WO2003002603A1

WO2003002603A1 - Novel neuropeptide y-like peptide

Info

Publication number: WO2003002603A1
Application number: PCT/JP2002/006397
Authority: WO
Inventors: Shunichiro Matsumoto; Jun Takasaki; Tetsu Saito; Masazumi Kamohara; Takatoshi Soga; Masashi Ukai
Original assignee: Yamanouchi Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Yamanouchi Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2001-06-27
Filing date: 2002-06-26
Publication date: 2003-01-09
Anticipated expiration: 2003-12-27
Also published as: JPWO2003002603A1

Description

明細喜新規のニューロべプチド Y様ぺプチド技術分野

本発明は、新規のニューロペプチド Y様ペプチドに関する。背景技術

ニューロぺプチド Y (n e u r o p e p t i d e Y ；以下、 N P Yと略称する）ファミリ一は、 NPY、ペプチド YY (PYY) 、及び膝臓ペプチド（p a n c r e a t i c p o l y p e p t i d e ; PP) の 3種類よリ構成される生理活性べプチド群である（Re g u に P Θ p t . , 62, 1—1 1 , 1 99 6) 。いずれのペプチドも、アミノ酸 36個からなり、 C末端がアミド化された直鎖べプチドである。

N PYは、 1 982年にブタ脳から単離 '精製され、その後の研究によって哺乳類の中枢及び末梢神経系で最も含有量が多い神経ペプチドであることが判明した（N a t u r e, 296, 659-60, 1 982) 。 NPYの発現は、中枢神経系（特に、視床下部、海馬、大脳皮質、及び脳幹部）、副腎髄質、及び副交感神経に見られる。

PYYも、 NPYと同じ 1 982年にブタ小腸から単離■精製された生理活性ぺプチドである（P r o c. N a t l . Ac a d. S c に USA, 79, 25 1 4-8, 1 982) 。 PYYは、 N P Yに対してアミノ酸一次配列で 70 %の相同性があり、下部小腸、大腸、及び膝臓で発現が確認されている。

ΡΡは、 1 975年にニヮトリのインスリン精製過程の副産物として、 ΝΡΥ ファミリ一中で最初の分子として同定された（ j B i o l . Ch em. , 25

0， 9369-76, 1 975) 。 Ν Ρ Υ及び Ρ Υ Υは全ての脊椎動物で存在が確認されているが、 Ρ Ρは四肢動物への進化の初期に発生したと考えられている c ΡΡは、 Ν ΡΥに対して 5 のアミノ酸配列相同性を有しており、発現は主に睦臓で観察される。

ΝΡΥ遺伝子は、ヒトで第 7染色体 ρ 1 5. 1に存在している。 ΡΥΥ遺伝子及び P P遺伝子は、いずれもヒ卜の第 1 7染色体 q 21. 1に、わずか 1 0 k b の距離に連座しており、分子進化学的解析から P P遺伝子は P Y Y遺伝子のコピ一として遺伝子複製（g e n e d u p l i c a t i o n) されたものと考えられている。 NPYは、既知の神経ペプチドの内で、分子進化上最も保存されている分子であり、既知ォーソログでは 36アミノ酸中、 22アミノ酸が同一である。一方で、 PYYは、それよりも少ない 1 5アミノ酸が種を超えて保存されているが、 PPについては、 7アミノ酸が同一であるに過ぎない。こうしたことから、 PYYはNPYに比べ、進化速度の速い分子と考えられており、 PP遺伝子が P Y Y遺伝子よリ遺伝子複製されたことが、 P Y Yの進化速度を速める一因となつたとの考察もある。

N P Yフアミリーでは、アミノ酸一次配列中で共通に保有する 3つのプロリン残基と 2つのチロシン残基とで（ポリプロリンへリックス）一（ターン）一

(ひへリックス）の U字構造と、自由度の高い C末端の 4アミノ酸の立体構造とが形成される。この構造は ΓΡ P— f o I d」と呼ばれ、 N PYファミリーの活性発現に重要な役割を担うと考えられている（丄 B i o l . C h em. ， 26 5, 1 1 706-1 2, 1 990) 。

N PYファミリーの機能発現は、 Ν ΡΥ特異的受容体との結合を介して行われる（T r e n d s N e u r o s c に， 20, 294— 8, 1 997) 。 N P Yファミリーの受容体としては、これまで 5つの異なるサブタイプが存在することが知られており、 Gタンパク質共役型受容体（GPCR) Y 1、 Υ2、 Υ4、 Υ5、及び Υ 6が遺伝子レベルで同定されている。 Υ 1受容体は、 Υ 4受容体と 42% (アミノ酸配列に関して）と最も高い相同性があり、ヒトでは機能を持たない偽遺伝子の Υ 6受容体と 51 %の相同性がある。興味深いことに、 Υ 1受容体は、アミノ酸配列に関して、 Υ 5受容体及び Υ 2受容体に対する相同性は、それぞれ 35%及び 31 %しかない。こうした事実は、 ΝΡΥ受容体が、 GPCR スーパーファミリ一の内で最もサブタィプ間相同性の低い群であることを示している。 5種類の ΝΡΥ受容体は、いずれも百日咳毒素感受性の Gタンパク質の活性化を介して細胞内シグナル伝達系を活性化し、細胞内 c AMP量の蓄積を抑制する。また、 Y 1受容体及び Y 2受容体は、活性化により細胞内 C a濃度上昇を引き起こすこと、そして、 Y 2受容体は、更に Kチャネルの活性化を引き起こすことも報告されている。

N PYの生理活性としては、摂食、性行動、曰周運動、及び血圧への関与が示唆されている。これらの生理機能のうち、最も良く研究されているのが、中枢投与時における摂食に関するもので、一連の研究より N PYは最も有効な摂食亢進物質であるとする報告がある（B i o c h em. Ce I に B i o l . ， 78, 371 -92, 2000) 。 NPYをラッ卜脳室内に投与すると、摂食量の増大が観察され、最終的には体重増加及び肥満が起こる。また、日常的な摂食前には、満腹中枢である視床下部室傍核にて NPYの発現が増大する（Am. J. P h y s i o l . , 270 (4 P t 1 ) , E589— 95, 1 996) 。飢餓状態では、視床下部での N PY発現量が亢進するが、摂食によりその発現は減弱する

(Am. J. P h y s i o l . , 266 (5 P t 2) , R 1 687 - 91 , 1 994) 。しかしながら、興味深いことに、 Ν ΡΥのノックアウトマウス（Κ Οマウス）では、摂食パターンに変化は起こらず（N a t u r β, 381 , 41 5-21 , 1 996) 、 ο b o bマウスと Ν Ρ Υの ΚΟマウスとを掛け合わせた場合に、摂食量減少及びエネルギー代謝量増加を伴う、強い体重減少が観察される（S c i e n c e, 274, 1 704— 7, 1 996) 。

PYY及び PPも、摂食亢進を惹起することが知られている。 PYYは、ラット脳室内投与によリ摂食量が著しく上昇し、その効果は N P Yよりも顕著であることが報告されている [Am. J. P h y s i o に， 259 (2 P t 2) , R 31 7 - 23, 1 990、 B r a i n Re s. , 341 , 200— 3, 1 9 85、 B r a i n Re s. , 805, 20— 8, 1 998、及び P y s i o に B e h a v. , 58, 731—5, 1 995] 。 PPは、脳室内投与によリ摂食が刺激されることが知られている [Am. J. P h y s i o l . , 269

(5 P t 2) , R983-7, 1 995] 。また、 P Y Y及び PPは、消化管機能、及び膝臓外分泌等の末梢生理機能も調節すると考えられている。 PYY は、多くの動物種において胃酸の分泌を抑制することが知られており、ラッ卜小腸では抗分泌活性を示す。逆に、胃酸は P Y Yの mRNA転写量を増大させる。膝臓では、 PYYは細胞の分泌顆粒にグルカゴンと共に貯蔵されており、 PY Yはグルコース刺激によるインスリン分泌抑制活性を有する（A c t a P y s i o l . S c a n d. , 1 57, 305-6, 1 996) 。 PPは、胃酸分泌の制御に関与することが示唆されている [Am. J. P h y s i o l . , 269 (5 Ρ t 2) , R983-7, 1 995] 。

更に、 Ν Ρ Υファミリー阻害剤である、 1 229 U91、 BMS- 1 9254 8、 J— 1 04870、及び B I B P 3226等について、抗肥満薬の研究が進められている（J. P h a rma c o I . E x p. T h e r. , 275, 1 26 1—6, 1 995, J . An t i b i o t . (To k y o) , 48, 1 055— 9, 1 995、 B i o c h em. B i o p h y s. Re s. C o mm u n . , 2 66, 88— 91 , 1 999、及び J. P h a rma c o I . E x p. T h e r . , 275, 1 36-42, 1 995) 。

上記の通り、 NPYファミリ一は新規医薬品ターゲッ卜として有用であることが知られている。発明の開示

本発明の課題は、新規な N PY様ペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、及びそれらの製造方法を提供することにある。

本発明者は、鋭意研究を行なった結果、配列番号 1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドを取得し、本ポリヌクレオチドがコードするペプチドは、 N PYファミリーに属する PYYに最も高い相同性を有することを見出した。そして、本ペプチドは、 PYYと同様に、摂食機能を司る視床下部、胃酸分泌を司る小腸、及びィンスリン分泌抑制機能を司る脳下垂体で発現していることを解明し、 P Y Yと同様の機能を有する新規な N P Y様べプチドであることを明らかにし、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、

[1 ] 配列番号 3で表されるアミノ酸配列からなるぺプチド；

[2] 配列番号 2で表されるアミノ酸配列からなるぺプチド；

[3] [1 ] 又は [2] に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド；

[4] [3] に記載のポリヌクレオチドを含む発現べクタ一；

[5] [3] に記載のポリヌクレオチドを含む形質転換体；

[6] [5] に記載の形質転換体を培養する工程、及びペプチドを回収する工程を含むことを特徴とする、 [1 ] 又は [2] に記載のペプチドの製造方法；並び [ 7 ] 配列番号 2で表されるアミノ酸配列からなるぺプチドをコードするポリヌクレオチドを含む形質転換真核生物細胞を培養する工程、及びべプチドを回収する工程を含む方法により製造されうるべプチド

に関する。

なお、本願優先日後に公開された WO O 1 6 0 8 5 0号公報には、単に、配列番号 2で表されるァミノ酸配列、及びそれをコードする塩基配列が記載されているのみで、配列番号 2で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、又はこれをコードするポリヌクレオチドの具体的な取得方法、及び前記べプチド又はポリヌクレオチドを取得したという実施例は存在せず、現実に前記べプチド等を取得したことを裏付ける記載はない。また、配列番号 3で表されるアミノ酸配列は、開示も示唆もされていない。つまり、配列番号 3又は配列番号 2で表されるァミノ酸配列からなるペプチド、及びこれらをコードするポリヌクレオチドは、本発明者が初めて取得したものである。図面の簡単な説明

図 1は、本発明ペプチドのアミノ酸配列と、 N P Yファミリーに属する公知べプチド 3種のァミノ酸配列とのァライメン卜解析の結果を示す説明図である。発明の実施するための最良の形態

以下、本発明を詳細に説明する。

[ 1 1 本発明のポリペプチド

本発明のぺプチドには、

( 1 ) 配列番号 3で表されるアミノ酸配列からなるぺプチド；及び

( 2 ) 配列番号 2で表されるァミノ酸配列からなるぺプチド

が含まれる。

本発明のぺプチドの 1つである、「配列番号 3で表されるアミノ酸配列からなるペプチド」は、 4 2個のアミノ酸残基からなるヒト由来のペプチドである。前記「配列番号 3で表されるアミノ酸配列からなるペプチド」は、後述の実施例 1 で示すように、「配列番号 2で表されるアミノ酸配列からなるペプチド」として翻訳された前駆体から、 N末端側のシグナルペプチド（すなわち、配列番号 2で表されるアミノ酸配列における 1番目〜 28番目のアミノ酸からなるぺプチド）が切断除去された成熟体であると考えられる。

本発明のペプチドは、 PYYと同様の機能、具体的には、摂食調節機能（好ましくは摂食亢進機能）、胃酸分泌抑制機能、又はインスリン分泌抑制機能を有する。

或るペプチドが「摂食調節機能」を示すか否かの確認方法は、特に限定されるものではないが、例えば、以下の方法により確認することができる。すなわち、被検ペプチドを適当量（例えば、 1 mg、 2mg、 5mg、及び 1 0m gずつ）でラット脳室内に投与し、前記投与から所定時間経過後（例えば、 30分経過後、 60分経過後、 90分経過後、 1 20分経過後、及び 240分経過後）の摂食量を、総給餌量の減少分より算出する。この結果、被検ペプチド投与量依存的にラッ卜摂食量の変化が観察されれば、被検ペプチドが摂食調節機能を有すると判定することができる。例えば、被検ペプチド投与量依存的にラッ卜摂食量の亢進が観察されれば、被検ぺプチドが摂食亢進機能を有すると判定することができる

(B r a i n Re s. , 341 , 200— 3, 1 985、及び Am. J. P y s i o I . , 259, R 31 7 - 23, 1 990) 。

C21 本発明のポリヌクレオチド

本発明のポリヌクレオチドは、本発明のぺプチドをコ一ドするポリヌクレオチドである限り、特に限定されるものではない。

本発明のポリヌクレオチドとしては、配列番号 1で表される塩基配列における 1 1 7番目〜 248番目の塩基からなる配列からなる.ポリヌクレオチド、あるいは、配列番号 1で表される塩基配列における 36番目〜 248番目の塩基からなる配列からなるポリヌクレオチドが好ましい。前者のポリヌクレオチドは、配列番号 3で表されるアミノ酸配列からなるぺプチドをコ一ドし、後者のポリヌクレォチドは、配列番号 2で表されるアミノ酸配列からなるぺプチドをコ一ドする。本明細書における用語「ポリヌクレオチド」には、 DNA及びRNAの両方が含まれる。

本発明のポリヌクレオチドの製造方法は、特に限定されるものではないが、例えば、（a) ポリメラーゼ連鎖反応（PCR) を用いた方法、（b) 常法の遺伝子工学的手法（すなわち、 c DN Aライブラリーで形質転換した形質転換株から、所望の c DN Aを含む形質転換株を選択する方法）を用いる方法、又は（c) 化学合成法などを挙げることができる。以下、各製造方法について、順次、説明する。

PCRを用いた方法 [前記製造方法（a) ] では、例えば、以下の手順により、本発明のポリヌクレオチドを製造することができる。

すなわち、本発明のペプチドを産生する能力を有するヒト細胞又は組織から m RN Aを抽出する。次いで、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて、本発明のぺプチドに相当する mRN Aの全長を挟むことのできる 2個 1組のプライマーセット、あるいは、その一部の mRN A領域を挟むことのできる 2個 1組のプライマーセットを作成する。反応条件（例えば、変性温度又は変性剤添加条件など）を適切に調整して、逆転写酵素一ポリメラーゼ連鎖反応（RT— PCR) を行なうことにより、本発明のペプチドをコードする全長 c DN A又はその一部を得ることができる。

また、本発明のペプチドを産生する能力を有するヒト細胞又は組織から調製した mRN Aから、逆転写酵素を用いて作製した c DN A、あるいは、市販のヒト細胞又は組織由来の c DN Aを錶型として、 PCRを実施することによつても、本発明のぺプチドをコ一ドする全長 c DN A又はその一部を得ることができる。より詳細には、まず、本発明のペプチドの産生能力を有する細胞又は組織から、本発明のぺプチドをコ一ドする mRN Aを含む総 RN Aを既知の方法により抽出する。抽出法としては、例えば、グァニジン■チオシァネート■ホット■フエノール法、グァニジン■チオシァネート一グァニジン ·塩酸法、又はグァニジン■ チオシァネート塩化セシウム法等を挙げることができるが、グァニジン■チオシァネ一ト塩化セシウム法を用いることが好ましい。本発明のぺプチドの産生能力を有する細胞又は組織は、例えば、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチド又はその一部を用いたノーザンブロッテイング法、あるいは、本発明のぺプチドに特異的な抗体を用いたウェスタンブロッテイング法などにより特定することができる。

続いて、抽出した mRN Aを精製する。 mRN Aの精製は常法に従えばよく、例えば、 mRNAをオリゴ（d T) セルロースカラムに吸着後、溶出させることにより精製することができる。所望により、ショ糖密度勾配遠心法等により mR N Aを更に分画することもできる。また、 mRN Aを抽出しなくても、市販されている抽出精製済みの mRN Aを用いることもできる。

次に、精製された mRN Aを、例えば、ランダムプライマー、オリゴ d Tブライマ一、及び又はカスタム合成したプライマーの存在下で、逆転写酵素反応を行ない、第 1鎖 c DNAを合成する。この合成は、常法によって行なうことができる。得られた第 1鎖 c DN Aを用い、目的ポリヌクレオチドの全長又は一部の領域を挟んだ 2種類のプライマーを用いて PCRを実施し、目的とする c DNA を増幅することができる。得られた DN Aをァガロースゲル電気泳動等により分画する。所望により、前記 DN Aを制限酵素等で切断し、接続することによって目的とする DNA断片を得ることもできる。また、ゲノム DNAから目的とする DN A断片を得ることもできる。

常法の遺伝子工学的手法を用いる方法 [前記製造方法（b) ] では、例えば、以下の手順により、本発明のポリヌクレオチドを製造することができる。

まず、前記の PCRを用いた方法で調製した mRN Aを錶型として、逆転写酵素を用いて 1本鎖 c DN Aを合成した後、この 1本鎖 c DN Aから 2本鎖 c DN Aを合成する。その方法としては、例えば、 S 1ヌクレアーゼ法（E f s t r a t i a d i s, A. ら， Ce l I , 7 , 279-288, 1 976) 、 La n d 法（L a n d, H. ら， N u c l e i c Ac i d s Re s. , 9, 2251 一 2266, 1 981 ) 、 0. J o o n Yo o法（Yo o, O. J. ら， P r o c. N a t l . Ac a d. S c に USA, 79, 1 049- 1053, 1 9 83) 、又は O k a y ama— Be r g法（Ok a y ama, H . 及び B e r g, P. , Mo に Ce l に B i o l . , 2, 1 61 -1 70, 1 982) などを挙げることができる。

次に、前記 2本鎖 c DNAを含む組換えプラスミドを作製した後、大腸菌（例えば、 DH5a株、 HB 1 01株、又は JM1 09株）に導入して形質転換させ, 例えば、テトラサイクリン、アンピシリン、又はカナマイシンに対する薬剤耐性を指標として、組換体を選択する。宿主細胞の形質転換は、例えば、宿主細胞が大腸菌の場合には、 H a n a h a nの方法（H a n a h a n, D. J. , Mo に B i o に， 1 66, 557-580, 1 983) 、すなわち、 C a C I ₂、 M gC I ₂、又は Rb C I を共存させて調製したコンビテン卜細胞に、前記組換え DN A体を加える方法により実施することができる。また、市販のコンビテン卜細胞を使用することもできる。なお、ベクターとしては、プラスミド以外にもラ厶ダ系などのファージベクターを用いることもできる。

このようにして得られる形質転換株から、目的の c DN Aを有する形質転換株を選択する方法としては、例えば、以下に示す（1 ) 合成オリゴヌクレオチドプローブを用いるスクリーニング法、又は（2) PCRにより作製したプローブを用いるスクリーニング法を用いる方法を採用することができる。

合成オリゴヌクレオチドプローブを用いるスクリーニング法 [前記選択方法

(1 ) ] では、例えば、以下の手順により、目的の c DN Aを有する形質転換株を選択することができる。

すなわち、本発明のぺプチドの全部又は一部に対応するオリゴヌクレオチドを合成し、これをプローブ（³²P又は³³ Pで標識する）として、形質転換株の DN Aを変性固定したニトロセルロースフィルターとハイブリダィズさせ、得られた陽性株を検索して、これを選択する。なお、プローブ用のオリゴヌクレオチドを合成する場合には、コドン使用頻度を用いて導いたヌクレオチド配列とすることもできるし、あるいは、考えられるヌクレオチド配列を組合せた複数個のヌクレォチド配列とすることもできる。後者の場合には、イノシンを含ませてその種類を減らすことができる。

PCRにより作製したプローブを用いるスクリーニング法 [前記選択方法

(2) ] では、例えば、以下の手順により、目的の c DN Aを有する形質転換株を選択することができる。

すなわち、本発明のぺプチドの一部に対応するセンスプライマー及びアンチセンスプライマーの各オリゴヌクレオチドを合成し、これらを組合せて PC Rを行ない、目的ペプチドの全部又は一部をコードする DN A断片を増幅する。ここで用いる錶型 DN Aとしては、本発明のぺプチドを産生する細胞の mRN Aより逆転写反応にて合成した c DN A、又はゲノム DN Aを用いることができる。このようにして調製した DN A断片を、例えば、 ³²P又は³³ Pで標識し、これをプロ —ブとして用いてコロニーハイブリダィゼーシヨン又はプラークハイブリダィゼーションを行なうことにより、目的の c DNAを有する形質転換株を選択する。得られた目的の形質転換株よリ本発明のポリヌクレオチドを採取する方法は、公知の方法（例えば、 S amb r o o k, J . ら， "Mo l e c u l a r C I o n I n g— A L a b o r a t o r y Ma n u a l , C o l d S p r ι n g H a r b o r L a b o r a t o r y, N Y, 1 989) に従って実施することができる。例えば、細胞よりプラスミド DN Aに相当する画分を分離し、得られたプラスミド DN Aから c DN A領域を切り出すことにより行なうことができる。

化学合成法を用いた方法 [前記製造方法（c) ] では、例えば、化学合成法によって製造した DN A断片を結合することによって、本発明のポリヌクレオチドを製造することができる。各 DNAは、 DNA合成機 [例えば、 O l i g o 1 000M DNA S y n t h e s i z e r ( B e c k m a n社製）、又は 39 4 DNA RNA S y n t h e s i z e r ( A p p I i e d B i o s y s t erns社製）など] を用いて合成することができる。

また、本発明のポリヌクレオチドは、本発明のペプチドの情報に基づいて、例えば、ホスフアイト■ トリエステル法（H u n k a p i I I e r , M. ら, N a t u r e, 1 0, 1 05- 1 1 1 , 1 984 ) 等の常法に従い、核酸の化学合成により製造することもできる。なお、所望アミノ酸に対するコドンは、それ自体公知であり、その選択も任意でよく、例えば、利用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、常法に従って決定することができる（C r a n t h a m, R. ら， N u c l e i c A c i d s R e s. , 9 , r 43— r 74, 1 98 1 ) 。更に、これら塩基配列のコドンの一部改変は、常法に従い、所望の改変をコードする合成ォリゴヌクレオチドからなるプライマーを利用した部位特異的突然変異誘発法 (s i t e s p e c i f i c mu t a g e n e s i s) (Ma r k, D . r . ら， P r o c. N a t l . A c a d. S c に USA, 8 1 , 5662-566 6, 1 984) 等により実施することができる。

これまで述べた種々の方法により得られる DNAの配列決定は、例えば、マキサム一ギルバートの化学修飾法（Ma x am, A. M. 及び G i I b e r t , W. , "Me t h o d s i n E n z ymo I o g y" , 65, 499— 55 9, 1 980) ゃジデォキシヌクレオチド鎖終結法（Me s s i n g, J . 及び V i e i r a, J . , G e n e, 1 9, 269-276, 1 982) 等により行なうことができる。

Γ31 本発明の発現ベクター、形質転換体、及びペプチド製造方法

単離された本発明のポリヌクレオチドを、適当なベクター DN Aに再び組込むことにより、宿主細胞（真核生物及び原核生物の各宿主細胞を含む）を形質転換させることができる。また、これらのベクターに適当なプロモーター及び形質発現にかかわる配列を導入することにより、それぞれの宿主細胞においてポリヌクレオチドを発現させることが可能である。

例えば、真核生物の宿主細胞には、脊椎動物、昆虫、及び酵母等の細胞が含まれ、脊椎動物細胞としては、例えば、サルの細胞である COS細胞（G I u zm a n, Y. , Ce l l , 23, 1 75- 1 82, 1 981 ) 、チャイニーズ■ハムスター卵巣細胞（CHO) のジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株（U r I a u b, G. 及び C h a s i n , L. A. ， P r o c. N a t l . Ac a d. S c に U S A, 77, 421 6-4220, 1 980) 、ヒト胎児腎臓由来 H E K 293 細胞、及び前記 H EK293細胞にェプスタイン ·バーウィルスの EBN A— 1 遺伝子を導入した 293— EBNA細胞（ I n v i t r o g e n社）等を挙げることができる。

脊椎動物細胞の発現ベクターとしては、通常発現しょうとするポリヌクレオチドの上流に位置するプロモーター、 RN Aのスプライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写終結配列等を有するものを使用することができ、更に必要により、複製起点を有していることができる。前記発現ベクターの例としては、例えば、 S V 40の初期プロモーターを有する pSV2 d h f r (S u b r ama n i , S. ら， Mo に C Θ I に B i o l . , 1， 854-864, 1 981 ) 、ヒ卜の延長因子プロモーターを有する p E F— BOS (M i z u s h i ma, S. 及び N a g a t a , S. , N u c l e i c Ac i d s Re s. ， 1 8, 53 22, 1 990) 、サイトメガロウィルスプロモーターを有する p CEP 4 ( I n v i t r o g _θ n社）等を挙げることができる。

宿主細胞として COS細胞を用いる場合には、発現ベクターとして、 SV40 複製起点を有し、 COS細胞において自律増殖が可能であり、更に、転写プロモ —ター、転写終結シグナル、及び RNAスプライス部位を備えたものを用いることができ、例えば、 pME 1 8S (M a r u y a m a , K. 及び T a k e b e, Y. , Me d. I mm u n o I . , 20, 27-32, 1 990) 、 p E F-B OS (M i z u s h i m a , S. 及び N a g a t a, S. , N u c l e i c A c i d s Re s. , 1 8, 5322, 1 990) 、又は p C DM 8 (S e e d, B. , N a t u r e, 329, 840-842, 1 987) 等を挙げることがでさる。

前記発現ベクターは、例えば、 DEAE—デキストラン法（L u t hma n, H. 及び M a g n u s s o n, G. ， N u c l e i c Ac i d s Re s. , 1 1 , 1 295- 1 308, 1 983 ) 、リン酸カルシウム一 D Ν Α共沈殿法 (G r a h am, F . L . 及び v a n d e r Ed, A. J. , V i r o I o g y , 52, 456-457, 1 973) 、市販の卜ランスフエクション試薬 (例えば、 F uGENE^TM6 T r a n s f e c t i o n Re a g e n t ; R o c β D i a g n o s t i c s社製）を用いた方法、あるいは、電気パスル穿孔法（N e uma n n, E. ら， EMBO J . 1 , 841—845, 1 9 82) 等により、 COS細胞に取り込ませることができる。

また、宿主細胞として CHO細胞を用いる場合には、本発明のペプチドをコ一ドするポリヌクレオチドを含む発現ベクターと共に、 G41 8耐性マーカーとして機能する n e o遺伝子を発現することのできるベクター、例えば、 p RSVn e o (S amb r o o K, J. b, Mo l e c u l a r C l o n i n g— A

La b o r a t o r y Ma n u a l , Co l d S p r i n g H a r b o r La b o r a t o r y, NY, 1 989 ) 又は p S V 2— n β o (So u t h Θ r n , P. J . 及び B e r g, P. , J . Mo に A p p I . Ge n e t . , 1 , 327-341 , 1 982) 等をコ ' トランスフエクトし、 G41 8 耐性のコ口ニーを選択することにより、本発明のぺプチドを安定に産生する形質転換細胞を得ることができる。

また、宿主細胞として 293— EBN A細胞を用いる場合には、発現ベクターとして、ェプスタイン■バ一ウィルスの複製起点を有し、 293— £8 細胞で自己増殖が可能な PCEP4 ( I n V i t r o g e n社）などを用いることができる。

本発明の形質転換体は、常法に従って培養することができ、前記培養により細胞外に本発明のぺプチドが生産される。前記培養に用いることのできる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種の培地を適宜選択することができる。例えば、 COS細胞の場合には、例えば、 RPM I— 1 640培地又はダルべッコ修正イーグル最小必須培地（DMEM) 等の培地に、必要に応じて牛胎仔血清（FBS) 等の血清成分を添加した培地を使用することができる。また、 293-EBN A細胞の場合には、牛胎仔血清（ F B S ) 等の血清成分を添加したダルベッコ修正イーグル最小必須培地（DMEM) 等の培地に G41 8を加えた培地を使用することができる。

本発明の形質転換体を培養することにより、前記形質転換体の細胞外に生産される本発明のぺプチドは、前記べプチドの物理的性質や生化学的性質等を利用した各種の公知の分離操作法により、分離精製することができる。具体的には、本発明のペプチドを含む培養液を、例えば、通常のタンパク質沈殿剤による処理、限外濾過、各種液体クロマトグラフィー [例えば、分子ふるいクロマトグラフィ一（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換体クロマトグラフィー、ァフィ二ティクロマトグラフィー、又は高速液体クロマトグラフィー（HP L C) 等] 、若しくは透析法、又はこれらの組合せ等により、本発明のペプチドを精製することができる。

本発明のぺプチドは、マーカー配列とインフレームで融合して発現させることにより、本発明のペプチドの発現の確認、又は精製等が容易になる。前記マーカ一配列としては、例えば、 F LAGェピトープ、へキサーヒスチジン■タグ、へマグルチニン .タグ、又は my cェピトープなどを挙げることができる。また、マ一カー配列と本発明のペプチドとの間に、プロテアーゼ（例えば、ェンテロキナーゼ、ファクター X a、又はトロンビンなど）が認識する特異的なアミノ酸配列を挿入することにより、マーカー配列部分をこれらのプロテアーゼにより切断除去することが可能である。

本発明のペプチドは、これまで述べたような、本発明の形質転換体を用いる製造方法以外にも、例えば、ペプチド自動合成機による化学合成法によっても製造が可能である。ペプチド自動合成機には、例えば、アプライドバイオシステムズ社 43 OA型、ミリポア社 9050型、又は島津製作所 PSSM— 8型等があり、いずれも樹脂に固定したァミノ酸誘導体に 1ァミノ酸ずつカルボキシル末端から結合させる固相合成を行なうことができる。この方法には、ァミノ基についている保護基（Bo。基）のトリフルォロ酢酸による切断を用いる t Bo c法と、ピペリジンで Nひ位の Fmo c基を外す Fmo c法とが公知であり、いずれも脱保護によリ樹脂から外した後、高速液体ク口マトグラフィ一等で精製することができる [大海■辻村■稲垣編，細胞工学別冊 Γ抗ぺプチド抗体実験プロトコ一ル J p 25-46 (1 994) 秀潤社] 。

本発明のペプチドに反応する抗体（例えば、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体）は、例えば、各種動物に、本発明のペプチド、又はその断片を直接投与することで得ることができる。また、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入したプラスミドを用いて、 DNAワクチン法（Ra z, E. ら, P r o c. N a t l . Ac a d. S c に USA, 91 , 951 9-9523, 1 994 ;又は Do n n e l I y , J . J . ら, J. I n f e c t . D i s. , 1 73, 31 4-320, 1 996 ) によっても得ることができる。

ポリクローナル抗体は、例えば、本発明のペプチド又はその断片を適当なアジュパント（例えば、フロイン卜完全アジュバントなど）に乳濁した乳濁液を、腹腔、皮下、又は静脈等に免疫して感作した動物（例えば、ゥサギ、ラット、ャギ, 又は二ヮ卜リ等）の血清又は卵から製造することができる。このように製造された血清又は卵から、常法のタンパク質単離精製法によリポリク口ーナル抗体を分離精製することができる。そのような分離精製方法としては、例えば、遠心分離，透析、硫酸アンモニゥムによる塩析、又は DE A E—セルロース、ハイドロキシァパタイト、若しくはプロテイン Aァガロース等によるクロマトグラフィ一法を挙げることができる。

モノクローナル抗体は、例えば、ケーラーとミルスタインの細胞融合法（Ko h I Θ r , G. 及び M i I s t e i n, C. , N a t u r e, 256, 495— 497, 1 975) により、当業者が容易に製造することが可能である。

すなわち、本発明のペプチド又はその断片を適当なアジュバント（例えば、フロイント完全アジュバントなど）に乳濁した乳濁液を、数週間おきにマウスの腹腔、皮下、又は静脈に数回繰り返し接種することにより免疫する。最終免疫後、脾臓細胞を取り出し、ミエローマ細胞と融合してハイプリドーマを作製する。ハイプリドーマを得るためのミエ口一マ細胞としては、例えば、ヒポキサンチン一グァニン一ホスホリボシルトランスフエラーゼ欠損又はチミジンキナーゼ欠損のようなマーカーを有するミエローマ細胞（例えば、マウスミエローマ細胞株 P 3 X63Ag 8. U 1 ) を利用することができる。また、融合剤としては、例えば、ポリエチレングリーコールを利用することができる。更には、ハイプリド一マ作製における培地として、例えば、イーグル氏最小必須培地、ダルベッコ氏変法最小必須培地、又は RPM I— 1 640などの通常よく用いられている培地に、 1 0~300/0のゥシ胎仔血清を適宜加えて用いることができる。融合株は、 HAT選択法により選択することができる。ハイプリドーマのスクリーニングは培養上清を用い、 E L I S A法又は免疫組織染色法などの周知の方法により行ない、目的の抗体を分泌しているハイプリドーマのクローンを選択することができる。また、限界希釈法によってサブクローニングを繰り返すことにより、ハイブリドーマの単クローン性を保証することができる。このようにして得られるハイプリドーマは、培地中で 2〜4日間、あるいは、プリスタンで前処理した BA L BZc系マウスの腹腔内で 1 0〜20日間培養することで、精製可能な量の抗体を産生することができる。

このように製造されたモノクローナル抗体は、培養上清又は腹水から常法のタンパク質単離精製法によリ分離精製することができる。そのような分離精製方法としては、例えば、遠心分離、透析、硫酸アンモニゥムによる塩析、又は DEA E—セルロース、ハイドロキシァパタイト、若しくはプロテイン Aァガロース等によるクロマトグラフィ一法を挙げることができる。

また、モノクローナル抗体又はその一部分を含む抗体断片は、前記モノクロ一ナル抗体をコードするポリヌクレオチドの全部又は一部を発現ベクターに組み込み、適当な宿主細胞（例えば、大腸菌、酵母、又は動物細胞）に導入して生産させることもできる。

以上のように分離精製された抗体（ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を含む）について、常法により、ペプチド分解酵素（例えば、ペプシン又はパパイン等）によって消化を行ない、引き続き、常法のタンパク質単離精製法によリ分離精製することで、活性のある抗体の一部分を含む抗体断片、例えば、 F (a b' ) ₂、 Fa b、 F a b' 、又は F vを得ることができる。

更には、本発明のペプチドに反応する抗体を、クラクソンらの方法又はゼべデらの方法（C I a c k s o n , T. ら， N a t u r e, 352, 624-628, 1 991 ;又は Z e b e d e e , S. ら， P r o c. N a t に Ac a d. S c に USA, 89. 31 75-31 79, 1 992 ) により、一本鎖（ s ί n g I e c h a i n) F v又は F a bとして得ることも可能である。また、マウスの抗体遺伝子をヒ卜抗体遺伝子に置き換えたトランスジエニックマウス（Lo n b e r g, N. ら， N a t u r e, 368, 856— 859, 1 994) に免疫することで、ヒト抗体を得ることも可能である。

本発明のペプチドを用いると、摂食障害、胃酸分泌障害、及び又はインスリン分泌障害の治療に有効な物質をスクリーニングすることができる。前記スクリ一二ングの手順は、特に限定されるものではないが、例えば、本発明のペプチドを用いて、本発明ペプチドの受容体をスクリーニングした後、その受容体を用いて、本発明ペプチドと前記受容体との結合を阻害する化合物（例えば、受容体ァゴニスト又はアンタゴニスト）をスクリーニングすることにより、摂食障害治療に有効な物質を得ることができる。以下、本発明のペプチドを用いる、本発明べプチドの受容体のスクリーニング（以下、受容体スクリーニングと称する）について説明し、続いて、得られた本発明ペプチドの受容体を用いる、本発明べプチドと前記受容体との結合を阻害する化合物のスクリーニング（以下、リガンドスクリーニングと称する）について説明する。

本発明のペプチドを用いると、本発明ペプチドの受容体発現細胞の同定、あるいは、本発明ペプチドの受容体の単離が可能である。本発明ペプチドの受容体を単離するためのスクリーニングを行なう場合、被検試料としては、例えば、受容体が発現していることが予想される細胞の細胞抽出物、あるいは、前記細胞から調製した R N Aを基に作製した c D N A発現ライブラリーを用いることが可能である。 NPYファミリー分子は、それらの受容体として Gタンパク質共役型受容体（GPCR) に結合することが知られている。本発明のペプチドも、同様に、 GPCRに結合し、細胞内へシグナル伝達を行なっている可能性が高い。本発明ぺプチドの受容体を単離することができれば、本発明べプチドの受容体に関するァゴニスト又はアンタゴニス卜の候補化合物を単離することも可能である。受容体スクリーニングは、例えば、以下の手順で実施することが可能である。まず、本発明のペプチドを遺伝子組換え技術により発現させるか、あるいは、化学合成することにより、その精製品を取得する。次いで、その精製ペプチドを標識し、各種細胞株又は初代培養細胞に対して結合アツセィを行ない、これにより受容体を発現している細胞を選定する [本庶 ·新井 ·谷口 '村松編，「新生化学実験講座 7 増殖分化因子とその受容体」 p 203— 236 ( 1 991 ) 東京化学同人] 。標識としては、例えば、 R I標識（例えば、 ³H又は¹²⁵1など）、又は酵素標識（例えば、アルカリホスファターゼ等）を使用することができる。また、本発明のペプチドを標識する代わりに、本発明のペプチドに対する抗体を標識し、本発明ぺプチドと受容体との結合を前記標識抗体を用いて検出することも考えられる。

前記受容体スクリーニングにより、本発明べプチドの受容体又は受容体発現細胞が得られると、前記受容体又は受容体発現細胞と本発明べプチドとの結合活性を指標に、前記結合を阻害する化合物（例えば、受容体ァゴニストやアンタゴニスト）のスクリーニング（リガンドスクリーニング）が可能となる。このリガンドスクリーニング方法にかける被検物質としては、特に限定されるものではないが、例えば、市販されている種々の化合物、ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物、ぺプチド、コンビナトリアル■ケミストリー技術（T e r r e t t , N. K. ら, T e t r a h e d r o n, 5 1 , 8 1 35— 8 1 37， 1 995) によって得られた化合物群、ファージ 'ディスプレイ法（F e I i c i , F. ら， J. Mo に B i o l . , 222, 301 -3 1 0, 1 99 1 ) などを応用して作成されたランダム ·ペプチド群、微生物の培養上清、植物又は海洋生物由来の天然成分、動物組織抽出物、あるいは、ペプチドを化学的又は生物学的に修飾した化合物又はべプチドを用いることができる。

本発明べプチドの活性に影響を与える物質は、本発明べプチドの活性の変化を測定することにより、本発明ペプチドのァゴニスト活性を有する物質（すなわち、本発明ペプチドの活性と同等の活性を有するか、あるいは、活性を亢進する物質）と、本発明ペプチドのアンタゴニスト活性を有する物質（すなわち、本発明ペプチドの活性を阻害する物質）とに大別される。このスクリーニング方法は、本発明ペプチドのァゴニスト活性を有する物質、あるいは、本発明ペプチドのァンタゴニスト活性を有する物質のいずれも選択することができる。本発明のスクリーニング方法は、本発明ペプチドのアンタゴニスト活性を有する物質の選択に、より適している。また、一次スクリーニングとして、本発明ペプチドに結合する物質をスクリーニングし、二次スクリーニングにおいて、本発明ペプチドの受容体の活性の変化を測定し、ァゴニス卜又はアンタゴニストを区別してスクリーニングすることもできる。実施例

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。

実施例 1 ：本発明の新規 N P Y様ペプチドコ一ド'する遺伝子の単離

配列番号 2で表されるァミノ酸配列からなる本発明のペプチドをコードする全長 c DN Aは、ヒ卜精巣由来の市販の c DNA (Ma r a t h o n Re a d y c DNA ; C l o n t e c h社）を錶型 c D N Aとし、ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) により以下の手順で取得した。

1回目の PCR用のフォヮ一ドプライマ一及びリバースプライマーとして、それぞれ、配列番号 4で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号 5で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用した。 1回目の P C Rは、 D N Aポリメラーゼ（P y r o b e s t DNA p o I y m e r a s e ；宝酒造）を用いて、 5%ジメチルスルホキシド（DMSO) 存在下で、 9 4°C (1分間）の変性工程の後、 94°C (30秒間）と 60°C (30秒間）と 7 2°C (1分間）とからなるサイクルを 35回繰り返すことにより実施した。続いて、前記 PC Rにより得られた反応液を 50倍に希釈し、この希釈液を錶型として 2回目の PCRを実施した。 2回目の PCRは、フォワードプライマー及びリバースプライマーとして、それぞれ、配列番号 6で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号 7で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用したこと、そして、サイクル数を 30回としたこと以外は、 1回目の P C Rと同じ条件で実施した。

2回目の PCRの結果、約 0. 2 k b pの DN A断片が増幅された。この断片を、 p CR2. 1プラスミド（ I n V i t r o g e n社）を用いてクローニングした。得られたクローンの塩基配列を、ジデォキシターミネータ一法により DN Aシークェンサ一（AB I 3700 DNA S e q u e n c e r ; Ap p l i e d B i o s y s t ems社）を用いて解析し、配列番号 1で表される塩基配列が得られた。

配列番号 1で表される塩基配列には、 21 3塩基のオープンリーディングフレーム（配列番号 1で表される塩基配列における 36番目〜 248番目の塩基からなる配列）が存在した。このオープンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列（70アミノ酸）は、配列番号 2で表されるアミノ酸配列であった。得られた予想アミノ酸配列について、 v o n H e i j n Θ Gの方法（N u c I e i c Ac i d s Re s. , 14, 4683— 90, 1 986) によリシグナルペプチド配列を予想すると、 N末端から 28番目のアミノ酸（卜レオニン）と 29番目のアミノ酸（システィン）との間にシグナルペプチド分断部位が存在することが判明した。このことから、本遺伝子が分泌ペプチドをコードする遺伝子であることが判明した。

実施例 2 ：本発明の新規 N PY様ペプチドのアミノ酸配列での SWI SS-PR OTに対する B L AS T検索

実施例 1で得られた「配列番号 2で表されるァミノ酸配列からなるぺプチド J のアミノ酸配列について、データベース SWI SS— P ROTに対する B LAS T (Ba s i c l o c a l a l i g nme n t s e a r c h t o o i ) 検索を実施した。既知ペプチドの中には、配列番号 2で表されるアミノ酸配列と同一の配列は存在せず、ペプチド YY (PYY) 前駆体（SWI SS— PROT

A c c No. P 1 0082、アミノ酸残基数 =97個）に対して、 56%で最も高い相同性（ i d e n t i t i e s) を示した。このことから、配列番号 2 で表されるアミノ酸配列からなる本発明のぺプチドが、 N PYファミリーに属する P Y Yに相同性の高い新規べプチドであることが判明した。

実施例 3 ：本発明の新規 NPY様ペプチドのアミノ酸配列での、既知 NPYファミリ一に属する N PY、 PYY、及び ΡΡに対するアラインメント解析

実施例 1で得られた「配列番号 2で表されるアミノ酸配列からなるぺプチド J のアミノ酸配列について、 N P Yファミリ一に属する既知ペプチド 3種、すなわち、ヒ卜 NPY (G β n B a n K A c c. N o. X P 004941 ) , ヒ卜 P YY (Ge n Ba n K Ac c. N o. D 1 3899) 、及びヒト P P (Ge n B a n K Ac c. No. X M 008357 ) の各アミノ酸配列に対する相同性を解析するために、市販のソフトウェア（DN AS I S f o r W i n d ow s V β r 2. 1 ；日立ソフトウェアエンジニアリング）を用いて、ァライメン卜解析を行なった。

結果を図 1に示す。図 1において、「X P」は、配列番号 2で表されるァミノ酸配列からなるペプチドを表わす。また、「一」は、ギャップ部分（すなわち、相当するアミノ酸が存在しないこと）を表わす。ァライメント解析の結果、配列番号 2で表されるァミノ酸配列からなる本発明のぺプチドは、 Ν ΡΥファミリーに属する既知べプチドと高い相同性を有する新規 Ν Ρ Υフアミリーに属する新規ペプチドであり、特に、 Ρ ΥΥに対して相同性が最も高いことが判明した。実施例 4 ：本発明の新規 Ν ΡΥ様べプチドの c DNAでのヒトゲノムドラフト配列データベースに対する B LAST検索

実施例 1で得られた c DN A配列について、ヒ卜ゲノムドラフ卜配列データべースに対する B LAS T検索を実施した。その結果、配列番号 1で表される塩基配列全部を、塩基配列の一部として含む公知の塩基配列として、 G e n B a n K

A c c . N o. A L 590366 (c h r omo s ome λ c l o n e RP 1 3-377 G 1 , D B : 200 1 /05/1 9 P h a s β 1 L e n g t h = 1 94799) 及び G e n B a n K A c c. N o. A J 239323 (c h r omo s ome X c l o n e P A C R P C I — 3 5 1 9 N 1 8 ma p X p 1 1. 2, D B : 200 1 /05/1 9 P h a s Θ 2 L e n g t = 1 02853) が存在した。この結果から、「配列番号 2で表されるアミノ酸配列からなるペプチド」は、 X染色体に遺伝子がコードされるペプチドであり、第 7染色体に存在する N PYや、第 1 7染色体に存在する P Y Y及び P Pとは、ゲノム上で遺伝子的に独立していることが判明した。

実施例 5 ：ヒ卜組織における本発明遺伝子の発現分布の確認

実施例 1で得られた「配列番号 2で表されるアミノ酸配列からなるぺプチド J をコードする遺伝子の組織発現分布を解析するために、ヒ卜各組織由来 c DNA を錶型とし、 PCRを以下の手順で実施した。

1回目の PC R用のフォヮ一ドプライマ一及びリバースプライマ一として、それぞれ、配列番号 4で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号 5で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用した。 1回目の PC Rは、 D N Aポリメラ一ゼ（E x T a q D N A p o l yme r a s e ;宝酒造）を用いて、 5%DMSO存在下で、 94°C (1分間）の変性工程の後、 9 4°C (30秒間）と 60°C (30秒間）と 72°C (45秒間）とからなるサイクルを 40回繰り返すことにより実施した。

続いて、前記 PC Rにより得られた各反応液を 50倍に希釈し、この各希釈液を錶型として 2回目の PCRを実施した。 2回目の PCRは、フォワードプライマ一及びリバースプライマーとして、それぞれ、配列番号 6で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号 7で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用したこと、そして、サイクル数を 35回としたこと以外は、 1回目の PCRと同じ条件で実施した。

その結果、約 0. 2 k b pの DNA断片が、摂食機能を司る視床下部に由来する c DN Aで増幅されることが確認された。この結果は、実施例 1で得られた遗伝子でコードされるペプチドの摂食機能を裏付ける結果となった。また、視床下部以外にも、 PYYや PPと同じように、脳下垂体及び小腸に由来する各 c DN Aでも増幅されること力《確認された。従って、 PYYや PPと同じように、胃酸の分泌抑制及びィンスリン分泌抑制機能を併せ持つ可能性もある。

実施例 6 ：動物細胞での F LAGェピトープ付加 XP発現系の構築

本実施例では、実施例 1で得られた「配列番号 2で表されるアミノ酸配列からなるペプチド」をコードする遺伝子（以下、 XP遺伝子と称する）を、マーカー配列 F LAGェピ卜一プとの融合ペプチド（以下、 X P— F LAGペプチドと称する）として動物細胞で発現させるための発現ベクターを構築し、更に、動物細胞において前記 XP— F LAGぺプチドの発現を確認した。

具体的には、 C末端側にマーカー配列 F L A Gェピトープをィンフレームで融合して発現される X P遺伝子（XP— F LAG) の増幅は、フォワードプライマ一として、配列番号 8で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用し、リバースプライマーとして、配列番号 9で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用した。配列番号 9で表される塩基配列には、 F LAG配列が含まれる。これにより、 XPペプチドの発現の検出を簡便化することができる。また、前記の各プライマーの 5' 末端には、それぞれ、 Kp n I認識配列又は No t I 認識配列が付加してある。 PCRは、実施例 1で得られた X Pぺプチドをコ一ドする c DN Aを錶型として、 D N Aホリメラーセ (P y r o b e s t DNA p o l yme r a s e ; 宝酒造）を用い、 94°C (2分間）の変性工程の後、 94°C (30秒間）と 5 5°C (30秒間）と 72°C (30秒間）とからなるサイクルを 20回繰り返すことにより実施した。その結果、約 250 b pの DN A断片が増幅された。この断片を、 pCR2. 1プラスミド（ I n v i t r o g e n社）を用いてクローニングした。得られたクローンの塩基配列は、ジデォキシターミネータ一法により D N Aシークェンサ一（A B 1 3700 DNA S e q u e n c e r ； Ap p l i e d B i o s y s t ems社）で解析し、 X P— F L A G遺伝子と合致したクローンを選択した。前記クローンを制限酵素 Kp n I及び N o t Iで消化し、動物細胞発現用 P CEP 4プラスミド（ I n V i t r o g e n社）に挿入した。

6ウェレプレ一卜 (Co l I a g e n— T y p e I— Co a t e d 6 we I I p I a t Θ ; AS AH I TECHNO G LASS社）に H EK293 細胞（1 X 1 0⁵細胞 Zゥエル； I n v i t r o g e n社）を播種して 24時間培養した後、先に構築した XP— F LAG発現プラスミドゥエル）を、市販のトランスフエクション試薬（F uGENE6 ; Bo e r i n g e r Ma n n h e i m社）を用いて遺伝子導入した。前記遺伝子導入から 72時間経過後から、ハイグロマイシン B含有培地で遺伝子導入細胞の選択を行ない、得られた薬剤耐性細胞を XP— F LAG発現細胞として用いた。 XP— F LAG発現細胞を" I 0 c mシャーレ（Co l I a g e n— T y p e I— Co a t e d ； ASAH I TECHNO G LASS社）でコンフルェントになるまで培養した後、培地を廃棄し、 0. 5%ゥシ胎仔血清（FBS) 添加 DM EM培地にて 4日間培養した後、 XP— F LAGペプチド含有培地を回収した。

XP— F LAGぺプチドの発現確認は、ウェスタンブロッ卜解析によリ行なつ Tこ。具体的には、 SDS (s o d i um d o d e c y l s u l f a t e ; 卜デシル硫酸ナトリウム）レムリ（L a emm l i ) 緩衝液（第一化学薬品）を用いてサンプル調製した回収培地を、 SDSZ1 5 %~ 25%アクリルアミドゲル (第一化学薬品）を用いて、 SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS -PAGE) を行なった後、二卜ロセルロース膜に転写した。得られた転写膜を、市販のブロッキング試薬（ブロックエース：大日本製薬）でブロッキングした後、マウス抗 F LAGモノクローナル抗体 M2 (S i gma社）と、西洋わさびパーォキシダーゼ標識ゥサギ抗マウス I gGポリクローナル抗体（Z yme d社）とを順次反応させた。反応後、市販の検出試薬（ECLウェスタンブロッテイング検出システム；アマシャムフアルマシア社）を用いて、 XP— F LAGペプチドの発現を確認した。抗 F LAGモノクローナル抗体 M 2と反応するべプチドは、空ベクター P CEP4を導入した細胞には存在しないが、 XP— FLAGぺプチドを発現した培地では、約 6 k D aのバンドとして検出された。 XP— F LAG ペプチドの推定分子量は、 61 91. 41 Daであり、ほぼ予測される分子量にバンドが存在した。

実施例 7 ： XPペプチドに対する内在性受容体のスクリーニング系の横築

本実施例では、 X Pぺプチドに対する内在性受容体のスクリーニング系を構築した。

具体的には、 48ゥエルプレート（Co l l a g e n-T y p e l -Co a t e d 48 we I I p l a t e ; ASAH I TECHNO GLASS 社）に HEK293細胞（3 x 1 0⁴細胞ウエル）を播種して 24時間培養した後、ォ一ファン受容体発現プラスミド（5 O n gZゥエル）とルシフェラーゼ' レポ一タープラスミド pSRE— I u c又は pCRE— I u c ( 1 0 n g/ ゥエル； S t r a t a g e n Θ社製）とを市販のトランスフエクシヨン試薬（F u GENE 6) により遺伝子導入した。次の日に、 X P— F LAGペプチドを含む培地に交換し、 5時間反応させた後、細胞内ルシフ Iラーゼ活性をルミノメータ一 (ML3000 I um i n ome t e r ； Dy n a t e c h l a b o r a t o r i e s社）にて測定した。

この系において、前記ォーファン受容体発現プラスミドとして、公知の各種ォ —ファン受容体遺伝子を含む各種発現プラスミドを遺伝子導入することで、 X P ぺプチドに対する内在性受容体のスクリーニングが可能となる。産業上の利用可能性

本発明のペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び前記ポリヌクレオチドを含む形質転換体は、摂食障害、胃酸分泌障害、及び又はインスリン分泌障害の治療剤の製造に有用であり, また、摂食障害、胃酸分泌障害、及び又はインスリン分泌障害の治療剤として有効な物質のスクリーニングにも有用である。配列表フリーテキスト

以下の配列表の数字見出し < 223>には、「A r t i f i c i a l S e q u e n c ej の説明を記載する。具体的には、配列表の配列番号 8及び 9の配列で表される各塩基配列は、人工的に合成したプライマー配列である。以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。

Claims

請求の範囲

1 . 配列番号 3で表されるアミノ酸配列からなるぺプチド。

2 . 配列番号 2で表されるアミノ酸配列からなるぺプチド。

3 . 請求項 1又は 2に記載のぺプチドをコ一ドするポリヌクレオチド。

4 . 請求項 3に記載のポリヌクレオチドを含む発現べクタ一。

5 . 請求項 3に記載のポリヌクレオチドを含む形質転換体。

6 . 請求項 5に記載の形質転換体を培養する工程、及びペプチドを回収する工程を含むことを特徴とする、請求項 1又は 2に記載のぺプチドの製造方法。

7 . 配列番号 2で表されるアミノ酸配列からなるぺプチドをコードするポリヌクレオチドを含む形質転換真核生物細胞を培養する工程、及びべプチドを回収する工程を含む方法により製造されうるペプチド。

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