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WO2003022056A1 - Utilisations d'inhibiteurs de l'acetohydroxyacide isomeroreductase pour le traitement des maladies fongiques des cultures - Google Patents

Utilisations d'inhibiteurs de l'acetohydroxyacide isomeroreductase pour le traitement des maladies fongiques des cultures Download PDF

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Publication number
WO2003022056A1
WO2003022056A1 PCT/FR2002/003073 FR0203073W WO03022056A1 WO 2003022056 A1 WO2003022056 A1 WO 2003022056A1 FR 0203073 W FR0203073 W FR 0203073W WO 03022056 A1 WO03022056 A1 WO 03022056A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
isomeroreductase
seq
grisea
inhibitor
ilv5
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/FR2002/003073
Other languages
English (en)
Inventor
Renaud Dumas
Marc-Henri Lebrun
Jean-Luc Zundel
Géraldine EFFANTIN
Valérie MORIN
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bayer CropScience SA
Original Assignee
Bayer CropScience SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bayer CropScience SA filed Critical Bayer CropScience SA
Priority to EP02777415A priority Critical patent/EP1424899A1/fr
Priority to JP2003526198A priority patent/JP2005501912A/ja
Publication of WO2003022056A1 publication Critical patent/WO2003022056A1/fr
Priority to US10/797,248 priority patent/US7166706B2/en
Anticipated expiration legal-status Critical
Priority to US11/623,624 priority patent/US20070129337A1/en
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N37/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids
    • A01N37/18—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids containing the group —CO—N<, e.g. carboxylic acid amides or imides; Thio analogues thereof
    • A01N37/28—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids containing the group —CO—N<, e.g. carboxylic acid amides or imides; Thio analogues thereof containing the group; Thio analogues thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N57/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds
    • A01N57/18—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds having phosphorus-to-carbon bonds
    • A01N57/20—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds having phosphorus-to-carbon bonds containing acyclic or cycloaliphatic radicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N61/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing substances of unknown or undetermined composition, e.g. substances characterised only by the mode of action
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)

Definitions

  • the present invention relates to the use of acetohydroxyacid isomeroreductase inhibitors for the treatment of fungal diseases of cultures.
  • Fungi are responsible for devastating epidemics which can cause significant losses in the cultivation of different plant species.
  • the principle of employing inhibitors of enzymes of pathogenic fungi, and of using these enzymes in tests to identify new molecules active against these fungi is known per se.
  • the simple characterization of a fungus enzyme is not sufficient to achieve this objective, it is still necessary that the enzyme chosen as the target of potential fungicidal molecules is essential to the life of the fungus, its inhibition by the fungicidal molecule leading to the death of the fungus, or essential to the pathogenesis of the fungus, its inhibition is not lethal for the fungus but simply inhibits its pathogenic power.
  • the identification of metabolic pathways and enzymes essential to the pathogenesis and survival of the fungus is therefore necessary for the development of new fungicidal products.
  • Acetohydroxyacid isomeroreductase is a well-characterized enzyme in plants and microorganisms such as bacteria and yeasts.
  • This enzyme is the second enzyme in the branched chain amino acid biosynthesis pathway, it catalyzes the transformation of the substrate, 2S-2-acetolactate (AL) or 2S-2-aceto-2-hydroxybutyrate (AHB) into 2 , 3-dihydroxy-3-isovalerate (DHIN) or as 2,3-dihydroxy-3-methylvalerate (DHIM) respectively.
  • This reaction requires the presence of magnesium ions (Mg 2+ ) and takes place in two stages: an isomerization of a methyl or ethyl group followed by a reduction by ⁇ ADPH.
  • the present invention relates to methods of treating cultures against fungal diseases comprising the application of an acetohydroxyacid isomeroreductase inhibitor. It has been found that inactivation of the ILV5 gene encoding the acetohydroxy acid isomeroreductase in Magnaporthe grisea results in inhibition of the growth of the fungus. This inhibition of the growth of the fungus is also observed in vivo in the presence of specific inhibitors of acetohydroxyacid isomeroreductase. M. grisea is pathogenic for many crop species such as rice.
  • SEQ ID No. 1 Magnaporthe grisea acetohydroxy acid isomeroreductase.
  • SEQ ID No. 2 Saccharomyces cerevisiae acetohydroxyacid isomeroreductase.
  • SEQ ID No. 3 Acetoohydroxy acid isomeroreductase from Neurospora crassa.
  • Magnaporthe grisea SEQ ID No. 5 Magnaporthe grisea acetohydroxy acid isomeroreductase. SEQ ID No. 6 Gene of the acetohydroxy acid isomeroreductase of Magnaporthe grisea. SEQ ID No. 7-18 Primers for PCR.
  • the present invention relates to methods of treating cultures against fungal diseases by applying an effective amount of an acetohydroxy acid isomeroreductase inhibitor.
  • the subject of the invention is a method of combating, for curative or preventive purposes, phytopathogenic fungi in crops, characterized in that one applies to the soil where plants grow or are likely to grow, on the leaves and / or the fruits of plants or on plant seeds, an effective (agronomically effective) and non-phytotoxic amount of an acetohydroxyacid isomeroreductase inhibitor.
  • effective and non-phytotoxic amount means an amount of inhibitor sufficient to allow the control or destruction of the fungi present or likely to appear on the cultures, and not causing for said cultures any significant symptom of phytotoxicity. Such an amount is likely to vary within wide limits depending on the fungus to be controlled, the type of crop, the climatic conditions, and the compounds. included in the fungicidal composition according to the invention. This quantity can be determined by systematic field tests, within the reach of those skilled in the art.
  • the methods according to the invention are useful for treating cereal seeds (wheat, rye, triticale and barley in particular), potato, cotton, peas, rapeseed, corn, flax or even seeds of forest trees, or genetically modified seeds of these plants.
  • the present invention also relates to the foliar application on plant crops, that is to say on the foliage, flowers, fruits and / or trunks of the plants concerned.
  • rice, corn, cotton, cereals such as wheat, barley, triticale, fruit trees, in particular apple, pear, peach, vine, banana trees, orange trees, lemon trees, etc.
  • oil crops for example, rapeseed, sunflower, vegetable and vegetable crops, tomatoes, salads, protein crops, peas, solaneas, for example potato, beets, flax, and forest trees, as well as genetically modified counterparts of these crops.
  • plants targeted by the method according to the invention there may be mentioned:
  • - wheat as regards the fight against the following seed diseases: fusarium wilt (Microdochium nivale and Fusariwn roseum), caries (Tilletia caries ,, Tilletia controversa or Tilletia indicé), septoria leaf spot (Septoria nodorum); naked coal (Ustilago tritic ⁇ ); - wheat, as regards the fight against the following diseases of the aerial parts of the plant: foot rot (Tapesia yallundae, Tapesia acuiformis), foot scald (Gaeumannomyces graminis), Fusarium head blight (F. culmorum , F.
  • helminthosporioses Pyrenophora graminea., Pyrenophora teres and Cochliobolus sativus
  • bare smut Ustilago nuda
  • fusarium wilt Fusarium roseum
  • helminthosporioses Pyrenophora graminea., Pyrenophora teres and Cochliobolus sativus
  • bare smut Ustilago nuda
  • fusarium wilt Fusarium roseum
  • - barley as regards the fight against the following diseases of the aerial parts of the plant: foot rot (Tapesia yallundae), helminthosporioses (Pyrenophora teres and Cochliobolus sativus), powdery mildew (Erysiphe graminis forma specie horde ⁇ ), dwarf rust (Puccinia
  • - cotton with regard to the fight against the following diseases of young plants grown from seed: seedlings and necrosis of the crown (Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum), black root rot (Thielaviopsis basicoh); - protein crops, for example peas, as regards the fight against the following seed diseases: anthracnose (Ascochyta pisi, Mycosphaerella pinodes), fusarium wilt (Fusarium oxysporum), gray mold (Botrytis cinerea), downy mildew (Peronospor ⁇ pis ⁇ );
  • blast disease Magnaporthe grisea
  • rhizoctonia Rostonia solan ⁇
  • Acetohydroxyacid isomeroreductase is a well-characterized enzyme found in plants and microorganisms (bacteria, yeasts, fungi).
  • the methods of the present invention use inhibitors of acetohydroxy acid isomeroreducatase.
  • the invention relates to the use of fungus acetohydroxy acid isomeroreductase inhibitors, more preferably phytopathogenic fungal acetohydroxy acid isomeroreductase inhibitors for the treatment of fungal diseases of cultures.
  • the acetohydroxyacid isomeroreductase inhibitors inhibit the acetohydroxyacid isomeroreductase of Magnaporthe grisea and / or Saccharomyces cerevisiae and / or Neurospora crassa.
  • the acetohydroxyacid isomeroreductase inhibitor is an inhibitor of the enzymatic activity of acetohydroxyacid isomeroreductase from SEQ ID No. 1, from SEQ ID No.2, from SEQ ID No .3 and / or SEQ ID No. 5.
  • acetohydroxyacid isomeroreductase inhibitor can be used in the methods according to the invention.
  • Inhibitors of acetohydroxyacid isomeroreductase are well known to those skilled in the art and these inhibitors have in particular been described in EP106114; US4,594,098, EP196026, EP481407, WO 94/23063, CA2002021 and WO 97/37660.
  • the acohydroxyacid isomeroreductase inhibitor is a reaction intermediary analog which binds to the active site of acetohydroxyacid isomeroreductase.
  • the acetohydroxyacid isomeroreductase inhibitor is dimethylphosphinoyl-2-hydroxyacetate.
  • the acetohydroxyacid isomeroreductase inhibitor is N-hydroxy-N-isopropyloxamate.
  • the acetohydroxyacid isomeroreductase inhibitor is in the form of a fungicidal composition.
  • the invention also relates to fungicidal compositions comprising an effective amount of at least one acetohydroxyacid isomeroreductase inhibitor.
  • the fungicidal compositions according to the invention comprise, in addition to the inhibitor, solid or liquid supports, acceptable in agriculture and / or surfactants also acceptable in agriculture.
  • the usual inert supports and the usual surfactants can be used.
  • fungicidal compositions according to the invention can also contain all kinds of other ingredients such as, for example, protective colloids, adhesives, thickeners, thixotropic agents, penetrating agents, stabilizers, sequestrants, etc. More generally the inhibitors of acetohydroxy acid isomero-reducatse can be combined with all the solid or liquid additives corresponding to the usual techniques of formulation.
  • the present invention also relates to fungicidal compositions comprising an acetohydroxy acid isomeroreductase inhibitor and another fungicidal compound.
  • Mixtures with other fungicides are particularly advantageous, in particular mixtures with acibenzolar-S-methyl, azoxystrobin, benalaxyl, benomyl, blasticidin-S, bromuconazole, captafol, captane, carbendazim, carboxin, carpropamide, chlorothalonil, fungicidal compositions based on copper or copper derivatives such as copper hydroxide or copper oxychloride, cyazofamide, cymoxanil, cyproconazole, cyprodinyl, dichloran, diclocymet, dicloran, diethofencarb, difenoconazole, diflumetorim, dimethomorph, diniconazole, discostrobin, dodemorph, do
  • the present invention also relates to methods of manufacturing a fungicidal composition using an acetohydroxyacid isomeroreductase inhibitor.
  • the present invention also relates to methods for the preparation of fungicidal compounds comprising the identification of compounds inhibiting the enzymatic activity of acetohydroxyacid isomeroreductase.
  • the enzymatic reaction is carried out in the presence of the compound to be tested to measure the inl ibition of the enzymatic activity of acetohydroxyacid isomeroreductase.
  • All the biochemical tests making it possible to measure the enzymatic activity of acetohydroxy acid isomeroreductase and therefore to identify compounds inhibiting this enzymatic activity can be used in the methods according to the invention.
  • These biochemical tests are well known to those skilled in the art (Dumas et al., Biochem. J. 288: 865-874, 1992; Dumas et al., Biochem. J. 301: 813-820, 1994; Dumas et al.
  • the enzymatic reactions are advantageously carried out in solution in an appropriate buffer.
  • This type of reaction medium makes it possible to carry out a large number of reactions in parallel and therefore to test a large number of compounds in a microplate format for example.
  • the methods for identifying compounds inhibiting the enzymatic activity of acetohydroxy acid isomeroreductase comprise contacting these compounds with acetohydroxy acid isomeroreductase in the presence of magnesium, of NADPH and of substrate; and measuring this enzymatic activity.
  • the measurement of the enzymatic activity comprises the measurement of the decrease in absorption of NADPH at 340 nm and the substrate used for the enzymatic reaction is 2S-2-acetolactate (AL) or 2S-2-aceto-2-hydroxybutyrate (AHB). It is understood that any other method of measuring activity enzyme known to the skilled person can be used in the methods according to the invention.
  • Acetohydroxy acid isomeroreductase can be used in the methods according to the invention.
  • Acetohydroxyacid isomeroreductases have been characterized in several organisms such as plants, bacteria, yeasts and fungi. The corresponding genes have been cloned to determine the protein sequence of this enzyme (Dumas et al, Biochem. J. 277: 69-475, 1991; Curien et al, Plant Mol. Biol. 21: 717-
  • the acetohydroxy acid isomeroreductase used in the methods according to the invention is represented in SEQ ID No. 1, in SEQ ID No.2, in SEQ ID No.3 and / or to SEQ ID No.5.
  • the acetohydroxy acid isomeroreductase is isolated, purified or partially purified from its natural environment.
  • Acetohydroxyacid isomeroreductase can be prepared by various methods. These methods include purification from natural sources such as cells naturally expressing these polypeptides, production of recombinant polypeptides by appropriate host cells and their subsequent purification, production by chemical synthesis or, finally, a combination of these different approaches. . These various production methods are well known to those skilled in the art.
  • the acetohydroxy acid isomeroreductase is purified from an organism naturally producing this enzyme, for example bacteria such as E. coli, yeasts such as S. cerevisiae, or fungi such than N.crassa or M. grisea.
  • the acetohydroxy acid isomeroreductase is overexpressed in a recombinant host organism.
  • the methods of engineering DNA fragments and the expression of polypeptides in host cells are well known to those skilled in the art and have for example been described in "Current Protocols in Molecular Biology” Volumes 1 and 2, Ausubel FM et al, published by Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (1989) or in Molecular Cloning, T. Maniatis, EFFritsch, J. Sambrook (1982).
  • the methods for identifying compounds which inhibit the enzymatic activity of acohydroxyacid isomeroreductase comprise the expression of acetohydroxyacid isomeroreductase in a host organism, the purification of acetohydroxyacid isomeroreductase produced by the host organism, contact of these compounds with purified acetohydroxyacid isomeroreductase in the presence of magnesium, NADPH and substrate; and measurement of enzyme activity.
  • all of these methods include an additional step in which it is determined whether said compounds inhibiting the enzymatic activity of acetohydroxy acid isomeroreductase inhibit the growth and / or pathogenesis of fungi.
  • the present invention therefore relates to methods for identifying compounds which inhibit the growth and / or pathogenesis of fungi by inhibiting the enzymatic activity of acetohydroxyacid isomeroreductase. These methods consist in subjecting a compound, or a mixture of compounds, to an appropriate test for the identification of the acetohydroxyacid isomeroreductase inhibitor compounds and to selecting the compounds reacting positively to said test, if necessary to isolating them, then to identify them.
  • the appropriate test is a test of the enzymatic activity of acetohydroxyacid isomeroreductase as defined above.
  • a compound identified according to these methods is then tested for these anti-fungal properties and for its capacity to inhibit the pathogenesis and / or the growth of the fungus for plants according to methods known to those skilled in the art.
  • the compound is evaluated using phenotypic tests such as pathogenesis tests on leaves or on whole plants.
  • phenotypic tests such as pathogenesis tests on leaves or on whole plants.
  • compound is meant according to the invention any chemical compound or mixture of chemical compounds, including peptides and proteins.
  • mixture of compounds is understood according to the invention at least two different compounds, such as for example the (dia) stereoisomers of a molecule, mixtures of natural origin resulting from the extraction of biological material (plants, plant tissues, culture bacteria, yeast or fungal cultures, insects, animal tissues, etc.) or unpurified reaction mixtures or wholly or partly purified, or mixtures of products from combinatorial chemistry techniques.
  • biological material plants, plant tissues, culture bacteria, yeast or fungal cultures, insects, animal tissues, etc.
  • unpurified reaction mixtures or wholly or partly purified, or mixtures of products from combinatorial chemistry techniques.
  • the present invention finally relates to new compounds which inhibit the pathogenesis of fungi inhibiting the enzymatic activity of acetohydroxy acid. isomeroreductase, in particular the compounds identified by the methods according to the invention and / or the compounds derived from the compounds identified by the methods according to the invention.
  • the compounds inhibiting the pathogenesis of fungi inhibiting the enzymatic activity of acetohydroxyacid isomeroreductase are not general inhibitors of enzymes.
  • the compounds according to the invention are not compounds already known to have fungicidal activity and / or activity on the pathogenesis of fungi.
  • the subject of the invention is also a method for treating plants against a phytopathogenic fungus, characterized in that it comprises the treatment of said plants with a compound identified by a method according to the invention.
  • the present invention also relates to a method for preparing a compound inhibiting the pathogenesis of fungi, said method comprising the steps of identifying a compound inhibiting the pathogenesis of fungi inhibiting the enzymatic activity of acetohydroxy acid isomeroreductase by the method identification according to the invention, then preparation of said compound identified by the usual methods of chemical synthesis, enzymatic synthesis and / or extraction of biological material.
  • step of preparation of the compound can be preceded if necessary by a step called optimization by which a compound derived from the compound identified by the identification process according to the invention is identified, said derivative compound then being prepared by the methods usual.
  • Figure 1 Comparison of the protein sequences of the isomeroreductases of M. grisea, N.crassa and of the yeast S. cerevisiae. Alignment of sequences using CLUSTAL W software (1.4). .: similar amino acid.
  • FIG. 1 Growth test of M. grisea in the presence of the inhibitor N-hydroxy-N-isopropyloxamate (IpOHA) and under different culture conditions.
  • IpOHA N-hydroxy-N-isopropyloxamate
  • the effect of the inhibitor IpOHA is tested on the pathogenic fungus M. grisea by following the evolution of the growth of this fungus in the presence of different concentrations of inhibitor, in different culture media and over a period of 7 days.
  • PI .2 of M grisea at a final concentration of 10 5 spores / ml.
  • the microplate is incubated at room temperature and the optical density at 630 nm (OD 63 o) is measured on days O, 3,
  • Figure 3 Influence of the concentration of NADPH on the enzymatic activity of the yeast isomeroreductase.
  • the enzymatic activity measurements are carried out at 25 ° C. in
  • the K M for NADPH is 1.6 ⁇ M.
  • Figure 4 Influence of the concentration of substrate AHB [A] and AL [B] on the enzymatic activity of the yeast isomeroreductase.
  • the enzymatic activity measurements are carried out at 25 ° C. in the following reaction medium: MgCh 10 mM, NADPH 250 ⁇ M and in 1 ml of Hepes sodium buffer 50 mM, pH 7.5 and in the presence of AHB [A] and AL
  • a The K M for AHB is 104 ⁇ M.
  • B The K M for LA is 266 ⁇ M.
  • Figure 5 Influence of the magnesium concentration on the enzymatic activity of the yeast isomeroreductase.
  • the enzymatic activity measurements are carried out at 25 ° C. in 1 ml of the following reaction medium: MgCte from 0 to 40 mM, NADPH 250 ⁇ M, AHB 0.48 mM and in the 50 mM sodium Hepes buffer, pH 7.5.
  • the curve is fitted to the Michaelis Menten model.
  • the K M for Mg 2+ is 968 ⁇ M.
  • Figure 6 Stoichiometry of binding of the inhibitors Dimethylphosphinoyl-2-hydroxyacetate and N-hydroxy-N-isopropyloxamate on the yeast isomeroreductase.
  • the inhibitors Hoe 704 [A] and IpOHA [B] (0.1 nmoles) are incubated with variable amounts of enzyme (0 to 0.4 nmoles) for 20 minutes at 25 ° C with 25 nmoles of NADPH and 0.25 ⁇ moles of Mg 2+ in a volume of 10 ⁇ l.
  • the enzymatic activity measurements are carried out at 25 ° C. in 1 ml of the following reaction medium: MgCh 10 mM, NADPH 250 ⁇ M, AHB 0.48 mM and in the Hepes sodium buffer 50 mM, pH 7.5.
  • Figure 7 Kinetics of inhibition of yeast isomeroreductase in the presence of inhibitors dimethylphosphinoyl-2-hydroxyacetate [A] and N-hydroxy-N-isopropyloxamate [B].
  • the enzymatic activity measurements are carried out at 25 ° C. in 1 ml of the following reaction medium: MgC 10 mM, NADPH 250 ⁇ M, AHB 0.48 mM in the Hepes sodium buffer 50 mM, pH 7.5 and in the presence of enzyme at 110 nM.
  • the reactions are initiated by simultaneously adding variable amounts of inhibitors dimethylphosphinoyl-2-hydroxyacetate [A] and N-hydroxy-N-isopropyloxamate [B] (from 2 ⁇ M to 30 ⁇ M) in the reaction medium.
  • the curves are plotted according to equation (1), which allows the determination of the values of K 0bs , apparent speed of formation of the enzyme-inhibitor complex.
  • Figure 8 Kinetics of inhibition of yeast isomeroreductase in the presence of inhibitors dimethylphosphinoyl-2-hydroxyacetate [A] and N-hydroxy-N-isopropyloxamate
  • the enzymatic activity measurements are carried out at 25 ° C. in 1 ml of the following reaction medium: MgCk 10 mM; NADPH 250 ⁇ M; 0.48 mM AHB in 50 mM sodium Hepes buffer, pH 7.5 and in the presence of an enzyme at 110 nM.
  • the reactions are initiated by simultaneously adding variable amounts of inhibitors [A] and [B] (from 2 ⁇ M to 50 ⁇ M) in the reaction medium.
  • Figure 9 Determination of the association constant k 0 of dimethylphosphinoyl-2-hydroxyacetate [A] and N-hydroxy-N-isopropyloxamate [B] on the yeast isomeroreductase thanks to the representation 1 / Kobs as a function of the concentration of AHB substrate.
  • the enzymatic activity measurements are carried out at 25 ° C. in 1 ml of the following reactive medium: MgCh 10 mM, NADPH 250 ⁇ M, AHB from 125 ⁇ M to 2.375 mM and in the Hepes sodium buffer 50 mM, pH 7.5 and in the presence of enzyme at 110 nM.
  • the reactions are initiated by simultaneously adding variable amounts of AHB substrate (from 125 ⁇ M to 2,375 mM) and the inhibitors [A] (10 ⁇ M) and [B] (15 ⁇ M) in the reaction medium.
  • An internal fragment of the M. Grisea ILV5 gene was amplified by PCR from the genomic DNA of this fungus using pairs of degenerate primers corresponding to protein domains conserved between the isomeroreductases of fungi.
  • the PCR product obtained was then cloned into the plasmid pGEM-T-Easy (Promega), sequenced and amplified by PCR with a new pair of primers.
  • the latter PCR product was used as a homologous probe to screen a M. grisea cosmid DNA library.
  • the M. grisea ILV5 gene sequence was then produced from of one of the positive clones and of oligonucleotides derived from the sequence of the PCR product already obtained.
  • Amplification of an internal fragment of the M. Grisea ILV5 gene was carried out by PCR using degenerate oligonucleotides. These degenerate oligonucleotides were chosen from the comparison of the protein sequences of the isomeroreductases of N. crassa and S. cerevisiae. This comparison made it possible to highlight 4 domains conserved between these two sequences of fungal isomeroreductases, which should be present in the isomeroreductase of M. grisea. These 4 conserved domains consist of a succession of at least 7 conserved amino acids. The sequence of degenerate oligonucleotides was determined from that of the conserved domain amino acids translated according to the genetic code.
  • PCR amplification can be carried out with four different pairs of degenerate oligonucleotides: 1 (+) and 2 (-); 1 (+) and 4 (-); 3 (+) and 2 (-); 3 (+) and 4 (-). 1.1.2. Amplification of an internal fragment of the M. Grisea ILV5 gene using degenerate oligonucleotides
  • the optimal conditions for amplification of the M. Grisea ILV5 gene were determined by varying the pair of primers and their hybridization temperature.
  • the first 3 amplification cycles were carried out at a variable hybridization temperature (42 ° C, 50 ° C or 55 ° C), while the hybridization temperature of the other cycles was 55 ° C.
  • Positive controls were carried out with the genomic DNA of N. crassa and of S. cerevisiae under the same conditions as for the genomic AD ⁇ of M. grisea. At a hybridization temperature of 42 ° C., the DNA fragments of S.
  • crassa were amplified to the expected size, namely 660 bp, 685 bp, 523 bp and 544 bp with the pairs of primers (1-4) , (1-2), (3-4) and (3-2), respectively, although the amplification profiles with the pairs of primers (1-4) and (3-4) are complex.
  • the different pairs of degenerate oligonucleotides made it possible to amplify, from the genomic AD ⁇ of yeast and of N. crassa, a fragment of expected size. These degenerate oligonucleotides could therefore be used to amplify the M. grisea ILV5 gene.
  • the quantity of oligonucleotides used, tested at a hybridization temperature of 42 ° C., does not seem to have any influence on the amplification of the genomic DNA of M. grisea.
  • the amplification profiles of the genomic DNA of M. grisea, obtained with the different pairs of primers are quite complex.
  • a simplification of the amplification profiles of the genomic DNA of M. grisea was observed for most of the primer pairs; in particular for the pair of primers (1 - 2) which makes it possible to amplify a single DNA fragment to the expected size (685 bp).
  • the internal fragment of the M. Grisea ILV5 gene was amplified by PCR from the genomic DNA of M. grisea, with the pair of primers (1-2), at a primer hybridization temperature of 50 °. C for 3 cycles, then 55 ° C for the other amplification cycles.
  • This PCR product of about 680 bp, is purified after separation by agarose gel electrophoresis and then cloned into the plasmid pGEM-T-easy.
  • the bacterial colonies obtained after transformation and thanks to a white / blue selection system (X-Gal) showed three different phenotypes: white, blue and white with the center of the blue colony (called white / blue colonies).
  • nucleotide sequences of the two clones # 4 and # 20 has shown that they correspond to the same DNA fragment cloned in different orientations in the plasmid pGEM-T-easy, which could explain their phenotypic difference ( white and white / blue).
  • the double-stranded nucleotide sequence of this cloned fragment was thus obtained.
  • the homology of this nucleotide sequence with those coding for known proteins was sought thanks to the Blastx program of NCBI (National Center for Biotechnology Information). This program compares the translated sequences of the six reading phases of a nucleotide sequence with all of the protein sequences contained in the databases.
  • the fragment cloned into the plasmid pGEM-T-easy therefore corresponds to the internal fragment of the ILV5 gene from M. grisea. Although the sequence of the internal fragment of the ILV5 gene of M. grisea and that of the ILV5 gene of N. crassa show strong homology, a difference at the center of the sequence of the ILV5 gene of M. grisea exists.
  • This difference could correspond to the presence of an intron within the sequence of M. grisea, since an intron of 77 bp exists in N. crassa at this position. The position and the sequence of this intron were sought.
  • a 5 ′ consensus splicing motif was identified in the nucleotide sequence of the internal fragment of the M. Grisea ILV5 gene, as well as a 3 ′ consensus splicing motif and a lariat sequence.
  • the putative intron (86 bp) of the internal fragment of the M. Grisea ILV5 gene was therefore identified. Splicing the intron of the sequence of the internal fragment of the ILV5 gene of M. grisea makes it possible to obtain a “theoretical” fragment of AD ⁇ c.
  • An internal fragment of the M. Grisea ILV5 gene was amplified by PCR, from clone No. 4, using primers 13U and 549L defined from the sequence of the ILV5 gene cloned in the plasmid pGEM-T- easy. This fragment, after purification on agarose gel, was used as a template to produce a labeled ILV5 gene probe.
  • the Guyl 1 cosmid library is represented in the form of 28 pools of 96 DNA mini-preparations corresponding to the 96 different cosmids present in a 96-well plate (2,688 clones).
  • the ILV5 gene of M. grisea was sought in this cosmid library by carrying out a PCR amplification on these pools of DNA mini-preparations using the primers 300U and 549L defined from the known sequence of the ILV5 gene.
  • a fragment of expected size (249 bp) was amplified from pools No. 17; 19; 20; 21; 27; 28 and 29.
  • the search for the ILV5 gene was continued by hybridizing with the ILV5 gene probe the cosmids of plates No. 17; 19; 20; 21; 27; 28 and 29.
  • the sequencing of the ILV5 gene was carried out in stages.
  • the first sequence reaction was carried out using divergent primers chosen from the known sequence of the internal fragment of the ILV5 gene from M. grisea obtained by PCR. From this new sequence of the ILV5 gene, new primers have been defined to carry out other sequence reactions and this until the ILV5 gene of M. grisea has been completely sequenced.
  • the sequences translated from the entire nucleotide sequence of the ILV5 gene according to the 6 reading phases are compared with the protein sequence of the N. crassa isomeroreductase, in order to locate the position of the translation initiating ATG, of the STOP codon. of termination of the translation, and of the different introns possible.
  • the translation initiating ATG has been identified on the nucleotide sequence of the ILV5 gene and serves as a reference (+1) from which the other elements of the sequence are positioned.
  • Three putative mirons have been identified in the nucleotide sequence of the M. grisea ILV5 gene. The first intron would be located between positions (in bp) 199 and 280, the second intron in position 314-390 and the third intron would be located between positions 670 and 755 of the ILV5 gene of M. grisea.
  • the translation termination STOP codon would be at position 1449 of the M. grisea ILV5 gene sequence. The isolation of the M.
  • Grisea ILV5 gene cDNA was undertaken in order to verify the position of the suspected introns by comparing the protein sequences of M. grisea and N. crassa. b) Isolation of AD ⁇ c from the ILV5 gene of M.grisea and search for introns of the gene of M.grisea
  • the AD ⁇ c of the ILV5 gene of M. grisea was isolated by carrying out a PCR amplification from an AD ⁇ c library of the isolate PI.2 (AR ⁇ of mycelium grown in complete medium) using the defined oligonucleotides from the ILV5 gene sequence: oligonucleotides 22U and 1603L.
  • the oligonucleotide 22U is located before the translation initiating ATG and the oligonucleotide 1603L is located 93 bp after the STOP codon for terminating the translation.
  • Two fragments are amplified with this pair of primers: a fragment of size less than 500 bp and a fragment amplified to the expected size, ie 1.6 kb.
  • the fragment amplified to the expected size is purified after separation by agarose gel electrophoresis and cloned into the plasmid pGEM-T-easy.
  • the 24 bacterial colonies obtained after transformation are analyzed by PCR using the pair of primers 22U and 1603L. These 24 clones have the AD ⁇ c of the ILV5 gene of M. grisea, because a DNA fragment has indeed been amplified to the expected size (1.6 kb).
  • Clone # 18 was chosen to be sequenced using the universal primers Sp6 and T7.
  • the three introns are located at the positions predicted by the comparison of the protein sequences of the isomeroreductases of N. crassa and translations of the ILV5 gene of M. grisea.
  • the ILV5 gene has 4 introns positioned differently and of different lengths compared to the IL V5 gene of M. grisea.
  • the protein sequence of the M. Grisea ILV5 gene has been deduced from the T AD ⁇ c sequence of this gene. Comparison of the protein sequences of the isomeroreductases of M. grisea, N. crassa and S. cerevisiae show a very strong identity between the isomeroreductases of these three species. Indeed, the percentage of identity between the sequences of the isomeroreductases of M. grisea and N. crassa is 86%. That between the isomeroreductases of M. grisea and yeast is 70% and that between the isomeroreductases of N. crassa and yeast is 72% ( Figure 1). N. crassa and M.
  • grisea are very similar fungal species (pyrenomycetes), which could explain the high identity percentage between the isomeroreductases of these two species. d) Study of the expression of the isomeroreductase of M.grisea in this fungus subjected to different stress conditions The total AR ⁇ s of M. grisea coming from mycelium subjected to different stress conditions were extracted and then transferred to the membrane before be hybrid with the homologous probe of the M. grisea ILV5 gene. The ILV5 gene is expressed constitutively. It is thus expressed at the same level during a hyperosmotic stress or a nitrogenous nutritional deficiency or an induction by cAMP, a thermal shock or an oxidative stress. It is however not expressed during a carbon nutritional deficiency.
  • the ILV5 gene is subcloned in the plasmid pBC SK + before insertional mutagenesis by transposon.
  • Cosmid 20 / G6 containing the ILV5 gene carries an ampicillin resistance gene, so it cannot be used directly as a target for insertional mutagenesis. Indeed, a double selection by kanamycin and ampicillin would not be selective enough for the target plasmids which have integrated the transposon, since the transposon donor plasmid (pGPS3 Hygro) is also resistant to kanamycin and to ampicillin.
  • the ILV5 gene was therefore subcloned into a plasmid carrying a chloramphenicol resistance gene, the plasmid pBC SK +.
  • the clones having integrated the transposon at the level of the target plasmid may be selected for their double resistance to kanamycin and to chloramphenicol.
  • the size of the cosmid insert is too large (40 kb).
  • the length of the ILV5 gene is approximately 3 kb, the probability that the transposon integrates into the gene present at the cosmid level (46 kb) is 6.5%, while the probability of integration of the transposon into the ILV5 gene subcloned into the plasmid pBC SK + (18 kb) is approximately 3 times higher, or approximately 17%.
  • the subcloning of the genomic DNA fragment carrying the ILV5 gene was carried out by positioning this gene at the center of the insert. This type of construction facilitates the integration of the mutated ILV5 gene into the genome of M. grisea by homologous recombination.
  • the mapping of the cosmid 20 / G6 region carrying ILV5 made it possible to choose a 15 kb Clal-Clal fragment in which the ILV5 gene is relatively well centered. Indeed, the ILV5 gene is framed in 5 'by 5 kb of the genomic sequence and in 3' by 5.5 kb.
  • the 15 kb fragment containing the ILV5 gene was purified after separation on an agarose gel and under clone in the plasmid pBC SK +. 24 colonies obtained after transformation were analyzed by PCR using the pair of primers 22U and 1603L specific for the ILV5 gene.
  • the 5 clones amplify a fragment to the expected size (1.6 kb) possessing the ILV5 gene.
  • Clone No. 19 was chosen to carry out insertional mutagenesis by in vitro transposition of the IL V5 gene.
  • Insertional mutagenesis by in vitro transposition of the ILV5 gene from M. grisea was carried out with the GPS T kit (New England Biolabs) from clone No. 19.
  • the plasmid pGPS 3 Hygro which carries a gene for resistance to kanamycin and to hygromycin at the level of the transpressor, is used as a transposon donor.
  • the plasmid pBC SK + carrying the ILV5 gene and the chloramphenicol resistance gene, corresponds to the target plasmid.
  • the bacterial clones having an integration of the transposon at the level of the target plasmid pBC SK + are selected by virtue of their resistance to both kanamycin and chloramphenicol. This double resistance could also be conferred on bacterial clones having both the target plasmid and the donor plasmid intact. Destruction of the donor plasmid by digestion with the enzyme Pl-Scel overcomes this problem.
  • the selected bacterial clones are analyzed by PCR using the pair of primers 22U and 1603L, located on either side of the coding region of the ILV5 gene.
  • Bacterial clones # 3; 8; 18 and 29 were sequenced using divergent primers Tn7L and Tn7R located at each end of the transposon, in order to locate the exact position of the site of insertion of the transposon Tn7 within the sequence of the ILV5 gene.
  • the transposon integrated 21 bp before ATG for clone # 18, 9 bp after ATG for clone # 8, 809 bp after ATG for clone # 3 and 1176 bp after ATG for clone # 29.
  • the insert of clone No. 8 containing the ILV5 gene of M. grisea disrupted in its coding region (9 bp after ATG) emerged from the plasmid by digestion with the enzyme CM and purified on agarose gel. It corresponds to the linearized construction.
  • the plasmid pBC SK + from the undigested clone No. 8 corresponds to the "circular" construction. Transformation of the protoplasts of the PI.2 strain. of M. grisea is carried out either with 5 ⁇ g of the linearized construction, or with 4 ⁇ g of the "circular" construction.
  • the positive transformation control is carried out using 3 ⁇ g of plasmid pCB1003 carrying a hygromycin resistance gene and the negative control is carried out without DNA.
  • 62 transformants are obtained for linearized construction and 24 for "circular" construction.
  • These 86 transformants were subcultured on complete medium supplemented with hygromycin at 120 mg / 1 and on minimum medium supplemented with hygromycin at 120 mg / 1 or at 60 mg / 1.
  • This type of subculture makes it possible to identify the transformers ilv5 ⁇ which are auxotrophic for leucine, valine and isoleucine and therefore which do not grow on minimum medium.
  • auxotrophic transformants are carried out by subculturing these colonies from these monospores on minimum medium, on minimum medium supplemented with leucine, valine and isoleucine at 0.3 mM and on complete TNKYE glucose medium. Thus, genetically purified and stable transformants were obtained. Out of 10 potential auxotrophic transformants for leucine, valine and isoleucine, 8 (80%) were found to be effectively auxotrophic. The 2 non-auxotrophic transformants had to correspond to a mixture of genetically different populations (ilv5 and ilv5 " ) which evolved towards a majority of ilv5 during the growth of the transformant on non-selective medium before monospore purification.
  • Example 3 Phenotic characterization of the ilv5 ⁇ transformants of auxotrophic Magnaporthe grisea for leucine, valine and isoleucine and study of their pathogenic power 3.1. Effect of disruption of the ILV5 gene on the growth and development of M.grisea transformants The development of the ilv5 transformants " was tested on different culture media. Thus, on minimum nitrate medium, the ilv5 " transformants are unable to grow, while their growth is possible on minimum medium supplemented with valine, leucine and isoleucine at 0.3 mM.
  • the development of the ilv5 " transformants on minimum medium supplemented with 0.3 mM valine and isoleucine can be improved by supplementing the minimum medium with a final concentration of valine and isoleucine of 1 mM.
  • the ilv5 " transformants exhibit little different from the wild strain: their mycelium is gray-white more or less aerial (less aerial than the wild strain).
  • adding of panthoteine, oxidized form of panthotenate which is involved in the biosynthesis of leucine, at 1 mg / 1 in the minimum medium + valine and isoleucine at 0.3 mM does not improve the development of the transformants ilv5 " .
  • the sporulation of transformants ilv5 " is more slow and ten times less important on agar medium "rice flour” compared to the wild strain.
  • the sporulation of the ilv5 " transformants is almost identical to the wild strain when valine and isoleucine are added to the" rice flour "agar medium at a final concentration of 1 mM.
  • M. grisea pathogenicity tests of ilv5 " transformants were carried out by brushing or depositing drops of spore suspension of the transformants to be tested on cut barley leaves.
  • An inoculation is carried out using a wet cotton swab dipped in a suspension of spores (3.10 ⁇ spores / ml in general) and used to brush the fragments of barley leaves in survival (on medium 1% agar water, kinetin 2 mg / 1).
  • the other type of inoculation consists of depositing 30 ⁇ l drops in three different places on the surface of the barley leaves. Symptoms are observed after 5 to 9 days of incubation at 26 ° C.
  • the lesions caused by the ilv5 " mutants are also atypical and appear later. They appear after 6 to 9 days of incubation at 26 ° C., compared with 4 to 9 days for the wild strain (see table 2 below). Some lesions caused by transformants ilv5 " appear at the ends of the barley leaves (Table 2). Injuries at the tips of the leaves could explain these lesions, as they could facilitate penetration of the fungus. Pathogenicity tests on whole plants have therefore been carried out, in order on the one hand to confirm the existence of a reduction in the pathogenic power of the transformants ilv5 " and on the other hand to estimate the reduction in the pathogenesis of the mutants ilv5 " and the importance of injuries for the penetration of the ilv5 fungus " .
  • the pathogenicity tests of ilv5 transformants " were carried out by spraying a suspension of spores (10 and 3.10 spores.ml " ) from these barley plants. Gelatin at a final concentration of 0.5% (w / v) is added to this suspension of spores to allow better adhesion of the spores to the surface of the leaves. The plants are placed in a humid room overnight after inoculation. Symptoms are usually seen after 5-10 days of room temperature incubation for barley.
  • Table 3 Test of pathogenic power of transformants ilv5 " on whole plant (barley) The inoculation of barley plants was carried out by spraying a suspension of spores
  • the fungicidal effect of the dimethylphosphinoyl-2-hydroxyacetate and N-hydroxy-N-isopropyloxamate inhibitors was tested on the pathogenic fungus M. grisea by following the evolution of the growth of this fungus in the presence of different concentrations of inhibitor, over a period of 7 days.
  • a dom ed culture medium minimum nitrate medium (MM); MM + leucine, valine and isoleucine at 0.3 mM; complete TNKYE glucose medium (MC); MC + leucine, valine and isoleucine at 0.3 mM
  • MM minimum nitrate medium
  • MC complete TNKYE glucose medium
  • N-hydroxy-N-isopropyloxamate at concentrations varying from 0.03 ⁇ M to 3 ⁇ M
  • different media MM and MM supplemented with leucine, valine and isoleucine at 0.3 mM.
  • N-hydroxy-N-isopropyloxamate strongly inhibits the growth of M. grisea. This inhibition of growth by N-hydroxy-N isopropyloxamate (from 0.3 .mu.M) is observed from the 3rd day of growth to me, and like the rest following days ( Figure 2).
  • the effect of the inhibitor N-hydroxy-N-isopropyloxamate was tested on the pathogenic fungus M. grisea by following the evolution of the growth of this fungus in the presence of different concentrations of inhibitor, in different culture media and on a period of 7 days.
  • the values given in the table correspond to the average growth percentages of the M. grisea fungus obtained on the 5th day of growth from two tests.
  • the control wild strain of M. grisea corresponds to a growth rate of 100%.
  • N-hydroxy-N-isopropyloxamate By supplementing the minimum medium with valine, leucine and isoleucine to 0.3 mM, the toxicity of N-hydroxy-N-isopropyloxamate on the growth of the fungus M. grisea is raised, whatever the concentration of N-hydroxy-N-isopropyloxamate used.
  • This lifting of toxicity of N-hydroxy-N-isopropyloxamate by the addition of valine, leucine and isoleucine to the minimum medium shows that this toxicity results from a specific inhibition of the pathway for biosynthesis of these amino acids, by inhibiting isomeroreductase.
  • N-hydroxy-N-isopropyloxamate acting specifically on the isomeroreductase of M. grisea strongly inhibits the growth of M. grisea at very low concentrations.
  • the isomeroreductase and the inhibitor N-hydroxy-N-isopropyloxamate appear to be a good target
  • N-hydroxy-N-isopropyloxamate had an effect on the germination of M. grisea spores.
  • Additional tests were performed to determine if N-hydroxy-N-isopropyloxamate at high concentrations could block spore germination. Thus, at 10 mM, N-hydroxy-N-isopropyloxamate does not inhibit the germination of M.
  • DI 50 concentration inhibiting the growth of the fungus by 50%.
  • DI 80 concentration inhibiting the growth of the fungus by 80%.
  • the coding sequence of the yeast ILV5 gene without the transit peptide was overexpressed in E. coli in order to obtain large quantities of enzyme to facilitate its biochemical study and in particular its structural study.
  • yeast isomeroreductase gene ILV5 was first amplified by PCR without the part coding for the transit peptide. The PCR reaction product was then cloned into a pTP expression vector inducible by 1TPTG. The isomeroreductase was then overproduced in E. coli, purified and its biochemical properties studied.
  • the signal peptide which allows the yeast isomeroreductase to be addressed in its cell compartment, the mitochondria, is cleaved when the protein has entered the mitochondria.
  • the region of the yeast ILV5 gene located between the end of the transit peptide and the translation termination STOP codon was amplified by PCR from the genomic DNA of S. cerevisiae with the pairs of primers (l'-3 ') and (2'-3').
  • the size of the DNA fragments amplified with the pairs of primers (1'-3 ') and (2'-3') is 1079 bp and 1124 bp, respectively.
  • Double digestion of the cloning vector and of the PCR reaction product with the enzymes Ncol and Sali makes it possible in fact to clone the yeast ILV5 gene in the correct orientation in the vector PET-23d.
  • the plasmid pET-23d (Tebu) carrying the ampicillin resistance gene, is used as an inducible expression vector to produce a large quantity of yeast isomeroreductase in E. coli.
  • This type of vector has a promoter of phage T7, which is recognized by T7 RNA polymerase, but not by E.co / z TARN polymerase.
  • the production of the cloned protein takes place after the induction by 1TPTG of the strain BL21 pLysS
  • the T7 RNA polymerase gene is under the control of the lac promoter inducible by 1TPTG.
  • the BL21 pLysS strain transformed with the plasmid p ⁇ T-23d, carrying the ILN5 gene from S. cerevisiae is called BL21 pLysS-p ⁇ T-23d-isomeroreductase.
  • Construction No. 1 corresponds to the cloning of the amplified fragment with the primers (1 '-3') and Construction No. 2 corresponds to the cloning of the amplified DNA fragment with the primers (2 '-3').
  • a double Sall / Ncol digestion of the 12 clones obtained after transformation of the DH5 cells with construction no. 1 and of the 6 clones transformed with construction no. 2 makes it possible to bring out the cloned fragment in the vector p ⁇ T and thus to verify the presence of one of the 2 constructions within the different clones. Analysis of the digestion profiles of these bacterial clones showed that they all had the corresponding construction.
  • Two clones were selected: the clone P ⁇ T 1-4 (construction n ° 1) and the clone P ⁇ T 2-1 (construction n ° 2); they were used to transform BL21 pLysS cells, in order to overproduce the yeast isomeroreductase in E. coli.
  • the overexpression of the "short" form (construction No. 1) and the “long” form (construction No. 2) of the yeast isomeroreductase was induced in E. coli by 1TPTG.
  • the bacterial strain BL21 pLysS, transformed with the plasmid p ⁇ T 23-d containing the yeast ILV5 gene without the region coding for the transit peptide, is cultured at 28 ° C. with stirring in LB medium supplemented with carbenicillin (100 mg / 1) and in chloramphenicol (30 mg / 1) up to a density equivalent to an OD 600 of approximately 0.6.
  • LTPTG is then added to a concentration of 0.4 mM final and the bacteria are left in culture at 28 ° C. with stirring for approximately 15 hours.
  • This bacterial culture is then centrifuged (30 minutes, 4500 rpm); the bacterial pellet is resuspended in 15 ml of buffer (KH2-K2PO4 10 mM (pH 7.5), ⁇ DTA 1 mM, DTT 1 mM and protease inhibitors: benzamidine HC1 1 mM, amino-caproic acid 5 mM) and sonicated by Vibra - cell disruptor (Sonics and Materials, Danbury, CT, US A) for 15 minutes, at power 4.40% of the total lysis time.
  • the cell extract is centrifuged (20 minutes, 15,000 rpm); the supernatant, containing the soluble proteins, is then stored at -80 ° C.
  • the purification of the short form of isomeroreductase was therefore carried out in two stages starting from the fraction of soluble proteins; first on an anion exchange column (Q-Sepharose), then on a permeation column (Superdex 75).
  • the soluble protein extract (15.5 ml; 227.8 mg protein), which contains the yeast isomeroreductase (crude extract) is applied to an anion exchange column, HiLoad 16/10 Q- Sepharose (Pharmacia) connected to a Pharmacia FPLC system, previously equilibrated with 10 mM KH2-K2PO4 buffer / 1 mM EDTA / 1 mM DTT.
  • the chromatographic fractions containing the yeast isomeroreductase are concentrated to 1.6 ml by centrifugation at 5500 rpm in a macrosep-10 unit (filter).
  • This extract (27.7 mg) is then applied to a Hiload 16/60 Superdex 75 column (Pharmacia) connected to an F.P.L.C system from Pharmacia, previously equilibrated with Hepes KOH 25 mM buffer. .
  • the chromatographic fractions containing the yeast isomeroreductase (18.99 mg) are concentrated to 9.7 mg / ml by centrifugation at 5500 rpm in a 10K microsep (filter) and stored at -80 ° C.
  • the yeast isomeroreductase After injection of the soluble protein fraction (approximately 230 mg) into the Q-Sepharose column, the yeast isomeroreductase is eluted with 10 mM KH2-K2PO4 buffer / 1 mM EDTA / 1 mM DTT. It is in fact useless to elute this enzyme by acting a gradient of increasing concentration of phosphate buffer since preliminary experiments have shown that this enzyme is not retained by the column. After this first purification step, approximately 30 mg of protein was recovered and the purification yield in terms of activity is 55% (Table 6). Table 6: Steps in the purification of the overexpressed yeast isomeroreductase in E. coli
  • the activities were determined in the following reaction medium: Hepes of sodium 50 mM, pH 7.5; MgCl 2 10 mM; NADPH 250 ⁇ M and AHB 0.48mM.
  • the determination of the kinetic parameters of the yeast isomeroreductase was carried out by monitoring the evolution of the enzymatic reaction using a spectrophotometer under saturated conditions of magnesium, NADPH and substrate AHB or AL. All the measurements of enzymatic activity were carried out in a quartz cell with a 1 cm optical path containing sodium Hepes buffer (50 mM, pH 7.5), 10 mM MgCl 2 , 250 ⁇ M NADPH, in a volume final 1 ml, at 25 ° C. The enzymatic reaction was initiated by the addition of 0.48 mM of AHB or AL. The progress of this reaction was monitored by virtue of the decrease in absorption of NADPH at 340 nm. 5.3.1. Determination of the optimum pH of activity of the purified yeast recombinant isomeroreductase
  • the optimum pH of activity of this enzyme was determined, by measuring the activity of the purified enzyme in buffers of variable pH.
  • the optimum activity pH for yeast isomeroreductase is 7.5, while studies have shown that for plant isomeroreductase is 8.2.
  • This difference in optimum pH of isomeroreductase activity between the plant and the yeast is explained by the cellular localization of these 2 enzymes.
  • the plant isomeroreductase is located in the chloroplast whose pH is 8.2 in the light, while the yeast isomeroreductase is located in the mitochondrion whose pH is 7.5.
  • the optimum pH of activity of these isomeroreductases is therefore well suited to the cellular environment in which they are found.
  • the specific activity of the yeast isomeroreductase for the AHB and AL substrates is 6 and 1 ⁇ mol of oxidized NADPH. Min “. Mg " of protein, respectively.
  • the specific activities of the plant isomeroreductas for the AHB and AL substrates are also 6 and 1 ⁇ mol of oxidized ⁇ ADPH.min " .mg " of protein, respectively.
  • Affinities for the cof actors ⁇ ADPH and ⁇ ADH The affinity of the yeast isomeroreductase for ⁇ ADPH is very high (FIG. 3).
  • K M K M - 5 ⁇ M
  • K M ⁇ ADPH K ⁇ ADPH obtained for the purified yeast isomeroreductase is consistent with the value obtained for the partially purified yeast enzyme (K M ⁇ 2.5 ⁇ M; Hawkes et al, 1989).
  • K M ⁇ ADH
  • ⁇ ADH 645 ⁇ M in the presence of AHB and Mg 2+ ; Dumas et al., Biochem. J., 288: 865-874, 1992), the yeast enzyme seems to be unable to use ⁇ ADH. No enzymatic activity was detected in the presence of ⁇ ADH (at 300 ⁇ M) under saturated conditions with AHB substrate and magnesium, perhaps because of an affinity for ⁇ ADH even more weak than that of plant isomeroreductase. The yeast isomeroreductase would use the
  • NADPH as a donor of hydrogen with an even greater specificity than the plant enzyme.
  • the study of the binding stoichiometry of the inhibitors N-hydroxy-N-isopropyloxamate and dimethylphosphinoyl-2-hydroxyacetate on the yeast isomeroreductase has shown that these inhibitors behave like irreversible inhibitors.
  • Equation (1) therefore makes it possible to describe the kinetics of formation of the reaction product, this equation being applicable to irreversible inhibitors.
  • the parameters ml, m2 and m3, defined from equation (1), are obtained directly from the adjustment of the experimental curves by the KaleidaGraph software, as well as the errors associated with the determination of these parameters. Equation (1):
  • DO 3 0 is the optical density measured with a spectrophotometer at 340 nm at time "t"
  • the apparent rate of formation of the enzyme-inhibitor complex is a linear function of the inhibitor concentration.
  • the graphical representation m 3 as a function of the inhibitor concentration is a hyperbola.
  • the graphical representation m 3 as a function of the inhibitor concentration is linear, suggesting that the inhibition of the yeast isomeroreductase by these products is done in a single step (FIG.
  • k 0 s - rn 3 apparent rate of formation of the enzyme-inhibitor complex
  • k o constant of association of the inhibitor with the enzyme
  • k -0 constant of dissociation of the inhibitor with the enzyme
  • the k -0 is then calculated using the equation (3) thanks to the KaleidaGraph program. Equation (3):
  • This equation can be used for the inhibitor N-hydroxy-N-isopropyloxamate, but not for dimethylphosphinoyl-2-hydroxyacetate.
  • the graphic representation l / m 3 as a function of the concentration of substrate is linear, but does not pass through the origin.
  • the graphic representation l / m 3 as a function of the substrate concentration is linear and the value of the ordinate at the origin is negligible.
  • the dimethylphosphinoyl-2-hydroxyacetate inhibitor may not be completely irreversible.
  • a linear regression line then makes it possible to obtain the value of k 0 for dimethylphosphinoyl-2 -hydroxyacetate.
  • the k 0 values corresponding to the inhibitors N-hydroxy-N-isopropyloxamate and dimethylphosphinoyl-2-hydroxyacetate are 12,433 M " .s " and 7721 M “ .s " , respectively.
  • k 0 for N-hydroxy-N-isopropyloxamate 1,900 M " .s " and k 0 for dimethylphosphinoyl-
  • the quaternary structure of the yeast isomeroreductase has been studied using two different approaches: mass spectrometry and gel filtration.
  • yeast isomeroreductase 194- monomer of the yeast isomeroreductase, represented by the states of charge [M + 12H] to [M + 14H] is demonstrated on this same mass spectrum.
  • the yeast isomeroreductase could therefore be in equilibrium between a monomeric form and a dimeric form.

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Abstract

La présente invention concerne l'utilisation d'inhibiteurs de l'acétohydroxyacide isoméroréductase pour le traitement des maladies fongiques des cultures. L'invention a pour objet des procédés de traitement des cultures contre les maladies fongiques comprenant l'application d'un inhibiteur de l'acétohydroxyacide isoméroréductase. L'invention se rapporte aussi ô des procédés pour l'identification de nouveaux composés fongicides comprenant une étape d'identification d'inhibiteurs de l'acétohydroxyacide isoméroréductase.

Description

Utilisations d'inhibiteurs de l'acétohydroxyacide isoméroréductase pour le traitement des maladies fongiques des cultures
La présente invention concerne l'utilisation d'inhibiteurs de l'acétohydroxyacide isoméroréductase pour le traitement des maladies fongiques des cultures.
Les champignons sont responsables d'épidémies dévastatrices qui peuvent entraîner des pertes importants au niveau des cultures de différentes espèces végétales. Le principe d'employer des inhibiteurs d'enzymes de champignons pathogènes, et d'utiliser ces enzymes dans des tests pour identifier de nouvelles molécules actives contre ces champignons est connu en soi. Toutefois, la simple caractérisation d'une enzyme de champignon n'est pas suffisante pour atteindre cet objectif, encore faut-il que l'enzyme choisi comme cible de molécules fongicides potentielles soit essentielle à la vie du champignon, son inhibition par la molécule fongicide entraînant la mort du champignon, ou essentielle à la pathogénie du champignon, son inhibition n'étant pas létale pour le champignon mais inhibant simplement son pouvoir pathogène. L'identification de voies métaboliques et d'enzymes indispensables à la pathogénie et à la survie du champignon est donc nécessaire au développement de nouveaux produits fongicides.
L'acétohydroxyacide isoméroréductase est une enzyme bien caractérisée chez les plantes et les microorganismes tels que les bactéries et les levures. Cette enzyme est la deuxième enzyme de la voie de biosynthèse des acides aminés à chaîne ramifiée, elle catalyse la transformation du substrat, le 2S-2-acétolactate (AL) ou le 2S-2-acéto-2- hydroxybutyrate (AHB) en 2,3-dihydroxy-3-isovalérate (DHIN) ou en 2,3-dihydroxy-3- méthylvalérate (DHIM) respectivement. Cette réaction nécessite la présence d'ions magnésium (Mg2+) et se déroule en deux étapes: une isomérisation d'un groupement méthyle ou éthyle suivie d'une réduction par le ΝADPH. Un grand nombre de connaissances ont été acquises sur l'isoméroréductase de plante en tant que cible pour des herbicides (Wittenbach et al., Plant Physiol. 96, Νo.l, Suppl., 94, 1991; Schulz et al, FEBS Lett, 238:375-378, 1988) et des inhibiteurs de l'acétohydroxyacide isoméroréductase ont été décrits comme herbicides (EP106114; US4,594,098, EP196026, EP481407, WO 94/23063, CA2002021). Cependant, ces composés n'ont pas montré une activité herbicide efficace sur plante.
La présente invention a pour objet des procédés de traitement des cultures contre les maladies fongiques comprenant l'application d'un inhibiteur de l'acétohydroxyacide isoméroréductase. On a trouvé que l'inactivation du gène ILV5 codant pour l'acétohydroxyacide isoméroréductase chez Magnaporthe grisea entraîne une inhibition de la croissance du champignon. Cette inhibition de la croissance du champignon est également observé in vivo en présence d'inhibiteurs spécifiques de l'acétohydroxyacide isoméroréductase. M. grisea est pathogène pour de nombreuses espèces de plantes cultivées telles que le riz.
Description de la liste de séquences
SEQ ID No. 1 Acétohydroxyacide isoméroréductase de Magnaporthe grisea. SEQ ID No. 2 Acétohydroxyacide isoméroréductase de Saccharomyces cerevisiae.
SEQ ID No. 3 Acétohydroxyacide isoméroréductase de Neurospora crassa.
SEQ ID No. 4 ADNc du gène de l' acétohydroxyacide isoméroréductase de
Magnaporthe grisea. SEQ ID No. 5 Acétohydroxyacide isoméroréductase de Magnaporthe grisea. SEQ ID No. 6 Gène de l' acétohydroxyacide isoméroréductase de Magnaporthe grisea. SEQ ID No. 7-18 Amorces pour PCR.
Description de l'invention
La présente invention a pour objet des procédés de traitement des cultures contre les maladies fongiques par application d'une quantité efficace d'un inhibiteur de l' acétohydroxyacide isoméroréductase .
L'invention a pour objet un procédé de lutte, à titre curatif ou préventif, contre les champignons phytopathogènes des cultures, caractérisé en ce que l'on applique sur le sol où poussent ou où sont susceptibles de pousser les végétaux, sur les feuilles et/ou les fruits des végétaux ou sur les semences des végétaux, une quantité efficace (agronomiquement efficace) et non phytotoxique d'un inhibiteur de l'acétohydroxyacide isoméroréductase. Par "quantité efficace et non phytotoxique", on entend une quantité d'inhibiteur suffisante pour permettre le contrôle ou la destruction des champignons présents ou susceptibles d'apparaître sur les cultures, et n'entraînant pour lesdites cultures aucun symptôme notable de phytotoxicité. Une telle quantité est susceptible de varier dans de larges limites selon le champignon à combattre, le type de culture, les conditions climatiques, et les composés compris dans la composition fongicide selon l'invention. Cette quantité peut être déterminée par des essais systématiques au champ, à la portée de l'homme du métier.
Les procédés selon l'invention sont utiles pour traiter les semences de céréales (blé, seigle, triticale et orge notamment), de pomme de terre, de coton, de pois, de colza, de maïs, de lin ou encore les semences d'arbres forestiers, ou encore les semences génétiquement modifiées de ces végétaux. La présente invention concerne aussi l'application foliaire sur les cultures végétales, c'est-à-dire sur les feuillages, les fleurs, les fruits et/ou les troncs des végétaux concernés. Parmi les végétaux visés par les procédés selon l'invention, on peut citer le riz, le maïs, le coton, les céréales, comme le blé, l'orge, le triticale, les arbres fruitiers, en particulier pommiers, poiriers, pêchers, vigne, bananiers, orangers, citronniers, etc., les cultures oléagineuses, par exemple, colza, tournesol, les cultures maraîchères et légumières, tomates, salades, les cultures protéagineuses, le pois, les solanées, par exemple la pomme de terre, la betterave, le lin, et les arbres forestiers, ainsi que les homologues génétiquement modifiés de ces cultures. Parmi les végétaux visés par la méthode selon l'invention, on peut citer :
- le blé, en ce qui concerne la lutte contre les maladies suivantes des semences : les fusarioses (Microdochium nivale et Fusariwn roseum), les caries (Tilletia caries,, Tilletia controversa ou Tilletia indicé), la septoriose (Septoria nodorum); le charbon nu (Ustilago triticï); - le blé, en ce qui concerne la lutte contre les maladies suivantes des parties aériennes de la plante : le piétin- verse (Tapesia yallundae, Tapesia acuiformis), le piétin-échaudage (Gaeumannomyces graminis), la fusariose du pied (F. culmorum, F. graminearum), la fusariose des épis (F. culmorum, F. graminearum, Microdochium nivale), le rhizoctone (Rhizoctonia cerealis), l'oïdium (Erysiphe graminis forma specie triticï), les rouilles (Puccinia striiformis et Puccinia recondita) et les septorioses (Septoria tritici et Septoria nodorum), l'helminthosporiose (Drechslera tritici-repentis) ;
- l'orge, en ce qui concerne la lutte contre les maladies suivantes des semences : les helminthosporioses (Pyrenophora graminea., Pyrenophora teres et Cochliobolus sativus), le charbon nu (Ustilago nuda) et les fusarioses (Microdochium nivale et Fusarium roseum); - l'orge, en ce qui concerne la lutte contre les maladies suivantes des parties aériennes de la plante : le piétin- verse (Tapesia yallundae), les helminthosporioses (Pyrenophora teres et Cochliobolus sativus), l'oïdium (Erysiphe graminis forma specie hordeï), la rouille naine (Puccinia hordeï) et la rhynchosporiose (Rhynchosporium secalis); - la pomme de terre, en ce qui concerne la lutte contre les maladies du tubercule (notamment
Helminthosporium solani, Phoma tuberosa, Rhizoctonia solani, Fusarium solanï), et le le mildiou (Phytopthora infestans ;
- la pomme de terre en ce qui concerne la lutte contre les maladies du feuillage suivantes : l'alternariose (Alternaria solanï), le mildiou (Phytophthora infestans);
- le coton, en ce qui concerne la lutte contre les maladies suivantes des jeunes plantes issues des semences : les fontes de semis et les nécroses du collet (Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum), la pourriture noire des racines (Thielaviopsis basicoh); - les cultures protéagineuses, par exemple le pois, en ce qui concerne la lutte contre les maladies suivantes des semences : l'anthracnose (Ascochyta pisi, Mycosphaerella pinodes), la fusariose (Fusarium oxysporum), la pourriture grise (Botrytis cinerea), le mildiou (Peronosporα pisï) ;
- les cultures oléagineuses, par exemple le colza, en ce qui concerne la lutte contre les maladies suivantes des semences : Phomα lingαm, Alternαriα brαssicαe et Scier otiniα sclerotiorum;
- le maïs, en ce qui concerne la lutte contre les maladies des semences : (Rhizopus sp., Pénicillium sp., Trichodermα sp., Aspergillus sp. Et Gibberellαfujikuroï);
- le lin, en ce qui concerne la lutte contre la maladie des semences -.Alternaria linicolα; - les arbres forestiers, en ce qui concerne la lutte contre les fontes de semis (Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solanï);
- le riz en ce qui concerne la lutte contre les maladies suivantes des parties aériennes : la pyriculariose (Magnaporthe grisea), le rhizoctone (Rhizoctonia solanï) ;
- les cultures légumières en ce qui concerne la lutte contre les maladies suivantes des semis ou des jeunes plants issus de semences : les fontes de semis et les nécroses du collet
(Fusarium oxysporum, Fusarium roseum, Rhizoctonia solani, Pythium sp.);
- les cultures légumières en ce qui concerne la lutte contre les maladies suivantes des parties aériennes : la pourriture grise (Botrytis sp.), les oïdiums (notamment Erysiphe cichoracearum, Sphaerotheca fuliginea, Leveillulα tαurica), les fusarioses (Fusarium oxysporum, Fusarium roseum), les cladosporioses (Cladosporium sp.), les alternarioses (Alternaria sp.), les anthracnoses (Colletotrichum sp.), les septorioses (Septoria sp.), le rhizoctone (Rhizoctonia solanï), les mildious (par exemple Bremia lactucae, Peronospora sp., Pseudoperonospora sp, Phytophthora sp); - les arbres fruitiers en ce qui concerne les maladies des parties aériennes : la moniliose
(Monïlia fructigenae, M. /axa), la tavelure (Venturia inaequalis), l'oïdium (Podosphaera leucotricha);
- la vigne en ce qui concerne les maladies du feuillage : notamment la pourriture grise (Botrytis cinere ), l'oïdium (Uncinula necatox), le black-rot (Guignardia biwelli), le mildiou (Plasmopara viticola);
- la betterave en ce qui concerne les maladies suivantes des parties aériennes : la cercosporiose (Cercosporα beticolà), l'oïdium (Erysiphe beticola), la ramulariose (Rαmulαriα beticola). L'acétohydroxyacide isoméroréductase est une enzyme bien caractérisée que l'on retrouve chez les plantes et les microorganismes (bactéries, levures, champignons). Les procédés de la présente invention mettent en œuvre des inhibiteurs de l'acétohydroxyacide isoméroréducatase. Dans un premier mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation d'inhibiteurs de l'acétohydroxyacide isoméroréductase de champignon, plus préférentiellement d'inhibiteurs de l'acétohydroxyacide isoméroréductase de champignon phytopathogène pour le traitement des maladies fongiques des cultures. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, les inhibiteurs de l'acétohydroxyacide isoméroréductase inhibent l'acétohydroxyacide isoméroréductase de Magnaporthe grisea et/ou de Saccharomyces cerevisiae et/ou de Neurospora crassa. Dans un autre mode de réalisation particulier, l'inhibiteur de l'acétohydroxyacide isoméroréductase est un inhibiteur de l'activité enzymatique de l'acétohydroxyacide isoméroréductase de la SEQ ID No.l, de la SEQ ID No.2, de la SEQ ID No.3 et/ou de la SEQ ID No. 5.
Tout inhibiteur de l'acétohydroxyacide isoméroréductase peut être utilisé dans les procédés selon l'invention. Des inhibiteurs de l'acétohydroxyacide isoméroréductase sont bien connues de l'homme du métier et ces inhibiteurs ont notamment été décrits dans EP106114; US4,594,098, EP196026, EP481407, WO 94/23063, CA2002021 et WO 97/37660.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, l'inhibiteur de l'acétohydroxyacide isoméroréductase est un analogue d'intermédiaire de réaction se fixant au site actif de l'acétohydroxyacide isoméroréductase.
Préférentiellement, l'inhibiteur de l'acétohydroxyacide isoméroréductase est le diméthylphosphinoyl-2-hydroxyacétate.
Plus préférentiellement, l'inhibiteur de l'acétohydroxyacide isoméroréductase est le N-hydroxy-N-isopropyloxamate. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, l'inhibiteur de l'acétohydroxyacide isoméroréductase est sous la forme d'une composition fongicide.
L'invention concerne aussi des compositions fongicides comportant une quantité efficace d'au moins un inhibiteur de l'acétohydroxyacide isoméroréductase. Les compositions fongicides selon l'invention comprennent, outre l'inliibiteur, les supports solides ou liquides, acceptables en agriculture et/ou les agents tensioactifs également acceptables en agriculture.
En particulier sont utilisables les supports inertes et usuels et les agents tensioactifs usuels.
Ces compositions fongicides selon l'invention peuvent contenir aussi toute sorte d'autres ingrédients tels que, par exemple, des colloïdes protecteurs, des adhésifs, des épaississants, des agents thixotropes, des agents de pénétration, des stabilisants, des séquestrants, etc.. Plus généralement les inhibiteurs de l'acétohydroxyacide isoméro-réducatse peuvent être combinés à tous les additifs solides ou liquides correspondant aux techniques habituelles de la mise en formulation.
La présente invention a également pour objet des compositions fongicides comprenant un inhibiteur de l'acétohydroxyacide isoméroréductase et un autre composé fongicide. Les mélanges avec d'autres fongicides sont particulièrement avantageux, notamment les mélanges avec l'acibenzolar-S-methyl, l'azoxystrobin, le benalaxyl, le benomyl, la blasticidin-S, le bromuconazole, le captafol, le captane, le carbendazim, la carboxine, le carpropamide, le chlorothalonil, les compositions fongicides à base de cuivre ou de dérivés du cuivre tels que l'hydroxide de cuivre ou l'oxychloride de cuivre, le cyazofamide, le cymoxanil, le cyproconazole, le cyprodinyl, le dichloran, le diclocymet, le dicloran, le diethofencarb, le difenoconazole, le diflumetorim, le dimethomorph, le diniconazole, le discostrobin, le dodemorph, la dodine, l'edifenphos, l'epoxyconazole, l'ethaboxam, l'ethirimol, la famoxadone, la fenamidone, le fenarimol, le fenbuconazole, le fenhexamid, le fenpiclonil, la fenpropidine, le fenpropimorph, la ferimzone, le fluazinam, le fludioxonil, le flumetover, le fluquinconazole, le flusilazole, le flusulfamide, le flutolanil, le flutriafol, le folpet, le furalaxyl, le furametpyr, la guazatine, l'hexaconazole, l'hymexazol, l'imazalil, l'iprobenphos, l'iprodione, l'isoprothiolane, la kasugamycin, le kresoxim-methyl, le mancozeb, le maneb, le mefenoxam, le mepanipyrim, le metalaxyl et ses entiomères tels que le metalaxyl-M, le metconazole, le metiram-zinc, la metominostrobin, l'oxadixyl, le pefurazoate, le penconazole, le pencycuron, l'acide phosporique et ses dérivés tels que le fosetyl-Al, la phthalide, la picoxystrobine, le probenazole, le prochloraz, la procymidone, le propamocarb, le propiconazole, la pyraclostrobin, le pyrimethanil, le pyroquilon, le quinoxyfen, le silthiofam, le simeconazole, la spiroxamine, le tebuconazole, le tetraconazole, le thiabendazole, la thifluzamide, le thiophanate, e.g. thiophanate-methyl, le thiram, le triadimefon, le triadimenol, le tricyclazole, le tridemorph, la trifloxystrobine, le triticonazole, les dérivés de la valinamide tels que par exemple l'iprovalicarb, la vinclozoline, le zineb et le zoxamide. Les mélanges ainsi obtenus ont un spectre d'activité plus large. Les compositions selon l'invention peuvent également comprendre un ou plusieurs insecticides, bactéricides, acaricides ou des phéromones ou d'autres composés ayant une activité biologique.
La présente invention a également pour objet des procédés de fabrication d'une composition fongicide utilisant un inhibiteur de l'acétohydroxyacide isoméroréductase. La présente invention a également pour objet des procédés pour la préparation de composés fongicides comprenant l'identification de composés inhibant l'activité enzymatique de l'acétohydroxyacide isoméroréductase.
La réaction enzymatique est effectuée en présence du composé à tester pour mesurer l'inl ibition de l'activité enzymatique de l'acétohydroxyacide isoméroréductase. Tous les tests biochimiques permettant de mesurer l'activité enzymatique de l'acétohydroxyacide isoméroréductase et donc d'identifier des composés inhibant cette activité enzymatique peuvent être utilisés dans les procédés selon l'invention. Ces tests biochimiques sont bien connus de l'homme du métier (Dumas et al., Biochem.J. 288:865-874, 1992; Dumas et al., Biochem. J. 301 :813-820, 1994; Dumas et al., Febs Letters 408:156-160, 1997, Halgand et al, Biochemistry 37:4773-4781, 1998, Wessel et al., Biochemistry 37:12753-12760, 1998; Halgand et al., Biochemistry 38:6025-6034, 1999).
Les réactions enzymatiques sont avantageusement effectuées en solution dans un tampon approprié. L'utilisation de ce type de milieu réactiomiel permet de faire un grand nombre de réactions en parallèle et donc de tester un grand nombre de composés dans un format microplaque par exemple.
De manière préférée, les procédés d'identification de composés inhibant l'activité enzymatique de l'acétohydroxyacide isoméroréductase comprennent la mise en contact de ces composés avec l'acétohydroxyacide isoméroréductase en présence de magnésium, de NADPH et de substrat; et la mesure de cette activité enzymatique. Avantageusement, dans les procédés selon l'invention, la mesure de l'activité enzymatique comprend la mesure de la décroissance d'absoφtion du NADPH à 340 nm et le substrat utilisé pour la réaction enzymatique est le 2S-2-acétolactate (AL) ou le 2S-2-acéto- 2-hydroxybutyrate (AHB). Il est entendu que toute autre méthode de mesure de l'activité enzymatique connue de l'homme du métier pourra être utilisée dans les procédés selon l'invention.
Toute acétohydroxyacide isoméroréductase peut être utilisée dans les procédés selon l'invention. Les acétohydroxyacide isoméroréductases ont été caractérisées chez plusieurs organismes tels que les plantes, les bactéries, les levures et les champignons. Les gènes correspondants ont été clones permettant de déterminer la séquence protéique de cette enzyme (Dumas et al, Biochem.J. 277:69-475, 1991; Curien et al, Plant Mol. Biol. 21:717-
722, 1993; Dumas et al, Biochem. J. 294:821-828, 1993; Biou et al, EMBO J. 16:3405-
3415, 1997; Dumas et al, Biochemistry 34:6026-6036, 1995; Dumas et al, Accounts of Chemical Research 34:399-408, 2001; Sista et al, Gène, 120:115-118, 1992; Zelenaya- Troitskaya et al., EMBO J. 14:3268-3276, 1995).
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, l'acétohydroxyacide isoméroréductase utilisée dans les procédés selon l'invention est représentée à la SEQ ID No.l, à la SEQ ID No.2, de la SEQ ID No.3 et/ou à la SEQ ID No.5. De préférence, l'acétohydroxyacide isoméroréductase est isolée, purifiée ou partiellement purifiée de son environnement naturel. L'acétohydroxyacide isoméroréductase peut être préparée au moyen de différents procédés. Ces procédés sont notamment la purification à partir de sources naturelles telles que des cellules exprimant naturellement ces polypeptides, la production de polypeptides recombinants par des cellules hôtes appropriées et leur purification ultérieure, la production par synthèse chimique ou, enfin, une combinaison de ces différentes approches. Ces différents procédés de production sont bien connus de l'homme du métier.
Dans un premier mode de réalisation de l'invention, l'acétohydroxyacide isoméroréductase est purifiée à partir d'un organisme produisant naturellement cette enzyme comme par exemple les bactéries telle que E. coli, les levures telles que S. cerevisiae, ou les champignons tels que N.crassa ou M. grisea.
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, l'acétohydroxyacide isoméroréductase est surexprimée dans un organisme hôte recombinant. Les méthodes d'ingénierie des fragments d'ADN et l'expression de polypeptides dans des cellules hôtes sont bien connues de l'homme du métier et ont par exemple été décrites dans "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes 1 et 2, Ausubel F.M. et al , publiés par Greene Publishing Associates et Wiley -Interscience (1989) ou dans Molecular Cloning, T.Maniatis, E.F.Fritsch, J.Sambrook (1982). Préférentiellement, les procédés d'identification de composés inhibant l'activité enzymatique de l'acétohydroxyacide isoméroréductase comprennent l'expression de l'acétohydroxyacide isoméroréductase dans un organisme hôte, la purification de l'acétohydroxyacide isoméroréductase produite par l'organisme hôte, la mise en contact de ces composés avec l'acétohydroxyacide isoméroréductase purifiée en présence de magnésium, de NADPH et de substrat; et la mesure de l'activité enzymatique.
Dans un mode de réalisation préféré, tous ces procédés comprennent une étape supplémentaire dans laquelle on détermine si lesdits composés inhibant l'activité enzymatique de l'acétohydroxyacide isoméroréductase inhibent la croissance et/ou la pathogénie des champignons.
La présente invention concerne donc des procédé pour identifier des composés inhibant la croissance et/ou la pathogénie des champignons en inhibant l'activité enzymatique de l'acétohydroxyacide isoméroréductase. Ces procédés consistant à soumettre un composé, ou un mélange de composés, à un test approprié pour l'identification des composés inhibiteurs de l'acétohydroxyacide isoméroréductase et à sélectionner les composés réagissant de manière positive audit test, le cas échéant à les isoler, puis à les identifier.
De manière préférentielle, le test approprié est un test de l'activité enzymatique de l'acétohydroxyacide isoméroréductase tel que défini ci-dessus. De manière préférée, un composé identifie selon ces procédés est ensuite testé pour ces propriétés anti-fongiques et pour sa capacité à inhiber la pathogénie et/ou la croissance du champignon pour les plantes selon des méthodes connues de l'homme du métier.
Préférentiellement, le composé est évalué à l'aide de tests phénotypiques tels que des essais de pathogénie sur feuilles ou sur plantes entières. Par composé on entend selon l'invention tout composé chimique ou mélange de composés chimiques, y compris les peptides et les protéines.
Par mélange de composés on comprend selon l'invention au moins deux composés différents, comme par exemple les (dia)stéréoisomères d'une molécule, des mélanges d'origine naturelle issus de l'extraction de matériel biologique (plantes, tissus végétaux, culture bactériennes, cultures de levures ou de champignons, insectes, tissus animaux, etc.) ou des mélanges réactionnels non purifiés ou purifiés totalement ou en partie, ou encore des mélanges de produits issus de techniques de chimie combinatoire.
La présente invention concerne enfin de nouveaux composés inhibiteurs de la pathogénie des champignons inhibant l'activité enzymatique de l'acétohydroxyacide isoméroréductase, notamment les composés identifiées par les procédés selon l'invention et/ou les composés dérivés des composés identifiés par les procédés selon l'invention.
De manière préférentielle, les composés inhibiteurs de la pathogénie des champignons inhibant l'activité enzymatique de l'acétohydroxyacide isoméroréductase ne sont pas des inhibiteurs généraux d'enzymes. De manière également préférentielle, les composés selon l'invention ne sont pas des composés déjà connus pour avoir une activité fongicide et/ou une activité sur la pathogénie des champignons.
L'invention a également pour objet un procédé pour traiter des plantes contre un champignon phytopathogène caractérisé en ce qu'il comprend le traitement desdites plantes avec un composé identifié par un procédé selon l'invention.
La présente invention concerne également un procédé de préparation d'un composé inhibiteur de la pathogénie des champignons, ledit procédé comprenant les étapes d'identification d'un composé inhibant la pathogénie des champignons inhibant l'activité enzymatique de l'acétohydroxyacide isoméroréductase par le procédé d'identification selon l'invention, puis de préparation dudit composé identifié par les méthodes usuelles de synthèse chimique, de synthèse enzymatique et/ou d'extraction de matériel biologique.
L'étape de préparation du composé peut être précédée le cas échéant par une étape dite d'optimisation par laquelle on identifie un composé dérivé du composé identifié par le procédé d'identification selon l'invention, ledit composé dérivé étant ensuite préparé par les méthodes usuelles.
Description des figures
Figure 1: Comparaison des séquences protéiques des isoméroréductases de M. grisea, N.crassa et de la levure S. cerevisiae. Alignementdes séquences à l'aide du logiciel CLUSTAL W(1.4). .: acide aminé similaire.
*: acide aminé identique.
Figure 2: Test de croissance de M. grisea en présence de l'inhibiteur N-hydroxy-N- isopropyloxamate (IpOHA) et sous différentes conditions de culture.
L'effet de l'inhibiteur IpOHA est testé sur le champignon pathogène M. grisea en suivant l'évolution de la croissance de ce champignon en présence de différentes concentrations en inhibiteur, dans différents milieux de culture et sur une période de 7 jours.
200 μl de milieu de culture, milieu minimum (MM) ou milieu minimum + leucine, valine et isoleucine à 0.3 mM (MM + ILV), est inoculé avec une suspension de spores de la souche
PI .2 de M grisea à une concentration finale de 105 spores / ml. La microplaque est incubée à température ambiante et la densité optique à 630 nm(DO63o) est mesurée aux jours O, 3,
4, 5, 6 et 7 (JO, J3, J4, J5, J6 et J7). La densité optique permet une mesure de la croissance mycélienne.
Figure 3: Influence de la concentration en NADPH sur l'activité enzymatique de l'isoméroréductase de levure. Les mesures d'activité enzymatique sont réalisées à 25°C dans
1 ml de milieu réactionnel suivant : MgCk 10 mM, NADPH de 0 à 175 μM, AHB 0.48 mM et dans le tampon Hépès de sodium50 mM, pH 7.5 .La courbe est ajustée au modèle de
Michaelis Menten. Le KM pour le NADPH est de 1.6 μM.
Figure 4: Influence de la concentration en substrat AHB [A] et AL [B] sur l'activité enzymatique de l'isoméroréductase de levure. Les mesures d'activité enzymatique sont réalisées à 25°C dans le milieu réactionnel suivant : MgCh 10 mM, NADPH 250 μM et dansl ml de tampon Hépès de sodium 50 mM, pH 7.5 et en présence d'AHB [A] et d'AL
[B]. Les courbes sont ajustées au modèle de Michaelis Menten.
A Le KM pour l'AHB est de 104 μM. B Le KM pour l' AL est de 266 μM.
Figure 5: Influence de la concentration en magnésium sur l'activité enzymatique de l'isoméroréductase de levure. Les mesures d'activité enzymatique sont réalisées à 25 °C dans 1 ml de milieu réactionnel suivant : MgCte de 0 à 40 mM, NADPH 250 μM, AHB 0.48 mM et dans le tampon Hépès de sodium 50 mM, pH 7.5 . La courbe est ajustée au modèle de Michaelis Menten. Le KM pour le Mg2+ est de 968 μM. Figure 6: Stoechiométrie de fixation des inhibiteurs Diméthylphosphinoyl-2-hydroxyacétate et N-hydroxy-N-isopropyloxamate sur l'isoméroréductase de levure. Les inhibiteurs Hoe 704 [A] et IpOHA [B] (0.1 nmoles) sont incubés avec des quantités variables d'enzyme (0 à 0.4 nmoles) pendant 20 minutes à 25°C avec 25 nmoles de NADPH et 0.25 μmoles de Mg2+ dans un volume de 10 μl. Les mesures d'activité enzymatique sont réalisées à 25°C dans 1 ml de milieu réactionnel suivant : MgCh 10 mM, NADPH 250 μM, AHB 0.48 mM et dans le tampon Hépès de sodium 50 mM, pH 7.5.
Figure 7: Cinétiques d'inhibition de l'isoméroréductase de levure en présence des inhibiteurs diméthylphosphinoyl-2-hydroxyacétate [A] et N-hydroxy-N-isopropyloxamate [B]. Les mesures d'activité enzymatique sont réalisées à 25°C dans 1 ml de milieu réactionnel suivant : MgC 10 mM, NADPH 250 μM , AHB 0.48 mM dans le tampon Hépès de sodium 50 mM, pH 7.5 et en présence d 'enzyme à 110 nM. Les réactions sont initiées en ajoutant simultanément des quantités variables d'inhibiteurs diméthylphosphinoyl-2-hydroxyacétate [A] et N-hydroxy-N-isopropyloxamate [B] (de 2 μM à 30 μM) dans le milieu réactionnel. Les courbes sont tracées suivant l'équation (1), ce qui permet la détermination des valeurs de K0bs, vitesse apparente de formation du complexe enzyme-inhibiteur.
Figure 8: Cinétiques d'inhibition de l'isoméroréductase de levure en présence des inhibiteurs diméthylphosphinoyl-2-hydroxyacétate [A] et N-hydroxy-N-isopropyloxamate
[B]. Les mesures d'activité enzymatique sont réalisées à 25°C dans 1 ml de milieu réactionnel suivant : MgCk 10 mM ; NADPH 250 μM ; AHB 0.48 mM dans le tampon Hépès de sodium50 mM, pH 7.5 et en présence d 'enzyme à 110 nM.
Les réactions sont initiées en ajoutant simultanément des quantités variables d'inhibiteurs [A] et [B] (de 2 μM à 50 μM) dans le milieu réactionnel.
Figure 9: Détermination de la constante d'association k0 du diméthylphosphinoyl-2- hydroxyacétate [A] et du N-hydroxy-N-isopropyloxamate [B] sur l'isoméroréductase de levure grâce à la représentation 1/Kobs en fonction de la concentration en substrat AHB. Les mesures d'activité enzymatique sont réalisées à 25°C dans 1 ml de milieu réactiom el suivant : MgCh 10 mM, NADPH 250 μM, AHB de 125μM à 2.375mM et dans le tampon Hépès de sodium 50 mM, pH 7.5 et en présence d 'enzyme à 110 nM. Les réactions sont initiées en ajoutant simultanément des quantités variables de substrat AHB (de 125μM à 2.375mM) et les inhibiteurs [A] (10 μM) et [B] (15 μM) dans le milieu réactionnel.
Les courbes sont tracées suivant l'équation (3), ce qui permet la détermination des valeurs de k0, vitesse d'association de l'inhibiteur à l'enzyme.
Exemples
Exemple 1: Clonage du gène ILV5 de Magnaporthe srisea
Un fragment interne du gène ILV5 de M. grisea a été amplifié par PCR à partir de TADN génomique de ce champignon grâce à des couples d'amorces dégénérées correspondant à des domaines protéiques conservés entre les isoméroréductases de champignons. Le produit de PCR obtenu a ensuite été clone dans le plasmide pGEM-T-Easy (Promega), séquence et amplifié par PCR avec un nouveau couple d'amorces. Ce dernier produit de PCR a été utilisé comme sonde homologue pour cribler une banque d'ADN cosmidique de M. grisea. La séquence du gène ILV5 de M. grisea a alors été réalisée à partir d'un des clones positifs et d'oligonucléotides dérivés de la séquence du produit de PCR déjà obtenu.
1.1. Isolement d'un fragment interne du gène ILV5 de M. grisea par amplification à l'aide d'oligonucléotides dégénérés
1.1.1 Choix des oligonucléotides dégénérés
L'amplification d'un fragment interne du gène ILV5 de M. grisea a été réalisée par PCR à l'aide d'oligonucléotides dégénérés. Ces oligonucléotides dégénérés ont été choisis à partir de la comparaison des séquences protéiques des isoméroréductases de N. crassa et de S. cerevisiae. Cette comparaison a permis de mettre en évidence 4 domaines conservés entre ces deux séquences d' isoméroréductases fongiques, qui devraient être présents dans l'isoméroréductase de M. grisea. Ces 4 domaines conservés sont constitués d'une succession d'au moins 7 acides aminés conservés. La séquence des oligonucléotides dégénérés a été déterminée à partir de celle des acides aminés des domaines conservés traduits d'après le code génétique. Afin que le degré de dégénérescence (nombre de codons pour un acide aminé donné) soit le plus faible possible, les acides aminés tels que l'arginine, la leucine, la serine sont à éviter car six codons leur correspondent. Les acides aminés méthionine et tryptophane sont quant à eux recherchés, puisqu'un seul codon leur correspond. Le degré de dégénérescence doit aussi être faible à l'extrémité 3' de l'oligonucléotide, afin d'augmenter la spécificité de l'amplification. Nous avons pu définir 4 oligonucléotides : les oligonucléotides 1(+) et 3(+) sur le brin (+) ; et les oligonucléotides 2(-) et 4(-) sur le brin (-) de l'ADN de M. grisea. Ainsi, l'amplification PCR peut être effectuée avec quatre couples différents d'oligonucléotides dégénérés : 1(+) et 2(-) ; 1(+) et 4(-) ; 3(+) et 2(-) ; 3(+) et 4(-). 1.1.2. Amplification d'un fragment interne du gène ILV5 de M. grisea à l'aide d'oligonucléotides dégénérés
Les conditions optimales d'amplification du gène ILV5 de M. grisea ont été déterminées en faisant varier le couple d'amorces et leur température d'hybridation. Les 3 premiers cycles d'amplification ont été effectués à une température d'hybridation variable (42°C, 50°C ou 55°C), alors que la température d'hybridation des autres cycles est de 55°C. Des contrôles positifs ont été réalisés avec l'ADN génomique de N. crassa et de S. cerevisiae dans les mêmes conditions que pour l'ADΝ génomique de M. grisea. A une température d'hybridation de 42°C, les fragments d'ADN de S. cerevisiae ont été amplifiés à la taille attendue soit 590 pb, 610 pb, 440 pb et 470 pb avec les couples d'amorces (1-4), (1-2), (3-4) et (3-2), respectivement. Les profils d'amplification de l'ADN génomique de S. cerevisiae avec les couples d'amorces (1-4) et (3-2) sont cependant complexes. Pour une température d'hybridation de 50°C, des fragments d'ADN de N. crassa ont été amplifiés à la taille attendue soit 660 pb, 685 pb, 523 pb et 544 pb avec les couples d'amorces (1-4), (1- 2), (3-4) et (3-2), respectivement, bien que les profils d'amplification avec les couples d'amorces (1-4) et (3-4) soient complexes. Les différents couples d'oligonucléotides dégénérés ont permis d'amplifier à partir de l'ADΝ génomique de levure et de N. crassa un fragment de taille attendue. Ces oligonucléotides dégénérés ont donc pu être utilisés pour amplifier le gène ILV5 de M. grisea. La quantité d'oligonucléotides utilisés, testée à une température d'hybridation de 42°C, ne semble pas avoir d'influence sur l'amplification de l' ADN génomique de M. grisea. A une température d'hybridation des premiers cycles de PCR de 42°C, les profils d'amplification de l'ADN génomique de M. grisea, obtenus avec les différents couples d'amorces sont assez complexes. A une température d'hybridation de 50°C, une simplification des profils d'amplification de l'ADN génomique de M. grisea a été observée pour la plupart des couples d'amorces ; en particulier pour le couple d'amorces (1 - 2) qui permet d'amplifier un seul fragment d'ADN à la taille attendue (685 pb). Une température d'hybridation des premiers cycles de PCR de 55°C ne permet pas d'augmenter la spécificité de l'amplification avec les couples d'amorces (1-2) et (3-2) et réduit son rendement. Les meilleures conditions d'amplification à partir de l'ADN génomique de M. grisea ont donc été obtenues à une température d'hybridation des amorces des premiers cycles de PCR de 50°C, avec le couple d'oligonucléotides (1-2). 1.1.3. Clonage d'un fragment interne du gène ILV5 de M. grisea amplifié par PCR dans le plasmide pGEM-T-easy
Le fragment interne du gène ILV5 de M. grisea a été amplifié par PCR à partir de l'ADN génomique de M. grisea, avec le couple d'amorces (1-2), à une température d'hybridation des amorces de 50°C pendant 3 cycles , puis 55°C pour les autres cycles d'amplification. Ce produit de PCR, d'environ 680 pb, est purifié après séparation par électrophorèse sur gel d'agarose puis clone dans le plasmide pGEM-T-easy. Les colonies bactériennes obtenues après transformation et grâce à un système de sélection blanc/bleu (X-Gal) montraient trois phénotypes différents: blanches, bleues et blanches avec le centre de la colonie bleu (nommées colonies blanc/bleu). 30 colonies de différents phénotypes ont été analysées par PCR en utilisant les amorces universelles Sp6 et T7 qui s'hybrident de part et d'autre du site de clonage du plasmide pGEM-T-easy. Les 20 colonies blanches et les 10 colonies blanc/bleu sont positives. En effet, à partir de ces colonies, un fragment d'ADN a été amplifié à la taille attendue (810 pb) qui correspond à la taille de l'insert (680 pb) additionné de la distance séparant l'insert de chacune des amorces Sp6 et T7 (129 pb). Deux clones de phénotypes différents, blanc et blanc/bleu, ont alors été choisis afin d'être séquences. Ce sont les clones n°4 (blanc) et n°20 (blanc/bleu). 1.1.4. Analyse de la séquence du fragment interne du gène ILV5 de M. grisea clone
La comparaison des séquences nucléotidiques des deux clones n°4 et n°20 a montré qu'ils correspondent à un même fragment d'ADN clone dans des orientations différentes dans le plasmide pGEM-T-easy, ce qui pourrait expliquer leur différence phénotypique (blanc et blanc/bleu). La séquence nucléotidique double brin de ce fragment clone a ainsi été obtenue. L'homologie de cette séquence nucléotidique avec celles codant pour des protéines connues a été recherchée grâce au programme Blastx de NCBI (National Center for Biotechnology Information). Ce programme compare les séquences traduites des six phases de lecture d'une séquence nucléotidique à l'ensemble des séquences protéiques contenues dans les bases de données. Une homologie significative entre la séquence nucléotidique du fragment clone et la séquence protéique de l'isoméroréductase de N. crassa (erreur de e- 102) a été identifiée. Le pourcentage d'identité en acides aminés au sein de région définie par le logiciel pour comparer ces deux séquences est de 94 %. Le fragment clone dans le plasmide pGEM-T-easy correspond donc au fragment interne du gène ILV5 de M. grisea. Bien que la séquence du fragment interne du gène ILV5 de M. grisea et celle du gène ILV5 de N. crassa présentent une forte homologie, une différence au centre de la séquence du gène ILV5 de M. grisea existe. Cette différence pourrait correspondre à la présence d'un intron au sein de la séquence de M. grisea, puisqu'un intron de 77 pb existe chez N. crassa à cette position. La position et la séquence de cet intron ont été recherchées. Un motif consensus d'épissage en 5' a été identifié dans la séquence nucléotidique du fragment interne du gène ILV5 de M. grisea, ainsi qu'un motif consensus d'épissage en 3 ' et une séquence lariat. L' intron putatif (86 pb) du fragment interne du gène ILV5 de M. grisea a donc été identifié. L'épissage de l'intron de la séquence du fragment interne du gène ILV5 de M. grisea permet d'obtenir un fragment d'ADΝc " théorique ". Le fragment de la séquence protéique de l'isoméroérductase de M. grisea alors déduit de cet ADΝc " théorique ", a été comparé avec celle de l'isoméroréductase de N. crassa, montrant une très forte identité entre les séquences primaires de ces deux enzymes (figure 1). 1.2. Criblage d'une banque cosmidique de M. grisea avec une sonde du gène ILV5 de
M. grisea
1.2.1. Construction de la sonde homologue du gène ILV5 de M. grisea
Un fragment interne du gène ILV5 de M. grisea a été amplifié par PCR, à partir du clone n°4, à l'aide des amorces 13U et 549L définies à partir de la séquence du gène ILV5 clone dans le plasmide pGEM-T-easy. Ce fragment, après purification sur gel d'agarose, a été utilisé comme matrice pour réaliser une sonde du gène ILV5 marquée.
1.2.2. Criblage de la banque cosmidique Guyll de M. grisea par PCR à l'aide d'amorces spécifiques du gène ILV5 de M. grisea La banque cosmidique Guyl 1 est représentée sous forme de 28 pools de 96 minipréparations d'ADN correspondant aux 96 cosmides différents présents dans une plaque 96 puits (2688 clones). Le gène ILV5 de M. grisea a été recherché dans cette banque cosmidique en réalisant une amplification PCR sur ces pools de minipréparations d'ADN à l'aide des amorces 300U et 549L définies à partir de la séquence connue du gène ILV5. Un fragment de taille attendue (249 pb) a été amplifié à partir des pools n°17 ; 19 ; 20 ; 21 ; 27 ; 28 et 29. La recherche du gène ILV5 a été poursuivie en hybridant avec la sonde du gène ILV5 les cosmides des plaques n°17 ; 19 ; 20 ; 21 ; 27 ; 28 et 29.
1.2.3. Criblage de la banque cosmidique Guyll de grisea par hybridation avec la sonde homologue du gène ILV5 de M. grisea Les colonies bactériennes issues des plaques n°17 ; 19 ; 20 ; 21 ; 27 ; 28 et 29 ont été répliquées sur membranes de Nylon et hybridées avec la sonde du gène ILV5 de M. grisea. Cette hybridation a permis de sélectionner les cosmides G6 et A7 des plaques n°20 et 27, respectivement et les cosmides B5 et B6 de la plaque n°29.
1.2.4. Caractérisation du gène IL V5 de grisea à partir du cosmide 20/G6 a) Séquençage du gène ILV5 de M.grisea à partir du cosmide 20/G6
Le séquençage du gène ILV5 a été effectué par étapes. La première réaction de séquence a été réalisée à l'aide d'amorces divergentes choisies à partir de la séquence connue du fragment interne du gène ILV5 de M. grisea obtenu par PCR. A partir de cette nouvelle séquence du gène ILV5, de nouvelles amorces ont été définies pour réaliser d'autres réactions de séquence et ceci jusqu'à ce que le gène ILV5 de M. grisea ait été entièrement séquence. Les séquences traduites à partir la séquence nucléotidique entière du gène ILV5 selon les 6 phases de lecture sont comparées avec la séquence protéique de l'isoméroréductase de N. crassa, afin de repérer la position de l' ATG initiateur de la traduction, du codon STOP de terminaison de la traduction, et des différents introns possibles. Ainsi, l' ATG initiateur de la traduction a été identifiée sur la séquence nucléotidique du gène ILV5 et sert de référence (+1) à partir de laquelle les autres éléments de la séquence sont positionnés. Trois mirons putatifs ont été repérés dans la séquence nucléotidique du gène ILV5 de M. grisea. Le premier intron serait localisé entre les positions (en pb) 199 et 280, le deuxième intron en position 314-390 et le troisième intron serait situé entre les positions 670 et 755 du gène ILV5 de M. grisea. Le codon STOP de terminaison de la traduction serait en position 1449 de la séquence du gène ILV5 de M. grisea. L'isolement de l'ADNc du gène ILV5 de M. grisea a été entrepris, afin de vérifier la position des introns suspectés par la comparaison des séquences protéiques de M. grisea et de N. crassa. b) Isolement de l'ADΝc du gène ILV5 de M.grisea et recherche des introns du gène de M.grisea
L'ADΝc du gène ILV5 de M. grisea a été isolé en réalisant une amplification PCR à partir d'une banque d'ADΝc de l'isolât PI.2 (ARΝ de mycélium cultivé en milieu complet) à l'aide des oligonucléotides définis à partir de la séquence du gène ILV5 : les oligonucléotides 22U et 1603L. L'oligonucléotide 22U est situé avant l'ATG initiateur de la traduction et l'oligonucléotide 1603L est situé 93 pb après le codon STOP de terminaison de la traduction. Deux fragments sont amplifiés avec ce couple d'amorces : un fragment de taille inférieure à 500 pb et un fragment amplifié à la taille attendue soit 1.6 kb. Le fragment amplifié à la taille attendue est purifié après séparation par électrophorèse sur gel d'agarose et clone dans le plasmide pGEM-T-easy. Les 24 colonies bactériennes obtenues après transformation sont analysées par PCR à l'aide du couple d'amorces 22U et 1603L. Ces 24 clones possèdent l'ADΝc du gène ILV5 de M. grisea, car un fragment d'ADN a en effet été amplifié à la taille attendue (1.6 kb). Le clone n°18 a été choisi afin d'être séquence à l'aide des amorces universelles Sp6 et T7. La comparaison de la séquence nucléotidique de l'ADNc et du gène ILV5 nous a permis de déterminer la position exacte des introns. Les trois introns sont localisés aux positions prédites par la comparaison des séquences protéiques des isoméroréductases de N. crassa et des traductions du gène ILV5 de M. grisea. Chez N. crassa, le gène ILV5 possède 4 introns positionnés différemment et de longueurs différentes par rapport au gène IL V5 de M. grisea. c) Séquence protéique de l'isoméroréductase de M.grisea déduite de l'ensemble des données acquises sur le gène I V5 de M.grisea
La séquence protéique du gène ILV5 de M. grisea a été déduite de la séquence de T ADΝc de ce gène. La comparaison des séquences protéiques des isoméroréductases de M. grisea, de N. crassa et de S. cerevisiae montre une très forte identité entre les isoméroréductases de ces trois espèces. En effet, le pourcentage d'identité entre les séquences des isoméroréductases de M. grisea et de N. crassa est de 86 %. Celui entre les isoméroréductases de M. grisea et de levure est de 70 % et celui entre les isoméroréductases de N. crassa et de levure est de 72 % (figure 1). N. crassa et M. grisea sont des espèces fongiques très proches (pyrenomycètes), ce qui pourrait expliquer le pourcentage d'identité élevé entre les isoméroréductases de ces deux espèces. d) Etude de l'expression de l'isoméroréductase de M.grisea chez ce champignon soumis à différentes conditions de stress Les ARΝ totaux de M. grisea provenant de mycélium soumis à différentes conditions de stress ont été extraits puis transférés sur membrane avant d'être hybrides avec la sonde homologue du gène ILV5 de M. grisea. Le gène ILV5 est exprimé de façon constitutive. Il est ainsi exprimé au même niveau lors d'un stress hyperosmotique ou d'une carence nutritionnelle azotée ou d'une induction par l'AMPc, d'un choc thermique ou d'un stress oxydatif. Il n'est cependant pas exprimé lors d'une carence nutritionnelle carbonée.
Exemple 2: Disruption du gène ILV5 de Magnaporthe grisea
Après l'isolement et la caractérisation du gène ILV5, l'objectif était d'obtenir des mutants du gène ILV5 de M. grisea pour tester leur pouvoir pathogène. La technique utilisée pour disrupter le gène ILV5 est la mutagenèse insertionnelle par transposition in vitro. 2.1. Sous-clonage du gène ILV5 de M. grisea dans le plasmide pBC SK +
Le sous-clonage du gène ILV5 est réalisé dans le plasmide pBC SK + avant la mutagenèse insertionnelle par transposon. Le cosmide 20/G6 contenant le gène ILV5 est porteur d'un gène de résistance à l'ampicilline, il ne peut donc pas être utilisé directement comme cible pour la mutagenèse insertionnelle. En effet, une double sélection par la kanamycine et l'ampicilline ne serait pas assez sélectifs des plasmides cibles ayant intégré le transposon, car le plasmide donneur de transposon (pGPS3 Hygro ) est également résistant à la kanamycine et à l'ampicilline. Le gène ILV5 a donc été sous-cloné dans un plasmide porteur d'un gène de résistance au chloramphénicol, le plasmide pBC SK+. Les clones ayant intégré le transposon au niveau du plasmide cible (pBC SK+ porteur du gène IL V5) pourront être sélectionnés pour leur double résistance à la kanamycine et au chloramphénicol. De plus, la taille de l'insert cosmidique est trop importante (40 kb). Nous avons choisi un fragment d'environ 15 kb contenant le gène ILV5 sous-cloné dans le plasmide pBC SK+. En effet, la probabilité que le transposon s'intègre dans le gène ILV5 est plus importante lorsque la taille du fragment portant le gène ILV5 est réduite. La longueur du gène ILV5 est d'environ 3 kb, la probabilité que le transposon s'intègre dans le gène présent au niveau du cosmide (46 kb) est de 6.5 %, alors que la probabilité d'intégration du transposon dans le gène ILV5 sous-cloné dans le plasmide pBC SK+ (18 kb) est environ 3 fois plus élevée, soit environ 17 %. Le sous-clonage du fragment d'ADN génomique portant le gène ILV5 a été réalisé en positionnant ce gène au centre de l'insert. Ce type de construction facilite l'intégration du gène ILV5 muté dans le génome de M. grisea par recombinaison homologue. La cartographie de la région du cosmide 20/G6 portant ILV5 a permis de choisir un fragment Clal-Clal de 15 kb dans lequel le gène ILV5 est relativement bien centré. En effet, le gène ILV5 est encadré en 5' par 5 kb de la séquence génomique et en 3' par 5.5 kb. Après digestion du cosmide 20/G6 par Clal, le fragment de 15 kb contenant le gène ILV5 a été purifié après séparation sur gel d'agarose et sous clone dans le plasmide pBC SK +. 24 colonies obtenues après transformation ont été analysées par PCR à l'aide du couple d'amorces 22U et 1603L spécifiques du gène ILV5. Les 5 clones amplifient un fragment à la taille attendue (1.6 kb) possèdent le gène ILV5. Le clone n°19 a été choisi pour réaliser la mutagenèse insertionnelle par transposition in vitro du gène IL V5. 2.2. Mutagenèse insertionnelle par transposition in vitro du gène ILV5 de M. grisea
La mutagenèse insertionnelle par transposition in vitro du gène ILV5 de M. grisea a été réalisée avec le kit GPST (New England Biolabs) à partir du clone n°19. Le plasmide pGPS3 Hygro , qui porte un gène de résistance à la kanamycine et à l'hygromycine au niveau du transprimer, est utilisé comme donneur de transposon. Le plasmide pBC SK +, porteur du gène ILV5 et du gène de résistance au chloramphénicol, correspond au plasmide cible. Une fois la mutagenèse insertionnelle réalisée, des bactéries DH5 thermocompétentes ou des bactéries DH10B électrocompétentes sont transformées avec le " mélange de mutagenèse ". Après transformation, les clones bactériens possédant une intégration du transposon au niveau du plasmide cible pBC SK + sont sélectionnés grâce à leur résistance à la fois à la kanamycine et au chloramphénicol. Cette double résistance pourrait également être conférée aux clones bactériens possédant à la fois le plasmide cible et le plasmide donneur intacts. Une destruction du plasmide donneur par digestion avec l'enzyme Pl-Scel permet de palier à ce problème. Afin de déterminer si le transposon s'est intégré au niveau du gène ILV5 de M. grisea, les clones bactériens sélectionnés sont analysés par PCR à l'aide du couple d'amorces 22U et 1603L, situées de part et d'autre de la région codante du gène ILV5. En effet, lorsque le transposon Tn7 s'insère au niveau du gène ILV5, il n'y a pas d'amplification avec le couple d'amorces 22U et 1603L puisque la taille du fragment d'ADN situé entre ces 2 amorces est trop élevée pour être amplifiée (4.3 kb). Cette taille correspond à la somme de la taille de la région codante du gène ILV5 de M. grisea (1.6 kb) et du transposon Tn7 de 2.7 kb. Après transformation des cellules DH5 thermocompétentes, une absence d'amplification a été observée pour 4 colonies (clones n°3 ; 4 ; 8 ; 18) sur 32 colonies testées (12.5 %). Ces clones bactériens possèdent donc une insertion du transprimer au niveau du gène ILV5. Après transformation des cellules DH10B électrocompétentes, sur 38 colonies testées par PCR, une seule (2.6 %) présente une absence d'amplification (clone n°29). Les clones bactériens n°3 ; 8 ; 18 et 29 ont été séquences à l'aide d'amorces divergentes Tn7L et Tn7R situées à chaque extrémité du transposon, afin de localiser la position exacte du site d'insertion du transposon Tn7 au sein de la séquence du gène ILV5. Le transposon s'est intégré 21 pb avant l'ATG pour le clone n°18, 9 pb après l'ATG pour le clone n°8, 809 pb après l'ATG pour le clone n°3 et 1176 pb après l'ATG pour le clone n°29. Nous avons choisi le clone n°8 pour la transformation de M. grisea. En effet, chez ce clone, le transposon s'est intégré au début de la région codante du gène ILV5 de M grisea (+ 9 pb après l'ATG), entraînant une inactivation du gène ILV5.
2.3.Transformation de la souche P1.2 de M. grisea par le gène ILV5 de M. grisea disrupté dans sa région codante
L'insert du clone n°8 contenant le gène ILV5 de M. grisea disrupté dans sa région codante (9 pb après l'ATG) est ressorti du plasmide par une digestion avec l'enzyme CM et purifié sur gel d'agarose. Il correspond à la construction linéarisée. Le plasmide pBC SK + provenant du clone n°8 non digéré correspond à la construction " circulaire ". La transformation des protoplastes de la souche PI.2. de M. grisea est réalisée soit avec 5 μg de la construction linéarisée, soit avec 4 μg de la construction " circulaire ". Le témoin positif de transformation est réalisé en utilisant 3 μg de plasmide pCB1003 porteur d'un gène de résistance à l'hygromycine et le témoin négatif est réalisé sans ADN. 62 transformants sont obtenus pour la construction linéarisée et 24 pour la construction " circulaire ". Ces 86 transformants ont été repiqués sur milieu complet supplémenté en hygromycine à 120 mg/1 et sur milieu minimum supplémenté en hygromycine à 120 mg/1 ou à 60 mg/1. Ce type de repiquage permet d'identifier les transformants ilv5~ qui sont auxotrophes pour la leucine, la valine et l'isoleucine et par conséquent qui ne poussent pas sur milieu minimum. 8 transformants seraient auxotrophes sur les 62 (13 %) obtenus avec la construction linéarisée, alors que 2 transformants sur 24 (8.3 %) le seraient avec la construction " circulaire ". La meilleure efficacité d'obtention de mutants ilv5" avec la construction linéarisée par rapport à la construction " circulaire " pourrait s'expliquer par le fait que la recombinaison homologue est facilitée avec une construction linéarisée. Ces transformants sont repiqués sur milieu " farine de riz " afin de les faire sporuler, puis les spores sont étalées sur milieu complet TNKYE glucose et mises à germer afin de réaliser un isolement monospore. Les monospores sont repiquées sur milieu TNKYE glucose supplémenté en hygromycine à 120 mg/1 afin de purifier les transformants. Une identification des transformants auxotrophes est réalisée en effectuant des repiquages de ces colonies issues de ces monospores sur milieu minimum, sur milieu minimum supplémenté en leucine, en valine et en isoleucine à 0.3 mM et sur milieu complet TNKYE glucose. Ainsi, des transformants génétiquement purifiés et stables ont été obtenus. Sur 10 transformants potentiels auxotrophes pour la leucine, la valine et l'isoleucine, 8 (80 %) se sont révélés effectivement auxotrophes. Les 2 transformants non auxotrophes devaient correspondre à un mélange de populations génétiquement différentes (ilv5 et ilv5 ") qui a évolué vers une majorité d' ilv5 lors de la croissance du transformant sur milieu non sélectif avant purification monospore.
Exemple 3: Caractérisation phénot pique des transformants ilv5~ de Magnaporthe grisea auxotrophes pour la leucine, la valine et l'isoleucine et étude de leur pouvoir pathogène 3.1. Effet de la disruption du gène ILV5 sur la croissance et le développement des transformants de M.grisea Le développement des transformants ilv5" a été testé sur différents milieux de culture. Ainsi, sur milieu minimum nitrate, les transformants ilv5" sont incapables de pousser, alors que leur croissance est possible sur milieu minimum supplémenté en valine, leucine et isoleucine à 0.3 mM. Le développement des transformants ilv5" sur milieu minimum + valine, leucine et isoleucine à 0.3 mM est cependant différent de celui de la souche sauvage PI.2 de M grisea. Leur croissance est en effet ralentie et leur mycélium est gris-vert, ras et sporulant et non pas aérien comme pour la souche sauvage. La présence de leucine n'est pas nécessaire à la croissance des transformants ilv5", puisque les résultats obtenus sur milieu minimum supplémenté en isoleucine et valine à 0.3 mM sont identiques à ceux obtenus sur milieu minimum supplémenté en leucine, valine et isoleucine à 0.3 mM. Le développement des transformants ilv5" sur milieu minimum supplémenté en valine et isoleucine à 0.3 mM peut être amélioré en supplémentant le milieu minimum avec une concentration finale en valine et en isoleucine de 1 mM. Sur milieu complet, les transformants ilv5" présentent un phénotype peu différent de la souche sauvage : leur mycélium est gris-blanc plus ou moins aérien (moins aérien que la souche sauvage). L'ajout de panthotéine, forme oxydée du panthoténate qui intervient dans la biosynthèse de la leucine, à 1 mg/1 au milieu minimum + valine et isoleucine à 0.3 mM n'améliore pas le développement des transformants ilv5". La sporulation des transformants ilv5" est plus lente et dix fois moins importante sur milieu gélose "farine de riz" par rapport à la souche sauvage. La sporulation des transformants ilv5" est presque identique à la souche sauvage lorsque la valine et l'isoleucine sont ajoutées au milieu gélose "farine de riz" à une concentration finale de 1 mM.
3.2. Tests du pouvoir pathogène des mutants auxotrophes ilv5" sur feuilles d'orge découpées en survie Les tests du pouvoir pathogène des transformants ilv5" de M. grisea ont été réalisés en badigeonnant ou en déposant des gouttes de suspension de spores des transformants à tester sur des feuilles d'orge découpées. Une inoculation est réalisée à l'aide d'un coton tige humide trempé dans une suspension de spores (3.10^ spores/ml en général) et utilisé pour badigeonner les fragments de feuilles d'orge en survie (sur milieu eau gélosée 1 %, kinétine 2 mg/1). L'autre type d'inoculation consiste à déposer des gouttes de 30 μl en trois endroits différents de la surface des feuilles d'orge. Les symptômes sont observés après 5 à 9 jours d'incubation à 26°C.
Les lésions provoquées par ces mutants sont de taille plus réduite que pour la souche sauvage et leur nombre est réduit de 75 % (voir tableau 1 ci-dessous). Tableau 1: Test du pouvoir pathogène des transformants ilv5- sur feuilles d'orge en survie
Nombre de lésions provoquées par les transformants de M.grisea sur feuilles d'orge ou en test en badigeon, 5 jours après inoculation ( L41 et L21) et 7 jours après innoculation (L57,
L64, L71, L85).
A) Suspension de spores des transformants préparés à 3.104 spores.ml"1
Figure imgf000024_0001
B) Suspension de spores des transformants préparés à 10 S spores.ml i-l
Figure imgf000024_0002
Les lésions provoquées par les mutants ilv5" sont en outre atypiques et leur apparition plus tardive. Elles apparaissent après 6 à 9 jours d'incubation à 26 °C, contre 4 à 9 jours pour la souche sauvage (voir tableau 2 ci-dessous). Certaines lésions provoquées par les transformants ilv5" apparaissent aux extrémités des feuilles d'orge (tableau 2). Des blessures au niveau des extrémités des feuilles pourraient expliquer ces lésions, car elles pourraient faciliter la pénétration du champignon. Des tests du pouvoir pathogène sur plante entière ont par conséquent été réalisés, afin d'une part de confirmer l'existence d'une réduction du pouvoir pathogène des transformants ilv5" et d'autre part d'estimer la réduction de la pathogénie des mutants ilv5" et l'importance des blessures pour la pénétration du champignon ilv5".
Tableau 2: Evolution des symptômes provoqués par les transformants de M.grisea sur feuilles d'orge en survie
Figure imgf000025_0001
3.3. Tests du pouvoir pathogène des mutants auxotrophes ilv5- sur plante entière
Les tests du pouvoir pathogène des transformants ilv5" ont été réalisés en pulvérisant une suspension de spores (10 et 3.10 spores.ml" ) de ces transformants sur des plants d'orge. De la gélatine à une concentration finale 0.5 % (p/v) est ajoutée à cette suspension de spores pour permettre une meilleure adhésion des spores à la surface des feuilles. Les plantes sont placées une nuit en chambre humide après l'inoculation. Les symptômes sont observés généralement après 5 à 10 jours d'incubation à température ambiante pour l'orge.
Une réduction notable des symptômes de la pyriculariose sur orge est observée chez les transformants ilv5" par rapport au transformant ilv5 . Après 10 jours d'incubation à température ambiante, le nombre de lésions par feuille (d'environ 12 cm) varie de 6 à 9 pour les transformants ilv5' (L87, L74 et C24) contre 37 en moyenne pour le transformant L57 ilv5 (voir tableau 3). Le nombre de lésions provoquées par les mutants ilv5" est donc réduit de 80 % par rapport à celui obtenu avec la souche sauvage. De plus, la taille des lésions est deux fois plus petite pour les mutants ilv5" que pour le transformant ilv5 (6 mm2 contre 13 mm2), et ces lésions apparaissent deux fois plus lentement. En effet, le nombre de lésions a doublé pour les mutants ilv5" entre le 5ème et le 10 ème jour d'expérience, alors qu'il est resté identique pour le sauvage. L'apparition de certaines lésions provoquées par les transformants ilv5" aux extrémités des feuilles d'orge en survie suggéraient que la pénétration du champignon pouvait être facilitée par les blessures infligées aux feuilles d'orge au cours du test de pathogénie. Cependant, les résultats des tests de pathogénie menés sur les transformants ilv5" sur plante entière, montrent clairement une réduction du pouvoir pathogène de ces mutants du même ordre (80 %) que sur feuilles d'orge en survie.
Tableau 3 : Test du pouvoir pathogène des transformants ilv5" sur plante entière (orge) L'inoculation des plants d'orge a été effectuée en pulvérisant une suspension de spores
(3.1 O^ spores.ml"1) des transformants dont on souhaite tester le pouvoir pathogène. Les plantes ont été placées une nuit en chambre humide après l'inoculation. Les symptômes ont été observés après 10 jours d'incubation à température ambiante. Les pourcentages de réduction du nombre et de la taille des lésions par feuille, calculés par rapport aux valeurs obtenues pour le transformant L57 (ilv5 ), sont indiqués entre parenthèses.
Figure imgf000026_0001
Exemple 4: Effet fongicide des inhibiteurs de l'acetphydroxy isoméroréductase
4.1 Effet fongicide des inhibiteurs de l'acetphydroxy isoméroréductase sur le champignon phytopathogène Magnaporthe grisea
L'effet fongicide des inhibiteurs dimethylphosphinoyl-2-hydroxyacétate et N- hydroxy-N-isopropyloxamate a été testé sur le champignon pathogène M. grisea en suivant l'évolution de la croissance de ce champignon en présence de différentes concentrations en inhibiteur, sur une période de 7 jours. Ainsi, un milieu de culture dom é (milieu minimum nitrate (MM) ; MM + leucine, valine et isoleucine à 0.3 mM; milieu complet TNKYE glucose (MC) ; MC + leucine, valine et isoleucine à 0.3 mM) est inoculé avec une suspension de spores de la souche PI.2 de M grisea à une concentration finale de 10-> spores/ml. Une gamme de dilutions du produit à tester, le N-hydroxy-N-isopropyloxamate (à pH 5), est préparée dans de l'eau tel que le produit soit 100 X concentré. 200 μl de milieu inoculé sont distribués dans une microplaque 96 puits auxquels sont additionnés 2 μl de produit 100X concentré. Le N-hydroxy-N-isopropyloxamate est testé à des doses finales de 3 ; 1 ; 0.3; 0.1 ; et 0.03 μM en milieux minimums et 3 et 0.3 μM en milieux complets. La microplaque est incubée à température ambiante et la lecture de la densité optique à 630 nm de cette microplaque permet de suivre la croissance du champignon dans ces différentes conditions de culture aux temps 0 (début du test) et aux jours 3, 4, 5, 6 et 7.
Ce test a été réalisé en inoculant différents milieux de culture avec une suspension de spores de la souche sauvage PI.2 de M grisea. Les premières expériences ont été réalisées en milieu minimum nitrate (MM) et différentes concentrations en inhibiteur ont été testées. Il faut attendre le 6 me et le 7 me jour de croissance avant de voir apparaître une inhibition significative de la croissance en milieu MM en présence de diméthylphosphinoyl-2- hydroxyacétate à 2 mM. La croissance est en effet réduite de 50 % par rapport à celle du témoin sans inhibiteur. En présence de l'inhibiteur N-hydroxy-N-isopropyloxamate (0.3 à lμM), dès le 3 me jour, une inhibition d'environ 50 % de la croissance du champignon est observée en milieu MM. L'inhibition plus importante de la croissance de M. grisea par le N- hydroxy-N-isopropyloxamate par rapport au diméthylphosphinoyl-2-hydroxyacétate nous a amené à approfondir l'étude de cet inhibiteur. Des tests de croissance du champignon M. grisea ont été effectués sur une période de
7 jours, en présence de l'inhibiteur N-hydroxy-N-isopropyloxamate (à des concentrations variant de 0.03 μM à 3 μM) dans différents milieux (MM et MM supplémenté en leucine, valine et isoleucine à 0.3 mM). En milieu minimum, le N-hydroxy-N-isopropyloxamate inhibe fortement la croissance de M. grisea. Cette inhibition de croissance par le N- hydroxy-N-isopropyloxamate (dès 0.3 μM) est observée à partir du 3 me jour de croissance, et reste similaire les jours suivants (Figure 2). Nous avons donc choisi de calculer la DI80 (concentration en inhibiteur telle que l'inhibition de la croissance du champignon est de 80 %) et la DI50 (concentration en inhibiteur telle que l'inhibition de la croissance est de 50 %) au 5 me jour de croissance. Ainsi, la croissance du champignon M. grisea est réduite de 80 % par rapport au témoin non traité, à une concentration en N-hydroxy-N-isopropyloxamate de 1 μM (DI80). Une concentration en N-hydroxy-N-isopropyloxamate de 0.3 μM (DI50) inhibe la croissance du champignon de 50 % (tableau 4).
Tableau 4 : Etude de l'effet de l'inhibiteur N-hydroxy-N-isopropyloxamate sur la croissance du champignon M. grisea
Figure imgf000028_0001
L'effet de l'inhibiteur N-hydroxy-N-isopropyloxamate a été testé sur le champignon pathogène M. grisea en suivant l'évolution de la croissance de ce champignon en présence de différentes concentrations en inhibiteur, dans différents milieux de culture et sur une période de 7 jours. Les valeurs données dans le tableau correspondent aux pourcentages moyens de croissance du champignon M. grisea obtenus au 5ème jour de croissance à partir de deux essais. Le témoin (souche sauvage de M. grisea) correspond à un taux de croissance de 100 %. 200 μl de milieu de culture, milieu minimum (MM) ou milieu minimum + leucine, valine et isoleucine à 0.3 mM (MM + ILV), ont été inoculé avec une suspension de spores de la souche PI.2 de M grisea à une concentration finale de 105 spores.ml"1. La microplaque a été incubée à température ambiante et la densité optique à 630 nm(DO63o) a été mesurée aux jours O, 3, 4, 5, 6 et 7 (JO, J3, J4, J5, J6 et J7). En supplémentant le milieu minimum en valine, leucine et isoleucine à 0.3 mM, la toxicité du N-hydroxy-N-isopropyloxamate sur la croissance du champignon M. grisea est levée, quelle que soit la concentration de N-hydroxy-N-isopropyloxamate utilisée. Cette levée de toxicité du N-hydroxy-N-isopropyloxamate par l'addition de valine, de leucine et d'isoleucine au milieu minimum montre que cette toxicité provient d'une inhibition spécifique de la voie de biosynthèse de ces acides aminés, en inliibant l'isoméroréductase. En effet, le N-hydroxy-N-isopropyloxamate agissant spécifiquement sur l'isoméroréductase de M. grisea, inhibe fortement la croissance de M. grisea à très faibles concentrations. L'isoméroréductase et l'inhibiteur N-hydroxy-N-isopropyloxamate se révèlent être un bon couple cible/fongicide.
Nous avons aussi cherché à déterminer si l'inhibiteur N-hydroxy-N- isopropyloxamate avait un effet sur la germination des spores de M. grisea. Une observation microscopique des spores de M. grisea au cours des expériences réalisées précédemment en milieu minimum, en présence de N-hydroxy-N-isopropyloxamate à 1 et 3 μM aux jours 0 et 2 a montré que la germination des spores n'était pas bloquée. Des tests supplémentaires ont été réalisés, afin de déterminer si à des concentrations élevées, le N-hydroxy-N- isopropyloxamate pouvait bloquer la germination des spores. Ainsi, à 10 mM, le N- hydroxy-N-isopropyloxamate n'inhibe pas la germination des spores de M. grisea aussi bien dans l'eau qu'en milieu minimum, à 24 et à 72 heures. L'inhibition de la croissance de M. grisea par le N-hydroxy-N-isopropyloxamate ne se manifeste qu'après la germination, lors de la croissance des hyphes. Nous pouvons donc supposer que l'utilisation des réserves en acides aminés (valine et isoleucine) présentes dans la spore pourrait permettre dans un premier temps la germination. La limitation des réserves en acides aminés et leur épuisement plus ou moins rapide pourraient agir comme facteur limitant de la croissance de M. grisea.
4.2 Effet fongicide des inhibiteurs de l'acetphydroxy isoméroréductase sur d'autres champignons
Nous avons réalisé des mesures de la toxicité d'IpOHA vis-à-vis d'autres espèces fongiques telles que Pythium ultimum, Botrytis cinerea, Ustilago nuda et Mycosphaerella graminicola dans les mêmes conditions que pour M. grisea (culture en milieu minimum liquide en microplaques à 96 puits). La croissance de Botrytis cinerea n'est pas affectée par la plus forte concentration d'IpOHA utilisée (30 μM), ce qui montre que cette espèce est résistante à IpoHA. La croissance à! Ustilago nuda et de Pythium ultimum est inhibée par IpOHA à partir de 10 μM. Celle de Mycosphaerella graminicola est inhibée dès 0,3 μM (tableau 5). Lorsque le milieu minimum (MM-liq) est supplémenté par de l'isoleucine, de la leucine et de la valine (1 mM), la toxicité d'IpOHA est levée pour toutes les espèces fongiques sensibles. Par contre, avec une concentration de 0,3mM, l'inhibition n'est levée chez Ustilago nuda que pour les concentrations inférieures à 30 μM d'IpOHA. IpOHA a une forte action sur la croissance de Mycosphaerella graminicola. Tableau 5: Toxicité d'IpOHA pour différentes espèces fongiques
Figure imgf000030_0001
DI50 : concentration inhibant la croissance du champignon de 50 %. DI80 : concentration inhibant la croissance du champignon de 80 %.
Exemple 5: Etudes biochimiques de l'acetphydroxy isoméroréductase de S.cerevisiae
La séquence codante du gène ILV5 de levure sans le peptide transit a été surexprimée chez E.coli afin d'obtenir de grandes quantités d'enzyme pour faciliter son étude biochimique et en particulier son étude structurale.
La stratégie employée pour l'étude de l'isoméroréductase de levure a été la suivante : le gène ILV5 de l'isoméroréductase de levure a été dans un premier temps amplifié par PCR sans la partie codant pour le peptide transit. Le produit de la réaction PCR a été ensuite clone dans un vecteur d'expression pET inductible par 1TPTG. L'isoméroréductase a été ensuite surproduite chez E. coli, purifiée puis ses propriétés biochimiques étudiées.
5.1 Amplification par PCR et clonage de la partie du gène ILV5 de l'isoméroréductase de levure codant pour la protéine mature
Le peptide signal, qui permet l'adressage de l'isoméroréductase de levure dans son compartiment cellulaire, la mitochondrie, est clivé lorsque la protéine a pénétré dans la mitochondrie. Nous avons donc choisi de cloner le gène ILV5 sans la région codant pour le peptide transit afin de surproduire l'isoméroréductase de levure correspondant à la protéine mature chez E. coli.
La région du gène ILV5 de levure située entre la fin du peptide transit et le codon STOP de terminaison de la traduction a été amplifiée par PCR à partir de l'ADN génomique de S. cerevisiae avec les couples d'amorces (l'-3') et (2'-3'). La taille des fragments d'ADN amplifiés avec les couples d'amorces (l'-3') et (2'-3') est de 1079 pb et 1124 pb, respectivement. Ces fragments d'ADN ont été purifiés après séparation par électrophorèse, puis digérés et clones dans le vecteur PET-23d en Sall/Ncol. Une double digestion du vecteur de clonage et du produit de réaction PCR par les enzymes Ncol et Sali permet en effet le clonage du gène ILV5 de levure dans la bonne orientation dans le vecteur PET-23d. Le plasmide pET-23d (Tebu), porteur du gène de résistance à l'ampicilline, est utilisé comme vecteur d'expression inductible pour produire en grande quantité l'isoméroréductase de levure chez E. coli. Ce type de vecteur possède un promoteur du phage T7, qui est reconnu par l'ARN polymerase T7, mais pas par TARN polymerase d'E.co/z. La production de la protéine clonée a lieu après l'induction par 1TPTG de la souche BL21 pLysS
(résistante au chloramphénicol) ; chez cette souche bactérienne, le gène de l'ARN polymerase T7 est sous le contrôle du promoteur lac inductible par 1TPTG. La souche BL21 pLysS transformée avec le plasmide pΕT-23d, porteur du gène ILN5 de S. cerevisiae est appelée BL21 pLysS-pΕT-23d-isoméroréductase. La construction n° 1 correspond au clonage du fragment amplifié avec les amorces (1 '-3') et la construction n° 2 au clonage du fragment d'ADN amplifié avec les amorces (2' -3'). Une double digestion Sall/Ncol des 12 clones obtenus après transformation des cellules DH5 avec la construction n°l et des 6 clones transformés avec la construction n°2 permet de ressortir le fragment clone dans le vecteur pΕT et de vérifier ainsi la présence d'une des 2 construction au sein des différents clones. L'analyse des profils de digestion de ces clones bactériens a montré qu'ils possédaient tous la construction correspondante.
Deux clones ont été sélectionnés : le clone PΕT 1-4 (construction n° 1) et le clone PΕT 2-1 (construction n° 2) ; ils ont été utilisés pour transformer des cellules BL21 pLysS, afin de surproduire l'isoméroréductase de levure chez E. coli.
5.2 Purification de l'isoméroréductase de levure surproduite chez E. coli
La suexpression de la forme " courte " (construction n°l) et de la forme " longue " (construction n°2) de l'isoméroréductase de levure a été induite chez E. coli par 1TPTG. La souche bactérienne BL21 pLysS, transformée avec le plasmide pΕT 23-d contenant le gène ILV5 de levure sans la région codant pour le peptide transit, est mise en culture à 28°C sous agitation dans du milieu LB supplémenté en carbénicilline (100 mg/1) et en chloramphénicol (30 mg/1) jusqu'à une densité équivalente à une DO600 d'environ 0.6. LTPTG est alors ajouté à une concentration de 0.4 mM finale et les bactéries sont laissées en culture à 28°C sous agitation durant environ 15 heures. Cette culture bactérienne est ensuite centrifugée (30 minutes, 4500 rpm) ; le culot bactérien est resuspendu dans 15 ml de tampon (KH2-K2PO4 10 mM (pH 7.5), ΕDTA 1 mM, DTT 1 mM et inhibiteurs de protéase : benzamidine HC1 1 mM, acide amino-caproïque 5 mM) et soniqué par le Vibra- cell disruptor (Sonics and Materials, Danbury, CT, U.S. A) pendant 15 minutes, à puissance 4, 40 % du temps total de lyse. L'extrait cellulaire est centrifugé (20 minutes, 15000 rpm) ; le surnageant, contenant les protéines solubles, est alors conservé à - 80°C.
L'analyse sur gel d'acrylamide des fractions protéiques totales et des fractions protéiques solubles a montré que les formes " courte " et " longue " de l'isoméroréductase de levure sont présentes dans la fraction de protéines solubles et qu'elles représentent environ 25 à 30 % de ces protéines. La position la plus vraisemblable du site de clivage du peptide transit de l'isoméroréductase de levure étant située entre les acides aminés 47 et 48 de la séquence protéique de cette enzyme (Petersen, G.L. et al., NAR 14, 24:9631-9650,
1986), nous avons choisi de continuer à travailler avec la forme courte de l'isoméroréductase de levure.
La purification de la forme courte de l'isoméroréductase a donc été réalisée en deux étapes à partir de la fraction des protéines solubles ; d'abord sur une colonne échangeuse d'anions (Q-Sépharose), puis sur une colonne de perméation (Superdex 75). L'extrait de protéines solubles (15.5 ml ; 227.8 mg de protéines), qui contient l'isoméroréductase de levure (extrait brut) est appliqué sur une colonne échangeuse d'anions, HiLoad 16/10 Q- Sépharose (Pharmacia) connectée à un système F.P.L.C de Pharmacia, préalablement équilibrée avec du tampon KH2-K2PO4 10 mM/EDTA 1 mM/DTT 1 mM. L'enzyme est éluée par 78 ml de ce même tampon (débit = 1 ml/min ; taille des fractions = 3 ml). Les fractions chromatographiques contenant l'isoméroréductase de levure sont concentrées à 1.6 ml par centrifugation à 5500 rpm dans un macrosep-10 unit (filtron). Cet extrait (27.7 mg) est alors appliqué sur une colonne Hiload 16/60 Superdex 75 (Pharmacia) connectée à un système F.P.L.C de Pharmacia, préalablement équilibrée avec du tampon Hépès KOH 25 mM. . L'enzyme est éluée par 58 ml de ce même tampon (débit = 1 ml/min ; taille des fractions = 1 ml). Les fractions chromatographiques contenant l'isoméroréductase de levure (18.99 mg) sont concentrées à 9.7 mg/ml par centrifugation à 5500 rpm dans un microsep 10K (filtron) et conservés à -80°C.
Après injection de la fraction des protéines solubles (environ 230 mg) sur la colonne Q-Sépharose, l'isoméroréductase de levure est éluée avec du tampon KH2-K2PO4 10 mM/EDTA 1 mM/DTT 1 mM. Il est en effet inutile d'éluer cette enzyme en faisant agir un gradient de concentration croissante en tampon phosphate puisque des expériences préliminaires ont montré que cette enzyme n'était pas retenue par la colonne. Après cette première étape de purification, environ 30 mg de protéine a été récupéré et le rendement de la purification en terme d'activité est de 55 % (tableau 6). Tableau 6 : Etapes de la purification de l'isoméroréductase de levure surexprimée chez E.coli
Figure imgf000033_0001
Les activités ont été déterminées dans le milieu réactionnel suivant : Hépès de sodium 50mM, pH 7.5 ; MgCl2 lOmM ; NADPH 250μM et AHB 0.48mM. Le dosage des protéines a été réalisé selon la méthode de Bradford (Bradford) ou en mesurant l'absorbance à 205 nm (205). n.d. = non déterminé
L'analyse sur gel d'acrylamide du pool des fractions de la Q-Sépharose montre qu'après cette première étape de purification l'enzyme est presque pure. Le pool des fractions de la Q-Sépharose est injecté sur la colonne de gel filtration et l'isoméroréductase de levure est éluée avec du tampon Hépès KOH 25 mM. Après cette 2 étape de purification, environ 20 mg de protéine pure est récupérée; le rendement final des deux étapes de purification de l'isoméroréductase de levure est d'environ 34 %. 5.3 Etudes des propriétés cinétiques de l'isoméroréductase de levure surproduite chez E. coli
La détermination des paramètres cinétiques de l'isoméroréductase de levure a été réalisée en suivant l'évolution de la réaction enzymatique au spectrophotomètre en conditions saturantes en magnésium, en NADPH et en substrat AHB ou AL. Toutes les mesures d'activité enzymatique ont été réalisées dans une cuve en quartz d'un trajet optique de 1 cm contenant du tampon Hépès de sodium (50 mM, pH 7.5), du MgCl2 10 mM, du NADPH 250μM, dans un volume final de 1 ml, à 25°C. La réaction enzymatique a été initiée par l'ajout de 0.48 mM d'AHB ou d'AL. L'évolution de cette réaction a été suivie grâce à la décroissance d'absorption du NADPH à 340 nm. 5.3.1. Détermination du pH pptimum d'activité de l'isoméroréductase recombinante de levure purifiée
Afin de déterminer les conditions optimales pour réaliser les mesures cinétiques sur l'isoméroréductase de levure, le pH optimum d'activité de cette enzyme a été déterminé, en mesurant l'activité de l'enzyme purifiée dans des tampons de pH variables. Le pH optimum d'activité de l'isoméroréductase de levure est de 7.5, alors que des études avaient montré que celui de l'isoméroréductase de plante était de 8.2. Cette différence de pH optimum d'activité de l'isoméroréductase entre la plante et la levure s'explique par la localisation cellulaire de ces 2 enzymes. L'isoméroréductase de plante est localisée dans le chloroplaste dont le pH est de 8.2 à la lumière, alors que l'isoméroréductase de levure est située dans la mitochondrie dont le pH est de 7.5. Le pH optimum d'activité de ces isoméroréductases est donc bien adapté à l'environnement cellulaire dans lequel elles se trouvent.
5.3.2. Détermination des paramètres cinétiques de l'isoméroréductase recombinante de levure purifiée L'affinité de l'isoméroréductase de levure pour ses différents ligands a été étudiée. a) Activités spécifiques
L'activité spécifique de l'isoméroréductase de levure pour les substrats AHB et AL sont de 6 et 1 μmoles de NADPH oxydées.min" .mg" de protéine, respectivement. Le rapport entre les vitesses maximales (Nm) de réaction enzymatique en présence du substrat AHB par rapport au substrat acétolactate est donc inchangé pour l'enzyme de levure par rapport à celle de plante (Nm AHBNm AL = 6). Les activités spécifiques de l'isoméroréductasede plante pour les substrats AHB et AL sont par ailleurs de 6 et 1 μmoles de ΝADPH oxydées.min" .mg" de protéine, respectivement. b) Affinités pour les cof acteurs ΝADPH et ΝADH L'affinité de l'isoméroréductase de levure pour le ΝADPH est très élevée (figure 3).
En effet, un Km pour ce cofacteur de 1.6 μM a été mesuré. Ce KM est peu différent de celui mesuré pour l'enzyme de plante (KM- 5 μM). La valeur de K ΝADPH obtenue pour l'isoméroréductase de levure purifiée est cohérente avec la valeur obtenue pour l'enzyme de levure partiellement purifiée (KM < 2.5 μM; Hawkes et al, 1989). Cependant, contrairement à l'enzyme de plante, qui est capable d'utiliser du ΝADH, avec une très faible affinité (KM
ΝADH = 645 μM en présence de AHB et de Mg 2+; Dumas et al., Biochem. J., 288:865- 874, 1992), l'enzyme de levure semble être incapable d'utiliser le ΝADH. Aucune activité enzymatique n'a été détectée en présence de ΝADH (à 300 μM) en conditions saturantes en substrat AHB et en magnésium, peut-être à cause d'une affinité pour le ΝADH encore plus faible que celle de l'isoméroréductase de plante. L'isoméroréductase de levure utiliserait le
NADPH comme donneur d'hydrogènes avec une spécificité encore plus marquée que l'enzyme de plante. c) Affinités pour les substrats AHB et AL L'affinité de l'isoméroréductase de levure pour le substrat AHB (KM = 104 μM pour la forme racémique) est environ 5 fois plus faible que celle de l'isoméroréductase de plante ; alors que l'affinité de l'isoméroréductase de levure pour le substrat AL (KM = 266 μM pour la forme racémique) est 10 fois plus faible que l'isoméroréductase de plante (figure 4). Ces valeurs de KM sont assez proches de celles obtenues pour l'enzyme partiellement purifiée de N. crassa. En effet, les KM AHB et AL pour l'isoméroréductase de N. crassa sont de 160 μM et 320 μM respectivement.
La différence de propriétés biochimiques la plus marquante entre l'isoméroréductase de levure et de plante est l'affinité de cette enzyme pour le magnésium. d) Affinités pour le magnésium L'affinité de l'isoméroréductase de levure (KM = 968 μM) est en effet 200 fois plus faible que celle de l'enzyme de plante (K = 5 μM environ). Voir figure 5. Cette faible affinité de l'isoméroréductase de levure pour le magnésium pourrait être une caractéristique de l'isoméroréductase de champignon. En effet, les études menées sur l'isoméroréductase de N. crassa ont montré que cette enzyme a un KM magnésium de 580 μM en présence de ΝADPH et du substrat AHB (Kritani et al, J. Biological Chemistry, 241:2047-2051, 1965). La comparaison des séquences primaires des isoméroréductases de levure, de N. crassa et de plante a montré que la principale différence entre ces trois enzymes était l'absence au sein de la protéine de champignon d'une séquence de 140 acides aminés impliquée dans l'interaction entre les deux monomères de l'enzyme de plante. Les 2 domaines connus pour fixer les ions Mg2+ chez l'enzyme de plante sont cependant présents au niveau de l'enzyme de levure. L'étude d'un mutant monomérique de l'isoméroréductase de plante obtenu en délétant 7 acides aminés dans la région de dimérisation de 140 acides aminés a montré que l'enzyme présente une affinité beaucoup plus réduite pour le magnésium (KM = 640 μM) que la forme sauvage de l'enzyme (Wessel et al., Biochemistry, 37:12753-12760, 1998). La structure quaternaire de l'isoméroréductase de plante jouerait donc un rôle dans la stabilisation du site actif de l'enzyme de plante et des sites de forte affinité pour le magnésium. Ainsi, bien que l'isoméroréductase de levure possède bien les deux domaines de fixation des ions Mg2+, l'absence de la séquence de cette région de 140 acides aminés au sein de l'enzyme de levure pourrait expliquer l'affinité plus réduite de l'isoméroréductase de levure pour le magnésium de par l'organisation spatiale du site actif de cette enzyme probablement différente de celle de l'enzyme de plante. Bien que les sites de liaison pour le magnésium de l'isoméroréductase de levure ont une affinité beaucoup plus faible pour ce cation, l'affinité de l'enzyme de levure pour le NADPH est similaire à celle de plante. Nous pouvons donc supposer que la conformation de l'isoméroréductase de levure pourrait être telle que le domaine amino-terminal qui intervient dans la fixation du NADPH est peu différent de celui de l'enzyme de plante et que le domaine carboxy-terminal qui est responsable de la fixation des deux atomes de magnésium et du substrat est différent de celui de l'enzyme de plante. La connaissance de la structure quaternaire de l'isoméroréductase de levure grâce à la cristallisation de l'enzyme permettrait d'expliquer cette faible affinité pour les ions Mg2+-
5.4 Etude de l'effet des inhibiteurs N-hydroxy-N-isopropyloxamate et diméthylphosphinoyl-2-hydroxyacétate sur l'isoméroréductase de levure
5.4.1 Etude de la stoechipmétrie de fïxatipn des inhibiteurs N-hydroxy-N- isopropyloxamate et diméthylphosphinoyl-2-hydroxyacétate sur l'isoméroréductase de levure
L'étude de la stoechiométrie de fixation des inhibiteurs N-hydroxy-N- isopropyloxamate et du diméthylphosphinoyl-2-hydroxyacétate a été réalisée en incubant des quantités variables d'enzyme (de 0.1 à 0.4 nmoles) avec une quantité constante en inhibiteur pendant 20 minutes avec 25 nmoles de NADPH et 0.25 μmoles de MgCl2 dans un volume final de 10 μl. Les réactions sont initiées en ajoutant de l'AHB 0.48mM dans du tampon Hépès de sodium 50 mM, pH 7.5, contenant du MgCl2 10 mM.
En présence de 0.1 nmoles de diméthylphosphinoyl-2-hydroxyacétate, une activité enzymatique n'est détectée qu'avec des quantités d'enzyme supérieures à 0.09 nmoles. De la même manière, en présence de 0.1 nmole de N-hydroxy-N-isopropyloxamate, une activité enzymatique n'est détectée que pour des quantités d'enzyme supérieures à 0.1 nmoles (figure 6). De plus, pour ces deux inhibiteurs, lorsque l'enzyme est en excès par rapport à l'inhibiteur dans le milieu réactionnel, les activités enzymatiques augmentent parallèlement à celles du témoin sans inhibiteur. Le N-hydroxy-N-isopropyloxamate et le diméthylphosphinoyl-2-hydroxyacétate agiraient donc sur l'isoméroréductase de levure comme des inhibiteurs irréversibles. En effet, dans le cas d'une inhibition irréversible, en présence d'une faible quantité d'enzyme, toute l'enzyme se complexe avec l'inhibiteur. L'activité enzymatique est alors nulle, puisqu'il n'existe plus d'enzyme libre dans le milieu réactionnel. Lorsque la quantité d'enzyme présente dans le milieu réactionnel est supérieure à la quantité d'inhibiteur, l'enzyme libre en excès dans le milieu se comporte alors comme le témoin sans inhibiteur (droite parallèle au témoin). Par ailleurs, 0.1 nmoles d'inhibiteur (N- hydroxy-N-isopropyloxamate ou diméthylphosphinoyl-2-hydroxyacétate) étant nécessaire pour inhiber entièrement 0.1 nmoles d'enzyme, la stoechiométrie de fixation des inhibiteurs sur l'isoméroréductase de levure est par conséquent de 1 mole d'inhibiteur par mole d'enzyme.
5.4.2 Etude de la vitesse de fixation des inhibiteurs N-hydroxy-N-isopropyloxamate et diméthylphosphinoyl-2-hydroxyacétate sur l'isoméroréductase de levure
L'effet des inhibiteurs N-hydroxy-N-isopropyloxamate et diméthylphosphinoyl-2- hydroxyacétate sur l'isoméroréductase de levure a été suivi au cours du temps en mesurant au spectrophotomètre la décroissance d'absorbance du NADPH à 340 nm. Chaque mesure est réalisée en conditions saturantes en MgCl2 (10 mM) et en NADPH (0.25 mM) pendant une durée de 6 minutes en présence d'une concentration donnée en inhibiteur (N-hydroxy- N-isopropyloxamate = 15 μM ou diméthylphosphinoyl-2-hydroxyacétate = 10 μM) et en enzyme (110 nM) ; la concentration en substrat AHB utilisée varie de 250 μM à 2 375μM. L'étude de la stoechiométrie de fixation des inhibiteurs N-hydroxy-N-isopropyloxamate et diméthylphosphinoyl-2-hydroxyacétate sur l'isoméroréductase de levure a montré que ces inhibiteurs se comportent comme des inhibiteurs irréversibles. L'équation (1) permet donc de décrire la cinétique de formation du produit de la réaction, cette équation étant applicable aux inhibiteurs irréversibles. Les paramètres ml, m2 et m3, définis à partir de l'équation (1), sont obtenus directement à partir de l'ajustement des courbes expérimentales par le logiciel KaleidaGraph, ainsi que les erreurs associées à la détermination de ces paramètres. Equation (1) :
DO ^ m^ n m .e ^3^
où les paramètres sont les suivants :
. DO 3 0 est la densité optique mesurée au spectrophotomètre à 340 nm au temps "t"
. m! la densité optique quand "t" tend vers l'infini . m2 la densité optique initiale
. m3 le produit de la concentration en inhibiteur par la constante apparente de disparition du
NADPH
Pour une inhibition irréversible, deux cas peuvent se présenter : soit l'inhibiteur se fixe directement en une seule étape sur l'enzyme, soit il se fixe en deux étapes sur l'enzyme en formant un complexe intermédiaire enzyme-inhibiteur réversible. La représentation graphique m3 en fonction de la concentration en inhibiteur permet de définir le type d'inhibition irréversible. Ainsi, pour déterminer si les inhibiteurs N-hydroxy-N- isopropyloxamate et diméthylphosphinoyl-2 -hydroxyacétate se fixent en une ou deux étapes sur l'isoméréortductase de levure, l'effet de ces inhibiteurs sur l'activité enzymatique de cette enzyme est suivi au cours du temps (6 min) en faisant varier la concentration en inhibiteur, pour des concentrations en enzyme (110 nM) et AHB (0.48 mM) données (figure 7). Pour une inhibition irréversible simple, sans formation du complexe intermédiaire enzyme- inhibiteur réversible, la vitesse apparente de formation du complexe enzyme-inhibiteur (K0bS ou m ) est une fonction linéaire de la concentration en inhibiteur. Si l'inhibition irréversible implique l'existence d'un complexe intermédiaire réversible, la représentation graphique m3 en fonction de la concentration en inhibiteur est une hyperbole. Pour les inhibiteurs N- hydroxy-N-isopropyloxamate et diméthylphosphinoyl-2-hydroxyacétate; la représentation graphique m3 en fonction de la concentration en inhibiteur est linéaire, suggérant que l'inhibition de l'isoméroréductase de levure par ces produits se fait en seule étape (figure 8), comme c'est le cas pour l'inhibition de l'isoméroréductase de plante. Cependant, même en tenant compte des erreurs expérimentales, les représentations graphiques m3 en fonction de la concentration en inhibiteur ne passent pas par l'origine pour les deux inhibiteurs. Ces deux inhibiteurs, N-hydroxy-N-isopropyloxamate et diméthylphosphinoyl-2- hydroxyacétate, pourraient ne pas être entièrement irréversibles. Dans ce cas, la constante de dissociation du complexe enzyme-inhibiteur, k.0 pourrait avoir une valeur non négligeable. Le mécanisme d'inhibition (compétitive ou non compétitive) peut être déterminé en étudiant l'effet de la concentration en substrat sur la vitesse apparente de formation du complexe enzyme-inhibiteur. Cette détermination se fait grâce à la représentation graphique l/m3 en fonction de la concentration en substrat. Pour des inhibiteurs de type compétitif, la représentation graphique l/m3 en fonction de la concentration en substrat est linéaire. Pour les inhibiteurs non compétitifs, le paramètre m3 est indépendant de la concentration en substrat. Pour les inhibiteurs N-hydroxy-N-isopropyloxamate et diméthylphosphinoyl-2- hydroxyacétate, l'inverse de m3 varie linéairement en fonction de la concentration en substrat AHB. Le N-hydroxy-N-isopropyloxamate et le diméthylphosphinoyl-2- hydroxyacétate se comportent donc comme des inhibiteurs compétitifs vis-à-vis du substrat AHB de l'isoméroréductase de levure (figure 9). La constante d'association de l'inhibiteur à l'enzyme de levure (k0) est alors calculée grâce à l'équation (2). Equation (2) :
Figure imgf000039_0001
k0 s - rn3 = vitesse apparente de formation du complexe enzyme-inhibiteur ko = constante d'association de l'inhibiteur à l'enzyme k -0= constante de dissociation de l'inhibiteur à l'enzyme
K^ = constante de Michaelis et Menten du substrat AHB [I] = concentration en inhibiteur [S] = concentration en substrat Pour des inhibiteurs irréversibles, le k -0 peut être considéré comme négligeable, le k0 est alors calculé grâce à l'équation (3) grâce au programme KaleidaGraph. Equation (3) :
roi
Figure imgf000039_0002
Cette équation est utilisable pour l'inhibiteur N-hydroxy-N-isopropyloxamate, mais pas pour le diméthylphosphinoyl-2-hydroxyacétate. Pour le diméthylphosphinoyl-2- hydroxyacétate, la représentation graphique l/m3 en fonction de la concentration en substrat est linéaire, mais ne passe par l'origine. Pour le N-hydroxy-N-isopropyloxamate, la représentation graphique l/m3 en fonction de la concentration en substrat est linéaire et la valeur de l'ordonnée à l'origine est négligeable. Une hypothèse peut expliquer ce résultat : l'inhibiteur diméthylphosphinoyl-2-hydroxyacétate n'est peut être pas complètement irréversible. Une droite de régression linéaire permet alors d'obtenir la valeur du k0 pour le diméthylphosphinoyl-2 -hydroxyacétate. Les valeurs de k0 correspondant aux inhibiteurs N- hydroxy-N-isopropyloxamate et diméthylphosphinoyl-2-hydroxyacétate sont de 12 433 M" .s" et 7721 M" .s" , respectivement. Ainsi, contrairement à l'isoméroréductase de plante (k0 pour le N-hydroxy-N-isopropyloxamate = 1 900 M" .s" et k0 pour le diméthylphosphinoyl-
2-hydroxyacétate = 22 000 M"1. s"1), le N-hydroxy-N-isopropyloxamate est un meilleur inhibiteur de l'enzyme de levure que le diméthylphosphinoyl-2-hydroxyacétate. 5.5. Etude structurale de l'isoméroréductase de levure
La structure quaternaire de l'isoméroréductase de levure a été étudiée selon deux approches différentes : la spectrométrie de masse et la gel filtration.
L'existence de deux états d'oligomérisation différents a été mise en évidence grâce à la spectrométrie de masse en conditions non dénaturantes. Cette technique a montré que l'isoméroréductase de levure est présente majoritairement sous forme dimérique mais une forme monomérique minoritaire est aussi présente. Le dimère est représenté par une
1 ι 1 + distribution des états de charge [D + 18H] à [D + 21 H] . Une faible présence de
194- monomère de l'isoméroréductase de levure, représenté par les états de charge [M + 12H] à [M + 14H] est mis en évidence sur ce même spectre de masse. L'isoméroréductase de levure pourrait donc être en équilibre entre une forme monomérique et une forme dimérique.
L'application sur gel filtration (Superdex 75) du pool des fractions de l'isoméroréductase de levure obtenues après la lere étape de purification montre que l'isoméroréductase est éluée en un seul pic et que sa masse moléculaire est estimée à 67 kDa. Or, la masse moléculaire attendue de la forme monomérique de cette enzyme est d'environ 40 kDa et de 80 kDa pour la forme dimérique en condition non dénaturante. La masse moléculaire intermédiaire entre les formes monomérique et dimérique de l'isoméroréductase de levure confirme l'existence d'un équilibre entre ces deux formes de l'enzyme. Seul un équilibre dynamique rapide entre ces deux formes pourrait expliquer l'obtention d'un seul pic d'élution en gel filtration. En effet, si cet équilibre était lent, 2 pics d'élution auraient été observés en sortie de gel filtration ; l'un correspondrait à la forme monomérique , et l'autre à la forme dimérique de l'enzyme.

Claims

Revendications
1) Procédé de traitement des cultures contre les maladies fongiques, caractérisé en ce que l'on applique une composition fongicide comprenant une quantité efficace d'un inhibiteur de l'acétohydroxyacide isoméroréductase de la SEQ ID No.l, la SEQ ID No.2 et/ou la SEQ ID No.3.
2) Procédé suivant la revendication 1, dans laquelle l'inhibiteur de l'acétohydroxyacide isoméroréductase est le diméthylphosphinoyl-2-hydroxyacétate.
3) Procédé suivant la revendication 1, dans laquelle l'inhibiteur de l'acétohydroxyacide isoméroréductase est le N-hydroxy-N-isopropyloxamate.
4) Compositions fongicides caractérisées en ce qu'elles comprennent un inhibiteur de l'acétohydroxyacide isoméroréductase isoméroréductase de la SEQ ID No.l, la SEQ ID No.2 et/ou la SEQ ID No.3 et un autre composé fongicide.
5) Procédé de fabrication d'une composition fongicide caractérisé en ce que l'on utilise un inhibiteur de l'acétohydroxyacide isoméroréductase isoméroréductase de la SEQ ID
No.l, la SEQ ID No.2 et/ou la SEQ ID No.3.
6) Procédé pour l'identification de composés fongicides comprenant l'identification de composés inhibant l'activité enzymatique de l'acétohydroxyacide isoméroréductase isoméroréductase de la SEQ ID No.1 , la SEQ ID No.2 et/ou la SEQ ID No.3.
7) Procédé selon la revendication 6 comprenant une étape supplémentaire dans laquelle on détermine si lesdits composés inhibant l'activité enzymatique de l'acétohydroxyacide isoméroréductase isoméroréductase de la SEQ ID No.l, la SEQ ID No.2 et/ou la SEQ ID No.3 inhibent la croissance et la pathogénie des champignons.
8) Procédé selon les revendications 6 ou 7, dans lequel l'identification de composés inhibant l'activité enzymatique de l'acétohydroxyacide isoméroréductase de la SEQ ID No.l, la SEQ ID No.2 et/ou la SEQ ID No.3 comprend les étapes suivantes : a) mettre en contact ledit composé avec l'acétohydroxyacide isoméroréductase en présence de magnésium, de NADPH et de substrat; et b) mesurer ladite activité enzymatique.
9) Procédé selon les revendications 6 ou 7, dans lequel l'identification de composés inhibant l'activité enzymatique de l'acétohydroxyacide isoméroréductase de la SEQ ID No.l, la SEQ ID No.2 et/ou la SEQ ID No.3 comprend les étapes suivantes: a) exprimer l'acétohydroxyacide isoméroréductase dans un organisme hôte; b) purifier l'acétohydroxyacide isoméroréductase produite par ledit organisme hôte; c) mettre en contact ledit composé avec ladite acétohydroxyacide isoméroréductase purifiée en présence de magnésium, de NADPH et de substrat; et d) mesurer ladite activité enzymatique.
10) Procédé selon l'une des revendications 8 ou 9 , dans lequel la mesure de ladite activité enzymatique comprend la mesure de la décroissance d'absorption du NADPH à 340 nm.
11) Procédé selon l'une des revendications 8 à 10, dans lequel ledit substrat est le 2S-2- acétolactate (AL) ou le 2S-2-acéto-2-hydroxybutyrate (AHB).
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