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WO2003023017A1 - Verfahren zur transformation von amycolatopsis sp. dsm 9991 und dsm 9992 - Google Patents

Verfahren zur transformation von amycolatopsis sp. dsm 9991 und dsm 9992 Download PDF

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WO2003023017A1
WO2003023017A1 PCT/EP2002/009619 EP0209619W WO03023017A1 WO 2003023017 A1 WO2003023017 A1 WO 2003023017A1 EP 0209619 W EP0209619 W EP 0209619W WO 03023017 A1 WO03023017 A1 WO 03023017A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
dsm
amycolatopsis
dna
transformation
mixture
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/EP2002/009619
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Jürgen Rabenhorst
Alexander Steinbüchel
Horst Priefert
Sandra Achterholt
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Haarmann and Reimer GmbH
Symrise AG
Original Assignee
Haarmann and Reimer GmbH
Symrise AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Haarmann and Reimer GmbH, Symrise AG filed Critical Haarmann and Reimer GmbH
Priority to EP02797929A priority Critical patent/EP1427809A1/de
Publication of WO2003023017A1 publication Critical patent/WO2003023017A1/de
Priority to US10/796,306 priority patent/US20040203123A1/en
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/24—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carbonyl group
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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    • C12N15/76—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Actinomyces; for Streptomyces

Definitions

  • the invention relates to a method for transforming Amycolatopsis sp. DSM 9991 or DSM 9992 and the use of the strains so transformed for
  • Vanillin is an important flavoring substance that is widely used in the food and luxury food industry. It is manufactured chemically mainly from lignin contained in spent sulfite liquors, and by oxidation of eugenol or isoeugenol. However, chemically produced vanillin has the disadvantage that it is not a natural product in the food law sense and therefore must not be called a natural flavoring.
  • EP 761 817 A describes a process for the fermentative production of natural vanillin from ferulic acid, two strains of the genus
  • Step (1) of the method according to the invention relates to the cultivation of Amycolatopsis sp. DSM 9991 or DSM 9992 mycelia in a culture medium.
  • Suitable culture media are those known in the literature for the cultivation of mycelia of the species Amycolatopsis.
  • Particularly suitable culture media are complex media such as, for example, YMG medium (0.4% [w / v] yeast extract, 1% [w / v] malt extract, 0.4% [w / v] glucose, pH 7.2), TYN medium ( 0.25% [w / v] yeast extract, 1% [w / v] tryptone, 0.5% [w / v] NaCl, pH 7.2) or TSB medium
  • the cultivation is preferably carried out at temperatures from 30 to 48 ° C., particularly preferably from 39 to 42 ° C.
  • the procedure is preferably such that a preculture of Amycolatopsis sp. DSM 9991 or DSM 9992 mycelia is used.
  • the preculture is preferably used at the same temperature and in the same culture medium as the actual culture.
  • To prepare a culture of Amycolatopsis sp. DSM 9991 or DSM 9992 mycelia is a part of the preculture preferred after 16 to 24 hours, particularly preferably after 18 to 22 hours, very particularly preferably after 19 to 20 hours, for inoculation.
  • the growth of Amycolatopsis sp. DSM 9991 or DSM 9992 mycelia in the culture medium can be determined, for example, using spectrometric methods.
  • the growth is preferably determined via the optical density of the culture.
  • the transformation of Amycolatopsis sp. DSM 9991 or DSM 9992 mycelia 4.5 to 9 hours after entering the stationary phase. It was surprisingly found that particularly high transformation rates can be achieved in this time window, which are significantly higher than when using the transformation methods described in the prior art.
  • the transformation is particularly preferably carried out 5 to 8.5 hours after entry into the stationary phase, very particularly preferably after 6.5 to 7.5 hours.
  • the mixture mentioned is referred to below as a transformation mixture.
  • an aliquot of the mycelium culture is preferably centrifuged off, washed and then resuspended in the washing solution or in a suitable buffer, preferably in TE buffer.
  • suitable buffers can be used as washing solution, preferably TRIS-EDTA buffer (10 mM TRIS-HC1, pH 8.0, 1 mM EDTA) was used.
  • TRIS-EDTA buffer 10 mM TRIS-HC1, pH 8.0, 1 mM EDTA
  • the mycelium culture is preferably diluted to an optical density of 25 to 160 (at 400 nm), particularly preferably to an optical density of 30 to 100 (at 400 nm), very particularly preferably to an optical density of 40 to 60 (at 400 nm).
  • the mycelium culture is preferably brought into contact by mixing with the above-mentioned transformation mixture.
  • the mixture thus obtained is preferably incubated for 20 to 60 minutes, particularly preferably for 30 to 40 minutes at a temperature of preferably 30 to 46 ° C., particularly preferably at 37 to 40 ° C. It has proven to be advantageous to wash the mycelia after the incubation.
  • Isotonic media are preferably used as washing liquids, particularly preferably S27M medium (7.32% [w / v] D-mannitol, 0.5% [w / v] peptone, 0.3% [w / v] yeast extract, 0, 2% [w / v] CaC03) You can wash one or more times.
  • the transformation mixture used in the process according to the invention contains the above-mentioned compounds a) - e).
  • the transformation mixture used in the method according to the invention contains 0.25 to 10 ⁇ g / ml of DNA to be transformed, preferably 1 to 7.5 ⁇ g / ml, particularly preferably 2 to 6 ⁇ g / ml.
  • the DNA to be transformed can be in the form of single-stranded or double-stranded DNA; DNA in the form of double-stranded circular DNA (plasmids) is preferably used.
  • the plasmids preferably used in the transformation contain in particular the following constituents: at least one origin of replication, which is the efficient one
  • the plasmid preferably additionally contains an origin of replication, which enables the efficient multiplication of the plasmid in a cell which is suitable for the simple production and isolation of the plasmid (for example Escherichia coli). Furthermore, the plasmid preferably contains a resistance gene, which selects Amycolatopsis sp. DSM 9991 or 9992 cell clones containing the plasmid enables, preferably a kanamycin resistance gene, but not an erythromycin or thiostrepton resistance gene, since Amycolatopsis sp. DSM 9991 or 9992 an inherent erythromycin or.
  • the plasmid preferably contains restriction sites for the incorporation of foreign DNA fragments.
  • the DNA to be transformed is preferably a DNA which has a low degree of methylation. This can be achieved by isolating the DNA to be transformed from an organism that is not or only to a small extent capable of modifying DNA. These organisms are known to the person skilled in the art, for example different Escherichia coli strains such as E. coli ET12567 (dam, dem, hsd) or E. coli JMllO (dam, dem) or Amycolatopsis sp. DSM 9991 or 9992 can be used.
  • the transformation mixture used in the process according to the invention contains 0.4 to 0.7 M CsCl, preferably 0.5 to 0.675 M CsCl, particularly preferably 0.575 to 0.625 M CsCl.
  • the transformation mixture used in the process according to the invention contains 0 to 9 mM MgCi2, preferably 2.5 to 7.5 mM MgCi2, particularly preferably 3.5 to 5.5 mM MgCl 2 .
  • the transformation mixture used in the process according to the invention contains 30 to 50% [w / v] polyethylene glycol 1000 (hereinafter referred to as PEG 1000), preferably 31 to 40% [w / v] PEG 1000, particularly preferably 32 to 35% [w / v] ] PEG 1000.
  • PEG 1000 polyethylene glycol 1000
  • the use of PEG 1000 is advantageous because when using PEG, which had a higher or a lower molecular weight, only low transformation rates could be achieved.
  • the transformation mixture used in the method according to the invention contains 10 to 50 ⁇ g / ml DNA, which is different from a), preferably 12 to 30 ⁇ g / ml, particularly preferably 15 to 25 ⁇ g / ml.
  • the presence of e) in the transforma- tion mixture allows the concentration of component a) to be kept low.
  • Calf thymus DNA is preferably used for this, particularly preferably ultrasound-treated calf thymus DNA.
  • the transformation mixture used in the method according to the invention contains
  • the transformation mixture used in the method according to the invention contains
  • the mycelium culture is preferably treated with an R2L agarose solution, as described in J. Madon et al. J Bacteriol. 173, 1991, 6325-6331, mixed, the R2L solution being preferably heated to 37 to 46 ° C., particularly preferably to 40 to 42 ° C.
  • the mixture is then applied to agar plates, preferably S27M agar plates.
  • the incubation time is preferably 14 to 22 hours, particularly preferably 16 to 20 hours, the incubation temperature is preferably 30 ° C.
  • the selection is preferably carried out by overlaying the plates with antibiotic-containing ones Soft agar (0.5% [w / v] agar), preferably S27M soft agar, and subsequent incubation at preferably 30 to 37 ° C. for preferably 5 to 10 days.
  • the method according to the invention makes it possible to use Amycolatopsis sp. Transform DSM 9991 and DSM 9992 in a simple manner, whereby high transformation rates are obtained.
  • the vector pRL60 (Lal et al, J. Antibiotics 51, 1998, 161-169) was used to construct a plasmid suitable for the transformation.
  • This 10.2 kbp vector contained an origin of replication (pA-rep) for various Amycolatopsis mediterranei strains, an origin of replication (pBR-ori) for Escherichia coli, a kanamycin resistance gene, an erythromycin resistance gene and an ⁇ -amylase
  • the plasmid was subjected to restriction digest with EcoRI, separated in an agarose gel and a 6 kbp fragment containing the kanamycin resistance gene, pA-rep and pBR-ori was isolated therefrom. The fragment was religated and the plasmid pRL ⁇ 6 (5843 bp) thus obtained was transformed into competent E. coli ET12567 cells and isolated therefrom. Restriction digestion, separation in agarose gel, isolation of the desired DNA fragment, religation, transformation in E. coli and isolation of the plasmid were carried out according to standard protocols customary in molecular biology (see, for example, J. Sambrook et al, Molecular cloning: a laboratory manual, 2 nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
  • Example 2 Protoplast transformation of Amycolatopsis sp. DSM 9992
  • Protoplasting buffer for Streptomycetes 103 g sucrose, 0.25 g MgCl 2 x 6 H 2 O, 2.02 g K 2 SO 4 , 2 ml trace element solution
  • Transformation buffer for protoplasts All solutions are prepared separately and autoclaved and then mixed as indicated:
  • dilution series (10 '1 - 10 " ) were applied in P buffer or in H 2 Obid es t ( + 0.01% [w / v] sodium dodecyl sulfate) and 100 ⁇ l of the dilution stages with 3 ml "Top agar” (38 ° C, P buffer mixed with 0.4% [w / v] "low melting point' ⁇ garose, Sigma) on R3 regeneration medium for
  • Protoplast applied The plates were sterile for 15-20 min Workbench dried before incubating at 37 ° C. After 4-6 days, the number of colonies per plate was counted.
  • the mycelium was grown for 15 h in 50 ml of YMG medium with 5% [v / v] PEG 6000 in 300 ml baffle flasks at 37 ° C. and 150 rpm. Under sterile conditions, the cell material was centrifuged at 3,000 rpm for 15 min and then washed twice with 15 ml of a sterile 10.3% [w / v] sucrose solution. The centrifuged mycelium pellet was subjected to a lysozyme treatment in order to achieve a (partial) digestion of the murein saccule.
  • the pellet was resuspended in 4 ml of lysozyme solution (2 mg / ml dissolved in sterile P buffer, see below) and incubated at 30 ° C. with gentle shaking (120 rpm). The course of the protoplasting was monitored microscopically over the entire period. Protoplasts were already recognizable after 15 - 30 min. After 2 to 2 l A h, the suspension was aspirated and aspirated 3 times with a sterile 5 ml pipette in order to achieve better protoplast release. The suspension was then incubated for a further 15-30 minutes.
  • Buffer resuspended The buffer volume (approx. 1 - 3 ml) was chosen so that a Titer of approximately 10 9-10 10 protoplasts per ml was achieved.
  • the protoplasts treated in this way could be stored at - 70 ° C for a long time until further use.
  • the cell aliquots were slowly frozen on ice at - 70 ° C, the protoplasts were thawed under lukewarm water.
  • Plasmid DNA (in TE buffer; max. 20 ⁇ l) was added to this protoplast suspension.
  • a control without plasmid DNA was carried out as a control.
  • 0.5 ml of transformation buffer with 25% [v / v] PEG 1 550 was added and the pipette was sucked up and down twice and 50 ⁇ l of the suspension with 3 ml of “Topagar” (38 ° C., P Buffer mixed with 0.4% [w / v] “low melting point” garose, Sigma) plated on regeneration medium R3.
  • Antibodies 50 ⁇ g / ml kanamycin were added to the medium R3 to select transformed protoplasts. After drying the plates under the sterile workbench (approx. 30 min), the plates were incubated for 4-6 days at 37 ° C.
  • the colony number was then determined.
  • Example 3 (not according to the invention) Electroporation of Amycolatopsis sp. DSM 9992
  • TYN-medium trypton 10 g; yeast extract 2.5 g; NaCl 5 g; H 2 O bidest to 1000 ml; pH 7.2
  • the mycelium was harvested by centrifugation (4,500 rpm, 4 ° C., 15 min) and then washed twice with ice-cold salt-free water (Milli-Q Plus treatment system for high-purity water; MILLIPORE, Eschborn, Germany).
  • the mycelium pellet was resuspended in 200 ⁇ l lysozyme solution (4 mg / ml; in 10% [v / v] glycerol) and used for
  • each of the pretreated mycelium suspension were mixed with the plasmid DNA to be transferred (0.1-5.0 ⁇ g / ⁇ l) and transferred to cooled electroporation cells (Eppendorf-Netheler-Hinz, Hamburg) with a 2 mm electrode gap.
  • the electroporation was carried out at an electrical field strength of 7.5 kV / cm (capacity
  • a transformation rate of 2 x 10 2 transformants per ⁇ g of plasmid DNA was obtained with a field strength of 7.5 kV cm -1 and a pulse of 4.6-5.2 ms.
  • the transformation mixture was incubated at 37 ° C for 40 min.
  • the cells were washed twice with 1 ml of S27M medium each.
  • the mycelium was resuspended in 400 ⁇ l of S27M medium and incubated on ice for 10 min. Subsequently, aliquots of the cells were mixed with R2L agarose solution (at a temperature of 42 ° C.) and applied to well-dried S27M agar plates. If necessary, the batches were previously diluted with S27M medium.
  • the selection was made by overlaying the plates with kanamycin-containing soft agar (S27M medium with 5 g / 1 agar) and subsequent incubation at 37 ° C for 5-10 days.
  • PEG 1000 was used in a final concentration of 32.5 5 [w / v], MgCl 2 in a final concentration of 5 mM, CsCl in a final concentration of 0.6 M and calf thymus DNA in a final concentration of 19 ng / ⁇ l 0.5 ⁇ g of the plasmid pRLE6 (isolated according to Example 1) was used.
  • the example was repeated using the plasmids described in Table 8 instead of the plasmid pRLE6 isolated from E. coli ET12567.
  • the plasmid isolated from E. coli XLl-Blue has a higher degree of methylation than that from E. coli ET12567 and Amycolatopsis sp. DSM 9992 isolated plasmid.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Transformation von $iAmycolatopsis sp. DSM 9991 und DSM 9992 und die Verwendung der so transformierten Stämme zur Herstellung von Vanillin, vorzugsweise zur Herstellung von Vanillin aus Ferulasäure.

Description

Verfahren zur Transformation von Amycolatopsis sp. DSM 9991 und DSM 9992
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Transformation von Amycolatopsis sp. DSM 9991 oder DSM 9992 und die Verwendung der so transformierten Stämme zur
Herstellung von Vanillin, vorzugsweise zur Herstellung von Vanillin aus Ferula- säure.
Vanillin ist ein wichtiger, in der Nahrungs- und Genussmittelindustrie viel ver- wendeter Aromastoff. Die Herstellung erfolgt auf chemischem Wege hauptsächlich aus in Sulfitablaugen enthaltenem Lignin, sowie durch Oxidation von Eugenol oder Isoeugenol. Auf chemischem Wege hergestelltes Vanillin hat jedoch den Nachteil, dass es im lebensmittelrechtlichen Sinne kein Naturstoff ist und deshalb nicht als natürlicher Aromastoff bezeichnet werden darf.
Der natürliche Aromastoff Vanillin ist bisher nur durch Extraktion von Vanilleschoten erhältlich, das auf diese Weise gewonnene Vanillin ist jedoch sehr teuer. Verschiedene andere Verfahren zur Herstellung von natürlichem Vanillin mit unterschiedlichen Mikroorganismen und Enzymen sind bereits bekannt (s. beispiels- weise EP 405 197 A, EP 453 368 A und EP 542 348 A), sind aber bislang aufgrund der geringen Ausbeuten bzw. Konzentrationen an Vanillin für eine großtechnische Herstellung ungeeignet.
In EP 761 817 A ist ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von natürlichem Vanillin aus Ferulasäure beschrieben, wobei zwei Stämme der Gattung
Amycolatopsis (Familie Pseudonorcardiaceae) welche unter den Nummern DSM 9991 und DSM 9992 (Datum der Ersthinterlegung: 2. Mai 1995) bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH in Braunschweig hinterlegt sind, eingesetzt wurden. Mit Hilfe dieser Stämme und des in EP 761 817 A beschriebenen Verfahrens war es möglich, natürliches Vanillin auf wirtschaftliche
Weise in guten Ausbeuten und hohen Konzentrationen zu erhalten. Es ist bekannt, dass der Einsatz von genetisch modifizierten Mikroorgarisimen in fermentativen Prozessen oft zu verbesserten Ausbeuten oder Konzentrationen an gewünschten Stoffen führt. Um solche genetisch modifizierten Mikroorganismen zu erhalten, ist es notwendig, ein geeignetes Verfahren zur Transformation dieser
Mikroorganismen zu kennen.
Verfahren zur Transformation verschiedener Amycolatopsis Spezies sind bekannt. In P. Matsushima et al. J Bacteriol. 169, 1987, 2298 - 2300 ist ein Verfahren zur Protoplasten-Transformation von Amycolatopsis orientalis beschrieben. Nachteilig an diesem Verfahren ist, dass es sich nicht auf die Transformation von Amycolatopsis sp. DSM 9991 und DSM 9992 anwenden lässt (s. Beispiele). In R. Lal et al. j. Antibiotics 51, 1998, 161-169 ist ein Elektroporations- Verfahren zur Transformation von Amycolatopsis mediterranei beschrieben. Nachteilig ist, dass bei der Anwendung dieses Verfahrens bei Amycolatopsis sp. DSM 9991 und DSM 9992 nur geringe
Transformationsraten erzielt werden konnten (s. Beispiele).
In J. Madon et al. J Bacteriol. 173, 1991, 6325 - 6331 ist die direkte Mycel- Transformation von Amycolatopsis mediterranei beschrieben. Eine Abwandlung dieses Verfahrens für die direkte Mycel-Transformation von Amycolatopsis methanolica ist in j. W. Vrijbloed et at. Plasmid 34, 1995, 96 - 104 beschrieben Nachteilig an diesen Verfahren sind die niedrigen Transformationsraten, welche sich aufgrund der langen Inkubationsdauer des Mycels von ca. 40 Stunden ergeben.
Es bestand daher Bedarf, ein für Amycolatopsis sp. DSM 9991 oder DSM 9992 geeignetes Transformationsverfahren zu finden, mit welchem hohe Transformationsraten erzielt werden können.
Überraschenderweise wurde nun ein Verfahren zur Transformation von Amycolatopsis sp. DSM 9991 oder DSM 9992 durch (1) Kultivierung von Amycolatopsis sp. DSM 9991- oder DSM 9992-Mycelien in einem Kulturmedium und
(2) Inkontaktbringen dieser Kultur mit einer Mischung enthaltend
a) 0,25 bis 10 μg/ml zu transformierende DNA b) 0,4 bis 0,7 M CsCl c) 0 bis 9 mM MgCl2 d) 30 bis 50 % [w/v] Polyethylenglykol 1000 und e) 10 bis 50 μg/ml DNA, welche von a) verschieden ist,
wobei das Mycel 4,5 bis 9 Stunden nach Eintritt in die stationäre Phase mit der genannten Mischung in Kontakt gebracht wird.
Schritt (1) des erfindungsgemäßen Verfahrens betrifft die Kultivierung von Amycolatopsis sp. DSM 9991 oder DSM 9992-Mycelien in einem Kulturmedium.
Geeignete Kulturmedien sind solche, wie sie in der Literatur für die Kultivierung von Mycelien der Spezies Amycolatopsis bekannt sind. Besonders geeignete Kulturmedien sind Komplexmedien wie beispielsweise YMG Medium (0,4 % [w/v] Hefeextrakt, 1 % [w/v] Malzextrakt, 0,4 % [w/v] Glucose, pH 7,2), TYN Medium (0,25 % [w/v] Hefeextrakt, 1 % [w/v] Trypton, 0,5 % [w/v] NaCl, pH 7,2) oder TSB Medium
(1,7 % [w/v] Trypton, 0,3 % [w/v] Soytone, 0,25% [w/v] Glucose, 0,5 % [w/v] NaCl, 0,25 % [w/v] K2HPO4 pH 7,3). Die Kultivierung wird vorzugsweise bei Temperaturen von 30 bis 48°C, besonders bevorzugt von 39 bis 42°C durchgeführt.
Vorzugsweise wird in Schritt (1) des erfindungsgemäßen Verfahrens so vorgegangen, dass in einem geeigneten Kulturmedium eine Vorkultur von Amycolatopsis sp. DSM 9991- oder DSM 9992-Mycelien herangezogen wird. Vorzugsweise wird die Vorkultur bei einer gleichen Temperatur und in gleichem Kulturmedium herangezogen, wie die eigentliche Kultur. Zur Herstellung einer Kultur von Amycolatopsis sp. DSM 9991- oder DSM 9992-Mycelien wird ein Teil der Vorkultur bevorzugt nach 16 bis 24 Stunden, besonders bevorzugt nach 18 bis 22 Stunden, ganz besonders bevorzugt nach 19 bis 20 Stunden, zur Inokulation verwendet.
Das Wachstum von Amycolatopsis sp. DSM 9991- oder DSM 9992-Mycelien im Kulturmedium kann beispielsweise mit Hilfe spektrometrischer Methoden bestimmt werden. Vorzugsweise wird das Wachstum über die optische Dichte der Kultur bestimmt. Gemäß dem erfmdungsgemäßen Verfahren erfolgt die Transformation von Amycolatopsis sp. DSM 9991- oder DSM 9992-Mycelien 4,5 bis 9 Stunden nach Eintritt in die stationäre Phase. Es wurde überraschenderweise gefunden, dass sich in diesem Zeitfenster besonders hohe Transformationsraten erzielen lassen, welche deutlich höher sind, als bei Anwendung der im Stand der Technik beschriebenen Transformationsverfahren. Besonders bevorzugt erfolgt die Transformation 5 bis 8,5 Stunden nach Eintritt in die stationäre Phase, ganz besonders bevorzugt nach 6,5 bis 7,5 Stunden.
Zur Transformation wird die Mycel-Kultur von Amycolatopsis sp. DSM 9991 oder DSM 9992 mit einer Mischung, enthaltend
a) 0,25 bis 10 μg/ml zu transformierende DNA b) 0,4 bis 0,7 M CsCl c) 0 bis 9 mM MgCl2 d) 30 bis 50 % [w/v] Polyethylenglykol 1000 und e) 10 bis 50 μg/ml DNA, welche von a) verschieden ist,
in Kontakt gebracht. Die genannte Mischung wird im folgenden als Transformationsmischung bezeichnet.
Zur Transformation wird vorzugsweise ein Aliquot der Mycel-Kultur abzentrifugiert, gewaschen und anschließend in der Waschlösung oder in einem geeigneten Puffer, vorzugsweise in TE-Puffer resuspendiert. Als Waschlösung können geeignete Puffer verwendet werden, vorzugsweise wird TRIS-EDTA-Puffer (10 mM TRIS-HC1, pH 8,0, 1 mM EDTA) verwendet. Bei der Resuspendierung wird die Mycel-Kultur vorzugsweise auf eine optische Dichte von 25 bis 160 (bei 400 nm) verdünnt, besonders bevorzugt auf eine optische Dichte von 30 bis 100 (bei 400 nm), ganz besonders bevorzugt auf eine optische Dichte von 40 bis 60 (bei 400 nm).
Das Inkontaktbringen der Mycel-Kultur erfolgt vorzugsweise durch Mischen mit der oben genannten Transformationsmischung. Die so erhaltene Mischung wird vorzugsweise für 20 bis 60 Minuten, besonders bevorzugt für 30 bis 40 Minuten bei einer Temperatur von vorzugsweise 30 bis 46°C, besonders bevorzugt bei 37 bis 40°C inkubiert. Als vorteilhaft hat es sich erwiesen, die Mycele nach der Inkubation zu waschen. Als Waschflüssigkeiten werden vorzugsweise isotonische Medien eingesetzt, besonders bevorzugt S27M Medium (7,32 % [w/v] D-Mannitol, 0,5 % [w/v] Pepton, 0,3 % [w/v] Hefeextrakt, 0,2 % [w/v] CaC03) Dabei kann ein oder mehrmals gewaschen werden.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte Transformationsmischung enthält die oben genannten Verbindungen a) - e).
Die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte Transformationsmischung enthält 0,25 bis 10 μg/ml zu transformierende DNA, vorzugsweise 1 bis 7,5 μg/ml, besonders bevorzugt 2 bis 6 μg/ml. Die zu transformierende DNA kann, in Form von einzelsträngiger oder doppelsträngiger DNA vorliegen, vorzugsweise wird DNA in Form von doppelsträngiger ringförmiger DNA (Plasmide) eingesetzt. Die vorzugsweise bei der Transformation eingesetzten Plasmide enthalten insbesondere folgende Bestandteile: mindestens einen Replikationsursprung, der die effiziente
Vermehrung des Plasmids in Amycolatopsis sp. DSM 9991 oder 9992 ermöglicht. Vorzugsweise enthält das Plasmid zusätzlich einen Replikationsursprung, der die effiziente Vermehrung des Plasmids in einer Zelle, die zur einfachen Produktion und Isolierung des Plasmids geeignet ist, (beispielsweise Escherichia coli) ermöglicht. Weiterhin enthält das Plasmid vorzugsweise ein Resistenzgen, welches die Selektion von Amycolatopsis sp. DSM 9991 oder 9992-Zellklonen, die das Plasmid enthalten, ermöglicht, vorzugsweise ein Kanamycin-Resistenzgen, nicht aber ein Erythromycin- oder Thiostrepton-Resistenzgen, da Amycolatopsis sp. DSM 9991 oder 9992 eine inherente Erythromycin-bzw. Thiostrepton-Resistenz aufweisen. Vorzugsweise enthält das Plasmid Restriktionsschnittstellen zum Einbau fremder DNA-Fragmente. Vorzugsweise handelt es sich bei der zu transformierenden DNA um eine DNA, welche einen niedrigen Methyherungsgrad aufweist. Dies kann dadurch erreicht werden, dass die zu transformierende DNA aus einen Organismus isoliert wird, der nicht oder nur in geringem Ausmaß zur Modifizierung von DNA in der Lage ist. Diese Organismen sind dem Fachmann bekannt, es können beispielsweise verschiedene Escherichia coli-Stämme wie beispielsweise E. coli ET12567 (dam, dem, hsd) oder E. coli JMllO (dam, dem) oder Amycolatopsis sp. DSM 9991 oder 9992 selbst eingesetzt werden.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte Transformationsmischung enthält 0,4 bis 0,7 M CsCl, vorzugsweise 0,5 bis 0,675 M CsCl, besonders bevorzugt 0,575 bis 0,625 M CsCl.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte Transformationsmischung enthält 0 bis 9 mM MgCi2, vorzugsweise 2,5 bis 7,5 mM MgCi2, besonders bevorzugt 3,5 bis 5,5 mM MgCl2.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte Transformationsmischung enthält 30 bis 50 % [w/v] Polyethylenglykol 1000 (im folgenden als PEG 1000 bezeichnet), vorzugsweise 31 bis 40 % [w/v] PEG 1000, besonders bevorzugt 32 bis 35 % [w/v] PEG 1000. Der Einsatz von PEG 1000 ist vorteilhaft, da bei Einsatz von PEG, welches ein höheres oder ein niedrigeres Molekulargewicht aufwies, nur geringe Transformationsraten erzielt werden konnten.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte Transformationsmischung enthält 10 bis 50 μg/ml DNA, welche von a) verschieden ist, vorzugsweise 12 bis 30 μg/ml, besonders bevorzugt 15 bis 25 μg/ml. Die Anwesenheit von e) in der Transforma- tionsmischung erlaubt es, die Konzentration der Komponente a) gering zu halten. Bevorzugt wird hierfür Kälberthymus-DNA eingesetzt, besonders bevorzugt ultra- schall-behandelte Kälberthymus-DNA.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte Transformationsmischung
a) 0,25 bis 10 μg/ml zu transformierende DNA b) 0,575 bis 0,625 M CsCl c) 2,5 bis 7,5 mM MgCl2 d) 32 bis 35 % [w/v] Polyethylenglykol 1000 und e) 12 bis 30 μg/ml DNA, welche von a) verschieden ist.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform enthält die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte Transformationsmischung
a) 2 bis 6 μg/ml zu transformierende DNA b) 0,575 bis 0,625 M CsCl c) 3,5 bis 5,5 mM MgCl2 d) 32 bis 35 % [w/v] Polyethylenglykol 1000 und e) 15 bis 25 μg/ml DNA, welche von a) verschieden ist.
Nach der Transformation wird die Mycel-Kultur vorzugsweise mit einer R2L- Agarose-Lösung, wie in J. Madon et al. J Bacteriol. 173, 1991, 6325 - 6331 beschrieben, vermischt, wobei die R2L-Lösung auf vorzugsweise auf 37 bis 46°C, besonders bevorzugt auf 40 bis 42°C temperiert ist. Die Mischung wird anschließend auf Agar-Platten, vorzugsweise S27M-Agar-Platten, ausgebracht. Die Inkubationszeit beträgt vorzugsweise 14 bis 22 Stunden, besonders bevorzugt 16 bis 20 Stunden, die Inkubationstemperatur beträgt vorzugsweise 30°C. Nach der Inkubation erfolgt die Selektion vorzugsweise durch Überschichten der Platten mit Antibiotika-haltigem Soft-Agar (0,5 % [w/v] Agar), vorzugsweise S27M-Soft-Agar, und anschließender Inkubation bei vorzugsweise 30 bis 37°C für vorzugsweise 5 bis 10 Tage.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren ist es möglich, Amycolatopsis sp. DSM 9991 und DSM 9992 in einfacher Weise zu transformieren, wobei hohe Transformationsraten erhalten werden.
Beispiele
Beispiel 1
Konstruktion und Isolierung des für die Transformation eingesetzten Plasmids
Zur Konstruktion eines für die Tranformation geeigneten Plasmids wurde der Vektor pRL60 (Lal et al, J. Antibiotics 51, 1998, 161-169) eingesetzt. Dieser 10,2 kbp große Vektor enthielt einen Replikationsursprung (pA-rep) für verschiedene Amycolatopsis mediterranei Stämme, einen Replikationsursprung (pBR-ori) für Escherichia coli, ein Kanamycin-Resistenzgen, ein Erythromycin-Resistenzgen und ein α-Amylase-
Markergen. Das Plasmid wurde einem Restriktionsverdau mit EcoRI unterworfen, in einem Agarosegel aufgetrennt und ein 6 kbp großes Fragment, welches das Kanamycin-Resistenzgen, pA-rep und pBR-ori enthielt, wurde daraus isoliert. Das Fragment wurde religiert und das so erhaltene Plasmid pRLΕ6 (5843 bp) wurde in kompetente E. coli ET12567-Zellen transformiert und daraus isoliert. Restriktionsverdau, Auftrennung im Agarosegel, Isolierung des gewünschten DNA-Fragments, Religation, Transformation in E. coli und Isolierung des Plasmids wurden gemäß in der Molekularbiologie üblichen Standardprotokollen durchgeführt (s. beispielsweise J. Sambrook et al, Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
Beispiel 2 (nicht erfindungs emäß) Protoplastentransformation von Amycolatopsis sp. DSM 9992
(modifiziert nach Hopwood et al 1985, Genetic manipulation of Streptomyces- a labor manual, The John Innes Foundation, Norwich, England.)
Folgende Methoden, Medien und Puffer wurden verwendet:
Protoplastierungs-Puffer (P-Puffer) für Streptomyceten 103 g Saccharose, 0,25 g MgCl2 x 6 H2O, 2,02 g K2SO4, 2 ml Spurenelementlösung
2 (beschrieben in Hopwood et al 1985, Genetic manipulation of Streptomyces- a labor manual, The John Innes Foundation, Norwich, England), mit Wasser auf 790 ml auffüllen und autoklavieren. Nach dem Autoklavieren werden folgende sterilisierte Lösungen separat dazugegeben: 100 ml TES (5,73 % [w/v] auf pH 7,2 mit NaOH eingestellt), 100 ml CaCl2 x 2 H2O (3,68 % [w/v]) und 10 ml K2HP04 (0,5 % [w/v])
R3 -Regenerationsmedium für Protoplasten
103 g Saccharose, 10 g Glucose (Monohydrat), 0,5 g KC1, 4 g Pepton, 4 g Hefeextrakt, 8,1 g MgCl2 x 6 H2O, 2,2 g CaCl2 x 2 H2O, mit Wasser auf 880 ml auffüllen, 18 g Bactoagar zugeben und autoklavieren. Nach dem Autoklavieren werden folgende sterilisierte Lösungen separat dazugegeben: 100 ml TES (5,73 % [w/v] auf pH 7,2 mit NaOH eingestellt), 20 ml K2HP04 (1 % [w/v])
Transformations-Puffer für Protoplasten Alle Lösungen werden separat angesetzt und autoklaviert und anschließend wie angegeben gemischt:
25 ml Saccharose (10,3 % [w/v]), 75 ml Wasserfest, 0,2 ml Spurenelementlösung 2 (beschrieben in Hopwood et al 1985, Genetic manipulation of Streptomyces- a labor manual, The John Innes Foundation, Norwich, England) und 1 ml K SO4 (2,5 % [w/v]).
Es werden 9,3 ml von der Mischung entnommen, dazu werden folgende Lösungen zugefügt: 0,2 ml 5 M CaCl2 und 0,5 ml 1 M TRIS-Maleinat, pH 8. Vor der Verwendung werden 3 Teile des Transformations-Puffers mit 1 Teil [w/v] sterilem PEG 1550 gemischt.
Bestimmung des Protoplastentiters und der Regenerationsrate
Um die Regenerationsrate zu ermitteln wurden Verdünnungsreihen (10'1 - 10" ) in P-Puffer bzw. in H2Obidest (+ 0,01 % [w/v] Natriumdodecylsulfat) angelegt und je 100 μl der Verdünnnungsstufen mit 3 ml „Topagar" (38 °C, P-Puffer versetzt mit 0,4 % [w/v] „low melting point'Αgarose, Sigma) auf R3 -Regenerationsmedium für
Protoplasten aufgetragen. Die Platten wurden für 15-20 min unter der sterilen Werkbank getrocknet, bevor sie bei 37 °C inkubiert wurden. Nach 4-6 Tagen wurde die Anzahl der Kolonien pro Platte ausgezählt.
a) Protoplastengewinnung
Die Anzucht des Mycels erfolgte für 15 h in 50 ml YMG-Medium mit 5 % [v/v] PEG 6000 in 300 ml Schikanekolben bei 37°C und 150 Upm. Unter sterilen Bedingungen wurde das Zellmaterial bei 3 000 Upm für 15 min abzentrifugiert und anschließend zwei mal mit je 15 ml einer sterilen 10,3 % [w/v] Saccharoselösung ge- waschen. Das abzentrifugierte Mycelpellet wurde einer Lysozym-Behandlung unterzogen, um einen (partiellen) Verdau des Murein-Sacculus zu erreichen. Hierzu wurde das Pellet in 4 ml Lysozym-Lösung (2 mg/ml gelöst in sterilem P-Puffer, s.u.) resuspendiert und bei 30°C unter leichtem Schütteln (120 Upm) inkubiert. Der Verlauf der Protoplastierung wurde über den gesamten Zeitraum mikroskopisch verfolgt. Bereits nach 15 - 30 min waren Protoplasten erkennbar. Nach 2 bis 2 lA h wurde die Suspension mit einer sterilen 5 ml-Pipette 3 mal auf- und abgesogen um eine bessere Protoplastenfreisetzung zu erzielen. Anschließend wurde die Suspension für weitere 15 - 30 min inkubiert.
Nach Zugabe von 5 ml P-Puffer erfolgte die Abtrennung der Protoplasten von den
Mycelresten durch differenzielle Zentrifugation. Nach 10 min Zentrifugation bei 1 100 Upm (Megafuge 1.0R) - entsprechend ca. 200 g - wurde der Protoplasten- haltige Überstand von den Mycelresten abdekantiert und erneut zentrifugiert. Dieser Schritt erfolgte bei 3 400 Upm (ca. 2 000 g) für 10 min. Die so erhaltenen Proto- plasten wurden in der Restflüssigkeit resupendiert. Zur Kontrolle der Protoplastierung wurden je 50 μl Suspension mit 50 μl P-Puffer, bzw. mit 50 μl ^O^est (+0,01 % [w/v] Natriumdodecylsulfat) versetzt und mikroskopisch betrachtet.) Es folgten 3 Waschschritte. Hierzu wurden 10 ml steriler P-Puffer zu der „cremigen" Protoplastensuspension gegeben und nach leichtem Schütteln folgte eine 10 min Zentrifugation bei 3 400 Upm und 4 °C. Die Protoplasten wurden abschließend P-
Puffer resuspendiert. Das Puffervolumen (ca. 1 - 3 ml) wurde so gewählt, dass ein Titer von ca. 109 - 1010 Protoplasten pro ml erzielt wurde. Die so behandelten Protoplasten konnten bis zur weiteren Verwendung bei - 70°C für längere Zeit gelagert werden. Die Zellaliquote wurden langsam auf Eis bei - 70 °C eingefroren, Aufgetaut wurden die Protoplasten unter lauwarmen Wasser.
b) Protoplastentransformation
Für die Transformation wurden 100 μl der Protoplastensuspension (Herstellung s.o.) in der Tischzentrifuge zur Pelletierung kurz anzentrifugiert. Der Überstand wurde abdekantiert, das Pellet in der „Restflüssigkeit" resuspendiert (durch Fingerantippen).
Plasmid-DNA (in TE-Puffer; max. 20 μl) wurde zu dieser Protoplastensuspension gegeben. Parallel wurde zur Kontrolle ein Ansatz ohne Plasmid-DNA durchgeführt. Unmittelbar danach wurden 0,5 ml Transformations-Puffer versetzt mit 25 % [v/v] PEG 1 550 zugegeben und mit der Pipette zweimal auf- und abgesogen und je 50 μl der Suspension mit 3 ml „Topagar" (38 °C, P-Puffer versetzt mit 0,4 % [w/v] „low melting point'Αgarose, Sigma) auf Regenerationsmedium R3 ausplattiert.
Zur Selektion transformierter Protoplasten wurde dem Medium R3 Antibiotika (50 μg/ml Kanamycin) zugefügt. Nach Trocknung der Platten unter der sterilen Werkbank (ca. 30 min) wurden die Platten für 4-6 Tage bei 37°C inkubiert.
Anschließend wurde die Koloniezahl ermittelt.
Es wurden keine Kanamycin-resistenten Transformanten erhalten, obwohl die Regeneration der Protoplasten erfolgreich war, was durch einen Kontrollversuch ge- zeigt werden konnte.
Beispiel 3 (nicht erfindungsgemäß) Elektroporation von Amycolatopsis sp. DSM 9992
Für die Elektroporation wurden eine Kultur von Amycolatopsis sp. DSM 9992 in
TYN-Mediurn (Trypton 10 g; Hefeextrakt 2,5 g; NaCl 5 g; H2Obidest ad 1000 ml; pH 7,2) bei 150 Upm für ca. 20 h bei 37°C angezogen. Das Mycel wurde durch Zentrifugation (4 500 Upm, 4°C, 15 min) geerntet und anschließend zweimal mit eiskaltem salzfreiem Wasser (Milli-Q Plus- Aufbereitungssystem für hochreines Wasser; MILLIPORE, Eschborn, Deutschland) gewaschen. Das Mycelpellet wurde in 200 μl Lysozym-Lösung (4 mg/ml; in 10 % [v/v] Glycerin) resuspendiert und für
20 min bei Raumtemperatur inkubiert. Im Anschluss wurde die Mycelsuspension mit 10 % [v/v] Glycerin gewaschen, die Zentrifugation wurde bei 3 000 Upm und 4°C für 10 min durchgeführt. Die so vorbehandelten Zellen wurden in einem entsprechenden Volumen Glycerin (10 % [v/v]) so resuspendiert, dass sich ein Zelltiter von ca. 1 x 1010 CFU/ml ergab.
Je 400 μl der vorbehandelten Mycelsuspension wurden mit der zu übertragenden Plasmid-DNA (0,1-5,0 μg/μl) gemischt und in gekühlte Elekfroporationsküvetten (Eppendorf-Netheler-Hinz, Hamburg) mit 2 mm Elektrodenabstand überführt. Die Elektroporation erfolgte bei einer elektrischen Feldstärke von 7,5 kV/cm (Kapazität
25 μF; Widerstand 600 Ω.). Zeitkonstanten von 3,6 - 5,6 ms wurden erreicht. Direkt nach der Elektroporation wurde 400 μl LB-Medium zu der Mycelsuspension zugefügt. Direkt im Anschluss wurden je 100 μl des Ansatzes auf GYM-Platten ausplattiert. Nach 15 h Inkubation bei 30°C wurden die Platten mit 3 ml Soft- Agar (TYN-Medium versetzt mit 5 g/1 Agar) überschichtet, welcher zur Selektion positiver
Elektroporanden Antibiotika (z.B. 1000 μg/ml Kanamycin) enthielt. Nach 20 min Trockenen der Platten wurden diese für 3 - 5 Tage bei 30°C bzw. 37°C inkubiert. Anschließend konnten die erhaltenen möglichen positiven Elektroporanden weiter untersucht werden.
Eine Transformationsrate von 2 x 102 Transformanten pro μg Plasmid-DNA wurde bei einer Feldstärke von 7,5 kV cm-1 und einem Puls von 4,6 - 5,2 ms erhalten. Beispiel 4
Erfmdungsgemäße Transformation von Amycolatopsis sp. DSM 9992
Die Zellen wurden TSB-Medium angezogen. Das Zellmaterial wurde nach 20 h Wachstum (7 h stationär) bei 4 500 Upm für 15 min abzentrifugiert. Nach dreimaligem Waschen des geernteten Mycels mit TRIS-EDTA-Puffer wurde durch Resuspension in geeignetem Volumen TE-Puffer eine dichte Mycelsuspension (OD400nrn = 50) erhalten. 100 μl dieser Suspension wurden mit MgCl2 (Merck Darmstadt, Endkonzentration 5 mM), CsCl (ICN Biomedicals, Endkonzentration 0,625 M), Kälberthymus-DNA (Sigma-Aldrich, Endkonzentration 37,5 ng/μl;
Stammlösung 7,5 μg/ml), Plasmid-DNA (Endkonzentration 1,25 μg/ml) und PEG 1 000 (NBS Biologicals, Endkonzentration 32,5 % [w/v]) versetzt. Das Gesamtvolumen des Transformationsgemisches betrug 400 μl. Die verwendete Plasmid- DNA des Modellvektors pRLE6 wurde zuvor wie in Beispiel 1 beschrieben, aus E. coli ET 12567 isoliert.
Das Transformationsgemisch wurde bei 37°C für 40 min inkubiert. Die Zellen wurden zweimal mit je 1 ml S27M-Medium gewaschen Das Mycel wurden in 400 μl S27M-Medium resuspendiert und für 10 min auf Eis inkubiert. Anschließend wurden Aliquots der Zellen mit R2L-Agarose-Lösung (temperiert auf 42°C) vermischt und auf gut getrocknete S27M-Agar-Platten ausgebracht. Gegebenenfalls wurden die Ansätze zuvor mit S27M-Medium verdünnt. Nach 16 - 20 h Inkubation bei 30°C erfolgte die Selektion durch Überschichten der Platten mit Kanamycin-haltigem Soft- Agar (S27M-Medium mit 5 g/1 Agar) und anschließender Inkubation bei 37°C für 5-10 Tage.
Die folgenden Beispiele wurden analog zu Beispiel 4 durchgeführt, wobei jeweils 1 Parameter (s. Tabellen) variiert wurde. Tabelle 1 : Abhängigkeit der Transformationsrate von der eingesetzten DNA-Menge
Figure imgf000016_0001
Tabelle 2: Abhängigkeit der Transformationsrate von der eingesetzten PEG- Konzentration
Figure imgf000016_0002
Tabelle 3: Abhängigkeit der Transformationsrate von der eingesetzten CsCl-Konzentration
Figure imgf000017_0001
Tabelle 4: Abhängigkeit der Transformationsrate von der eingesetzten
MgCl2-Konzentration
Figure imgf000018_0001
Tabelle 5: Abhängigkeit der Transformationsrate von der Zelldichte der eingesetzten Mycelsuspension
Figure imgf000018_0002
Tabelle 6: Abhängigkeit der Transformationsrate von der eingesetzten Konzentration an Kälberthymus-DNA (CT-DNA)
Figure imgf000019_0001
Tabelle 7: Abhängigkeit der Transformationsrate von dem physiologischen Status der eingesetzten Zellen
(Bestimmung der optischen Dichte in Klett-Einheiten erfolgte mittels eines Klett-
Colorimeters (Manostat Corp., USA) bei einer Wellenlänge von 520-580 nm) a)
Figure imgf000020_0001
b)
Figure imgf000020_0002
c)
Figure imgf000020_0003
Beispiel 5
Erfindungsgemäße Transformation von. Amycolatopsis sp. DSM 9992
Beispiel 5 wurde analog zu Beispiel 4 durchgeführt, wobei das Mycel 7 h nach Erreichen der stationären Phase geerntet wurde (OD4oonm = 50). PEG 1000 wurde in einer Endkonzentration von 32,5 5 [w/v], MgCl2 in einer Endkonzentration von 5 mM, CsCl in einer Endkonzentration von 0,6 M und Kälberthymus-DNA in einer Endkonzentration von 19 ng/μl eingesetzt, weiterhin wurden 0,5 μg des Plasmids pRLE6 (isoliert nach Beispiel 1) eingesetzt.
Das Beispiel wurde wiederholt, wobei statt des aus E. coli ET12567 isolierten Plasmids pRLE6 die in Tabelle 8 beschriebenen Plasmide eingesetzt wurden. Dabei weist das aus E. coli XLl-Blue isolierte Plasmid einen höheren Methyherungsgrad auf als das aus E. coli ET12567 und Amycolatopsis sp. DSM 9992 isolierte Plasmid.
Figure imgf000021_0001

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Transformation von Amycolatopsis sp. DSM 9991 oder 9992 durch
(1) Kultivierung von Amycolatopsis sp. DSM 9991- oder DSM 9992- Mycelien in einem Kulturmedium und
(2) Inkontaktbringen dieser Kultur mit einer Mischung enthaltend
a) 0,25 bis 10 μg/ml zu transformierende DNA b) 0,4 bis 0,7 M CsCl c) 0 bis 9 mM MgCl2 d) 30 bis 50 % [w/v] Polyethylenglykol 1000 und e) 10 bis 50 μg/ml DNA, welche von a) verschieden ist,
wobei die Kultur 4,5 bis 9 Stunden nach Eintritt in die stationäre Phase mit der genannten Mischung in Kontakt gebracht wird.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Kultur 5 bis 8,5 Stunden nach Eintritt in die stationäre Phase mit der genannten Mischung in Kontakt gebracht wird.
3. Verfahren gemäß einem oder mehreren der vorangegangenen Ansprüche 1 und
2, wobei die genannte Mischung 0,5 bis 0,675 M CsCl enthält.
4. Verfahren gemäß einem oder mehreren der vorangegangenen Ansprüche 1 bis
3, wobei die genannte Mischung 2,5 bis 7,5 mM MgCl2 enthält.
5. Verfahren gemäß einem oder mehreren der vorangegangenen Ansprüche 1 bis
4, wobei die genannte Mischung 12 bis 30 μg/ml DNA, welche von a) verschieden ist, enthält.
6. Verfahren gemäß einem oder mehreren der vorangegangenen Ansprüche 1 bis 5, wobei e) Kälberthymus-DNA ist.
7. Verfahren gemäß einem oder mehreren der vorangegangenen Ansprüche 1 bis 6, wobei die genannte Mischung 32 bis 35 % [w/v] Polyethylenglykol 1000 enthält.
8. Verfahren gemäß einem oder mehreren der vorangegangenen Ansprüche 1 bis 7, wobei a) eine DNA mit einem niedrigen Methylierungsgrad ist.
9. Transformierte Amycolatopsis sp. DSM 9991 oder 9992, wobei die Transformation nach einem Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 8 durchgeführt wurde.
10. Verwendung von Amycolatopsis sp. DSM 9991 oder 9992 gemäß Anspruch 9 zur Herstellung von Vanillin.
11. Verwendung von Amycolatopsis sp. DSM 9991 oder 9992 gemäß Anspruch 9 zur Herstellung von Vanillin aus Ferulasäure.
12. Verfahren zur Herstellung von Vanillin, dadurch gekennzeichnet, dass transformierte Amycolatopsis sp. DSM 9991 oder 9992 gemäß Anspruch 9 eingesetzt werden.
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