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WO2003069345A2 - Analyse von proteinexpressionsmuster - Google Patents

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Publication number
WO2003069345A2
WO2003069345A2 PCT/EP2003/001374 EP0301374W WO03069345A2 WO 2003069345 A2 WO2003069345 A2 WO 2003069345A2 EP 0301374 W EP0301374 W EP 0301374W WO 03069345 A2 WO03069345 A2 WO 03069345A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
detection
mmp
kinase
group
carrier
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/EP2003/001374
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2003069345A3 (de
Inventor
Jürgen Wilhelm Richard BERNHARDT
Felix Oliver Heinrich
Karin Engelhart-Jentzsch
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BIOTESYS GmbH
Original Assignee
BIOTESYS GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BIOTESYS GmbH filed Critical BIOTESYS GmbH
Priority to AU2003226975A priority Critical patent/AU2003226975A1/en
Publication of WO2003069345A2 publication Critical patent/WO2003069345A2/de
Publication of WO2003069345A3 publication Critical patent/WO2003069345A3/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor

Definitions

  • the invention relates to a method for detecting a metabolization process and a carrier for use in a method according to the features in the preambles of claims 1 and 37 and the use of the carrier according to the features in the preamble of claim 55.
  • Sequencing of the human genome has shown that there are approximately 30,000 genes. This corresponds to approximately 1% of the human genome. Each gene in the human genome encodes more than one protein. It is even believed that there are between 200,000 and 500,000 proteins, although only a fraction of the proteins are expressed in a certain cell type. In addition, the proteins are also subject to post-translational changes. These changes take place before the proteins unfold their final biological function.
  • Proteome analysis has meanwhile become an excellent means of observing cellular processes and will contribute more and more to essential findings in the elucidation of various cellular functions in the future. It is therefore of great importance to provide suitable analysis methods for the detection of protein expression patterns. So far, some procedures have been developed that solve this question more or less well. It should be borne in mind that due to the advanced automation, the issue of miniaturization and parallelization is becoming increasingly important.
  • capillary electrophoresis One method of separating proteins and peptides is by capillary electrophoresis. The separation takes place through the use of high voltage, which Allows osmotic and electrophoretic flow of the buffer solution and the ions within the capillaries. Capillary electrophoresis itself is only suitable for the separation of proteins but not for their identification.
  • the most common method currently used to analyze multiple protein samples is two-dimensional gel electrophorosis.
  • the entire expressed proteome of a cell type can be recorded. Under certain conditions, changes in the proteome can also be observed.
  • the proteins are separated by isoelectric focusing in the first dimension and, based on the molecular weight in the second dimension, using sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels (SDS-PAGE).
  • SDS-PAGE sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels
  • the method of two-dimensional gel electrophoresis has some intrinsic shortcomings that have hitherto prevented its use as a rapid diagnostic tool for determining the proteome status of a cell.
  • the difficulty in maintaining the biological activity of proteins during the separation process is a limitation for the use of two-dimensional gel electrophoresis.
  • the samples are usually prepared in denaturing and reducing buffers, which fully unfold the proteins and break all disulfide bridges. Most proteins are inactivated in this process. Another problem during the separation is the precipitation of the proteins.
  • the detection of rarely occurring and low-concentration proteins can also be a problem, because up to now there has been no equivalent amplification method like the polymerase chain reaction for DNA for proteins. Some proteins simply cannot be detected because they are too small in number and a large sample volume would have to be loaded onto the gel to compensate for the low concentration.
  • the comigration of proteins during the separation can also mask the presence of rare proteins.
  • 2D gel electrophoresis is also not suitable for the separation of very hydrophobic proteins (in particular for membrane proteins).
  • Membrane proteins are actually systematically excluded because they have a very low solubility in the common two-dimensional gel electrophoresis sample buffer.
  • the two-dimensional gel electrophoresis requires an extraction step and a staining in order to quantify the fractions and to sequence the products and to be able to subject them to mass spectrometry.
  • HPLC High performance liquid chromatography
  • the protein mix is passed through a column during HPLC.
  • the column is filled with a porous matrix and the proteins in Solution are separated as they flow past.
  • the proteins are separated based on their size and electrical charge.
  • the selection of the right column reagents and the matrix is crucial for the successful application of this method. Negative aspects of this technique are the complex sample preparation and the exact strategy regarding the length of the columns, the flow rate, the matrix particle size etc.
  • nuclear magnetic resonance works on the principle of determining the position of the individual atoms in the molecule, based on the magnetic properties of the atomic nucleus.
  • the advantage of nuclear magnetic resonance is that the proteins can be determined in solution. However, it is only suitable for very small proteins.
  • X-ray crystallography over NMR is that proteins of any size can be analyzed. The disadvantage is that not all proteins can be made accessible to crystallization.
  • Surface plasmon resonance-based biosensor technology is available as the latest technology. It enables a higher specificity and sensitivity in the detection and identification of proteins.
  • Surface plasmon resonance technology is unique in protein research because it enables the concentration of bound proteins to be determined and, at the same time, the determination of compound-dependent kinetics and specificity in a system.
  • Surface plasmon resonance sensors have a thin metal layer with the ligands immobilized thereon as sensor surfaces.
  • the surface plasmon resonance measurement method is based on the optical excitation of surface plasmon in thin metal layers. The interaction is directly detectable as an increase in layer thickness.
  • Ciphergen (Palo Alto, USA) developed a carrier on which the ligands, preferably antibodies, are immobilized and bind antigens from a solution.
  • the carrier is evaluated by mass spectrometry.
  • this method is only eightfold in parallel, and its usability is largely limited by the high expenditure on equipment and the difficulty associated with the evaluation of complex mass spectra. So far, this method cannot be used for screening many samples.
  • the object of the invention is therefore to provide a possibility for determining the (pathological) physiological state of a cell, a tissue, an organ or an organ. It is further a part of the invention to demonstrate the protein expression pattern of oxidative stress, skin changes or diabetes mellitus and its sequelae.
  • the object of the invention is achieved by the method according to the features in the characterizing part of claim 1 and independently by the carrier according to the features in the characterizing part of claim 38.
  • the advantage of this method is that the detection of the at least one indicative component provides important information about the (patho) physiological state of a cell, a tissue, organ or organ system and thus about the metabolic process that is in progress or has expired.
  • the detection of the expression of the at least one indicative component enables a targeted analysis of the proteome status of a cell.
  • the expressed proteins of a cell were detected using the mRNA level. However, this proves to be disadvantageous because, as is known today, the mRNA level correlates poorly with the actual expression of the proteins.
  • the Immobilization of the ligand performing and evaluating the analysis.
  • this method can provide information about the presence and strength of the interaction between the indicative component and ligands at the molecular level. It also proves to be advantageous if the at least one indicative component is formed from substances which occur in organic liquids or solids, and thus detects both physiological and pathological processes in the organism at the molecular level, thereby considerably simplifying the research into the causes.
  • the at least one indicative component can also be quantified in addition to the identification and thus a statement is made about the intensity of the expression of the indicative components, on which important therapy decisions can subsequently depend.
  • the indicative components it is also advantageous to separate them if necessary and a selection of the components for additional analysis steps, such as Purification processes to undergo.
  • a further development of the method according to claim 3 is advantageous because even slight changes in the indicative component can indicate far-reaching consequences for the cell or for the entire organism. For example, it is assumed that the state of conformity of some indicative components can decide on the pathogenicity or non-pathogenicity, e.g. the amyloid protein in Alzheimer's disease or the prions in BSE. Another advantage is that by adding active ingredients and / or ingredients from the pharmaceutical, cosmetic or food industry, their effects on the indicative components can be tested.
  • the method enables the volume of the substances to be analyzed and that of the reagents to be reduced and thus the costs to be minimized. Another advantage is that parallel analysis is possible.
  • An embodiment of the method according to claim 7 proves to be advantageous, wherein for indicative components which do not have a corresponding ligand, this is synthesized and thus a much larger number of indicative components is detected.
  • the use of a ligand of biological origin has the advantage that the elimination of the synthesis results in a cost saving.
  • a further development of the method according to claim 8 is advantageous, wherein for the analysis of protein expression patterns there are control systems on the carrier which go through the same process steps as the biomacromolecules for a defined metabolization process and thus provide the user with an option without additional expenditure of time to assess or improve the quality of the analysis result using this control system. Unclear results can be traced back to possible sources of error.
  • Another advantage is that the process costs using the carrier are hardly or not increased compared to processes without controls. It is also an advantage that in the event that the carrier is archived for follow-up checks or later evaluations, the indicative biomacromolecules can be archived together with the quality controls, so that the procedure can be checked at any time and the evaluation can be repeated with the same quality.
  • An embodiment according to claim 9 is advantageous, according to which the detection of the constitutively expressed housekeeping proteins, which are expressed in all eukaryotic cells, regardless of their degree of specialization, enables a quality control of the analysis.
  • the activity of housekeeping proteins is not subject to any special control mechanisms in vivo that have a positive or negative effect on protein expression, and thus suggests a correct analysis without additional controls.
  • An embodiment according to claim 11 proves to be advantageous, according to which end products and not intermediate products, such as. B. DNA, mRNA, etc., which have to be modified further and are therefore still subject to various changes, are detected.
  • the execution of the method according to claim 12 enables the detection of even slight changes in the indicative component and thus provides an extremely sensitive method for analyzing the proteome status of a cell.
  • the further development according to claim 14 is advantageous, according to which the indicative components are identified with different or also with a combination of several detection methods. It proves to be advantageous that methods that are too sensitive or insensitive can be replaced by other methods or that several methods can be combined with one another. Furthermore, the method enables the expression of the indicative components to be presented in such a way that they can be analyzed using various detection methods.
  • the surface plasmon resonance technology advantageously makes it possible to determine a broad spectrum of information relating to the specificity, affinity, kinetics and concentrations which are involved in protein interactions.
  • the samples can be analyzed not only in aqueous solution, but also in solutions that contain organic components such as cell or membrane preparations. It is also advantageous that interactions or the extent of the interactions between ligand and the at least one component are detected. Due to the degree of interaction between ligand and component, a targeted procedure for the selection of suitable ligands can be followed.
  • an embodiment of the method according to claim 17 proves to be advantageous, according to which both a single step of the metabolization process is detected or the sequence of the steps is verified chronologically.
  • supernatants or cells from cell cultures or cells in physiological liquids, such as blood, urine, saliva can be continuously passed over carriers and a sequence of the chronologically occurring metabolization processes can thus be determined.
  • a further development of the method according to claims 19 to 36 is advantageous, according to which it is possible to identify a wide variety of metabolism-specific proteins.
  • a further advantage is that the detection of proteins specific to the metabolic process, without routine clarification of general laboratory parameters, provides a targeted and thus fast, inexpensive and associated with minimal effort. This is advantageous, for example, in the field of outpatient patient treatment. Other areas of application can be sports medicine, occupational medicine and environmental medicine issues.
  • the carrier enables an analysis of a protein expression pattern of different metabolization processes, whereby a large number of different indicative components can be detected. Further developments of the carrier are specified in claims 38 to 54 and the aforementioned advantages of claims 2 to 36 are correspondingly transferable or can be found in the description.
  • the carrier for use in a method according to claim 55 is used in both the pharmaceutical, cosmetic and food industries.
  • the method can be used both for the detection of changes in the expression of biomacromolecules after exposure of the cells to a pharmaceutical and cosmetic active ingredient and to a food.
  • the dimension of the slide of the subject invention includes the dimensions of a slide.
  • the carrier may also be sized to be compatible with standard measuring devices currently on the market.
  • the size of the carrier can also be adapted to the sample chamber size of a mass spectrometer.
  • Shapes such as B. a cuboid, a cube, a ball or other cross-sections of the plate-like formation, such as square, round, etc., can be used for the carrier.
  • the carrier is preferably designed in platelet form and the sample (s) to be examined is or are applied to this carrier.
  • the carrier can both have a smooth surface and be formed with depressions (wells).
  • the shape of the wells can be rectangular, square, oval or round.
  • the bottom of the wells can be square, round, U-shaped or V-shaped.
  • Crosspieces are formed between the wells to prevent cross-contamination between the samples in the adjacent wells.
  • a metal film on a grid in a substrate (glass) is preferably used as the material for the production of the carrier.
  • the metal film is between 35 and 200 nm thick. But it is also possible to form the carrier from plastic.
  • these supports can be provided with a metallic layer or core made of a magnetic material, so that the removal The carrier can be easily removed from the sample solution after the biomacromolecules have been attached.
  • the support with at least one cover layer in order to protect the underlying surface with the ligands bound to it from unintended external influences, e.g. from scratching and thus destroying surface areas.
  • This cover layer can also be arranged to be at least partially removable.
  • Biomolecular interactions for the analysis of a proteome are examined by means of interaction analyzes on biomacromolecule-ligand systems, the ligand being a probe, a molecule of lower molecular weight of biological or synthetic origin (peptides, oligonucleotides or small organic molecules).
  • ligands have highly specific structural features which interact with a biomacromolecule when there are corresponding structures.
  • One or more ligands can be used.
  • a large number of ligands, each of which specifically bind a specific protein, are immobilized on different fields of a carrier.
  • the ligand is bound covalently or by adsorption to an organic or inorganic surface (glass, plastic, metal, etc.). This generation of a specific boundary layer on the surface gives it bioactivity.
  • the ligands are bound to the surface of the support directly or via a linker.
  • the linker can be any organic or inorganic molecule that changes the surface of the support and facilitates binding of the ligand.
  • Linkers bind the ligands covalently or non-covalently to the surface of the support.
  • the linker used is preferably 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane (GPTS) and / or aldehyde and / or aminosilane and / or streptavidin and or biotin and / or thiol and / or magnetic materials.
  • GPTS 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane
  • At least one ligand for at least one of the housekeeping proteins ⁇ -actin and / or GAPDH is applied to the carrier.
  • the quality of the analysis is checked with this control ligand.
  • Native protein structures are preferably preferred for the detection of a metabolization process, because the secondary structure of proteins can lead to complications during the analysis.
  • Tissue samples blood cells, biopsies, etc.
  • liquid samples blood, plasma, saliva, urine, pleural or peritoneal fluid, etc.
  • the proteins can be labeled using standard methods, so that they can then be detected using appropriate detection methods, such as fluorescence or chemiluminescence measurements.
  • the interaction of the ligands with the biomacromolecules on the carrier are determined using enzyme assays using chemiluminescence and / or fluorescence and / or in the case of radioactive labeling using autoradiography or phosphoimager analysis and / or electron microscopy and / or mass spectrometry and / or surface plasmon resonance, and / or colorimetric Methods proven.
  • biomacromolecules are applied to the carrier.
  • the biomacromolecules are either in a tissue, e.g. as a histological preparation, in solution or bound to a substrate, e.g. Beads, applied to the surface of the carrier.
  • An ideal instrument for the parallel measurement of a large number of protein samples is the support with a large number of measuring fields, which, when incubated with the sample, allows a quick statement about the presence of its proteome without any markings.
  • a measurement using surface plasmon resonance technology is unspecific, it cannot differentiate between different chemical changes. The specificity depends only on the pair of molecules that react with each other. One partner of the pair is the ligand, the other the biomacromolecule. A pair of molecules that binds specifically can be detected using surface plasmon resonance technology.
  • the sensor now detects the ligand with the bound biomacromolecule, a change in the metal surface in the plasmon field is observed and the change in the wavelength of the incident light is measured.
  • the size of the change is proportional to the amount of biomacromolecule in the sample. Due to the high specificity between ligand and biomacromolecule, no other samples can be incorrectly detected by the sensor.
  • Chemiluminescence, fluorescence measurements, autoradiography, etc. can of course also be used as alternative detection methods.
  • the indicative component or the ligand for example with biotin, digoxigenin, dyes, such as e.g. Cy3, Cy5, etc., or radioactively labeled.
  • the distribution of the signals provides information about which subset of proteins is expressed and thus about the (patho) physiological state of the tissue.
  • the simultaneous and parallel measurement of a large number of cellular proteins increases the meaningfulness of the results many times over.
  • the method of mass spectrometry can also be technologically combined with surface plasmon resonance.
  • the surface plasmon resonance technology also enables a characterization of the binding partner and information about the specificity of the binding, which is particularly important if only small amounts of the sample are present.
  • Mass spectrometry then offers a suitable means of identifying proteins based on the search for mass spectral data against proteins from expression-sequence-tagged databases (EST).
  • the elution of the surface plasmon resonance analysis enables enough material for mass spectrometry.
  • the aim is to carry out mass spectrometry directly on the carrier in order to avoid loss of material during transmission. It would increase both the sensitivity of the detection and the speed of the analysis. It was therefore necessary to present the proteins and the ligands in such a way that detection using several measurement methods is possible.
  • the oxidative stress response of the cell was selected as an example of an application.
  • An imbalance between antioxidants and oxidants in favor of the oxidants is called oxidative stress.
  • the human organism has antioxidants such as Tocopherols, quinones, carotenoids, ascorbic acid and glutation.
  • Oxidative stress is accompanied by an increased occurrence of reactive compounds. This includes radicals but also other reactive compounds, such as hydrogen peroxide, hydroperoxide, or singlet oxygen, which are summarized with the term reactive oxygen compounds (ROS). They have a high oxidizing potential in common, although a gradation of responsiveness has remained.
  • ROS reactive oxygen compounds
  • Oxidative stress leads to modifications of all important macromolecules in the cell.
  • the peroxidation of lipids in the cell membrane leads to a change in the Fluidity of the membrane and thus also a change in the permeability.
  • the oxidation of proteins is characterized by the loss of free thiol groups and the introduction of free carbonyl groups. These molecular modifications involve conformational changes or protein interactions, which in turn can lead to loss of function.
  • Indicative components that are altered by the influence of oxidative stress can be primary mediators of stress, selected from a group comprising epidermal growth factor receptor (EGF-R), and / or interleukin-1 receptor (II-1R) and / or tumor Necrosis factor- ⁇ receptor (TNF- ⁇ R).
  • EGF-R epidermal growth factor receptor
  • II-1R interleukin-1 receptor
  • TNF- ⁇ R tumor Necrosis factor- ⁇ receptor
  • antioxidant enzymes are able to react specifically with free radicals, so that no new reactive proteins are created.
  • These antioxidative enzymes include manganese superoxide dismutase (Mn-SOD), zinc superoxide dismutase (Zn-SOD), catalase, and / or glutathione peroxidase, glutathione-S-transferase, ⁇ -glutamyltransferase, nicotinamide adenine dinucleotide hydrogen reductase ( NADH reductase), ascorbyl reductase, phospholipase C, phospholipase A2, cyclooxygenase-1 and / or cyclooxygenase-2. Although these enzymes are constitutive, they are increasingly induced in the formation of reactive oxygen compounds.
  • endothelial cell-associated molecules selected from a group comprising intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), vascular adhesion molecule-1 (VCAM-1), monocyte chemoattractant protein (MCP-1), E-selectin, and / or Hemoxygenase-1 (HO-1), inducible nitrogen oxide synthase (iNOS) and / or myeoloperoxidase, provides information about the exposure to oxidative stress.
  • ICM-1 intercellular adhesion molecule-1
  • VCAM-1 vascular adhesion molecule-1
  • MCP-1 monocyte chemoattractant protein
  • E-selectin E-selectin
  • HO-1 Hemoxygenase-1
  • iNOS inducible nitrogen oxide synthase
  • myeoloperoxidase myeoloperoxidase
  • oxidative stress also triggers the induction of signal transduction-associated molecules, selected from a group comprising Ras, Rac, and / or Cdc 42, NADPH oxidase enzyme complex, Raf, Mitogen activated / extracellular signal regulated kinase (MEK), Extracellular signal-regulated kinase (ERK kinase), mitogen activated / extracellular signal regulated kinase kinase (MEKK), mitogen-activated protein kinase kinase 4 (MKK4), c-Jun NH 2 -terminal kinase (JNK kinase), p21 activated kinase (PAK), Mitogen-activated protein kinase kinase 3 (MKK3), Mitogen-activated protein kinase kinase 6 (MKK6), P38 kinase, c-Jun, activating protein-1 (
  • cytokines selected from a group comprising interleukin-l (Il-l ⁇ ), Il-lß, and / or 11-4, H-6, and / or 11-8, tumor necrosis factor-oc (TNF- oc), Tumor growth factor-ß (TGF-ß), TGF-ßl, and or NFKB, CXC Chemokine receptor-2 (CXCR-2), Melanoma growth stimulatory activity (MGSA / Gro ⁇ ), Epidermal growth factor (EGF), platelet derived growth factor (PDGF), fibroblast growth factor (bFGF), interferon- ⁇ (IFN- ⁇ ), granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), endothelin-1 (ET-1) and / or prostaglandin synthase , the exposure to oxidative stress is demonstrated.
  • Il-l ⁇ interleukin-l
  • Il-lß tumor necrosis factor-oc
  • TGF-ß Tumor growth factor-ß
  • TGF-ßl
  • oxidative stress leads to oxidative changes in the nucleotides of the DNA.
  • the damage caused must be repaired by repair mechanisms, which can be demonstrated by the increase in ornithine decarboxylase. If the load on the respective cell is too great, apoptosis is induced.
  • Apoptosis is detected by gene products associated with apoptosis, selected from a group comprising Bax, Bcl-2, Caspase-3, Caspase-6, Caspase-7 and / or Caspase-8.
  • HSP heat shock proteins
  • cell contact-associated proteins selected from a group comprising ⁇ -catenin, ⁇ -catenin, E-cadherin, and / or M-cadherin, N-cadherin and / or desmoglein, allows a conclusion to be drawn about the extent of the oxidative stress ,
  • the concentration of the matrix-degrading and / or -building mediators selected from a group comprising the matrix metalloproteinase-1 (MMP-1; collagenase-1), MMP-2 (gelatinase A), MMP-3 (stromelysin-1), MMP- 7 (Matrilysin), MMP-8 (Collagenase-2), MMP-9 (Gelatinase B), MMP-10 (Stromelysin-2), MMP-11 (Stromelysin-3), MMP-12 (Macrophage elastase), MMP- 13 (Collagenase-3), MMP-14 (MT1-MMP), MMP-15 (MT2-MMP), MMP-16 (MT3-MMP), MMP-17 (MT4-MMP), tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1 (TIMP-1), TIMP-2, TEvIP-3 and / or TIMP-4, provides information about the exposure to oxi- dating stress for the body.
  • MMP-1 matrix metalloproteinase-1
  • a statement about the uptake and metabolism of antioxidants can also be made at the cell culture level. Antioxidative effects of complex matrices or extracts can be recorded and the active components can be determined both qualitatively and quantitatively.
  • primary cultures from trachea, skin and aorta can be obtained as a starting point.
  • the cultured cell lines include human skin fibroblasts, human keratinocytes, human endothelial cells, human bronchial epithelial cells and HL60 cells.
  • the effect of high-energy radiation on the triggering of oxidative stress and on pathological changes in the normal metabolism of the skin can be demonstrated by the detection of primary mediators of stress, selected from a group comprising epidermal growth factor receptor (EGF-R), interleukin-1 receptor (II - 1R) and / or tumor necrosis factor receptor (TNF- ⁇ R) and of antioxidative enzymes selected from a group comprising superoxide dismutase (SOD), catalase and / or glutathione peroxidase.
  • EGF-R epidermal growth factor receptor
  • II - 1R interleukin-1 receptor
  • TNF- ⁇ R tumor necrosis factor receptor
  • SOD superoxide dismutase
  • catalase catalase
  • glutathione peroxidase glutathione peroxidase
  • a transcription factor is activated via a protein kinase cascade.
  • This activation is carried out by signal transduction-associated molecules, selected from a group comprising Ras, Rac, Cdc 42, NADPH oxidase enzyme complex, Raf, Mitogen activated / extracellular signal regulated kinase (MEK), Extracellular signal-regulated kinase (ERK kinase), Mitogen activated / extracellular signal regulated kinase kinase (MEKK), Mitogen-activated protein kinase kinase 4 (MKK4), c-Jun NH 2 -terminal kinase (JNK kinase), p21 activated kinase (PAK), Mitogen-activated protein kinase kinase 3 (MKK3), Mitogen-activated protein kinase kinase 6 (MKK6), P38 kinase,
  • signal transduction-associated molecules selected from
  • the method can comprise matrix-degrading and building-up biomacromolecules, selected from a group comprising the matrix metalloproteinase-1 (MMP-1; collagenase-1), MMP-2 (gelatinase A), MMP-3 (stromelysin-1), MMP-7 ( Matrily-sin), MMP-8 (Collagenase-2), MMP-9 (Gelatinase B), MMP-10 (Stromelysin-2), MMP-11 (Stromelysin-3), MMP-12 (Macrophage elastase), MMP- 13 (Collagenase-3), MMP-14 (MT1-MMP), MMP-15 (MT2-MMP), MMP-16 (MT3-MMP), MMP-17 (MT4-MMP), tissue inhibitor of matrix metalloproteinase Detect -1 (TIMP-1), TIMP-2, TIMP-3, TIMP-4, proline hydroxy
  • Matrix metalloproteinases encompass a whole family of matrix-degrading Enzymes that are able to break down native collagen and elastin. It is now known that matrix metalloproteinases not only play a crucial role in skin aging, but are also important in cancer development.
  • UV radiation also activates cytokines and growth factors, which are important mediators of the immune and inflammatory reactions.
  • the proteome analysis enables the relevant indicators, selected from a group comprising interleukin-l ⁇ (H-l ⁇ ), D-lß, and / or 11-4, 11-6, and / or 11-8, tumor necrosis factor- ⁇ (TNF - ⁇ ), tumor growth factor-ß (TGF-ß), TGF-ßl, and / or NFKB, CXC Chemokine receptor-2 (CXCR-2), melanoma growth stimulatory activity (MGSA / Gro ⁇ ), epidermal growth factor (EGF ), platelet derived growth factor (PDGF), fibroblast growth factor (bFGF), interferon- ⁇ (IFN- ⁇ ), granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), endothelin-1 (ET-1) and / or Prostaglandin synthase, to be proven for immune and inflammatory reactions.
  • interleukin-l ⁇ H-
  • HSP heat shock proteins
  • HSP 70 selected from a group comprising HSP 70, HSP 27, and / or HSP 47, HSP 65, and / or HSP 72, alpha (l) -acid glycoprotein and / or CCAAT enhancer binding protein
  • apoptosis-associated gene products selected from a group comprising Bax, Bcl-2, and / or Caspase-3, Caspase-6 , Caspase-7 and / or Caspase-8, which can be detected by means of the carrier.
  • the proteome analysis enables the relevant indicators for melamine synthesis, e.g. Tyrosinase, and for lipid production e.g. Sphingomyolase (SMase), which can be detected in cell-free body fluids such as serum, cereprospinal fluid, urine, lacrimal fluid, synovial fluid and saliva, after an extraordinary exposure, for an increased risk of skin diseases and, as a result, to detect carcinogenic degeneracies.
  • Sphingomyolase Sphingomyolase
  • the ligands applied to the carrier further represent cell-cell contact-associated proteins, selected from a group comprising ⁇ -catenin, and / or ⁇ -catenin, E-cadherin, M-cadherin, N-cadherin desmoglein, and endothelial cells-associated molecules , selected from a group comprising intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), vascular adhesion molecule-1 (VCAM-1), e-selectin, hemoxygenase-1 (HO-1), and / or nitric oxide synthase (NOS) , as well as housekeeping proteins ß-actin and / or GAPDH, for control.
  • IAM-1 intercellular adhesion molecule-1
  • VCAM-1 vascular adhesion molecule-1
  • HO-1 hemoxygenase-1
  • NOS nitric oxide synthase
  • Diabetes mellitus is a metabolic disorder characterized by hyperglycemia. Hyperglycemia is triggered by a defect in insulin secretion or action. As a result, not only the carbohydrate metabolism but also the lipid and protein metabolism are disturbed. Chronic hyperglycaemia associated with diabetes leads to a number of complications with associated functional disorders of organs.
  • the proteome analysis enables the relevant indicators such as the pigment epithelium factor-1 (IGF-1) and / or the vascular endothelial growth factor (VEGF) to be detected at an early stage and a sufficient therapy to be initiated.
  • IGF-1 pigment epithelium factor-1
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • the proteome analysis enables the relevant nephropathy-associated indicators, selected from a group comprising Soluble VCAM-1, Collagen IV, Albumin, Transforming Growth Factor-ß (TGF-ß), Protein Kinase C, PI3 kinase, Serum- and Glucocorticoid-induced protein kinase- 1 (SGK-1), endothelin, angiotensin-converting enzyme (ACE), renin, prorenin, connective tissue growth factor, advanced glycation end-product peptides, C-peptides and / or plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1), to be proven early and to initiate adequate therapy.
  • TGF-ß Transforming Growth Factor-ß
  • TGF-ß Transforming Growth Factor-ß
  • Protein Kinase C Protein Kinase C
  • PI3 kinase Serum- and Glucocorticoid-induced protein kinase- 1
  • endothelin endothel
  • Neuropathies are detected early using proteome analysis based on pigment epithelium-derived factor and / or HbAlc.
  • the proteome analysis enables the relevant indicators, selected from a group comprising epidermal growth factor receptor, interleukin-1 receptor, tumor necrosis factor- ⁇ receptor, SOD, and / or catalase, glutathione peroxidase, E-selectin, HO-1, NO synthase, ICAM-1, and / or VCAM-1, II-1- ⁇ , and / or Il-lß, 11-4, and / or II-6, II-8, TNF- ⁇ , TGF-ß, CXCR-2 , MGSA / Gro ⁇ , EGF, and / or PDGF, bFGF, and / or TGF-ß 1, IFN-ß, GM-CSF, ET-1 and / or prostaglandin synthase, for an increased risk of atherosclerosis and, as a result, cardiovascular complications demonstrated.
  • relevant indicators selected from a group comprising epidermal growth factor receptor, interleukin-1 receptor, tumor necrosis factor- ⁇ receptor, SOD, and / or cat
  • Diabetes can also be detected by the detection of signal transduction-associated molecules, selected from a group comprising Ras, Rac, Cdc 42, NADPH oxidase enzyme complex, Raf, Mitogen activated / extracellular signal regulated kinase (MEK), Extracellular signal-regulated kinase (ERK kinase ), Mitogen activated / extracellular signal regulated kinase kinase (MEKK), Mitogen-activated protein kinase kinase 4 (MKK4), c-Jun NH 2 -terminal kinase (JNK kinase), p21 activated kinase (PAK), Mitogen-activated protein kinase kinase 3 (MKK3), mitogen-activated protein kinase kinase 6 (MKK6), P38 kinase, c-Jun, activating protein-1 (AP-1), activating protein-2 (AP-2), signal transducer and activator
  • the proteome analysis enables the relevant indicators of a number of pathological processes and associated metabolism processes to be recorded and thus to facilitate the early detection of consequential damage.
  • This carrier for proteome analysis is primarily designed for the assessment of clinical questions using biological samples (biopsy material, body fluids). Furthermore, the carrier is also used for cell culture lysates and samples of three-dimensional models in research for the basics and application-related questions in the pharmaceutical and cosmetic skin care areas.
  • EGF epidermal growth factor
  • Ligands with specific binding sites complementary to amino acid sequences according to Seq. ID Nos. 1 to 11 immobilized in different fields of the carrier by means of covalent bonding.
  • a ligand with a complementary amino acid sequence to the housekeeping protein ⁇ -actin is immobilized in at least one field of the carrier.
  • the biomacromolecules, in particular the proteins from cells, are isolated according to the standard methods given in the literature, in which the original conformation of the proteins is approximately retained.
  • the proteins are not labeled, since they are detected using surface plasmon resonance analysis methods, and this technology allows biomacromolecules to be labeled without labeling.
  • TNF- ⁇ tumor necrois factor- ⁇
  • Ligands with specific binding sites complementary to the amino acid sequence of the polypeptide according to Seq. ID No. 12 immobilized on the surface by adsorption to a linker.
  • a ligand with a complementary amino acid sequence to the housekeeping protein GAPDH is immobilized in at least one field of the carrier.
  • biomacromolecules in particular the proteins from cells, are isolated according to the standard methods given in the literature, in which the original conformation of the proteins is approximately retained.
  • the proteins are coated with fluorescent dyes, e.g. Cy5, marked, and detected by means of fluorescence measurement.
  • fluorescent dyes e.g. Cy5
  • the exemplary embodiments show possible design variants, it being noted at this point that the invention is not restricted to the specifically illustrated exemplary embodiments of the same, but rather also various combinations of the individual exemplary embodiments are possible with one another and this variation possibility is based on the teaching of technical action through the present invention in Ability of the specialist working in this technical field.
  • the scope of protection also includes all conceivable design variants which are possible by combining individual details of the design variant shown and described.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis eines Metabolisierungsprozesses durch Immobilisierung zumindest eines Liganden mit einer spezifischen Bindungsstelle für zumindest ein Biomakromolekül auf einem Träger. Zumindest eine indikative Komponente des Biomakromoleküls eines zellulären Repertoires des Metabolisierungsprozesses in zumindest annähernd nativer und/oder metabolisierter Konformation wird durch die Interaktion der spezifischen Bindungsstelle mit einem aktiven Bindungszentrum der indikativen Komponente identifiziert.

Description

Analvse von Proteinexpressionsmuster
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis eines Metabolisierungsprozesses und einen Träger zur Verwendung in einem Verfahren entsprechend den Merkmalen in den Oberbegriffen der Ansprüche 1 und 37 sowie der Verwendung des Trägers entsprechend den Merkmalen im Oberbegriff des Anspruches 55.
Die Sequenzierung des menschlichen Genoms hat ergeben, dass ca. 30.000 Gene vorhanden sind. Das entspricht ungefähr 1 % des menschlichen Genoms. Jedes Gen im menschlichen Genom kodiert für mehr als ein Protein. Man nimmt sogar an, dass es zwischen 200.000 bis 500.000 Proteine gibt, wobei allerdings nur ein Bruchteil der Proteine in einem bestimmten Zelltyp exprimiert wird. Hinzu kommt, dass die Proteine auch noch posttranslationalen Veränderungen unterliegen. Diese Veränderungen erfolgen bevor die Proteine ihre endgültige biologische Funktion entfalten.
Man weiß inzwischen, dass nur geringfügige Proteinmodifizierungen und Veränderungen in der Natur der Proteininteraktionen und der Proteinlokalisation einen dramatischen Effekt auf die Zellphysiologie haben können. Auch die Konformation eines Proteins ist essentiell um die Rolle die es ausübt zu verstehen. Die Form eines Proteins ist auch pharmakologisch von großer Relevanz, weil die meisten Pharmazeutika aufgrund ihrer Fähigkeit mit einem bestimmten Proteinmolekül zu interagieren, ihre Wirkung entfalten.
Die Proteomanalyse stellt mittlerweile ein hervorragendes Mittel zur Beobachtung zellulärer Prozesse dar und wird in Zukunft immer mehr zu wesentlichen Erkenntnissen bei der Aufklärung verschiedener zellulärer Funktionen beitragen. Es ist daher von großer Bedeutung, geeignete Analyseverfahren zum Nachweis von Proteinexpressionsmustern zur Verfügung zu stellen. Bisher wurden schon einige Verfahren entwickelt, die diese Fragestellung mehr oder weniger gut lösen. Zu berücksichtigen ist, dass durch die vorangetriebene Automatisierung die Fragestellung der Miniaturisierung und Parallelisierung von immer größerer Bedeutung ist.
Zur Analyse des Proteinexpressionsmusters stehen mehrere Methoden zur Verfügung.
Eine Methode zur Auftrennung von Proteinen und Peptiden ist die Kapillarelektrophorese. Die Auftrennung erfolgt durch die Verwendung von hoher Spannung, welche einen elektro- osmotischen und elektrophoretischen Fluss der Pufferlösung und der Ionen innerhalb der Kapillaren ermöglicht. Die Kapillarelektrophorese selbst ist nur zur Auftrennung von Proteinen nicht aber zu deren Identifikation geeignet.
Die gegenwärtig am häufigsten verwendete Methode zur Analyse von mehreren Proteinproben ist die zweidimensionale Gelelektrophorose. Dabei lässt sich im Prinzip das gesamte exprimierte Proteom eines Zelltyps aufzeichnen. Unter bestimmten Bedingungen lassen sich auch Veränderungen im Proteom beobachten. Die Proteine werden durch isoelektrische Foku- sierung in der ersten Dimension und aufgrund des Molekulargewichts in der zweiten Dimension über Natrium-Dodecylsulfatpolyacrylamidgele aufgetrennt (SDS-PAGE). Die Methode der zweidimensionalen Gelelektrophorese weist jedoch einige intrinsische Mängel auf, die den Einsatz als schnelles diagnostisches Werkzeug zur Bestimmung des Proteomstatus einer Zelle bislang verbieten. Die Schwierigkeit, die biologische Aktivität von Proteinen während des Separationsprozesses aufrecht zu erhalten, ist eine Limitierung für den Einsatz der zweidimensionalen Gelelektrophorese. Die Proben werden normalerweise in denaturierenden und reduzierenden Puffern, welche die Proteine komplett entfalten und alle Disulfidbrücken aufbrechen, vorbereitet. Die meisten Proteine werden bei diesem Prozess inaktiviert. Ein weiteres Problem während der Auftrennung ist die Präzipitation der Proteine. Auch der Nachweis von selten und in niedriger Konzentration vorkommenden Proteinen kann ein Problem darstellen, weil es bis dato keine äquivalente Amplifizierungsmethode, wie die Polymerase-Ketten- reaktion für DNA auch für Proteine gibt. Einige Proteine können somit einfach nicht nachgewiesen werden, weil sie in zu geringer Anzahl vorkommen und um die niedrige Konzentration zu kompensieren ein zu großes Probenvolumen auf das Gel geladen werden müsste. Die Comigration von Proteinen während der Separation kann ebenso die Gegenwart von selten vorkommenden Proteinen maskieren. Außerdem ist die 2D-Gelelektrophorese ebenso nicht für die Separation von sehr hydrophoben Proteinen (im speziellen für Membranproteine) geeignet. Membranproteine werden eigentlich systematisch ausgeschlossen, weil sie eine sehr niedrige Löslichkeit in den gängigen zweidimensionalen Gelelektrophoreseprobenpuffer aufweisen. Die zweidimensionale Gelelektrophorese erfordert einen Extraktionsschritt und eine Färbung, um die Fraktionen zu quantifizieren und die Produkte zu sequenzieren und einer Massenspektrometrie unterziehen zu können.
Die Flüssigkeitschromatographie (High Performance liquid chromatography, HPLC) ist eine weitere Methode um Proteine zu identifizieren. Während der HPLC wird der Proteinmix durch eine Säule geschickt. Die Säule ist mit einer porösen Matrix gefüllt und die Proteine in Lösung werden beim Vorbeifließen aufgetrennt. Die Proteine werden aufgrund der Größe und der elektrischen Ladung aufgetrennt. Die Auswahl der richtigen Säulenreagenzien und der Matrix ist entscheidend für die erfolgreiche Anwendung dieser Methode. Negative Aspekte dieser Technik sind die aufwendige Probenzubereitung und die genaue Strategie bezüglich der Länge der Säulen, der Durchflussgeschwindigkeit, der Matrixpartikelgröße etc.
Um die dreidimensionale Struktur von Proteinen zu bestimmen, gibt es zur Zeit zwei Methoden die Kernmagnetresonanz (NMR) und die Röntgenstrahlkristallographie. Die Kernmagnetresonanz funktioniert auf dem Prinzip der Bestimmung der Position der einzelnen Atome im Molekül, basierend auf den magnetischen Eigenschaften des Atomkerns. Der Vorteil der Kernmagnetresonanz ist, dass die Proteine in Lösung bestimmt werden können. Allerdings ist sie nur für sehr kleine Proteine geeignet. Der Vorteil der Röntgenstrahlkristallographie gegenüber der NMR ist, dass Proteine jeder Größe analysiert werden können. Nachteilig ist, dass nicht alle Proteine einer Kristallisation zugänglich gemacht werden können.
Als neueste Technologie steht die Oberflächenplasmonresonanz-basierende Biosensortechnologie zur Verfügung. Sie ermöglicht eine höhere Spezifität und Sensitivität im Nachweis und der Identifikation von Proteinen. In der Proteinforschung stellt die Oberflächenplasmon- resonanztechnologie ein Unikum dar, weil sie die Bestimmung der Konzentration von gebundenen Proteinen und gleichzeitig die Bestimmung verbindungsabhängiger Kinetik und Spezifität in einem System ermöglicht. Oberflächenplasmonresonanzsensoren weisen als Sensor- oberflächen eine dünne Metallschicht mit den darauf immobilisierten Liganden auf. Die Ober- flächenplasmonresonanz-Messmethode beruht auf der optischen Anregung von Oberflä- chenplasmonen in dünnen Metallschichten. Die Wechselwirkung ist als Schichtdickenzuwachs direkt nachweisbar.
Diagnostische Methoden zur Bestimmung von Proteinen als Marker für pathophysiologische Bedingungen beruhen heute in der Regel auf immunologischen Nachweismethoden. Diese Methoden haben den Vorzug, dass - sich soweit ein geeigneter hochaffiner und hochspezifischer Antikörper vorhanden ist - ein sehr spezifischer Immunoassay aufbauen lässt. Es ist allerdings noch nicht gelungen, diese Assays soweit zu parallelisieren, dass simultan eine Vielzahl von verschiedenen Proteinproben bei gleichzeitiger Detektion der Messsignale zu analysieren.
Die Firma Ciphergen (Palo Alto, USA) entwickelte einen Träger, auf welchem die Liganden, bevorzugt Antikörper, immobilisiert werden und Antigene aus einer Lösung binden. Der Träger wird durch Massenspektrometrie ausgewertet. Diese Methode weist im Moment eine nur achtfache Parallelität auf und die Einsatzfähigkeit ist weitgehend durch den hohen apparativen Aufwand und die Schwierigkeit, die mit der Auswertung komplexer Massenspektren verbunden ist, begrenzt. Diese Methode ist bislang nicht für das Screenen vieler Proben anwendbar.
Steward L. Schreiber (MacBeath, G., Schreiber, SL. 2000. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. Science 289: 1760-3.) immobilisiert die Liganden auf Glasträgern und weist mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern die Proteinbindung nach.
Die Gruppe von Ronald Frank (Frank. R., Overwin, H. 1996. SPOT synthesis. Epitope analy- sis with arrays of synthetic peptides prepared on cellulose membranes. Methods Mol. Biol. 66: 149-69.) synthetisiert Peptidbibliotheken vorwiegend auf Zellulosefiltern und weist damit die Proteinbindung mittels ELIS A-Technologie nach. Für den Nachweis von Proteinen in einem definiertem Metabolisierungsprozess, wo auch eine Realzeitbeobachtung eine große Rolle spielt, kommen diese Methoden nicht in Frage, weil sowohl die Fluoreszenzdetektion als auch ELISA-Technologie relativ lange Inkubationsschritte beinhalten und für die schnelle Routineanalyse somit nicht geeignet sind.
Aufgabe der Erfindung ist es daher, eine Möglichkeit zur Bestimmung des (patho)physio- logischen Zustande einer Zelle, eines Gewebes, Organs oder Organsimus anzugeben. Es ist weiters Teilaufgabe der Erfindung das Proteinexpressionsmuster von oxidativem Stress, Hautveränderungen oder Diabetes mellitus und dessen Folgeerscheinungen nachzuweisen.
Die Aufgabe der Erfindung wird durch das Verfahren entsprechend den Merkmalen im Kennzeichenteil des Anspruches 1 und eigenständig auch durch den Träger entsprechend den Merkmalen im Kennzeichenteil des Anspruches 38 gelöst. Der Vorteil dieses Verfahrens liegt darin, dass der Nachweis der zumindest einen indikativen Komponente wichtige Informationen über den (patho)physiologischen Zustand einer Zelle, eines Gewebes, Organs oder Organsystems und somit über den jeweils ablaufenden bzw. abgelaufenen Metabolisierungsprozess gibt. Außerdem ermöglicht der Nachweis der Expression der zumindest einen indikativen Komponente eine gezielte Analyse des Proteomstatus einer Zelle. In bisherigen Verfahren wurden die exprimierten Proteine einer Zelle anhand des mRNA Levels nachgewiesen. Dies erweist sich allerdings als nachteilig, weil, wie man heute weiß, der mRNA Level mit der tatsächlichen Expression der Proteine nur mangelnd korreliert. Des weiteren erleichtert die Immobilisierung des Liganden die Durchführung und Auswertung der Analyse. In Kombination mit geeigneten Detektionsmethoden vermag dieses Verfahren Auskunft über das Vorhandensein und die Stärke der Wechselwirkung zwischen indikativer Komponente und Liganden auf molekularer Ebene geben. Vorteilhaft erweist es sich auch, wenn die zumindest eine indikative Komponente von Substanzen gebildet wird, welche in organischen Flüssigkeiten bzw. Feststoffen vorkommt, und somit sowohl physiologische als auch pathologische Prozesse im Organismus auf molekularer Ebene nachweist und dadurch die Ursachenforschung erheblich vereinfacht.
Von Vorteil nach Anspruch 2 erweist sich, dass die zumindest eine indikative Komponente neben der Identifikation auch quantifiziert werden kann und somit eine Aussage über die Intensität der Expression der indikativen Komponenten getroffen wird, wovon in weiterer Folge wichtige Therapieentscheidungen abhängen können. Für eventuelle weitere Analysen der indikativen Komponenten ist es weiters von Vorteil, diese gegebenenfalls voneinander zu trennen und eine Auswahl der Komponenten zusätzlichen Analyseschritten, wie z.B. Aufreinigungsprozessen, zu unterziehen.
Vorteilhaft ist dabei eine Weiterbildung des Verfahrens nach Anspruch 3, weil bereits geringfügige Veränderungen der indikativen Komponente weitreichende Folgen für die Zelle bzw. für den gesamten Organsimus anzeigen können. Beispielsweise nimmt man an, dass der Kon- formationszustand einiger indikativer Komponenten über die Pathogenität bzw. Nicht- Pathogenität entscheiden kann, wie z.B. das Amyloidprotein bei Morbus Alzheimer oder die Prionen bei BSE. Weiters ist von Vorteil, dass durch die Zugabe von Wirkstoffen und/oder Inhaltsstoffen aus der pharmazeutischen, kosmetischen bzw. Nahrungsmittelindustrie deren Auswirkungen auf die indikativen Komponenten getestet werden können.
Gemäß Anspruch 4 ermöglicht das Verfahren das Volumen der zu analysierenden Substanzen und das der Reagenzien zu reduzieren und somit die Kosten zu minimieren. Von Vorteil ist dabei weiteres, dass eine Parallelität der Analyse ermöglicht wird.
Von Vorteil ist auch die Weiterbildung des Verfahrens nach Anspruch 5, womit als Ligand kleinere Moleküle als die indikative Komponente verwendet werden und somit sterische Hemmnisse und in der Folge unspezifische Interaktionen und somit unspezifische Signale bei der Auswertung räumlich zu dicht angeordneter Moleküle verhindert werden können. Vorteilhaft ist weiters eine Ausführung des Verfahrens nach Anspruch 6, wonach verschiedene Moleküle als Ligand zur Verfügung stehen und somit eine indikative Komponente mit mehreren Liganden nachgewiesen wird, womit auch eine höhere Aussagekraft der Analyse erzielt wird.
Vorteilhaft erweist sich eine Ausführung des Verfahrens nach Anspruch 7, wobei für indikative Komponenten, die keinen korrespondierenden Liganden haben, dieser synthetisiert wird, und somit eine viel größere Anzahl an indikativen Komponenten nachgewiesen wird. Die Verwendung eines Liganden biologischen Ursprungs weist den Vorteil auf, dass durch den Wegfall der Synthese eine Kostenersparnis erfolgt.
Von Vorteil ist dabei eine Weiterbildung des Verfahrens nach Anspruch 8, wobei für die Analyse von Proteinexpressionsmustern Kontrollsysteme auf dem Träger vorhanden sind, welcher dieselben Verfahrensschritte wie die Biomakromoleküle für einen definierten Meta- bolisierungsprozess durchlaufen und damit dem Anwender ohne zusätzlichen Zeitaufwand eine Möglichkeit zur Verfügung steht, die Qualität des Analyseergebnisses über dieses Kontrollsystem zu beurteilen bzw. zu verbessern. Unklare Ergebnisse können dadurch auf mögliche Fehlerquellen zurückverfolgt werden. Ein weiterer Vorteil ist, dass die Verfahrenskosten unter Anwendung des Trägers im Vergleich zu Verfahren ohne Kontrollen kaum bis nicht erhöht sind. Es ist weiters von Vorteil, dass für den Fall, dass der Träger für Nachkontrollen oder spätere Auswertungen archiviert wird, die indikativen Biomakromoleküle, zusammen mit den Qualitätskontrollen archiviert werden können, sodass jederzeit der Verfahrensablauf nachkontrollierbar ist und die Auswertung mit gleichbleibender Qualität wiederholt werden kann.
Vorteilhaft ist dabei eine Ausgestaltung nach Anspruch 9, wonach der Nachweis der konstitu- tiv exprimierten Housekeepingproteine, die in allen eukaryontischen Zellen, unabhängig von deren Spezialisierungsgrad exprimiert werden, eine Qualitätskontrolle der Analyse ermöglicht. Die Aktivität der Housekeepingproteine unterliegt in vivo keinerlei speziellen Kontrollmechanismen, die die Proteinexpression positiv oder negativ beeinflussen, und lassen somit auf eine korrekte Analyse ohne zusätzliche Kontrollen schließen.
So ist bei einer Weiterbildung nach Anspruch 10 von Vorteil, dass sämtliche indikative Komponenten, nämlich sowohl extrazellulär als auch intrazellulärvorkommende Komponenten aus Zeil- bzw. Gewebelysaten analysiert werden können. Weiters ist von Vorteil, dass die indika- tiven Komponenten nicht aufwendig aufgereinigt werden müssen, sondern direkt in das Verfahren eingesetzt werden können und somit ein kosten- und zeitaufwendiger Arbeitsschritt wegfällt.
Vorteilhaft erweist sich dabei eine Ausführung nach Anspruch 11, wonach bereits Endprodukte und nicht Zwischenprodukte, wie z. B. DNA, mRNA, etc., die erst weiter modifiziert werden müssen und somit noch verschiedenen Veränderungen unterliegen, nachgewiesen werden.
Vorteilhafterweise ermöglicht die Ausführung des Verfahrens nach Anspruch 12 bereits geringfügige Veränderungen der indikativen Komponente nachzuweisen und somit eine äußerst sensitive Methode zur Analyse des Proteomstatus einer Zelle zur Verfügung zu stellen.
Von Vorteil ist aber auch die Weiterbildung nach Anspruch 13, weil dieselbe Analyse für den Nachweis von indikativen Komponenten aus Körperflüssigkeiten, Zellen, Geweben oder deren Lysaten als auch für den Nachweis von indikativen Komponenten aus Zellkulturen verwendet werden kann.
Von Vorteil ist die Weiterbildung nach Anspruch 14, wonach die indikativen Komponenten mit verschiedenen bzw. auch mit einer Kombination von mehreren Detektionsmethoden identifiziert werden. Als vorteilhaft dabei erweist sich, dass zu wenig sensitive oder unsensitive Methoden durch andere Methoden ersetzt werden können bzw. mehrere Methoden miteinander kombiniert werden können. Weiters ermöglicht das Verfahren die Expression der indikativen Komponenten derart zu präsentieren, dass sie mittels verschiedener Detektionsmethoden analysiert werden können. Vorteilhafterweise ermöglicht die Oberflächenplasmonresonanz- technologie ein breites Spektrum von Informationen bezüglich der Spezifität, Affinität, Kinetik und Konzentrationen, die in Proteininteraktionen involviert sind, zu bestimmen. Weiters können die Proben nicht nur in wässriger Lösung, sondern auch in Lösungen, die organische Komponenten wie Zeil- oder Membranpräparationen enthalten, analysiert werden. Weiters ist daran vorteilhaft, dass Interaktionen bzw. das Maß der Interaktionen zwischen Ligand und der zumindest einen Komponente nachgewiesen werden. Aufgrund des Maßes der Wechselwirkung zwischen Ligand und Komponente kann eine gezielte Vorgehensweise zur Selektion von geeigneten Liganden verfolgt werden.
Vorteilhaft ist weiters eine Ausführung des Verfahrens nach Anspruch 15, wonach die indi- kativen Komponenten nicht markiert werden müssen und somit Konformationsveränderungen, die eine Markierung bewirken können, verhindert werden. Der Konformationszustand gibt nämlich wichtige Informationen über die Funktionalität der indikativen Komponente. Weiters ist von Vorteil, dass durch den Wegfall der Markierung der indikativen Komponenten diese sofort in das Detektionsverfahren weitergeleitet werden können und somit eine Realzeitbeobachtung des Metabolisierungsprozesses ermöglicht wird.
Von Vorteil erweist sich die Weiterbildung nach Anspruch 16, wonach Metabolisierungspro- zesse sogar schrittweise analysiert werden können und somit ein sehr aussagekräftiges und umfangreiches Ergebnis der Analyse zur Verfügung gestellt wird.
Dabei erweist sich eine Ausführung des Verfahrens nach Anspruch 17 von Vorteil, wonach sowohl ein einzelner Schritt des Metabolisierungsprozesses nachgewiesen wird bzw. auch die Abfolge der Schritte chronologisch nachgewiesen wird. Beispielsweise können Überstände oder Zellen aus Zellkulturen oder Zellen in physiologischen Flüssigkeiten, wie Blut, Urin, Speichelflüssigkeit, kontinuierlich über Träger geleitet werden und somit eine Abfolge der chronologisch stattfindenden Metabolisierungsprozesse bestimmt werden.
Weiters ist nach Anspruch 18 von Vorteil, dass durch die Auswahl definierter Zielproteine keine kostenaufwendige und zeitintensive Screening-Methode aller eventuell möglich vorkommenden Biomakromoleküle benötigt wird.
Von Vorteil ist eine Weiterbildung des Verfahrens nach den Ansprüchen 19 bis 36, wonach es möglich ist, verschiedenste metabolisierungsprozessspezifische Proteine zu identifizieren. Weiters ist von Vorteil, dass durch den Nachweis von metabolisierungsprozessspezifischen Proteinen ohne routinemäßige Abklärung von allgemeinen Laborparametern eine gezielte und somit schnelle, kostengünstige und mit minimalen Aufwand verbundene Methode zur Verfügung steht. Dies ist beispielsweise auf dem Gebiet der ambulanten Patientenbehandlung von Vorteil. Weitere Anwendungsgebiete können sportmedizinische, arbeitsmedizinische und umweltmedizinische Fragestellungen sein.
Gemäß Anspruch 37 ist von Vorteil, dass der Träger einer Analyse eines Proteinexpressionsmusters verschiedener Metabolisierungsprozesse ermöglicht, wobei eine Vielzahl verschiedener indikativer Komponenten nachgewiesen werden kann. Weiterbildungen des Trägers sind in den Ansprüchen 38 bis 54 angegeben und es sind die vorab genannten Vorteile der Ansprüche 2 bis 36 entsprechend übertragbar bzw. können diese der Beschreibung entnommen werden.
Als vorteilhaft erweist sich, dass der Träger zur Verwendung in einem Verfahren nach Anspruch 55 sowohl in der pharmazeutischen- als auch kosmetischen- und auch Nahrungsmittelindustrie Anwendung findet. Das Verfahren kann sowohl zum Nachweis von Veränderungen in der Expression von Biomakromolekülen nach Exposition der Zellen gegenüber einem pharmazeutischen- als auch kosmetischen Wirkstoff als auch gegenüber einem Nahrungsmittel herangezogen werden.
Die Dimension des Trägers der gegenständlichen Erfindung umfasst die Abmessungen eines Objektträgers. Der Träger kann auch eine Größe umfassen, um mit den zur Zeit auf dem Markt befindlichen Standardmessgeräten kompatibel zu sein. Die Größe des Trägers kann aber auch an die Probenkammergröße eines Massenspektrometers angepasst sein.
Es können Formen, wie z. B. ein Quader, ein Würfel, eine Kugel bzw. andere Querschnitte der plättchenförmigen Ausbildung, wie z.B. quadratische, runde, etc., für den Träger verwendet werden. Vorzugsweise ist der Träger jedoch plättchenförmig ausgebildet und wird bzw. werden die zu untersuchenden Probe(n) auf diesen Träger aufgebracht.
Der Träger kann sowohl eine glatte Oberfläche aufweisen als auch mit Vertiefungen (Wells) ausgebildet sein. Die Form der Wells kann sowohl rechteckig, quadratisch, oval oder rund sein. Der Boden der Wells kann quadratisch, rund, U- oder V-förmig ausgestaltet sein. Zwischen den Wells sind Stege ausgebildet, um Kreuzkontaminationen zwischen den Proben in den benachbarten Wells zu verhindern.
Als Material für die Herstellung des Trägers wird vorzugsweise ein Metallfilm auf einem Gitter in einem Substrat (Glas) verwendet. Der Metallfilm ist zwischen 35 bis 200 nm dick. Es ist aber auch möglich, den Träger aus Kunststoff zu bilden.
Es ist z.B. möglich, zumindest annähernd kugelförmige Träger oberflächlich mit Liganden zu versehen, wobei diese Träger in der Folge in eine zu analysierende flüssige Probelösung gegeben werden. Gegebenenfalls können diese derart ausgebildeten Träger mit einer metallischen Schicht oder Kern aus einem magnetischen Material versehen sein, sodass die Entfer- nung der Träger nach Anbindung der Biomakromoleküle aus der Probelösung einfach möglich ist.
Weiters ist es möglich den Träger mit zumindest einer Deckschicht zu versehen, um damit die darunter liegende Oberfläche mit den daran gebundenen Liganden vor unbeabsichtigten, äußeren Einwirkungen zu schützen, z.B. vor Zerkratzen und damit Zerstörungen von Oberflächenbereichen. Diese Deckschicht kann auch zumindest teilweise entfernbar angeordnet sein.
Biomolekulare Interaktionen zur Analyse eines Proteoms werden anhand von Interaktionsanalysen an Biomakromolekül-Ligandensystemen untersucht, wobei der Ligand eine Sonde, ein Molekül geringerem Molekulargewichts biologischer oder synthetischer Herkunft (Pepti- de, Oligonukleotide oder kleine organische Moleküle) darstellt. Solche Liganden weisen hochspezifische Strukturmerkmale auf, die bei vorliegen von korrespondierenden Strukturen an einem Biomakromolekül mit diesem in Wechselwirkung treten. Die Anwendung kann durch einen oder mehrere Liganden erfolgen.
Eine Vielzahl von Liganden, die jeweils ein bestimmtes Protein spezifisch binden, werden auf unterschiedlichen Feldern eines Trägers immobilisiert. Der Ligand wird kovalent oder durch Adsorption an eine organische oder anorganische Oberfläche (Glas, Kunststoff, Metall, etc.) gebunden. Durch diese Generierung einer spezifischen Grenzschicht auf der Oberfläche erhält diese eine Bioaktivität. Die Liganden werden direkt oder über einen Linker an die Oberfläche des Trägers gebunden. Linker kann jedes organische oder anorganische Molekül sein, welches die Oberfläche des Trägers verändert und eine Anbindung des Liganden erleichtert. Linker binden die Liganden kovalent oder nicht kovalent an die Oberfläche des Trägers. Als Linker wird vorzugsweise 3-Glycidoxypropyltrimethoxysilan (GPTS) und/oder Aldehyd- und/oder Aminosilan und/oder Streptavidin und oder Biotin und/oder Thiol und/oder magnetische Materialien verwendet.
Als Kontrollsystem ist auf dem Träger zumindest ein Ligand für zumindest eines der House- keeping-Proteine ß-Aktin und/oder GAPDH aufgebracht. Mit diesem Kontrollliganden wird die Qualität der Analyse überprüft.
Protein Extraktion
Die Verwendung von geeigneten Extraktionsmethoden, vor allem für Membranproteine, spielt eine wichtige Rolle. In vielen Fällen führt die Extraktion bereits zur Denaturierung der Proteine. Die Extraktion aus Flüssigkeiten erweist sich einfacher als aus Geweben. In vielen biologischen Proben, z.B. in physiologischen Flüssigkeiten, stellen Albumin, Hämoglobin und Myoglobin ungefähr 80 % der Proteinmasse dar. Um den unspezifischen Hintergrund, der durch diese Proteine verursacht wird, zu verhindern, werden diese Moleküle mittels Affinitätschromatographie, magnetic beads oder Antikörper vor Zugabe auf den Träger entfernt.
Vorzugsweise werden für den Nachweis eines Metabolsierungsprozesses native Proteinstrukturen bevorzugt, weil die Sekundärstruktur von Proteinen zu Komplikationen während der Analyse führen kann.
Es können sowohl Gewebsproben (Blutzellen, Biopsien, etc.) als auch Flüssigkeitsproben (Blut, Plasma, Speichel, Harn, Pleura- oder Peritonealflüssigkeit, etc.) verwendet werden.
Die Proteine können mit Standardmethoden markiert werden, um sie anschließend mit entsprechenden Detektionsmethoden, wie Fluoreszenz- oder Chemilumineszenzmessungen, nachweisen zu können.
Die Interaktion der Liganden mit den Biomakromolekülen auf dem Träger werden unter Verwendung von Enzymassays mittels Chemilumineszenz und/oder Fluoreszenz und/oder bei radioaktiver Markierung mittels Autoradiographie oder Phosphoimager Analyse und/oder Elektronenmikroskopie und/oder Massenspektrometrie und oder Oberflächenplasmonreso- nanz, und/oder colorimetrische Methoden nachgewiesen.
Bei Inkubation der einzelnen Felder mit biologischen Proben wird dann nur an den Feldern ein Signal detektiert, bei dem das Protein, das an diesen Liganden bindet, in der biologischen Probe vorhanden ist. Auf dem Träger werden nicht, teilweise und/oder vollständig aufgereinigte Biomakromoleküle aufgebracht. Die Biomakromoleküle werden entweder in einem Gewebe, z.B. als histologisches Präparat, in Lösung oder gebunden an ein Substrat, z.B. Beads, auf die Oberfläche des Trägers aufgebracht.
Ein ideales Instrument zur parallelen Messung einer Vielzahl von Proteinproben ist der Träger mit einer Vielzahl von Messfeldern, der bei der Inkubation mit der Probe markierungsfrei eine schnelle Aussage über das Vorhandensein seines Proteoms erlaubt. Eine Messung mittels Oberflächenplasmonresonanztechnologie ist unspezifisch, sie kann nicht zwischen verschiedenen chemischen Veränderungen unterscheiden. Die Spezifität hängt nur von dem Molekülpaar ab, das miteinander reagiert. Ein Partner des Paares ist der Ligand der andere das Biomakromolekül. Ein Molekülpaar das eine spezifische Bindung eingeht, kann mittels Oberflächenplasmonresonanztechnologie detektiert werden.
Wenn nun der Sensor den Liganden mit dem gebundenen Biomakromolekül detektiert, wird eine Veränderung der Metalloberfläche im Plasmonfeld beobachtet und die Veränderung der Wellenlänge des einfallenden Lichts wird gemessen. Die Größe der Veränderung ist proportional zur Menge des Biomakromoleküls in der Probe. Aufgrund der hohen Spezifität zwischen Liganden und Biomakromolekül können keine anderen Proben fälschlicherweise vom Sensor detektiert werden.
Als alternative Detektionsmethoden können natürlich auch Chemilumineszenz-, Fluoreszenzmessungen, Autoradiographie, etc. verwendet werden. Bei Anwendung dieser Verfahren muss die indikative Komponente bzw. der Ligand, beispielsweise mit Biotin, Digoxigenin, Farbstoffen, wie z.B. Cy3, Cy5, etc., oder radioaktiv markiert werden.
Die Verteilung der Signale gibt Aufschluss darüber welches Subset von Proteinen exprimiert wird und damit über den (patho)physiologischen Zustand des Gewebes. Die gleichzeitige und parallele Messung einer Vielzahl zellulärer Proteine steigert die Aussagekraft der Ergebnisse um ein Vielfaches.
Es kann auch das Verfahren der Massenspektrometrie mit der Oberflächenplasmonresonanz technologisch kombiniert werden. Die Oberflächenplasmonresonanztechnologie ermöglicht auch eine Charakterisierung der Bindungspartner und Informationen über die Spezifität der Bindung, was vor allem dann von Bedeutung ist, wenn nur geringe Mengen von der Probe vorhanden sind. Die Massenspektrometrie bietet dann ein geeignetes Mittel zur Identifikation von Proteinen aufgrund der Suche von Massenspektraldaten gegen Proteine von expression- sequence-tagged Datenbanken (EST).
Unter optimalen Bedingungen ermöglicht die Elution der Oberflächenplasmonresonanzanaly- se genügend Material für die Massenspektrometrie. Ziel ist es, die Massenspektrometrie direkt auf dem Träger durchzuführen, um den Materialverlust bei der Übertragung zu vermeiden. Es würde sowohl die Sensibilität der Detektion als auch die Schnelligkeit der Analyse erhöhen. Es bestand daher die Notwendigkeit, die Proteine und die Liganden so zu präsentieren, dass ein Nachweis mit mehreren Meßmethoden möglich ist.
Mit diesem Verfahren kann man beispielsweise verschiedene (patho)physiologische und funktionelle Charakteristika und Konformationsänderungen von Proteinen, Proteinisoformen von verschiedenen Allelen, Zellzyklusstadien, krankheits- und krankheitsstadienspezifische Proteinexpressionmuster, physiologischen Zustand einer Zelle vor und nach medikamentöser Behandlung, Differenzierungs- bzw. Entwicklungsgrad einer Zelle, Zellantwort auf Stimuli aus der Umgebung, wie Hitze, Kälte, Licht, etc., nahrungsmittelabhängige Proteinexpressionsmuster, etc. nachweisen.
Im folgenden werden Beispiele für eine mögliche Auswahl an indikativen Komponenten für die Anwendung des Verfahrens aufgezeigt. Die im folgenden dargestellten Beispiele an möglichen Anwendungen sollen keinerlei einschränkenden Charakter auf den Schutzumfang der Erfindung darstellen.
Ausführungsbeispiel 1:
Analyse des Proteinexpressionsmusters unter oxidativem Stress
Als ein Anwendungsbeispiel wurde exemplarisch der oxidative Stress Response der Zelle ausgewählt. Eine Imbalance zwischen Antioxidantien und Oxidantien zugunsten der Oxidan- tien wird als oxidativer Stress bezeichnet. Der menschliche Organismus verfügt über Antioxidantien, wie z.B. Tocopherole, Chinone, Carotinoide, Ascorbinsäure und Gluthation. Oxidativer Stress ist begleitet von einem verstärkten Vorkommen reaktiver Verbindungen. Dazu gehören Radikale aber auch andere reaktive Verbindungen, wie Wasserstoffperoxid, Hydroperoxid, oder Singulettsauerstoff, die mit der Bezeichnung reaktive Sauer Stoff Verbindungen (ROS) zusammengefasst werden. Ihnen gemein ist ein hohes oxidierendes Potential, wobei eine Abstufung der Reaktionsfreudigkeit durchaus geblieben ist. Gebildet werden diese reaktiven Sauerstoffverbindungen zum einen durch die exogene Einwirkung von Strahlung und Schadstoffen (wie z.B. Zigarettenrauch) und zum anderen endogen im Zuge der Atmungskette, der Immunabwehr, verschiedener Metabolisierungsprozesse und durch Enzymaktivitäten.
Oxidativer Stress führt zu Modifikationen aller wichtigen Makromoleküle der Zelle. Beispielsweise führt die Peroxidation von Lipiden der Zellmembran zu einer Veränderung der Fluidität der Membran und damit auch zu einer Änderung der Permeabilität. Die Oxidation von Proteinen ist durch den Verlust freier Thiolgruppen und durch die Einführung freier Car- bonylgruppen gekennzeichnet. Diese Molekularmodifikationen bringen Konformationsänderungen oder Proteininteraktionen mit sich, die wiederum zum Funktionsverlust führen können.
Indikative Komponenten, die durch den Einfluss von oxidativen Stress verändert werden, können primäre Mediatoren des Stress, ausgewählt aus einer Gruppe umfassend Epidermal growth factor receptor (EGF-R), und/oder Interleukin-1 receptor (II- 1R) und/oder Tumor Necrosis factor-α receptor (TNF-αR), sein.
Ein wichtiger Bestandteil des Abwehrsystems sind antioxidativ wirkende Enzyme. Diese sind in der Lage spezifisch mit freien Radikalen zu reagieren, sodass keine neuen reaktiven Proteine entstehen. Zu diesen antioxidativen Enzymen gehören Mangan Superoxid dismutase (Mn- SOD), Zink Superoxid dismutase (Zn-SOD), Catalase, und/oder Glutathion peroxidase, Glu- tathion-S-transferase, γ-Glutamyltransferase, Nikotinamid adenin dinukleotid hydrogen- reduktase (NADH-Reduktase), Ascorbylreduktase, Phospholipase C, Phospholipase A2, Cyclooxygenase-1 und/oder Cyclooxygenase-2. Diese Enzyme Hegen zwar konstitutiv vor, werden jedoch bei der Bildung von reaktiven Sauerstoff Verbindungen verstärkt induziert.
Die Expression von Endothelzellen assoziierten Molekülen, ausgewählt aus einer Gruppe umfassend Intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), Vascular adhesion molecule-1 (VCAM- 1), Monocyte chemoattractant protein (MCP-1), E-Selectin, und/oder Hemoxygenase-1 (HO- 1), induzierbare Stickoxidsynthase (iNOS) und/oder Myeoloperoxidase, gibt Information über die Belastung durch oxidativen Stress.
Zusätzlich zur direkten Schädigung von Biomakromolekülen löst oxidativer Stress auch die Induktion von Signaltransduktion assoziiertne Moleküle, ausgewählt aus einer Gruppe umfassend Ras, Rac, und/oder Cdc 42, NADPH oxidase enzyme complex, Raf, Mitogen activated/ extracellular signal regulated kinase (MEK), Extracellular signal-regulated kinase (ERK kina- se), Mitogen activated/extracellular signal regulated kinase kinase (MEKK), Mitogen- activated protein kinase kinase 4 (MKK4), c-Jun NH2-terminal kinase (JNK kinase), p21 activated kinase (PAK), Mitogen-activated protein kinase kinase 3 (MKK3), Mitogen-activated protein kinase kinase 6 (MKK6), P38 kinase, c-Jun, aktivierendes Protein-1 (AP-1), aktivierendes Protein-2 (AP-2), Signal transducer and activator of transcription-1 (Statl), Stat2, Stat3, und/oder Proteinkinase C, Cytochrom C-reductase, Retinoic acid receptor- (RAR-α), RAR-ß, RAR-γ und/oder Retinoid X receptor (RXR), aus. In der Folge kommt es zur Transkription zahlreicher Gene.
Durch den Anstieg von Cytokinen ausgewählt aus einer Gruppe, umfassend Interleukin-l (Il-lα), Il-lß, und/oder 11-4, H-6, und/oder 11-8, Tumor necrosis factor-oc (TNF-oc), Tumor growth factor-ß (TGF-ß), TGF-ßl, und oder NFKB, CXC Chemokine receptor-2 (CXCR-2), Melanoma growth stimulatory activity (MGSA/Groα), Epidermal growth factor (EGF), pla- telet derived growth factor (PDGF), Fibroblast growth factor (bFGF), Interferon-γ (IFN-γ), Granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), Endothelin-1 (ET-1) und/oder Prostaglandin synthase, wird die Belastung durch oxidativen Stress nachgewiesen.
Zuerst kommt es durch oxidativen Stress zu oxidativen Veränderungen der Nukleotide der DNA. Die entstandenen Schäden müssen durch Reparaturmechanismen behoben werden, was durch die Zunahme der Ornithindecarboxylase nachgewiesen werden kann. Bei zu großer Belastung für die jeweilige Zelle kommt es zur Induktion der Apoptose. Apoptose wird durch die Apoptose assoziierte Genprodukte, ausgewählt aus einer Gruppe umfassend Bax, Bcl-2, Caspase-3, Caspase-6, Caspase-7 und/oder Caspase-8, nachgewiesen.
Eine erhöhte Expression der Heat-Shock-Proteine (HSP), ausgewählt aus einer Gruppe umfassend HSP 70, HSP 27, HSP 47, HSP 65, HSP 72, Alpha (l)-acid glycoprotein und/oder CCAAT-enhancer binding protein, lässt auch auf eine Zunahme des oxidativen Stress schließen.
Durch den Nachweis von Zellkontakt assoziierten Proteinen, ausgewählt aus einer Gruppe umfassend α-Catenin, ß-Catenin, E-Cadherin, und/oder M-Cadherin, N-Cadherin und/oder Desmoglein, wird ein Rückschluss auf das Ausmaß des oxidativen Stress gezogen.
Die Konzentration der matrixabbauenden und/oder -aufbauenden Mediatoren, ausgewählt aus einer Gruppe umfassend die Matrix Metalloproteinase-1 (MMP-1; Collagenase- 1), MMP-2 (Gelatinase A), MMP-3 (Stromelysin-1), MMP-7 (Matrilysin), MMP-8 (Collagenase-2), MMP-9 (Gelatinase B), MMP-10 (Stromelysin-2), MMP-11 (Stromelysin-3), MMP-12 (Macrophage elastase), MMP-13 (Collagenase-3), MMP-14 (MT1-MMP), MMP-15 (MT2-MMP), MMP-16 (MT3-MMP), MMP-17 (MT4-MMP), Tissue inhibitor of matrix metalloproteinase- 1 (TIMP-1), TIMP-2, TEvIP-3 und/oder TIMP-4, gibt Auskunft über die Belastung durch oxi- dativen Stress für den Körper.
Mit dem Nachweis der Expression der Housekeepingproteine ß-Aktin und/oder Glyceralde- hyd-3-Phosphatdehydrogenase (GAPDH) erfolgt die Qualitätskontrolle der Analyse.
Die Forschungsergebnisse der letzten Jahre weisen auf den Zusammenhang zwischen oxidativen Stress und der Entstehung einer ganzen Reihe von Erkrankungen hin. Hierzu zählen unter anderem Arteriosklerose und seine klinische Manifestationen wie koronare Herzkrankheiten, Angina pectoris, Schlaganfall sowie eine Reihe von entzündlichen Prozessen wie z.B. Rheu- matoide Arthritis. Weiterhin geht man heute davon aus, dass die Bildung aggressiver Radikale bei der Entstehung und Entwicklung einiger Krebsarten und neurodegenerativer Erkrankungen, wie z.B. Morbus Alzheimer, eine wesentliche Rolle spielen.
Selbst bei der Wahl standardisierter Stressoren erzeugen unterschiedliche Zelllinien qualitativ und quantitativ unterschiedliche Expressionsmuster. Das jeweils entstandene Muster der Me- tabolisierungsprodukte ist daher hinsichtlich der Spezifität und Sensitivität des Nachweisverfahrens aussagekräftig. Dies gilt natürlich insbesondere dann, wenn es sich wie im Anwendungsbeispielen um die kombinierte Erfassung unterschiedlichster biologischer Reaktionen handelt. Mit dem geeigneten Detektionssystem, wie z. B. Autoradiographie, Fluoreszenz-, Chemilumineszenzmessungen und insbesondere Oberflächenplasmonresonanzmessungen, sind nicht nur Ja/Nein - Antworten möglich, sondern es können auch Angaben über den physiologischen Zustand der Zellen gemacht werden, womit sich die Einsatzmöglichkeiten des Verfahrens erheblich erweitern.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kann eine Aussage über die Aufnahme und Metaboli- sierung von Antioxidantien auch auf Zellkulturebene getroffen werden. Es können antioxida- tive Wirkungen komplexer Matrices oder Extrakte erfasst werden und die aktiven Komponenten können sowohl qualitativ als auch quantitativ bestimmt werden. Als Ausgangspunkt können neben Zellkulturen von Zelllinien auch Primärkulturen aus Trachea, Haut und Aorta gewonnen werden. Zu den kultivierten Zellinien gehören humane Hautfibroblasten, humane Keratinozyten, humane Endothelzellen, humane Bronchialepithelzellen und HL60- Zellen.
Ausführungsbeispiel 2:
Analyse des Proteinexpressionsmusters bei Hautveränderungen Als dem größten Organ fällt der Haut des Menschen eine wichtige Rolle im Stoffwechsel zu. Der Haut setzen nicht nur endogene pathophysiologische Faktoren, sondern auch allgemeine Umweltfaktoren, wie Sonnenlichtexposition, Zigarettenrauch, etc. zu und können beispielsweise zu einer vorzeitigen Alterung der Haut führen.
Die Wirkung energiereicher Strahlung auf die Auslösung von oxidativem Stress und auf pathologische Veränderungen des normalen Metabolismus der Haut kann durch den Nachweis von primären Mediatoren des Stress, ausgewählt aus einer Gruppe umfassend Epidermal growth factor receptor (EGF-R), Interleukin-1 receptor (II- 1R) und/oder Tumor Necrosis fac- tor- receptor (TNF-αR) und von antioxidativen Enzymen, ausgewählt aus einer Gruppe umfassend Superoxid dismutase (SOD), Catalase und/oder Glutathion peroxidase, identifiziert werden.
Bei der Einstrahlung von UV-Licht kommt es beispielsweise über eine Proteinkinasekaskade zur Aktivierung von Transkriptionsfaktoren. Diese Aktivierung wird durch Signaltransdukti- on assoziierte Moleküle, ausgewählt aus einer Gruppe umfassend Ras, Rac, Cdc 42, NADPH oxidase enzyme complex, Raf, Mitogen activated/extracellular signal regulated kinase (MEK), Extracellular signal-regulated kinase (ERK kinase), Mitogen activated/extracellular signal regulated kinase kinase (MEKK), Mitogen-activated protein kinase kinase 4 (MKK4), c-Jun NH2-terminal kinase (JNK kinase), p21 activated kinase (PAK), Mitogen-activated protein kinase kinase 3 (MKK3), Mitogen-activated protein kinase kinase 6 (MKK6), P38 kinase, c-Jun, aktivierendes Protein- 1 (AP-1) und/oder aktivierendes Protein-2 (AP-2), nachgewiesen.
Nach Sonnenexposition wird auch die Expression matrixab- und/oder aufbauender Protein- asen und ihrer Gegenspieler gesteigert. Das Verfahren kann matrixab- und aufbauender Biomakromoleküle, ausgewählt aus einer Gruppe umfassend die Matrix Metalloproteinase-1 (MMP-1; Collagenase-1), MMP-2 (Gelatinase A), MMP-3 (Stromelysin-1), MMP-7 (Matrily- sin), MMP-8 (Collagenase-2), MMP-9 (Gelatinase B), MMP-10 (Stromelysin-2), MMP-11 (Stromelysin-3), MMP-12 (Macrophage elastase), MMP-13 (Collagenase-3), MMP-14 (MT1- MMP), MMP-15 (MT2-MMP), MMP-16 (MT3-MMP), MMP-17 (MT4-MMP), Tissue inhi- bitor of matrix metalloproteinase-1 (TIMP-1), TIMP-2, TIMP-3, TIMP-4, Prolin- Hydroxylase, Galactosyltransferase, Glucosyltransferase und/oder Factor Xlll-transamidase, nachweisen. Matrix Metalloproteinasen umfassen eine ganze Familie von matrix abbauenden Enzymen, die in der Lage sind natives Collagen und Elastin abzubauen. Inzwischen weiß man, dass Matrix Metalloproteinasen nicht nur in der Hautalterung eine entscheidende Rolle spielen, sondern auch in der Krebsentwicklung von Bedeutung sind.
Die UV-Strahlung bewirkt auch eine Aktivierung von Cytokinen und Wachstumsfaktoren, die wichtige Mediatoren der Immun- und Inflammationsreaktionen sind. Die Proteomanalyse ermöglicht die relevanten Indikatoren, ausgewählt aus einer Gruppe umfassend Interleukin-lα (H-lα), D-lß, und/oder 11-4, 11-6, und/oder 11-8, Tumor necrosis factor-α (TNF-α), Tumor growth factor-ß (TGF-ß), TGF-ßl, und/oder NFKB, CXC Chemokine receptor-2 (CXCR-2), Melanoma growth stimulatory activity (MGSA/Groα), Epidermal growth factor (EGF), pla- telet derived growth factor (PDGF), Fibroblast growth factor (bFGF), Interferon-γ (IFN-γ), Granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), Endothelin-1 (ET-1) und/oder Prostaglandin synthase, für Immun- und Inflammationsreaktionen nachzuweisen.
Eine zu starke Sonnenlichtexposition kann unter anderem auch eine Zellschädigung, nachweisbar durch den Anstieg der Heat Shock Proteine (HSP), ausgewählt aus einer Gruppe umfassend HSP 70, HSP 27, und/oder HSP 47, HSP 65, und/oder HSP 72, Alpha (l)-acid gly- coprotein und/oder CCAAT-enhancer binding protein, und schlimmsten Fall sogar den Zelluntergang nachweisbar durch Apoptose assoziierte Genprodukte, ausgewählt aus einer Gruppe umfassend Bax, Bcl-2, und/oder Caspase-3, Caspase-6, Caspase-7 und/oder Caspase-8, die mittels des Trägers nachgewiesen werden können.
Die Proteomanalyse ermöglicht die relevanten Indikatoren für die Melaminsynthese, z.B. Tyrosinase, und für die Lipidproduktion z.B. Sphingomyolase (SMase), welche in zellfreien Körperflüssigkeiten, wie Serum, Cereprospinalflüssigkeit, Urin, Tränenflüssigkeit, Synovial- flüssigkeit und Speichel, nach außergewöhnlicher Belastung nachgewiesen werden können, für ein erhöhtes Hauterkrankungsrisiko und in der Folge dessen karzinogener Entartungen nachzuweisen.
Die auf dem Träger aufgebrachten Liganden repräsentieren des weiteren Zell-Zell-Kontakt assoziierte Proteine, ausgewählt aus einer Gruppe umfassend α-Catenin, und/oder ß-Catenin, E-Cadherin, M-Cadherin, N-Cadherin Desmoglein, und Endothelzellen assoziierte Moleküle, ausgewählt aus einer Gruppe umfassend Intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), Vas- cular adhesion molecule-1 (VCAM-1), E-Selectin, Hemoxygenase-1 (HO-1), und/oder Stickoxidsynthase (NOS), sowie Housekeeping-Proteine ß-Aktin und/oder GAPDH, zur Kontrolle. Ausführungsbeispiel 3:
Analyse des Proteinexpressionsmusters bei Diabetes mellitus und dessen Folgeerscheinungen
Diabetes mellitus ist eine Stoffwechselerkrankung, die durch Hyperglykämie gekennzeichnet ist. Auslöser der Hyperglykämie ist ein Defekt in der Insulinsekretion oder der Insulinwirkung. In Folge dessen sind nicht nur der Kohlenhydrahtstoffwechsel sondern auch der Lipid- und Proteinstoffwechsel gestört. Die mit Diabetes einhergehende chronische Hyperglykämie führt zu einer Reihe von Folgeerkrankungen mit assoziierten Funktionsstörungen von Organen.
Häufigste Folgeerkrankungen sind Retinopathien bis hin zur Erblindung. Die Proteomanalyse ermöglicht die relevanten Indikatoren wie den Pigment epithelium factor- 1 (IGF-1) und/oder den Vascular endothelial growth factor (VEGF) frühzeitig nachzuweisen und somit eine suffi- ziente Therapie einzuleiten.
Weitere Folgen sind Nephropathien bis bin zur Niereninsuffizienz. Die Proteomanalyse ermöglicht die relevanten Nephropathie assoziierten Indikatoren, ausgewählt aus einer Gruppe umfassend Soluble VCAM-1, Collagen IV, Albumin, Transforming Growth Factor-ß (TGF- ß), Proteinkinase C, PI3 kinase, Serum- und Glucocorticoid-induced protein kinase-1 (SGK- 1), Endothelin, Angiotensin-converting enzyme (ACE), Renin, Prorenin, Connective tissue growth factor, Advanced glycation end-product peptides, C-Peptide und/oder Plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1), frühzeitig nachzuweisen und eine suffiziente Therapie einzuleiten.
Neuropathien werden mittels der Proteomanalyse aufgrund von Pigment epithelium-derived factor und/oder HbAlc frühzeitig nachgewiesen.
Die Proteomanalyse ermöglicht die relevanten Indikatoren, ausgewählt aus einer Gruppe umfassend Epidermal growth factor receptor, Interleukin-1 receptor, Tumor necrosis factor-α receptor, SOD, und/oder Catalase, Glutathion peroxidase, E-Selectin, HO-1, NO synthase, ICAM-1, und/oder VCAM-1, II-1-α, und/oder Il-lß, 11-4, und/oder II-6, II-8, TNF-α, TGF-ß, CXCR-2, MGSA/Groα, EGF, und/oder PDGF, bFGF, und/oder TGF-ß 1, IFN-ß, GM-CSF, ET-1 und/oder Prostaglandin synthase, für ein erhöhtes Artherioskleroserisiko und in der Folge dessen kardiovaskuläre Komplikationen nachzuweisen. Weiters kann Diabetes auch durch den Nachweis von Signaltransduktion assoziierten Molekülen, ausgewählt aus einer Gruppe umfassend Ras, Rac, Cdc 42, NADPH oxidase enzyme complex, Raf, Mitogen activated/extracellular signal regulated kinase (MEK), Extracellular signal-regulated kinase (ERK kinase), Mitogen activated/extracellular signal regulated kinase kinase (MEKK), Mitogen-activated protein kinase kinase 4 (MKK4), c-Jun NH2-terminal kinase (JNK kinase), p21 activated kinase (PAK), Mitogen-activated protein kinase kinase 3 (MKK3), Mitogen-activated protein kinase kinase 6 (MKK6), P38 kinase, c-Jun, aktivierendes Protein-1 (AP-1), aktivierendes Protein-2 (AP-2), Signal transducer and activator of transcription-1 (Statl), Stat2, Stat3, und/oder Proteinkinase C, Cytochrom C-reductase, Reti- noic acid receptor-α (RAR-α), RAR-ß, RAR-γ und/oder Retinoid X receptor (RXR), identifiziert werden.
Da die Folgeerkrankungen die Lebensqualität der Diabetiker ganz entscheidend beeinflussen ist neben der Selbstkontrolle des Blutzuckerspiegels auch eine regelmäßige Übe riifung der Funktion von Niere, Augen und Nerven dringend notwendig. Die Proteomanalyse ermöglicht die relevanten Indikatoren einer Reihe von pathologischen Prozessen und damit verknüpfte Metabolisierungsvorgänge zu erfassen und so die Früherkennung von Folgeschäden zu erleichtern.
Dieser Träger zur Proteomanalyse ist primär für die Einschätzung klinischer Fragestellungen anhand von biologischen Proben konzipiert (Biopsiematerial, Körperflüssigkeiten). Des weiteren wird der Träger auch bei Zellkulturlysaten und Proben dreidimensionaler Modelle in der Forschung für Grundlagen und anwendungsbezogene Fragestellungen im pharmazeutischen Bereich und kosmetischen Skincarebereich eingesetzt.
Ausfuhrungsbeispiel 4:
Nachweis der Expression von Epidermal growth factor (EGF)
Auf einem Objektträger werden Liganden mit spezifischen Bindungsstellen komplementär zu Aminosäuresequenzen gemäß Seq. ID Nos. 1 bis 11 mittels kovalente Bindung in unterschiedlichen Feldern des Trägers immobilisiert. Zur Kontrolle der Analyse ist in zumindest einem Feld des Trägers ein Ligand mit einer komplementären Aminosäuresequenz zum Housekeeping-Protein ß-Aktin immobilisiert. Die Isolation der Biomakromoleküle, insbesondere der Proteine aus Zellen erfolgt gemäß den in der Literatur angegebenen Standardmethoden, bei welchen die ursprüngliche Konformation der Proteine annähernd erhalten bleibt.
Im vorliegenden Ausfuhrungsbeispiel werden die Proteine nicht markiert, da sie mit Oberflä- chenplasmonresonanzanalyseverfahren nachgewiesen werden, und diese Technologie einen markierungsfreien Nachweis von Biomakromolekülen zulässt.
Durch den Nachweis der Konformationsänderung insbesondere der ß-Faltblattstruktur von EGF wird ein Metabolisierungsprozess, welcher beispielsweise indikativ für Hautveränderungen ist, nachgewiesen.
Ausführungsbeispiel 5:
Nachweis der Expression von Tumor-Necrois-factor-α (TNF-α)
Auf einer Mikrotiterplatte werden Liganden mit spezifischen Bindungsstellen komplementär zur Aminosäuresequenz des Polypeptids gemäß Seq. ID No. 12 mittels Adsorption an einen Linker auf der Oberfläche immobilisiert. Zur Kontrolle der Analyse ist in zumindest einem Feld des Trägers ein Ligand mit einer komplementären Aminosäuresequenz zum Housekee- ping-Protein GAPDH immobilisiert.
Die Isolation der Biomakromoleküle, insbesondere der Proteine aus Zellen erfolgt gemäß den in der Literatur angegebenen Standardmethoden, bei welchen die ursprüngliche Konformation der Proteine annähernd erhalten bleibt.
Im vorliegenden Ausführungsbeispiel werden die Proteine mit fluoreszierenden Farbstoffen, wie z.B. Cy5, markiert, und mittels Fluoreszenzmessung detektiert.
Durch den Nachweis der Konformationsänderung unter anderem des TNF-α Proteins wird ein Metabolisierungsprozess, welcher beispielsweise indikativ für oxidativen Stress ist, nachgewiesen.
Abschließend soll darauf hingewiesen werden, dass die Methodik betreffend die Immobilisierung des Liganden, die Isolierung der Proteine und die Nachweismethoden an sich nicht näher erläutert wurden, da sie dem auf dem gegenständlichen Gebiet tätigen Fachmann ohnehin bekannt sind und derartige Ausführungen zur Klarheit des erfindungsgemäßen Verfahrens bzw. Trägers nicht weiter beitragen.
Die Ausfuhrungsbeispiele zeigen mögliche Ausführungsvarianten, wobei an dieser Stelle bemerkt sei, dass die Erfindung nicht auf die speziell dargestellten Ausfuhrungsbeispiele derselben eingeschränkt ist, sondern vielmehr auch diverse Kombinationen der einzelnen Ausführungsbeispiele untereinander möglich sind und diese Variationsmöglichkeit aufgrund der Lehre zum technischen Handeln durch gegenständliche Erfindung im Können des auf diesem technischen Gebiet tätigen Fachmannes liegt. Es sind also auch sämtliche denkbaren Ausführungsvarianten, die durch Kombinationen einzelner Details der dargestellten und beschriebenen Ausführungsvariante möglich sind, vom Schutzumfang mitumfasst.
Diese Ausführungsbeispiele sind nicht beschränkend zu sehen und es können selbstverständlich die darin angegebenen indikativen Komponenten, ausgewählt aus den jeweiligen in der Beschreibung genannten Vorschlägen bzw. alternative Moleküle, ausgewählt werden.
Die den eigenständigen erfinderischen Lösungen zugrundeliegende Aufgabe kann der Beschreibung entnommen werden.

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e
1. Verfahren zum Nachweis eines Metabolisierungsprozesses durch Immobilisierung zumindest eines Liganden mit einer spezifischen Bindungsstelle für zumindest ein Biomakromolekül auf einem Träger, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest eine indikative Komponente des Biomakromoleküls eines zellulären Repertoires des Metabolisierungsprozesses in zumindest annähernd nativer und oder metabolisierter Konformation durch die Interaktion der spezifischen Bindungsstelle mit einem aktiven Bindungszentrum der indikativen Komponente identifiziert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die zumindest eine indikative Komponente separiert und/oder quantifiziert wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass Veränderungen, insbesondere Konformationsveränderungen, der indikativen Komponente nachgewiesen werden.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass ein miniaturisierter Träger, z.B. ein Objektträger, verwendet wird.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Molekulargewicht des Liganden kleiner ist als das der indikativen Komponente.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest ein Ligand, ausgewählt aus einer Gruppe umfassend Proteine, Peptide, insbesondere Polypeptide, oder Aptamere, verwendet wird.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Ligand biologischer oder synthetischer Herkunft verwendet wird.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest ein weiterer Ligand durch die Interaktion mit zumindest einer weiteren indikativen Komponente die Qualität der Analyse bestimmt.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Qualität des Verfahrens durch den Nachweis der Expression der Housekeepingproteine ß-Aktin und/oder Glyceraldehyd-3 Phosphatdehydrogenase (GAPDH) kontrolliert wird.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die zumindest eine indikative Komponente aus Körperflüssigkeiten und/oder Zellen und/oder Geweben gewonnen wird.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die zumindest eine indikative Komponente ausgewählt aus einer Gruppe umfassend Proteine, Peptide, Hormone, Vitamine, Mono-, Oligo- und/oder Polysaccharide oder Lipide gebildet wird.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die zumindest eine indikative Komponente von einem Metaboliten gebildet wird.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die zumindest eine indikative Komponente sowohl in vivo- als auch in vitro-Metabolisie- rungsprozesse nachweist.
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Interaktion durch zumindest eine Detektionsmethode, ausgewählt aus einer Gruppe umfassend Fluoreszenz-, Chemilumineszenzmessungen, Autoradiographie, Massenspektrometrie und/oder Oberflächenplasmonresonanztechnologie, nachgewiesen wird.
15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die zumindest eine Komponente markierungsfrei mittels Oberflächenplasmonresonanztech- nologie identifiziert wird.
16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass durch die Interaktion des zumindest einen Liganden mit der zumindest einen indikativen Komponente eine Realzeitbeobachtung des Metabolisierungsprozesses durchgeführt wird.
17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die zumindest eine indikative Komponente auf den Träger aufgebracht wird bzw. in einem Flüssigkeitsstrom an der Oberfläche des Träger vorbeifließt.
18. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die zumindest eine indikative Komponente den Metabolisierungsprozess für oxidativen Stress oder Hautveränderungen oder Diabetes mellitus und dessen Folgeerscheinungen charakterisiert.
19. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass oxidativer Stress durch den Nachweis von zumindest einem Biomakromolekül ausgewählt aus einer Gruppe umfassend primäre Mediatoren des Stress, antioxidative Enzyme, Endothelzel- lassoziierte Moleküle, Signaltransduktion assoziierte Moleküle, Cytokine, Apoptose assoziierte Moleküle, Heat Shock Proteine, Zell-Zell-Kontakt assoziierte Moleküle und/oder matrixabbauende- und/ oder -aufbauende Enzyme identifiziert wird.
20. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Hautveränderungen durch den Nachweis von zumindest einem Biomakromolekül ausgewählt aus einer Gruppe umfassend primäre Mediatoren des Stress, Endothelzellassoziierte Moleküle, Signaltransduktion assoziierte Moleküle, Cytokine, Apoptose assoziierte Moleküle, Heat Shock Proteine, Zell-Zell-Kontakt assoziierte Moleküle, matrixabbauende und/oder -aufbauende Enzyme, Melaminsynthese assoziierte und/oder Lipidproduktion assoziierte Proteine identifiziert wird.
21. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Diabetes mellitus und dessen Folgeerscheinungen durch den Nachweis von zumindest einem Biomakromolekül ausgewählt aus einer Gruppe umfassend Signaltransduktion assoziierte Moleküle, Arfheriosklerotische Prozesse assoziierte Moleküle, Nephropathie assoziierte Moleküle, Retinopathie assoziierte Moleküle und/oder Neuropathie assoziierte Moleküle identifiziert wird.
22. Verfahren nach Anspruch 20 und 21, dadurch gekennzeichnet, dass oxidativer Stress und Hautveränderungen durch den Nachweis zumindest eines primären Mediators des Stress, ausgewählt aus einer Gruppe umfassend Epidermal growth factor receptor (EGF-R), Interleu- kin-1 receptor (I1-1R) oder Tumor Necrosis factor-α receptor (TNF-αR), identifiziert werden.
23. Verfahren nach Anspruch 20 und 21, dadurch gekennzeichnet, dass oxidativer Stress und Hautveränderungen durch den Nachweis zumindest eines antioxidativen Enzyms, ausgewählt aus einer Gruppe umfassend Mangan Superoxid dismutase (Mn-SOD), Zink Superoxid dismutase (Zn-SOD), Catalase, Glutathion peroxidase, Glutathion-S-transferase, γ-Glutamyl- transferase, Nikotinamid adenin dinukleotid hydrogen-reduktase (NADH-Reduktase), Ascor- bylreduktase, und/oder Phospholipase C, Phospholipase A2, Cyclooxygenase-1 und/oder Cyclooxygenase-2 identifiziert, werden.
24. Verfahren nach Anspruch 20 und 21, dadurch gekennzeichnet, dass oxidativer Stress und Hautveränderungen durch den Nachweis zumindest eines Endothelzellen assoziierten Moleküls, ausgewählt aus einer Gruppe umfassend Intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), Vascular adhesion molecule-1 (VCAM-1), Monocyte chemoattractant protein (MCP-1), E-Selectin, Hemoxygenase-1 (HO-1), induzierbare Stickoxidsynthase (iNOS) und/ oder Myeoloperoxidase, identifiziert werden.
25. Verfahren nach Anspruch 20, 21 und 22, dadurch gekennzeichnet, dass oxidativer Stress, Hautveränderungen oder Diabetes mellitus und dessen Folgeerscheinungen durch den Nachweis zumindest eines Signaltransduktion assoziierten Moleküls, ausgewählt aus einer Gruppe umfassend Ras, Rac, Cdc 42, NADPH oxidase enzyme complex, Raf, Mitogen activated/extracellular signal regulated kinase (MEK), Extracellular signal-regulated kinase (ERK kinase), Mitogen activated/extracellular signal regulated kinase kinase (MEKK), Mitogen- activated protein kinase kinase 4 (MKK4), c-Jun NH2-tenninal kinase (JNK kinase), p21 acti- vated kinase (PAK), Mitogen-activated protein kinase kinase 3 (MKK3), Mitogen-activated protein kinase kinase 6 (MKK6), P38 kinase, c-Jun, aktivierendes Protein-1 (AP-1), aktivierendes Protein-2 (AP-2), Signal transducer and activator of transcription-1 (Statl), Stat2, Stat3, und/oder Proteinkinase C, Cytochrom C-reductase, Retinoic acid receptor-α (RAR-α), RAR-ß, RAR-γ und/oder Retinoid X receptor (RXR), identifiziert werden.
26. Verfahren nach Anspruch 20 und 21, dadurch gekennzeichnet, dass oxidativer Stress und Hautveränderungen durch den Nachweis zumindest eines Cytokins, ausgewählt aus einer Gruppe umfassend Interleukin-lα (Il-lα), Il-lß, und/oder 11-4, 11-6, und/oder 11-8, Tumor nec- rosis factor-α (TNF-α), Tumor growth factor-ß (TGF-ß), TGF-ß 1, NFKB, CXC Chemokine receptor-2 (CXCR-2), Melanoma growth stimulatory activity (MGSA/Groα), Epidermal growth factor (EGF), platelet derived growth factor (PDGF), Fibroblast growth factor (bFGF), Interferon-γ (IFN-γ), Granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), Endo- thelin-1 (ET-1) und/oder Prostaglandin synthase, identifiziert werden.
27. Verfahren nach Anspruch 20 und 21, dadurch gekennzeichnet, dass oxidativer Stress und Hautveränderungen durch den Nachweis zumindest eines Apoptose assoziierten Genproduktes, ausgewählt aus einer Gruppe umfassend Bax, Bcl-2, Caspase-3, Caspase-6, Caspase-7 und/oder Caspase-8, identifiziert werden.
28. Verfahren nach Anspruch 20 und 21, dadurch gekennzeichnet, dass oxidativer Stress und Hautveränderungen durch den Nachweis zumindest eines Heat Shock Proteins (HSP), ausgewählt aus einer Gruppe umfassend HSP 70, HSP 27, HSP 47, HSP 65, HSP 72, Alpha (l)-acid glycoprotein und/oder CCAAT-enhancer binding protein, identifiziert werden.
29. Verfahren nach Anspruch 20 und 21, dadurch gekennzeichnet, dass oxidativer Stress und Hauterkrankungen durch den Nachweis zumindest eines Zell-Zell-Kontakt assoziierten Proteins, ausgewählt aus einer Gruppe umfassend α-Catenin, ß-Catenin, E-Cadherin, M-Cadherin, N-Cadherin und/oder Desmoglein, identifiziert werden.
30. Verfahren nach Anspruch 20 und 21, dadurch gekennzeichnet, dass oxidativer Stress und Hautveränderungen durch den Nachweis zumindest eines Matrixabbauenden und/oder - aufbauenden Mediators, ausgewählt aus einer Gruppe umfassend die Matrix Metalloprotein- ase-1 (MMP-1; Collagenase-1), MMP-2 (Gelatinase A), MMP-3 (Stromelysin-1), MMP-7 (Matrilysin), MMP-8 (Collagenase-2), MMP-9 (Gelatinase B), MMP-10 (Stromelysin-2), MMP-11 (Stromelysin-3), MMP-12 (Macrophage elastase), MMP-13 (Collagenase-3), MMP- 14 (MT1-MMP), MMP-15 (MT2-MMP), MMP-16 (MT3-MMP), MMP-17 (MT4-MMP), Tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1 (TIMP-1), TIMP-2, TIMP-3, TIMP-4, Prolin- Hydroxylase, Galactosyltransferase, Glucosyltransferase und/oder Factor XUI-transamidase, identifiziert werden.
31. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass Hautveränderungen durch den Nachweis des Melaminsynthese assoziierten Enzyms Tyrosinase identifiziert werden.
32. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass Hautveränderungen durch den Nachweis des Lipidproduktion assoziierten Enzyms Sphingomyelinase (SMase) identifiziert werden.
33. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass Diabetes mellitus und dessen Folgeerscheinungen durch den Nachweis zumindest eines Artheriosklerotischen Pro- zesse assoziierten Biomakromoleküls, ausgewählt und einer Gruppe umfassend Epidermal growth factor receptor, Interleukin-1 receptor, Tumor necrosis factor-α receptor, SOD, Cata- lase, Glutathion peroxidase, E-Selectin, HO-1, und/oder NO synthase, ICAM-1, VCAM-1, II- 1 α, Il-lß, und/oder II-4, II-6, II-8, TNF-α, TGF-ß, CXCR-2, MGSA/Groα, EGF, PDGF, bFGF, TGF-ß 1, IFN-γ, und/oder GM-CSF, ET-1 und/oder Prostaglandin synthase, identifiziert werden.
34. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass Diabetes Folgeerscheinungen durch den Nachweis zumindest eines Nephropathie assoziierten Biomakromoleküls, ausgewählt aus einer Gruppe umfassend Soluble VCAM-1, Collagen IV, Albumin, Transfor- ming Growth Factor-ß (TGF-ß), Proteinkinase C, PI3 kinase, Serum- und Glucocorticoid- induced protein kinase-1 (SGK-1), Endothelin, Angiotensin-converting enzyme (ACE), Renin, Prorenin, Connective tissue growth factor, Advanced glycation end-product peptides, C-Peptide und/oder Plasminogen activator inbibitor-1 (PAI-1), identifiziert werden.
35. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass Diabetes Folgeerscheinungen durch den Nachweis zumindest eines Retinopathie assoziierten Biomakromoleküls, ausgewählt aus einer Gruppe umfassend Pigment Epithelium-derived factor und/oder HbAlc, identifiziert werden.
36. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass Diabetes Folgeerkrankungen durch den Nachweis zumindest eines Neuropathie assoziierten Biomakromoleküls ausgewählt aus einer Gruppe umfassend Insulin-like growth factor- 1 (IGF-1) und/oder Vascular endothelial growth factor (VEGF) identifiziert werden.
37. Träger zur Verwendung in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 36 zum Nachweis eines Metabolisierungsprozesses, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest ein Ligand mit einer spezifischen Bindungsstelle zur Interaktion mit einem aktiven Bindungszentrum zumindest einer indikativen Komponente in annähernd nativer und/oder metabolisierter Konformation eines Biomakromoleküls eines zellulären Repertoires des Metabolisierungsprozesses immobilisiert ist.
38. Träger nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, dass die zumindest eine indikative Komponente separiert und/oder quantifiziert wird.
39. Träger nach Anspruch 37 oder 38, dadurch gekennzeichnet, dass Veränderungen, insbesondere Konformationsveränderungen, der indikativen Komponente nachgewiesen werden.
40. Träger nach einem der Ansprüche 37 bis 39, dadurch gekennzeichnet, dass dieser miniaturisiert ist.
41. Träger nach einem der Ansprüche 37 bis 40, dadurch gekennzeichnet, dass das Molekulargewicht des Liganden kleiner ist als das der indikativen Komponente.
42. Träger nach einem der Ansprüche 37 bis 41, dadurch gekennzeichnet, dass der Ligand wie in Anspruch 6 und 7 ausgebildet ist.
43. Träger nach einem der Ansprüche 37 bis 42, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest ein weiterer Ligand durch die Interaktion mit zumindest einer weiteren indikativen Komponente die Qualität der Analyse bestimmt.
44. Träger nach einem der Ansprüche 37 bis 43, dadurch gekennzeichnet, dass die Qualität des Verfahrens durch den Nachweis der Expression der Hauskeepingproteine ß-Aktin und/oder Glyceraldehyd-3 Phosphatdehydrogenase (GAPDH) kontrolliert wird.
45. Träger nach einem der Ansprüche 37 bis 44, dadurch gekennzeichnet, dass die indikative Komponente wie in Anspruch 10, 11, 12 und 13 ausgebildet ist.
46. Träger nach einem der Ansprüche 37 bis 45, dadurch gekennzeichnet, dass die Interaktion durch zumindest eine Detektionsmethode, ausgewählt aus einer Gruppe umfassend Fluoreszenz-, Chemilumineszenzmessungen, Autoradiographie, Massenspektrometrie und/ oder Oberflächenplasmonresonanztechnologie nachgewiesen wird.
47. Träger nach einem der Ansprüche 37 bis 46, dadurch gekennzeichnet, dass die zumindest eine Komponente wie in Anspruch 15 identifiziert wird.
48. Träger nach einem der Ansprüche 37 bis 47, dadurch gekennzeichnet, dass durch die Interaktion des zumindest einen Liganden mit der zumindest einen indikativen Komponente eine Realzeitbeobachtung des Metabolisierungsprozesses durchgeführt wird.
49. Träger nach einem der Ansprüche 37 bis 48, dadurch gekennzeichnet, dass die zumindest eine indikative Komponente auf diesen aufgebracht wird bzw. in einem Flüssigkeitsstrom an der Oberfläche des Träger vorbeifließt.
50. Träger nach einem der Ansprüche 37 bis 49, dadurch gekennzeichnet, dass die indikativen Biomakromoleküle den Metabolisierungsprozess für oxidativen Stress oder Hautveränderungen oder Diabetes mellitus und dessen Folgeerscheinungen charakterisieren.
51. Träger nach einem der Ansprüche 37 bis 50, dadurch gekennzeichnet, dass oxidativer Stress wie in Anspruch 19 nachgewiesen wird.
52. Träger nach einem der Ansprüche 37 bis 51, dadurch gekennzeichnet, dass Hautveränderungen wie in Anspruch 20 nachgewiesen werden.
53. Träger nach einem der Ansprüche 37 bis 52, dadurch gekennzeichnet, dass Diabetes mellitus und dessen Folgeerscheinungen wie in Anspruch 21 nachgewiesen werden.
54. Träger nach einem der Ansprüche 37 bis 53, dadurch gekennzeichnet, dass oxidativer Stress und/oder Hautveränderungen und/oder Diabetes mellitus und dessen Folgeerscheinungen, wie in den Ansprüchen 22 bis 36 identifiziert werden.
55. Verwendung des Trägers nach einem der Ansprüche 37 bis 54, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger in der pharmazeutischen, kosmetischen und Nahrungsmittelindustrie angewendet wird.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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AU2001224349A1 (en) * 2000-04-10 2001-10-23 The Scripps Research Institute Proteomic analysis

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106919998A (zh) * 2015-12-28 2017-07-04 航天信息股份有限公司 一种基于aoe网络的物流模型及方法

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