject, target disease, etc.
  • the compound of the present invention which inhibits the promoter activity on DNA against DNA is usually in the form of an injection.
  • the compound of the present invention which inhibits the promoter activity on DNA against DNA is usually in the form of an injection.
  • about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg of the compound per day is injected intravenously. It is convenient to administer the drug by. In the case of other animals, it is possible to administer the equivalent amount per 60 kg. Include.
  • the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention is extremely useful for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of the promoter for the DNA of the present invention. It can greatly contribute to the investigation of the causes of various diseases caused by insufficient DNA expression or the development of therapeutic drugs.
  • genes encoding various proteins are ligated downstream thereof and injected into an egg cell of an animal to produce a so-called transgenic animal (gene transfer). Animal), it is possible to specifically synthesize the polypeptide and examine its effects in the living body. Furthermore, by binding an appropriate repo overnight gene to the above promoter portion and establishing a cell line in which this is expressed, the polypeptide of the present invention has an action of specifically promoting or suppressing the in vivo production ability of the polypeptide itself. It can be used as a search system for low molecular weight compounds.
  • bases, amino acids, and the like are indicated by abbreviations based on the abbreviations by IUPAC-IUB Communication on Biochemical Nomenclature or commonly used abbreviations in the art, and examples thereof are described below.
  • amino acids can have optical isomers, the L-form is indicated unless otherwise specified.
  • Y Thymine (T) or cytosine (C)
  • M Adenine (A) or cytosine (C) K guanine (G) or thymine (T)
  • B cytosine (C), guanine (G) or thymine (T) D adenine (A), guanine (G) or thymine (T) V adenine (A), guanine (G) or cytosine (C) N adenine ( A), guanine (G), cytosine (C) or thymine (T) or unknown or other base
  • BSA serum CHAPS 3— [(3-colamidopropyl) dimethyl ammonium]
  • H is or H histidine
  • FIG. 2 shows the amino acid sequence of a part of the human GPR8 ligand peptide precursor.
  • FIG. 2 shows the amino acid sequence of a synthetic human GPR8 ligand (1-29).
  • Fig. 3 shows the amino acid sequence of a synthetic human GPR8 ligand (1-27).
  • Fig. 3 shows the amino acid sequence of a synthetic human GPR8 ligand (1-26).
  • 1 shows the amino acid sequence of a synthetic human GPR8 ligand (1-25).
  • FIG. 2 shows the amino acid sequence of a human GPR8 ligand peptide precursor.
  • FIG. 2 shows the amino acid sequence of a GPR8 ligand peptide.
  • FIG. 2 shows the amino acid sequence of a GPR8 ligand peptide.
  • FIG. 2 shows the amino acid sequence of a GPR8 ligand peptide.
  • FIG. 2 shows the sequence of the cDNA encoding the rat GPR8 ligand peptide precursor.
  • FIG. 4 shows the amino acid sequence of rat GPR8 ligand peptide precursor.
  • FIG. 2 shows the amino acid sequence of rat GPR8 ligand peptide.
  • FIG. 2 shows the amino acid sequence of rat GPR8 ligand peptide.
  • FIG. 2 shows the amino acid sequence of a mouse GPR8 ligand peptide precursor.
  • FIG. 2 shows the amino acid sequence of a mouse GPR8 ligand peptide.
  • FIG. 2 shows the amino acid sequence of a mouse GPR8 ligand peptide.
  • FIG. 2 shows the amino acid sequence of an oxidized synthetic human GPR8 ligand (1-23).
  • 1 shows the amino acid sequence of a synthetic human GPR8 ligand (1-18).
  • 1 shows the amino acid sequence of a synthetic human GPR8 ligand (1-17).
  • 1 shows the amino acid sequence of a synthetic human GPR8 ligand (1-16).
  • FIG. 2 shows the amino acid sequence of a synthetic Fmoc-modified human GPR8 ligand (1-23).
  • FIG. 2 shows the amino acid sequence of a synthetic human GPR8 ligand (2-23).
  • Fig. 3 shows the amino acid sequence of a synthetic human GPR8 ligand (4-23).
  • [SEQ ID NO: 56] Shows the amino acid sequence of synthetic [N_Acetyrant Tyr 2 ] -human GPR8 ligand (2-23).
  • 1 shows the nucleotide sequence of cDNA encoding rat TGR26.
  • 1 shows the nucleotide sequence encoding human GPR7.
  • ⁇ Shows the nucleotide sequence of the 5 'upstream of cDNA encoding GPR8.
  • ⁇ Shows the nucleotide sequence of the 5 'upstream of cDNA encoding GPR7.
  • ⁇ Egret Shows the nucleotide sequence of the 5 'upstream of cDNA encoding GPR8 ligand peptide precursor protein.
  • ⁇ Egret Shows the nucleotide sequence of the 3 'downstream of cDNA encoding GPR8 ligand peptide precursor protein.
  • ⁇ Shows the nucleotide sequence containing the cDNA coding for the heron GPR8 ligand peptide precursor protein.
  • ⁇ Shows the nucleotide sequence containing the cDNA coding for the heron GPR8 ligand peptide precursor protein.
  • Escherichia coli DH5 ⁇ / ⁇ rab-rabbit GPR7 obtained in Example 3 described below has been obtained from September 25, 2003 at 1-1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki Prefecture. Deposited at the Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology under the accession number FERM BP-8496.
  • Escherichia coli DH5 ⁇ / ⁇ -rbbit prepro-NPW obtained in Example 4 described later has been located at 1-1 1-1 Higashi, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture since September 25, 2003.
  • the present invention will be described in more detail with reference to Reference Examples and Examples, but these examples do not limit the scope of the present invention.
  • the protected peptide resin was dried. Deprotection of the resulting protected peptide and separation of the peptide from the resin carrier were performed by TFA treatment. The obtained crude peptide was extracted with 0.1% TFA water and freeze-dried to obtain a powder solid. Subsequently, the crude peptide was subjected to preparative purification by reversed-phase high-performance chromatography (Shimadzu Corporation, preparative instrument: model LC8A) using acetonitrile-0.1% TFATK system (15-35%, 80 min). Thus, 35 mg of the purified peptide to be obtained was obtained.
  • the amino acid analysis value of the hydrolyzate obtained by hydrolyzing the purified product with 4N methanesulfonic acid containing 0.2% 3- (2-aminoethyl) indole at 110 ° C for 22 hours is as follows. Value) as follows.
  • the column used was 0DS-80 ⁇ (4.6 thigh ⁇ 15 cm) (Tosoh, one company), 10% acetonitrile / 0.1% TFA as eluent A, and 60% acetonitrile / 0.1% TFA as eluate B.
  • the daradient elution method of -0 (2 min), 0-27 (5 min), 27-32 (40 min)% B / A + B was performed.
  • the flow rate was 1 mL / min
  • the column temperature was 40 ° C
  • the detection was 215 nm.
  • DPhe 2, 125 I-Tyr 10] human GPR8 ligand (1-20) was eluted around 25 minutes.
  • Urethane ethyl carbamate
  • a ureteral catheter was inserted into both ureters, and arterial blood pressure, heart rate and urine volume were measured using Polygraph 363.
  • Human GPR8 ligand (1-23) (SEQ ID NO: 1) (sometimes described as hNPW23) prepared in the same manner as described in WO 01/98494 is a physiological saline (Otsuka Pharmaceutical) And doses were set at 12.5, 25, 50 and 100 mnol / kg. Physiological saline was administered to the control group, and the treatment was performed in 5 cases in each group. The urine volume before and after administration of hNPW23 was measured for 4 minutes, and the F-test was performed using the ratio (%) of the change in urine volume before and after administration.
  • hNPW23 had no effect on blood pressure or heart rate at any dose.
  • TotalTotal RNA of whole egret brain was purchased from UNITECH. After preparing the Poly (A) + RNA fraction using the mRNA purification kit (Amersham Biosciences), manually prepare 1.0 g of poly (A) + RNA from the egret whole brain using PowerScript Reverse Transcriptase (Clontech). After reverse transcription was performed according to the above, a type II, egret whole brain double-stranded cDNA for 5, -RACE was prepared using a Marathon cDNA Amplification kit (Clontech).
  • the primer sets used for the RACE PCR reaction were Adapter Primer 1 and Primer 1 (SEQ ID NO: 89) attached to the kit for the first PCR reaction, and Nested Adapter Primer 2 and Primer 2 ( SEQ ID NO: 90) was used.
  • the reaction was performed in the form of ⁇ with a volume of 50 ⁇ 1 for 2 ng of mRNA of reverse transcribed cDNA.
  • the composition of the reaction solution was primer concentration 0.2 M, dNTP mixture 0.2 mM, LA-Taq (Takara Shuzo) 1/100 volume, and 2 times concentrated GC Buffer I 1/2 volume.
  • the cycle for amplification is that both PCRs are kept at 94 ° C for 120 seconds, 94 ° C ⁇ 30 seconds, 60 ° C (increases by 0.5 ° C for each additional cycle), 15 cycles of 72 ° C ⁇ 4 minutes, 94 ° C ⁇ 30 seconds, 68 ° C ⁇ 4 After repeating the cycle for 15 minutes for 15 minutes, the mixture was kept at 72 ° C for 10 minutes.
  • the reaction mixture was electrophoresed on a 1.2% agarose gel, and a band near 900 bp, which was visible when stained with ethidium umide, was extracted with a DNA Extraction Kit (Qiagen) and the plasmid vector "PGEM" was extracted using a DM Ligation Kit (Takara Shuzo). After subcloning into -T Easy Vector (Promega), the cells were introduced into E. coli DH5 (T0Y0B0) Plasmid DNA was purified from the resulting transformant using the QIAGEN Plasmid Mini Kit (Qiagen).
  • the reaction for nucleotide sequence determination was performed using the BigDye Terminator Cycle Sequence Ready Reaction Kit (available from Kinery Reema Co., Ltd.) The sequence was read using a fluorescent automatic sequencer, and the 5 'upstream of the cDNA encoding Egret GPR8 A base sequence represented by SEQ ID NO: 91, which is a side sequence, was obtained.
  • TotalTotal RNA of whole egret brain was purchased from UNITECH. Poly (A) + RNA fractions were prepared using mRNA purification kit (Amersham Biosciences), and then were prepared from Egret whole brain poly (A) + RNA 1.0 / ig using PowerScript Reverse Transcriptase (Clontech). After reverse transcription was performed according to the manual, a type 2 rabbit egret whole brain double-stranded cDNA for 3'-RACE was prepared using a Marathon cDNA Amplification kit (Clontech).
  • the primer set used for the RACE PCR reaction was Adapter Primer 1 and Primer 1 (SEQ ID NO: 92) attached to the kit for the first PCR reaction, and Nested Adapter Primer 2 and Primer 2 for the second PCR reaction. (SEQ ID NO: 93) was used.
  • the reaction was carried out in the form of ⁇ with a volume of 501, corresponding to 2 ng of mRNA of the reverse-transcribed cDNA.
  • the composition of the reaction solution was a primer concentration of 0.2 M, a dNTP mixed solution of 0.2 mM, LA-Taq (Takara Shuzo) 1/100 vol hidden, and a 2-fold concentrated GC Buffer I 1/2 volume.
  • the cycle for amplification is that both PCRs are kept at 94 ° C for 120 seconds,
  • Plasmid DNA was purified from the resulting transformant using QIAGEN Plasmid Mini Kit (Qiagen). The reaction for base sequence determination was performed using BigDye Terminator Cycle Sequence Ready Reaction Kit (Perkin Elmer). Decoding was performed using a fluorescent automatic sequencer to obtain a base sequence represented by SEQ ID NO: 94, which is the 3 'downstream sequence of cDNA encoding the magpie GPR8.
  • TotalTotal RM of egret whole brain was purchased from UNITECH. After preparing the Poly (A) + RNA fraction using the mRNA purification kit (Amersham Biosciences), use manual PowerScript Reverse Transcriptase (Clontech) from 1.0 g of dried whole brain poly (A) + RNA. After reverse transcription was performed according to the above, a double heron brain double stranded cDNA was prepared using a Marathon cDNA Amplification kit (Clontech).
  • a PCR reaction was performed using the whole brain double-stranded cDNA as type II.
  • the reaction was carried out using 100 liters of cDNA corresponding to 1 ng of mRNA for type III.
  • the composition of the reaction solution was a primer concentration of 0.5 zM, a dT mixed solution of 0.2 mM, LA-Taq (Takara Shuzo) 1/100 volume, and a 2-fold concentrated GC Buffer I 1/2 volume.
  • the cycle for amplification was as follows: after incubating at 94 ° C for 120 seconds, a cycle of 94 ° C for 30 seconds and 68 ° C for 2 minutes was repeated 40 times, and then incubated at 72 ° C for 10 minutes.
  • the resulting reaction solution was purified using the QIAquick PCR purification Kit (Qiagen), subcloned into a plasmid vector — pGEM-T Easy Vector (Promega) using the DNA Ligation Kit (Takara Shuzo), and then transformed into E. coli DH5a ( T0Y0B0). Plasmid DNA was purified from the resulting transformant using QIAGEN Plasmid Mini Kit (Qiagen).
  • the reaction for base sequence determination was performed using a BigDye Terminator Cycle Sequence Ready Reaction Kit (No., Kin-Elema). Decoding was performed using a fluorescent automatic sequencer to obtain a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 97. This sequence contained the nucleotide sequence encoding the entire amino acid sequence of the Great Egret GPR8 (SEQ ID NO: 81).
  • the plasmid After digesting the DNA with the restriction enzymes Sal I and Spe I (Takara Shuzo), the reaction solution was electrophoresed on a 1.2% agarose gel, and the band near 1000 bp, which was visible when stained with ethidium amide, was extracted using the DNA Extraction Kit ( (Qiagen).
  • TotalTotal RNA of whole egret brain was purchased from UNITECH. After preparing a Poly (A) + RNA fraction using mRNA purification kit (Amersham Biosciences), PowerScript Reverse Transcriptase (Clontech) was prepared from 10% whole brain poly (A) 1 "RNA 1.Og. After reverse transcription was performed according to the manual according to the manual, using a Marathon cDNA Amplification kit (Clontech), a type II, egosa whole brain double-stranded cDNA for RACE was prepared using the RACE PCR reaction.
  • Adapter Primer 1 and primer 1 SEQ ID NO: 98
  • Nested Adapter Primer 2 and Primer 2 SEQ ID NO: 99
  • the reaction was performed using 2 ng of reverse transcribed cDNA in the amount of 50 ⁇ 1 for the type II mRNA at a primer concentration of 0.2 / M, dNTP mixture 0.2 mM, LA- Taq (Takara Shuzo) 1/100 volume, 2x concentrated GC Buffer I 1/2 volume.
  • the cycle for, after both of the PCR was also kept at 94 to 120 seconds,
  • TotalTotal RNA of whole egret brain was purchased from UNITECH. After preparing the Poly (A) + RNA fraction using the mRNA purification kit (Amersham Biosciences), PowerScript Reverse Transcriptase (Clontech) was used from Escherichia coli whole brain poly (A) + RNA 1. O ⁇ g. After reverse transcription was performed according to the manual using the manual, Marathon cDNA Amplification kit (Clontech) was used to prepare a type II Egat whole brain double-stranded cDNA for 3, -RACE.
  • the primer set used for the RACE PCR reaction was: Adapter Primer 1 and primer 1 (SEQ ID NO: 10 1) attached to the kit in the first PCR reaction, and Nested Adapter Primer 2 and primer 1 in the kit for the second PCR reaction. (SEQ ID NO: 102) was used.
  • the reaction was carried out in the form of type II in a volume of 50 with 2 ng of mRNA of the reverse transcribed cDNA.
  • the composition of the reaction solution was a primer concentration of 0.2 M, a dMT mixed solution of 0.2 mM, LA-Taq (Takara Shuzo) 1/100 volume, and GC buffer I 1/2 volume concentrated twice.
  • the cycles for amplification were as follows: Both PCRs were kept at 94 ° C for 120 seconds, then 94 ° C for 30 seconds, 72T: 5 cycles of 4 minutes, 94 ° C for 30 seconds, 70 ° C The cycle was repeated 5 times at 4 minutes, 94 ° C for 30 seconds, 68 DC for 4 minutes 20 times, and then incubated at 72 ° C for 10 minutes.
  • the reaction mixture was electrophoresed on a 1.2% agarose gel, and the band at around 1000 bp, which was visible when stained with ethidium bromide, was extracted with a DNA Extraction Kit (Qiagen) and the plasmid was extracted using a DNA Ligation Kit (Takara Shuzo). After subcloning into the vector pGEM-T Easy Vector (Promega), E. coli DH5
  • Plasmid DNA was purified from the resulting transformant using a QIAGEN Plasmid Mini Kit (Qiagen). The reaction for base sequence determination was carried out using a BigDye Terminator Cycle Sequence Ready Reaction Kit (NO. Decoding was performed using a fluorescent automatic sequencer to obtain a base sequence represented by SEQ ID NO: 103, which is a 3 'downstream sequence of cDNA encoding Egret GPR7. (3) Cloning of full length cDNA encoding Egret GPR7
  • TotalTotal RNA of whole egret brain was purchased from UNITECH. After preparing Poly (A) + RNA fraction using mRNA purification kit (Amersham Biosciences), using PowerScript Reverse Transcriptase (Clontech) from 1.0 xg of egos whole brain poly (A) + RNA, After reverse transcription was performed according to the manual, a rabbit egret whole brain double-stranded cMA was prepared using Marathon cDNA Amplification kit (Clontech).
  • a PCR reaction was performed using whole brain double-stranded cDNA as type II.
  • the reaction was carried out using a cDNA equivalent to 1 ng of mRNA as a type II in a volume of 1001.
  • the composition of the reaction solution was primer concentration 0.5 iM, dNTP mixture 0.2 mM, LA-Taq (Takara Shuzo) 1/100 volume, and 2 times concentrated GC Buffer I 1/2 volume.
  • the cycle for amplification was as follows: after incubating at 94 ° C for 120 seconds, a cycle of 94 ° C for 30 seconds and 68 ° C for 2 minutes was repeated 40 times, and then incubated at 72 ° C for 10 minutes.
  • the resulting reaction solution was purified using the QIAquick PCR purification Kit (Qiagen), subcloned into the plasmid vector pGEM-T Easy Vector (Promega) using the DNA Ligation Kit (Takara Shuzo), and then E. coli DH5Q! T0Y0B0). Plasmid DNA was purified from the resulting transformant using QIAGEN Plasmid Mini Kit (Qiagen).
  • the base sequence was determined using the BigDye Terminator Cycle Sequence Ready Reaction Kit (Zo-Kin Elma). Decoding was performed using a fluorescent automatic sequencer to obtain a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 106. This sequence contained the nucleotide sequence encoding the entire amino acid sequence of the Great Egret GPR7 (SEQ ID NO: 83).
  • the plasmid DNA was digested with the restriction enzymes Sal I and Spe I (Takara Shuzo), and the reaction solution was electrophoresed on a 1.2% agarose gel, and the 1000 bp region observed when stained with ethidium bromide was observed. Bands were collected using DNA Extraction Kit (Qiagen).
  • TotalTotal RNA of the egret whole brain was purchased from UNI TECH. After preparing the Poly (A) + RNA fraction using the mRNA purification kit (Amersham Biosciences), PowerScript Reverse Transcriptase (Clontech) was used from Escherichia coli whole brain poly (A) + RNA 1. O ⁇ g. After reverse transcription was carried out according to the manual using the manual, Marathon cDNA Amplification kit (Clontech) was used to prepare a type II, egos whole brain double-stranded cDNA for 5-RACE.
  • the primer set used for the RACE PCR reaction was Adapter Primer 1 and Primer 1 (SEQ ID NO: 10 7) attached to the kit in the first PCR reaction, and Nested Adapter Primer 2 and Kit 1 in the kit for the second PCR reaction. 2 (SEQ ID NO: 108) was used.
  • the reaction was performed using a 2 ⁇ g equivalent of mRNA of the reverse transcribed cDNA as a type II solution at a volume of 50 A.
  • the composition of the reaction solution was a primer concentration of 0.2 ⁇ iM, a dNTP mixed solution of 0.2 mM, LA-Taq (Takara Shuzo) 1/100 volume, and a 2-fold concentrated GC Buffer II 1/2 volume.
  • the amplification cycle was as follows: After incubating both PCRs at 94 ° C for 120 seconds, 5 cycles of 94 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 4 minutes, 94 ° C for 30 seconds, and 70 ° C ⁇ 4 cycles of 5 minutes, 94t ⁇ 30 seconds, 68 ° C ⁇ After repeating the cycle of 4 minutes 20 times, it was kept at 72 ° C for 10 minutes.
  • the reaction mixture was electrophoresed on a 1.5% agarose gel, and the band around 350 bp, which was visible when stained with ethidium umide, was extracted with a DNA Extraction Kit (Qiagen) and the plasmid vector pGEM-T was used with the DNA Ligation Kit (Takara Shuzo). After subcloning into Easy Vector (Promega), E. coli DH5a
  • Plasmid DNA was purified from the resulting transformant using QIAGEN Plasmid Mini Kit (Qiagen). The reaction for base sequence determination was performed using BigDye Terminator Cycle Sequence Ready Reaction Kit (Kinrylema). Decoding was performed using a fluorescent automatic sequencer to obtain a base sequence represented by SEQ ID NO: 109, which is a 5 'upstream sequence of cDNA encoding a persimmon GPR8 ligand peptide precursor protein.
  • TotalTotal RNA of the egret whole brain was purchased from Ring I TECH.
  • Poly (A) + RNA fractions were prepared using mRNA purification kit (Amersham Biosciences), and 1.0 g of egos whole brain poly (A) + RNA was purified using PowerScript Reverse Transcriptase (Clontech). After reverse transcription was performed according to the manual, a type II, egret whole brain double-stranded cDNA for 3, -RACE was prepared using a Marathon cDNA Amplification kit (Clontech).
  • the primer set used in the RACE PCR reaction was Adapter Primer 1 and degenerate primer 1 (SEQ ID NO: 1 10) attached to the kit in the first PCR reaction, and Nested Adapter Primer attached to the kit in the second PCR reaction. 2 and degenerate primer 1 (SEQ ID NO: 1 1 1) were used.
  • the reaction was carried out using the equivalent of 2 ng of the mRNA of the reversely transcribed cDNA as a ⁇ in a liquid volume of 501.
  • the composition of the reaction solution was a primer concentration of 0.2 iM, a dNTP mixture of 0.2, LA-Taq (Takara Shuzo) 1/100 vol, and a 2 ⁇ concentrated GC Buffer I 1/2 volume.
  • the cycles for amplification are as follows: After incubating both PCRs at 94 ° C for 120 seconds, 5 cycles of 94 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 4 minutes, 94 ° C for 30 seconds, 70 ° C ⁇ 5 cycles of 4 minutes, 94 ° C ⁇ 30 seconds, 68 ° C ⁇ After repeating the cycle of 4 minutes 20 times, it was kept at 72 ° C for 10 minutes.
  • the reaction mixture was electrophoresed on a 1.2% agarose gel, and the band near 600 bp, which was visible when stained with ethidium bromide, was
  • Extraction was performed using Extraction Kit (Qiagen), subcloned into a plasmid vector pGEM-T Easy Vector (Promega) using DNA Ligation Kit (Takara Shuzo), and then introduced into E. coli DH5Q! (T0Y0B0). Plasmid DNA was purified from the resulting transformant using QIAGEN Plasmid Mini Kit (Qiagen). The seventh round of nucleotide sequence determination was performed using the BigDye Terminator Cycle Sequence Ready Reaction Kit (PerkinElmer). Decoding was performed using a fluorescent automatic sequencer to obtain a base sequence represented by SEQ ID NO: 112, which is a 3, downstream sequence of a cDNA encoding a ⁇ sagi GPR8 ligand peptide precursor protein.
  • TotalTotal RNA of whole egret brain was purchased from UNITECH. After preparing Po (A) + RNA fraction using mRNA purification kit (Amersham Biosciences), After reverse transcription was performed according to the manual using PowerScript Reverse Transcriptase (Clontech) from poly (A) + RNA 1.0 ig of Giant Whole Brain, and then using the Marathon cDNA Amplification kit (Clontech), ⁇ Sagi whole brain double-stranded cDNA was prepared.
  • Primer 1 SEQ ID NO: 113 prepared based on the 5'-side sequence of the gene encoding the heron GPR8 ligand peptide precursor protein and the 3'-side of the gene encoding the ⁇ sagi GPR8 ligand peptide precursor protein Using a primer II (SEQ ID NO: 114) prepared on the basis of the sequence, a PCR reaction was performed on the type II of double-stranded cDNA of the egret whole brain.
  • the reaction was performed using 200 liters of cDNA corresponding to 1 ng of mRNA in the form of type II.
  • the composition of the reaction solution was a primer concentration of 0.5 M, a dNTP mixed solution of 0.2 mM, LA-Taq (Takara Shuzo) 1/100 volume, and a 2-fold concentrated GC Buffer II 1/2 volume. Cycles for amplification were kept at 94 ° C for 120 seconds, followed by 5 cycles of 9430 seconds, 72 minutes, 5 cycles of 94:30 seconds, 70 ° C, 1 minute, A cycle of 94 ° C for 30 seconds and 68 minutes for 1 minute was repeated 35 times, followed by incubation at 72 for 7 minutes.
  • the resulting reaction solution was purified using the QIAquick PCR purification Kit (Qiagen), subcloned into the plasmid vector pGEM-T Easy Vector (Promega) using the DNA Ligation Kit (Takara Shuzo), and then E. coli DH5a (T0Y0B0). Plasmid DNA was purified from the resulting transformant using QIAGEN Plasmid Mini Kit (Qiagen).
  • the reaction for base sequence determination was performed using BigDye Terminator Cycle Sequence Ready Reaction Kit (Perkin Elmer). Decoding was performed using a fluorescent automatic sequencer to obtain a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 115.
  • the amino acid sequence of this hypothetical rabbit heron GPR8 ligand peptide precursor protein is shown in SEQ ID NO: 116. ⁇ A normal bioactive peptide is cut out from the expected amino acid sequence of the heron GPR8 ligand peptide to the amino acid sequence, similar to the human, porcine, rat or mouse homolog precursor protein of the GPR8 ligand peptide. There were two Arg_Arg sequences (Ann. NY Acad. Sci. 839, 9-24, 1998). From these facts, it was deduced that the amino acid sequence of the egret homolog of the GPR8 ligand peptide was either or both of SEQ ID NOs: 85 and 87.
  • amino acid sequence of the 23-residue heron GPR8 ligand peptide of SEQ ID NO: 87 is identical to the amino acid sequence of the 23-residue human GPR8 ligand peptide (SEQ ID NO: 1).
  • telomere sequence 50 ng was transformed into a type II primer 1 (SEQ ID NO: 1) prepared based on the 5'-side sequence of the heron GPR8 ligand peptide precursor protein gene.
  • PCR was carried out with the use of primer 1 (SEQ ID NO: 118) prepared based on the 3′-side sequence of the 117 ′) and egret GPR8 ligand peptide precursor protein gene.
  • the composition of the reaction solution was a primer concentration of 0.5 M dNTP mixed solution 0.2 mM LA-Taq (Takara Shuzo) 1/100 vol 2 times concentrated GC Buffer II 1/2 volume.
  • the cycle for amplification was as follows: after incubating at 94 ° C for 120 seconds, a cycle of 94 ° C for 30 seconds and 68 ° C for 1 minute was repeated 15 times, and then incubated at 72 ° C for 7 minutes.
  • the obtained reaction solution was purified using QIAquick PCR purification Kit (Qiagen), and then digested with restriction enzymes Sal I and Spe I (Takara Shuzo). This DNA fragment was subcloned into the SalI site and SpeI site of the animal cell expression vector pAKKO using the DNA Ligation Kit (Takara Shuzo), and then introduced into Escherichia coli DH5Q! (T0Y0B0).
  • Plasmid DNA was purified from the resulting transformant using QIAGEN 'Plasmid Mini Kit (Qiagen). The reaction for base sequence determination was performed using BigDye Terminator Cycle Sequence Ready Reaction Kit (PerkinElmer). Decoding was performed using a fluorescent automatic sequencer to obtain a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 119. Escherichia coli DH5 (T0Y0B0) was transformed with this plasmid to obtain Escherichia coli DH5 ⁇ / ⁇ -rabbit prepro_NPW. Industrial applicability
  • the polypeptide or receptor of the present invention and the DNA of the present invention are useful for screening antidiuretics or diuretics.
  • urinary storage disorders eg, frequent urination, urinary incontinence (eg, urge incontinence, stress urinary incontinence, functional urinary incontinence, etc.)
  • polyuria eg, diabetes insipidus (eg, pituitary incontinence) ⁇
  • urinary excretion disorder eg, fl parapleural contraction
  • urethral passage obstruction dysuria, urination pain, urinary tract obstruction, etc.
  • hyponatremia antidiuretic hormone secretion inadequate syndrome
  • the polypeptide or receptor of the present invention, the DNA of the present invention, the compound promoting the activity of the polypeptide or the receptor of the present invention, or a salt thereof is useful as a low-toxicity and safe antidiuretic, and has an urinary storage disorder ( Eg, urinary frequency, urinary incontinence (eg, urge incontinence, stress urinary incontinence, functional urinary incontinence, etc.), etc., polyuria, diabetes insipidus (eg, pituitary diabetes insipidus, renal urine) It is useful as a preventive and therapeutic agent for hypernatremia, metabolic alkalosis, hypokalemia, Cushing syndrome, etc.
  • urinary storage disorder Eg, urinary frequency, urinary incontinence (eg, urge incontinence, stress urinary incontinence, functional urinary incontinence, etc.), etc., polyuria, diabetes insipidus (eg, pituitary diabetes insipidus, renal urine) It is
  • the antibody of the present invention, the antisense DNA of the present invention, the polypeptide of the present invention, or a compound that inhibits the activity of the receptor or a salt thereof is useful as a low-toxicity and safe diuretic, and has renal edema and urinary dysfunction.
  • a compound that inhibits the activity of the receptor or a salt thereof is useful as a low-toxicity and safe diuretic, and has renal edema and urinary dysfunction.
  • SIADH antidiuretic hormone secretion syndrome

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Abstract

　本発明のポリペプチド（例、GPR8リガンドなど）や、本発明のポリペプチドもしくはその受容体（例、GPR8、GPR7、TGR26など）の活性を促進する化合物またはその塩は、優れた抗利尿剤などとして有用であり、本発明のポリペプチド（例、GPR8リガンドなど）およびその受容体（例、GPR8、GPR7、TGR26など）は優れた抗利尿剤および利尿剤などのスクリーニングなどに有用である。

Description

明 細書 , 抗利尿剤 技術分野
本発明は抗利尿剤もしくは利尿剤またはそのスクリ一ニングなどに関する。 背景技術
動物における尿生成機構は、 全体重の 45〜 70 %を占める体内の水分および電 解質の代謝の恒常性を維持するためにきわめて重要である。 これに伴い、 尿生 成を制御する様々な作用機作に基づく多くの利尿薬および抗利尿薬が治療現場 で使用されている。 例えば、 尿細管細胞における Na+-H+交換系を抑制する炭酸 脱水酵素阻害であるスルファニルアミドまたはァセタゾラミド、 尿細管再吸収 抑制剤であるべンゾチアジアジン系利尿薬、 .ヘンレ上行脚の Na+/Cl—の能動輸送 抑制によつて髄質の浸透圧勾配を消失させるフエノキシ酢酸誘導体'またはスル ファモイル安息香酸誘導体などの利尿薬が知られている。 また、 抗利尿薬とし ては、 抗利尿ホルモンであるバソプレツシンまたはその誘導体がある。 これら はいずれも強力な利尿作用あるいは抗利尿作用を有し、 高血圧、 腎性浮腫、 肝 硬変や心不全に伴う浮腫、 鬱血性心不全による肺鬱血、 下垂体性尿崩症または 腎性尿崩症の治療に使用されている。 しかしながら、 ベンゾチアジアジン系利 尿藥では血中カリウム濃度の低下や高血糖、 また、 フエノキシ酢酸誘導体ある いはスルファモイル安息香酸誘導体では抗尿酸血症や聴覚障害といつた副作用 が知られている。 バソプレツシンは血圧上昇作用を有する。
一方、 ヒト GPR8 (Genomics, 28巻、 84-91頁、 1995年） のリガンドとして、 摂 食作用等を有するペプチド （W0 01/98494号公報、 J. Biol . Chem.、 277巻、 35826-35832頁、 2002年） が報告されている。
利尿作用または抗利尿作用を有することが知られている公知の化合物に比べ て、 新たなメカニズムに基づく副作用の少ない安全な腎性浮腫、 下垂体性尿崩 症または腎性尿崩症などの予防 ·治療剤の開発が望まれていた。 発明の開示
本発明者らは、 この様な現状に鑑み、 鋭意検討した結果、 W0 01/98494号公報 記載の GPR8リガンドぺプチドが、 ゥサギに対して抗利尿作用を有することを見 出し、 更に研究を重ねた結果、 本発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明は、
( 1 ) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有するポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステ ルまたはその塩を含有してなる抗利尿剤、
( 2 ) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有するポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステ ルまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩を含有してなる抗利尿剤、
( 3 ) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の ァミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステ ルまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩を含有してなる利尿剤、
( 4 ) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の ァミノ酸配列を含有するポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステ ルをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してなる 抗利尿剤、
( 5 ) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の ,ァミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステ ルまたはその塩を用いることを特徴とする抗利尿剤または利尿剤のスクリ一二 ング方法、
( 6 ) 配列番号： 7 3、 配列番号： 7 5、 配列番号： 7 7または配列番号： 7 9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含 有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とす る抗利尿剤または利尿剤のスクリーニング方法、
( 7 ) さらに、 配列番号： 7 3、 配列番号： 7 5、 配列番号： 7 7または配 列番号： 7 9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実賁的に同一のアミノ酸 配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いる上記 (5) 記載のスクリーニング方法'、
(7 a) さらに、 配列番号： 73または配列番号： 79で表されるアミノ酸 配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いる上記 (5) 記載のスクリーニング方法、
(8) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の ァミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそめアミドもしくはそのエステ ルまたはその塩を含有することを特徴とする抗利尿剤または利尿剤のスクリー ニング用キッ卜、
(9) 配列番号： 73、 配列番号： 75、 配列番号： 77または配列番号： 79で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含 有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩を含有することを特徴と する抗利尿剤または利尿剤のスクリーニング用キット、
(10) さらに、 配列番号： Ί 3、 配列番号： 75、 配列番号： 77または 配列番号： 79で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ 酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有する上 記 （8) 記載のスクリー ング用キット、
(10 a) 上記 （5) 〜 （7) 記載のスクリーニング方法または上記 （8) 〜 （1 0) 記載のスクリーニング用キットを用いて得られる抗利尿剤または利 尿剤、
(1 1) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有するポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはそのエス テルをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを用いること を特徴とする抗利尿剤または利尿剤のスクリーニング方法、
(12) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有するポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはそのエス テルをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有するこ とを特徴とする抗利尿剤または利尿剤のスクリーニング用キット、
(12 a) 上記 （1 1) 記載のスクリーニング方法または上記 （12) 記載 のスクリーニング用キットを用いて得られる抗利尿剤または利尿剤、
(13) (i) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のァミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはその エステルまたはその塩に対する抗体、 または （ii) 配列番号： 73、 配列番 号：， 75、.配列番号： 77または配列番号： 79で表されるアミノ酸配列と同 一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べ プチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる利尿剤、
(14) (0 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のァミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはその エステルまたはその塩をコードする D N Aの塩基配列に相補的もしくは実質的 に相補的な塩基配列またはその一部、 または （ii) 配列番号： 73、 配列番 . 号： 75、 配列番号： 77または配列番号： 79で表されるアミノ酸配列と同 一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べ . プチドまたはその塩をコードする DNAの塩基配列に相補的もしくは実質的に 相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチドを 含有してなる利尿剤、
(15) 多尿症、 尿崩症、 高ナトリウム血症、 代謝性アルカローシス、 低力 リウム血症または Cushing症候群の予防 ·治療剤である上記 （1) 、 （2) また は （4) 記載の抗利尿剤、
(16) 腎性浮腫または抗利尿ホルモン分泌不適症候群の予防 ·治療剤であ る上記 （3) 、 (13) または （14) 記載の利尿剤、
(17) 哺乳動物に対して、 （i) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同 一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリべプチドもしくはその アミドもしくはそのエステルまたはその塩、 (ii) 該ポリペプチドもしくはそ のアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進する化合物またはそ の塩、 または （iii) 該ポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステル をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドの有効量を投与す ることを特徴とする尿生成抑制方法、
(18) 哺乳動物に対して、 （i) 配列審号： 1で表されるアミノ酸配列と同 一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはその， アミドもしくはそのエステルまたはその塩、 （i i) 該ポリペプチドもしくはそ のアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進する化合物またはそ の塩、 または （i i i) 該ポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステル をコ一ドするポリヌクレオチドの有効量を投与することを特徴とする多尿症、 尿崩症、 高ナトリウ'ム血症、 代謝性アルカローシス、 低カリウム血症または Cushing症候群の予防 ·治療法、
( 1 9 ) 哺乳動物に対して、 （i) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同 一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはその アミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその 塩、 （i i) 上記ポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたは その塩に対する抗体、 （i i i) 配列番号： 7 3、 配列番号： 7 5、 配列番号： 7 7または配列番号： 7 9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 ' のァミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対 する抗体、 (iv) 上記ポリペプチドもしくはそのァミドもしくはそのエステル またはその塩をコードする D N Aの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的 な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチド、 または , (v 上記蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩をコードする D NAの 塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有す るァンチセンスポリヌクレオチドの有効量を投与することを特徴とする尿生成 促進方法、
( 2 0 ) 哺乳動物に対して、 （i) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同 一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリぺプチドもしくはその アミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその 塩、 （i i) 上記ポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたは その塩に対する抗体、 （i i i) 配列番号： 7 3、 配列番号： 7 5、 配列番号： 7 7または配列番号： 7 9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩に対 する抗体、 （iv) 上記ポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステル またはその塩をコードする D N Aの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的 .な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチド、 または (V) 上記蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩をコードする D NAの 塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有す ' るアンチセンスポリヌクレオチドの有効量を投与することを特徴とする腎性浮 腫または抗利尿ホルモン分泌不適症候群の予防 ·治療法、
( 2 1 ) (i) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に ' 同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはその エステルまたはその塩、 または （i i) 配列番号： 7 3、 配列番号： 7 5、 配列 番号： 7 7または配列番号： 7 9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質 . 的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはそ の塩の活性を促進することを特徴とする尿生成抑制方法、
( 2 2 ) (i) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のアミノ酸配列を含有するポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはその エステルまたはその塩、 または （i i) 配列番号： 7 3、 配列番号： 7 5、 配列 番号： 7 7または配列番号： 7 9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質 的に同一のァミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはそ の塩の活性を促進することを特徴とする多尿症、 尿崩症、 高ナトリウム血症、 代謝性アルカローシス、 低カリウム血症または Cushing症候群の予防 ·治療法、 ( 2 3 ) (i) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のアミノ酸 E列を含有するポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはその エステルまたはその塩、 または （i i) 配列番号： 7 3、 配列番号： 7 5、 配列 番号： 7 7または配列番号： 7 9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質 的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはそ の塩の活性を阻害することを特徴とする尿生成促進方法、
( 2 4 ) (i) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のアミノ酸配列を含有するポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはその エステルまたはその塩、 または （i i) 配列番号： 7 3、 配列番号： 7 5、 配列 番号： 7 7または配列番号： 7 9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質 的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはそ の塩の活性を阻害することを特徴とする腎性浮腫または抗利尿ホルモン分泌不 適症候群の予防 '治療法、
( 2 5 ) 多尿症、 尿崩症、 高ナトリウム血症、 代謝性アルカローシス、 低力 リゥム血症または Cushing症候群の予防 ·治療剤を製造するための、 （i) 配列 番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列 を含有するポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその 塩、 （i i) 該ポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはそ の塩の活性を促進する化合物またはその塩、 または （i i i) 該ポリペプチドもし くはそのアミドもしくはそのエステルをコードするポリヌクレオチドの使用、 ( 2 6 ) 腎性浮腫または抗利尿ホルモン分泌不適症候群の予防 ·治療剤の製 造のための、 （i) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的 に同一のァミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそ のエステルまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩、 （i i) 上記ポ リぺプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩に対する抗 体、 （i i i) 配列番号： 7 3、 配列番号： 7 5、 配列番号： 7 7または配列番 号： 7 9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列 を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩に対する抗体、 (iv) 上記ポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその 塩をコ一ドする D N Aの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列 またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチド、 または （V) 上記蛋 白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩をコードする D N Aの塩基配列に 相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセ ンスポリヌクレオチドの使用、
( 2 7 ) 配列番号： 8 1または配列番号： 8 3で表されるアミノ酸配列と同 一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩、
( 2 8 ) 配列番号： 8 1または配列番号： 8 3で表されるアミノ酸配列から なる蛋白質またはその塩、
( 2 9 ) 上記 （2 7 ) 記載の蛋白質の部分ペプチドまたはその塩、 (30) 上記 （27) 記載の蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポ リヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
(31) DNAである上記 （30) 記載のポリヌクレオチド、
(32) 配列番号'： 82または配列番号： 84で表される塩基配列からなる ポリヌクレオチド、
(33) 上記 （30) 記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、 (34) 上記 （33) 記載の組換えべクタ一で形質転換された形質転換体、 (35) 上記 （34) 記載の形質転換体を培養し、 上記 （27) 記載の蛋白 質またはその部分ペプチドを生成 ·蓄積せしめることを特徴とする上記 （2 7) 記載の蛋白質またはその部分ペプチドまたはその塩の製造法、
(36) 上記 （27) 記載の蛋白質またはその部分ペプチドまたはその塩に 対する抗体、
(37) 上記 （36) 記載の抗体を含有してなる診断薬、
(38) 上記 （30) 記載のポリヌクレオチドに相補的または実質的に相補 的な塩基配列またはその一部を有するアンチセンスポリヌクレオチド、
(39) DNAである上記 （38) 記載のアンチセンスポリヌクレオチド、 (40) 上記 （27) 記載の蛋白質またはその部分ペプチドを用いることを 特徴とする抗利尿剤または利尿剤のスクリーニング方法、
(41) 上記 （27) 記載の蛋白質またはその部分ペプチドを含有すること を特徴とする抗利尿剤または利尿剤のスクリーニング用キット、
(42) -配列番号： 85で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのェ ステルまたはその塩、
(43) 配列番号： 85で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドもし くはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、
(44) 上記 （42) 記載のポリペプチドの部分ペプチドまたはその塩、 (45) 上記 （42) 記載のポリペプチドまたはその部分ペプチドをコード するポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
(46) DNAである上記 （45) 記載のポリヌクレオチド、 (47) 配列番号： 86で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、 (48) 上記 （45) 記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、 (49) 上記 （48) 記載の組換えベクターで形質転換された形 ¾転換体、 (50)1 上記 （49) 記載の形質転換体を培養し、 上記 （42) 記載のポリ ペプチドまたはその部分ペプチドを生成。蓄積せしめることを特徴とする上記 (42) 記載のポリペプチドまたはそめ部分ペプチドまたはその塩の製造法、 (51) 上記 （42) 記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはその エステルまたはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、
(52) 上記 （51) 記載の抗体を含有してなる診断薬、
(53) 上記 （45) 記載のポリヌクレオチドに相補的または実質的に相補 的な塩基配列またはその一部を有するアンチセンスポリヌクレオチド、
(54) DNAである上記 （53) 記載のアンチセンスポリヌクレオチド、 (55) 上記 （42) .記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはその エステルまたはその塩を用いることを特徴とする抗利尿剤または利尿剤のスク リーニング方法、
(56) 上記 （42) 記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはその エステルまたはその塩を含有することを特徴とする抗利尿剤または利尿剤のス クリーニング用キットなどを提供する。 発明を実施するための最良の形態
配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を有するポリペプチド （以下、 本発明のポリペプチドと称する場合が ある） は、 ヒトゃ温血動物 （例えば、' モルモ、>ト、 ラット、 マウス、 ニヮトリ、 ゥサギ、 ブ夕、 ヒッジ、 ゥシ、 サルなど） の細胞 （例えば、 網膜細胞、 肝細胞、 脾細胞、 神経細胞、 グリア細胞、 塍臓 iS細胞、 骨髄細胞、 メサンギゥム細胞、 . ランゲル八ンス細胞、 表皮細胞、 上皮細胞、 内皮細胞、 繊維芽細胞、 繊維細胞、 筋細胞、 脂肪細胞、 免疫細胞 （例、 マクロファージ、 T細胞、 B細胞、 ナチュ ラルキラ一細胞、 肥満細胞、 好中球、 好塩基球、 好酸球、 単球） 、 巨核球、 滑 膜細胞、 軟骨細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 乳腺細胞、 肝細胞もしくは 間質細胞、 またはこれら細胞の前駆細胞、 幹細胞もしくは癌細胞など） もしく はそれらの細胞が存在するあらゆる組織、 例えば、 脳、 脳の各部位 （例、 網膜、 嗅球、 扁桃核、 大脳基底球、 海馬、 視床、 視床下部、 大脳皮質、 延髄、 小脳） 、 脊髄、 下垂体、 胃、 滕臓、 腎臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆のう、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋肉、 肺、 消化管 （例、 大腸、 小腸） 、 血管、 心臓、 胸腺、 脾臓、 顎下 腺、 末梢血、 前立腺、 睾丸、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 関節、 骨格筋など、 また は血球系の細胞もしくはその培養細胞 （例えば、 MEL、 Ml、 CTLL-2, HT- 2、 WEHI- 3、 HL- 60、 】0SK_1、 K562 | ML-K M0LT_3、 M0LT-4、 MOLT- 10、 CCRF- CEM、 TALL- 1、 Jurkat , CCRT-HSB-2, KE_37、 SCT-3、 HUT- 78、 HUT- 102、 H9、 U937、 THP-U HEL, JK-K CMK、 0-812, MEG-01など） に由来するポリペプチドであつ てもよく、 合成ポリペプチドであってもよい。
配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とし ， ては、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と例えば約 7 0 %以上、 好まし ぐは約 8 0 %以上、 好ましくは約 9 0 %以上、 好ましくは約 9 5 %以上、 より 好ましくは約 9 8 %以上の相同性を有するアミノ酸配列などがあげられる。
特に、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配 列としては、 上記のアミノ酸配列の他、
(i) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列中の 1〜5個 （好ましくは 1〜3個、 さらに好ましくは 1〜2個、 より好ましくは、 1個） のアミノ酸が欠失したァ ミノ酸配列、
(i i) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列に 1〜5個 （好ましくは 1〜3個、 さらに好ましくは 1〜2個、 より好ましくは、 1個） のアミノ酸が付加したァ ミノ酸配列、
(i i i) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列に 1〜5個 （好ましくは 1〜3個、 さらに好ましくは 1〜2個、 より好ましくは、 1個） のアミノ酸が挿入された アミノ酸配列、
(iv) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列中の 1〜 5個 （好ましくは 1〜3個、 さらに好ましくは 1〜2個、 より好ましくは、 1個） のアミノ酸が俾のァミノ 酸で置換されたアミノ酸配列、 (v) 上記（i；)〜（i v)を組み合わせたアミノ酸配列などがあげられる。
配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有 するポリペプチドとしては、 例えば、 前記の配列番号： 1で表わされるァミノ 酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、 配列番号： 1で表わされるアミ. ノ酸配列を有するポリぺプチドと実質的に同質の活性を有するポリぺプチドな どが好ましい。
' 実質的に同質の活性としては、 例えば、 本発明のポリペプチドの有する活性 (例、 抗利尿作用など） などがあげられる。
実質的に同質の活性とは、 それらの活性が性質的に （例、 理化学的に、 ま たは薬理学的に） 崗質であることを示す。
抗利尿作用の測定は、 公知の方法に準じて行うことができ、 例えば、 Modern Urine Chemistry (Bayer Corporation, New York, 1996年） に記載の方法また はそれに準じた方法、 後述の実施例に記載の方法などに従って測定することが できる。
配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と実質的 同一のアミノ酸配列の具体 例としては、 例えば、 配列番号： 21、 配列番号： 2、 配列番号： 7、 配列番 号： 8、 配列番号： 9、 配列番号： 10、 配列番号： 11、 配列番号： 12、 配列番号： 24、 配列番号： 25、 配列番号： 30、 配列番号： 31、 配列番 号： 36、 配列番号： 37、 配列番号： 40、 配列番号： 41、 配列番号： 4 2、 配列番号： 43、 配列番号： 44、 配列番号： 45、 配列番号： 46、 配 列番号： 47、 配列番号： 48、 配列番号： 49、 配列番号： 50、 配列番 号： 51、 配列番号： 52、 配列番号： 53、 配列番号： 54、 配列番号： 5 5、 配列番号： 56、 配列番号： 57、 配列番号： 58または配列番号： 71 で表されるァミノ酸配列などがあげられる。
本発明のポリペプチドの具体例としては、 例えば、 配列番号： 1で表わされ るアミノ酸配列を有するポリペプチド、 配列番号： 2で表されるアミノ酸配列 を有するポリペプチド、 配列番号： 21で表されるアミノ酸配列を有するポリ ペプチド、 配列番号： 7で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、 配列 ■ 番号： 8で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、 配列番号： 9で表さ れるアミノ酸配列を有するポリペプチド、 配列番号： 1 0で表されるアミノ酸' 配列を有するポリペプチド、 配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列を有する ポリペプチド、 配列番号： 1 2で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、 配列番号： 2 4で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、 配列番号： 2 5で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、 配列番号： 3 0で表される アミノ酸配列を有するポリペプチド、 配列番号： 3 1で表されるアミノ酸配列 を有するポリペプチド、 配列番号： 3 6で表されるアミノ酸配列を有するポリ ペプチド、 配列番号： 3 7で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、 配 列番号： 4 0で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、 配列番号： 4 1 で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、 配列番号： 4 2で表されるァ ミノ酸配列を有するポリペプチド'、 配列番号： 4 3で表されるアミノ酸配列を 有するポリペプチド、 配列番号： 4 4で表されるアミノ酸配列を有するポリべ プチド、 配列番号： 4 '5で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、 配列 番号： 4 6で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、 配列番号： 4 7で 表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、 配列番号： 4 8で表されるアミ ノ酸配列を有するポリペプチド、 配列番号： 4 9で表されるアミノ酸配列を有 するポリペプチド、 配列番号： 5 0で表されるアミノ酸配列を有するポリぺプ チド、 配列番号： 5 1で表されるアミノ酸配列を有するポリぺフ °チド、 配列番 号： 5 2で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、 配列番号： 5 3で表 されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、 配列番号： 5 4で表されるァミノ 酸配列を有するポリペプチド、 配列番号： 5 5で表されるアミノ酸配列を有す るポリペプチド、 配列番号： 5 6で表されるアミノ酸配列を有するポリべプチ ド、 配列番号： 5 7で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドおよび配列 番号： 5 8で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、 配列番号： 7 1で 表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、 配列番号： 8 5で表されるアミ ノ酸配列を有するポリペプチドなどの GPR8と特異的に結合する能力を有するポ リペプチドがあげられる。
また、 本発明のポリペプチドは、 本発明のポリペプチドの前駆体ポリべプチ ドをも包含する意味で用いられる。 該前駆体ポリペプチドの具体例としてほ、 例えば、 配列番号： 6で表される アミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有することを特 徵とするポリペプチド等があげられる。
より、 具体的には、
配列番号： 6で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とし ては、 配列番号： 6で表わされるアミノ酸配列と約 8 0 %以上、 好ましくは約 9 0 %以上、 より好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有するアミノ酸配列など があげられる。 .
特に、 配列番号： 6で表わされるアミノ酸配列 実質的に同一のアミノ酸配 列としては、 上記めアミノ酸配列の他、
(i) 配列番号： 6で表されるアミノ酸配列中の 1〜1 5個 （好ましくは 1〜1 0個、 さらに好ましくは 1〜5個、 より好ましくは、 1〜3個) のアミノ酸が 欠失したアミノ酸配列、
(i i) 配列番号： 6で表されるアミノ酸 3列に 1〜1 0 0個 （好ましくは 1〜5 0個、 さらに好ましくは 1〜5個、 より好ましくは、 1〜3個） のアミノ酸が 付加したアミノ酸配列、
(i i i) 配列番号： 6で表されるアミノ酸配列に 1〜1 5個 （好ましくは 1〜1 0個、 さらに好ましくは 1〜5個、 より好ましくは、 1〜3個） のアミノ酸が 挿入されたアミノ酸配列、
(iv) 配列番号： 6で表されるアミノ酸配列中の 1〜1 5個 （好ましくは 1〜1 0個、 さらに好ましくは 1〜5個、 より好ましくは、 1〜3個） のアミノ酸が 他のアミノ酸で置換されたァミノ酸配列、
(V) 上記（i)〜（i v)を組み合わせたアミノ酸配列などがあげられる。 '
配列番号： 6で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列の具体 例としては、 例えば、 配列番号： 2 0、 配列番号： 2 3、 配列番号： 2 9また は配列番号： 3 5で表されるアミノ酸配列などがあげられる。
上記前駆体ポリぺプチドの具体例としては、 例えば、 配列番号： 6で表わさ れるアミノ酸配列を有するポリペプチド、 配列番号： 2 0で表されるアミノ酸 配列を有するポリペプチド、 配列番号： 2 3で表されるアミノ酸配列を有する ポリペプチド、 配列番号： 29で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、 配列番号： 35で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、 配列番号： 1 16で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドなどがあげられる。
本発明のポリペプチドに対する受容体としては、 種々の受容体のうち、 本発 明のポリペプチドと結合活性を有し、 本発明のポリプチドにより該受容体発現 細胞の細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞 内 C a2+遊離、 細胞内 cAMP生成 抑制、 細胞内 c GMP生成、 イノシトー ル'リン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c一 f o sの活性 化、 pHの低下、 GTPrS結合活性などを促進する活性等） が観察されるも のなどがあげられる。
具体的には、 （1) GPR8 (配列番号： 73 ； Genomics, 28巻、 84- 91頁、 1995 年） または配列番号： 73で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸 配列を含有する蛋白質、 （2) ラット TGR26 (配列番号： 75 ； TO 02/44368号 公報） または配列番号： 75で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質、 （3) マウス TGR26 (配列番号： 77 ； W0 02/44368号公報） または配列番号： ケ 7で表されるアミノ酸配列と同一もし くは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質、 （4) GPR7 (配列番号： 79 ； Genomics, 28巻、 84- 91頁、 1995年) またば配列番号： 79で表されるァ ミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質、 (5) ゥサギ GPR8 (配列番号： 81) または配列番号： 8 1で表されるァミノ 酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質、 （6) ゥサギ GPR7 (配列番号： 83) または配列番号： 83で表されるアミノ酸配列 と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質などがあげられ る。
配列番号： 73で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を有する蛋白質、 配列番号： 76で表わされるアミノ酸配列と同一 もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質、 配列番号： 77で表わ されるアミノ酸配列と同一も,しくは実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白 質、 配列番号： 79で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の. アミノ酸配列を有する蛋白質、 配列番号： 8 1で表されるアミノ酸配列と同一 もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質、 配列番号： 8 3で表 ■ されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋 白質 （以下、 これらを本発明の受容体と称する場合がある） は、 ヒトゃ温血動 物 （例えば、 モルモット、 ラット、 マウス、 ニヮトリ、 ゥサギ、 ブ夕、 ヒッジ、 ゥシ、 サルなど） の細胞 （例えば、 網膜細胞、 肝細胞、 脾細胞、 神経細胞、 グ リア細胞、 塍臓 i6細胞、 骨髄細胞、 メサンギゥム細胞、 ランゲルハンス細胞、 表皮細胞、 上皮細胞、 内皮細胞、 繊維芽細胞、 繊維細胞 筋細胞、 脂肪細胞、 免疫細胞 （例、 マクロファージ、 T細胞、 B細胞、 ナチュラルキラー細胞、 肥 満細胞、 好中球、 好塩基球、 好酸球、 単球） 、 巨核球、 滑膜細胞、 軟骨細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 乳腺細胞、 肝細胞もしくは間質細胞、 またはこ れら細胞の前駆細胞、 幹細胞もしくは癌細胞など） もしくはそれらの細胞が存 在するあらゆる組織、 例えば、 脳、 脳の各部位 （例、 網膜、 嗅球、 扁桃核、 大 脳基底球、 海馬、 視床、 視床下部、 大脳皮質、 延髄、 小脳） 、 脊髄、 下垂体、. 胃、 塍臓、 腎臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆のう、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋肉、 肺、 消化管 （例、 大腸、 小腸） 、 血管、 心臓、.胸腺、 脾臓、 顎下腺、 末梢血、 前立腺、 睾丸、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 関節、 骨格筋など、 または血球系の細 胞もしくはその培養細胞 （例えば、 MEL、 MK CTLL- 2、 HT-2, WEHI- 3、 HL_60、 JOSK-K K562, ML - 1、 MOLT- 3、 MOLT- 4、 MOLT- 10、 CCRF-CEM、 TALL - 1、 Jurkat、 CCRT-HSB - 2、 KE- 37、 SKW- 3、 HUT - 78、 HUT - 102、 H9、 U937 THP-K HEL, JK-K CMK、 KO-812, MEG- 01など） に由来する蛋白質であってもよく、 合成蛋白質であ つてもよい。
配列番号： 7 3で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列と しては、 配列番号： 7 3·で表わされるアミノ酸配列と約 7 0 %以上、 好ましく は約 8 0 %以上、 より好ましくは約 9 0 %以上の相同性を有するアミノ酸配列 などがあげられる。
配列番号： 7 5で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とし ては、 例えば、 配列番号： 7 5で表されるアミノ酸配列と 8 5 %以上、 好まし くは約 9 0 %以上、 より好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有するアミノ酸配 列などが挙げられる。
配列番号： 77で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とし ては、 例えば、 配列番号： 77で表されるアミノ酸配列と 86%以上、 好まし くは約 90%以上、 より好ましくは約 95%以上の相同性を有するアミノ酸配 列などが挙げられる。
配列番号： 79で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列と しては、 配列番号： 79で表わされるアミノ酸配列と約 70%以上、 好ましく は約 80%以上、 より好ましくは約 90%以上の相同性を有するアミノ酸配列 などがあげられる。
配列番号： 81で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列と しては、 配列番号： 73で表わされるアミノ酸配列と約 82%以上、 好ましく は約 90%以上、 より好ましくは約 95%以上の相同性を有するアミノ酸配列 などがあげられる。
配列番号： 83で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とし ては、 例えば、 配列番号： 83で表されるアミノ酸配列と 92%以上、 好まし くは約 95%以上、 より好ましくは約 98%以上の相同性を有するアミノ酸配 列などが挙げられる。 '
配列番号： 73、 配列番号： 75、 配列番号： 77、 配列番号： 79、 配列 番号： 8 1または配列番号： 83で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有する蛋白質としては、 例えば、 配列番号： 73、 配列番号： 75、 配列番号： 77、 配列番号： 79、 配列番号： 81または配列番号： 8 3で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番 号： 73、 配列番号： 75、 配列番号： 77、 配列番号： 79、 配列番号： 8 1または配列番号： 83で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と実質的に同 質の活性を有する蛋白質などが好ましい。
配列番号： 73、 配列番号： 75、 配列番号： 77、 配列番号： 79、 配列 番号： 81または配列番号： 83で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一の アミノ酸配列としては、 （i) 配列番号： 73、 配列番号： 75、 配列番号： 7 7、 配列番号： 79、 配列番号： 8 1または配列番号： 83で表されるァミノ 酸配列中の 1〜1 5個 （好ましくは 1〜 1 0個、 さらに好ましくは 1〜5個、 より好ましくは、 1〜3個） のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 （i i) 配列番 号： 7 3、 配列番号： 7 5、 配列番号： 7 7、 配列番号： 7 9、 配列番号： 8 1または配列番号： 8 3で表されるアミノ酸配列に 1〜1 5個 （好ましくは 1 〜1 0個、 さらに好ましくは 1〜5個、 より好ましくは、 1〜3個） のァミノ 酸が付加したアミノ酸配列、 （i i i) ¾列番号： 7 3、 配列番号： 7 5、 配列番 号： 7 7、 配列番号： 7 9、 配列番号： 8 1または配列番号： 8 3で表される アミノ酸配列に 1 ~ 1 5個 （好ましくは 1〜1 0個、 さらに好ましくは 1〜5 個、 より好ましくは、 1〜3個） のアミノ酸が揷入されたアミノ酸配列、 （iv) 配列番号： 7 3、 配列番号： 7 5、 配列番号： 7 7、 配列番号： 7 9、 配列番 号： 8 1または配列番号： 8 3で表されるアミノ酸配列中の 1〜1 5個 （好ま しくは 1〜1 0個、 さらに好ましくは 1〜5個、 より好ましくは、 1〜3個） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、 （V) 上記（i)〜（iv)を組 み合わせたァミノ酸配列などがあげられる。
本発明の受容体の具体例としては、 例えば、 配列番号： 7 3で表されるアミ ノ酸配列を含有する蛋白寳、 配列番号： 7 5で表されるアミノ酸配列.を含有す る蛋白質、 配列番号： 7 7で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質、 配列番 号： 7 9で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質、 配列番号： 8 1で表され るアミノ酸配列を含有する蛋白質； 配列番号： 8 3で表されるアミノ酸配列を 含有する蛋白質などが用いられる。
本発明のポリペプチドに対する受容体の部分ペプチド （以下、 本発明の部分 ペプチドと称する場合がある） としては、 後述の医薬等のスクリーニング方法 に用いることのできる部分ペプチドであれば、 いかなるものであっていてもよ いが、 好ましくは、 本発明のポリペプチドに対する結合能を有する部分べプチ ド、 細胞膜外領域に相当するアミノ酸配列を含有ずる部分ペプチド等が用いら れる。 本発明の受容体の構成アミノ酸配列のうち 2 0個以上、 好ましくは 5 0 個以上、 より好ましくは 1 0 0個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが 好ましい。 （i) 上記アミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数個 （1〜5個） ） のアミノ酸が欠失し、 （i i) 上記アミノ酸配列に 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜2 0個程度、 より好 ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数個 （1〜5個） ) のアミノ酸が 付加し、 または （i i i) 上記アミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜1 0個程度、 より好ましくは数個、 さらに好ましくは 1〜5個程度） のァ ミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
具体例としては、 （a) 配列番号： 7 3で表されるアミノ酸配列中、 1番目 (Met) 〜1 2 3番目 （Phe) のアミノ酸残基からなる部分アミノ酸配列もしく はその一部、 3 0 1番目 （Asn) 〜3 5 8番目 （Lys) のアミノ酸残基からなる 部分アミノ酸配列もしくはその一部、 5 4 8番目 （Tyr) 〜5 9 3番目 （Arg) ' のアミノ酸残基からなる部分アミノ酸配列もしくはその一部、 および 8 4 3番 目 （Ala) 〜8 9 5番目 （l i e) のアミノ酸残基からなる部分アミノ酸配列もし くはその一部から選択される 1または 2以上の部分アミノ酸配列を含有する部 分ペプチド、 （b) 配列番号： 7 5で表されるアミノ酸配列中、 1番目 （Met) 〜8 5番目 （Asp) のアミノ酸残基からなる部分アミノ酸配列もしくはその一部、 または 2' 2 2番目 （Cys) 〜3 2 9番目 （Ala) のアミノ酸残基からなる部分ァ ミノ酸配列もしくはその一部を含有するペプチドなどがあげられる。
本発明のポリペプチド、 受容体またはその部分ペプチドは、 ペプチド標記の 慣例に従って左端が N末端 （ァミノ末端） 、 右端が C末端 （カルボキシル末 端） である。 本発明のポリペプチド、 受容体またはその部分ペプチドは、 C末 端が力ルポキシル基 （-C00H) 、 カルポキシレート（- C00_) 、 アミド （- C0NH2) またはエステル （- C00R) の何れであってもよい。
ここでエステルにおける Rとしては、 例えば、 メチル、 ェチル、 n—プロピ ル、 イソプロピルもしくは n—ブチルなどの アルキル基、 例えば、 シクロ ペンチル、 シクロへキシルなどの C 3_8シクロアルキル基、 例えば、 フエニル、 α—ナフチルなどの C 6— |2ァリール基、 例えば、 ベンジル、 フエネチルなどのフ ェニル一 C Mアルキル基もしくは α—ナフチルメチルなどのひ一ナフチルー C卜 2アルキル基などの C7— 14ァラルキル基のほか、 経口用エステルとして汎用される ピバロィルォキシメチル基などが用いられる。
本発明のポリペプチド、 受容体またはその部分ペプチドが C末端以外にカル ポキシル基 （またはカルポキシレート） を有している場合、 カルボキシル基が アミド化またはエステル化されているものも本発明のポリペプチドに含まれる。 この場合のエステルとしては、 例えば上記した C未端のエステルなどが用いら れる。
さらに、 本発明のポリペプチド、 受容体またはその部分ペプチドには、 N末 端のアミノ酸残基 （例、 メチォニン残基） のァミノ基が保護基 （例えば、 ホル ミル基、 ァセチル基などの C t_6アルカノィルなどの C ,_6ァシル基など） で保護. されているもの、 生体内で切断されて生成する N末端のグルタミン残基がピロ グルタミン酸化したもの、 分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基 （例えば一〇H、 — S H、 アミノ基、 イミダゾール基、 インドール基、 グァニジノ基など） が適 当な保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチル基などの アルカノィル基など の c,_6ァシル基など） で保護されているもの、 あるいは糖鎖が結合したいわゆ る糖蛋白質などの複合蛋白質なども含まれる。
本発明のポリペプチド、 受容体またはその部分ペプチドの塩としては、 生理 学的に許容される酸 （例、 無機酸、 有機酸） や塩基 （例、 アルカリ金属塩） な どとの塩が用いられ、 とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。 こ のような塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル 酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸） との塩などが用いられる。
本発明のポリペプチド、'受容体またはその部分ペプチドは、 前述したヒトゃ 温血動物の細胞または組織から公知のポリぺプチドの精製方法によつて製造す ることもできるし、 後述するポリぺプチドをコ一ドする D N Aで形質転換され た形質転換体を培養することによつても製造することができる。 また、 後述の ペプチド合成法に準じて製造することもできる。 例えば、 WO 0 1 / 9 8 4 9 4号公報、 WO 0 2 74 4 3 6 8号公報などに記載の方法に準じて製造するこ とができる。
ヒトゃ哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、 ヒトゃ哺乳動物の組織 または細胞をホモジナイズした後、 酸などで抽出を行ない、 該抽出液を逆相ク 口マトグラフィ一、 イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー を組み合わせることにより精製単離することができる。
本発明のポリペプチド、 受容体、 その部分ペプチド、 もしくはそれらの塩、 またはそれらのアミド体の合成には、 通常市販のポリペプチド合成用樹脂を用 いることができる。 そのような樹脂としては、 例えば、 クロロメチル樹脂、 ヒ ドロキシメチル樹脂、 ベンズヒドリルァミン樹脂、 アミノメチル樹脂、 4—ベ ンジルォキシベンジルアルコール樹脂、 4—メチルベンズヒドリルァミン樹脂、 P AM樹脂、 4—ヒドロキシメチルメチルフエニルァセトアミドメチル樹脂、 ポリアクリルアミド樹脂、 4一 （2 '， 4 ' -ジメトキシフエ二ルーヒドロキシメ チル） フエノキシ樹脂、 4一 （2 ' , 4 ' -ジメトキシフエ二ルー Fm o cァミノ ェチル） フエノキシ樹脂などをあげることができる。 このような樹脂を用い、 ひーァミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、 目的とするポリぺプ チドの配列通りに、 公知の各種縮合方法に従い、 樹脂上で縮合させる。 反応の 最後に樹脂からポリぺプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、 さらに 高希釈溶液中で分子内ジスルフイド結合形成反応を実施し、 目的のポリべプチ ド、 受容体、 部分ペプチドまたはそれらのアミド体を取得する。 ' 上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、 ポリべプチド合成に使用できる各 種活性化試薬を用いることができるが、 特に、 カルポジイミド類がよい。 カル ポジイミド類としては、 D C C、 N， N' —ジイソプロピルカルポジイミド、 N ーェチルー N'— ( 3—ジメチルァミノプロリル) カルポジイミドなどが用いら れる。 これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤 （例えば、 H〇B t、 H O O B t ) とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、 対称酸無水物 または HO B tエステルあるいは H〇〇B tエステルとしてあらかじめ保護ァ ミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、 ポリぺプ チド縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。 例 えば、 N, N—ジメチルホルムアミド， N, N—ジメチルァセトアミド， N— メチルピロリドンなどの酸アミド類、 塩ィ匕メチレン， クロ口ホルムなどのハロ ゲン化炭化水素類、 トリフルォロエタノールなどのアルコール類、 ジメチルス ルホキシドなどのスルホキシド類、 ピリジン， ジォキサン， テトラヒドロフラ ンなどのエーテル類、 ァセトニトリル， プロピオ二トリルなどの二トリル類、 酢酸メチル， 酢酸ェチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物など が用いられる。 反応温度はポリペプチド結合形成反応に使用され得ることが知 られている範囲から適宜選択され、 通常約— 2 0 °C〜5 0 の範囲から適宜選 択される。 活性化さ.れたアミノ酸誘導体は通常 1 . 5〜4倍過剰で用いられる。 ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、 縮合が不十分な場合には保護基の脱 離を行なうことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことが できる。 反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、 無水酢酸また はァセチルイミダゾ一ルを用いて未反応アミノ酸をァセチル化することによつ て、 後の反応に影響を与えないようにすることができる。
原料のァミノ基の保護基としては、 例えば、 Z、 B o c、 t一ペンチルォキ シカルポニル、 ィソポルニルォキシカルボニル、 4ーメトキシベンジルォキシ 力ルポニル、 C 1 一 Z、 B r _ Z、 ァダマンチルォキシカルポニル、 トリフル ォロアセチル、 'フタロイル、 ホルミル、 2—二トロフエニルスルフエ二ル、 ジ フエニルホスフイノチオイル、 Fm o cなどが用いられる。
力ルポキシル基は、 例えば、 アルキルエステル化 （例えば、 メチル、 ェチル、 プロピル、 ブチル、 tーブチル、 シクロペンチル、 シクロへキシル、 シクロへ プチル、 シクロォクチル、 2—ァダマンチルなどの直鎖状、 分枝状もしくは環 状アルキルエステル化） 、 ァラルキルエステル化 （例えば、 ベンジルエステル、 4—ニトロべンジルエステル、 4ーメトキシベンジルエステル、 4一クロ口べ ンジルエステル、 ベンズヒドリルエステル化) 、 フエナシルエステル化、 ベン ジルォキシカルポニルヒドラジド化、 t一ブトキシカルポニルヒドラジド化、 トリチルヒドラジ,ド化などによつて保護することができる。
セリンの水酸基は、 例えば、 エステル化またはエーテル化によって保護する ことができる。 このエステル化に適する基としては、 例えば、 ァセチル基など の低級 （C ^) アルカノィル基、 ベンゾィル基などのァロイル基、 ベンジル ォキシカルボ二ル基、 エトキシカルポニル基などの炭酸から誘導される基など が用いられる。 また、 エーテル化に適する基としては、 例えば、 ベンジル基、 テドラヒドロビラ二ル基、 卜ブチル基などである。
チロシンのフエノール性水酸基の保護基としては、 例えば、 Bz 1、 C 12 一 B z l、 2—二トロベンジル、 B r— Z、 t一ブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、 例えば、 To s、 4ーメトキ シー 2, 3， 6—トリメチルベンゼンスルホニル、 DNP、 ベンジルォキシメ チル、 Bum、 Bo c、 Tr t, Fmo cなどが用いられる。
原料の力ルポキシル基の活性ィ匕されたものとしては、 例えば、 対応する酸無 水物、 アジド、 活性エステル 〔アルコール （例えば、 ペンタクロロフエノール、 2, 4， 5—トリクロ口フエノール、 2, 4—ジニトロフエノール、 シァノメ チルアルコール、 パラニトロフエノール、 HONB、 N—ヒドロキシスクシミ ド、 N—ヒドロキシフタルイミド、 HOB t) とのエステル〕 などが用いられ る。 原料のァミノ基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応するリン酸ァ ミドが用いられる。 .
保護基の除去 （脱離） 方法としては、 例えば、 Pd—黒あるいは Pd—炭素 などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、 また、 無水フッ化水素、 メタンスルホン酸、 トリフルォロメ夕ンスルホン酸、 トリフルォロ酢酸あるい はこれらの混合液などによる酸処理や、 ジイソプロピルェチルァミン、 トリエ チルァミン、 ピぺリジン、 ピぺラジンなどによる塩基処理、 また液体アンモニ ァ中ナトリウムによる還元なども用いられる。 上記酸処理による脱離反応は、 一般に約一 20°C〜4 O の温度で行なわれるが、 酸処理においては、 例えば、 ァニソール、 フエノール、 チオアニソ一ル、 メタクレゾ一ル、 パラクレゾール、 ジメチルスルフイド、 1, 4—ブタンジチォ一ル、 1， 2—エタンジチオール などのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。 また、 ヒスチジンのイミダ ゾール保護基として用いられる 2， 4 ^ジニトロフエニル基はチオフェノ一ル 処理により除去され、 トリブトファンのインドール保護基として用いられるホ ルミル基は上記の 1, 2—エタンジチオール、 1， 4—ブタンジチオールなど の存在下の酸処理による脱保護以外に、 希水酸化ナトリウム溶液、 希アンモニ ァなどによるアルカリ処理によっても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、 およびその保 護基の脱離、 反応に'関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段 から適宜選択しうる。
本発明のポリペプチド、 受容体またはその部分ペプチドのアミド体を得る別 の方法としては、 例えば、 まず、 カルボキシ末端アミノ酸のひ一力ルポキシル 基をアミド化して保護した後、 アミノ基側にペプチド （ポリペプチド） 鎖を所 望の鎖長まで延ばした後、 該ぺプチド鎖の N末端の a—ァミノ基の保護基のみ を除いたポリぺプチドと C末端のカルボキシル基の保護基のみを除去したポリ ペプチドとを製造し、 この両ポリべプチドを上記したような混合溶媒中で縮合 させる。 縮合反応の詳細については上記と同様である。 縮合により得られた保 護ポリペプチドを精製した後、 上記方法によりすベての保護基を除去し、 所望 の粗ポリペプチドを得ることができる。 この粗ポリペプチドは既知の各種精製 手段を駆使して精製し、 主要画分を凍結乾燥することで所望のポリぺプチド、 受容体またはその部分べプチドのアミド体を得ることができる。
本発明のポリぺプチド、 受容体またはその部分べプチドのエステル体を得る には、 例えば、 カルポキシ末端アミノ酸の α—力ルポキシル基を所望のアルコ —ル類と縮合しアミノ酸エステルとした後、 ポリペプチド、 受容体またはその 部分ペプチドのアミド体と同様にして、 所望のポリペプチド、 受容体またはそ の部分べプチドのエステル体を得ることができる。
本発明のポリぺプチド、 受容体またはその部分べプチドは、 .公知のぺプチド の合成法に従って、 あるいは受容体の部分ペプチドについては、 受容体を適当 なぺプチダーゼで切断することによつて製造することができる。 ペプチドの合 成法としては、 例えば、 固相合成法、 液相合成法のいずれによっても良い。 す なわち、 本発明のポリペプチド、 受容体またはその部分ペプチドを構成し得る 部分べプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、 生成物が保護基を有 する場合は保護基を脱離することによ,り目的のペプチドを製造することができ る。 公知の縮合方法や保護基の脱離としては、 例えば、 以下の （a) 〜 （e) に 記載された方法があげられる。
(a) M. Bodanszky および M. A. Ondet t i , ペプチド 'シンセシス （Pept ide Synthes is; , Interscience Publ ishers, New York (1966年) (b) Schroederおよび Luebke、 ザ'ペプチド（The Peptide), Academic Press, New York (1965年） ,
(c) 泉屋信夫他、 ペプチド合成の基礎と実験、 丸善 (株） （1975年）
(d) 矢島治明 および榊原俊平、 生化学実験講座 1、 タンパク質の化学 IV、 205、 （1977年）
(e) 矢島治明監修、 続医薬品の開発、 第 14卷、 ペプチド合成、 広川書店 . また、 反応後は通常の精製法、 例えば、 溶媒抽出 ·蒸留 ·カラムクロマトグ ラフィ一 ·液体クロマトグラフィー ·再結晶などを組み合わせて本発明のポリ ペプチド、 受容体またはその部分ペプチドを精製単離することができる。 上記 方法で得られるポリぺプチド、 受容体またはその部分べプチドが遊離体である 場合は、 公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換するこ とができるし、 逆に塩で得られた場合は、 公知の方法あるいはそれに準じる方 法によって遊離体または他の塩に変換することが きる。
本発明のポリべプチド、 受容体またはその部分べプチドをコードする D N A としては、 前述した本発明のポリペプチド、 受容体またはその部分ペプチドを コードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。 ま た、 ゲノム DNA、 ゲノム DN Aライブラリー、 前記した細胞'組織由来の c DNA、 前記した細胞 ·組織由来の' c DN Aライブラリー、 合成 DN Aのいず れでもよい。
ライブラリーに使用するベクターは、 バクテリオファージ、 プラスミド、 コ スミド、 ファ一ジミドなどいずれであってもよい。 また、 前記した細胞 ·組織 より totalRNAまたは mRNA画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (以下、 RT-PCR法と略称する) によ つて増幅することもできる。
本発明のポリペプチドをコ一ドする DNAとしては、 例えば （a) 配列番号： 3、 配列番号： 4、 配列番号： 13、 配列番号： 14、 配列番号： 15、 配列 番号： 16、 配列番号： 17、 配列番号： 18、 配列番号： 26、 配列番号： 27、 配列番号： 32、 配列番号： 33、 配列番号： 38、 配列番号： 39、 配列番号： 59、'配列番号： 60、 配列番号： 61、 配列番号： 62、 配列番 号： 63、 配列番号： 64、 配列番号： 65、 配列番号： 66、 配列番号： 6 7、 配列番号： 68、 配列番号： 69、 配列番号 : 70、 配列番号： 72、 配 列番号： 86または配列番号： 88で表わされる塩基配列を含有する DNA、
(b) 配列番号： 3、 配列番号： 4、 配列番号： 13、 配列番号： 14、 配列番 号： 15、 配列番号： 16、 配列番号： 17、 配列番号： 18、 配列番号： 2
6、 配列番号：，27、 配列番号： 32、 配列番号： 33、 配列番号： 38、 配 列番号： 39、 配列番号： 59、 配列番号： 60、 配列番号： 61、 配列番 号： 62、 配列番号： 63、 配列番号： 64、 配列番号： 65、 配列番号： 6 6、 配列番号： 67、 配列番号： 68、 配列番号： 69、 配列番号： 70、 配 列番号： 72、 配列番号： 86または配列番号： 88で表わされる塩基配列と ハイストリンジェン卜な条件下でハイブリダィズする塩基配列を有し、 本発明 のポリぺプチドと実質的に同質の活性を有するポリぺプチドをコ一ドする DN A、
(c) 配列番号： 5、 配列番号： 19、 配列番号： 22、 配列番号： 28または 配列番号： 34で表わされる塩基配列を含有する DNA、 または
(d) 配列番号： 5、 配列番号： 19、 配列番号： 22、 配列番号： 28または 配列番号： 34で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイ ブリダイズする塩基配列を有する D N Aなどであれば何れのものでもよい。
(i) 配列番号： 3、 配列番号： 4、 配列番号： 13、 配列番号： 14、 配列 番号： 15、 配列番号： 16、 配列番号： 17、 配列番号： 18、 配列番号： 26、 配列番号： 27、 配列番号： 32、 配列番号： 33、 配列番号： 38、 配列番号： 39、 配列番号： 59、 配列番号： 60、 配列番号： 61、 配列番 号： 62、 配列番号： 63、 配列番号： 64、 配列番号： 65、 配列番号： 6 6、 配列番号： 67、 配列番号： 68、 配列番号： 69、 配列番号： 70、 配 列番号： 72、 配列番号： 86または配列番号： 88で表わされる塩基配列、 または （ii) 配列番号： 5、 配列番号： 19、 配列番号： 22、 配列番号： 2 8または配列番号： 34'で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件 下でハイブリダィズできる DN Aとしては、 例えば、 それぞれ (0 配列番号.： 3、 配列番号： 4、 配列番号： 13、 配列番号： 14、 配列番号： 15、 配列 番号： 16、 配列番号： 17、 配列番号： 18、 配列番号： 26、 配列番号：
27、 配列番号： 32、 配列番号： 33、 配列番号： 38、 配列番号： 39、 配列番号： 59、 配列番号： 60、 配列番号： 61、 配列番号： 62、 配列番 号： 63、 配列番号： 64、 配列番号： 65、 配列番号： 66、 配列番号： 6 7、 配列番号： 68、 配列番号： 69、 配列番号： 70、 配列番号： 72、 配 列番号： 86または配列番号： 88で表される塩基配列、 または （ii) 配列番 号： 5、 配列番号： 19、 配列番号： 22、 配列番号： 28または配列番号：
34で表わされる塩基配列と約 70 %以上、 好ましくは約 80%以上、 より好 ましくは約 90 %以上、 さらに好ましくは約 95 %以上の相同性を有する塩基 配列を含有する D N Aなどが用いられる。
ハイブリダィゼーシヨンは、 公知の方法あるいはそれに準じる方法、 例えば、
Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab.
Press, 1989) に記載の方法などに従って行なうことができる。 また、 市販のラ イブラリーを使用する場合、 添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうこ とができる。 より好ましくは、 ハイストリンジェントな条件に従って行なうこ とができる。 .
ハイストリンジェントな条件とは、 例えば、 ナトリウム濃度が約 19〜4:0 mM、 好ましくは約 19〜 20 mMで、 温度が約 50〜 70で、 好ましくは約 60〜65°Cの条件を示す。 特に、 ナトリウム濃度が約 19 mMで温度が約 6 5 °Cの場合が最も好ましい。 '
より具体的には、
(i) 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコード する DNAとしては、 配列番号： 3で表わされる塩基配列を含有する DNA、 配列番号： 88で表わされる塩基配列を含有する DNAなどが用いられ、
(ϋ) 配列番号： 2で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコード する DNAとしては、 配列番号： 4で表わきれる塩基配列を含有する DNAな どが用いられ、
(iii) 配列番号： 7で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコー ドする DNAとしては、 配列番号： 13で表わされる塩基配列を含有ずる DN Aなどが用.いられ、
(iv) 配列番号： 8で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコード する DNAとしては、 配列番号： 14で表わされる塩基配列を含有する DN A などが用いられ、 ，
(V) 配列番号： 9で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコード する DNAとしては、 配列番号： 1'5で表わされる塩基配列を含有する DNA などが用いられ、 .
(vi) 配列番号： 10で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコー ドする DNAとしては、 配列番号： 16で表わされる塩基配列を含有する DN Aなどが用いられ、
(vii) 配列番号： 11で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコ ードする DNA しては、 配列番号： 17で表わされる塩基配列を含有する D N Aなどが用いられ、
(viii) 配列番号： 12で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコ —ドする DNAとしては、 配列番号： 18で表わされる塩基配列を含有する D
N Aなどが用いられ、
(ix) 配列番号： 24で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコ一 ドする DNAとしては、 配列番号： 26で表わされる塩基配列を含有する DN Aなどが用いられ、 '
(X) 配列番号： 25で表わされるァミノ酸配列を含有するポリペプチドをコ一 ドする DNAとしては、 配列番号： 27で表わされる塩基配列を含有する DN Aなどが用いられ、
(xi) 配列番号： 30で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコー ドする DNAとしては、 配列番号： 32で表わされる塩基配列を含有する DN Aなどが用いられ、
(xii) 配列番号： 31で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコ —ドする DNAとしては、 配列番号： 33で表わされる塩基配列を含有する. D N Aなどが用いられ、
(xiii) 配列番号： 36で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコ —ドする D NAとしては、 配列番号： 3 8で表わされる塩基配列を含有する D N Aなどが用いられ、 ,
(xiv) 配列番号： 3 7で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコ —ドする D NAとしては、 配列番号： 3 9で表わされる塩基配列を含有する D N Aなどが用いられ、
(XV) 配列番号： 4 0で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコー ドする D NAとしては、 配列番号： 3で表わされる塩基配列を含有する D NA などが用いられ、
(xv i) 配列番号：' 4 1で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコ 一'ドする D NAとしては、 配列番号： 5 9で表わされる塩基配列を含有する D
NAなどが用いられ、
(xvi i) 配列番号： 4 2で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコ —ドする D NAとしては、 配列番号： 6 0で表わされる塩基配列を含有する D
N Aなどが用いられ、
(xvi i i) 配列番号： 4 3で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドを コードする D NAとしては、 配列番号： 6 1で表わされる塩基配列を含有する D N Aなどが用いられ、
(xix) 配列番号： 4 4で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコ ードする D NAとしては、 配列番号： 6 2で表わされる塩基配列を含有する D N Aなどが用いられ、
(XX) 配列番号： 4 5で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコー ドする D NAとしては、 配列番 ： 6 3で表わされる塩基配列を含有する D N •Aなどが用いられ、
(xxi) 配列番号： 4 6で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコ . —ドする D NAとしては、 配列番号： 6 4で表わされる塩基配列を含有する D
NAなどが用いられ、 、
(xxi i) 配列番号： 4 7で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコ ードする D NAとしては、 配列番号： 6 5で表わされる塩基配列を含有する D N Aなどが用いられ、 (xxiii) 配列番号： 48で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドを コードする DNAとしては、 配列番号： 26で表わされる塩基配列を含有する DNAなどが用いられ、
(XX i v) 配列番号： 49で表わされるァミノ酸配列を含有するポリべプチドをコ —ドする DNAとしては、 配列番号： 32で表わされる塩基配列を含有する D N Aなどが用い'られ、
(XXV) 配列番号： 50で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコ —ドする DNAとしては、 配列番号： 3 'で表わされる塩基配列を含有する DN Aなどが用いられ、
2
(xxvi) 配列番号： 51で表わされるアミ9 -ノ酸配列を含有するポリペプチドをコ —ドする DNAとしては、 配列番号： 3で表わされる塩基配列を含有する DN Aなどが用いられ、
(xxvii) 配列番号： 52で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドを コードする DNAとしては、 配列番号： 66で表わされる塩基配列を含有する DNAなどが用いられ、
(xxviii) 配列番号： 53で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドを コードする DNAとしては、 配列番号： 67で表わされる塩基配列を含有する DN Aなどが用いられ、
(xx ix) 配列番号： 54で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドを: π —ドする DNAとしては、 配列番号： 68で表わされる塩基配列を含有する D N Aなどが用いられ、
(XXX) 配列番号： 55で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコ ードする DNAとしては、 配列番号： 69で表わされる塩基配列を含有する D N Aなどが用いられ、
(xxxi) 配列番号： 21で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコ ードする DNAとしては、 '配列番号： 70で表わされる塩基配列を含有する D N Aなどが用いられ、
(xxxii) 配列番号： 56で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドを コードする DNAとしては、 配列番号： 66で表わされる塩基配列を含有する DN Aなどが用いられ、 ■
(xxxiii) 配列番号： 57で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドを コードする DNAとしては、 配列番号： 3で表わされる塩基配列を含有する D N Aなどが用いられ、
(xxxiv) 配列番号： 58で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドを ' コードする DNAとしては、 配列番号： 66で表わされる塩基配列を含有する DNAなどが用いられ、
(XXXV) 配列番号： 71で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコ ードする DNAとしては、 配列番号： 72で表わされる塩基配列を含有する D N Aなどが用いられ、
(xxxv i) 配列番号： 85で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドを コードする DNAとしては、 配列番号： 86で表わされる塩基配列を含有する， DN Aなどが用いられる。
本発明の受容体をコードする DNAとしては、 例えば、 （1) 配列番号： 7 4で表される塩基配列を含有する DNA、 または配列番号： 74で表わされる 塩基配列とハイストリンジエンドな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有 し、 配列番号： 73で表されるアミノ酸を含有する蛋白質と実質的に同質の活' 性を有する蛋白質をコードする DNA、 (2) 配列番号： 76で表される塩基 配列を含有する DNA、 または配列番号： 76で表わされる塩基配列とハイス トリンジェントな条件下でハイブリダィズする塩基配列を有し、 配列番号： 7 5で表されるアミノ酸を含有する蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質 をコ一ドする DNA、 (3) 配列番号： 78で表される塩基配列を含有する D NA、 または配列番号：' 78で表わされる塩基配列とノ\イストリンジェントな 条件下でハイブリダィズする塩基配列を有し、 配列番号： 77で表されるアミ ノ酸を含有する蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードする DN A、 （4) 配列番号： 80で表される塩基配列を含有する DNA、 または配列 番号： 80で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイプリ ダイズする塩基配列を有し、 配列番号： 79で表されるアミノ酸を含有する蛋 白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードする DNA、 (5) 配列番 • 号： 82で表される塩基配列を含有する DNA、 または配列番号： 82で表わ される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイプリダイズする塩基配 列を有し.、 配列番号： 81,で表されるアミノ酸を含有する蛋白質と実質的に同 質の活性を有する蛋白質をコードする DNA、 (6) 配列番号： 84で表され · る塩基配列を含有する DNA、 または配列番号： 84で表わされる塩基配列と ハイストリンジェントな条件下でハイプリダイズする塩基配列を有し,、 配列 号： 83で表されるアミノ酸を含有する蛋白質と実質的に同質の活性を有する 蛋白質をコードする DN Aなどであれば何れのものでもよい。
配列番号： 74、 配列番号： 76、 配列番号： 78または配列番号： 80で 表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダィズできる DNAとしては、 例えば、 それぞれ配列番号： 74、 配列番号： 76、 配列番 号： 78または配列番号： 80で表わされる塩基配列と約 70%以上、 好まし くは約 80%以上、 より好ましくは約 90%以上、 さらに好ましくは約 95% 以上の相同性を有する塩基配列を含有する DNAなどが用いられる。
配列番号： 82で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハ イブリダィズできる DNAとしては、 例えば、 配列番号： 82で表わされる塩 基配列と 82%以上、 好ましくは約 85%以上、 より好ましくは約 90%以上、 さらに好ましくは約 95 %以上の相同性を有する塩基配列を含有する D N Aな どが用いられる。
配列番号： 84で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハ イブリダィズできる DNAとしては、 例えば、 配列番号： 84で表わされる塩 基配列と 92%以上、 好ましくは約 95%以上、 より好ましくは約 98%以上 の相同性を有する塩基配列を含有する DNAなどが用いられる。
ハイブリダィゼ一シヨンは、 公知の方法あるいはそれに準じる方法、 例えば、 Molecular Cloning 2nd (J. Sarabrook et al. , Cold Spring Harbor Lab.
■ Press, 1989) に記載の方法などに従って行なうことができる。 また、 市販のラ イブラリーを使用する場合、 添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうこ とができる。 より好ましくは、 ハイストリンジェントな条件に従って行なうこ とができる。 ハイストリンジェントな条件とは、 例えば、 ナトリウム濃度が約 19〜40 mM、 好ましくは約 19〜2 OmMで、 温度が約 50〜70°C、 好ましくは約
60-65 °Cの条件を示す。 特に、 ナトリゥム濃度が約 19 mMで温度が約 6 5 °Cの場合が最も好ましい。
より具体的には、 配列番号： 73で表わされるアミノ酸配列を含有する蛋白 質をコードする DNAとしては、 配列番号： 74で表わされる塩基配列を含有 する DNA、 配列番号.： 75で表わされるアミノ酸配列を含有する蛋白質をコ —ドする DNAとしては、 配列番号： 76で表わされる塩基配列を含有する D NA、 配列番号： 77で表わされるアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードす る DNAとしては、 配列番号： 78で表わされる塩基配列を含有する DNA、 配列番号： 79で表わされるアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードする DN Aとしては、 配列番号： 80で表わされる塩基配列を含有する DNA、，配列番 号： 81で表わされるアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードする DNAとし ては、 配列番号： 82で表わされる塩基配列を含有する DNA、 配列番号： 8 3で表わされるアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードする DNAとしては、 配列番号： 84で表わされる塩基配列を含有する DNAなどが用いられる。 本発明の受容体の部分ペプチドをコードする DN Aとしては、 前述した本発 明の受容体の部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいか なるものであってもよい。 また、 ゲノム DNA、 ゲノム DNAライブラリ一、 前記した細胞 ·組織由来の c DNA、 前記した細胞 ·組織由来の c DNAライ ブラリー、 合成 DNAのいずれでもよい。
本発明の受容体の部分べプチドをコードする D N Aとしては、 例えば、 (1) 配列番号： 74で表わされる塩基配列を有する DNAの部分塩基配列を 有する DNA、 または配列番号： 74で表わされる塩基配列と八イストリンジ ェントな条件下でハイブリダィズする塩基配列を有し、 配列番号： 73で表さ れるアミノ酸を含有する蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコード する DNAの部分塩基配列を有する DNA、 (2) 配列番号： 76で表わされ る塩基配列を有する DN Aの部分塩基配列を有する DNA、 または配列番号：
76で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダィズ する塩基配列を有し、 配列番号： 75で表されるアミノ酸を含有する蛋白質と 実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードする DNAの部分塩基配列を有す る DNA、 (3) 配列番号： 78で表わされる塩基配列を有する DNAの部分 塩基配列を有する DNA、 または配列番号： 77で表わされる塩基配列とハイ ストリンジェン卜な条件下でハイブリダィズする塩基配列を有し、 配列番号： 75で表されるアミノ酸を含有する蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白 質をコードする DNAの部分塩基配列を有する DNA、 （4) 配列番号： 80 で表わされる塩基配列を有する D N Aの部分塩基配列を有する D N A、 または 配列番号： 80で表わされる塩基配列とハイストリンジェン卜な条件下でハイ ブリダィズする塩基配列を有し、 配列番号： 79で表されるアミノ酸を含有す る蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードする DNAの部分塩基 配列を有する DNA、 (5) 配列番号： 82で表わされる塩基配列を有する D NAの部分塩基配列を有する DNA、 または配列番号： 82で表わされる塩基 配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダィズする塩基配列を有し、 配列番号： 81で表されるアミノ酸を含有する蛋白質と実質的に同質の活性を 有する蛋白質をコードする DNAの部分塩基配列を有する DNA、 (6) 配列 番号： 84で表わされる塩基配列を有する DNAの部分塩基配列を有する DN A、 または配列番号： 84で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条 件下でハイブリダィズする塩基配列を有し、 配列番号： 83で表されるァミノ 酸を含有する蛋白貧と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードする DNA の部分塩基配列を有する D N Aなどが用いられる。
配列番号： 74、 配列番号： 76、 配列番号： 78、 配列番号： 80、 配列 番号： 82または配列番号： 84で表わされる塩基配列とハイブリダィズでき る DNAは、 前記と同意義を示す。
ハイブリダイゼーションの方法およびハイストリンジェン卜な条件は前記と 同様のものが用いられる。
また、 本発明の受容体の部分べプチドをコ一ドする DNAとしてより具体的 には、 配列番号： 73で表されるアミノ酸配列中、 1番目 （Met) 〜43番目 (P e) 、 101番目 （Asn) 〜1 18番目 （Lys) 、 188番目 （Tyr) 〜21 3番目 （Arg) および 2 8 3番目 （Al a) 〜2 9 5番目 （l ie) で表される部分ァ ミノ酸配列から選択される 1または 2以上の部分アミノ酸配列を含有する部分 ペプチドをコードする塩基配列を有する D NAを含有する D NA、 またはこれ らとハイストリンジェン卜な条件下でハイプリダイズする塩基配列を有する NAを含有する D NAなどがあげられる。 .
' 本発明のポリペプチド、 受容体またはその部分ペプチドをコードする D N A は、 公知の方法で標識化されていてもよく、 具体的にはアイソトープラベル化 されたもの、 蛍光標識されたもの （例えば、 フルォレセインなどによる蛍光標 識） 、 ピオチン化されたものまたは酵素標識されたものなどがあげられる。 好 ましくはァイソトーブラベル化された本発明 ,のポリペプチドが用いられる。
本発明のポリペプチド、 受容体またはその部分ペプチド （以下、 これらポリ ぺプチド等をコードする D N Aのクローニングおよび発現の説明においては、 これらポリぺプチド等を単に本発明のポリぺプチドと略記する場合がある） を 完全にコードする D NAのクローニングの手段としては、 本発明のポリべプチ ドの部分塩基配列を有する合成 D N Aプライマ一を用いて公知の P C R法によ つて増幅するか、 または適当 ベクターに組み込んだ D N Aを本発明のポリぺ プチドの一部あるいは全領域をコードする D N A断片もしくは合成 D N Aを用 いて標識したものとのハイブリダイゼ一シヨンによつて選別することができる。 ハイブリダィゼ一シヨンの方法は、 例えば、 Molecul ar Cloning 2nd (J.
Sambrook et al. , Col d Spr ing Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法など に従って行なうことができる。 また、 市販のライブラリ一を使用する場合、 添 付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
D NAの塩基配列の変換は、 公知のキット、 例えば、 MutanTM-super Express Km (宝酒造 （株） ） 、 Mutan™- K (宝酒造 （株） ) 等を用いて、 OM-LA PCR法、 Gapped duplex法、 Kunkel法等の公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従つ て行なうことができる。
クローン化されたポリペプチドをコ一ドする D N Aは目的によりそのまま、 または所望により制限酵素で消化したり、 リンカーを付加したりして使用する ことができる。 該 D NAはその 5， 末端側に翻訳開始コドンとしての A T Gを 有し、 また 3' 末端側には翻訳終止コドンとしての TAA、 TGAまたは TA Gを有していてもよい。 これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、 適当な 合成 DNAアダプターを用いて付加することもでぎる。
本発明のポリペプチドの発現べクタ一は、 例えば、 （ィ） 本発明のポリぺプ チドをコードする DNAから目的とする DNA断片を切り出し、 （口） 該 DN A断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製 造することができる。
ベクターとしては、 大腸菌由来のプラスミド （例、 pBR 322， pBR3 25, pUC 12, pUC 13) 、 枯草菌由来のプラスミド （例、 pUB l l 0, TP 5, pC 194) 、 酵母由来プラスミド （例、 p SH 19, p SH 15) 、 λファージなどのバクテリオファージ、 レトロウイルス， ワクシニア 'ウィルス， バキュロウィルスなどの動物ウィルスなどの他、 pAl— 11、 p XT 1、 Rc/CMV, p R c/RS V、 p c DNA I/N e oなどが用い られる。 ， 1
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子,の発現に用いる宿主に対 応して適切なプロモ一夕一であればいかなるものでもよい。 例えば、 動物細胞 を宿主として用いる場合は、 SR aプロモータ一、 SV40プロモーター、 H I V · LTRプロモーター、 CMVプロモータ一、 HS V- TKプロモ一夕一な どがあげられる。
これらのうち、 CMV (サイトメガロウィルス） プロモ一夕一、 SRCKプロ モータ一などを用いるのが好ましい。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 t r pプロモータ一、 l a cプロモーター、 r e cAプロモーター、 λ PLプロ モーター、 l ppプロモーター、 T 7プロモータ一などが、 宿主がバチルス属 菌 ある場合は、 SP〇1プロモーター、 SPO 2プロモーター、 p enPプ ロモ一夕一など、 宿主が酵母である場合は、 PH05プロモータ一、 PGKプ 口モーター、 GAPプロモータ一、 ADH.プロモーターなどが好ましい。 宿主 が昆虫細胞である場合は、 ポリヘドリンプロモータ一、 P 10プロモーターな どが好ましい。
発現べクタ一には、 以上の他に、 所望によりェンハンサー、 スプライシング シグナル、 ポリ A付加シグナル、 選択マーカー、 SV40複製オリジン （以下、 S V40 o r iと略称する場合がある'） などを含有しているものを用いること ができる。 選択マーカーとしては、 例えば、 ジヒドロ葉酸還元酵素 （以下、 d h f rと略称する場合がある） 遺伝子 〔メソトレキセ一ト （MTX) 耐性〕 、 アンピシリン耐性遺伝子 （以下、 Amp 37と略称する場合がある） 、 ネオマイ シン耐性遺伝子 （以下、 Ne o r.と略称する場合がある、 G418耐性） 等が あげられる。 特に、 dh f r遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用いて dh f r遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、 目的遺伝子をチミジンを 含まない培地によっても選択できる。
また、 必要に応じて、 宿主に合ったシグナル配列を、 本発明のポリペプチド の N端末側に付加する。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 PhoA *シグナ ル配列、 0即 A ·シグナル配列などが、 宿主がバチルス属菌である場合は、 ひ一 アミラーゼ ·シグナル配列、 サブチリシン ·シグナル配列などが、 宿主が酵母 である場合は、 MFcK ·シグナル配列、 SUC2 ·シグナル配列など、 宿主が 動物細胞である場合には、 インシュリン ·シグナル配列、 α—^ fンターフェ口 ン ·シグナル配列、 抗体分子 ·シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明のポリペプチドをコードする DN Aを含有， するベクターを用いて、 形質転換体を製造することができる。
宿主としては、 例えば、 ェシエリヒア属菌、 バチルス属菌、 酵母、 昆虫細胞、 昆虫、 動物細胞などが用いられる。 ' ェシエリヒア属菌の具体例としては、 例えば、 ェシエリヒア ·コリ
(Escherichia coli) K 12 · DH 1 〔プロシ一ジングズ ·ォブ ·ザ ·ナショ ナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ユーエスエー （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 60巻， 160 (1968)〕 ， JM103 〔ヌクイレック .ァ シッズ · リサーチ （Nucleic Acids Research) , 9巻， 309 (1981)〕 , J Α22 1 〔ジャーナル ·ォブ ·モレキュラー。バイオロジー （Journal of Molecular Biology) 〕 , 120卷， 517(1978)〕 ， ΗΒ 101 〔ジャーナル .ォブ.モレキュ ラ一'バイオロジー， 41巻， 459 (1969)〕 ， C 600 〔ジェネティックス
(Genetics) , 39巻, 40(1954)] などが用いられる。 バチルス属菌としては、 例えば、 バチルス 'サブチルス （Bacillus subtilis) M I 1 14 〔ジーン， 24巻， 255 (1 983)〕 ， 207— 21 〔ジャーナル'ォブ ·バイオケミストリー （Journal of Biochemistry) ， 95 巻， 8.7 (1 984)〕 などが用いられる。
. 酵母としては、 例えば、 サッカロマイセス セレピシェ （Saccharomyces cerevisiae) AH 22, AH 22 R~, NA87 - 1 1 A, DKD—5D, 2 0B— 12、 シゾサッカロマイセス ボンべ （Schizosaccharomyces pombe) N CYC 19 1 3, NCYC 2036、 ピキア パス卜リス （Pichia astoris) KM 71などが用いられる。
昆虫細胞としては、 例えば、' ウィルスが Ac NPVの場合は、 夜盗蛾の幼虫 由来株化細胞 (Spodoptera frugiperda cell； S f細胞） 、 Trichoplusia niの 中腸由来の MG1細胞、 Trichoplusia niの卵由来の High Five™細胞、
Mamestra brassicae由来の細胞または Estigmena acrea由来の細胞などが用いら れる。 ウィルスが BmNPVの場合は、 蚕由来株化細胞 （Bombyx mori 細 胞； BmN細胞） などが用いられる。 該 S f細胞としては、 例えば、 S f 9細 胞 （ATCC CRL1711) 、 S f 2 1細胞 （以上、 Vaughn, J.L.ら、 イン ·ヴイボ (In Vivo) ，13， 213-217, (1977)) などが用いられる。
昆虫としては、 例えば、 カイコの幼虫などが用いられる 〔前由ら、 ネィチヤ 一 (Nature) ， 315卷， 592(1985)〕 。
動物細胞としては、 例えば、 サル細胞 COS— 7， Vero, チャイニーズハム ス夕一細胞 CHO (以下、 CHO細胞と略記） , dh ί r遺伝子欠損チヤィニ ーズハムスター細胞 CHO (以下、 CHO (dh f r— ) 細胞と略記） ， マウ ス L細胞， マウス A t T— '20， マウスミエローマ細胞， ラット GH3， ヒト FL細胞などが用いられる。 '
ェシエリヒア属菌を形質転換するには、 例えば、 プロシージングズ ·ォブ. ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ。サイェンジィズ ·ォブ ·ザ 'ユーエスェ . ― (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) ， 69巻， 2110 (1972)やジーン (Gene) , 17 巻， 107(1982)などに記載の方法に従って行なうことができる。
バチルス属菌を形質転換するには、 例えば、 モレキュラー 'アンド 'ジエネ ラル'ジェネティックス （Molecular & General Genetics) ， 168卷，
111 (1979)などに記載の方法に従つて行なうことができる。
酵母を形質転換するには、 例えば、 メソッズ'イン ·ェンザィモロジ一
(Methods in Enzymology) , 194巻, 182-187(1991)、 プロシ一ジングズ -ォ ブ 'ザ。ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ユーェ スェ一 （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) ， 75巻， 1929 (1978)などに記載の方法 に従って行なうことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、 例えば、 バイオ Zテクノロジ一 (Bio/Technology, 6, 47-55 (1988)) などに記載の方法に従って行なうことが できる。 ，
動物細胞を^質転換するには、 例えば、 細胞工学別冊 8 新細胞工学実験プ ロトコール. 263-267 (1995) (秀潤社発行） 、 ヴイロロジ一 （Virology) ， 52巻， 456(1973)に記載の方法に従って行なうことができる。
このようにして、 ポリペプチドをコードする DNAを含有する発現べクタ一 で形質転換された形質転換体を得ることができる。
宿主がェシエリヒア属菌、 バチルス属菌である形質転換体を培養する際、 培 養に使用される培地としては液体培地が適当であり、 その中には該形質転換体 の生育に必要な炭素源、 窒素源、 無機物その他が含有せしめられる。 炭素源と しては、 例えば、 グルコース、 デキストリン、 可溶性澱粉、 ショ糖など、 窒素 源としては、 例えば、 アンモニゥム塩類、 硝酸塩類、 コーンスチープ. リカー、 ペプトン、 カゼイン、 肉エキス、 大豆粕、 バレイショ抽出液などの無機または 有機物質、 無機物としては、 例えば、 塩化カルシウム、 リン酸二水素ナトリウ ム、 塩化マグネシウムなどがあげられる。 また、 酵母エキス、 ビタミン類、 成 長促進因子などを添加してもよい。 培地の pHは約 5〜8が望ましい。
ェシエリヒア属菌を培養する際の培地としては、 例えば、 グルコース、 カザ ミノ酸を含む M9培地 〔ミラー （Miller) , ジャーナル.ォブ 'ェクスぺリメ ンッ 'イン 'モレキュラー■ジェネティックス (Journal of Experiments in Molecular Genetics) , 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972〕 が好ましい。 ここに必要によりプロモータ一を効率よく働かせるために、 例えば、 3 i3—インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。 宿主がェシエリヒア属菌の場合、 培養は通常約 15〜43°Cで約 3〜24時 間行ない、 必要により、 通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、 培養は通常約 30〜40°Cで約 6〜24時間行 ない、 必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 バーク ホ一ルダー （Burkholder) 最小培地 〔Bostian, K. L. ら、 プロシージングズ. ォブ.'ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ 'ザ.ユー エスエー （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) ， 77巻， 4505 (1980)〕 や 0.5%カザミノ酸を含有する SD培地 [： Bitter, G. A. ら、 プロシージング . ズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ · ュ一エスエー （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) ， 81巻， 5330 (198 4) 〕 があげられる。 培地の pHは約 5〜 8に調整するのが好ましい。 培養は 通常約 20°C〜35°Cで約 24〜72時間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を 加える。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、 培地としては、 Grace s Insect Medium (Grace, T. ，ネィチヤ一
(Nature) ,195,788(1962)) に非動化した 10 %ゥシ血清等の添加物を適宜加 えたものなどが用いられる。 培地の pHは約 6. 2〜6. 4に調整するのが好 ましい。 培養は通常約 27°Cで約 3〜 5日間行ない、 必要に応じて通気や撹拌 を加える。 ,
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 約 5〜20%の胎児牛血清を含む MEM培地 〔サイエンス （Science) ， 122卷， 501 (1952)] , DMEM培地 〔ヴイロロジー (Virology) , 8巻， 396 (1959)〕 , RPMI 1640培地 〔ジャーナル ·ォブ ·ザ ·アメリカン ·メディカル ·ァ ソシ工一シ 'ヨン (The Journal of the American Medical Association) 199巻 519 (1967)3 ， 199培地 〔プロシージング 'ォブ 'ザ 'ソサイエティ 'フォ — 'ザ 'バイオロジカル.メディスン （Proceeding of the Society for the Biological Medicine) , 73巻， 1 (1950)〕 などが用いられる。 pHは約 6〜8 であるのが好ましい。 培養は通常約 3 0 °C〜4 0 °Cで約 1 5〜6 0時間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、 形質転換体の細胞内、 細胞膜または細胞外などに本発明 のポリペプチドを生成せしめることができる。
上記培養物から本発明のポリペプチドを分離精製するには、 例えば、 下記の 方法により行なうことができる。 '
本発明のポリペプチドを培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、 培 養後、 公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、 これを適当な緩衝液に懸濁し、 超音波、：リゾチームおよび/または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を 破壊したのち、 遠心分離やろ過によりポリペプチドの粗抽出液を得る方法など が適宜用いられる。 緩衝液の中に尿素や塩酸グァニジンなどの蛋白質変性剤や、 トリトン X— 1 0 0 TMなどの界面活性剤が含まれていてもよい。 培養液中にポ リペプチドが分泌される場合には、 培養終了後、 公知の方法で菌体あるいは細 胞と上清とを分離し、'上清を集める。
このようにして得られた培養上清、 あるいは抽出液中に含まれるポリべプチ ドの精製は、 公知の分離 ·精製法を適宜組み合わせて行なうことができる。 こ れらの公知の分離、 精製法としては、 塩析ゃ溶媒沈澱法などの溶解度を利用す る方法、 透析法、 限外ろ過法、 ゲルろ過法、 および S D S—ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、 イオン交換クロ マトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、 ァフィ二ティーク口マトダラ フィ一などの特異的親和性を利用する方法、 逆相高速液体クロマトグラフィー などの疎水性の差を利用する方法、 等電点電気泳動法などの等電点の差を利用 する方法などが用いられる。
かくして得られるポリペプチドが遊離体で得られた場合には、 公知の方法あ るいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、 逆に塩で得られた 場合には公知の方法あるいはそれに準じる方法により、 遊離体または他の塩に 変換することができる。
なお、 組換え体が産生するポリペプチドを、 精製前または精製後に適当な蛋 白修飾酵素を作用させることにより、 任意に修飾を加えたり、 ポリペプチドを 部分的に除去することもできる。 蛋白修飾酵素としては、 例えば、 トリプシン、 キモトリプシン、 アルギニルェンドぺプチダ一ゼ、 プロティンキナーゼ、 'グリ コシダーゼなどが用いられる。
本発明のポリペプチドまたは受容体に対する抗体 （以下、 単に本発明の 体 と称する場合がある） は、 本発明のポリペプチドまたは受容体を認識し得る抗 体であれば、 ポリクローナル抗体、 モノクロ一ナル抗体の何れであつてもよい。 本発明のポリベプチドまたは受容体に対する抗体は、 本発明のポリぺプチド または受容体を抗原として用い、 公知の抗体または抗血清の製造法に従って製 造することができる。
〔モノクローナル抗体の作 S〕 '
( a ) モノクローナル抗体産生細胞の^製
本発明のポリべプチまたは受容体ドは、 温血動物に対して投与により抗体産 生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に 際して抗体産生能を高めるため、 完全フロイントアジュバントや不完全フロイ ントアジュバントを投与してもよい。 投与は通常 2〜6週毎に 1回ずつ、 計 2 〜1 0回程度行われる。 用いられる温血動物としては、 例えば、 サル、 ゥサギ、 ィヌ、 モルモット、 マウス、 ラット、 ヒッジ、 ャギ、 ニヮトリがあげられるが、 マウスおよびラッドが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、 抗原で免疫された温血動物、 例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の 2〜 5日後に脾 臓またはリンパ節を採取し、 それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種 動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、 モノクローナル抗体産生ハイプリ ドーマを調製することができる。 抗血清中の抗体価の測定は、 例えば、 後記の 標識化ポリペプチドと抗血清とを反応させたのち、 抗体に結合した標識剤の活 性を測定することにより行なうことができる。 融合操作は既知の方法、 例えば、 ケ一ラーとミルスタインの方法 〔ネィチヤ一 （Nature) , 256、 495 (1975)〕 に 従い実施することができる。 融合促進剤としては、 例えば、 ポリエチレンダリ コール ( P E G) やセンダイゥィルスなどがあげられるが、 好ましくは P E G が用いられる。 '骨髄腫細胞としては、 例えば、 NS— 1、 P 3U1、 SP 2/0、 AP— 1 などの温血動物の骨髄腫細胞があげられるが、 P 3U1が好ましく用いられる。 用いられる抗体産生細胞 （脾臓細胞） 数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は 1 ： 1〜20 ： 1程度であり、 PEG (好ましくは PEG 1000〜PEG6 000) が 10〜 80 %程度の濃度で添加され、 20〜 40 °C、 好ましくは 3 0〜37°Cで 1〜10分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を 実施できる。
モノクローナル抗体産生ハイプリドーマのスクリーニングには瑋々の方法が 使用できるが、 例えば、 ポリペプチド （蛋白質） 抗原を直接あるいは担体とと もに吸着させた固相 （例、 マイクロプレート） にハイプリドーマ培養上清を添 加し、 次に放射性物質や酵素などで標識された抗免疫グロブリン抗体 （細胞融 合に用いられる細胞がマウスの場合、 坊マウス免疫グロプリン抗体が用いられ る） またはプロテイン Aを加え、 固相に結合したモノクローナル抗体を検出す る方法、 抗免疫グロブリン抗体またはプロテイン Aを吸着させた固相にハイブ リドーマ培養上清を添加し、 放射性物質や酵素などで標識されたポリペプチド を加え、 固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などがあげられる。 モノクローナル抗体の選別は、 公知あるいはそれに準じる方法に従って行な うことができる。 通常 HAT (ヒポキサンチン、 アミノプテリン、 チミジン） を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。 選別および育種用培地とし ては、 ハイプリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。 例えば、 1~20%、 好ましくは 10~20%の牛胎児血清を含む RPMI 1 640培地、 1〜 10 %の牛胎児血清を含む G I T培地 （和光純薬工業
(株） ） あるいはハイプリドーマ培養用無血清培地 （SFM— 101、 日水製 薬 （株） ） などを用いることができる。 培養温度は、 通常 20〜40°C、 好ま しくは約 37 °Cである。 培養時間は、 通常 5日〜 3 間、 好ましくは 1週間〜 2週間である。 培養は、 通常 5%炭酸ガス下で行なうことができる。 ハイプリ ドーマ培養上清の抗体価は、 上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定 できる。
(b) モノクローナル抗体の精製 モノクローナル抗体の分離精製は、 公知の方法、 例えば、 免疫グロブリンの 分離精製法 〔例、 塩析法、 アルコール沈殿法、 等電点沈殿法、 電気泳動法、 ィ オン交換体 （例、 D E A E) による吸脱着法、 超遠心法、 ゲルろ過法、 抗原結 合固相あるいはプロテイン Aあるいはプロテイン Gなどの活性吸着剤により抗 体のみを採取し、 結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕 に従って行なう ことができる。
〔ポリクロ一ナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、 公知あるいはそれに準じる方法に従って製 造することができる。 例えば、 免疫お原 （ポリペプチド抗原） 自体、 あるいは それとキャリアー蛋白質との複合体をつくり、 上記のモノクローナル抗体の製 造法と同様に温血動物に免疫を行ない、 該免疫動物から本発明のポリペプチド に対する抗体含有物を採取して、 抗体の分離精製を行なうことにより製造する ことができる。
温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキヤリァー蛋白質との複合 体に関し、 キヤリァ一蛋白質の種類およびキヤリァ一とハプテンとの混合比は、 キャリア一に架橋させて免疫したハプテンに対して抗^が効率良くできれば、 どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、 例えば、 ゥシ血清アルブ ミンゃゥシサイログロブリン、 へモシァニン等を重量比でハプテン 1に対し、 約 0 . 1〜2 0、 好ましくは約 1〜5の割合でカプルさせる方法が用いられる。 また、 ハプテンとキャリアーの力プリングには、 種々の縮合剤を用いること ができるが、 ダルタルアルデヒドやカルポジイミド、 マレイミド活性エステル、 チオール基、 ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。 縮合生成物は、 温血動物に対して、 抗体産生が可能な部位にそれ自体あるい は担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能を高めるため、 完全フロイントアジュバントゃ不完全フロイントアジュバントを投与してもよ い。 投与は、 通常約 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計約 3〜1 0回程度行なわれる。 ポリクローナル抗体は、 上記の方法で免疫された温血動物の血液、 腹水など、 好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、 上記の抗血清中の抗体価の測定 と同様にして測定できる。 ポリクローナル抗体の分離精製は、 上記のモノクロ ーナル抗体の分離精製と同様の免疫グロプリンの分離精製法に従って行なうこ とができる。
本発明のポリべプチド、 受容体またはその部分ペプチドをコードする D N A (以下、 これらの DN Aを本発明の DN Aと略記する場合がある） に相補的な、 または実質的に相補的な塩基配列を有するアンチセンスポリヌクレオチド （好 ましくは DNA) (以下、 アンチセンス DNAと略記する場合がある） として は、 本発明の DNAに相補的な、 または実質的に相補的な塩基配列を有し、 該 DNAの発現を抑制し る作用を有するものであれば、 いずれのアンチセンス DNAであづてもよい。
本発明の DNAに実質的に相補的な塩基配列とは、 例えば、 本発明の DNA に相補的な塩基配列 （すなわち、 本発明の DNAの相補鎖） の全塩基配列ある いは部分塩基配列と約 70%以上、 好ましくは約 80%以上、 より好ましくは 約 90%以上、 最も好ましくは約 95%以上の相同性を有する塩基配列などが あげられる。 特に、 本発明の DNAの相補鎖の全塩基配列うち、 本発明のポリ ペプチドの Ν末端部位をコードする部分の塩基配列 （例えば、 開始コドン付近 ■ の塩基配列など） の相補鎖と約 70%以上、 好ましくは約 80%以上、 より好 ましくは約 90%以上、 最も好ましくは約 95%以上の相同性を有するアンチ センス DNAが好適である。 これらのアンチセンス は、 公知の DNA合 成装置などを用レ ^て製造することができる。
本発明のアンチセンス DNAは、 変化せしめられたり、 修飾された糖、 塩基、 結合を含有していて良く、 リボゾーム、 ミクロスフエアのような特殊な形態で 供与されたり、 遺伝子治療により適用されたり、 付加された形態で与えられる ことができうる。 こうして付加形態で用いられるものとしては、 リン酸基骨格 の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、 細胞膜との 相互作用を高めたり、 核酸の取込みを増大せしめるような脂質 （例えば、 ス ホリピド、 コレステロールなど） といった疎水性のものが挙げられる。 付加す るに好ましい脂質としては、 コレステロールやその誘導体 （例えば、 コレステ リルクロ口ホルメート、 コール酸など） が挙げられる。 こうしたものは、 核酸 の 3 '端あるいは 5 '端に付着させることができ、 塩基、 糖、 分子内ヌクレオシ ド結合を介して付着させることができうる。 その他の基としては、 核酸の 3 '端 あるいは 5 '端に特異的に配置されたキヤップ用の基で、 ェキソヌクレアーゼ、 R N a s eなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。 こうしたキャップ用の基としては、 ポリエチレングリコール、 テトラエチレン グリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護 基が挙げられるが、 それに限定されるものではない。
アンチセンス D N Aの阻害活性は、 本発明の形質転換体、 本発明の生体内や 生体外の遺伝子発現系、 あるいは本発明のぺプチドまたは受容体の生体内や生 体外の翻訳系を用いて調べることができる。 以下に、 （a) 本発明のポリペプチド、 （b) 本発明の受容体 （以下、 その部 分ペプチドも含む） 、 （c) 本発明の D N A、 (d) 本発明の抗体および （e) 本 発明のアンチセンス D N Aなどの用途を説明する。
( 1 ) 本発明のポリぺプチドが関与する疾患の予防 ·治療剤
本発明のポリペプチドは、 本発明の受容体 （例、 GPR8、 GPR7, ラット TGR26、 マウス TGR26、 ゥサギ GPR8、 ゥサギ GPR7など） などの発現細胞の細胞剌激活性を 有し、 本発明の受容体の内因性リガンドである。
本発明のポリペプチドまたは本発明の D N Aに異常があったり、 欠損してい る場合、 または本発明の受容体または該受容体をコードする D NAに異常があ つたり、 欠損している場合には、 例えば、 蓄尿障害 〔例、 頻尿、 尿失禁 （例、 切迫性尿失禁、 腹圧性尿失禁、 機能性尿失禁など） など〕 、 多尿症、 尿崩症 (例、 下垂体性尿崩症、 腎性尿崩症など） 、 高ナトリウム血症、 代謝性アル力 ローシス、 低カリウム血症、 Gushing症候群などとなる可能性が高い。 従って、 本発明のポリペプチドおよび本発明の D NAは、 例えば、 抗利尿剤として使用 することができ、 例えば、 蓄尿障害 〔例、 頻尿、 尿失禁 （例、 切迫性尿失禁、 鹰圧性尿失禁、 機能性尿失禁など） など〕 、 多尿症、 尿崩症 （例、 下垂体性尿 崩症、 腎性尿崩症など） 、 高ナトリウム血症、 代謝性アルカロ一シス、 低カリ ゥム血症、 Cushing症候群などの予防 '治療剤として使用することができる。 好 ましくは、 尿失禁 （例、 切迫性尿失禁、 腹圧性尿失禁、 機能性尿失禁など） 、. 多尿症、 尿崩症 （例、 下垂体性尿崩症、 腎性尿崩症など） 、 高ナトリウム血症、 代謝性アルカロ一シス、 低カリウム血症、 Cushing症候群などの予防 '治療剤で ある。 '
本発明のポリペプチドおよび本発明の D N Aは、 例えば、 生体内において本 発明のポリペプチドが減少あるいは欠損している患者がいる場合に、 （ィ） 本 発明の D NAを該患者に投与し、 生体内で本発明のポリペプチドを発現させる ことによって、 （口） 細胞に本発明の D NAを挿入し、 本発明のポリペプチド を発現させた後に、 該細胞を患者に移植することによって、 たは （ハ） 本発 明のポリべプチドを該患者に投与することなどによって、 該患者における本発 明のポリペプチドの役割を十分に、 あるいは正常に発揮させることができる。 本発明の D NAを上記の予防 ·治療剤として使用する場合は、 該 D NAを単 独あるいはレトロウイルスベクタ一、 アデノウイルスベクタ一、 アデノウィル スァソシェ一テッドウィルスベクタ一などの適当なベクターに揷入した後、 常 套手段に従って、 ヒトまたは温血動物に投与することができる。.本発明の D N Αは、 そのままで、 あるいは摂取促進のための補助剤などの生理学的に認めら れる担体'とともに製剤化し、 遺伝子銃やハイド口ゲルカテーテルのようなカテ 一テルによって投与できる。 '
本発明のポリペプチドを上記の予防 ·治療剤として使用する場合は、 少なく とも 9 0 %、 好ましくは 9 5 %以上、 より好ましくは 9 8 %以上、 さらに好ま しくは 9 9 %以上に精製されたものを使用するのが好ましい。
本発明のポリペプチドは、 例えば、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセ ル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤などとして経口的に、 あるいは水も しくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液剤など の注射剤の形で非経口的 （好ましくは皮下投与） に使用できる。 例えば、 本発 明のポリペプチドを生理学的に認められる担体、 香味剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される 単位用量形態で混和することによって製造することができる。 これら製剤にお ける有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものであ る。 .
錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えば、 ゼ ラチン、 コーンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性 セルロースのような賦形剤、 コ一ンス夕一チ、 ゼラチン、 アルギン酸などのよ うな膨化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖または サッカリンのような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリーのよう な香味剤などが甩いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 前記夕 イブの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。 注射のた めの無菌組成物は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油な どのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施 に従って処方することができる。
注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬 を含む等張液 （例えば、 D—ソルビトール、 D—マンニトール、 塩ィ匕ナトリウ ムなど） などがあげられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール （例えば、 エタノールなど） 、 ポリアルコール （例えば、 プロピレングリコール、 ポリエ チレングリコールなど） 、 非イオン性界面活性剤 （例えば、 ポリソルべ一ト 8 0™、 H C O— 5 0など） などと併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油などがあげられ、 溶解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジ ルアルコールなどと併用してもよい。 また、 緩衝剤 （例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢酸ナトリウム緩衝液など） 、 無痛化剤 （例えば、 塩化ベンザルコニゥム、：塩 酸プロ力インなど） 、 安定剤 （例えば、 ヒト血清アルブミン、 ポリエチレング ： リコ一ルなど） 、 保存剤 (例えば、 ベンジルアルコール、 フエノールなど） 、 酸化防止剤などと配合してもよい。 調製された注射液は、 通常、 適当なアンプ ルに充填される。
本発明の D NAが挿入されたベクターも上記と同様に製剤化され、 通常、 非 経口的に使用される。
このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトま たは温血動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 トリ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ'、 ィヌ、 サル、 など） に対して投与することができる。 本発明のポリペプチドの投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ルートなどに より差異はあるが、 例えば、 尿崩症の治療の目的で本発明のポリペプチドを皮 下投与する場合、 一般的に成人 （60kgとして） においては、 一日につき該ポリ ペプチドを約 0. l〜100mg、 好ましくは約 1. 0〜50mg、 より好ましくは約 1. 0〜 20mg投与する。 他の動物の場合も、 60kg当たりに換算した量を投与することが' できる。
( 2 ) 利尿または抗利尿作用を有する医薬候補化合物のスクリ一二ング 本発明のポリぺプチドは本発明の受容体のリガンドとしての機能などを有す るため、 本発明のポリペプチドまたは本発明の ¾容体の機能を促進する化合物 またはその塩は、 例えば、 抗利尿剤などとして有用であり、 蓄尿障害 〔例、 頻 尿、 尿失禁 （例、 切迫性尿失禁、 腹圧性尿失禁、 機能性尿失禁など） など〕 、 多尿症、 尿崩症 （例、 下垂体性尿崩症、 腎性尿崩症など） 、 高ナトリウム血症、 代謝性アルカローシス、 低カリウム血症、 Cushing症候群などの予防 ·治療剤な どとして使用できる。 好ましくは、 尿失禁 （例、 切迫性尿失禁、 腹圧性尿失禁、 機能性尿失禁など） 、 多尿症、 尿崩症 （例、 下垂体性尿崩症、 腎性尿崩症な ど） 、 高ナトリウム血症、 代謝性アルカローシス、 低カリウム血症、 Cush ing症 候群などの予防。治療剤である。
一方、 本発明のポリペプチドまたは本発明の受容体の機能を阻害する化合物 またはその塩は、 例えば利尿剤として有用であり、 腎性浮腫、 尿排出障害 （例、 '膀胱収縮障害、 尿道通過障害、 排尿困難、 排尿痛、 尿路閉塞など） 、 低ナトリ ゥム血症、 抗利尿ホルモン分泌不適症候群 （SIADH) 、 高血圧などの予防 ·治療 '剤などとして使用できる。
該スクリーニングは、 本発明のポリペプチドを用いるか、 または組換え型本 発明のポリペプチドの発現系を構築し、 該発現系を用いたレセプ夕一結合アツ セィ系を用いることによって、 本発明のポリペプチドとその受容体との結合性 を変化させる化合物 （本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合 物、 本発明の受容体の活性を促進または阻害する化合物） （例、 ペプチド、 蛋 白質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物など） またはその塩をス クリーニングすることができる。 このような化合物には、 本発明の受容体を介 して細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +遊離、 細胞内 AM P生成 Z抑制、 細胞内 c GM P生成、 イノシトール リン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c一 f o sの活性化、 p Hの低下、 G T P T S結合活性などを促進する活性など） を有する化合物 (即ち本発明のポリペプチドの受容体ァゴニスト） と該細胞刺激活性を有しな い化合物 （即ち本発明のポリペプチドの受容体アンタゴニスト） などが含まれ る。 「本発明のポリペプチドとの結合性を変化させる」 とは、 本発明のポリべ プチドとの結合を阻害する場合と本発明のポリぺプチドとの結合を促進する場 合の両方を包含するものである。
本発明のポリペプチドおよびンまたは本発明の受容体を用いることを特徴と する、 本発明のポリペプチドまたは本発明の受容体の活性を促進または阻害す る化合物またはその塩のスクリーニング方法の具体例としては、 （i) 本発明の 受容体に、 本発明のポリペプチドを接触させた場合と （i i) 上記した本発明の 受容体に、 本発明のポリペプチドおよび試験化合物を接触させた場合との比較 を行なうことを特徴とする本発明のポリペプチドと本発明の受容体の結合性を 変化させる化合物 （本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合 物） またはその塩のスクリーニング方法が挙げられる。
上記スクリーニング方法においては、 （i) 上記した本発明の受容体に、 本発 明のポリペプチドを接触させた場合と （i i) 上記した本発明の受容体に、 本発 明のポリペプチドおよび試験化合物を接触させた場合における、 例えば該本発 明の受容体に対する該ポリペプチドの結合量、 細胞刺激活性などを測定して、 比較する。
上記スクリーニング方法のさらなる具体例としては、
(a) 標識された本発明のポリペプチドを、 上記した本発明の受容体に接触させ た場合と、 標識された本発明のポリペプチドおよび試験化合物を本発明の受容 体に接触させた場合における、 標識された本発明のポリペプチドの本発明の受 容体に対する結合量を測定し、 比較することを特徴とする本発明のポリべプチ ドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物 （本発明のポリペプチドの 活性を促進または阻害する化合物） またはその塩のスクリ一ニング方法、
(b) 標識された本発明のポリペプチドを、 本発明の受容体を 有する細胞また は該細胞の膜画分に接触させた場合と、 標識された本発明のポリペプチドおよ び試験化合物を本発明の受容体を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触さ せた場合における、 標識された本発明のポリペプチドの該細胞または該膜画分 に対する結合量を測定し、 比較することを特徴とする本発明のポリペプチドと 本発明の受容体との結合性を変化させる化合物 （本発明のポリペプチドの活性 を促進または阻害する化合物） またはその塩のスクリーニング方法、
(c) .標識された本発明のポリペプチドを、 本発明の受容体をコードする D NA を含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明の受 容体に接触させた場合と、 標識された本発明のポリぺプチドおよび試験化合物 を本発明の受容体をコードする D NAを含有する形質転換体を培養することに よって細胞膜上に発現した本発明のポリぺプチドの受容体に接触させた場合に おける、'標識された本発明のポリペプチドの本発明の受容体に対する結合量を 測定し、 比較することを特徴とする本発明のポリペプチドと本発明の受容体と の結合性を変化させる化合物 （本発明のポリべプチドの活性を促進または阻害 する化合物） またはその塩のスクリーニング方法、
(d) 本発明の受容体を活性化する化合物 （例えば、 本発明のポリペプチド） を 本発明の受容体を含有する細胞に接触させた場合と、 本発明の受容体を活性化 する化合物および試験化合物を本発明の受容体を含有する細胞に接触させた場 合における、 本発明の受容体を介した細胞刺激活性 （例えば、 ァラキ 'ドン酸遊 離、 ァセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +遊離、 細胞内 C AM P生成 Z抑制、 細 胞内 c GM P生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質 のリン酸化、 c— f o sの活性化、 p Hの低下、 G T P r S結合活性などを促 進する活性または抑制する活性など） を測定し、 比較することを特徴とする本 発明のポリペプチドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物 （本発明 のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物） またはその塩のスクリー ニング方法、 および
(e) 本発明の受容体を活性化する化合物 （例えば、 本発明のポリペプチドな ど） を本発明の受容体をコ一ドする DN Aを含有する形質転換体を培養するこ とによって細胞膜上に発現した本発明の受容体に接触させた場合と、 本発明の 受容体を活性化する化合物および試験化合物を、 本発明の受容体をコードする D N Aを含有する形質転換体を培養することによ て細胞膜上に発現した本発 明の受容体に接触させた場合における、 本発明の受容体を介する細胞刺激活性 (例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 Ca2+遊離、 細胞 内 cAMP生成ノ抑制、 細胞内 cGMP生成、 イノシト ルリン酸産生、 細胞 膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c一 : f o sの活性化、 pHの低下、 G TPァ S結合活性などを促進する活 または抑制する活性など） を測定し、 比 較することを特徴とする本発明のポリぺプチドと本発明の受容体との結合性を 変化させる化合物 （本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合 物） またはその塩のスクリーニング方法などである。
標識された本発明のポリペプチドの好ましい具体例は、 〔1251〕 でそれぞれ標 識された配列番号： 1、 配列番号： 2、 配列番号： 7、 配列番号： 8、 配列番 号： 9、 配^番号： 10、 配列番号： 1 1、 配列番号： 12、 配列番号： 21、 配列番号： 24、 配列番号： 25、 配列番号： 30、 配列番号： 31、 配列番 号： 36、 配列番号： 37、 配列番号： 40、 配列番号： 41、 配列番号： 4 2、 配列番号： 43、 配列番号： 44、 配列番号： 45、 配列番号： 46、 配 列番号： 47、 配列番号： 48、 配列番号： 49、 配列番号： 50、 配列番 号： 51、 配列番号： 52、 配列番号： 53、 配列番号： 54、 配列番号.： 5 5、 配列番号： 56、 配列番号： 57、 配列番号： 58、 配列番号： 71また は配列番号： 85で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドなどが挙げら れる。
上記スクリーニング方法の具体的な説明を以下にする。
まず、 本発明のスクリーニング方法に用いる本発明の受容体としては、 本発 明のポリぺプチドをリガンドとして認識するものであれば何れのものであつて もよいが、 ヒトゃ温血動物の臓器の膜画分などが好適である。 しかし、 特にヒ ト由来の臓器は入手が極めて困難なこ から、 スクリーニングに用い れるも のとしては、 組換え体を用いて大量発現させた本発明の受容体などが適してい る。
本発明の受容体を製造するには、 前述の製造方法などが用いられる。
本発明のスクリーニング方法において、 本発明の受容体を含有する細胞ある いは該細胞膜画分などを用いる場合、 後述の調製法に従えばよい。
本発明の受容体を含有する細胞を用いる場合、 該細胞をダルタルアルデヒド、 'ホルマリンなどで固定化してもよい。 固定化方法は公知の方法に従って行うこ とができる。 ·
本発明の受容体を含有する細胞としては、 本発明の受容体を発現した宿主細 胞をいうが、 該宿主細胞としては、 前述の大腸菌、 枯草菌、 酵母、 昆虫細胞、 動物細胞などが挙げられる。 また、 本発明の受容体を発現した宿主細胞は、 前 述の本発明のポリペプチドを含有する発現べクタ一で形質転換された形貲転換 体の製造方法と同様の方法などがあげられる。
膜画分としては、 細胞を破碎した後、 公知の方法で得られる細胞膜が多く含 まれる画分のことをいう。 細胞の破碎方法としては、 Po t ter— Elvehj em型ホモ ジナイザーで細胞を押し潰す方法、 ワ リンダブレンダ一やポリトロン
(Kinemat i ca社製） による破砕、 超音波による破碎、 フレンチプレスなどで加 圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破碎などがあげられる。 細胞膜の分画には、 分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による 分画法が主として用いられる。 例えば、 細胞破碎液を低速 （500〜3000卬111) で 短時間 （通常、 約 1〜10分） 遠心し、 上清をさらに高速 （15000〜30000rpm) で 通常 3 0分〜 2時間遠心し、 得られる沈澱を膜画分とする。 該膜画分中には、 発現した本発明の受容体と細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く 含まれる。
該本発明の受容体を含有する細胞や膜画分中の本発明の受容体の量は、 1細胞 当たり 103〜108分子であるのが好ましく、 105〜107分子であるのが好適である。 なお、 発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性 （比活性） が高くな り、 高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、 同一ロット で大量の試料を測定できるようになる。
本発明のポリペプチドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物 （本 発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物） をスクリーニングす る前記の （a) 〜 （c) を実施するために'は、 適当な本発明の受容体画分と、 標 識された本発明のポリペプチドなどが用いられる。 本発明の受容体画分として は、 天然型の本発明の受容体画分か、 またはそれと同等の活性を有する組換え 型本発明の受容体画分などが望ましい。 ここで、 同等の活性とは、 同等のリガ ンド結合活性などを示す。 標識されたポリペプチドとしては、 例えば 〔¾〕 、 〔1251〕 、 〔14C〕 、 C35S] などで標識されたポリペプチドなどを利用すること ができる。 このうち好ましくは、 〔1251〕 で標識されたポリペプチドである。 具体的には、 本発明のポリペプチドと本発明の受容体との結合性を変化させ る化合物のスクリーニングを行うには、 まず本発明の受容体を含有する細胞ま たは細胞の膜画分を、 スクリーニングに適したバッファ一に懸濁することによ りレセプ夕一標品を調製する。 バッファ一には、 pH4〜10 (望ましくは p H6〜8) のリン酸バッファー、 トリス一塩酸バッファ一などのリガンドとレ セプ夕一との結合を阻害しないバッファ一であればいずれでもよい。 また、 非 特異的結合を低減させる目的で、 CHAPS、 Twe e n— 80TM (花王—ァ トラス社) 、 ジギトニン、 デォキシコレートなどの界面活性剤をバッファ一に 加えることもできる。 さらに、 プロテアーゼによる本発明の受容体や本発明の ポリペプチドの分解を抑える目的で PMS F、 ロイぺプチン、 E—64 (ぺプ チド研究所製） 、 ぺプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加することもで きる。 0.01〜10mlの該レセプ夕一溶液に、 一定量 （5000〜500000cpm) の標識さ れた本発明のポリペプチドを添加し、 同時に 10— 1D〜1(T7Mの試験化合物を共存さ せる。 非特異的結合量 （NSB) を知るために大過剰の未標識の本発明のポリ ペプチドを加えた反応チューブも用意する。 反応は 0〜50°C、 望ましくは 4〜 37°Cで 20分〜 24時間、 望ましくは 30分〜 3時間行う。 反応後、 ガラス繊維濾紙等 で濾過し、 適量の同バッファーで洗浄した後、 ガラス繊維濾紙に残存する放射 活性を液体シンチレーシヨンカウンターまたはァーカウンタ一で計測する。 拮 抗する物質がない場合のカウント（B。） から非特異的結合量 （NSB) を引い たカウント （B。一 NSB) を 100%とした時、 特異的結合量 （B— NSB) が 例えば 50%以下になる試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択す ることができる。
本発明のポリペプチドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物 （本 発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物） をスクリーニングす る前記の （d) 〜 （e) の方法を実施するためには、 本発明の受容体を介する細 胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 + 遊離、 細胞内 c AM P生成 Z抑制、 細胞内 c GM P生成、 イノシトールリン酸 産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c一 f o sの活性化、 p H の低下、 G T Pァ S結合活性などを促進する活性または抑制する活性など） を 公知の方法または市販の測定用キットを用いて測定することができる。 具体的 には、 まず、 本発明の受容体を含有する細胞をマルチウエルプレート等に培養 する。 スクリーニングを行うにあたっては前もつて新鮮な培地あるいは細胞に 毒性を示さない適当なバッファーに交換し、 試験化合物などを添加して一定時 間インキュベートした後、 細胞を抽出あるいは上清液を回収して、 生成した産 物をそれぞれの方法に従って定量する。 細胞刺激活性の指標とする物質 （例え ば、 ァラキドン酸など） の生成が、 細胞が含有する分解酵素によって検定困難 な場合は、 該分解酵素に対する阻害剤を添加してアツセィを行なってもよい。 また、 c AM P産生抑制などの活性については、 フオルスコリンなどで細胞の 基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出するこ とができる。
細胞刺激活性を測定してスクリーニングを行なうには、 適当な本発明の受容 体を発現した細胞が必要である。 本発明の受容体を発現した細胞としては、 前 述の本発明の受容体発現細胞株などが望ましい。
試験化合物としては、 例えばペプチド、 蛋白質、 非ペプチド性化合物、 合成 化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液などがあげら れる。
本発明のポリペプチドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物 （本 発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物） またはその塩のスク リーニング用キットは、 本発明の受容体またはその塩、 本発明の受容体の部分 ペプチドまたはその塩、 本発明の受容体を含有する細胞、 あるいは本発明の受 容体を含有する細胞の膜画分、 および本発明のポリペプチドを含有するもので ある。. '
本発明のスクリーニング用キットの例としては、 次のものが挙げられる。
1. スクリーニング用試薬
(a) 測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Hanks' Balanced Salt Solution (ギブコ社製） に、 0.05%のゥシ血清ァ ルブミン (シグマ社製) を加えたもの。
孔径 0.45 mのフィルタ一で濾過滅菌し、 4°Cで保存するか、 あるいは用 時調製しても良い。
(b) 本発明の受容体標品
本発明の受容体を発現させた CHO細胞を、 12穴プレートに 5 X 105個 /穴で継代し、 37 、 5 %C02、 95 % a i rで 2日間培養したもの。
(c) 標識リガンド
〔¾〕 、 〔 I〕 、 〔14C〕 、 〔 〕 などで標識された本発明のポリペプチドを 適当な溶媒または緩衝液に溶解したものを 4°Cあるいは— 20 にて保存し、 用時に測定用緩衝液にて 1 Mに希釈する。
(d) リガンド標準液
本発明のポリペプチドを 0.1 %ゥシ血清アルブミン （シグマ社製） を含む P ' B Sで ImMとなるように溶解し、 — 20°Cで保存する。
. 2. 測定法
(a) 12穴組織培養用プレートにて培養した本発明の受容体を発現させた細胞 を、 測定用緩衝液 1 m 1で 2回洗浄した後、 490 1の測定用緩衝液を各穴 に加える。
(b) 10— 3〜10—1DMの試験化合物溶液を 5 21加えた後、 標識された本 ¾明のべ プチドを 5 1加え、 室温にて 1時間反応させる。 非特異的結合量を知るため には試験ィヒ合物の代わりに 10一3 Mの本発明のポリペプチドを 5 ^ 1加えてお
(c) 反応液を除去し、 lmlの洗浄用緩衝液で 3回洗浄する。 細胞に結合した 標識された本発明のポリペプチドを 0.2N NaOH— 1 %SDSで溶解し、 4m 1の液体シンチレーター A (和光純薬製） と混合する。
(d) 液体シンチレ一シヨンカウンタ一 （ベックマン社製） を用いて放射活性を 測定し、 Percent Maximum Binding (PMB) を次の式 〔数 1〕 で求める。 〔数 1〕
PMB= [ (B-NSB) Z (B。— NSB) ] X 100
PMB： Percent Maximum Binding
B ：検体を加えた時の値
NSB： Non-specific Binding (非特異的結合量）
B。 ：最大結合量
上記スクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化 合物またはその塩は、 本発明のポリぺプチドと本発明の受容体との結合を変化 させる （結合を阻害あるいは促進する） 化合物 （本発明のポリペプチドの活性 を促進または阻害する化合物） であり、 具体的には本発明の受容体を介して細 胞剌激活性を有する化合物またはその塩 （いわゆる本発明の受容体ァゴニス ト） 、 あるいは該剌激活性を有しない化合物 （いわゆる本発明の受容体アンタ ゴニスト） である。 該化合物としては、 ペプチド、 蛋白質、 非ペプチド性化合 物、 合成化合物、 発酵生産物などが挙げられ、 これら化合物は新規な化合物で あってもよいし、 公知の化合物であってもよい。
上記本発明の受容体ァゴニストであるかアンタゴニストであるかの具体的な 評価方法は以下の （i),または （ii) に従えばよい。
(0前記 (a) 〜 (c) のスクリーニング方法で示されるバインディング ·アツ セィを行い、 本発明のポリぺプチドと本発明の受容体との結合性を変化させる (特に、 結合を阻害する） 化合物を得た後、 該化合物が上記した本発明の受容 体を介する細胞刺激活性を有しているか否かを測定する。 細胞刺激活性を有す る化合物またはその塩は本発明の受容体ァゴニストであり、 該活性を有しない 化合物またはその塩は本発明の受容体アン夕ゴニストである。
(ii) (a)試験化合物を本発明の受容体を含有する細胞に接触させ、 上記本発明 の受容体を介した細胞刺激活性を測定する。 細胞刺激活性を有する化合物また はその塩は本発明の受容体ァゴニストである。 (b) 本発明の受容体を活性化する化合物 （例えば、 本発明のポリペプチドまた は本発明の受容体ァゴニストなど） を本発明の受容体を含有する細胞に接触さ せた場合と、 本発明の受容体を活性化する化合物および試験化合物を本発明の 受容体を含有する細胞に接触させた場合における、 本発明の受容体を介した細 胞剌激活性を測定し、 比較する。 本発明の受容体を活性化する化合物による細 胞刺激活性を減少させ得る化合物またはその塩は本発明の受容体アン夕ゴニス トである。
上記本発明の受容体ァゴニストは、 本発明の受容体に対する本発明のポリべ プチドが有する生理活性と同様の作用を有しているので、 本発明のポリべプチ ドと同様に抗利尿剤として有用であり、 安全で低毒性な、 蓄尿障害 〔例、 頻尿、 尿失禁 （例、 切迫性尿失禁、 腹圧性尿失禁、 機能性尿失禁など） など〕 、 多尿 症、 尿崩症 （例、 下垂体性尿崩症、 腎性尿崩症など） 、 高ナトリウム血症、 代 謝性アルカローシス、 低カリウム血症、 Cushing症候群などの予防 ·治療剤など として使用することができる。 好ましくは、 尿失禁 （例、 切迫性尿失禁、 腹圧 性尿失禁、 機能性尿失禁など） 、 多尿症、 尿崩症 （例、 下垂体性尿崩症、 腎性 尿崩症など） 、 高ナトリウム血症、 代謝性アルカロ一シス、 低カリウム血症、 Cushing症候群などの予防 ·治療剤などとして使用することができる。
上記本発明の受容体アン夕ゴニストは、 本発明の受容体に対する本発明のポ リぺプチドが有する生理活性を抑制することができるので、 利尿剤として有用 であり、 安全で低毒性な、 腎性浮腫、 尿排出障害 （例、 膀胱収縮障害、 尿道通 過障害、 排尿困難、 排尿痛、 尿路閉塞など） 、 低ナトリウム血症、 抗利尿ホル モン分泌不適症候群 （SIADH) 、 高血圧などの予防 ·治療剤などして使用するこ とができる。
本発明のスクリ一ニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られ る化合物またはその塩は、 例えば、 ペプチド、 蛋白質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血漿な どから選ばれた化合物であり、 本発明のポリぺプチドの活性または機能を促進 または阻害する化合物である。
該化合物の塩としては、 前記した本発明のポリペプチドの塩と同様のものが 用いられる。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られ る化合物を上述の予防 ·治療剤として使用する場合、 常套手段に従って実施す ることができる。 例えば、 前記した本発明のポリペプチドを含有する医薬と同 様にして、 錠剤、 カプセル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤、 無菌性溶 液、 懸濁液剤などとすることができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトまた は温血動物 （例えば、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ゥマ、 トリ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジーなど） に対して投与することができる。 該化合物またはその塩の投与量は、 その作用、 対象疾患、 投与対象、 投与ル ートなどにより差異はあるが、 例えば、 尿崩症の治療の目的で本発明のポリべ プチドの活性を促進する化合物を皮下投与する場合、 一般的に成人 （体重 60kg 当たり） においては、 一日につき該ィ匕合物を約 0. 1〜100mg、 好ましくは約 1. 0〜 50mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mg投与する。 他の動物の場合も、 60kg当たりに 換算した量を投与することができる。
また、 例えば、 腎性浮腫の治療の目的で本発明のポリペプチドの活性を阻害 する化合物を皮下投与する場合、 一般的に成人 （体重 60kg当たり） においては、 一日につき該化合物を約 0. 1〜100m g、 好ましくは約 1. 0〜50m g、 より好まし くは約 1. 0〜20mg投与する。 他の動物の場合も、 60kg当たりに換算した量を投与 することができる。
( 3 ) 本発明のポリペプチドまたは受容体の定量
本発明の抗体は、 本発明のポリペプチドまたは受容体を特異的に認識するこ とができるので、 被検波中の本発明のポリペプチドまたは受容体の定量、 特に サンドィツチ免疫測定法による定量などに使用することができる。
本発明は、
(i) 本発明の抗体と、 被検液および標識化された本発明のポリペプチドまたは 受容体とを競合的に反応させ、 該抗体に結合した標識化された本発明のポリべ プチドの割合を測定することを特徴とする被検液中の本発明のポリぺプチドの 定量法、 および
(i i) 被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の 別の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、 不溶化担体上の標識剤の 活性を測定することを特徴とする被検波中の本発明のポリぺプチドまたは受容 体の定量法を提供する。
上記 （i i) の定量法においては、 一方の抗体が本発明のポリペプチドまたは 受容体の N端部を認識する抗体で、 他方の抗体が本発明のポリぺプチドまたは 受容体の C端部に反応する抗体であることが望ましい。
また、 本発明のポリぺプチドまたは受容体に対するモノクローナル抗体を用 いて本発明のポリペプチドまたは受容体の定量を行うことができるほか、 組織 染色等による検出を行なうこともできる。 これらの目的には、 抗体分子そのも のを用いてもよく、 また、 抗体分子の F (ab' ) 2、 Fab'、 あるいは Fab画分を用い てもよい。
本発明の抗体を用いる本発明のポリペプチドまたは受容体の定量法は、 特に 制限されるべきものではなく、 被測定液中の抗原量 （例えば、 ポリペプチド 量） に対応した抗体、 抗原もしくは抗体一抗原複合体の量を化学的または物理 的手段により検出し、 これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準 曲線より算出する測定法であれば、 いずれの測定法を用いてもよい。 例えば、 ネフロメトリー、 競合法、 ィムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に 用いられるが、 感度、 特異性の点で、 後述するサンドイッチ法を用いるのが特 に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、 例えば、 放射性同位 元素、 酵素、 蛍光物質、 発光物質などが用いられる。 放射性同位元素としては、 例えば、 〔1251〕 、 〔1311〕 、 〔¾〕 、 〔14c〕 などが用いられる。 上記酵素とし ては、 安定で比活性の大きなものが好ましく、 例えば、 ；3—ガラクトシダーゼ、 /3—ダルコシダーゼ、 アルカリフォスファタ一ゼ、 パ一ォキシダーゼ、 リンゴ 酸脱水素酵素などが用いられる。 蛍光物質としては、 例えば、 フルォレスカミ ン、 フルォレツセンイソチオシァネートなどが用いられる。 発光物質としては、 例えば、 ルミノール、 ルミノール誘導体、 ルシフェリン、 ルシゲニンなどが用 いられる。 さらに、 抗体あるいは抗原と標識剤との結合にピオチン一アビジン 系を用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、 物理吸着を用いてもよく、 また通常 ポリペプチドあるいは酵素等を不溶化、 固定化するのに用いられる化学結合を 用いる方法でもよい。 担体としては、 ァガロース、 デキストラン、 セルロース などの不溶性多糖類、 ポリスチレン、 ポリアクリルアミド、 シリコン等の合成 樹脂、 あるいはガラス等があげられる。
サンドィツチ法においては不溶化した本発明のモノク口一ナル抗体に被検液 を反応させ （1次反応） 、 さらに標識化した別の本発明のモノクロ一ナル抗体 を反応させ （2次反応） たのち、 不溶化担体上の標識剤の活性を測定すること により被検液中の本発明のポリぺプチド量を定量することができる。 1次反応 と 2次反応は逆の順序に行っても、 また、 同時に行なってもよいし時間をずら して行なってもよい。 標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じるこ とができる。 また、 サンドイッチ法による免疫測定法において、 固相用抗体あ るいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも 1種類である必要はなく、 測定 感度を向上させる等の目的で 2種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
本発明のサンドイッチ法による本発明のポリペプチドの測定法においては、
1次反応と 2次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は、 本発明のポ リぺプチドの結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。 すなわち、 1次反応および 2次反応に用いられる抗体は、 例えば、 2次反応で用いられる 抗体が、 本発明のポリペプチドの C端部を認識する場合、 1次反応で用いられ る抗体は、 好ましくは C端部以外、 例えば N端部を認識する抗体が用いられる。 本発明のモノクローナル抗体をサンドィツチ法以外の測定システム、 例えば、 競合法、 ィムノメトリック法あるいはネフロメトリ一などに用いることができ る。
競合法では、 被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させ たのち、 未反応の標識抗原（F ) と、 抗体と結合した標識抗原 （B) とを分離し
(BZF分離） 、 B , Fいずれかの標識量を測定し、 被検波中の抗原量を定量 する。 本反応法には、 抗体として可溶性抗体を用い、 B / F分離をポリエチレ ングリコール、 前記钪体に対する第 2坊体などを用いる液相法、 および、 第 1 抗体として固相化抗体を用いるか、 あるいは、 第 1抗体は可溶性のものを用い 第 2抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
ィムノメトリック法では、 被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化 - 抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、 あるいは、 被検液中 の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、 次に固相化抗原を加え未反応の標 識化抗体を固相に結合させたのち、 固相と液相を分離する。 次に、 いずれかの 相の標識量を測定し被検波中の抗原量を定量する。
また、 ネフロメトリ一では、 ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生 じた不溶性の沈降物の量を測定する。 被検液中の抗原量が僅かであり、 少量の 沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメト リーなどが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、 特別の条件、 操作等の設定は必要とされない。 それぞれの方法における通常の 条件、 操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のポリペプチドの測 定系を構築すればよい。 これらの一般的な技術手段の詳細については、 総説、 成書などを参照することができる。
例えば、 入江 寛編 「ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 4 9年発行） 、 入江 寛編 「続ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 5 4年発行） 、 石川栄 治ら編 「酵素免疫測定法」 （医学書院、 昭和 5 3年発行） 、 石川栄治ら編 「酵 素免疫測定法」 （第 2版） （医学書院、 昭和 5 7年発行） 、 石川栄治ら編 「酵 素免疫測定法」 （第 3版） （医学書院、 昭和 6 2年発行） 、 「Methods in ENZYMOLOGYJ Vol . 70 (Immunochemical Techniques (Par t A) )、 同書 Vol .
73 (1画 nochemical Techniques (Part B))、 同書 Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C))、 同書 Vol . 84 (Immunochemical Techniques (Part D ： Selected Immunoassays) ) , 同書 Vol . 92 (Immunochemical Techniques (Part E ： Monoclonal Ant ibodies and General Immunoassay Methods) )、 同書 Vol. 121 (Iinmnochemical Techniques (Par t I ： Hybr idoma Technology and
Monoclonal Ant ibodies) ) (以上、 アカデミックプレス社発行）などを参照するこ とができる。
以上のようにして、 本発明の抗体を用いることによって、 本発明のポリぺプ チドまたは受容体を感度良く定量することができる。
本発明の抗体を用いて本発明のポリペプチドまたは受容体の濃度を定量する ことによって、 本発明のポリペプチドまたは受容体の濃度の減少が検出された 場合、 例えば、 蓄尿障害 〔例、 頻尿、 尿失禁 （例、 切迫性尿失禁、 腹圧性尿失 禁、 機能性尿失禁など） など〕 、 多尿症、 尿崩症 （例、 下垂体性尿崩症、 腎性 尿崩症など） 、 高ナトリウム血症、 代謝性アルカローシス、 低カリウム血症、 Cushing症候群などの疾病である、 または将来罹患する可能性が高いと診断する ことができる。
また、 本発明のポリペプチドまたは受容体の濃度の増加が検出された場合に は、 例えば、 腎性浮腫、 尿排出障害 （例、 膀胱収縮障害、 尿道通過障害、 排尿 困難、 排尿痛、 尿路閉塞など） 、 低ナトリウム血症、 抗利尿ホルモン分泌不適 症候群 （SIADH) 、 高血圧などの疾病である、 または将来罹患する可能性が高い と診断することができる。
また、 本発明の抗体は、 体液や組織などの被検体中に存在する本発明のポリ ペプチドまたは受容体を検出するために使用することができる。 また、 本発明 のポリべプチドまたは受容体を精製するために使用する抗体カラムの作製、 精 製時の各分画中の本発明のポリぺプチドまたは受容体の検出、 被検細胞内にお ける本発明のポリペプチドまたは受容体の挙動の分析などのために使用するこ とができる。
( 4 ) 遺伝子診断薬
本発明の D NAは、 例えば、 プローブとして使用することにより、 ヒトまた は温血動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 トリ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 など） における本発明のポリペプチド をコードする D NAまたは mR NAの異常 （遺伝子異常） を検出することがで きるので、 例えば、 該 D NAまたは mR NAの損傷、 突然変異あるいは発現低 下や、 該 D N Aまたは m R N Aの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断薬と して有用である。
本発明の D N Aを用いる上記の遺伝子診断は、 例えば、 公知のノーザンハイ ブリダィゼ一シヨンや P C R— S S C P法 （Genomi cs, 第 5巻， 874— 879頁
(1989年) 、 Proceed ings of the Nat i onal Academy of Sc i ences of the Uni ted S tates o f Amer i ca, 第 86巻， 2766— 2770頁 （1989年） ） などにより実 施することができる。
例えば、 ノーザンハイブリダイゼ一シヨンにより本発明のポリぺプチドまた は受容体の遺伝子の発現低下が検出された場合は、 例えば、 蓄尿障害 〔例、 頻 尿、 尿失禁 （例、 切迫性尿失禁、 腹圧性尿失禁、 機能性尿失禁など） など〕 、 多尿症、 尿崩症 （例、 下垂体性尿崩症、 腎性尿崩症など） 、 高ナトリウム血症、 代謝性アルカローシス、 低カリウム血症、 Cushing症候群などの疾病である可能 性が高い、 または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
また、 ノ一ザンハイプリダイゼーシヨンにより本発明のポリぺプチドまたは 受容体の遺伝子の発現過多が検出された場合は、 例えば、 腎性浮腫、 尿排出障 害 （例、 膀胱収縮障害、 尿道通過障害、 排尿困難、 排尿痛、 尿路閉塞など） 、 低ナトリウム血症、 抗利尿ホルモン分泌不適症候群 （S IADH) 、 高血圧などの疾 病である可能性が高い、 または将来罹患する可能性が高いと診断することがで さる。 ( 5 ) アンチセンス D N Aを含有する医薬
本発明のアンチセンス D NAは、 利尿剤などとして使用することができ、 例 えば、 腎性浮腫、 尿排出障害 （例、 膀胱収縮障害、 尿道通過障害、 排尿困難、 排尿痛、 尿路閉塞など） 、 低ナトリウム血症、 抗利尿ホルモン分泌不適症候群 (SIADH) 、 高血圧などの予防 ·治療剤などとして使用することができる。
例えば、 該アンチセンス D N Aを用いる場合、 該アンチセンス D N Aを単独 あるいはレトロウイルスベクター、 アデノウイルスベクター、 アデノウイルス ァソシエーテツドウィルスベクタ一などの適当なベクターに挿入した後、 常套 手段に従って実施することができる。 該アンチセンス D NAは、 そのままで、 あるいは摂取促進のために補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製 剤化し、 遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与 できる。
さらに、 該アンチセンス D N Aは、 組織や細胞における本発明の D N Aの存 在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使 用することもできる。
( 6 ) 本発明の抗体を含有する医薬
本発明のポリペプチドを中和する作用を有する本発明の抗体は、 例えば利尿 剤などとして使用することができ、 例えば、 腎性浮腫、 尿排出障害 （例、 膀胱 収縮障害、 尿道通過障害、 排尿困難、 排尿痛、 尿路閉塞など） 、 低ナトリウム 血症、 抗利尿ホルモン分泌不適症候群 （SIADH) 、 高血圧などの予防 ·治療剤と して有用である。
本発明の抗体を含有する上記疾患の剤は、 そのまま液剤として、 または適当 な剤型の医薬組成物として、 ヒトまたは哺乳動物 （例、 ラット、 ゥサギ、 ヒッ ジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して経口的または非経口的に投 与することができる。 投与量は、 投与対象、 対象疾患、 症状、 投与ルートなど によっても異なるが、 例えば、 成人の腎性浮腫の治療のために使用する場合に は、 本発明の抗体を 1回量として、 通常 0. 01〜20mg/kg体重程度、 好ましくは 0. l〜10mg/kg体重程度、 さらに好ましくは 0. l〜5mg/kg体重程度を、 1日 1〜 5 回程度、 好ましくは 1日 1〜3回程度、 静脈注射により投与するのが好都合で ある。 他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与すること ができる。 症状が特に重い場合には、 その症状に応じて増量してもよい。
本発明の抗体は、 それ自体または適当な医薬組成物として投与することがで きる。 上記投与に用いられる医薬組成物は、 上記またはその塩と薬理学的に許 容され得る担体、 希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。 かかる組成物は、 経口または非経口投与に適する剤形として提供される。
すなわち、 例えば、 経口投与のための組成物としては、 固体または液体の剤 形、 具体的には錠剤 （糖衣錠、 フィルムコーティング錠を含む） 、 丸剤、 顆粒 剤、 散剤、 カプセル剤 （ソフトカプセル剤を含む） 、 シロップ剤、 乳剤、 懸濁 剤などがあげられる。 かかる組成物は公知の方法によって製造され、 製剤分野 において通常用いられる担体、 希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。 例えば、 錠剤用の担体、 賦形剤としては、 乳糖、 でんぷん、 蔗糖、 ステアリン 酸マグネシゥムなどが用いられる。
非経口投与のための組成物としては、 例えば、 注射剤、 坐剤などが用いられ、 注射剤は静脈注射剤、 皮下注射剤、 皮内注射剤、 筋肉注射剤、 点滴注射剤など の剤形を包含する。 かかる注射剤は、 公知の方法に従って、 例えば、 上記抗体 またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、 懸 濁または乳化することによって調製する。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、 適当な 溶解補助剤、 例えば、 アルコール （例、 エタノール） 、 ポリアルコール （例、 プロピレングリコール、 ポリエチレングリコール） 、 非イオン界面活性剤 〔例、 ポリソルべ一ト 8 0、 H C O - 5 0 (polyoxyethyl ene (50mo l) adduc t of hydrogenated cas tor oi l) 〕 などと併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油などが用いられ、 溶解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジ ルアルコールなどを併用してもよい。 調製された注射液は、 通常、 適当なアン プルに充填される。 直腸投与に用いられる坐剤は、 上記抗体またはその塩を通 常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。
上記の経口用または非経口用医薬組成物は、 活性成分の投与量に適合するよ うな投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。 かかる投薬単位の剤形 としては、 錠剤、 丸剤、 カプセル剤、 注射剤 （アンプル） 、 坐剤などが例示さ れ、 それぞれの投薬単位剤形当たり通常 5〜500mg、 とりわけ注射剤では 5〜 100mg、 その他の剤形では 10〜250mgの上記抗体が含有されていることが好まし い。
なお前記した各組成物は、 上記抗体との配合により好ましくない相互作用を 生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
( 7 ) D NA転移動物
外来性の本発明のポリペプチドまたは受容体をコ一ドする D NA (以下、 本 発明の外来性 DNAと略記する） またはその変異 DNA (本発明の外来性変異 DNAと略記する場合がある） を有する非ヒト哺乳動物も、 利尿剤などをスク リーニングするために用いられる。
本発明の外来性 DNAまたはその変異 DNAを有する非ヒト哺乳動物 （以下、 本発明の DN A転移動物と略記する） は、 未受精卵、 受精卵、 精子およびその 始原細胞を含む胚芽細胞などに対して、 好ましくは、 非ヒト哺乳動物の発生に おける胚発生の段階 （さらに好ましくは、 単細胞または受精卵細胞の段階でか つ一般に 8細胞期以前） に、 リン酸カルシウム法、 電気パルス法、 リボフェク シヨン法、 凝集法、 マイクロインジェクション法、 パーティクルガン法、 DE AE—デキストラン法などにより目的とする DN Aを転移することによって作 出することができる。 また、 該 DNA転移方法により、 体細胞、 生体の臓器、 組織細胞などに目的とする本発明の外来性 DNAを転移し、 細胞培養、 組織培 養などに利用することもでき、 さらに、 これら細胞を上述の胚芽細胞と公知の 細胞融合法により融合させることにより本発明の DN A転移動物を作出するこ ともできる。
非ヒト哺乳動物としては、 例えば、 ゥシ、 ブタ、 ヒッジ、 ャギ、 ゥサギ、 ィ ヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムスター、 マウス、 ラットなどが用いられる。 なか でも、 病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的 短く、 また、 繁殖が容易なゲッ歯動物、 とりわけマウス （例えば、 純系として、 C57BLZ6系統， DBA2系統など、 交雑系として、 BSCSFi系統， BDF1系統， BeDSFi系統， BALBZc系統， I CR系統など） または ラット （例えば、 Wi s t a r， SDなど） などが好ましい。
哺乳動物において発現しうる組換えベクターにおける 「哺乳動物」 としては、 上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどがあげられる。 本発明の外来性 DNAとは、 非ヒト哺乳動物が本来有している本発明の DN Aではな.く、 いったん哺乳動物から単離 ·抽出された本発明の DNAをいう。 本発明の変異 DNAとしては、 元の本発明の DN Aの塩基配列に変異 （例え ば、 突然変異など） が生じたもの、 具体的には、 塩基の付加、 欠損、 他の塩基 への置換などが生じた D NAなどが用いられ、 また、 異常 D NAも含まれる。 該異常 D N Aとしては、 異常な本発明のポリペプチドまたは受容体を発現さ せる D NAを意味し、 例えば、 正常な本発明のポリペプチドまたは受容体の機 能を抑制するポリぺプチドを発現させる D N Aなどが用いられる。
本発明の外来性 D NAは、 対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺 乳動物由来のものであってもよい。 本発明の D N Aを対象動物に転移させるに あたつては、 該 D N Aを動物細胞で発現させうるプロモー夕一の下流に結合し た D NAコンストラクトとして用いるのが一般に有利である。 例えば、 本発明 のヒト D NAを転移させる場合、 これと相同性が高い本発明の D NAを有する 各種哺乳動物 （例えば、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムスター、 ラッ ト、 マウスなど） 由来の D NAを発現させうる各種プロモーターの下流に、 本 発明のヒト D N Aを結合した D N Aコンストラクト （例、 ベクタ一など） を対 象哺乳動物の受精卵、 例えば、 マウス受精卵へマイクロインジェクションする ことによって本発明の D NAを高発現する D N A転移哺乳動物を作出すること ができる。
本発明のポリペプチドまたは受容体の発現ベクターとしては、 大腸菌由来の プラスミド、 枯草菌由来のプラスミド、 酵母由来のプラスミド、 λファージな どのバクテリオファージ、 モロニ一白血病ウィルスなどのレトロウイルス、 ヮ クシニアウイルスまたはバキュロウィルスなどの動物ウィルスなどが用いられ る。 なかでも、 大腸菌由来のプラスミド、 枯草菌由来のプラスミドまたは酵母 由来のプラスミドなどが好ましく用いられる。
上記の D N A発現調節を行なうプロモーターとしては、 例えば、 （a) ウィル ス (例、 シミアンウィルス、 サイトメガロウィルス、 モロニ一白血病ウィルス、 J Cウィルス、 乳癌ウィルス、 ポリオウイルスなど） に由来する D NAのプロ モーター、 （b) 各種哺乳動物 （ヒト、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハム スター、 ラット、 マウスなど） 由来のプロモ一夕一、 例えば、 アルブミン、 ィ ンスリン I I、 ゥロブラキン I I、 エラスターゼ、 エリスロポエチン、 エンド セリン、 筋クレアチンキナ一ゼ、 グリア線維性酸性蛋白質、 ダル夕チオン S— トランスフェラ一ゼ、 血小板由来成長因子 j3、 ケラチン K 1 , 1 0ぉょび W 200
14、 コラーゲン I型および I I型、 サイクリック AMP依存蛋白質キナーゼ /3 1サブユニット、 ジストロフィン、 酒石酸抵抗性アルカリフォスファターゼ、 心房ナトリウム利尿性因子、 内皮レセプターチ口シンキナーゼ （一般に T i e. 2と略される） 、 ナトリウムカリウムアデノシン 3リン酸化酵素 （Na， K一 ATP a s e) 、 ニューロフィラメント軽鎖、 メタ口チォネイン Iおよび I I 、 A、 メタ口プロティナーゼ 1組織インヒビター、 MHCクラス ΙΪ¾原 （H— 2 L) 、 H— r a s、 レニン、 ド一パミン j8—水酸化酵素、 甲状腺ペルォキシダ ーゼ （TPO) 、 ポリペプチド鎖延長因子 1ひ (EF- 1 ) 、 βァクチン、 a および /3ミオシン重鎖、 ミオシン軽鎖 1および 2、 ミエリン基礎蛋白質、 チロ グロブリン、 Thy— 1、 免疫グロブリン、 H鎖可変部 （VNP) 、 血清アミ ロイド Pコンポーネント、 ミオグロビン、 トロポニン (：、 平滑筋 aァクチン、 プレプロエンケフアリン A、 バソプレシンなどのプロモ一夕一などが用いられ る。 なかでも、 全身で高発現することが可能なサイトメガロウィルスプロモー 夕一、 ヒトポリペプチド鎖延長因子 1 ひ (EF- 1 ) のプロモーター、 ヒト およびニヮトリ）3ァクチンプロモーターなどが好適である。
上記ベクターは、 DNA転移哺乳動物において目的とするメッセンジャー R NAの転写を終結する配列 （一般に夕一ミネタ一と呼ばれる） を有しているこ とが好ましく、 例えば、 ウィルス由来および各種哺乳動物由来の各 DNAの配 列を用いることができ、 好ましくは、 シミアンウィルスの SV40ターミネタ —などが用いられる。
その他、 目的とする外来性 DNAをさらに高発現させる目的で各 DNAのス プライシングシグナル、 ェンハンサ一領域、 真核 DNAのイントロンの一部な どをプロモーター領域の 5 '上流、 プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻 訳領域の 3 '下流 に連結することも目的により可能である。
正常な本発明のポリペプチドまたは受容体の翻訳領域は、 ヒトまたは各種哺 乳動物 （例えば、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムスター、 ラット、 マ ウスなど） 由来の肝臓、 腎臓、 甲状腺細胞、 線維芽細胞由来 DN Aおよび市販 の各種ゲノム DN Aライブラリ一よりゲノム DN Aの全てあるいは一部として、 または肝臓、 腎臓、 甲状腺細胞、 線維芽細胞由来 RNAより公知の方法により 調製された相補 D NAを原料として取得することが出来る。 また、 外来性の異 常 D N Aは、 上記の細胞または組織より得られた正常なポリぺプチドの翻訳領 域を点突然変異誘発法により変異した翻訳領域を作製することができる。
該翻訳領域は転移動物において発現しうる D NAコンストラクトとして、 前 記のプロモーターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる通 常の D N A工学的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性 D N Aの転移は、 対象哺乳動物の胚 芽細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。 D N A転移後の作 出動物の胚芽細胞において、 本発明の外来性 D NAが存在することは、 作出動 物の後代がすべて、 その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性 D N Aを保持することを意味する。 本発明の外来性 D N Aを受け継いだこの種の動 物の子孫はその胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性 D N Aを有す る。
本発明の外来性正常 D NAを転移させた非ヒト哺乳動物は、 交配により外来 性 D NAを安定に保持することを確認して、 該 D NA保有動物として通常の飼 育環境で継代飼育することが出来る。
受精卵細胞段階における本発明の外来性 D NAの転移は、 対象哺乳動物の胚 芽細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。 D NA転移後 の作出動物の胚芽細胞において本発明の外来性 D NAが過剰に存在することは、 作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性 D N Aを過剰に有することを意味する。 本発明の外来性 D NAを受け継いだこの種 の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性 D N Aを過 剰に有する。
導入 D NAを相同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得し、 この雌 雄の動物を交配することによりすべての子孫が該 D N Aを過剰に有するように 繁殖継代することができる。
本発明の正常 D NAを有する非ヒト哺乳動物は、 本発明の正常 D NAが高発 現させられており、 内在性の正常 D N Aの機能を促進することにより最終的に 本発明のポリぺプチドの機能亢進症を発症することがあり、 その病態モデル動 物として利用することができる。 例えば、 本発明の正常 D NA転移動物を用い て、 本発明のポリペプチドの機能亢進症や、 本発明のポリペプチドが関連する 疾患の病態機序の解明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行なうことが可 能である。
また、 本発明の外来性正常 D N Aを転移させた哺乳動物は、 遊離した本発明 のポリぺプチドの増加症状を有することから、 本発明のポリぺプチドに関連す る疾患に対する治療薬のスクリーニング試験にも利用可能である。
一方、 本発明の外来性異常 D NAを有する非ヒト哺乳動物は、 交配により外 来性 D N Aを安定に保持することを確認して該 D N A保有動物として通常の飼 育環境で継代飼育することが出来る。 さらに、 目的とする外来 D NAを前述の プラスミドに組み込んで原料として用いることができる。 プロモーターとの D NAコンストラク卜は、 通常の D NA工学的手法によって作製することができ る。 受精卵細胞段階における本発明の異常 D NAの転移は、 対象哺乳動物の胚 芽細胞および体細胞の全てに存在するように確保される。 D N A転移後の作出 動物の胚芽細胞において本発明の異常 D N Aが存在することは、 作出動物の子 孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常 D N Aを有すること を意味する。 本発明の外来性 D N Aを受け継いだこの種の動物の子孫は、 その 胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常 D N Aを有する。 導入 D NAを相 同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得し、 この雌雄の動物を交配す ることによりすべての子孫が該 D N Aを有するように繁殖継代することができ る。
本発明の異常 D NAを有する非ヒト哺乳動物は、 本発明の異常 D NAが高発 現させられており、 内在性の正常 D N Aの機能を阻害することにより最終的に 本発明のポリぺプチドの機能不活性型不応症となることがあり、 その病態モデ ル動物として利用することができる。 例えば、 本発明の異常 D N A転移動物を 用いて、 本発明のポリペプチドの機能不活性型不応症の病態機序の解明および この疾患を治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、 具体的な利用可能性としては、 本発明の異常 D N A高発現動物は、 本 発明のポリぺプチドの機能不活性型不応症における本発明の異常ポリぺプチド による正常ポリペプチドの機能阻害 (dominant negat ive作用） を解明するモデ Jレとなる。
また、 本発明の外来異常 D N Aを転移させた哺乳動物は、 遊離した本発明の ポリぺプチドの増加症状を有することから、 本発明のポリぺプチドまたはの機 能不活性型不応症に対する治療薬スクリーニング試験にも利用可能である。 また、 上記 2種類の本発明の D N A転移動物のその他の利用可能性として、 例えば、
(a) 組織培養のための細胞源としての使用、
(b) 本発明の D N A転移動物の組織中の D NAもしくは R NAを直接分析する か、 または D NAにより発現されたポリペプチド組織を分析することによる、 本発明のポリぺプチドにより特異的に発現あるいは活性化するポリぺプチドと の関連性についての解析、
(c) D NAを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、 これらを使 用して、 一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
(d) 上記 （c) 記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬剤 のスクリーニング、 および
(e) 本発明の変異ポリべプチドを単離精製およびその抗体作製などが考えられ る。
さらに、 本発明の D NA転移動物を用いて、 本発明のポリペプチドの機能不 活性型不応症などを含む、 本発明のポリペプチドまたは受容体に関連する疾患 の臨床症状を調べることができ、 また、 本発明のポリペプチドまたは受容体に 関連する疾患モデルの各臓器におけるより詳細な病理学的所見が得られ、 新し い治療方法の開発、 さらには、 該疾患による二次的疾患の研究および治療に貢 献することができる。
また、 本発明^) D N A転移動物から各臓器を取り出し、 細切後、 トリプシン などの蛋白質分解酵素により、 遊離した D NA転移細胞の取得、 その培養また はその培養細胞の系統化を行なうことが可能である。 さらに、 本発明のポリべ プチドまたは受容体産生細胞の特定化、 アポトーシス、 分化あるいは増殖との 関連性、 またはそれらにおけるシグナル伝達機構を調べ、 それらの異常を調べ ることなどができ、 本発明のポリぺプチドまたは受容体およびその作用解明の ための有効な研究材料となる。
さらに、 本発明の D N A転移動物を用いて、 本発明のポリペプチドまたは受 容体の機能不活性型不応症を含む、 本発明のポリぺプチドまたは受容体に関連 する疾患の治療薬の開発を行なうために、 上述の検査法および定量法などを用 いて、 有効で迅速な該疾患治療薬のスクリ一ニング法を提供することが可能と なる。 また、 本発明の D N A転移動物または本発明の外来性 D N A発現べクタ 一を用いて、 本発明のポリペプチドが関連する疾患の D NA治療法を検討、 開 発することが可能である。
( 8 ) ノックアウト動物
本発明の D N Aが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞および本発明の D N A発現不全非ヒト哺乳動物も、 抗利尿剤をスクリーニングするために用いら れる。
本発明の D NAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、 該非ヒト哺 乳動物が有する本発明の D N Aに人為的に変異を加えることにより、 D NAの 発現能を抑制するか、 もしくは該 D N Aがコードしている本発明のポリぺプチ ドの活性を実質的に喪失させることにより、 D N Aが実質的に本発明のポリぺ プチドの発現能を有さない （以下、 本発明のノックアウト D NAと称すること がある） 非ヒト哺乳動物の胚幹細胞 （以下、 E S細胞と略記する） をいう。 非ヒト哺乳動物としては、 前記と同様のものが用いられる。
本発明の D NAに人為的に変異を加える方法としては、 例えば、 遺伝子工学 的手法により該 D N A配列の一部又は全部の削除、 他 D NAを挿入または置換 させることによって行なうことができる。 これらの変異により、 例えば、 コド ンの読み取り枠をずらしたり、 プロモーターあるいはェキソンの機能を破壊す ることにより本発明のノックアウト D NAを作製すればよい。
' 本発明の D N Aが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞 （以下、 本発明の D NA不活性化 E S細胞または本発明のノックアウト E S細胞と略記する） の 具体例としては、 例えば、 目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明の D NA を単離し、 そのェキソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、 ハイグロマイシン耐 性遺伝子を代表とする薬剤耐性遺伝子、 あるいは l a c Z ( 3—ガラクトシダ —ゼ遺伝子） 、 c a t (クロラムフエニコ一ルァセチルトランスフェラーゼ遺 伝子） を代表とするレポ一夕一遺伝子等を挿入することによりェキソンの機能 を破壊するか、 あるいはェキソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結さ せる DNA配列 （例えば、 polyA付加シグナルなど） を挿入し、 完全なメッセ ンジャー RN Aを合成できなくすることによって、 結果的に遺伝子を破壊する ように構築した DNA配列を有する DNA鎖 （以下、 ターゲッティングベクタ 一と略記する） を、 例えば相同組換え法により該動物の染色体に導入し、 得ら れた ES細胞について本発明の DNA上あるいはその近傍の DNA配列をプロ —ブとしたサザンハイブリダィゼーション解析あるいはターゲッティングべク タ一上の D N A配列とターゲッティングベクタ一作製に使用した本発明の D N A以外の近傍領域の D N A配列をプライマーとした P C R法により解析レ、 本 発明のノックアウト E S細胞を選別することにより得ることができる。
また、 相同組換え法等により本発明の DN Aを不活化させる元の ES細胞と しては、 例えば、 前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、 また公知 Evansと Kaufmaの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。 例えば、 マウスの ES細胞の場合、 現在、 一般的には 129系の ES細胞が使用されているが、 免疫学的背景がはっきりしていないので、 これに代わる純系で免疫学的に遺伝 的背景が明らかな ES細胞を取得するなどの目的で例えば、 C 57BLZ6マ ウスや C 57 BLZ 6の採卵数の少なさを DBAZ 2との交雑により改善した BDFiマウス （C 57 BLZ6と DBA/2との F を用いて樹立したもの なども良好に用いうる。 BDI^マウスは、 採卵数が多く、 かつ、 卵が丈夫で あるという利点に加えて、 C 57 BLZ6マウスを背景に持つので、 これを用 いて得られた ES細胞は病態モデルマウスを作出したとき、 C 57BLZ6マ ウスとバッククロスすることでその遺伝的背景を C 57 BLZ6マウスに代え ることが可能である点で有利に用い得る。
また、 ES細胞を樹立する場合、 一般には受精後 3.5日目の胚盤胞を使用す るが、 これ以外に 8細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効 率よく多数の初期胚を取得することができる。
また、 雌雄いずれの ES細胞を用いてもよいが、 通常雄の ES細胞の方が生 殖系列キメラを作出するのに都合が良い。 また、 煩雑な培養の手間を削減する ためにもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。
ES細胞の雌雄の判定方法としては、 例えば、 PCR法により Y染色体上の 性決定領域の遺伝子を増幅、 検出する方法が、 その 1例としてあげることがで きる。 この方法を使用すれば、 従来、 核型分析をするのに約 106個の細胞数 を要していたのに対して、 1コロニー程度の ES細胞数 （約 50個） で済むの で、 培養初期における E S細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうこ とが可能であり、 早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間 は大幅に削減できる。
また、 第二次セレクションとしては、 例えば、 G—バンデイング法による染 色体数の確認等により行うことができる。 得られる ES細胞の染色体数は正常 数の 100%が望ましいが、 樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、 ES細胞の遺伝子をノックアウトした後、 正常細胞 （例えば、 マウスでは染色 体数が 2 n = 40である細胞） に再びクローニングすることが望ましい。
このようにして得られた胚幹細胞株は、 通常その増殖性は大変良いが、 個体 発生できる能力を失いやすいので、 注意深く継代培養することが必要である。 例えば、 S TO繊維芽細胞のような適当なフィーダ一細胞上で L I F (1〜1 000 OU/ml) 存在下に炭酸ガス培養器内 （好ましくは、 5 %炭酸ガス、 9
5%空気または 5%酸素、 5%炭酸ガス、 90%空気） で約 37 で培養する などの方法で培養し、 継代時には、 例えば、 トリプシン ZEDTA溶液 （通常 0.001〜0.5%トリプシン Z0. l〜5mM EDTA, 好ましくは約 0. 1%トリプシン ZlmM EDTA) 処理により単細胞化し、 新たに用意したフ ィーダ一細胞上に播種する方法などがとられる。 このような継代は、 通常 1〜 3日毎に行なうが、 この際に細胞の観察を行い、 形態的に異常な細胞が見受け られた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。
ES細胞は、 適当な条件により、 高密度に至るまで単層培養するか、 または 細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、 頭頂筋、 内臓筋、 心筋など の種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり 〔M. J. Evans及び M. H. Kaufman, Nature第 292卷、 154頁、 1981年； G. R. Martin Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A.第 78巻、 7634頁、 1981年； T. C. Doetschman ら、 ジャーナル ·ォ ブ ·ェンブリオロジー ·アンド ·ェクスペリメンタル ·モルフォロジ一、 第 87 巻、 27頁、 1985年〕 、 本発明の ES細胞を分化させて得られる本発明の DNA 発現不全細胞は、 インビトロにおける本発明のポリぺプチドまたは本発明の受 容体の細胞生物学的検討において有用である。
本発明の DNA発現不全非ヒ卜哺乳動物は、 該動物の mRN A量を公知方法 を用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、 正常動物と区別 することが可能である。 .
該非ヒ卜哺乳動物としては、 前記と同様のものが用いられる。
本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物は、 例えば、 前述のようにして作製 した夕ーゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し、 導入により夕ーゲッティングベクターの本発明の D N Aが不活性化された D N A配列が遺伝子相同組換えにより、 マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色 体上の本発明の DN Aと入れ換わる相同組換えをさせることにより、 本発明の DN Aをノックアウトさせることができる。
本発明の DNAがノックアウトされた細胞は、 本発明の DNA上またはその 近傍の DN A配列をプローブとしたサザンハイプリダイゼ一ション解析または 夕一ゲッティングベクター上の DNA配列と、 夕一ゲッティングベクターに使 用したマウス由来の本発明の DN A以外の近傍領域の DN A配列とをプライマ 一とした PCR法による解析で判定することができる。 非ヒト哺乳動物胚幹細 胞を用いた場合は、 遺伝子相同組換えにより、 本発明の DN Aが不活性化され た細胞株をクローニングし、 その細胞を適当な時期、 例えば、 8細胞期の非ヒ ト哺乳動物胚または胚盤胞に注入し、 作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒ ト哺乳動物の子宮に移植する。 作出された動物は正常な本発明の DNA座をも つ細胞と人為的に変異した本発明の DN A座をもつ細胞との両者から構成され るキメラ動物である。
該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明の D N A座をもつ場合、 こ 200
76 のようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、 全 ての組織が人為的に変異を加えた本発明の D N A座をもつ細胞で構成された個 体を、 例えば、 コ一トカラ一の判定等により選別することにより得られる。 こ のようにして得られた個体は、 通常、 本発明のポリペプチドのヘテロ発現不全 個体であり、 本発明のポリペプチドまたは本発明の受容体のへテロ発現不全個 体同志を交配し、 それらの産仔から本発明のポリべプチドまたは本発明の受容 体のホモ発現不全個体を得ることができる。
卵細胞を使用する場合は、 例えば、 卵細胞核内にマイクロインジェクション 法で D NA溶液を注入することにより夕一ゲッティングベクターを染色体内に 導入したトランスジエニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、 これらのトラ ンスジエニック非ヒト哺乳動物に比べて、 遺伝子相同組換えにより本発明の D N A座に変異のあるものを選択することにより得られる。
このようにして本発明の D NAがノックアウトされている個体は、 交配によ り得られた動物個体も該 D NAがノックアウトされていることを確認して通常 の飼育環境で飼育継代を行なうことができる。
さらに、 生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。 すなわち. 該不活化 D N Aの保有する雌雄の動物を交配することにより、 該不活化 D NA を相同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得しうる。 得られたホモザ ィゴート動物は、 母親動物に対して、 正常個体 1 , ホモザィゴート複数になる ような状態で飼育することにより効率的に得ることができる。 ヘテロザィゴ一 ト動物の雌雄を交配することにより、 該不活化 D N Aを有するホモザィゴート およびへテロザィゴート動物を繁殖継代する。
本発明の D N Aが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、 本発明の D N A発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、 非常に有用である。
また、 本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物は、 本発明のポリペプチドま たは本発明の受容体により誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、 本発 明のポリペプチドまたは本発明の受容体の生物活性の不活性化を原因とする疾 病のモデルとなり得るので、 これらの疾病の原因究明及び治療法の検討に有用 である。 ( 8 a ) 本発明の D NAの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療 ·予防 効果を有する化合物のスクリーニング方法
本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物は、 本発明の D N Aの欠損や損傷な どに起因する疾病に対して治療 ·予防効果を有する化合物のスクリーニングに 用いることができる。
すなわち、 本発明は、 本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物 を投与し、 該動物の変化を観察 ·測定することを特徴とする、 本発明の D NA の欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療 ·予防効果を有する化合物また はその塩のスクリーニング方法を提供する。
該スクリーニング方法において用いられる本発明の D NA発現不全非ヒト哺 乳動物としては、 前記と同様のものがあげられる。
試験化合物としては、 例えば、 ペプチド、 蛋白質、 非ペプチド性化合物、 合 成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血漿など があげられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物で あってもよい。
具体的には、 本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物を、 試験化合物で処理 し、 無処理の対照動物と比較し、 該動物の各器官、 組織、 疾病の症状などの変 化を指標として試験化合物の治療 ·予防効果を試験することができる。
試験動物を試験化合物で処理する方法としては、 例えば、 経口投与、 静脈注 射などが用いられ、 試験動物の症状、 試験化合物の性質などにあわせて適宜選 択す
ることができる。 また、 試験化合物の投与量は、 投与方法、 試験化合物の性質 などにあわせて適宜選択することができる。
例えば、 抗利尿剤をスクリーニングする場合、 本発明の D NA発現不全非ヒ ト哺乳動物に飲水負荷処置を行ない、 飲水負荷処置前または処置後に試験化合 物を投与し、 該動物の尿量変化などを経時的に測定する。
該スクリーニング方法において、 試験動物に試験化合物を投与した場合、 該 試験動物の尿量が約 1 0 %以上、 好ましくは約 3 0 %以上、 より好ましくは約 5 0 %以上低下した場合、 該試験化合物を上記の疾患に対して治療 ·予防効果 を有する化合物として選択することができる。
該スクリーニング方法を用いて得られる化合物は、 上記した試験化合物から 選ばれた化合物であり、 本発明のポリぺプチドの欠損や損傷などによって引き 起こされる疾患に対して治療 ·予防効果を有するので、 該疾患に対する安全で 低毒性な予防，治療剤などの医薬として使用することができる。 さらに、 上記 スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることが できる。
該スクリ一ニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、 該化合 物の塩としては、 生理学的に許容される酸 （例、 無機酸、 有機酸など） や塩基 (例、 アルカリ金属など） などとの塩が用いられ、 とりわけ生理学的に許容さ れる酸付加塩が好ましい。 この様な塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩 酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸など） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸など） と の塩などが用いられる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、 前 記した本発明のポリペプチドを含有する医薬と同様にして製造することができ る。
このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトま たは哺乳動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ルートなどに より差異はあるが、 例えば、 該化合物を皮下投与する場合、 一般的に成人 （体 重 60kgとして） の患者においては、 一日につき該化合物を約 0. 1〜100mg、 好ま しくは約 1. 0〜50mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mg投与する。 非経口的に投与す る場合は、 該化合物の 1回投与量は投与対象、 対象疾患などによっても異なる が、 例えば、 本発明の D N Aに対するプロモータ一活性を促進する化合物を注 射剤の形で通常成人 （体重 60kgとして） の拒食症患者に投与する場合、 一日に つき該化合物を約 0. 01〜30mg程度、 好ましくは約 0. 1〜20mg程度、 より好ましく は約 0. 1〜10mg程度を静脈注射により投与するのが好都合である。 他の動物の場 合も、 体重 60kg当たりに換算した量を投与することができる。
( 8 b ) 本発明の D NAに対するプロモ一夕一の活性を促進または阻害する化 合物をスクリーニング方法
本発明は、 本発明の D NA発現不全非ヒ卜哺乳動物に、 試験化合物を投与し、 レポ一夕一遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明の D N Aに対する プロモ一夕一の活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリ一ニン グ方法を提供する。
上記スクリーニング方法において、 本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物 としては、 前記した本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物の中でも、 本発明 の D N Aがレポ一夕一遺伝子を導入することにより不活性化され、 該レポ一夕 一遺伝子が本発明の D N Aに対するプロモーターの制御下で発現しうるものが 用いられる。
試験化合物としては、 前記と同様のものがあげられる。
レポーター遺伝子としては、 前記と同様のものが用いられ、 /3—ガラクトシ ダーゼ遺伝子 ( 1 a c Z ) 、 可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子またはル シフェラーゼ遺伝子などが好適である。
本発明の D NAをレポ一夕一遺伝子で置換された本発明の D N A発現不全非 • ヒト哺乳動物では、 レポ一夕一遺伝子が本発明の D NAに対するプロモータ一 の支配下に存在するので、 レポ一夕一遺伝子がコードする物質の発現をトレ一 スすることにより、 プロモ一夕一の活性を検出することができる。
例えば、 本発明のポリペプチドをコードする D N A領域の一部を大腸菌由来 の) 3—ガラクトシダ一ゼ遺伝子 （1 a c Z ) で置換している場合、 本来、 本発 明のポリぺプチドの発現する組織で、 本発明のポリぺプチドの代わりに j3—ガ ラクトシダ一ゼが発現する。 従って、 例えば、 5—ブロモー 4一クロ口— 3— インドリル一 /3—ガラクトピラノシド （X— g a l ) のような ]3—ガラクトシ ダーゼの基質となる試薬を用いて染色することに'より、 簡便に本発明のポリべ プチドの動物生体内における発現状態を観察することができる。 具体的には、 本発明のポリペプチド欠損マウスまたはその組織切片をダルタルアルデヒドな どで固定し、 リン酸緩衝生理食塩液 ( P B S ) で洗浄後、 X— g a lを含む染 色液で、 室温または 3 7 °C付近で、 約 3 0分ないし 1時間反応させた後、 組織 標本を I mM E D T AZP B S溶液で洗浄することによって、 β—ガラクトシ ダ一ゼ反応を停止させ、 呈色を観察すればよい。 また、 常法に従い、 1 a c Ζ をコードする mR NAを検出してもよい。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、 上記した 試験化合物から選ばれた化合物であり、 本発明の D N Aに対するプロモーター 活性を促進または阻害する化合物である。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、 該化合 物の塩としては、 生理学的に許容される酸 （例、 無機酸など） や塩基 （例、 有 機酸など）、などとの塩が用いられ、 とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が 好ましい。 この様な塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭 化水素酸、 硫酸など） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピ オン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚 酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸など） との塩などが用 いられる。 '
本発明の D N Aに対するプロモーター活性を促進する化合物またはその塩は、 本発明のポリぺプチドまたは受容体の発現を促進し、 該ポリぺプチドまたは受 容体の機能を促進することができるので、 例えば、 抗利尿剤などとして有用で あり、 例えば蓄尿障害 〔例、 頻尿、 尿失禁 （例、 切迫性尿失禁、 腹圧性尿失禁、 機能性尿失禁など） など〕 、 多尿症、 尿崩症 （例、 下垂体性尿崩症、 腎性尿崩 症など） 、 高ナトリウム血症、 代謝性アルカローシス、 低カリウム血症、
Cushing症候群などの予防 ·治療剤などとして使用することができる。
また、 本発明の D N Aに対するプロモー夕一活性を阻害する化合物またはそ の塩は、 本発明のポリペプチドまたは受容体の発現を阻害し、 該ポリペプチド または受容体の機能を阻害することができるので、 例えば利尿剤などとして有 用であり、 例えば腎性浮腫、 尿排出障害 （例、 膀胱収縮障害、 尿道通過障害、 排尿困難、 排尿痛、 尿路閉塞など） 、 低ナトリウム血症、 抗利尿ホルモン分泌 不適症候群 （SIADH) 、 高血圧などの予防 ·治療剤などとして使用することがで さる。
さらに、 上記スクリ一ニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様 に用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、 前 記した本発明のポリペプチドまたはその塩を含有する医薬と同様にして製造す ることができる。
このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトま たは哺乳動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ルートなどに より差異はあるが、 例えば、 本発明の D NAに対ずるプロモータ一活性を促進 する化合物を経口投与する場合、 一般的に成人 （体重 60kgとして） の患者にお いては、 一日につき該ィ匕合物を約 0. 1〜100m g、 好ましくは約 1. 0〜50mg、 より 好ましくは約 1. 0〜20mg投与する。 非経口的に投与する場合は、 該化合物の 1回 投与量は投与対象、 対象疾患などによっても異なるが、 例えば、 本発明の D N Aに対するプロモ一ター活性を促進する化合物を注射剤の形で通常成人 （60kg として） の患者に投与する場合、 一日につき該化合物を約 O. Ql〜30mg程度、 好 ましくは約 0. l〜20mg程度、 より好ましくは約 0. l〜10mg程度を静脈注射により 投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 60kg当たりに換算した量を投 与することができる。
一方、 例えば、 本発明の D N Aに対するプロモーター活性を阻害する化合物 を経口投与する場合、 一般的に成人 （体重 60kgとして） の患者においては、 一 日につき該化合物を約 0. 1〜100mg、 好ましくは約 1. 0〜50mg、 より好ましくは約
1. 0〜20mg投与する。 非経口的に投与する場合は、 該化合物の 1回投与量は投与 対象、 対象疾患などによっても異なるが、 例えば、 本発明の D N Aに対するプ 口モーター活性を阻害する化合物を注射剤の形で通常成人 （60kgとして） の患 者に投与する場合、 一日につき該化合物を約 0. 01〜30mg程度、 好ましくは約 0. 1 〜20mg程度、 より好ましくは約 0. l〜10mg程度を静脈注射により投与するのが好 都合である。 他の動物の場合も、 60kg当たりに換算した量を投与することがで 含る。
このように、 本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物は、 本発明の D NAに 対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリ —ニングする上で極めて有用であり、 本発明の D N A発現不全に起因する各種 疾患の原因究明または予防 ·治療薬の開発に大きく貢献することができる。
また、 本発明のポリペプチドのプロモーター領域を含有する D NAを使って、 その下流に種々の蛋白質をコードする遺伝子を連結し、 これを動物の卵細胞に 注入していわゆるトランスジエニック動物 （遺伝子移入動物） を作成すれば、 特異的にそのポリペプチドを合成させ、 その生体での作用を検討することも可 能となる。 さらに上記プロモーター部分に適当なレポ一夕遺伝子を結合させ、 これが発現するような細胞株を樹立すれば、 本発明のポリペプチドそのものの 体内での産生能力を特異的に促進もしくは抑制する作用を持つ低分子ィヒ合物の 探索系として使用できる。 本明細書および図面において、 塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、 IUPAC-IUB Commiss ion on Biochemical Nomenclatureによる略号あるいは当該 分野における慣用略号に基づくものであり、 その例を下記する。 またアミノ酸 に関し光学異性体があり得る場合は、 特に明示しなければ L体を示すものとす る。
D N A ：デォキシリポ核酸
c D NA ：相補的デォキシリポ核酸
A ：アデニン
T ：チミン
G ：グァニン
C ：シトシン
I ：イノシン
' R ：アデニン （A) またはグァニン （G)
Y ：チミン （T) またはシトシン （C)
M ：アデニン (A) またはシトシン ( C ) K グァニン （G) またはチミン （T)
S グァニン （G) またはシ卜シン （C)
W アデニン （A) またはチミン （T)
B シ卜シン （C) 、 グァニン （G) またはチミン （T) D アデニン （A) 、 グァニン （G) またはチミン （T) V アデニン （A) 、 グァニン （G) またはシトシン （C) N アデニン （A) 、 グァニン （G) 、 シトシン (C) もしくはチミン (T) または不明もしくは他の塩基
RNA リポ核酸
mRNA メッセンジャー -リポ核酸
d ATP ギ十 'ァギノ 'シン三リン酸
dTTP デォキシチミジン三リン酸
dGTP デォキシグアノシン三リン酸
dCTP デォキシシチジン三リン酸
ATP アデノシン三リ 酸
EDTA エチレンジァミン四酢酸
SDS ドデシル硫酸ナトリウム
Figure imgf000084_0001
T o s P-トルエンスルフォニル
B z 1
Bom ベンジルォキシメチル
B o c t一ブチルォキシカルポニル
DCM ジクロロメタン
HOB t
DCC N, N'—ジシクロへキシルカルポジィ
TFA トリフルォロ酢酸
D I EA ジィソプロピルェチルアミン
B S A ゥシ血清： CHAPS 3— 〔 （3—コラミドプロピル） ジメチルアンモニ ォ〕 一 1一プロパンスホナ一卜
G 1 y又は G グリシン
A 1 a又は A ァラニン
V a 1又は V バリン
L e u又は L
I 1 e又は I
S e r又は S セリン
Th r又は T スレオ
Cy s又は C
Me t又は M メチォニン
G 1 u又は E グルタミン酸
As p又は D ァスパラギン酸
L y s又は K リジン
A r g又は R アルギニン
H i s又は H ヒスチジン
Ph e又は F フエ二ルァラニン
Ty r又は Y チロシン
T r p又は W トリプトファン
P r o又は P プロリン
As n又は N ァスパラギン
G 1 n又は Q グルタミン
p G 1 u ピログルタミン酸
Ty r (I) 3—ョードチロシン
DMF N，N—ジメチルホルムアミド
Fm o c N— 9一フルォレニルメトキシカルポ
T r t 卜リチル
P b f 2, 2, 4, 6, 7 - 一 5ースルホニル C 1 t 2—クロロトリチル
B u 1 t一ブチル
M e t (〇） メチォニンスルフォキシド 本願明細書の配列表の配列番号は、 以下の配列を示す。
〔配列番号： 1〕
ヒト GPR8リガンドペプチド （hNPW23) のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 2〕
ヒト GPR8リガンドペプチド （hNPW30) のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 3〕
配列番号： 1で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号： 4〕
配列番号： 2で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号： 5〕
ヒト GPR8リガンドぺプチド前駆体の一部をコ一ドする DNAの塩基配列を示す。 〔配列番号： 6〕
ヒト GPR8リガンドぺプチド前駆体の一部のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 7 3
合成ヒト GPR8リガンド （1-29) のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 8〕
合成ヒト GPR8リガンド （卜 28) のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 9〕
合成ヒト GPR8リガンド （1-27) のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 1 0〕
合成ヒト GPR8リガンド （1-26) のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 1 1〕
合成ヒト GPR8リガンド （1-25) のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 1 2〕
合成ヒト GPR8リガンド （卜 24) のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号： 13〕
配列番号： 7で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号： 14〕 '.
配列番号： 8で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。 〔配列番号： 1 5〕
配列番号： 9で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号： 16〕
配列番号： 10で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。 〔配列番号： 1 7〕
配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。 〔配列番号： 1 8〕
配列番号： 12で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。 〔配列番号： 19〕
ヒト GPR8リガンドぺプチド前駆体をコ一ドする cDNAの塩基配列を示す。 〔配列番号： 20〕
ヒト GPR8リガンドぺプチド前駆体のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 2 1〕
ブ夕 GPR8リガンドペプチドのァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 22〕
ブ夕 GPR8リガンドぺプチド前駆体をコードする cDNAの塩基配列を示す。 〔配列番号： 23〕
ブタ GPR8リガンドペプチド前駆体のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 24〕
ブ夕 GPR8リガンドペプチドのァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 25〕
ブ夕 GPR8リガンドペプチドのァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 26〕
配列番号： 24で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。 〔配列番号： 27〕 配列番号： 25で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号： 2 8〕
ラット GPR8リガンドぺプチド前駆体をコードする cDNAの配列を示す。
〔配列番号： 2 9〕
ラット GPR8リガンドペプチド前駆体のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 30〕
ラット GPR8リガンドペプチドのァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 3 1〕
ラット GPR8リガンドペプチドのァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 32〕
配列番号： 3 0で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号： 3 3〕
配列番号： 3 1で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。 〔配列番号： 34〕
マウス GPR8リガンドぺプチド前駆体をコードする cDNAの配列を示す。 〔配列番号： 3 5〕
マウス GPR8リガンドぺプチド前駆体のァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 3 6〕
マウス GPR8リガンドペプチドのァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 3 7〕
マウス GPR8リガンドペプチドのァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 3 8〕
配列番号： 3 6で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。 〔配列番号： 3 9〕
配列番号： 3 7で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号： 40〕
合成ヒト GPR8リガンド （1-23) 酸化体のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 4 1〕
合成ヒト GPR8リガンド （1-22) のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号： 42〕
合成ヒト GPR8リガンド （卜 21) のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 43〕
合成ヒト GPR8リガンド （卜 20) のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 44〕
合成ヒト GPR8リガンド （卜 19) のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 45〕
合成ヒト GPR8リガンド （1-18) のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 46〕
合成ヒト GPR8リガンド （1-17) のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 47〕
合成ヒト GPR8リガンド （1-16) のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 48〕
合成 GPR8リガンド （1-23) 酸化体のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 49〕
合成ラットまたはマウス GPR8リガンド （1-23) 酸化体のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：.5 Q〕
合成 Fmoc化ヒト GPR8リガンド （1-23) のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 5 1〕
合成 [Na- Acetyl- Τπ)1]-ヒト GPR8リガンド （1-23) のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号： 52〕
合成ヒト GPR8リガンド （2-23) のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 5 3〕
合成ヒト GPR8リガンド （4-23) のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 54〕
合成ヒト GPR8リガンド （9-23) のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 5 5〕 ―
合成ヒ卜 GPR8リガンド （15-23) のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 56〕 合成 [N_Ace ty卜 Tyr2] -ヒト GPR8リガンド （2-23) のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 5 7〕
合成 [D_Trpi] -ヒト GPR8リガンド （卜 23) のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号 : 5 8 3
合成 [N-3- Indo l epropanoy卜 Tyr2] -ヒト GPR8リガンド (2-23) のアミノ酸配列 を示す。
〔配列番号 ： 5 9〕
配列番号： 4 1で表されるアミノ酸配列をコ -ドする塩基配列を示す。
〔配列番号 : 6 0 )
配列番号： 4 2で表されるアミノ酸配列をコ -ドする塩基配列を示す。
〔配列番号 : 6 1 ]
配列番号： 4 3で表されるアミノ酸配列をコ -ドする塩基配列を示す。
〔配列番号 ： 6 2〕
配列番号： 4 4で表されるアミノ酸配列をコ -ドする塩基配列を示す。
〔配列番号 ： 6 3〕
配列番号： 4 5で表されるアミノ酸配列をコ - -ドする塩基配列を示す。
〔配列番号 ： 6 4〕
配列番号： 4 6で表されるア ノ酸配列をコ- -ドする塩基配列を示す。
〔配列番号 ： 6 5〕
配列番号： 4 7で表されるアミノ酸配列をコ -ドする塩基配列を示す。
〔配列番号 ： 6 6〕
配列番号： 5 2で表されるアミノ酸配列をコ- -ドする塩基配列を示す。
〔配列番号 ： 6 7〕
配列番号： 5 3で表されるアミノ酸配列をコ- -ドする塩基配列を示す。
〔配列番号 ： 6 8〕
配列番号： 5 4で表されるアミノ酸配列をコ -ドする塩基配列を示す。
〔配列番号 ： 6 9〕
配列番号： 5 5で表されるアミノ酸配列をコ- -ドする塩基配列を示す。
〔配列番号 ： 7 0〕 配列番号'： 2 1で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。 〔配列番号： 7 1〕
[Phe2] ヒト GPR8リガンド （1-20) のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 7 2〕
配列番号： 7 1で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号： 7 3〕
ヒト GPR8のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 74〕
配列番号： 7 3で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号： 7 53
ラット TGR26のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 7 6〕
ラット TGR26をコードする c DNAの塩基配列を示す。
〔配列番号： 7 7〕
マウス TGR26のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 7 8〕
マウス TGR26をコードする cDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号： 7 9〕
ヒ卜 GPR7のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 8 0〕
ヒト GPR7をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号： 8 1〕
ゥサギ GPR8のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 8 2〕
ゥサギ GPR8をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号： 8 3〕
ゥサギ GPR7のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 84〕
ゥサギ GPR7をコ一ドする塩基配列を示す。 〔配列番号： 85〕
ゥサギ GPR8リガンドペプチド （1-30) のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 86〕
ゥサギ GPR8リガンドぺプチド （1-30) をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号： 87〕
ゥサギ GPR8リガンドペプチド （1-23) のアミノ酸配列を示す。 配列番号： 1で 表されるアミノ酸配列と同一である。
〔配列番号： 88〕
ゥサギ GPR8リガンドペプチド （1-23) をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号： 89〕
以下の実施例 2— (1) における PCR反応で使用したプライマーの塩基配列を示 す。
〔配列番号： 90〕
以下の実施例 2— (1) における PCR反応で使用したプライマーの塩基配列を示 す。
〔配列番号： 91〕
ゥサギ GPR8をコードする cDNAの 5' 上流側の塩基配列を示す。
〔配列番号： 92〕
以下の実施例 2— (2) における PCR反応で使用したプライマーの塩基配列を示 す。
〔配列番号： 93〕
以下の実施例 2— (2) における PCR反応で使用したプライマ一の塩基配列を示 す。
〔配列番号： 94〕
ゥサギ GPR8をコードする cDNAの 3' 下流側の塩基配列を示す。
〔配列番号： 95〕
以下の実施例 2— (3) における PCR反応で使用したプライマ一の塩基配列を示 す。 - 〔配列番号： 96〕 以下の実施例 2— (3) における PCR反応で使用したプライマーの塩基配列を示 す。
〔配列番号： 97〕
以下の実施例 2 _ (3) において得られたゥサギ GPR8をコードする cDNAを含む 塩基配列を示す。
〔配列番号： 98〕
以下の実施例 3— (1) における PCR反応で使用したプライマーの塩基配列を示 す。
〔配列番号： 99〕
以下の実施例 3_ (1) における PCR反応で使用したプライマーの塩基配列を示 す。
〔配列番号： 100〕
ゥサギ GPR7をコ一ドする cDNAの 5' 上流側の塩基配列を示す。
〔配列番号： 101〕
以下の実施例 3— (2) における PCR反応で使用したプライマ一の塩基配列を示 す。
〔配列番号： 102〕
以下の実施例 3— (2) における PCR反応で使用したプライマーの塩基配列を示 す。
〔配列番号： 103〕
ゥサギ GPR7をコードする cDNAの 3' 下流側の塩基配列を示す。
〔配列番号： 104〕
以下の実施例 3— (3) における PCR反応で使用したプライマーの塩基配列を示 す。
〔配列番号： 105〕
以下の実施例 3— (3) における PCR反応で使用したプライマーの塩基配列を示 す。 .
〔配列番号： 106〕
以下の実施例 3— (3) において得られたゥサギ GPR7をコードする cDNAを含む 塩基配列を示す。
〔配列番号： 107〕
以下の実施例 4一 (1) における PCR反応で使用したプライマ一の塩基配列を示 す。
〔配列番号： 108〕 ·
以下の実施例 4— (1) における PCR反応で使用したプライマーの塩基配列を示 す。
〔配列番号： 109〕
ゥサギ GPR8リガンドぺプチド前駆体蛋白質をコードする cDNAの 5' 上流側の塩基 配列を示す。
〔配列番号： 1 10〕
以下の実施例 4一 .(2) における PCR反応で使用したプライマ一の塩基配列を示 す。
〔配列番号： 1 1 1〕
以下の実施例 4— (2) における PCR反応で使用したプライマーの塩基配列を示 す。
〔配列番号： 1 12〕
ゥサギ GPR8リガンドぺプチド前駆体蛋白質をコ一ドする cDNAの 3' 下流側の塩基 配列を示す。
〔配列番号： 1 13〕
以下の実施例 4一 (3) における PCR反応で使用したプライマーの塩基配列を示 す。
〔配列番号： 1 14〕
以下の実施例 4— (3) における PCR反応で使用したプライマ一の塩基配列を示 す。
〔配列番号： 1 1 5〕
ゥサギ GPR8リガンドぺプチド前駆体蛋白質をコードする cDNAを含む塩基配列を 示す。
〔配列番号： 1 16〕 ゥサギ GPR8リガンドぺプチド前駆体蛋白質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 1 1 7〕
以下の実施例 4一 (3) における PCR反応で使用したプライマーの塩基配列を示 す。
〔配列番号： 1 18〕
以下の実施例 4一 (3) における PCR反応で使用したプライマーの塩基配列を示 す。
〔配列番号： 1 19〕
ゥサギ GPR8リガンドぺプチド前駆体蛋白質をコードする cDNAを含む塩基配列を 示す。
〔配列番号： 120〕
配列番号： 1 16で表されるアミノ酸配列をコードする cDNAの塩基配列を示す。 後述の実施例 2で得られた Escherichia coli DH5 α/ρΑΚΚΟ-rabbi t GPR8は、 2003年 9月 25日から茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305 -
8566) の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに受託番号 FERM BP-8497として寄託されている。
後述の実施例 3で得られた Escherichia coli DH5 α/ρΑΚ Ο-rabbi t GPR7は、 2003年 9月 25日から茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305 - 8566) の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに受託番号 FERM BP-8496として寄託されている。
後述の実施例 4で得られた Escherichia coli DH5 α/ρΑΚΚΟ-r bbi t prepro- NPWは、 2003年 9月 25日から茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305-8566) の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに受託 番号 FERM BP- 8495として寄託されている。 以下に参考例および実施例を示して、 本発明をより詳細に説明するが、 これ らは本発明の範囲を限定するものではない。
参考例 1 [Phe2]ヒト GPR8リガンド（1-20) (配列番号： 7 1) の製造
アプライドバイオシステムズ社のペプチド自動合成機 （ABI 433モデル） を使 用し、 プログラムに従って C端より逐次 Fmoc法によりペプチド鎖を延長し目的 の保護べプチド樹脂の合成を行つた。
出発アミノ酸樹脂担体は Wang (p-benzyloxybenzyl alcohol) 樹脂 (0.25 mmol) を使用し、 Fmoc-Leu, Fmoc-Gly, Fmoc - Ala、 Fmoc-Arg(Pbf) > Fmoc-VaK Fmoc - Thr(Bul)、 Fmoc- His (Trt)、 Fmoc-Tyr (Bul) > Fmoc-Pro. Fmoc- Ser (Bul)、 Fmoc- Lys (Boc)、 Fmoc-Phe, Fmoc- Trp(Boc)の Fmocアミノ酸誘導体を HBTU (2— (1H—べンゾトリァゾールー 1_ィル） 一1, 1,3, 3—テトラメチルゥロニゥム へキサフルォロホスフェート） によりシークェンスにしたがって逐次縮合した。 樹脂上へのペプチドの構築が終了後、 保護ペプチド樹脂を乾燥した。 得られ た保護べプチドの脱保護処理とぺプチドの樹脂担体からの切り離しは TFA処理に よって行なった。 得られた粗ペプチドは 0.1% TFA水によって抽出し、 凍結乾燥 により粉末固体として得た。 続いて、 粗ペプチドを逆相高速クロマトグラフィ 一 （島津製作所、 分取装置：モデル LC8A) によりァセトニトリル— 0.1% TFATK の系 （15-35%、 80分） を用いて分取精製を行なって目的とする精製ペプチド 35 mgを得た。
精製物を 0.2% 3- (2-アミノエチル)インドールを含む 4N メタンスルホン酸に よって 110°C · 22時間の条件で加水分解して得た加水分解物のアミノ酸分析値は (括弧内は理論値） 以下のとおり。
Thr (1) 0.93, Ser (1) 0.92, Gly (2) 2.03, Ala (3) 3.09, Val (2) 1.90, Leu (2) 2.02, Tyr (1) 1.02, Phe (1) 1.00， His (2) 1.91, Lys (1) 0.98, Trp (1) 0.88, Arg (2) 2.06, Pro (1) 1.02
純度は HPLCにより 98.8%と算出された。 また、 質量分析値は 2266.6 (理論値 2266.6) であった。 参考例 2
ラク卜パーォキシダ一ゼ法を用いた [Phe2，125I- Tyr1(1]ヒト GPR8リガンド - 20)の 作製 DMSO 10 lに溶かした、 参考例 1に記載した製法に準じて得られた [Phe2] ヒ ト GPR8リガンド α-20) (配列番号： 7 1) 10 rnnolを、 0.1 M塩ィ匕ニッケル水溶 液 10 1、 0.1 M HEPES (pH 7.6)に溶かした 0.001%過酸化水素水 10 1、 0.1 M HEPES (pH 7.6)に溶かしたラクトパーォキシダ一ゼ （シグマ社） 10 g/mlを 10 l、 および [125I]NaI 40 MBq (NENライフサイエンスプロダクツ社） 10 1を混 合して室温で 50分間反応させた後、 生成した [Phe2， 125I-Tyr10] ヒト GPR8リガン ド α- 20)を以下の条件の HPLCにより分取した。
用いたカラムは、 0DS- 80ΤΜ (4.6 腿 χ 15 cm) (ト一ソ一社）、 溶出液 Aとして 10%ァセトニトリル /0.1% TFA、 溶出液 Bとして 60%ァセトニトリル /0.1% TFA を用い、 0-0 (2 min)、 0-27 (5 min)、 27-32 (40 min) %B/A+Bのダラディエン ト溶出法を行なった。 流速は 1 mL/min、 カラム温度は 40°C、 検出は 215 nmとし た。 この HPLC条件では、 DPhe2， 125I-Tyr10] ヒト GPR8リガンド（1-20)は 25分付近 に溶出した。 実施例 1
ヒト GPR8リガンド（1-23)の静脈投与によるゥサギの尿量、 心拍数および血圧に 対する作用
Japanese White系雄性ゥサギ (2.2-2.4 kg) にウレタン （カルバミド酸ェチ ル） を耳静脈より投与し （1.5 g/il/kg), 麻酔下にてゥサギ手術台に固定して 開腹した。 右大腿動脈揷管および尿管を剥離し、 尿管カテーテルを両尿管に挿 管し、 ポリグラフ 363を用いて動脈血圧、 心拍数および尿量を計測した。 生理食 塩水の輸液（10 ml/h)および検体の投与（300 l/回）は耳静脈より行なった。 W0 01/98494号公報に記載の方法と同様にして作製したヒ卜 G P R 8リガンド （1 -23) (配列番号： 1) (hNPW23と記載することがある） は生理食塩水 （大 塚製薬） に溶解し、 投与量を 12.5、 25、 50および 100 mnol/kgに設定した。 対照 区には生理食塩水を投与し、 各群 5例で行なった。 hNPW23投与前および投与後の 4分間の尿量を計測し、 投与前後の尿量変化の比率 (%) をもって F-検定を行 なった。
hNPW23投与による尿量の変動は、 下式に従って表記する。 結果を表 1に示す。 (%) = (投与後 4分間の尿量） / (投与前 4分間の尿量） X100
〔表 1〕
投与量 （nmol/kg) 0 12J 25 50 100 尿量の変動 (%) 101±0.9 90.0±7.4 78.2±2.7 74.8土 2.6 56.8±8.1
(平均値土標準誤差） 投与群では、 25、 50および 100 nmol/kg投与群において、 生理食塩水投 与群と比較し、 投与量依存的に有意に尿量が減少した。 また、 111«^23の12.5 nmol/kg投与群では、 尿量の減少傾向がみられたが、 生理食塩水投与群に比較し て有意な差はみられなかった （表 1) 。
また、 hNPW23は、 いずれの投与量においても血圧および心拍数には影響を与 えなかった。 実施例 2
ゥサギ GPR8をコードする cDNAのクローニング
( 1 ) ゥサギ GPR8をコードする cDMの 5'上流側配列のクローニング
ゥサギ全脳の total RNAは UNITECH社より購入した。 Poly(A)+ RNA画分を mRNA purification kit (アマシャム バイオサイエンス社） を用いて調製後、 ゥサ ギ全脳 poly(A)+ RNA 1.0 gから PowerScript Reverse Transcriptase (クロン テック社） を用いてマニュアルに従って逆転写を行なった後、 Marathon cDNA Amplification kit (クロンテック社） を用いて 5，- RACE用の铸型であるゥサギ 全脳二本鎖 cDNAを作成した。 RACE PCR反応に用いたプライマーセットは、 1回目 の PCR反応では kit添付の Adaptor Primer 1とプライマ一 1 (配列番号： 89) 、 2回目の PCR反応では kit添付の Nested Adaptor Primer 2とプライマー 2 (配列 番号： 90) を用いた。 反応は、 逆転写した cDNAのうち mRNA 2 ng相当分を錶型 に 50^1の液量で行なった。 反応液の組成は、 プライマー濃度 0.2 M、 dNTP混合 液 0.2 mM、 LA-Taq (宝酒造） 1/100 volume, 2倍濃縮 GC Buffer I 1/2 volumeと した。 増幅のためのサイクルは、 どちらの PCRも 94°Cで 120秒保温した後、 94°C · 30秒、 60°C (サイクル数が 1回増える毎に 0.5°Cずつ上昇） 、 72°C · 4分の サイクルを 15回、 94°C · 30秒、 68°C · 4分のサイクルを 15回繰り返した後、 72°C で 10分保温した。 反応液を 1.2% ァガロースゲルで電気 動し、 ェチジゥムブ 口マイドで染色した時に見える 900 bp付近のバンドを DNA Extraction Kit (キ ァゲン社） で抽出し、 DM Ligation Kit (宝酒造） を用いてプラスミドベクタ "PGEM-T Easy Vector (プロメガ社） へサブクロ一ニングした後、 大腸菌 DH5ひ (T0Y0B0社） へ導入した。 生じた形質転換体から QIAGEN Plasmid Mini Kit (キ ァゲン社） を用いてプラスミド DNAを精製した。 塩基配列決定のための反応は、 BigDye Terminator Cycle Sequence Ready Reaction Kit ひ ——キンエリレマ—— 社） を用いて行なった。 蛍光式自動シーケンサーを用いて解読し、 ゥサギ GPR8 をコードする cDNAの 5'上流側配列である配列番号： 9 1で示される塩基配列を 得た。
(2) ゥサギ GPR8をコードする cDNAの 3'下流側配列のクローニング
ゥサギ全脳の total RNAは UNITECH社より購入した。 Poly(A)+ RNA画分を mRNA purification kit (アマシャム バイオサイエンス社） を用いて調製後、 ゥサ ギ全脳 poly (A)+ RNA 1.0/igから PowerScript Reverse Transcriptase (クロン テック社） を用いてマニュアルに従って逆転写を行なった後、 Marathon cDNA Amplification kit (クロンテック社） を用いて 3'- RACE用の铸型であるゥサギ 全脳二本鎖 cDNAを作成した。 RACE PCR反応に用いたプライマーセットは、 1回目 の PCR反応では kit添付の Adaptor Primer 1とプライマ一 1 (配列番号： 9 2) 、 2回目の PCR反応では kit添付の Nested Adaptor Primer 2とプライマー 2 (配列 番号： 9 3) を用いた。 反応は、 逆転写した cDNAのうち mRNA 2 ng相当分を铸型 に 50 1の液量で行なった。 反応液の組成は、 プライマー濃度 0.2 M、 dNTP混合 液 0.2 mM、 LA-Taq (宝酒造) 1/100 vol匿、 2倍濃縮 GC Buffer I 1/2 volumeと した。 増幅のためのサイクルは、 どちらの PCRも 94°Cで 120秒保温した後、
94°C · 30秒、 72°C · 4分のサイクルを 5回、 94 ■ 30秒、 70°C · 4分のサイクルを 5回、 94 ' 30秒、 68 · 4分のサイクルを 20回繰り返した後、 72°Cで 10分保温 した。 反応液を 1.2% ァガロースゲルで電気泳動し、 ェチジゥムブロマイドで 染色した時に見える 2000 bp付近のバンドを DNA Extraction Kit (キアゲン社） で抽出し、 DNA Ligation Kit (宝酒造） を用いてプラスミドベクター pGEM - T Easy Vector (プロメガ社） へサブクローニングした後、 大腸菌 DH5ひ (T0Y0B0 社） へ導入した。 生じた形質転換体から QIAGEN Plasmid Mini Kit (キアゲン 社） を用いてプラスミド DNAを精製した。 塩基配列決定のための反応は、 BigDye Terminator Cycle Sequence Ready Reaction Kit (パーキンエルマ一社） を用 いて行なった。 蛍光式自動シーケンサーを用いて解読し、 ゥサギ GPR8をコード する cDNAの 3'下流側配列である配列番号： 94で示される:^基配列を得た。
(3) ゥサギ GPR8をコードする全長 cDNAのクロ一ニング
ゥサギ全脳の total RMは UNITECH社より購入した。 Poly(A)+ RNA画分を mRNA purification kit (アマシャム バイオサイエンス社） を用いて調製後、 ゥサ 干全脳 poly(A)+ RNA 1.0 gから PowerScript Reverse Transcriptase (クロン テック社） を用いてマニュアルに従って逆転写を行なった後、 Marathon cDNA Amplification kit (クロンテック社） を用いてゥサギ全脳二本鎖 cDNAを作成し た。 ゥサギ GPR8遺伝子の 5'側配列をもとに作製したプライマー 1 (配列番号： 95) およびゥサギ GPR8遺伝子の 3'側配列をもとに作製したプライマー 2 (配 列番号： 96) を用いてゥサギ全脳二本鎖 cDNAを铸型に PCR反応を行なった。 反 応は、 mRNA 1 ng相当分の cDNAを铸型に 100 lの液量で行なった。 反応液の組成 は、 プライマ一濃度 0.5 zM、 d T混合液 0.2mM、 LA-Taq (宝酒造） 1/100 volume, 2倍濃縮 GC Buffer I 1/2 volumeとした。 増幅のためのサイクルは、 94°Cで 120 秒保温した後、 94°C · 30秒、 68°C · 2分のサイクルを 40回繰り返した後、 72°Cで 10分間保温した。 得られた反応液を QIAquick PCR purification Kit (キアゲン 社） を用いて精製し、 DNA Ligation Kit (宝酒造） を用いてプラスミドベクタ — pGEM-T Easy Vector (プロメガ社） へサブクローニングした後、 大腸菌 DH5 a (T0Y0B0社） へ導入した。 生じた形質転換体から QIAGEN Plasmid Mini Kit (キ ァゲン社） を用いてプラスミド DNAを精製した。 塩基配列決定のための反応は、 BigDye Terminator Cycle Sequence Ready Reaction Kit (ノ、 °——キンエレマ—— 社） を用いて行なった。 蛍光式自動シーケンサーを用いて解読し、 配列番号： 97に示す塩基配列を得た。 この配列には、 ゥサギ GPR8の全アミノ酸配列 （配 列番号： 81) をコードする塩基配列が含まれていた。 次に、 そのプラスミド DNAを制限酵素 Sal Iと Spe I (宝酒造） を用いて消化後、 反応液を 1.2% ァガロ —スゲルで電気泳動し、 ェチジゥムブ口マイドで染色した時に見える 1000 bp付 近のバンドを DNA Extraction Kit (キアゲン社） を用いて回収した。 この DNA断 片を pAKKOの Sal Iサイトと Spe Iサイトに DNA Ligation Kit (宝酒造） を用いて サブクローニングした後、 大腸菌 DH5ひ （T0Y0B0社） へ導入し、 形質転換体 Escherichia coli DH5 α/ρΑΚΚΟ - rabbi t GPR8を得た。 実施例 3
ゥサギ GPR7をコ一ドする cDNAのクローニング
(1) ゥサギ GPR7をコードする cDNAの 5'上流側配列のクロ一ニング
ゥサギ全脳の total RNAは UNITECH社より購入した。 Poly(A)+ RNA画分を mRNA purification kit (アマシャム バイオサイエンス社） を用いて調製後、 ゥサ 十全脳 poly(A)1" RNA 1. O gから PowerScript Reverse Transcriptase (クロン テック社） を用いてマニュアルに従って逆転写を行なった後、 Marathon cDNA Amplification kit (クロンテック社） を用いて 5，_RACE用の铸型であるゥサギ 全脳二本鎖 cDNAを作成した。 RACE PCR反応に用いたプライマ一セットは、 1回目 の PCR反応では kit添付の Adaptor Primer 1とプライマー 1 (配列番号： 98) 、 2回目の PCR反応では kit添付の Nested Adaptor Primer 2とプライマ一 2 (配列 番号： 99) を用いた。 反応は、 逆転写した cDNAのうち mRNA 2 ng相当分を錶型 に 50^1の液量で行なった。 反応液の組成は、 プライマー濃度 0.2 /M、 dNTP混合 液 0.2 mM、 LA-Taq (宝酒造) 1/100 volume, 2倍濃縮 GC Buffer I 1/2 volumeと した。 増幅のためのサイクルは、 どちらの PCRも 94 で 120秒保温した後、
94°C · 30秒、 72 · 4分のサイクルを 5回、 94 · 30秒、 70°C · 4分のサイクルを 5回、 94t 30秒、 68 · 4分のサイクルを 20回繰り返した後、 72 で 10分保温 した。 反応液を 1.2% ァガロースゲルで電気泳動し、 ェチジゥムブロマイドで 染色した時に見える 1000 bp付近のバンドを DNA Extraction Kit (キアゲン社） で抽出し、 DNA Ligation Kit (宝酒造） を用いてプラスミドベクター pGEM - T Easy Vector (プロメガ社） へサブクローニングした後、 大腸菌 DH5a (T0Y0B0 社） へ導入した。 生じた形質転換体から QIAGEN Plasmid Mini Kit (キアゲン 社） を用いてプラスミド DNAを精製した。 塩基配列決定のための反応は、 BigDye Terminator Cycle Sequence Ready Reaction Kit (ノ、°——キンエリレマ——社) を用 いて行なった。 蛍光式自動シーケンサ一を用いて解読し、 ゥサギ GPR7をコード する cDNAの 5'上流側配列である配列番号： 100で示される塩基配列を得た。
(2) ゥサギ GPR7をコードする cDNAの 3'下流側配列のクローニング
ゥサギ全脳の total RNAは UNITECH社より購入した。 Poly(A)+ RNA画分を mRNA purification kit (アマシャム バイオサイエンス社） を用いて調製後、 ゥサ ギ全脳 poly(A)+ RNA 1. O^gから PowerScript Reverse Transcriptase (クロン テック社） を用いてマニュアルに従って逆転写を行なった後、 Marathon cDNA Amplification kit (クロンテック社） を用いて 3，- RACE用の铸型であるゥサギ 全脳二本鎖 cDNAを作成した。 RACE PCR反応に用いたプライマーセットは、 1回目 の PCR反応では kit添付の Adaptor Primer 1とプライマー 1 (配列番号： 10 1) 、 2回目の PCR反応では kit添付の Nested Adaptor Primer 2とプライマ一 2 (配列番号： 102) を用いた。 反応は、 逆転写した cDNAのうち mRNA 2 ng相当 分を铸型に 50 の液量で行なった。 反応液の組成は、 プライマー濃度 0.2 M、 dMT混合液 0.2 mM、 LA-Taq (宝酒造) 1/100 volume, 2倍濃縮 GC Buffer I 1/2 volumeとした。 増幅のためのサイクルは、 どちらの PCRも 94°Cで 120秒保温した 後、 94°C · 30秒、 72T: · 4分のサイクルを 5回、 94°C · 30秒、 70°C · 4分のサイク ルを 5回、 94°C ' 30秒、 68DC · 4分のサイクルを 20回繰り返した後、 72°Cで 10分 保温した。 反応液を 1.2% ァガロースゲルで電気泳動し、 ェチジゥムプロマイ ドで染色した時に見える 1000 bp付近のバンドを DNA Extraction Kit (キアゲン 社） で抽出し、 DNA Ligation Kit (宝酒造） を用いてプラスミドベクター pGEM - T Easy Vector (プロメガ社） へサブクロ一ニングした後、 大腸菌 DH5ひ
(T0Y0B0社） へ導入した。 生じた形質転換体から QIAGEN Plasmid Mini Kit (キ ァゲン社) を用いてプラスミド DNAを精製した。 塩基配列決定のための反応は、 BigDye Terminator Cycle Sequence Ready Reaction Kit (ノ \°一キンエレマー 社） を用いて行なった。 蛍光式自動シーケンサーを用いて解読し、 ゥサギ GPR7 をコードする cDNAの 3'下流側配列である配列番号： 103で示される塩基配列 を得た。 (3) ゥサギ GPR7をコードする全長 cDNAのクローニング
ゥサギ全脳の total RNAは UNITECH社より購入した。 Poly(A)+ RNA画分を mRNA purification kit (アマシャム バイオサイエンス社） を用いて調製後、 ゥサ ギ全脳 poly (A)+ RNA 1.0 xgから PowerScript Reverse Transcriptase (クロン テック社） を用いて、 マニュアルに従って逆転写を行なった後、 Marathon cDNA Amplification kit (クロンテック社） を用いてゥサギ全脳二本鎖 cMAを作成し た。 ゥサギ GPR7遺伝子の 5'側配列をもとに作製したプライマ一 1 (配列番号： 104) およびゥサギ GPR7遺伝子の 3，側配列をもとに作製したプライマー 2 (配列番号： 105) を用いてゥサギ全脳二本鎖 cDNAを铸型に PCR反応を行なつ た。 反応は、 mRNA 1 ng相当分の cDNAを铸型に 100 1の液量で行なった。 反応液 の組成は、 プライマー濃度 0.5 iM、 dNTP混合液 0.2mM、 LA-Taq (宝酒造） 1/100 volume, 2倍濃縮 GC Buffer I 1/2 volumeとした。 増幅のためのサイクルは、 94°Cで 120秒保温した後、 94°C · 30秒、 68°C · 2分のサイクルを 40回繰り返した 後、 72°Cで 10分間保温した。 得られた反応液を QIAquick PCR purification Kit (キアゲン社） を用いて精製し、 DNA Ligation Kit (宝酒造） を用いてプラス ミドベクター pGEM-T Easy Vector (プロメガ社） へサブクローニングした後、 大腸菌 DH5Q! (T0Y0B0社） へ導入した。 生じた形質転換体から QIAGEN Plasmid Mini Kit (キアゲン社） を用いてプラスミド DNAを精製した。 塩基配列決定のた めの反 ϋま、 BigDye Terminator Cycle Sequence Ready Reaction Kit (ゾ ——キ ンエルマ一社） を用いて行なった。 蛍光式自動シーケンサ一を用いて解読し、 配列番号： 106に示す塩基配列を得た。 この配列には、 ゥサギ GPR7の全アミ ノ酸配列 （配列番号： 83) をコードする塩基配列が含まれていた。 次に、 そ のプラスミド DNAを制限酵素 Sal Iと Spe I (宝酒造） を用いて消化後、 反応液を 1.2% ァガロースゲルで電気泳動し、 ェチジゥムブロマイドで染色した時に見 える 1000 bp付近のバンドを DNA Extraction Kit (キアゲン社） を用いて回収し た。 この MA断片を、 pAKKOの Sal Iサイトと S e Iサイトに DNA Ligation Kit (宝酒造） を用いてサブクローニングした後、 大腸菌 DH5o; (T0Y0B0社） へ導入 し、 形質転換体 Escherichia coli DH5 α/ρΑΚΚΟ-rabbit GPR7を得た。 実施例 4
ゥサギ GPR8リガンドぺプチド前駆体蛋白質をコードする cDNAのクローニング (1) ゥサギ GPR8リガンドペプチド前駆体蛋白質をコードする cDNAの 5'上流側 配列のクローニング
ゥサギ全脳の total RNAは UNI TECH社より購入した。 Poly(A)+ RNA画分を mRNA purification kit (アマシャム バイオサイエンス社） を用いて調製後、 ゥサ ギ全脳 poly (A)+ RNA 1. O^gから PowerScript Reverse Transcriptase (クロン テック社） を用いてマニュアルに従って逆転写を行なった後、 Marathon cDNA Amplification kit (クロンテック社) を用いて 5，- RACE用の铸型であるゥサギ 全脳二本鎖 cDNAを作成した。 RACE PCR反応に用いたプライマ一セットは、 1回目 の PCR反応では kit添付の Adaptor Primer 1とプライマー 1 (配列番号： 10 7) 、 2回目の PCR反応では kit添付の Nested Adaptor Primer 2とプライマ一 2 (配列番号： 108) を用いた。 反応は、 逆転写した cDNAのうち mRNA 2 ng相当 分を錶型に 50A の液量で行なった。 反応液の組成は、 プライマ一濃度 0.2^iM、 dNTP混合液 0.2 mM、 LA-Taq (宝酒造） 1/100 volume, 2倍濃縮 GC Buffer II 1/2 volumeとした。 増幅のためのサイクルは、 どちらの PCRも 94°Cで 120秒保温した 後、 94°C · 30秒、 72°C · 4分のサイクルを 5回、 94°C · 30秒、 70°C · 4分のサイク ルを 5回、 94t · 30秒、 68°C · 4分のサイクルを 20回繰り返した後、 72°Cで 10分 保温した。 反応液を 1.5% ァガロースゲルで電気泳動し、 ェチジゥムブ口マイ ドで染色した時に見える 350bp付近のバンドを DNA Extraction Kit (キアゲン 社） で抽出し、 DNA Ligation Kit (宝酒造） を用いてプラスミドベクター pGEM- T Easy Vector (プロメガ社） へサブクローニングした後、 大腸菌 DH5 a
(T0Y0B0社） へ導入した。 生じた形質転換体から QIAGEN Plasmid Mini Kit (キ ァゲン社） を用いてプラスミド DNAを精製した。 塩基配列決定のための反応は、 BigDye Terminator Cycle Sequence Ready Reaction Kit ひ ——キンエリレマ—— 社） を用いて行なった。 蛍光式自動シーケンサーを用いて解読し、 ゥサギ GPR8 リガンドぺプチド前駆体蛋白質をコードする cDNAの 5'上流側配列である配列番 号： 109で示される塩基配列を得た。
( 2 ) ゥサギ GPR8リガンドぺプチド前駆体蛋白質をコードする cDNAの 3'下流側 配列のクローニング
ゥサギ全脳の total RNAは環 I TECH社より購入した。 Poly(A)+ RNA画分を mRNA purification kit (アマシャム バイオサイエンス社） を用いて調製後、 ゥサ ギ全脳 poly (A)+ RNA 1.0 gから PowerScr ipt Reverse Transcriptase (クロン テック社） を用いてマニュアルに従って逆転写を行なった後、 Marathon cDNA Amplification kit (クロンテック社） を用いて、 3，-RACE用の铸型であるゥサ ギ全脳二本鎖 cDNAを作成した。 RACE PCR反応に用いたプライマ一セットは、 1回 目の PCR反応では kit添付の Adaptor Primer 1と縮重プライマ一 1 (配列番号： 1 10) 、 2回目の PCR反応では kit添付の Nested Adaptor Primer 2と縮重プラ イマ一 2 (配列番号： 1 1 1) を用いた。 反応は、 逆転写した cDNAのうち mRNA 2 ng相当分を铸型に 50 1の液量で行なった。 反応液の組成は、 プライマ一濃度 0.2 iM、 dNTP混合液 0.2 、 LA-Taq (宝酒造) 1/100 vol匿、 2倍濃縮 GC Buffer I 1/2 volumeとした。 増幅のためのサイクルは、 どちらの PCRも 94°Cで 120秒保温した後、 94°C · 30秒、 72°C · 4分のサイクルを 5回、 94°C · 30秒、 70°C · 4分のサイクルを 5回、 94°C · 30秒、 68°C · 4分のサイクルを 20回繰り返し た後、 72°Cで 10分保温した。 反応液を 1.2% ァガロースゲルで電気泳動し、 ェ チジゥムブロマイドで染色した時に見える 600 bp付近のバンドを DNA
Extraction Kit (キアゲン社） で抽出し、 DNA Ligation Kit (宝酒造） を用い てプラスミドベクタ一 pGEM- T Easy Vector (プロメガ社） へサブクロ一ニング した後、 大腸菌 DH5Q! (T0Y0B0社） へ導入した。 生じた形質転換体から QIAGEN Plasmid Mini Kit (キアゲン社） を用いてプラスミド DNAを精製した。 塩基配列 決定の 7こめの反 は、 BigDye Terminator Cycle Sequence Ready Reaction Kit (パーキンエルマ一社） を用いて行なった。 蛍光式自動シーケンサ一を用いて 解読し、 ゥサギ GPR8リガンドぺプチド前駆体蛋白質をコ一ドする cDNAの 3，下流 側配列である配列番号： 1 12で示される塩基配列を得た。
( 3 ) ゥサギ GPR8リガンドぺプチド前駆体蛋白質をコードする全長 cDNAのク口 一二ング
ゥサギ全脳の total RNAは UNITECH社より購入した。 Po (A)+ RNA画分を mRNA purification kit (アマシャム バイオサイエンス社） を用いて調製後、 ゥサ ギ全脳 poly (A)+ RNA 1.0 igから PowerScr ipt Reverse Transcriptase (クロン テック社） を用いてマニュアルに従って逆転写を行なった後、 Marathon cDNA Amplification kit (クロンテック社） を用いてゥサギ全脳二本鎖 cDNAを作成し た。 ゥサギ GPR8リガンドぺプチド前駆体蛋白質をコードする遺伝子の 5'側配列 をもとに作製したプライマー 1 (配列番号： 11 3) およびゥサギ GPR8リガン ドぺプチド前駆体蛋白質をコードする遺伝子の 3'側配列をもとに作製したブラ イマ一 2 (配列番号： 1 14) を用いてゥサギ全脳二本鎖 cDNAを铸型に PCR反応 を行なった。 反応は、 mRNA 1 ng相当分の cDNAを铸型に 200 1の液量で行なった。 反応液の組成は、 プライマー濃度 0.5 M、 dNTP混合液 0.2mM、 LA-Taq (宝酒造） 1/100 volume, 2倍濃縮 GC Buffer II 1/2 volumeとした。 増幅のためのサイク ルは、 94°Cで 120秒保温した後、 94 · 30秒、 72 · 1分のサイクルを 5回、 94 · 30秒、 70°C · 1分のサイクルを 5回、 94°C · 30秒、 68 · 1分のサイクルを 35回繰り返した後、 72 で 7分間保温した。 得られた反応液を QIAquick PCR purification Kit (キアゲン社） を用いて精製し、 DNA Ligation Kit (宝酒 造） を用いてプラスミドベクター pGEM-T Easy Vector (プロメガ社） へサブク ローニングした後、 大腸菌 DH5a (T0Y0B0社） へ導入した。 生じた形質転換体か ら QIAGEN Plasmid Mini Kit (キアゲン社） を用いてプラスミド DNAを精製した。 塩基配列決定のための反応は、 BigDye Terminator Cycle Sequence Ready Reaction Kit (パーキンエルマ一社） を用いて行なった。 蛍光式自動シーケン サ一を用いて解読し、 配列番号： 1 15に示す塩基配列を得た。 この DNA配列に は、 ヒト、 ブ夕、 ラットおよびマウス GPR8リガンドペプチドのアミノ酸配列に 類似したゥサギ GPR8リガンドペプチドと予想されるペプチドをコードするよう なフレームが存在するが、 その 5'上流側には蛋白翻訳の開始コドンであると予 想される ATGが存在しない。 しかし、 これまでに幾つかの蛋白質で ATG以外のコ ドンを開始コドンとすることが予想されている例が報告されている 〔ヒト塩基 性線維芽細胞増殖因子 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA、 86巻、 1836-1840頁、 1989年、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86卷、 3978- 3981頁、 1989年) 、 マウス レチノイン酸受容体 )34 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89巻、 2718頁、 1992 年） 、 ヒトホスホリポシルピロリン酸合成酵素 （J. Biol. Chem.、 265卷、 1649卜 16497頁、 1990年） 、 ショウジヨウバエコリンァセチル転移酵素 （J.
Biol. Chem. 265巻、 21714 - 21719頁、 1990年） 〕 。 これらの例では、 ATGに代 わり Leuをコードする CTGが開始コドンとして仮定されていることが多い。 ゥサ ギ GPR8リガンドぺプチド前駆体蛋白質においても同様であると考え、 ブタある いはラットの GPR8リガンドぺプチド前駆体蛋白質との比較からこれらの前駆体 蛋白質における開始コドンと予想される ATGにほぼ対応する位置に存在する CTG コドンを開始コドンと仮定し、 前駆体蛋白質の配列を推定した。 この仮想的ゥ サギ GPR8リガンドペプチド前駆体蛋白質のアミノ酸配列を配列番号： 1 1 6に 示した。 ゥサギ GPR8リガンドペプチドのァミノ酸配列と予想される配列の力ル ポキシ末端側には GPR8リガンドペプチドのヒト、 ブタ、 ラットあるいはマウス ホモログ前駆体蛋白の場合と同様に、 通常の生理活性ペプチドが切り出される と考えられる Arg_Argの配列 (Ann. N. Y. Acad. Sci. 839巻、 9 - 24頁、 1998 年） が 2ケ所存在した。 これらのことから、 GPR8リガンドペプチドのゥサギホモ ログのアミノ酸配列は配列番号： 8 5および 8 7のいずれかもしくは両方であ ると推定された。 なお、 配列番号： 8 7の 23残基型ゥサギ GPR8リガンドぺプチ ドのアミノ酸配列は、 23残基型ヒト GPR8リガンドペプチドのアミノ酸配列 （配 列番号： 1) と一致している。
次に、 配列番号： 1 1 5の塩基配列を含むプラスミド DNA 50 ngを铸型にして ゥサギ GPR8リガンドぺプチド前駆体蛋白質遺伝子の 5'側配列をもとに作製した プライマ一 1 (配列番号： 1 1 7) およびゥサギ GPR8リガンドペプチド前駆体 蛋白質遺伝子の 3'側配列をもとに作製したプライマ一 2 (配列番号： 1 1 8) を用いて の液量で PCR反応を行なった。 反応液の組成は、 プライマ一濃度 0.5 M dNTP混合液 0.2mM LA-Taq (宝酒造) 1/100 vol 2倍濃縮 GC Buffer II 1/2 volumeとした。 増幅のためのサイクルは、 94°Cで 120秒保温した後、 94°C · 30秒、 68°C · 1分のサイクルを 15回繰り返した後、 72°Cで 7分間保温した。 得られた反応液を QIAquick PCR purification Kit (キアゲン社） を用いて精製 後、 制限酵素 Sal Iと Spe I (宝酒造） を用いて消化した。 この DNA断片を動物細 胞発現ベクター pAKKOの Sal Iサイトと Spe Iサイトに DNA Ligation Kit (宝酒 造） を用いてサブクロ一ニングした後、 大腸菌 DH5 Q! (T0Y0B0社） へ導入した。 生じた形質転換体から QIAGEN 'Plasmid Mini Ki t (キアゲン社） を用いてプラス ミド DNAを精製した。 塩基配列決定のための反応は、 BigDye Terminator Cyc le Sequence Ready Reac t ion Ki t (パーキンエルマ一社） を用いて行なった。 蛍光 式自動シーケンサ一を用いて解読し、 配列番号： 1 1 9に示す塩基配列を得た。 このプラスミドで大腸菌 DH5 « (T0Y0B0社） を形質転換して Escher ichia col i DH5 α/ρΑΚ Ο-rabbi t prepro_NPWを得た。 産業上の利用可能性
本発明のポリペプチドまたは受容体、 本発明の D NAは、 抗利尿剤または利 尿剤のスクリーニングに有用である。 さらに、 例えば蓄尿障害 〔例、 頻尿、 尿 失禁 （例、 切迫性尿失禁、 腹圧性尿失禁、 機能性尿失禁など） など〕 、 多尿症、 尿崩症 （例、 下垂体性尿崩症、 腎性尿崩症など） 、 高ナトリウム血症、 代謝性 アルカローシス、 低カリウム血症、 Cushing症候群などの予防 ·治療剤、 あるい は腎性浮腫、 尿排出障害 （例、 fl旁胱収縮障害、 尿道通過障害、 排尿困難、 排尿 痛、 尿路閉塞など） 、 低ナトリウム血症、 抗利尿ホルモン分泌不適症候群
(SIADH) 、 高血圧などの予防 ·治療剤などのスクリーニングにも有用である。 本発明のポリペプチドまたは受容体、 本発明の D NA、 本発明のポリペプチド または受容体の活性を促進する化合物またはその塩は、 低毒性で安全な抗利尿 剤として有用であり、 蓄尿障害 〔例、 頻尿、 尿失禁 （例、 切迫性尿失禁、 腹圧 性尿失禁、 機能性尿失禁など） など〕 、 多尿症、 尿崩症 （例、 下垂体性尿崩症、 腎性尿崩症など） 、 高ナトリウム血症、 代謝性アルカローシス、 低カリウム血 症、 Cushing症候群などの予防 ·治療剤などとして有用である。 本発明の抗体、 本発明のアンチセンス D N A、 本発明のポリペプチドまたは受容体の活性を阻 害する化合物またはその塩は、 低毒性で安全な利尿剤として有用であり、 腎性 浮腫、 尿排出障害 （例、 膀胱収縮障害、 尿道通過障害、 排尿困難、 排尿痛、 尿 路閉塞など） 、 低ナトリウム血症、 抗利尿ホルモン分泌不適症候群 （SIADH) 、 高血圧などの予防 ·治療剤などとして有用である。

Claims

請求 の 範 囲
1 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステル またはその塩を含有してなる抗利尿剤。
2 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステル またはその塩の活性を促進する化合物またはその塩を含有してなる抗利尿剤。
3 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステル またはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩を含有してなる利尿剤。
4 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステル をコードす ポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有してなる抗 利尿剤。
5 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステル またはその塩を用いることを特徴とする抗利尿剤または利尿剤のスクリ一ニン グ方法。
6 . 配列番号： 7 3、 配列番号： 7 5、 配列番号： 7 7または配列番号： Ί 9で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有 する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩を用いることを特徴とする 抗利尿剤または利尿剤のスクリ一ニング方法。
7 . さらに、 配列番号： 7 3、 配列番号： 7 5、 配列番号： 7 7または配列 番号： 7 9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配 列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩を用いる請求項 5 記載のスクリーニング方法。
8 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステル 2004/041301 ·· ··· ： ··· : ··· " PCT/JP2003/014102'",
109 またはその塩を含有することを特徴とする抗利尿剤または利尿剤のスクリ一二 ング用キッ卜。
9 . 配列番号： 7 3、 配列番号： 7 5、 配列番号： 7 7または配列番号： 7 9で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有 する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩を含有することを特徴とす る抗利尿剤または利尿剤のスクリーニング用キット。
1 0 . さらに、 配列番号： 7 3、 配列番号： 7 5、 配列番号： 7 7または配 列番号： 7 9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸 配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩を含有する請求 項 8記載のスクリーニング用キット。
1 1 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の ァミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステ ルをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを用いることを 特徴とする抗利尿剤または利尿剤のスクリーニング方法。
1 2 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有するポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステ ルをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有すること を特徴とする抗利尿剤または利尿剤のスクリーニング用キット。
1 3 . (i) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 —のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのェ ステルまたはその塩に対する抗体、 または （i i) 配列番号： 7 3、 配列番号： 7 5、 配列番号： 7 7または配列番号： 7 9で表されるアミノ酸配列と同一も しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチ ドまたはその塩に対する抗体を含有してなる利尿剤。
1 4. (i) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含有するポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはそのェ ステルまたはその塩をコードする D NAの塩基配列に相補的もしくは実質的に 相補的な塩基配列またはその一部、 または （i i) 配列番号： 7 3、 配列番号： 7 5、 配列番号： 7 7または配列番号： 7 9で表されるアミノ酸配列と同一も 2004/041301 ： ···： ·*· : ,·· PCT/JP2003/014102"**
110 しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチ ドまたはその塩をコードする D N Αの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補 的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチドを含有 してなる利尿剤。 - 1 5 . 多尿症、 尿崩症、 高ナトリウム血症、 代謝性アルカロ一シス、 低カリ ゥム血症または Cushing症候群の予防 ·治療剤である請求項 1、 請求項 2または 請求項 4記載の抗利尿剤。
1 6 . 腎性浮腫または抗利尿ホルモン分泌不適症候群の予防 ·治療剤である 請求項 3、 請求項 1 3または請求項 1 4記載の利尿剤。
1 7 . 哺乳動物に対して、 （i) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一 もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのァ ミドもしくはそのエステルまたはその塩、 （i i) 該ポリペプチドもしくはその アミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進する化合物またはその 塩、 または （i i i) 該ポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルを コードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドの有効量を投与する ことを特徴とする尿生成抑制方法。
1 8 . 哺乳動物に対して、 （i) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一 もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するポリぺプチドもしくはそのァ ミドもしくはそのエステルまたはその塩、 (i i) 該ポリペプチドもしくはその アミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進する化合物またはその 塩、 または （i i i) 該ポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルを コードするポリヌクレオチドの有効量を投与することを特徴とする多尿症、 尿 崩症、 高ナトリウム血症、 代謝性アルカローシス、 低カリウム血症または Cushing症候群の予防 ·治療法。
1 9 . 哺乳動物に対して、 （i) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一 もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのァ ミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩、 (i i) 上記ポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその 塩に対する抗体、 （i i i) 配列番号： 7 3、 配列番号： 7 5、 配列番号： 7 7ま たは配列番号： 7 9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する 抗体、 (iv) 上記ポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまた はその塩をコードする D NAの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩 基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチド、 または （V) 上記蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩をコードする D N Aの塩基 配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するァ ンチセンスポリヌクレオチドの有効量を投与することを特徴とする尿生成促進 方法。
2 0 . 哺乳動物に対して、 （i) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一 もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのァ ミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩、 (i i) 上記ポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその 塩に対する抗体、 （i i i) 配列番号： 7 3'、 配列番号： 7 5、 配列番号： 7 7ま たは配列番号： 7 9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩に対する 抗体、 (iv) 上記ポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまた はその塩をコードする D N Aの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩 基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチド、 または （V) 上記蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩をコードする D N Aの塩基 配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するァ ンチセンスポリヌクレオチドの有効量を投与することを特徴とする腎性浮腫ま たは抗利尿ホルモン分泌不適症候群の予防 ·治療法。
2 1 . (i) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのェ ステルまたはその塩、 または （i i) 配列番号： 7 3、 配列番号： 7 5、 配列番 号： 7 7または配列番号： 7 9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的 に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその 塩の活性を促進することを特徴とする尿生成抑制方法。 WO 2004/041301 ： 、· ： ··· : ··· PCT/JP2003/014102 * * * *
112
2 2 . (i) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含有するポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはそのェ ステルまたはその塩、 または （i i) 配列番号： 7 3、 配列番号： 7 5、 配列番 号： 7 7または配列番号： 7 9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的 5 に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその 塩の活性を促進することを特徴とする多尿症、 尿崩症、 高ナトリウム血症、 代 謝性アルカローシス、 低力リゥム血症または Cushing症候群の予防 ·治療法。 2 3 . (0 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含有するポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはそのェ 10 ステルまたはその塩、 または （i i) 配列番号： 7 3、 配列番号： 7 5、 配列番 号： 7 7または配列番号： 7 9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的 に同一のァミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその 塩の活性を阻害することを特徴とする尿生成促進方法。
2 4. (0 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同
15 一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのェ ステルまたはその塩、 または （i i) 配列番号： 7 3、 配列番号： 7 5、 配列番 号： 7 7または配列番号： 7 9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的
' に同一のァミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその 塩の活性を阻害することを特徴とする腎性浮腫または抗利尿ホルモン分泌不適
20 症候群の予防 ·治療法。
2 5 . 多尿症、 尿崩症、 高ナトリウム血症、 代謝性アルカローシス、 低カリ ゥム血症または Cushing症候群の予防 ·治療剤を製造するための、 （i) 配列番 号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を 含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、
25 (i i) 該ポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩 の活性を促進する化合物またはその塩、 または （i i i) 該ポリペプチドもしくは そのアミドもしくはそのエステルをコードするポリヌクレオチドの使用。
2 6 . 腎性浮腫または抗利尿ホルモン分泌不適症候群の予防 ·治療剤の製造 のための、 （i) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 2004/041301^ ： ··· · "* ： ··· · PCT/JP2003/014102 ····
113 同一のァミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはその エステルまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩、 （i i) 上記ポリ ぺプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩に対する抗体、
(i i i) 配列番号： 7 3、 配列番号： 7 5、 配列番号： 7 7または配列番号： 7 9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有 する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、 （iv) 上記 ポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩をコ一ド する D N Aの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその 一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチド、 または （V) 上記蛋白質もしく はその部分べプチドまたはその塩をコードする D N Aの塩基配列に相補的もし くは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌ クレオチドの使用。
2 7 . 配列番号： 8 1または配列番号： 8 3で表されるアミノ酸配列と同一 もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩。
2 8 . 配列番号： 8 1または配列番号： 8 3で表されるアミノ酸配列からな る蛋白質またはその塩。
2 9 . 請求項 2 7記載の蛋白質の部分ペプチドまたはその塩。
3 0 . 請求項 2 7記載の蛋白質またはその部分ペプチドをコードするポリヌ クレオチドを含有するポリヌクレオチド。
3 1 . D NAである請求項 3 0記載のポリヌクレオチド。
3 2 . 配列番号： 8 2または配列番号： 8 4で表される塩基配列からなるポ リヌクレオチド。
3 3 . 請求項 3 0記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
3 4. 請求項 3 3記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
3 5 . 請求項 3 4記載の形質転換体を培養し、 請求項 2 7記載の蛋白質また はその部分ペプチドを生成 ·蓄積せしめることを特徴とする請求項 2 7記載の 蛋白質またはその部分べプチドまたはその塩の製造法。
3 6 . 請求項 2 7記載の蛋白質またはその部分ペプチドまたはその塩に対す る ifL体。
3 7 . 請求項 3 6記載の抗体を含有してなる診断薬。
3 8 . 請求項 3 0記載のポリヌクレオチドに相補的または実質的に相補的な 塩基配列またはその一部を有するアンチセンスポリヌクレオチド。
3 9 . D NAである請求項 3 8記載のアンチセンスポリヌクレオチド。 4 0 . 請求項 2 7記載の蛋白質またはその部分ペプチドを用いることを特徴 とする抗利尿剤または利尿剤のスクリーニング方法。
4 1 . 請求項 2 7記載の蛋白質またはその部分ペプチドを含有することを特 徴とする抗利尿剤または利尿剤のスクリーニング用キット。
4 2 . 配列番号： 8 5で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有するポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはそのエス テルまたはその塩。
4 3 . 配列番号： 8 5で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドもしく はそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩。
4 4 . 請求項 4 2記載のポリぺプチドの部分べプチドまたはその塩。
4 5 . 請求項 4 2記載のポリペプチドまたはその部分ペプチドをコードする ポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
4 6 . D NAである請求項 4 5記載のポリヌクレオチド。
4 7 . 配列番号： 8 6で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド。
4 8 . 請求項 4 5記載のポリヌクレオチドを含有する組換えべクタ一。 4 9 . 請求項 4 8記載の組換えべクタ一で形質転換された形質転換体。
5 0 . 請求項 4 9記載の形質転換体を培養し、 請求項 4 2記載のポリべプチ ドまたはその部分ペプチドを生成 ·蓄積せしめることを特徴とする請求項 4 2 記載のポリぺプチドまたはその部分べプチドまたはその塩の製造法。
5 1 . 請求項 4 2記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエス テルまたはその部分べプチドまたはその塩に対する抗体。
5 2 . 請求項 5 1記載の抗体を含有してなる診断薬。
5 3 . 請求項 4 5記載のポリヌクレオチドに相補的または実質的に相補的な 塩基配列またはその一部を有するアンチセンスポリヌクレオチド。
5 4. D NAである請求項 5 3記載のアンチセンスポリヌクレオチド。 、
2004/041301
115
5 5 . 請求項 4 2記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエス テルまたはその塩を用いることを特徴とする抗利尿剤または利尿剤のスクリ一 ニング方法。
5 6 . 請求項 4 2記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエス テルまたはその塩を含有することを特徴とする抗利尿剤または利尿剤のスクリ 一二ング用キッ卜。
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