FR2829363A1

FR2829363A1 - Utilisations d'inhibiteurs de l'acetohydroxyacide isomeroreductase pour le traitement des maladies fongiques des cultures

Info

Publication number: FR2829363A1
Application number: FR0111689A
Authority: FR
Inventors: Renaud Dumas; Marc Henri Lebrun; Jean Luc Zundel; Geraldine Effantin; Valerie Morin
Original assignee: Aventis CropScience SA
Current assignee: Bayer CropScience SA
Priority date: 2001-09-10
Filing date: 2001-09-10
Publication date: 2003-03-14
Anticipated expiration: 2021-09-10
Also published as: WO2003022056A1; US7166706B2; FR2829363B1; US20040259848A1; JP2005501912A; US20070129337A1; JP2011093909A; EP1424899A1

Abstract

La présente invention concerne l'utilisation d'inhibiteurs de l'acétohydroxyacide isoméroréductase pour le traitement des maladies fongiques des cultures. L'invention a pour objet des procédés de traitement des cultures contre les maladies fongiques comprenant l'application d'un inhibiteur de l'acétohydroxyacide isoméroréductase. L'invention se rapporte aussi à des procédés pour l'identification de nouveaux composés fongicides comprenant une étape d'identification d'inhibiteurs de l'acétohydroxyacide isoméroréductase.

Description

Utilisations d'inhibiteurs de l'acétohydroxyacide isoméroréductase pour le traitement des maladies fongiques des cultures La présente invention concerne l'utilisation d'inhibiteurs de l'acétohydroxyacide isoméroréductase pour le traitement des maladies fongiques des cultures.

Les champignons sont responsables d'épidémies dévastatrices qui peuvent entraîner des pertes importants au niveau des cultures de différentes espèces végétales. Le principe d'employer des inhibiteurs d'enzymes de champignons pathogènes, et d'utiliser ces enzymes dans des tests pour identifier de nouvelles molécules actives contre ces champignons est connu en soi. Toutefois, la simple caractérisation d'une enzyme de champignon n'est pas suffisante pour atteindre cet objectif, encore faut-il que l'enzyme choisi comme cible de molécules fongicides potentielles soit essentielle à la vie du champignon, son inhibition par la molécule fongicide entraînant la mort du champignon, ou essentielle à la pathogénie du champignon, son inhibition n'étant pas létale pour le champignon mais inhibant simplement son pouvoir pathogène. L'identification de voies métaboliques et d'enzymes indispensables à la pathogénie et à la survie du champignon est donc nécessaire au développement de nouveaux produits fongicides.

L'acétohydroxyacide isoméroréductase est une enzyme bien caractérisée chez les plantes et les microorganismes tels que les bactéries et les levures. Cette enzyme est la deuxième enzyme de la voie de biosynthèse des acides aminés à chaîne ramifiée, elle catalyse la transformation du substrat, le 2S-2-acétolactate (AL) ou le 2S-2-acéto-2hydroxybutyrate (AHB) en 2, 3-dihydroxy-3-isovalérate (DHIV) ou en 2, 3-dihydroxy-3méthylvalérate (DHIM) respectivement. Cette réaction nécessite la présence d'ions magnésium (Mg2+) et se déroule en deux étapes : une isomérisation d'un groupement méthyle ou éthyle suivie d'une réduction par le NADPH. Un grand nombre de connaissances ont été acquises sur l'isoméroréductase de plante en tant que cible pour des herbicides (Wittenbach et al., Plant Physiol. 96, No. 1, Suppl., 94, 1991 ; Schulz et al., FEBS Lett., 238 : 375-378, 1988) et des inhibiteurs de l'acétohydroxyacide isoméroréductase ont été décrits comme herbicides (EP106114 ; US4, 594, 098, EP196026, EP481407, WO 94/23063, CA2002021). Cependant, ces composés n'ont pas montré une activité herbicide efficace sur plante.

La présente invention a pour objet des procédés de traitement des cultures contre les maladies fongiques comprenant l'application d'un inhibiteur de l'acétohydroxyacide isoméroréductase. On a trouvé que l'inactivation du gène IL V5 codant pour

l'acetohydroxyacide isoméroréductase chez Magnaporthe grisea entraîne une inhibition de la croissance du champignon. Cette inhibition de la croissance du champignon est également observé in vivo en présence d'inhibiteurs spécifiques de l'acétohydroxyacide isoméroréductase. M grisea est pathogène pour de nombreuses espèces de plantes cultivées telles que le riz.

Description de la liste de séquences SEQ ID No. 1 Acétohydroxyacide isoméroréductase de Magnaporthe grisea.

SEQ ID No. 2 Acétohydroxyacide isoméroréductase de Saccharomyces cerevisiae.

SEQ ID No. 3 Acétohydroxyacide isoméroréductase de Neurospora crassa.

SEQ ID No. 4 ADNc du gène de l'acétohydroxyacide isoméroréductase de

Magnaporthe grisea.

SEQ ID No. 5 Acétohydroxyacide isoméroréductase de Magnaporthe grisea.

SEQ ID No. 6 Gène de l'acétohydroxyacide isoméroréductase de Magnaporthe grisea.

SEQ ID No. 7-18 Amorces pour PCR.

Description de l'invention
La présente invention a pour objet des procédés de traitement des cultures contre les maladies fongiques par application d'une quantité efficace d'un inhibiteur de l'acetohydroxyacide isoméroréductase.

L'invention a pour objet un procédé de lutte, à titre curatif ou préventif, contre les champignons phytopathogènes des cultures, caractérisé en ce que l'on applique sur le sol où poussent ou où sont susceptibles de pousser les végétaux, sur les feuilles et/ou les fruits des végétaux ou sur les semences des végétaux, une quantité efficace (agronomiquement efficace) et non phytotoxique d'un inhibiteur de l'acétohydroxyacide isoméroréductase. Par "quantité efficace et non phytotoxique", on entend une quantité d'inhibiteur suffisante pour permettre le contrôle ou la destruction des champignons présents ou susceptibles d'apparaître sur les cultures, et n'entraînant pour lesdites cultures aucun symptôme notable de phytotoxicité. Une telle quantité est susceptible de varier dans de larges limites selon le champignon à combattre, le type de culture, les conditions climatiques, et les composés

compris dans la composition fongicide selon l'invention. Cette quantité peut être déterminée par des essais systématiques au champ, à la portée de l'homme du métier.

Les procédés selon l'invention sont utiles pour traiter les semences de céréales (blé, seigle, triticale et orge notamment), de pomme de terre, de coton, de pois, de colza, de maïs, de lin ou encore les semences d'arbres forestiers, ou encore les semences génétiquement modifiées de ces végétaux. La présente invention concerne aussi l'application foliaire sur les cultures végétales, c'est-à-dire sur les feuillages, les fleurs, les fruits et/ou les troncs des végétaux concernés. Parmi les végétaux visés par les procédés selon l'invention, on peut citer le riz, le maïs, le coton, les céréales, comme le blé, l'orge, le triticale, les arbres fruitiers, en particulier pommiers, poiriers, pêchers, vigne, bananiers, orangers, citronniers, etc..., les cultures oléagineuses, par exemple, colza, tournesol, les cultures maraîchères et légumières, tomates, salades, les cultures protéagineuses, le pois, les solanées, par exemple la pomme de terre, la betterave, le lin, et les arbres forestiers, ainsi que les homologues génétiquement modifiés de ces cultures.

Parmi les végétaux visés par la méthode selon l'invention, on peut citer : - le blé, en ce qui concerne la lutte contre les maladies suivantes des semences : les fusarioses (Microdochium nivale et Fusarium roseum), les caries (Tilletia caries, Tilletia controversa ou Tilletia indica), la septoriose (Septoria nodorum) ; le charbon nu (Ustilago tritici) ;

- le blé, en ce qui concerne la lutte contre les maladies suivantes des parties aériennes de la plante : le piétin-verse (Tapesia yallundae, Tapesia acuiformis), le piétin-échaudage (Gaeumannomyces graminis), la fusariose du pied (F. culmorum, F. graminearum), la fusariose des épis (F. culmorum, F. graminearum, Microdochium nivale), le rhizoctone (A/zocM'cs), l'oïdium Esg gTYWHoa'c -ci), les rouilles (Puccinia striiformis et Puccinia recondita) et les septorioses (Septoria tritici et Septoria nodorum), l'helminthosporiose (Drechslera tritici-repentis) ; - l'orge, en ce qui concerne la lutte contre les maladies suivantes des semences : les helminthosporioses (Pyrenophora graminea, Pyrenophora teres et Cochliobolus sativus), le charbon nu (Ustilago nuda) et les fusarioses (Microdochium nivale et Fusarium roseum) ; - l'orge, en ce qui concerne la lutte contre les maladies suivantes des parties aériennes de la plante : le piétin-verse (Tapesia yallundae), les helminthosporioses (Pyrenophora teres et Cochliobolus sativus), ltoïdium fErysiphe graminis forma specie hordei), la rouille naine (Puccinia hordei) et la rhynchosporiose (Rhynchosporium secalis) ;

- la pomme de terre, en ce qui concerne la lutte contre les maladies du tubercule (notamment Helminthosporium solani, Phoma tuberosa, Rhizoctonia solani, Fusarium solani), et le le mildiou (Phytopthora infestans ;

- la pomme de terre en ce qui concerne la lutte contre les maladies du feuillage suivantes : l'alternariose (Alternaria solani), le mildiou (Phytophthora infestans) ; - le coton, en ce qui concerne la lutte contre les maladies suivantes des jeunes plantes issues des semences : les fontes de semis et les nécroses du collet (Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum), la pourriture noire des racines (Thielaviopsis basicola) ; - les cultures protéagineuses, par exemple le pois, en ce qui concerne la lutte contre les

maladies suivantes des semences : l'anthracnose (Ascochytapisi, Mycosphaerellapinodes), la fusariose (Fusarium oxysporum), la pourriture grise (Botrytis cinerea), le mildiou (Peronospora pisi) ; - les cultures oléagineuses, par exemple le colza, en ce qui concerne la lutte contre les maladies suivantes des semences : Phoma lingam, Alternaria brassicae et Sclerotinia sclerotiorum ; - le maïs, en ce qui concerne la lutte contre les maladies des semences : (Rhizopus sp., Penicillium sp., Trichoderma sp., Aspergillus sp. Et Gibberellafujikuroï) ; - le lin, en ce qui concerne la lutte contre la maladie des semences : Alternaria linicola ; - les arbres forestiers, en ce qui concerne la lutte contre les fontes de semis (Fusarium

oxysporum, Rhizoctonia solani) ; - le riz en ce qui concerne la lutte contre les maladies suivantes des parties aériennes : la pyriculariose (Magnaporthe grisea), le rhizoctone (Rhizoctonia solani) ; - les cultures légumières en ce qui concerne la lutte contre les maladies suivantes des semis ou des jeunes plants issus de semences : les fontes de semis et les nécroses du collet

(Fusarium oxysporum, Fusarium roseum, Rhizoctonia solani, Pythium sp.) ; - les cultures légumières en ce qui concerne la lutte contre les maladies suivantes des parties aériennes : la pourriture grise (Botrytis sp. ), les oïdiums (notamment Erysiphe cichoracearum, Sphaerothecafuliginea, Leveillula taurica), les fusarioses (Fusarium oxysporum, Fusarium roseum), les cladosporioses (Cladosporium sp.), les alternarioses

(Alternaria sp.), les anthracnoses (Colletotrichum sp.), les septorioses (Septoria sp.), le rhizoctone (Rhizoctonia solani), les mildious (par exemple Bremia lactucae, Peronospora sp., Pseudoperonospora sp, Phytophthora sp) ;

- les arbres fruitiers en ce qui concerne les maladies des parties aériennes : la moniliose (Monilia fructigenae, M/ laxa), la tavelure (Venturia inaequalis), l'oïdium (Podosphaera leucotricha) ; - la vigne en ce qui concerne les maladies du feuillage : notamment la pourriture grise (Botrytis cinerea), l'oïdium (Uncinula necator), le black-rot (Guignardia biwelli), le mildiou (Plasmopara viticola) ;

- la betterave en ce qui concerne les maladies suivantes des parties aériennes : la cercosporiose (Cercospora beticola), l'oïdium (Erysiphe beticola), 1a ramu1ariose (Ramularia beticola).

L'acétohydroxyacide isoméroréductase est une enzyme bien caractérisée que l'on retrouve chez les plantes et les microorganismes (bactéries, levures, champignons). Les procédés de la présente invention mettent en oeuvre des l'inhibiteurs de l'acétohydroxyacide isoméroréducatase. Dans un premier mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation d'inhibiteurs de l'acétohydroxyacide isoméroréductase de champignon, plus préférentiellement d'inhibiteurs de l'acétohydroxyacide isoméroréductase de champignon phytopathogène pour le traitement des maladies fongiques des cultures. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, les inhibiteurs de l'acétohydroxyacide isoméroréductase inhibent l'acétohydroxyacide isoméroréductase de Magnaporthe grisea et/ou de Saccharomyces cerevisiae et/ou de Neurospora crassa. Dans un autre mode de réalisation particulier, l'inhibiteur de l'acetohydroxyacide isoméroréductase est un inhibiteur de l'activité enzymatique de l'acétohydroxyacide isoméroréductase de la SEQ ID No. l, de la SEQ ID No. 2, de la SEQ ID No. 3 et/ou de la SEQ ID No. 5.

Tout inhibiteur de l'acétohydroxyacide isoméroréductase peut être utilisé dans les procédés selon l'invention. Des inhibiteurs de l'acétohydroxyacide isoméroréductase sont bien connues de l'homme du métier et ces inhibiteurs ont notamment été décrits dans EP106114 ; US4,594, 098, EP196026, EP481407, WO 94/23063, CA2002021 et WO 97/37660.

Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, l'inhibiteur de l'acetohydroxyacide isoméroréductase est un analogue d'intermédiaire de réaction se fixant au site actif de l'acétohydroxyacide isoméroréductase.

Préférentiellement, l'inhibiteur de l'acétohydroxyacide isoméroréductase est le diméthylphosphinoyl-2-hydroxyacétate.

Plus préférentiellement, l'inhibiteur de l'acétohydroxyacide isoméroréductase est le N-hydroxy-N-isopropyloxamate.

Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, l'inhibiteur de l'acetohydroxyacide isoméroréductase est sous la forme d'une composition fongicide.

L'invention concerne aussi des compositions fongicides comportant une quantité efficace d'au moins un inhibiteur de l'acétohydroxyacide isoméroréductase. Les compositions fongicides selon l'invention comprennent, outre l'inhibiteur, les supports solides ou liquides, acceptables en agriculture et/ou les agents tensioactifs également acceptables en agriculture.

En particulier sont utilisables les supports inertes et usuels et les agents tensioactifs usuels.

Ces compositions fongicides selon l'invention peuvent contenir aussi toute sorte d'autres ingrédients tels que, par exemple, des colloïdes protecteurs, des adhésifs, des épaississants, des agents thixotropes, des agents de pénétration, des stabilisants, des séquestrants, etc...

Plus généralement les inhibiteurs de l'acétohydroxyacide isoméro-réducatse peuvent être combinés à tous les additifs solides ou liquides correspondant aux techniques habituelles de la mise en formulation.

La présente invention a également pour objet des compositions fongicides comprenant un inhibiteur de l'acétohydroxyacide isoméroréductase et un autre composé fongicide. Les mélanges avec d'autres fongicides sont particulièrement avantageux, notamment les mélanges avec l'acibenzolar-S-methyl, l'azoxystrobin, le benalaxyl, le benomyl, la blasticidin-S, le bromuconazole, le captafol, le captane, le carbendazim, la carboxine, le carpropamide, le chlorothalonil, les compositions fongicides à base de cuivre ou de dérivés du cuivre tels que l'hydroxide de cuivre ou l'oxychloride de cuivre, le cyazofamide, le cymoxanil, le cyproconazol, le cyprodinyl, le dichloran, le diclocymet, le dicloran, le diethofencarb, le difenoconazole, le diflumetorim, le dimethomorph, le diniconazole, le discostrobin, le dodemorph, la dodine, l'edifenphos, l'epoxyconazole,

l'ethaboxam, l'ethirimol, la famoxadone, la fenamidone, le fenarimol, le fenbuconazole, le fenhexamid, le fenpiclonil, la fenpropidine, le fenpropimorph, la ferimzone, le fluazinam, le fludioxonil, le flumetover, le fluquinconazole, le flusilazole, le flusulfamide, le flutolanil, le flutriafol, le folpet, le furalaxyl, le furametpyr, la guazatine, l'hexaconazole, l'hymexazol, l'imazalil, l'iprobenphos, l'iprodione, l'isoprothiolane, la kasugamycin, le kresoxim-methyl, le mancozeb, le maneb, le mefenoxam, le mepanipyrim, le metalaxyl et ses entiomères tels que le metalaxyl-M, le metconazole, le metiram-zinc, la metominostrobin, l'oxadixyl, le pefurazoate, le penconazole, le pencycuron, l'acide phosporique et ses dérivés tels que le fosetyl-Al, la phthalide, la picoxystrobine, le probenazole, le prochloraz, la procymidone, le propamocarb, le propiconazole, la pyraclostrobin, le pyrimethanil, le pyroquilon, le quinoxyfen, le silthiofam, le simeconazole, la spiroxamine, le tebuconazole, le

tetraconazole, le thiabendazole, la thifluzamide, le thiophanate, e. g. thiophanate-methyl, le thiram, le triadimefon, le triadimenol, le tricyclazole, le tridemorph, la trifloxystrobine, le triticonazole, les dérivés de la valinamide tels que par exemple l'iprovalicarb, la vinclozoline, le zineb et le zoxamide. Les mélanges ainsi obtenus ont un spectre d'activité plus large. Les compositions selon l'invention peuvent également comprendre un ou plusieurs insecticides, bactéricides, acaricides ou des phéromones ou d'autres composés ayant une activité biologique.

La présente invention a également pour objet des procédés de fabrication d'une composition fongicide utilisant un inhibiteur de l'acétohydroxyacide isoméroréductase.

La présente invention a également pour objet des procédés pour la préparation de composés fongicides comprenant l'identification de composés inhibant l'activité enzymatique de l'acétohydroxyacide isoméroréductase.

La réaction enzymatique est effectuée en présence du composé à tester pour mesurer l'inhibition de l'activité enzymatique de l'acétohydroxyacide isoméroréductase. Tous les tests biochimiques permettant de mesurer l'activité enzymatique de l'acétohydroxyacide isoméroréductase et donc d'identifier des composés inhibant cette activité enzymatique peuvent être utilisés dans les procédés selon l'invention. Ces tests biochimiques sont bien connus de l'homme du métier (Dumas et al., Biochem. J 288 : 865-874, 1992 ; Dumas et al., Biochem. J. 301 : 813-820, 1994 ; Dumas et al., Febs Letters 408 : 156-160, 1997, Halgand et al., Biochemistry 37 : 4773-4781, 1998, Wessel et al., Biochemistry 37 : 12753-12760, 1998 ; Halgand et al., Biochemistry 38 : 6025-6034, 1999).

Les réactions enzymatiques sont avantageusement effectuées en solution dans un tampon approprié. L'utilisation de ce type de milieu réactionnel permet de faire un grand nombre de réactions en parallèle et donc de tester un grand nombre de composés dans un format microplaque par exemple.

De manière préférée, les procédés d'identification de composés inhibant l'activité enzymatique de l'acétohydroxyacide isoméroréductase comprennent la mise en contact de ces composés avec l'acétohydroxyacide isoméroréductase en présence de magnésium, de NADPH et de substrat ; et la mesure de cette activité enzymatique.

Avantageusement, dans les procédés selon l'invention, la mesure de l'activité enzymatique comprend la mesure de la décroissance d'absorption du NADPH à 340 nm et le substrat utilisé pour la réaction enzymatique est le 2S-2-acétolactate (AL) ou le 2S-2-acéto- 2-hydroxybutyrate (AHB). Il est entendu que toute autre méthode de mesure de l'activité

enzymatique connue de l'homme du métier pourra être utilisée dans les procédés selon l'invention.

Toute acétohydroxyacide isoméroréductase peut être utilisée dans les procédés selon l'invention. Les acétohydroxyacide isoméroréductases ont été caractérisées chez plusieurs organismes tels que les plantes, les bactéries, les levures et les champignons. Les gènes correspondants ont été clonés permettant de déterminer la séquence protéique de cette enzyme (Dumas et al., Biochem. J 277 : 69-475, 1991 ; Curien et al., Plant Mol. Biol. 21 : 717- 722,1993 ; Dumas et al., Biochem. J 294 : 821-828,1993 ; Biou et al., EMBO J 16 : 3405- 3415,1997 ; Dumas et al., Biochemistry 34 : 6026-6036,1995 ; Dumas et al., Accounts of Chemical Research 34 : 399-408,2001 ; Sista et al., Gene, 120 : 115-118,1992 ; Zelenaya- Troitskaya et al., EMBO J 14 : 3268-3276,1995).

Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, l'acétohydroxyacide isoméroréductase utilisée dans les procédés selon l'invention est représentée à la SEQ ID No. 1, à la SEQ ID No. 2, de la SEQ ID No. 3 et/ou à la SEQ ID No. 5.

De préférence, l'acétohydroxyacide isoméroréductase est isolée, purifiée ou partiellement purifiée de son environnement naturel. L'acétohydroxyacide isoméroréductase peut être préparée au moyen de différents procédés. Ces procédés sont notamment la purification à partir de sources naturelles telles que des cellules exprimant naturellement ces polypeptides, la production de polypeptides recombinants par des cellules hôtes appropriées et leur purification ultérieure, la production par synthèse chimique ou, enfin, une combinaison de ces différentes approches. Ces différents procédés de production sont bien connus de l'homme du métier.

Dans un premier mode de réalisation de l'invention, l'acétohydroxyacide isoméroréductase est purifiée à partir d'un organisme produisant naturellement cette enzyme comme par exemple les bactéries telle que E. coli, les levures telles que S. cerevisiae, ou les champignons tels que N. crassa ou Mgrisea.

Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, l'acétohydroxyacide isoméroréductase est surexprimée dans un organisme hôte recombinant. Les méthodes d'ingénierie des fragments d'ADN et l'expression de polypeptides dans des cellules hôtes sont bien connues de l'homme du métier et ont par exemple été décrites dans"Current Protocols in Molecular Biology" Volumes 1 et 2, Ausubel F. M. et al, publiés par Greene Publishing Associates et Wiley-Interscience (1989) ou dans Molecular Cloning, T. Maniatis, E. F. Fritsch, J. Sambrook (1982).

Préférentiellement, les procédés d'identification de composés inhibant l'activité enzymatique de l'acétohydroxyacide isoméroréductase comprennent l'expression de l'acétohydroxyacide isoméroréductase dans un organisme hôte, la purification de

l'acetohydroxyacide isoméroréductase produite par l'organisme hôte, la mise en contact de ces composés avec l'acetohydroxyacide isoméroréductase purifiée en présence de magnésium, de NADPH et de substrat ; et la mesure de l'activité enzymatique.

Dans un mode de réalisation préféré, tous ces procédés comprennent une étape supplémentaire dans laquelle on détermine si lesdits composés inhibant l'activité enzymatique de l'acétohydroxyacide isoméroréductase inhibent la croissance et/ou la pathogénie des champignons.

La présente invention concerne donc des procédé pour identifier des composés inhibant la croissance et/ou la pathogénie des champignons en inhibant l'activité enzymatique de l'acétohydroxyacide isoméroréductase. Ces procédés consistant à soumettre un composé, ou un mélange de composés, à un test approprié pour l'identification des composés inhibiteurs de l'acétohydroxyacide isoméroréductase et à sélectionner les composés réagissant de manière positive audit test, le cas échéant à les isoler, puis à les identifier.

De manière préférentielle, le test approprié est un test de l'activité enzymatique de l'acétohydroxyacide isoméroréductase tel que défini ci-dessus.

De manière préférée, un composé identifie selon ces procédés est ensuite testé pour ces propriétés anti-fongiques et pour sa capacité à inhiber la pathogénie et/ou la croissance du champignon pour les plantes selon des méthodes connues de l'homme du métier.

Préférentiellement, le composé est évalué à l'aide de tests phénotypiques tels que des essais de pathogénie sur feuilles ou sur plantes entières.

Par composé on entend selon l'invention tout composé chimique ou mélange de composés chimiques, y compris les peptides et les protéines.

Par mélange de composés on comprend selon l'invention au moins deux composés différents, comme par exemple les (dia) stéréoisomères d'une molécule, des mélanges d'origine naturelle issus de l'extraction de matériel biologique (plantes, tissus végétaux, culture bactériennes, cultures de levures ou de champignons, insectes, tissus animaux, etc.) ou des mélanges réactionnels non purifiés ou purifiés totalement ou en partie, ou encore des mélanges de produits issus de techniques de chimie combinatoire.

La présente invention concerne enfin de nouveaux composés inhibiteurs de la pathogénie des champignons inhibant l'activité enzymatique de l'acétohydroxyacide

isoméroréductase, notamment les composés identifiées par les procédés selon l'invention et/ou les composés dérivés des composés identifiés par les procédés selon l'invention.

De manière préférentielle, les composés inhibiteurs de la pathogénie des champignons inhibant l'activité enzymatique de l'acétohydroxyacide isoméroréductase ne sont pas des inhibiteurs généraux d'enzymes. De manière également préférentielle, les composés selon l'invention ne sont pas des composés déjà connus pour avoir une activité fongicide et/ou une activité sur la pathogénie des champignons.

L'invention a également pour objet un procédé pour traiter des plantes contre un champignon phytopathogène caractérisé en ce qu'il comprend le traitement desdites plantes avec un composé identifié par un procédé selon l'invention.

La présente invention concerne également un procédé de préparation d'un composé inhibiteur de la pathogénie des champignons, ledit procédé comprenant les étapes d'identification d'un composé inhibant la pathogénie des champignons inhibant l'activité enzymatique de l'acétohydroxyacide isoméroréductase par le procédé d'identification selon l'invention, puis de préparation dudit composé identifié par les méthodes usuelles de synthèse chimique, de synthèse enzymatique et/ou d'extraction de matériel biologique.

L'étape de préparation du composé peut être précédée le cas échéant par une étape dite d'optimisation par laquelle on identifie un composé dérivé du composé identifié par le procédé d'identification selon l'invention, ledit composé dérivé étant ensuite préparé par les méthodes usuelles.

Description des figures Figure 1 : Comparaison des séquences protéiques des isoméroréductases de Mgrisea, N crassa

et de la levure S. cerevisiae. Alignementdes séquences à l'aide du logiciel CLUSTAL W (1. 4).

. : acide aminé similaire.

* : acide aminé identique.

Figure 2 : Test de croissance de Mgrisea en présence de l'inhibiteur N-hydroxy-Nisopropyloxamate (IpOHA) et sous différentes conditions de culture.

L'effet de l'inhibiteur IpOHA est testé sur le champignon pathogène M grisea en suivant l'évolution de la croissance de ce champignon en présence de différentes concentrations en inhibiteur, dans différents milieux de culture et sur une période de 7 jours.

200 ul de milieu de culture, milieu minimum (MM) ou milieu minimum + leucine, valine et isoleucine à 0.3 mM (MM + ILV), est inoculé avec une suspension de spores de la souche PI. 2 de M grisea à une concentration finale de 105 spores/ml. La microplaque est incubée

à température ambiante et la densité optique à 630 nm (D0630) est mesurée aux jours 0, 3, 4,5, 6 et 7 (JO, J3, J4, J5, J6 et J7). La densité optique permet une mesure de la croissance mycélienne.

Figure 3 : Influence de la concentration en NADPH sur l'activité enzymatique de

l'isoméroréductase de levure. Les mesures d'activité enzymatique sont réalisées à 25 C dans 1 ml de milieu réactionnel suivant : MgCl210 mM, NADPH de 0 à 175 uM, AHB 0. 48 mM et dans le tampon Hépès de sodium50 mM, pH 7. 5. La courbe est ajustée au modèle de Michaelis Menten. Le KM pour le NADPH est de 1. 6 u. M.

Figure 4 : Influence de la concentration en substrat AHB [A] et AL [B] sur l'activité enzymatique de l'isoméroréductase de levure. Les mesures d'activité enzymatique sont réalisées à 25 C dans le milieu réactionnel suivant : MgCh 10 mM, NADPH 250 uM et dansl ml de tampon Hépès de sodium 50 mM, pH 7.5 et en présence d'AHB [A] et d'AL

[B]. Les courbes sont ajustées au modèle de Michaelis Menten.

A Le KM pour l'AHB est de 104 uM.

B Le KM pour l'AL est de 266 uM.

Figure 5 : Influence de la concentration en magnésium sur l'activité enzymatique de l'isoméroréductase de levure. Les mesures d'activité enzymatique sont réalisées à 25 C dans 1 ml de milieu réactionnel suivant : MgCIz de 0 à 40 mM, NADPH 250 uM, AHB 0. 48 mM et dans le tampon Hépès de sodium 50 mM, pH 7.5.

La courbe est ajustée au modèle de Michaelis Menten. Le KM pour le Mg2+ est de 968 u. M.

Figure 6 : Stoechiométrie de fixation des inhibiteurs Diméthylphosphinoyl-2-hydroxyacétate et N-hydroxy-N-isopropyloxamate sur l'isoméroréductase de levure. Les inhibiteurs Hoe 704 [A] et IpOHA [B] (0.1 nmoles) sont incubés avec des quantités variables d'enzyme (0 à

0. 4 nmoles) pendant 20 minutes à 25 C avec 25 nmoles de NADPH et 0. 25 gnoles de Mg2+ dans un volume de 10 ul. Les mesures d'activité enzymatique sont réalisées à 25 C dans 1 ml de milieu réactionnel suivant : MgCh 10 mM, NADPH 250 uM, AHB 0. 48 mM et dans le tampon Hépès de sodium 50 mM, pH 7.5.

Figure 7 : Cinétiques d'inhibition de l'isoméroréductase de levure en présence des inhibiteurs diméthylphosphinoyl-2-hydroxyacétate [A] et N-hydroxy-N-isopropyloxamate [B]. Les mesures d'activité enzymatique sont réalisées à 25 C dans 1 ml de milieu réactionnel suivant : MgCh 10 mM, NADPH 250 uM, AHB 0.48 mM dans le tampon Hépès de sodium 50 mM, pH 7.5 et en présence d'enzyme à 110 nM.

Les réactions sont initiées en ajoutant simultanément des quantités variables d'inhibiteurs diméthylphosphinoyl-2-hydroxyacétate [A] et N-hydroxy-N-isopropyloxamate [B] (de 2 u. M à 30 RM) dans le milieu réactionnel. Les courbes sont tracées suivant l'équation (1), ce qui permet la détermination des valeurs de Kobs, vitesse apparente de formation du complexe enzyme-inhibiteur.

Figure 8 : Cinétiques d'inhibition de l'isoméroréductase de levure en présence des inhibiteurs diméthylphosphinoyl-2-hydroxyacétate [A] et N-hydroxy-N-isopropyloxamate [B]. Les mesures d'activité enzymatique sont réalisées à 25 C dans 1 ml de milieu réactionnel suivant : MgCh 10 mM ; NADPH 250 uM ; AHB 0.48 mM dans le tampon Hépès de sodium50 mM, pH 7.5 et en présence d'enzyme à 110 nM.

Les réactions sont initiées en ajoutant simultanément des quantités variables d'inhibiteurs [A] et [B] (de 2 uM à 50 kam) dans le milieu réactionnel.

Figure 9 : Détermination de la constante d'association ko du diméthylphosphinoyl-2hydroxyacétate [A] et du N-hydroxy-N-isopropyloxamate [B] sur l'isoméroréductase de levure grâce à la représentation l/Kobs en fonction de la concentration en substrat AHB.

Les mesures d'activité enzymatique sont réalisées à 25 C dans 1 ml de milieu réactionnel suivant : MgCh 10 mM, NADPH 250 uM, AHB de 125uM à 2. 375mM et dans le tampon Hépès de sodium 50 mM, pH 7.5 et en présence d'enzyme à 110 nM. Les réactions sont initiées en ajoutant simultanément des quantités variables de substrat AHB (de 125uM à 2.375mM) et les inhibiteurs [A] (10/lM) et [B] (15) M) dans le milieu réactionnel.

Les courbes sont tracées suivant l'équation (3), ce qui permet la détermination des valeurs de ko, vitesse d'association de l'inhibiteur à l'enzyme.

Exemples

Exemple 1 : Clonage du gène IL de de Ma n Wn porthe grisea
Un fragment interne du gène IL V5 de M grisea a été amplifié par PCR à partir de l'ADN génomique de ce champignon grâce à des couples d'amorces dégénérées correspondant à des domaines protéiques conservés entre les isoméroréductases de champignons. Le produit de PCR obtenu a ensuite été cloné dans le plasmide pGEM-T-Easy (Promega), séquencé et amplifié par PCR avec un nouveau couple d'amorces. Ce dernier produit de PCR a été utilisé comme sonde homologue pour cribler une banque d'ADN cosmidique de M grisea. La séquence du gène IL V5 de M grisea a alors été réalisée à partir

d'un des clones positifs et d'oligonucléotides dérivés de la séquence du produit de PCR déjà obtenu.

1.1. Isolement d'un fragment interne du gène IL VS de M. zrisea par amplification à l'aide d'oligonucléotides dégénérés 1.1. 1 Choix des oligonucléotides dégénérés
L'amplification d'un fragment interne du gène ILV5 de M grisea a été réalisée par PCR à l'aide d'oligonucléotides dégénérés. Ces oligonucléotides dégénérés ont été choisis à partir de la comparaison des séquences protéiques des isoméroréductases de N. crassa et de S. cerevisiae. Cette comparaison a permis de mettre en évidence 4 domaines conservés entre ces deux séquences d'isoméroréductases fongiques, qui devraient être présents dans l'isoméroréductase de M grisea. Ces 4 domaines conservés sont constitués d'une succession d'au moins 7 acides aminés conservés. La séquence des oligonucléotides dégénérés a été déterminée à partir de celle des acides aminés des domaines conservés traduits d'après le code génétique. Afin que le degré de dégénérescence (nombre de codons pour un acide aminé donné) soit le plus faible possible, les acides aminés tels que l'arginine, la leucine, la sérine sont à éviter car six codons leur correspondent. Les acides aminés méthionine et tryptophane sont quant à eux recherchés, puisqu'un seul codon leur correspond. Le degré de dégénérescence doit aussi être faible à l'extrémité 3'de l'oligonucléotide, afin d'augmenter la spécificité de l'amplification. Nous avons pu définir 4 oligonucléotides : les oligonucléotides 1 (+) et 3 (+) sur le brin (+) ; et les oligonucléotides 2 (-) et 4 (-) sur le brin (-) de l'ADN de M grisea. Ainsi, l'amplification PCR peut être effectuée avec quatre couples différents d'oligonucléotides dégénérés : 1 (+) et 2 (-) ; 1 (+) et 4 (-) ; 3 (+) et 2 (-) ; 3 (+) et 4 (-).

1.1. 2. Amplification d'un fragment interne du gène ILS de M. grisea à l'aide d'oligonucléotides dégénérés
Les conditions optimales d'amplification du gène ILV5 de M grisea ont été déterminées en faisant varier le couple d'amorces et leur température d'hybridation. Les 3

premiers cycles d'amplification ont été effectués à une température d'hybridation variable (42 C, 50 C ou 55 C), alors que la température d'hybridation des autres cycles est de 55 C.

Des contrôles positifs ont été réalisés avec l'ADN génomique de N. crassa et de S. cerevisiae dans les mêmes conditions que pour l'ADN génomique de M grisea. A une température d'hybridation de 42 C, les fragments d'ADN de S. cerevisiae ont été amplifiés à la taille attendue soit 590 pb, 610 pb, 440 pb et 470 pb avec les couples d'amorces (1-4),

(1-2), (3-4) et (3-2), respectivement. Les profils d'amplification de l'ADN génomique de S. cerevisiae avec les couples d'amorces (1-4) et (3-2) sont cependant complexes. Pour une température d'hybridation de 50 C, des fragments d'ADN de N. crassa ont été amplifiés à la taille attendue soit 660 pb, 685 pb, 523 pb et 544 pb avec les couples d'amorces (1-4), (1- 2), (3-4) et (3-2), respectivement, bien que les profils d'amplification avec les couples d'amorces (1-4) et (3-4) soient complexes. Les différents couples d'oligonucléotides dégénérés ont permis d'amplifier à partir de l'ADN génomique de levure et de N. crassa un fragment de taille attendue. Ces oligonucléotides dégénérés ont donc pu être utilisés pour amplifier le gène ILV5 de M grisea. La quantité d'oligonucléotides utilisés, testée à une température d'hybridation de 42 C, ne semble pas avoir d'influence sur l'amplification de l'ADN génomique de M grisea. A une température d'hybridation des premiers cycles de PCR de 42 C, les profils d'amplification de l'ADN génomique de M grisea, obtenus avec les différents couples d'amorces sont assez complexes. A une température d'hybridation de 50 C, une simplification des profils d'amplification de l'ADN génomique de M grisea a été observée pour la plupart des couples d'amorces ; en particulier pour le couple d'amorces (1- 2) qui permet d'amplifier un seul fragment d'ADN à la taille attendue (685 pb). Une température d'hybridation des premiers cycles de PCR de 55 C ne permet pas d'augmenter la spécificité de l'amplification avec les couples d'amorces (1-2) et (3-2) et réduit son rendement. Les meilleures conditions d'amplification à partir de l'ADN génomique de M grisea ont donc été obtenues à une température d'hybridation des amorces des premiers cycles de PCR de 50 C, avec le couple d'oligonucléotides (1-2).

1.1. 3. Clonage d'un fragment interne du gène ILV5 de M. grisea amplifié par PCR dans le plasmide pGEM-T-easy
Le fragment interne du gène IL V5 de M grisea a été amplifié par PCR à partir de l'ADN génomique de M grisea, avec le couple d'amorces (1-2), à une température d'hybridation des amorces de 50 C pendant 3 cycles, puis 55 C pour les autres cycles d'amplification. Ce produit de PCR, d'environ 680 pb, est purifié après séparation par électrophorèse sur gel d'agarose puis cloné dans le plasmide pGEM-T-easy. Les colonies bactériennes obtenues après transformation et grâce à un système de sélection blanc/bleu (X-Gal) montraient trois phénotypes différents : blanches, bleues et blanches avec le centre de la colonie bleu (nommées colonies blanc/bleu). 30 colonies de différents phénotypes ont été analysées par PCR en utilisant les amorces universelles Sp6 et T7 qui s'hybrident de part et d'autre du site de clonage du plasmide pGEM-T-easy. Les 20 colonies blanches et les 10 colonies blanc/bleu sont positives. En effet, à partir de ces colonies, un fragment d'ADN a

été amplifié à la taille attendue (810 pb) qui correspond à la taille de l'insert (680 pb) additionné de la distance séparant l'insert de chacune des amorces Sp6 et T7 (129 pb). Deux clones de phénotypes différents, blanc et blanc/bleu, ont alors été choisis afin d'être séquencés. Ce sont les clones n 4 (blanc) et n 20 (blanc/bleu).

1. 1. 4. Analyse de la séquence du fragment interne du gène IL V5 de M. grisea cloné
La comparaison des séquences nucléotidiques des deux clones n 4 et n 20 a montré qu'ils correspondent à un même fragment d'ADN cloné dans des orientations différentes dans le plasmide pGEM-T-easy, ce qui pourrait expliquer leur différence phénotypique (blanc et blanc/bleu). La séquence nucléotidique double brin de ce fragment cloné a ainsi été obtenue. L'homologie de cette séquence nucléotidique avec celles codant pour des protéines connues a été recherchée grâce au programme Blastx de NCBI (National Center for Biotechnology Information). Ce programme compare les séquences traduites des six phases de lecture d'une séquence nucléotidique à l'ensemble des séquences protéiques contenues dans les bases de données. Une homologie significative entre la séquence nucléotidique du fragment cloné et la séquence protéique de l'isoméroréductase de N. crassa (erreur de e- 102) a été identifiée. Le pourcentage d'identité en acides aminés au sein de région définie

par le logiciel pour comparer ces deux séquences est de 94 %. Le fragment cloné dans le plasmide pGEM-T-easy correspond donc au fragment interne du gène ILV5 de M grisea. Bien que la séquence du fragment interne du gène IL V5 de M grisea et celle du gène IL V5 de N. crassa présentent une forte homologie, une différence au centre de la séquence du gène IL V5 de M grisea existe. Cette différence pourrait correspondre à la présence d'un intron au sein de la séquence de M grisea, puisqu'un intron de 77 pb existe chez N. crassa à cette position. La position et la séquence de cet intron ont été recherchées. Un motif consensus d'épissage en 5'a été identifié dans la séquence nucléotidique du fragment interne du gène IL V5 de M grisea, ainsi qu'un motif consensus d'épissage en 3'et une séquence lariat. L'intron putatif (86 pb) du fragment interne du gène ILV5 de M grisea a donc été identifié. L'épissage de l'intron de la séquence du fragment interne du gène ILV5 de M grisea permet d'obtenir un fragment d'ADNc"théorique". Le fragment de la séquence protéique de l'isoméroérductase de M grisea alors déduit de cet ADNc "théorique", a été comparé avec celle de l'isoméroréductase de N. crassa, montrant une très forte identité entre les séquences primaires de ces deux enzymes (figure 1).

1. 2. Criblage d'une banque cosmidique de M. grisea avec une sonde du gène IL de M. grisea 1. 2. 1. Construction de la sonde homologue du gène IL V5 de M. grisea
Un fragment interne du gène IL de M. grisea a été amplifié par PCR, à partir du clone n 4, à l'aide des amorces 13U et 549L définies à partir de la séquence du gène IL V5 cloné dans le plasmide pGEM-T-easy. Ce fragment, après purification sur gel d'agarose, a été utilisé comme matrice pour réaliser une sonde du gène IL V5 marquée.

1.2. 2. Criblage de la banque cosmidique Guyll de M. grisea par PCR à l'aide d'amorces spécifiques du gène IL de M. grisea
La banque cosmidique Guyl 1 est représentée sous forme de 28 pools de 96 minipréparations d'ADN correspondant aux 96 cosmides différents présents dans une plaque 96 puits (2688 clones). Le gène ILV5 de M grisea a été recherché dans cette banque cosmidique en réalisant une amplification PCR sur ces pools de minipréparations d'ADN à

l'aide des amorces 300U et 549L définies à partir de la séquence connue du gène IL V5. Un fragment de taille attendue (249 pb) a été amplifié à partir des pools n 17 ; 19 ; 20 ; 21 ; 27 ; 28 et 29. La recherche du gène IL V5 a été poursuivie en hybridant avec la sonde du gène IL V5 les cosmides des plaques n 17 ; 19 ; 20 ; 21 ; 27 ; 28 et 29. 1.2. 3. Criblage de la banque cosmidique Guyll de M. grisea par hybridation avec la sonde homologue du gène IL V5 de M. grisea

Les colonies bactériennes issues des plaques n 17 ; 19 ; 20 ; 21 ; 27 ; 28 et 29 ont été répliquées sur membranes de Nylon et hybridées avec la sonde du gène IL V5 de M grisea.

Cette hybridation a permis de sélectionner les cosmides G6 et A7 des plaques n 20 et 27, respectivement et les cosmides B5 et B6 de la plaque n 29.

1. 2. 4. Caractérisation du gène ILV5 de M. grisea à partir du cosmide 20/G6 a) Séquençage du gène/L de MgHa à partir du cosmide 20/G6
Le séquençage du gène IL V5 a été effectué par étapes. La première réaction de séquence a été réalisée à l'aide d'amorces divergentes choisies à partir de la séquence connue du fragment interne du gène IL V5 de M grisea obtenu par PCR. A partir de cette nouvelle séquence du gène IL V5, de nouvelles amorces ont été définies pour réaliser d'autres réactions de séquence et ceci jusqu'à ce que le gène IL V5 de M grisea ait été entièrement séquencé. Les séquences traduites à partir la séquence nucléotidique entière du gène IL V5 selon les 6 phases de lecture sont comparées avec la séquence protéique de l'isoméroréductase de N. crassa, afin de repérer la position de l'ATG initiateur de la traduction, du codon STOP de terminaison de la traduction, et des différents introns

possibles. Ainsi, l'ATG initiateur de la traduction a été identifiée sur la séquence nucléotidique du gène IL V5 et sert de référence (+1) à partir de laquelle les autres éléments de la séquence sont positionnés. Trois introns putatifs ont été repérés dans la séquence nucléotidique du gène IL V5 de M grisea. Le premier intron serait localisé entre les positions (en pb) 199 et 280, le deuxième intron en position 314-390 et le troisième intron serait situé entre les positions 670 et 755 du gène IL V5 de M grisea. Le codon STOP de terminaison de la traduction serait en position 1449 de la séquence du gène IL V5 de M

grisea. L'isolement de l'ADNc du gène IL V5 de M grisea a été entrepris, afin de vérifier la position des introns suspectés par la comparaison des séquences protéiques de M grisea et de N. crassa. b) Isolement de l'ADNc du gène ILV5 de M. grisea et recherche des introns du gène de M. grisea
L'ADNc du gène IL de M gn-sa a été isolé en réalisant une amplification PCR à partir d'une banque d'ADNc de l'isolat P1. 2 (ARN de mycélium cultivé en milieu complet) à l'aide des oligonucléotides définis à partir de la séquence du gène IL V5 : les oligonucléotides 22U et 1603L. L'oligonucléotide 22U est situé avant l'ATG initiateur de la traduction et l'oligonucléotide 1603L est situé 93 pb après le codon STOP de terminaison de la traduction. Deux fragments sont amplifiés avec ce couple d'amorces : un fragment de taille inférieure à 500 pb et un fragment amplifié à la taille attendue soit 1.6 kb. Le fragment amplifié à la taille attendue est purifié après séparation par électrophorèse sur gel d'agarose et cloné dans le plasmide pGEM-T-easy. Les 24 colonies bactériennes obtenues après transformation sont analysées par PCR à l'aide du couple d'amorces 22U et 1603L. Ces 24 clones possèdent l'ADNc du gène/LK de M grisea, car un fragment d'ADN a en effet été amplifié à la taille attendue (1.6 kb). Le clone n 18 a été choisi afin d'être séquencé à l'aide des amorces universelles Sp6 et T7. La comparaison de la séquence nucléotidique de l'ADNc et du gène IL V5 nous a permis de déterminer la position exacte des introns. Les trois introns sont localisés aux positions prédites par la comparaison des séquences protéiques des isoméroréductases de N. crassa et des traductions du gène IL V5 de M grisea.

Chez N. crassa, le gène IL possède 4 introns positionnés différemment et de longueurs différentes par rapport au gène IL V5 de M grisea. c) Séquence protéique de l'isoméroréductase de M. grisea déduite de l'ensemble des données acquises sur le gène ILV5 de M. grisea
La séquence protéique du gène IL V5 de M grisea a été déduite de la séquence de l'ADNc de ce gène. La comparaison des séquences protéiques des isoméroréductases de M

grisea, de N. crassa et de S. cerevisiae montre une très forte identité entre les isoméroréductases de ces trois espèces. En effet, le pourcentage d'identité entre les séquences des isoméroréductases de M grisea et de N. crassa est de 86 %. Celui entre les isoméroréductases de M grisea et de levure est de 70 % et celui entre les isoméroréductases

de N. crassa et de levure est de 72 % (figure 1). N. crassa et M grisea sont des espèces fongiques très proches (pyrenomycètes), ce qui pourrait expliquer le pourcentage d'identité élevé entre les isoméroréductases de ces deux espèces. d) Etude de l'expression de l'isoméroréductase de M. grisea chez ce champignon soumis à différentes conditions de stress
Les ARN totaux de M grisea provenant de mycélium soumis à différentes conditions de stress ont été extraits puis transférés sur membrane avant d'être hybridés avec la sonde homologue du gène IL de M grisea. Le gène IL V5 est exprimé de façon constitutive. Il est ainsi exprimé au même niveau lors d'un stress hyperosmotique ou d'une carence nutritionnelle azotée ou d'une induction par l'AMPc, d'un choc thermique ou d'un stress oxydatif. Il n'est cependant pas exprimé lors d'une carence nutritionnelle carbonée.

Exemple 2 : Disruption du gène IL V5 de Magnaporthe grisea ,,, porthe glis
Après l'isolement et la caractérisation du gène IL V5, l'objectif était d'obtenir des mutants du gène IL V5 de M grisea pour tester leur pouvoir pathogène. La technique utilisée pour disrupter le gène IL V5 est la mutagenèse insertionnelle par transposition in vitro.

2.1. Sous-clonage du f ! ène IL V5 de M. grisea dans le plasmide pBC SK +
Le sous-clonage du gène IL V5 est réalisé dans le plasmide pBC SK + avant la mutagenèse insertionnelle par transposon. Le cosmide 20/G6 contenant le gène IL V5 est porteur d'un gène de résistance à l'ampicilline, il ne peut donc pas être utilisé directement comme cible pour la mutagenèse insertionnelle. En effet, une double sélection par la kanamycine et l'ampicilline ne serait pas assez sélectifs des plasmides cibles ayant intégré le

u transposon, car le plasmide donneur de transposon (pGPS3 HygroR) est également résistant à la kanamycine et à l'ampicilline. Le gène IL V5 a donc été sous-cloné dans un plasmide porteur d'un gène de résistance au chloramphénicol, le plasmide pBC SK+. Les clones ayant intégré le transposon au niveau du plasmide cible (pBC SK+ porteur du gène IL V5) pourront être sélectionnés pour leur double résistance à la kanamycine et au chloramphénicol. De plus, la taille de l'insert cosmidique est trop importante (40 kb). Nous avons choisi un fragment d'environ 15 kb contenant le gène ILV5 sous-cloné dans le plasmide pBC SK+. En effet, la probabilité que le transposon s'intègre dans le gène ILV5 est plus importante

lorsque la taille du fragment portant le gène IL V5 est réduite. La longueur du gène IL V5 est d'environ 3 kb, la probabilité que le transposon s'intègre dans le gène présent au niveau du cosmide (46 kb) est de 6.5 %, alors que la probabilité d'intégration du transposon dans le gène IL V5 sous-cloné dans le plasmide pBC SK+ (18 kb) est environ 3 fois plus élevée, soit environ 17 %. Le sous-clonage du fragment d'ADN génomique portant le gène IL V5 a été réalisé en positionnant ce gène au centre de l'insert. Ce type de construction facilite l'intégration du gène ILV5 muté dans le génôme de M grisea par recombinaison homologue. La cartographie de la région du cosmide 20/G6 portant IL V5 a permis de choisir un fragment ClaI-ClaI de 15 kb dans lequel le gène ILV5 est relativement bien centré. En effet, le gène ILV5 est encadré en 5'par 5 kb de la séquence génomique et en 3'par 5.5 kb.

Après digestion du cosmide 20/G6 par Clal, le fragment de 15 kb contenant le gène IL V5 a été purifié après séparation sur gel d'agarose et sous cloné dans le plasmide pBC SK +. 24 colonies obtenues après transformation ont été analysées par PCR à l'aide du couple d'amorces 22U et 1603L spécifiques du gène ILV5. Les 5 clones amplifient un fragment à la taille attendue (1.6 kb) possèdent le gène IL V5. Le clone n 19 a été choisi pour réaliser la mutagenèse insertionnelle par transposition in vitro du gène IL V5.

2.2. Mutagenèse insertionnelle par transposition in vitro du gène IL V5 de M. grisea

La mutagenèse insertionnelle par transposition in vitro du gène IL V5 de M grisea a été réalisée avec le kit GAPS (New England Biolabs) à partir du clone n 19. Le plasmide R pGPS3 HygroR, qui porte un gène de résistance à la kanamycine et à l'hygromycine au niveau du transprimer, est utilisé comme donneur de transposon. Le plasmide pBC SK +, porteur du gène IL V5 et du gène de résistance au chloramphénicol, correspond au plasmide cible. Une fois la mutagenèse insertionnelle réalisée, des bactéries DH5a thermocompétentes ou des bactéries DH10B électrocompétentes sont transformées avec le "mélange de mutagenèse". Après transformation, les clones bactériens possédant une intégration du transposon au niveau du plasmide cible pBC SK + sont sélectionnés grâce à leur résistance à la fois à la kanamycine et au chloramphénicol. Cette double résistance pourrait également être conférée aux clones bactériens possédant à la fois le plasmide cible et le plasmide donneur intacts. Une destruction du plasmide donneur par digestion avec l'enzyme PI-SceI pennet de palier à ce problème. Afin de déterminer si le transposon s'est intégré au niveau du gène IL V5 de M grisea, les clones bactériens sélectionnés sont analysés par PCR à l'aide du couple d'amorces 22U et 1603L, situées de part et d'autre de la région codante du gène ILV5. En effet, lorsque le transposon Tn7 s'insère au niveau du gène ILV5, il n'y a pas d'amplification avec le couple d'amorces 22U et 1603L puisque la

taille du fragment d'ADN situé entre ces 2 amorces est trop élevée pour être amplifiée (4.3 kb). Cette taille correspond à la somme de la taille de la région codante du gène IL VS de M grisea (1.6 kb) et du transposon Tn7 de 2.7 kb. Après transformation des cellules DH5 thermocompétentes, une absence d'amplification a été observée pour 4 colonies (clones

n 3 ; 4 ; 8 ; 18) sur 32 colonies testées (12. 5 %). Ces clones bactériens possèdent donc une insertion du transprimer au niveau du gène ILV. Après transformation des cellules DH10B électrocompétentes, sur 38 colonies testées par PCR, une seule (2.6 %) présente une absence d'amplification (clone n 29). Les clones bactériens n 3 ; 8 ; 18 et 29 ont été séquences à l'aide d'amorces divergentes Tn7L et Tn7R situées à chaque extrémité du transposon, afin de localiser la position exacte du site d'insertion du transposon Tn7 au sein de la séquence du gène Ills. Le transposon s'est intégré 21 pb avant l'ATG pour le clone n 18, 9 pb après

l'ATG pour le clone n 8, 809 pb après l'ATG pour le clone n 3 et 1176 pb après l'ATG pour le clone n 29. Nous avons choisi le clone n 8 pour la transformation de M grisea. En effet, chez ce clone, le transposon s'est intégré au début de la région codante du gène lLV5 de M grisea (+ 9 pb après l'ATG), entraînant une inactivation du gène ILV5.

2. 3. Transformation de la souche P1. 2 de M. grisea par le gène ILV5 de M. grisea disrupté dans sa région codante
L'insert du clone n 8 contenant le gène ILV5 de M grisea disrupté dans sa région codante (9 pb après l'ATG) est ressorti du plasmide par une digestion avec l'enzyme ClaI et purifié sur gel d'agarose. Il correspond à la construction linéarisée. Le plasmide pBC SK +

provenant du clone n 8 non digéré correspond à la construction"circulaire". La transformation des protoplastes de la souche P1. 2. de M grisea est réalisée soit avec 5 ig de la construction linéarisée, soit avec 4 ug de la construction"circulaire". Le témoin positif de transformation est réalisé en utilisant 3 Ilg de plasmide pCB 1003 porteur d'un gène de résistance à l'hygromycine et le témoin négatif est réalisé sans ADN. 62 transformants sont obtenus pour la construction linéarisée et 24 pour la construction"circulaire". Ces 86 transformants ont été repiqués sur milieu complet supplémenté en hygromycine à 120 mg/1 et sur milieu minimum supplémenté en hygromycine à 120 mg/l ou à 60 mg/l. Ce type de repiquage permet d'identifier les transformants ilv5- qui sont auxotrophes pour la leucine, la valine et l'isoleucine et par conséquent qui ne poussent pas sur milieu minimum. 8 transformants seraient auxotrophes sur les 62 (13 %) obtenus avec la construction linéarisée,

alors que 2 transformants sur 24 (8. 3 %) le seraient avec la construction"circulaire". La meilleure efficacité d'obtention de mutants ilv5- avec 1a construction linéarisée par rapport à la construction"circulaire"pourrait s'expliquer par le fait que la recombinaison

homologue est facilitée avec une construction linéarisée. Ces transformants sont repiqués sur milieu"farine de riz"afin de les faire sporuler, puis les spores sont étalées sur milieu complet TNKYE glucose et mises à germer afin de réaliser un isolement monospore. Les monospores sont repiquées sur milieu TNKYE glucose supplémenté en hygromycine à 120 mg/1 afin de purifier les transformants. Une identification des transformants auxotrophes est réalisée en effectuant des repiquages de ces colonies issues de ces monospores sur milieu minimum, sur milieu minimum supplémenté en leucine, en valine et en isoleucine à 0.3 mM et sur milieu complet TNKYE glucose. Ainsi, des transformants génétiquement purifiés et stables ont été obtenus. Sur 10 transformants potentiels auxotrophes pour la leucine, la valine et l'isoleucine, 8 (80 %) se sont révélés effectivement auxotrophes. Les 2 transformants non auxotrophes devaient correspondre à un mélange de populations

génétiquement différentes (ilv5 + et ilv5 *) qui a évolué vers une majorité d'ilv5 + lors de la croissance du transformant sur milieu non sélectif avant purification monospore.

Exemple 3 : Caractérisation phénotypique des transformants ilv5-de de Magnaporthe h grisea auxotrophes pour la leucine, la valine et l'isoleucine et étude de leur pouvoir pathogène 3.1. Effet de la disruption du gène IL V5 sur la croissance et le développement des transformants de M. grisea
Le développement des transformants ilv5-a été testé sur différents milieux de culture. Ainsi, sur milieu minimum nitrate, les transformants ilv5-sont incapables de pousser, alors que leur croissance est possible sur milieu minimum supplémenté en valine, leucine et isoleucine à 0.3 mM. Le développement des transformants ilv5-sur milieu minimum + valine, leucine et isoleucine à 0.3 mM est cependant différent de celui de la souche sauvage P1. 2 de M grisea. Leur croissance est en effet ralentie et leur mycélium est gris-vert, ras et sporulant et non pas aérien comme pour la souche sauvage. La présence de leucine n'est pas nécessaire à la croissance des transformants ilv5-, puisque les résultats obtenus sur milieu minimum supplémenté en isoleucine et valine à 0.3 mM sont identiques à ceux obtenus sur milieu minimum supplémenté en leucine, valine et isoleucine à 0.3 mM.

Le développement des transformants ilv5-sur milieu minimum supplémenté en valine et isoleucine à 0.3 mM peut être amélioré en supplémentant le milieu minimum avec une concentration finale en valine et en isoleucine de 1 mM. Sur milieu complet, les transformants ilv5- présentent un phénotype peu différent de la souche sauvage : leur mycélium est gris-blanc plus ou moins aérien (moins aérien que la souche sauvage). L'ajout

de panthotéine, forme oxydée du panthoténate qui intervient dans la biosynthèse de la leucine, à 1 mg/l au milieu minimum + valine et isoleucine à 0.3 mM n'améliore pas le développement des transformants ilv5-. La sporulation des transformants i1vS- est p1us lente et dix fois moins importante sur milieu gélosé "farine de riz"par rapport à la souche sauvage. La sporulation des transformants ilv5-est presque identique à la souche sauvage lorsque la valine et l'isoleucine sont ajoutées au milieu gélosé "farine de riz"à une concentration finale de 1 mM.

3.2. Tests du pouvoir pathogène des mutants auxotrophes ilv5-sur feuilles d'orge découpées en survie
Les tests du pouvoir pathogène des transformants ilv5-de de grisea ont été réalisés en badigeonnant ou en déposant des gouttes de suspension de spores des transformants à tester sur des feuilles d'orge découpées. Une inoculation est réalisée à l'aide d'un coton tige humide trempé dans une suspension de spores (3. 104 spores/ml en général) et utilisé pour badigeonner les fragments de feuilles d'orge en survie (sur milieu eau gélosée 1 %, kinétine 2 mg/l). L'autre type d'inoculation consiste à déposer des gouttes de 30 l en trois endroits différents de la surface des feuilles d'orge. Les symptômes sont observés après 5 à 9 jours d'incubation à 26 C.

Les lésions provoquées par ces mutants sont de taille plus réduite que pour la souche sauvage et leur nombre est réduit de 75 % (voir tableau 1 ci-dessous).

Tableau 1 : Test du pouvoir pathogène des transformants ilv5-sur feuilles d'orge en survie Nombre de lésions provoquées par les transformants de Mgrisea sur feuilles d'orge ou en test en badigeon, 5 jours après inoculation (L41 et L21) et 7 jours après innoculation (L57, L64, L71, L85).

A) Suspension de spores des transformants préparés à 3. 104 spores. mol-1

<tb>
<tb> Transformants <SEP> Nombre <SEP> moyen <SEP> de <SEP> lésions <SEP> par
<tb> feuille
<tb> L57 <SEP> (ilv5+) <SEP> 4
<tb> L64 <SEP> (ilv5+) <SEP> 4
<tb> L71 <SEP> (ilvS") <SEP> 1 <SEP> (-80%)
<tb> L85 <SEP> (ilvS") <SEP> 1 <SEP> (-80%)
<tb>
B) Suspension de spores des transformants préparés à 105 spores. mol-1

<tb>
<tb> Transformants <SEP> Nombre <SEP> moyen <SEP> de <SEP> lésions <SEP> par
<tb> feuille
<tb> L41 <SEP> (ilv5+) <SEP> 10
<tb> L21 <SEP> (ilv5-) <SEP> 2 <SEP> (-80%)
<tb>

Les lésions provoquées par les mutants ilv5-sont en outre atypiques et leur apparition plus tardive. Elles apparaissent après 6 à 9 jours d'incubation à 26 C, contre 4 à 9 jours pour la souche sauvage (voir tableau 2 ci-dessous).

Certaines lésions provoquées par les transformants ilv5'apparaissent aux extrémités des feuilles d'orge (tableau 2). Des blessures au niveau des extrémités des feuilles pourraient expliquer ces lésions, car elles pourraient faciliter la pénétration du champignon. Des tests du pouvoir pathogène sur plante entière ont par conséquent été réalisés, afin d'une part de confirmer l'existence d'une réduction du pouvoir pathogène des transformants ilv5-et d'autre part d'estimer la réduction de la pathogénie des mutants ilv5-et l'importance des blessures pour la pénétration du champignon ilv5-.

Tableau 2 : Evolution des symptômes provoqués par les transformants de Mgrisea sur feuilles d'orge en survie

<tb>
<tb> Test <SEP> en <SEP> gouttes <SEP> Test <SEP> en <SEP> badigeon
<tb> Transformants
<tb> 4ème <SEP> jour <SEP> 9ème <SEP> jour <SEP> 4ème <SEP> jour <SEP> 9ème <SEP> jour
<tb> Absence <SEP> de <SEP> Lésions <SEP> Absence <SEP> de <SEP> Absence <SEP> de <SEP> lésion <SEP> (sauf <SEP> aux
<tb> 1.71 <SEP> (ilv5-)
<tb> lésion <SEP> atypiques <SEP> lésion <SEP> extrémités <SEP> de <SEP> la <SEP> feuille)
<tb> L.73(ilv5- <SEP> Absence <SEP> de <SEP> Quelques <SEP> Absence <SEP> de
<tb> lésion <SEP> rares <SEP> lésions <SEP> lésion
<tb> L85 <SEP> (ilv5-) <SEP> Une <SEP> lésion <SEP> Lésions <SEP> Rares <SEP> lésions <SEP> Rares <SEP> lésions <SEP> atypiques
<tb> atypiques
<tb> Absence <SEP> de <SEP> Lésions <SEP> Absence <SEP> de
<tb> L63 <SEP> (ilv5-) <SEP> Absence <SEP> de <SEP> lésion
<tb> lésion <SEP> atypiques <SEP> lésion
<tb> Lésions <SEP> Lésions <SEP> Quelques
<tb> L64 <SEP> (ilv5+) <SEP> sporulantes <SEP> sporulantes <SEP> lésions <SEP> Lésions <SEP> sporulantes <SEP> grises
<tb> grises <SEP> sporulantes
<tb>

3. 3. Tests du pouvoir pathogène des mutants auxotrophes ilv5-sur plante entière Les tests du pouvoir pathogène des transformants ilv5-ont été réalisés en pulvérisant une suspension de spores (104 et 3. 104 spores. mil'') de ces transformants sur des plants d'orge. De la gélatine à une concentration finale 0.5 % (p/v) est ajoutée à cette suspension de spores pour permettre une meilleure adhésion des spores à la surface des feuilles. Les plantes sont placées une nuit en chambre humide après l'inoculation. Les symptômes sont observés généralement après 5 à 10 jours d'incubation à température ambiante pour l'orge.

Une réduction notable des symptômes de la pyriculariose sur orge est observée chez les transformants ilv5-par rapport au transformant ilv5+. Après 10 jours d'incubation à température ambiante, le nombre de lésions par feuille (d'environ 12 cm) varie de 6 à 9 pour

les transformants ilv5- (L87, L74 et C24) contre 37 en moyenne pour le transformant L57 ilv5+ (voir tableau 3). Le nombre de lésions provoquées par les mutants ilv5-est donc réduit de 80 % par rapport à celui obtenu avec la souche sauvage. De plus, la taille des lésions est deux fois plus petite pour les mutants ilv5-que pour le transformant ilv5+ (6 mm2 contre 13 nun2), et ces lésions apparaissent deux fois plus lentement. En effet, le nombre de lésions a doublé pour les mutants ilv5-entre le 5ème et le 10 ème jour d'expérience, alors qu'il est resté identique pour le sauvage. L'apparition de certaines lésions provoquées par les transformants ilv5-aux extrémités des feuilles d'orge en survie suggéraient que la pénétration du champignon pouvait être facilitée par les blessures infligées aux feuilles d'orge au cours du test de pathogénie. Cependant, les résultats des tests de pathogénie menés sur les transformants ilv5-sur plante entière, montrent clairement une réduction du pouvoir pathogène de ces mutants du même ordre (80 %) que sur feuilles d'orge en survie.

Tableau 3 : Test du pouvoir pathogène des transformants ilv5-sur plante entière (orge)
L'inoculation des plants d'orge a été effectuée en pulvérisant une suspension de spores (3. 104 spores. mr 1) des transformants dont on souhaite tester le pouvoir pathogène. Les plantes ont été placées une nuit en chambre humide après l'inoculation. Les symptômes ont été observés après 10 jours d'incubation à température ambiante. Les pourcentages de réduction du nombre et de la taille des lésions par feuille, calculés par rapport aux valeurs obtenues pour le transformant L57 (ilv5+), sont indiqués entre parenthèses.

Transformants <SEP> Nombre <SEP> moyen <SEP> de <SEP> lésions <SEP> Taille <SEP> moyenne <SEP> des
<tb> par <SEP> feuille <SEP> d'orge <SEP> de <SEP> 12cm <SEP> lésions <SEP> (en <SEP> mm2)
<tb> L57 <SEP> (ilv5+) <SEP> 37 <SEP> 9 <SEP> 13
<tb> L87 <SEP> (ilv5-) <SEP> 9 <SEP> 2 <SEP> (-75%) <SEP> 6 <SEP> (-50%)
<tb> C24 <SEP> (ilv5) <SEP> 6 <SEP> 2 <SEP> (-83 <SEP> %) <SEP> 4 <SEP> (-70 <SEP> %)
<tb> L74 <SEP> (itv5') <SEP> 8 <SEP> 3 <SEP> (-80 <SEP> %) <SEP> 6 <SEP> (-50 <SEP> %)
<tb>

Exemple 4 : Effet fongicide des inhibiteurs de l'acetohydroxy isoméroréductase 4.1 Effet fongicide des inhibiteurs de l'acetohydroxy isoméroréductase sur le champignon phytopathogène Magnaporthe grisea
L'effet fongicide des inhibiteurs dimethylphosphinoyl-2-hydroxyacétate et Nhydroxy-N-isopropyloxamate a été testé sur le champignon pathogène M grisea en suivant

l'évolution de la croissance de ce champignon en présence de différentes concentrations en inhibiteur, sur une période de 7 jours. Ainsi, un milieu de culture donné (milieu minimum nitrate (MM) ; MM + leucine, valine et isoleucine à 0.3 mM ; milieu complet TNKYE glucose (MC) ; MC + leucine, valine et isoleucine à 0.3 mM) est inoculé avec une

suspension de spores de la souche P1. 2 de M grisea à une concentration finale de 105 spores/ml. Une gamme de dilutions du produit à tester, le N-hydroxy-N-isopropyloxamate (à pH 5), est préparée dans de l'eau tel que le produit soit 100 X concentré. 200 al de milieu inoculé sont distribués dans une microplaque 96 puits auxquels sont additionnés 2 jj. l de produit 100X concentré. Le N-hydroxy-N-isopropyloxamate est testé à des doses finales de 3 ; 1 ; 0.3 ; 0.1 ; et 0.03 flM en milieux minimums et 3 et 0.3 uM en milieux complets. La microplaque est incubée à température ambiante et la lecture de la densité optique à 630 nm de cette microplaque permet de suivre la croissance du champignon dans ces différentes conditions de culture aux temps 0 (début du test) et aux jours 3,4, 5,6 et 7.

Ce test a été réalisé en inoculant différents milieux de culture avec une suspension de spores de la souche sauvage PI. 2 de M grisea. Les premières expériences ont été réalisées en milieu minimum nitrate (MM) et différentes concentrations en inhibiteur ont été testées.

Il faut attendre le 6ème et le 7ème jour de croissance avant de voir apparaître une inhibition significative de la croissance en milieu MM en présence de diméthylphosphinoyl-2hydroxyacétate à 2 mM. La croissance est en effet réduite de 50 % par rapport à celle du témoin sans inhibiteur. En présence de l'inhibiteur N-hydroxy-N-isopropyloxamate (0.3 à 1 uM), dès le 3ème jour, une inhibition d'environ 50 % de la croissance du champignon est observée en milieu MM. L'inhibition plus importante de la croissance de M grisea par le Nhydroxy-N-isopropyloxamate par rapport au diméthylphosphinoyl-2-hydroxyacétate nous a amené à approfondir l'étude de cet inhibiteur.

Des tests de croissance du champignon M grisea ont été effectués sur une période de 7 jours, en présence de l'inhibiteur N-hydroxy-N-isopropyloxamate (à des concentrations variant de 0. 03 uM à 3 uM) dans différents milieux (MM et MM supplémenté en leucine, valine et isoleucine à 0.3 mM). En milieu minimum, le N-hydroxy-N-isopropyloxamate inhibe fortement la croissance de M grisea. Cette inhibition de croissance par le Nhydroxy-N-isopropyloxamate (dès 0.3 flM) est observée à partir du 3ème jour de croissance, et reste similaire les jours suivants (Figure 2). Nous avons donc choisi de calculer la Dingo (concentration en inhibiteur telle que l'inhibition de la croissance du champignon est de 80 %) et la DIso (concentration en inhibiteur telle que l'inhibition de la croissance est de 50 %) au 5ème jour de croissance. Ainsi, la croissance du champignon M grisea est réduite de 80 %

par rapport au témoin non traité, à une concentration en N-hydroxy-N-isopropyloxamate de 1 uM (DIgo). Une concentration en N-hydroxy-N-isopropyloxamate de 0. 3 uM (DIo) inhibe la croissance du champignon de 50 % (tableau 4).

Tableau 4 : Etude de l'effet de l'inhibiteur N-hydroxy-N-isopropyloxamate sur la croissance du champignon M grisea

<tb>
<tb> N-hydroxy-N-
<tb> 0
<tb> isopropvloxamate <SEP> 0. <SEP> 03 <SEP> 0.1 <SEP> 0. <SEP> 3 <SEP> 1 <SEP> 3
<tb> (témoin)
<tb> en <SEP> M
<tb> Milieu <SEP> Minimum
<tb> 100 <SEP> 92 <SEP> 89 <SEP> 72 <SEP> 56 <SEP> 13
<tb> (MM)
<tb> MM+ILV <SEP> 100 <SEP> 77.5 <SEP> 83.5 <SEP> 81 <SEP> 72.5 <SEP> 71.5
<tb>

L'effet de l'inhibiteur N-hydroxy-N-isopropyloxamate a été testé sur le champignon pathogène M grisea en suivant l'évolution de la croissance de ce champignon en présence de différentes concentrations en inhibiteur, dans différents milieux de culture et sur une période de 7 jours. Les valeurs données dans le tableau correspondent aux pourcentages moyens de croissance du champignon M grisea obtenus au 5ème jour de croissance à partir de deux essais. Le témoin (souche sauvage de M grisea) correspond à un taux de croissance de 100 %. 200 ul de milieu de culture, milieu minimum (MM) ou milieu minimum + leucine, valine et isoleucine à 0.3 mM (MM + ILV), ont été inoculé avec une suspension de spores de la souche PI. 2 de M grisea à une concentration finale de 105 spores. mol-1. La microplaque a été incubée à température ambiante et la densité optique à 630 nm (D0630) a été mesurée aux jours 0,3, 4,5, 6 et 7 (JO, J3, J4, J5, J6 et J7).

En supplémentant le milieu minimum en valine, leucine et isoleucine à 0.3 mM, la toxicité du N-hydroxy-N-isopropyloxamate sur la croissance du champignon M grisea est levée, quelle que soit la concentration de N-hydroxy-N-isopropyloxamate utilisée. Cette levée de toxicité du N-hydroxy-N-isopropyloxamate par l'addition de valine, de leucine et d'isoleucine au milieu minimum montre que cette toxicité provient d'une inhibition spécifique de la voie de biosynthèse de ces acides aminés, en inhibant l'isoméroréductase.

En effet, le N-hydroxy-N-isopropyloxamate agissant spécifiquement sur l'isoméroréductase de M grise a, inhibe fortement la croissance de M grisea à très faibles

-. concentrations. L'isoméroréductase et l'inhibiteur N-hydroxy-N-isopropyloxamate se révèlent être un bon couple cible/fongicide.

Nous avons aussi cherché à déterminer si l'inhibiteur N-hydroxy-Nisopropyloxamate avait un effet sur la germination des spores de M grisea. Une observation microscopique des spores de M grisea au cours des expériences réalisées précédemment en milieu minimum, en présence de N-hydroxy-N-isopropyloxamate à 1 et 3 uM aux jours 0 et 2 a montré que la germination des spores n'était pas bloquée. Des tests supplémentaires ont été réalisés, afin de déterminer si à des concentrations élevées, le N-hydroxy-Nisopropyloxamate pouvait bloquer la germination des spores. Ainsi, à 10 mM, le Nhydroxy-N-isopropyloxamate n'inhibe pas la germination des spores de M grisea aussi bien dans l'eau qu'en milieu minimum, à 24 et à 72 heures. L'inhibition de la croissance de M grisea par le N-hydroxy-N-isopropyloxamate ne se manifeste qu'après la germination, lors de la croissance des hyphes. Nous pouvons donc supposer que l'utilisation des réserves en acides aminés (valine et isoleucine) présentes dans la spore pourrait permettre dans un premier temps la germination. La limitation des réserves en acides aminés et leur épuisement plus ou moins rapide pourraient agir comme facteur limitant de la croissance de M grisea.

4. 2 Effet fongicide des inhibiteurs de l'acetohvdroxy isoméroréductase sur d'autres isomeroré champignons Nous avons réalisé des mesures de la toxicité d'IpOHA vis-à-vis d'autres espèces fongiques telles que Pythium ultimum, Botrytis cinerea, Ustilago nuda et Mycosphaerella graminicola dans les mêmes conditions que pour M grisea (culture en milieu minimum liquide en microplaques à 96 puits). La croissance de Botrytis cinerea n'est pas affectée par la plus forte concentration d'IpOHA utilisée (30 itM), ce qui montre que cette espèce est résistante à IpoHA. La croissance d'Ustilago nuda et de Pythium ultimum est inhibée par IpOHA à partir de 10 AM. Celle de Mycosphaerella graminicola est inhibée dès 0, 3 uM (tableau 5). Lorsque le milieu minimum (MM-liq) est supplémenté par de l'isoleucine, de la leucine et de la valine (1 mM), la toxicité d'IpOHA est levée pour toutes les espèces fongiques sensibles. Par contre, avec une concentration de 0, 3mM, l'inhibition n'est levée chez Ustilago nuda que pour les concentrations inférieures à 30 uM d'IpOHA. IpOHA a une forte action sur la croissance de Mycosphaerella graminicola.

Tableau 5 : Toxicité d'IpOHA pour différentes espèces fongiques

<tb>
<tb> DIsc <SEP> DIso <SEP> Niveau <SEP> de <SEP> sensibilité <SEP> à <SEP> IpOHA
<tb> Botrytis <SEP> cinea//Résistant
<tb> Pythium <SEP> ultimum <SEP> 30 <SEP> 10 <SEP> Moyennement <SEP> sensible
<tb> Ustilago <SEP> nuda <SEP> 30 <SEP> 3 <SEP> Moyennement <SEP> sensible
<tb> Mycosphaerella <SEP> graminicola <SEP> 3 <SEP> 1 <SEP> Sensible
<tb> Magnaporthe <SEP> grisea <SEP> 3 <SEP> 1 <SEP> Sensible
<tb>
DIso : concentration inhibant la croissance du champignon de 50 %.

DIso : concentration inhibant la croissance du champignon de 80 %.

Exemple 5 : Etudes biochimiques de l'acetohydroxy isoméroréductase de S. cerevisiae
La séquence codante du gène IL V5 de levure sans le peptide transit a été surexprimée chez Ecoli afin d'obtenir de grandes quantités d'enzyme pour faciliter son étude biochimique et en particulier son étude structurale.

La stratégie employée pour l'étude de l'isoméroréductase de levure a été la suivante : le gène ILV5 de l'isoméroréductase de levure a été dans un premier temps amplifié par PCR sans la partie codant pour le peptide transit. Le produit de la réaction PCR a été ensuite cloné dans un vecteur d'expression pET inductible par l'IPTG. L'isoméroréductase a été ensuite surproduite chez E. coli, purifiée puis ses propriétés biochimiques étudiées.

5.1 Amplification par PCR et clonage de la partie du gène IL V5 de l'isoméroréductase de levure codant pour la protéine mature
Le peptide signal, qui permet l'adressage de l'isoméroréductase de levure dans son compartiment cellulaire, la mitochondrie, est clivé lorsque la protéine a pénétré dans la mitochondrie. Nous avons donc choisi de cloner le gène ILV5 sans la région codant pour le peptide transit afin de surproduire l'isoméroréductase de levure correspondant à la protéine mature chez E coli.

La région du gène IL V5 de levure située entre la fin du peptide transit et le codon STOP de terminaison de la traduction a été amplifiée par PCR à partir de l'ADN génomique de S. cerevisiae avec les couples d'amorces (1'-3') et (2'-3'). La taille des fragments d'ADN amplifiés avec les couples d'amorces (1'-3') et (2'-3') est de 1079 pb et 1124 pb, respectivement. Ces fragments d'ADN ont été purifiés après séparation par électrophorèse,

puis digérés et clonés dans le vecteur PET-23d en SalI/NcoI. Une double digestion du vecteur de clonage et du produit de réaction PCR par les enzymes NcoI et SalI permet en effet le clonage du gène ILV5 de levure dans la bonne orientation dans le vecteur PET-23d.

Le plasmide pET-23d (Tebu), porteur du gène de résistance à l'ampicilline, est utilisé comme vecteur d'expression inductible pour produire en grande quantité l'isoméroréductase de levure chez E. coli. Ce type de vecteur possède un promoteur du phage T7, qui est reconnu par l'ARN polymerase T7, mais pas par l'ARN polymerase d'E. coli. La production de la protéine clonée a lieu après l'induction par l'IPTG de la souche BL21 pLysS (résistante au chloramphénicol) ; chez cette souche bactérienne, le gène de l'ARN polymerase T7 est sous le contrôle du promoteur lac inductible par l'IPTG. La souche BL21 pLysS transformée avec le plasmide pET-23d, porteur du gène ILV5 de S. cerevisiae est appelée BL21 pLysS-pET-23d-isoméroréductase. La construction n 1 correspond au clonage du fragment amplifié avec les amorces (1'-3') et la construction n 2 au clonage du fragment d'ADN amplifié avec les amorces (2'-3'). Une double digestion SalI/NcoI des 12 clones obtenus après transformation des cellules DH5 avec la construction n01 et des 6 clones transformés avec la construction n 2 permet de ressortir le fragment cloné dans le vecteur pET et de vérifier ainsi la présence d'une des 2 construction au sein des différents clones. L'analyse des profils de digestion de ces clones bactériens a montré qu'ils possédaient tous la construction correspondante.

Deux clones ont été sélectionnés : le clone PET 1-4 (construction n 1) et le clone PET 2-1 (construction n 2) ; ils ont été utilisés pour transformer des cellules BL21 pLysS, afin de surproduire l'isoméroréductase de levure chez E. coli.

5. 2 Purification de l'isoméroréductase de levure surproduite chez E. coli La suexpression de la forme"courte" (construction n l) et de la forme"longue" (construction n 2) de l'isoméroréductase de levure a été induite chez E. coli par l'IPTG.

La souche bactérienne BL21 pLysS, transformée avec le plasmide pET 23-d contenant le gène IL V5 de levure sans la région codant pour le peptide transit, est mise en culture à 28 C sous agitation dans du milieu LB supplémenté en carbénicilline (100 mg/l) et en chloramphénicol (30 mg/l) jusqu'à une densité équivalente à une D0600 d'environ 0. 6.

L'IPTG est alors ajouté à une concentration de 0. 4 mM finale et les bactéries sont laissées en culture à 28 C sous agitation durant environ 15 heures. Cette culture bactérienne est ensuite centrifugée (30 minutes, 4500 rpm) ; le culot bactérien est resuspendu dans 15 ml de tampon (K-KPO 10 mM (pH 7. 5), EDTA 1 mM, DTT 1 mM et inhibiteurs de protéase : benzamidine HCl1 mM, acide amino-caproïque 5 mM) et soniqué par le Vibracell disruptor (Sonics and Materials, Danbury, CT, U. S. A) pendant 15 minutes, à puissance

4,40 % du temps total de lyse. L'extrait cellulaire est centrifugé (20 minutes, 15000 rpm) ; le surnageant, contenant les protéines solubles, est alors conservé à-80 C.

L'analyse sur gel d'acrylamide des fractions protéiques totales et des fractions protéiques solubles a montré que les formes"courte"et"longue"de l'isoméroréductase de levure sont présentes dans la fraction de protéines solubles et qu'elles représentent environ 25 à 30 % de ces protéines. La position la plus vraisemblable du site de clivage du peptide transit de l'isoméroréductase de levure étant située entre les acides aminés 47 et 48 de la séquence protéique de cette enzyme (Petersen, G. L. et al., NAR 14,24 : 9631-9650, 1986), nous avons choisi de continuer à travailler avec la forme courte de l'isoméroréductase de levure.

La purification de la forme courte de l'isoméroréductase a donc été réalisée en deux étapes à partir de la fraction des protéines solubles ; d'abord sur une colonne échangeuse d'anions (Q-Sépharose), puis sur une colonne de perméation (Superdex 75). L'extrait de protéines solubles (15.5 ml ; 227.8 mg de protéines), qui contient l'isoméroréductase de levure (extrait brut) est appliqué sur une colonne échangeuse d'anions, HiLoad 16/10 QSépharose (Pharmacia) connectée à un système F. P. L. C de Pharmacia, préalablement équilibrée avec du tampon KH2-K2P04 10 mM/EDTA 1 mM/DTT 1 mM. L'enzyme est éluée par 78 ml de ce même tampon (débit = 1 ml/min ; taille des fractions = 3 ml). Les fractions chromatographiques contenant l'isoméroréductase de levure sont concentrées à 1.6 ml par centrifugation à 5500 rpm dans un macrosep-10 unit (filtron). Cet extrait (27.7 mg) est alors appliqué sur une colonne Hiload 16/60 Superdex 75 (Pharmacia) connectée à un système F. P. L. C de Pharmacia, préalablement équilibrée avec du tampon Hépès KOH 25 mM.. L'enzyme est éluée par 58 ml de ce même tampon (débit = 1 ml/min ; taille des fractions = 1 ml). Les fractions chromatographiques contenant l'isoméroréductase de levure (18.99 mg) sont concentrées à 9.7 mg/ml par centrifugation à 5500 rpm dans un microsep 10K (filtron) et conservés à-80 C.

Après injection de la fraction des protéines solubles (environ 230 mg) sur la colonne Q-Sépharose, l'isoméroréductase de levure est éluée avec du tampon KH2-K2PO4 10 mM/EDTA 1 mM/DTT 1 mM. Il est en effet inutile d'éluer cette enzyme en faisant agir un gradient de concentration croissante en tampon phosphate puisque des expériences préliminaires ont montré que cette enzyme n'était pas retenue par la colonne. Après cette première étape de purification, environ 30 mg de protéine a été récupéré et le rendement de la purification en terme d'activité est de 55 % (tableau 6).

Tableau 6 : Etapes de la purification de l'isoméroréductase de levure surexprimée chez E. coli

<tb>
<tb> Quantité <SEP> de <SEP> Activité <SEP> totale <SEP> Activité <SEP> spécifique
<tb> Etapes <SEP> de <SEP> la <SEP> protéines <SEP> (mg) <SEP> (llmoles <SEP> de <SEP> (Actlvlte <SEP> totale. <SEP> mg <SEP> Rendement
<tb> purification <SEP> NADPH <SEP> de <SEP> protéines) <SEP> en <SEP> %
<tb> Bradford <SEP> 205 <SEP> oxydées. <SEP> min'') <SEP> Bradford <SEP> 205
<tb> Extrait <SEP> brut <SEP> de
<tb> protéines <SEP> 227.82 <SEP> n. <SEP> d. <SEP> 134.16 <SEP> 0.59 <SEP> n. <SEP> d. <SEP> 100
<tb> solubles
<tb> Pool <SEP> des
<tb> fractions <SEP> de <SEP> la <SEP> 27.72 <SEP> 14.34 <SEP> 73.22 <SEP> 2.64 <SEP> 5.11 <SEP> 54.58
<tb> Q-Sépharose
<tb> Pool <SEP> des
<tb> fractions <SEP> de <SEP> la <SEP> 18.99 <SEP> 8.4 <SEP> 45.85 <SEP> 2.4 <SEP> 5.46 <SEP> 34.18
<tb> Superdex <SEP> 75
<tb>

Les activités ont été déterminées dans le milieu réactionnel suivant : Hépès de sodium 50mM, pH 7.5 ; MgCl210mM ; NADPH 250uM et AHB 0.48mM.

Le dosage des protéines a été réalisé selon la méthode de Bradford (Bradford) ou en mesurant l'absorbance à 205 nm (205). n. d. = non déterminé
L'analyse sur gel d'acrylamide du pool des fractions de la Q-Sépharose montre qu'après cette première étape de purification l'enzyme est presque pure. Le pool des fractions de la Q-Sépharose est injecté sur la colonne de gel filtration et l'isoméroréductase de levure est éluée avec du tampon Hépès KOH 25 mM. Après cette 2ème étape de purification, environ 20 mg de protéine pure est récupérée ; le rendement final des deux étapes de purification de l'isoméroréductase de levure est d'environ 34 %.

5.3 Etudes des propriétés cinétiques de l'isoméroréductase de levure surproduite chez E. coli
La détermination des paramètres cinétiques de l'isoméroréductase de levure a été réalisée en suivant l'évolution de la réaction enzymatique au spectrophotomètre en conditions saturantes en magnésium, en NADPH et en substrat AHB ou AL. Toutes les mesures d'activité enzymatique ont été réalisées dans une cuve en quartz d'un trajet optique de 1 cm contenant du tampon Hépès de sodium (50 mM, pH 7.5), du MgCl2 10 mM, du NADPH 250uM, dans un volume final de 1 ml, à 25 C. La réaction enzymatique a été initiée par l'ajout de 0.48 mM d'AHB ou d'AL. L'évolution de cette réaction a été suivie grâce à la décroissance d'absorption du NADPH à 340 nm.

5.3. 1. Détermination du pH optimum d'activité de l'isoméroréductase recombinante de levure purifiée
Afin de déterminer les conditions optimales pour réaliser les mesures cinétiques sur l'isoméroréductase de levure, le pH optimum d'activité de cette enzyme a été déterminé, en mesurant l'activité de l'enzyme purifiée dans des tampons de pH variables. Le pH optimum d'activité de l'isoméroréductase de levure est de 7.5, alors que des études avaient montré que celui de l'isoméroréductase de plante était de 8.2. Cette différence de pH optimum d'activité de l'isoméroréductase entre la plante et la levure s'explique par la localisation cellulaire de ces 2 enzymes. L'isoméroréductase de plante est localisée dans le chloroplaste dont le pH est de 8.2 à la lumière, alors que l'isoméroréductase de levure est située dans la mitochondrie dont le pH est de 7.5. Le pH optimum d'activité de ces isoméroréductases est donc bien adapté à l'environnement cellulaire dans lequel elles se trouvent.

5.3. 2. Détermination des paramètres cinétiques de l'isoméroréductase recombinant de levure purifiée
L'affinité de l'isoméroréductase de levure pour ses différents ligands a été étudiée. a) Activités spécifiques
L'activité spécifique de l'isoméroréductase de levure pour les substrats AHB et AL sont de 6 et 1 umoles de NADPH oxydées. min-l. mg-l de protéine, respectivement. Le rapport entre les vitesses maximales (Vm) de réaction enzymatique en présence du substrat AHB par rapport au substrat acétolactate est donc inchangé pour l'enzyme de levure par rapport à celle de plante (Vm AHB/Vm AL = 6). Les activités spécifiques de l'isoméroréductasede plante pour les substrats AHB et AL sont par ailleurs de 6 et 1 umoles de NADPH oxydées. min-l. mg-l de protéine, respectivement. b) Affinités pour les cofacteurs NADPH et NADH
L'affinité de l'isoméroréductase de levure pour le NADPH est très élevée (figure 3).

En effet, un Km pour ce cofacteur de 1.6 p. M a été mesuré. Ce KM est peu différent de celui

mesuré pour l'enzyme de plante (KM= 5 uM). La valeur de KM NADPH obtenue pour l'isoméroréductase de levure purifiée est cohérente avec la valeur obtenue pour l'enzyme de levure partiellement purifiée (KM < 2.5 uM ; Hawkes et al., 1989). Cependant, contrairement à l'enzyme de plante, qui est capable d'utiliser du NADH, avec une très faible affinité (KM NADH = 645 uM en présence de AHB et de Mg 2+ ; Dumas et al., Biochem. J., 288 : 865- 874,1992), l'enzyme de levure semble être incapable d'utiliser le NADH. Aucune activité enzymatique n'a été détectée en présence de NADH (à 300 uM) en conditions saturantes en substrat AHB et en magnésium, peut-être à cause d'une affinité pour le NADH encore plus

faible que celle de l'isoméroréductase de plante. L'isoméroréductase de levure utiliserait le NADPH comme donneur d'hydrogènes avec une spécificité encore plus marquée que l'enzyme de plante. c) Affinités pour les substrats AHB et AL
L'affinité de l'isoméroréductase de levure pour le substrat AHB (KM =104 uM pour la forme racémique) est environ 5 fois plus faible que celle de l'isoméroréductase de plante ; alors que l'affinité de l'isoméroréductase de levure pour le substrat AL (KM = 266 uM pour la forme racémique) est 10 fois plus faible que l'isoméroréductase de plante (figure 4). Ces

valeurs de KM sont assez proches de celles obtenues pour l'enzyme partiellement purifiée de N. crassa. En effet, les KM AHB et AL pour l'isoméroréductase de N. crassa sont de 160 uM et 320 uM respectivement.

La différence de propriétés biochimiques la plus marquante entre l'isoméroréductase de levure et de plante est l'affinité de cette enzyme pour le magnésium. d) Affinités pour le magnésium
L'affinité de l'isoméroréductase de levure (KM = 968 uM) est en effet 200 fois plus

faible que celle de l'enzyme de plante (KM = 5 uM environ). Voir figure 5. Cette faible affinité de l'isoméroréductase de levure pour le magnésium pourrait être une caractéristique de l'isoméroréductase de champignon. En effet, les études menées sur l'isoméroréductase de N. crassa ont montré que cette enzyme a un KM magnésium de 580 uM en présence de NADPH et du substrat AHB (Kritani et al., J. Biological Chemistry, 241 : 2047-2051,1965).

La comparaison des séquences primaires des isoméroréductases de levure, de N. crassa et de plante a montré que la principale différence entre ces trois enzymes était l'absence au sein de la protéine de champignon d'une séquence de 140 acides aminés impliquée dans l'interaction entre les deux monomères de l'enzyme de plante. Les 2 domaines connus pour fixer les ions Mg2+ chez l'enzyme de plante sont cependant présents au niveau de l'enzyme de levure. L'étude d'un mutant monomérique de l'isoméroréductase de plante obtenu en délétant 7 acides aminés dans la région de dimérisation de 140 acides aminés a montré que l'enzyme présente une affinité beaucoup plus réduite pour le magnésium (KM = 640 M) que la forme sauvage de l'enzyme (Wessel et al., Biochemistry, 37 : 12753-12760,1998). La structure quaternaire de l'isoméroréductase de plante jouerait donc un rôle dans la stabilisation du site actif de l'enzyme de plante et des sites de forte affinité pour le magnésium. Ainsi, bien que l'isoméroréductase de levure possède bien les deux domaines de fixation des ions Mg2+, l'absence de la séquence de cette région de 140 acides aminés au sein de l'enzyme de levure pourrait expliquer l'affinité plus réduite de l'isoméroréductase de

levure pour le magnésium de par l'organisation spatiale du site actif de cette enzyme probablement différente de celle de l'enzyme de plante. Bien que les sites de liaison pour le magnésium de l'isoméroréductase de levure ont une affinité beaucoup plus faible pour ce cation, l'affinité de l'enzyme de levure pour le NADPH est similaire à celle de plante. Nous pouvons donc supposer que la conformation de l'isoméroréductase de levure pourrait être telle que le domaine amino-terminal qui intervient dans la fixation du NADPH est peu différent de celui de l'enzyme de plante et que le domaine carboxy-terminal qui est responsable de la fixation des deux atomes de magnésium et du substrat est différent de celui de l'enzyme de plante. La connaissance de la structure quaternaire de l'isoméroréductase de levure grâce à la cristallisation de l'enzyme permettrait d'expliquer cette faible affinité pour les ions Mg2+.

5. 4 Etude de l'effet des inhibiteurs N-hydroxy-N-isopropyloxamate et diméthylphosphinoyl-2-hydroxyacétate sur l'isoméroréductase de levure 5.4. 1 Etude de la stoechiométrie de fixation des inhibiteurs N-hydroxy-Nisopropyloxamate et diméthylphosphinoyl-2-hydroxyacétate sur l'isoméroréductase de levure
L'étude de la stoechiométrie de fixation des inhibiteurs N-hydroxy-Nisopropyloxamate et du diméthylphosphinoyl-2-hydroxyacétate a été réalisée en incubant des quantités variables d'enzyme (de 0.1 à 0.4 nmoles) avec une quantité constante en

inhibiteur pendant 20 minutes avec 25 nmoles de NADPH et 0. 25 moles de MgC12 dans un volume final de 10 ul. Les réactions sont initiées en ajoutant de l'AHB 0. 48mM dans du tampon Hépès de sodium 50 mM, pH 7. 5, contenant du MgC12 10 mM.

En présence de 0.1 nmoles de diméthylphosphinoyl-2-hydroxyacétate, une activité enzymatique n'est détectée qu'avec des quantités d'enzyme supérieures à 0.09 nmoles. De la même manière, en présence de 0.1 nmole de N-hydroxy-N-isopropyloxamate, une activité enzymatique n'est détectée que pour des quantités d'enzyme supérieures à 0.1 nmoles (figure 6). De plus, pour ces deux inhibiteurs, lorsque l'enzyme est en excès par rapport à l'inhibiteur dans le milieu réactionnel, les activités enzymatiques augmentent parallèlement à celles du témoin sans inhibiteur. Le N-hydroxy-N-isopropyloxamate et le diméthylphosphinoyl-2-hydroxyacétate agiraient donc sur l'isoméroréductase de levure comme des inhibiteurs irréversibles. En effet, dans le cas d'une inhibition irréversible, en présence d'une faible quantité d'enzyme, toute l'enzyme se complexe avec l'inhibiteur.

L'activité enzymatique est alors nulle, puisqu'il n'existe plus d'enzyme libre dans le milieu réactionnel. Lorsque la quantité d'enzyme présente dans le milieu réactionnel est supérieure

à la quantité d'inhibiteur, l'enzyme libre en excès dans le milieu se comporte alors comme le témoin sans inhibiteur (droite parallèle au témoin). Par ailleurs, 0.1 nmoles d'inhibiteur (Nhydroxy-N-isopropyloxamate ou diméthylphosphinoyl-2-hydroxyacétate) étant nécessaire pour inhiber entièrement 0.1 nmoles d'enzyme, la stoechiométrie de fixation des inhibiteurs sur l'isoméroréductase de levure est par conséquent de 1 mole d'inhibiteur par mole d'enzyme.

5. 4.2 Etude de la vitesse de fixation des inhibiteurs N-hydroxy-N-isopropyloxamate et diméthylphosphinoyl-2-hydroxyacétate sur l'isoméroréductase de levure
L'effet des inhibiteurs N-hydroxy-N-isopropyloxamate et diméthylphosphinoyl-2- hydroxyacétate sur l'isoméroréductase de levure a été suivi au cours du temps en mesurant au spectrophotomètre la décroissance d'absorbance du NADPH à 340 nm. Chaque mesure est réalisée en conditions saturantes en MgC12 (10 mM) et en NADPH (0.25 mM) pendant une durée de 6 minutes en présence d'une concentration donnée en inhibiteur (N-hydroxy-

N-isopropyloxamate =15 uM ou diméthylphosphinoyl-2-hydroxyacétate =10 nom) et en enzyme (110 nM) ; la concentration en substrat AHB utilisée varie de 250 uM à 2 375uM.

L'étude de la stoechiométrie de fixation des inhibiteurs N-hydroxy-N-isopropyloxamate et diméthylphosphinoyl-2-hydroxyacétate sur l'isoméroréductase de levure a montré que ces inhibiteurs se comportent comme des inhibiteurs irréversibles. L'équation (1) permet donc de décrire la cinétique de formation du produit de la réaction, cette équation étant applicable aux inhibiteurs irréversibles. Les paramètres ml, m2 et m3, définis à partir de l'équation (1), sont obtenus directement à partir de l'ajustement des courbes expérimentales par le logiciel KaleidaGraph, ainsi que les erreurs associées à la détermination de ces paramètres.

Equation (1) :
340= ml + (ni2-mi). e ' où les paramètres sont les suivants : . DO 340 est la densité optique mesurée au spectrophotomètre à 340 nm au temps"t" . mi la densité optique quand"t"tend vers l'infini . m2 la densité optique initiale . m3 le produit de la concentration en inhibiteur par la constante apparente de disparition du NADPH
Pour une inhibition irréversible, deux cas peuvent se présenter : soit l'inhibiteur se fixe directement en une seule étape sur l'enzyme, soit il se fixe en deux étapes sur l'enzyme en formant un complexe intermédiaire enzyme-inhibiteur réversible. La représentation

graphique m3 en fonction de la concentration en inhibiteur permet de définir le type d'inhibition irréversible. Ainsi, pour déterminer si les inhibiteurs N-hydroxy-Nisopropyloxamate et diméthylphosphinoyl-2-hydroxyacétate se fixent en une ou deux étapes sur l'isoméréortductase de levure, l'effet de ces inhibiteurs sur l'activité enzymatique de cette enzyme est suivi au cours du temps (6 min) en faisant varier la concentration en inhibiteur, pour des concentrations en enzyme (110 nM) et AHB (0.48 mM) données (figure 7). Pour une inhibition irréversible simple, sans formation du complexe intermédiaire enzymeinhibiteur réversible, la vitesse apparente de formation du complexe enzyme-inhibiteur (Kobs ou m3) est une fonction linéaire de la concentration en inhibiteur. Si l'inhibition irréversible implique l'existence d'un complexe intermédiaire réversible, la représentation graphique m3 en fonction de la concentration en inhibiteur est une hyperbole. Pour les inhibiteurs N- hydroxy-N-isopropyloxamate et diméthylphosphinoyl-2-hydroxyacétate ; la représentation graphique m3 en fonction de la concentration en inhibiteur est linéaire, suggérant que l'inhibition de l'isoméroréductase de levure par ces produits se fait en seule étape (figure 8), comme c'est le cas pour l'inhibition de l'isoméroréductase de plante. Cependant, même en tenant compte des erreurs expérimentales, les représentations graphiques m3 en fonction de la concentration en inhibiteur ne passent pas par l'origine pour les deux inhibiteurs. Ces deux inhibiteurs, N-hydroxy-N-isopropyloxamate et diméthylphosphinoyl-2- hydroxyacétate, pourraient ne pas être entièrement irréversibles. Dans ce cas, la constante de dissociation du complexe enzyme-inhibiteur, k-o pourrait avoir une valeur non négligeable.

Le mécanisme d'inhibition (compétitive ou non compétitive) peut être déterminé en étudiant l'effet de la concentration en substrat sur la vitesse apparente de formation du complexe enzyme-inhibiteur. Cette détermination se fait grâce à la représentation graphique 1/m3 en fonction de la concentration en substrat. Pour des inhibiteurs de type compétitif, la représentation graphique 11m3 en fonction de la concentration en substrat est linéaire. Pour les inhibiteurs non compétitifs, le paramètre m3 est indépendant de la concentration en substrat. Pour les inhibiteurs N-hydroxy-N-isopropyloxamate et diméthylphosphinoyl-2hydroxyacétate, l'inverse de m3 varie linéairement en fonction de la concentration en substrat AHB. Le N-hydroxy-N-isopropyloxamate et le diméthylphosphinoyl-2hydroxyacétate se comportent donc comme des inhibiteurs compétitifs vis-à-vis du substrat AHB de l'isoméroréductase de levure (figure 9). La constante d'association de l'inhibiteur à l'enzyme de levure (ko) est alors calculée grâce à l'équation (2).

Equation (2) :

k. ko. [I], k. bs=--+k-o l+'L K

kobs = rus = vitesse apparente de formation du complexe enzyme-inhibiteur ko = constante d'association de l'inhibiteur à l'enzyme k -0= constante de dissociation de l'inhibiteur à l'enzyme K = constante de Michaelis et Menten du substrat AHB [1] = concentration en inhibiteur [S] = concentration en substrat Pour des inhibiteurs irréversibles, le k -0 peut être considéré comme négligeable, le ko est alors calculé grâce à l'équation (3) grâce au programme KaleidaGraph.

Equation (3) :

1 1 1 m3 ko. [I] K. [I]. ko

Cette équation est utilisable pour l'inhibiteur N-hydroxy-N-isopropyloxamate, mais pas pour le diméthylphosphinoyl-2-hydroxyacétate. Pour le diméthylphosphinoyl-2- hydroxyacétate, la représentation graphique 11m3 en fonction de la concentration en substrat est linéaire, mais ne passe par l'origine. Pour le N-hydroxy-N-isopropyloxamate, la représentation graphique 11m3 en fonction de la concentration en substrat est linéaire et la valeur de l'ordonnée à l'origine est négligeable. Une hypothèse peut expliquer ce résultat : l'inhibiteur diméthylphosphinoyl-2-hydroxyacétate n'est peut être pas complètement irréversible. Une droite de régression linéaire permet alors d'obtenir la valeur du ko pour le diméthylphosphinoyl-2-hydroxyacétate. Les valeurs de ko correspondant aux inhibiteurs N-

hydroxy-N-isopropyloxamate et diméthylphosphinoyl-2-hydroxyacétate sont de 12433 Mi. S-1 et 7721 Mol. s-l, respectivement. Ainsi, contrairement à l'isoméroréductase de plante (ko pour le N-hydroxy-N-isopropyloxamate = 1 900 M-l. s-l et ko pour le diméthylphosphinoyl- 2-hydroxyacétate = 22 000 M-l. s''), le N-hydroxy-N-isopropyloxamate est un meilleur inhibiteur de l'enzyme de levure que le diméthylphosphinoyl-2-hydroxyacétate.

5.5. Etude structurale de l'isoméroréductase de levure
La structure quaternaire de l'isoméroréductase de levure a été étudiée selon deux approches différentes : la spectrométrie de masse et la gel filtration.

L'existence de deux états d'oligomérisation différents a été mise en évidence grâce à la spectrométrie de masse en conditions non dénaturantes. Cette technique a montré que l'isoméroréductase de levure est présente majoritairement sous forme dimérique mais une

forme monomérique minoritaire est aussi présente. Le dimère est représenté par une distribution des états de charge [D + 18H] 18+ à [D + 21H]21+. Une faible présence de monomère de l'isoméroréductase de levure, représenté par les états de charge [M + 12H] + à [M + 14H]14+ est mis en évidence sur ce même spectre de masse. L'isoméroréductase de levure pourrait donc être en équilibre entre une forme monomérique et une forme dimérique.

L'application sur gel filtration (Superdex 75) du pool des fractions de l'isoméroréductase de levure obtenues après la 1 ère étape de purification montre que l'isoméroréductase est éluée en un seul pic et que sa masse moléculaire est estimée à 67 kDa. Or, la masse moléculaire attendue de la forme monomérique de cette enzyme est d'environ 40 kDa et de 80 kDa pour la forme dimérique en condition non dénaturante. La masse moléculaire intermédiaire entre les formes monomérique et dimérique de l'isoméroréductase de levure confirme l'existence d'un équilibre entre ces deux formes de l'enzyme. Seul un équilibre dynamique rapide entre ces deux formes pourrait expliquer l'obtention d'un seul pic d'élution en gel filtration. En effet, si cet équilibre était lent, 2 pics d'élution auraient été observés en sortie de gel filtration ; l'un correspondrait à la forme monomérique, et l'autre à la forme dimérique de l'enzyme.

Claims

Revendications 1) Procédé de traitement des cultures contre les maladies fongiques, caractérisé en ce que l'on applique une composition fongicide comprenant une quantité efficace d'un inhibiteur de l'acetohydroxyacide isoméroréductase.
2) Procédé selon la revendication 1, dans laquelle l'inhibiteur de l'acetohydroxyacide

isoméroréductase est un inhibiteur de l'activité enzymatique de l'acétohydroxyacide isoméroréductase de la SEQ ID No. l, de la SEQ ID No. 2 et/ou de la SEQ ID No. 3.
3) Procédé suivant l'une des revendications lou 2, dans laquelle l'inhibiteur de l'acétohydroxyacide isoméroréductase est le diméthylphosphinoyl-2-hydroxyacétate.
4) Procédé suivant l'une des revendications 1 ou 2, dans laquelle l'inhibiteur de l'acétohydroxyacide isoméroréductase est le N-hydroxy-N-isopropyloxamate.
5) Compositions fongicides caractérisées en ce qu'elles comprennent un inhibiteur de l'acétohydroxyacide isoméroréductase et un autre composé fongicide.
6) Procédé de fabrication d'une composition fongicide caractérisé en ce que l'on utilise un inhibiteur de l'acétohydroxyacide isoméroréductase.
7) Procédé pour l'identification de composés fongicides comprenant l'identification de composés inhibant l'activité enzymatique de l'acétohydroxyacide isoméroréductase.
8) Procédé selon la revendication 7 comprenant une étape supplémentaire dans laquelle on détermine si lesdits composés inhibant l'activité enzymatique de l'acétohydroxyacide isoméroréductase inhibent la croissance et la pathogénie des champignons.
9) Procédé selon les revendications 7 ou 8, dans lequel l'identification de composés inhibant l'activité enzymatique de l'acétohydroxyacide isoméroréductase comprend les étapes suivantes :

<Desc/Clms Page number 40>

a) mettre en contact ledit composé avec l'acétohydroxyacide isoméroréductase en présence de magnésium, de NADPH et de substrat ; et b) mesurer ladite activité enzymatique.
10) Procédé selon les revendications 7 ou 8, dans lequel l'identification de composés inhibant l'activité enzymatique de l'acétohydroxyacide isoméroréductase comprend les étapes suivantes : a) exprimer l'acétohydroxyacide isoméroréductase dans un organisme hôte ; b) purifier l'acetohydroxyacide isoméroréductase produite par ledit organisme hôte ; c) mettre en contact ledit composé avec ladite acetohydroxyacide isoméroréductase purifiée en présence de magnésium, de NADPH et de substrat ; et d) mesurer ladite activité enzymatique.
11) Procédé selon la revendication 9 ou 10, dans lequel ladite acétohydroxacide isoméroréductase est représentée à la SEQ ID No. 1, à la SEQ ID No. 2 et/ou à la SEQ ID

No. 3.
12) Procédé selon l'une des revendications 9-11, dans lequel la mesure de ladite activité enzymatique comprend la mesure de la décroissance d'absorption du NADPH à 340 nm.
13) Procédé selon l'une des revendications 9-12, dans lequel ledit substrat est le 2S-2- acétolactate (AL) ou le 2S-2-acéto-2-hydroxybutyrate (AHB).