WO2003048385A2 - Oligonukleotidanordung, verfahren zum nukleotidnachweis sowie vorrichtung hierfür - Google Patents
Oligonukleotidanordung, verfahren zum nukleotidnachweis sowie vorrichtung hierfür Download PDFInfo
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- C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
Definitions
- Oligonucleotide arrangement method for nucleotide detection and device therefor
- the present invention relates to an oligonucleotide arrangement, for example an oligonucleotide array such as the DNA chips and the like. the like , a method for the detection of oligonucleotides and an apparatus for carrying out such methods.
- oligonucleotide arrangements are used to simultaneously detect or check a large number of oligonucleotide sequences by means of their individual fields.
- the respective fields of the nucleotide arrays contain oligonucleotides in immobilized form, which have a complementary sequence to the oligonucleotides to be detected.
- Another difficulty is the non-specific binding, which leads to disturbing background signals. This problem exists in hybridization with amplified oligonucleotides as well as in hybridization with genomic DNA.
- the binding component either has to be provided directly with a fluorescent dye or has to have a chemical modification which enables subsequent radioactive or fluorescent labeling.
- the hybridized array since it must be kept away from light, in the second case at least one further marking and washing step is required, which extends the overall procedure and thus makes it less efficient.
- the object of the present invention is now a
- Oligonucleotide arrangement for example a DNA chip, to provide, with which the hybridization of oligonucleotides in the individual fields can be detected in a simple, safe and highly sensitive manner. Furthermore, it is an object to provide a corresponding detection method and a device for this.
- nucleotide sequences are now detected by binding them to complementary oligonucleotides immobilized on a substrate. Then there is a breakdown, for example a digestion, for example a restriction digest, with which essentially or specifically single-stranded nucleic acids are broken down. Chemical, physical or chemical-physical degradation is also possible. Double-stranded nucleic acids thus remain on the substrate and can then be detected. This can be done, for example, by the fact that the actual nucleotide sequences to be detected are already marked and so only the markers immobilized on the substrate are to be detected. On the other hand, double-stranded nucleic acids can also be detected, for example, by intercalating dyes.
- the degradation of the single-stranded DNA on the substrate causes a reduction in the background.
- the nucleotide sequences to be detected can be, for example, nucleic acids plotted by PCR or directly non-amplified genomic DNA or RNA can also be used.
- the degradation can take place chemically or also by means of suitable restriction endonucleases, for example the S1 nuclease.
- probe sequences immobilized on the substrate which are protected against the respective degradation as a single strand and / or as a double strand, i.e. if they are stable, repeated hybridization with the nucleotide sequences to be detected can take place, the hybridization being followed in each case by a corresponding degradation or digestion step.
- hybridized nucleotide sequences to be detected can be enriched on the chip over time, so that the sensitivity of the detection method increases considerably.
- Suitable degradation processes are, for example, the degradation of nucleic acid by means of chemicals, for example by means of hydroxylamine and osmium tetroxide, followed by cleavage with piperidine or the degradation by hydrazine with piperidine or else the degradation by dimethyl sulfoxide (DMS), formic acid and piperidine.
- Alternative degradation methods use restriction endonucleases, for example SI nucleases. Also a breakdown by
- DNA cleavage using radiation can be used.
- Sequences are applied to an array which contain thioesters instead of a phosphoric acid ester bond in the sugar-phosphate backbone of the oligonucleotides (thiophosphonates).
- the hybridization takes place with fragmented genomic DNA without prior amplification at the optimal hybridization temperature for the corresponding sequences.
- this hybridization step is repeated cyclically with a new application of fragmented, unamplified DNA.
- the DNA can be fragmented, for example, by at least partial restriction digestion or by shearing the DNA. Only small amounts of genomic DNA are used to further increase the specificity (instead of about 10 ng / 30 ⁇ l with an area of 4 qcm, this is reduced to approx. 1 ng).
- the hybridization solution is replaced by a solution for restriction digestion with S1 nuclease, the temperature being reduced to 37 ° C.
- S1 nuclease M5761 from Promega was used here as an example of the Sl nuclease.
- a further increase in temperature to the hybridization temperature denatures the restriction enzyme and thus prevents the digestion of single-stranded DNA for the next following hybridization step.
- remaining short DNA sections which, however, do not hybridize with the entire oligonucleotide, are detached without detaching completely hybridized DNA sections to be detected.
- DNA solution (genomic, non-amplified, sheared DNA without modifications) is applied again.
- This cyclically repeated hybridization can be simplified by automatically changing the solutions. In this way, complete saturation of all oligonucleotides is achieved at one application site, while incomplete and incorrect hybridizations are avoided become; in sequences without a genomic counterpart there is no double strand after hybridization.
- a complete background reduction is possible due to the fact that the nucleases degrade or cut the incompletely hybridized oligonucleotides from the sample and the protruding nucleotides of the strand end of a fully hybridized oligonucleotide, which are each present as a single strand. Because the remaining fragments, which continue to bind to the immobilized oligonucleotides after the single-stranded nucleotide regions have been broken down, detach even with a slight heating, so that the corresponding oligonucleotides, which are immobilized on the fields, then again completely for the next cycle for hybridization. reaction are available. So it is possible to remove any background.
- an optical differentiation between hybridized and non-hybridized sequences is necessary.
- This can be done in different ways.
- One possibility is to use a fluorescent dye intercalating in double-stranded DNA, which also enables absolute quantification.
- the temperature is brought to a value which is slightly below the hybridization temperature and a solution with a fluorescent dye which selectively intercalates in double-stranded DNA is added. This enables highly specific coloring without a background to take place in a relatively short time.
- An absolute quantification is then possible through the proportional intercalation of the fluorescent dye.
- the following methods are also suitable as detection methods for the ultimately double-stranded nucleic acid of each individual field:
- Absolute quantification is possible, the LNA technology for point mutations can be avoided, there is still no separate marking step with appropriate process management and detection using intercalating substances, the entire process can be automated and enables the use of genomic DNA without any chemical modification or without any previous reproduction. This means that the sample preparation takes little time and money. There is maximum flexibility with regard to the marking technology, since a wide variety of markers can be used.
- a selective step of breaking down, for example restriction cleavage on the array, is carried out;
- Stabilized immobilized oligonucleotides are advantageously used to enable repeated hybridizations
- the intercalation dye can only be added at the end of the process, thereby avoiding light-protected handling during the previous hybridizations.
- 4 figures show a device according to the invention and the basic process sequence.
- Figure 1 shows a device according to the invention in cross section.
- FIG. 2 shows a top view of a device according to the invention
- Fig. 3 is a plan view of a cross section through an inventive device
- Fig. 4 shows the basic process flow of the method according to the invention.
- reference number 1 denotes an apparatus according to the invention for carrying out the detection method according to the invention.
- This has a carrier 2, which has a recess 3 as a hybridization chamber.
- This hybridization chamber 3 is closed with a cover 6 which rests on the carrier 2.
- the carrier 2 also contains a heating element in order to heat or cool the hybridization chamber.
- the heating element can also be located below / outside the carrier in the surrounding device.
- the heating or cooling can be carried out, for example, by a Peltier element.
- the hybridization chamber 3 has a further recess with a narrower cross section, which is designed as an oligonucleotide array according to the invention.
- a hybridization chamber 3 which is designed as a DNS chip, is also introduced into a carrier 2.
- Inlets 6 to 9 can be controlled, for example, via magnetically controlled valves and a corresponding microprocessor control.
- FIG. 3 again shows a device 1 with a carrier 2, a hybridization chamber 3 and a heating and cooling element 4, with which the hybridization chamber 3 and thus the DNS chip can be heated or cooled.
- the hybridization chamber 3 in such a way that it can accommodate a DNS chip, so that the DNS chip can be replaced.
- 4A shows a field of a DNA array with a surface 11 to which oligonucleotides 12 which are not cleavable by nucleases and have the same nucleotide sequence in each field are bound.
- FIG. 4B shows how, after contacting this field with a sample solution, for example • an oligonucleotide 13 hybridizes from the sample solution to an oligonucleotide 12. This takes place with the formation of loops. In contrast, oligonucleotide 13 'binds in a regular manner to oligonucleotide 12 to form a double strand. The protruding part of the oligonucleotide 13 'in turn binds oligonucleotides 14 from the sample solution however form a disturbing background.
- a sample solution for example • an oligonucleotide 13 hybridizes from the sample solution to an oligonucleotide 12. This takes place with the formation of loops. In contrast, oligonucleotide 13 'binds in a regular manner to oligonucleotide 12 to form a double strand. The protruding part of the oligonucleotide 13 'in turn binds oli
- 4C shows the result after digestion by S1 nuclease.
- the non-hybridized loops of the oligonucleotide 13 are now removed, as is the end of the nucleotide 13 'projecting beyond the oligonucleotide 12 and hybridized there oligonucleotides 14. Consequently, two short fragments 15, 16 and a correct double strand 17 remain.
- 4C shows the result after heating the oligonucleotide array to approximately 65 to 75 ° C. This destroys the S1 nuclease and the short fragments. 15, 16 detach from the oligonucleotide 12. This leaves only the correct double-stranded oligonucleotide 13 ', 17 and all further nucleotides 12 are for a further cycle to run through the steps ready according to Figures 4A to 4D.
- oligonucleotides 12 are hybridized correctly double-stranded, so that the cycle is terminated and the double-stranded DNA is now stained with an intercalating dye. This enables an absolute quantification of the oligonucleotides from the sample that are hybridized in the field of the DNA array on the surface.
- VDR gene contains a point mutation that leads to a
- a complementary oligonucleotide was prepared and immobilized to this wild-type DNA segment.
- the backbone of this oligonucleotide was modified as thiophosphonate as described above. As a result, it cannot be digested for the Sl nuclease M5761 from Promega.
- the hybridization takes place on 35 of the 36 nucleotides but not on the nucleotide that was exchanged.
- the S1 nuclease cuts the hybridized DNA section at this point.
- the resulting DNA fragments are shown below
- the S1 nuclease removes the protruding single-stranded DNA at both the 5 'and the 3' end.
- the immobilized oligonucleotide two DNA fragments hybridized with ⁇ 18 nucleotides each. These two nucleotides have melting temperatures of
- the temperature is then raised to approximately 70 ° C. in the subsequent step, the short sections detach from the immobilized oligonucleotide, while the wild-type DNA section remains hybridized. At the same time, the Sl nuclease is inactivated by this temperature increase step.
- an oligonucleotide is again produced and immobilized on the oligonucleotide arrangement, which is complementary to the nucleotide sequence of the wild-type DNA shown here.
- the further procedure proceeds as described in the example above, the fragments shown below arise when DNA of the mutation type binds to the oligonucleotide with a mismatch at the point mutation site and is then cut there by the S1 nuclease M5761.
- the melting temperature of the hybridized widtype DNA section with 34 nucleotides is 74.3 ° C, while for the two fragments the melting temperatures are 64.4 ° C and 52.7 ° C, respectively.
- both examples can also be varied such that the immobilized nucleotide is complementary to.
- Sequence of the respective mutation, or different oligonucleotide sequences are immobilized on two fields of the oligonucleotide arrangement, one sequence being complementary to the wild type and the other sequence being complementary to the mutation.
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Oligonukleotidanordnung mit einem Substrat, das mindestens ein Feld aufweist, wobei in dem zumindest einen Feld Oligonukleotide mit feldspezifischer Sequenz immobilisiert sind, wobei die immobilisierten Oligonukleotide des mindestens einen Feldes derart modifiziert sind, dass sie gegen enzymatischen, chemischen, physikalischen und/oder chemisch-physikalischen Abbau als Einzelstrang und/oder als Doppelstrang stabil sind.
Description
Oligonukleotidanordnung, Verfahren zum Nukleotidnach- weis sowie Vorrichtung hierfür
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Oli- gonukleotidanordnung, beispielsweise ein Oligonukleo- tid-Array wie den DNS-Chips u. dgl . , ein Verfahren zum Nachweis von Oligonukleotiden sowie eine Vorrichtung zur Durchführung derartiger Verfahren. Derartige Oligonukleotidanordnungen werden verwendet, um mit- tels ihrer' einzelnen Felder gleichzeitig eine Vielzahl von Oligonukleotidsequenzen nachzuweisen oder zu überprüfen. Dabei enthalten die jeweiligen Felder der Nukleotid-Arrays Oligonukleotide in immobilisierter Form, die eine komplementäre Sequenz zu den nachzu- weisenden Oligonukleotiden aufweisen. Befindet sich nun in einer Probe ein entsprechendes Oligonukleotid, so wird es an das entsprechende komplementäre Oligonukleotid in einem bestimmten Feld des Arrays hybridisiert und ist dann dort nachweisbar.
Die direkte Hybridisierung von Arrays mit genomischer DNA erreicht jedoch im Regelfall nicht die erforderliche Sensivität des nachfolgend aufgrund einer komplementären Bindung von Nukleinsäuren detektierten Signals. Daher ist im Regelfall eine der Hybridisierung vorgeschaltene selektive Vervielfältigung (z. B. durch PCR) einzelner Sequenzen erforderlich. Diese muß für jeden Array separat etabliert werden und hat eine mengenmäßige Begrenzung (beispielsweise als Mul- tiplex, in der gleichzeitig nicht mehr als 50 verschiedene Sequenzen amplifiziert werden können, wobei obendrein die Amplifikationseffizienz für einzelne Sequenzen bei dieser Komplexität unterschiedlich sein kann.
Eine weitere Schwierigkeit besteht in der unspezifischen Bindung, die zu störenden Hintergrundsignalen führt. Dieses Problem besteht bei der Hybridisierung mit amplifizierten Oligonukleotiden ebenso wie bei der Hybridisierung mit genomischer DNA.
Eine weitere Schwierigkeit besteht darin, daß, um ein detektierbares Signal zu erhalten, die bindende Komponente entweder direkt mit einem Fluoreszenzfarb- stoff versehen werden muß oder eine chemische Modifikation besitzen muß, die eine nachfolgende radioaktive oder Fluoreszenzmarkierung ermöglicht. Im ersten Fall bestehen Handhabungseinschränkungen für den hybridisierten Array, da er unter Lichtabschluß aufbe- wahrt werden muß, im zweiten Fall ist mindestens ein weiterer Markierungs- und Waschschritt erforderlich, der die Gesamtprozedur verlängert und damit weniger effizient werden läßt.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es nun, eine
Oligonukleotidanordnung, beispielsweise ein DNS-Chip,
zur Verfügung zu stellen, mit dem auf einfache, sichere und hochsensitive Weise die Hybridisierung von Oligonukleotiden in den einzelnen Feldern nachgewiesen werden kann. Weiterhin ist es Aufgabe, ein ent- sprechendes Nachweisverfahren und eine Vorrichtung hierzu zur Verfügung zu stellen.
Diese Aufgabe wird durch die Oligonukleotidanordnung gemäß Anspruch 1, das Verfahren gemäß Anspruch 7 so- wie die Vorrichtung gemäß Anspruch 32 gelöst. Vorteilhafte Weiterbildung der erfindungsgemäßen Oligonukleotidanordnung, des erfindungsgemäßen Verfahrens bzw. der erfindungsgemäßen Vorrichtung werden in den jeweiligen Ansprüchen gegeben.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren werden nun Nukle- otidsequenzen nachgewiesen, indem sie an komplementäre, auf einem Substrat immobilisierte Oligonukleotide gebunden werden. Anschließend findet ein Abbau, bei- spielsweise ein Verdau, beispielsweise ein Restrikti- onsverdau, statt, mit dem im wesentlichen bzw. spezifisch einzelsträngige Nukleinsäuren abgebaut werden. Auch ein chemischer, physikalischer oder chemischphysikalischer Abbau ist möglich. Auf dem Substrat verbleiben damit doppelsträngige Nukleinsäuren die dann nachgewiesen werden können. Dies kann beispielsweise dadurch erfolgen, daß die eigentlichen nachzuweisenden Nukleotidsequenzen bereits markiert sind und so lediglich die auf dem Substrat immobilisierten Marker nachzuweisen sind. Andererseits können dop- pelsträngige Nukleinsäuren auch beispielsweise durch interkalierende Farbstoffe nachgewiesen werden. Durch den Abbau der einzelsträngigen DNS auf dem Substrat wird eine Reduktion des Hintergrundes bewirkt. Als nachzuweisende Nukleotidsequenzen können beispielsweise durch PCR, a plifizierte Nukleinsäuren
oder auch unmittelbar nichtamplifizierte genomische DNS bzw. RNS verwendet werden. Der Abbau kann chemisch erfolgen oder auch durch geeignete Restriktion- sendonukleasen, beispielsweise die Sl-Nuklease.
Werden Sondensequenzen auf dem Substrat immobilisiert, die gegen den jeweiligen Abbau als Einzelstrang, und/oder als Doppelstrang geschützt, d.h. also stabil sind, so kann eine wiederholte Hybridisie- rung mit den nachzuweisenden Nukleotidsequenzen erfolgen, wobei die Hybridisierung jeweils von einem entsprechenden Abbau bzw. Verdauschritt gefolgt ist. Dadurch kann im Laufe der Zeit eine Anreicherung hybridisierter nachzuweisender Nukleotidsequenzen auf dem Chip erzielt werden, so daß die Empfindlichkeit des Nachweisverfahrens erheblich steigt.
Als Abbauverfahren eignen sich beispielsweise der Nu- kleinsäureabbau mittels Chemikalien, beispielsweise mittels Hydroxylamin und Osmiumtetroxid gefolgt von Spaltung mit Piperidin oder der Abbau durch Hydrazin mit Piperidin oder auch der Abbau durch Dimethylsulf- oxid (DMS) , Ameisensäure und Piperidin. Alternative Abbaumethoden verwenden Restriktionsendonukleasen, beispielsweise Sl-Nukleasen. Auch ein Abbau durch
DNA-Spaltung mittels Strahlung kann eingesetzt werden.
Im folgenden wird ein Beispiel für eine derartige Oligonukleotidanordnung sowie ihre Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren beschrieben.
Auf einem Array werden Sequenzen aufgetragen, die anstelle einer Phosphorsäureesterbindung im Zucker- Phosphatrückgrat der Oligonukleotide Thioester enthalten (Thiophosphonate) . Die Hybridisierung erfolgt
mit fragmentierter genomischer DNA ohne vorherige Am- plifikation bei der für- die entsprechenden Sequenzen optimalen Hybridisierungstemperatur. Um eine vollständige und spezifische Hybridisierung zu erreichen, wird dieser Hybridisierungsschritt zyklisch mit jeweils neuer Gabe von fragmentierter, nicht amplifi- zierter DNA wiederholt. Die Fragmentierung der DNS kann beispielsweise durch zumindest teilweisen Restriktionsverdau oder durch Scheren der DNS erfolgen. Es werden jeweils nur geringe Mengen an genomischer DNA eingesetzt, um die Spezifität weiter zu erhöhen (statt etwa 10 ng/30 μl bei einer Fläche von 4 qcm wird dies auf ca. 1 ng reduziert) . Nachfolgend zu jedem Hybridisierungsschritt wird die Hybridisierungs- lösung durch eine Lösung für einen Restriktionsverdau mit Sl-Nuklease ersetzt, wobei die Temperatur auf 37 °C reduziert wird. Als Sl-Nuklease wurde hier beispielhaft die Sl-Nuklease M5761 der Firma Promega verwendet. Hierdurch werden Einzelstränge aller Art, wie sie bei Fehlhybridisierungen vorkommen, sowie überstehende Strangenden beseitigt. Eine erneute Temperaturerhöhung auf die Hybridisierungstemperatur denaturiert das Restriktionsenzym und verhindert so für den nächsten folgenden Hybridisierungsschritt den Verdau von einzelsträngiger DNA. Außerdem werden verbliebene kurze DNS-Abschnitte, die jedoch nicht mit dem gesamten Oligonukleotid hybridisieren, abgelöst, ohne daß vollständig hybridisierte, nachzuweisende DNS-Abschnitte abgelöst werden. Danach wird erneut DNA-Lösung (genomische, nicht-amplifizierte gescherte DNA ohne Modifikationen) aufgebracht. Diese zyklisch wiederholte Hybridisierung kann durch automatisiertes Wechseln der Lösungen vereinfacht werden. Auf diese Weise wird eine vollständige Absättigung aller Oligo- nukleotide an einem Auftragungsort erreicht, während unvollständige und falsche Hybridisierungen vermieden
werden; bei Sequenzen ohne genomisches Pendant liegt nach Hybridisierung kein Doppelsträng vor.
Dadurch, daß durch die Nukleasen die nicht vollstän- dig hybridisierten Oligonukleotide aus der Probe sowie die überstehenden Nukleotide des Strangendes eines vollständig hybridisierten Oligonukleotides, die jeweils als Einzelstrang vorliegen, abgebaut bzw. geschnitten werden, ist eine vollständige Hintergrund- reduzierung möglich. Denn die Restfragmente, die nach Abbau der einzelsträngigen Nukleotidbereiche an die immobilisierten Oligonukleotide weiterhin gebunden sind, lösen sich schon bei einer geringen Erwärmung ab, so daß die entsprechenden Oligonukleotide, die an den Feldern immobilisiert sind, anschließend wieder beim nächsten Zyklus vollständig für eine Hybridisie- rungsreaktion zur Verfügung stehen. Es ist also möglich, jeglichen Hintergrund zu beseitigen.
Nach vollständiger Hybridisierung ist eine optische Unterscheidung von hybridisierten und nicht- hybridisierten Sequenzen notwendig. Dies kann auf unterschiedliche Weise erreicht werden. Eine Möglichkeit besteht darin, einen in doppelsträngiger DNA in- terkalierenden Fluoreszenzfarbstoff zu verwenden, wodurch auch eine absolute Quantifizierung ermöglicht wird. Hierzu wird nach der letzten Hybridisierung/Sl- Verdau die Temperatur auf einen Wert, der geringfügig unter der Hybridisierungstemperatur liegt, gebracht und eine Lösung mit einem selektiv in doppelsträngige DNA interkalierenden Fluoreszenzfarbstoffs zugesetzt. Dadurch kann in relativ kurzer Zeit eine hochspezifische Färbung ohne Hintergrund erfolgen. Durch die proportionale Interkalation des Fluoreszenzfarbstoffs ist dann eine Absolutquantifizierung möglich.
Als Nachweismethoden für die letztlich doppelsträngig vorliegende Nukleinsäure jedes einzelnen Feldes eignen sich weiterhin die folgenden Möglichkeiten:
• Verwendung von in DNA-Doppelstränge interkalieren- den Fluoreszenzfarbstoffen;
• Verwendung von in DNA-Doppelstränge interkalieren- den Substanzen mit Modifikation (z.B. Biotin) , über die ein Fluoreszenz- oder anderer Farbstoff gebunden werden kann;
• Verwendung von in DNA-Doppelstränge interkalieren- den Substanzen mit Modifikation (z.B. Biotin), über die ein Enzym gebunden werden kann, welches eine Farbreaktion katalysiert;
• Verwendung von in DNA-Doppelstränge interkalieren- den Substanzen mit Modifikation (z.B. Biotin), über die ein Enzym gebunden werden kann, welches eine Bio- oder Chemilumineszenzreaktion katalysiert;
• Verwendung von in DNA-Doppelstränge interkalieren- den Substanzen mit Modifikation (z.B. Biotin), über die spezifisch eine radioaktivmarkierte Komponente gebunden werden kann;
• Verwendung einer Komponente, die in einer Redoxre- aktion spezifisch an den randständigen Zucker des bindenden Stranges kovalent addiert und als Farbstoff/Fluoreszenzfarbstoff/radioaktive Markierung oder Che i- bzw. Biolumineszenzreaktion identifiziert werden kann.
Weiterhin ist es möglich, die einzelnen Hybridisie- rungstemperaturen der einzelnen Arrayfelder aneinander anzugleichen, um eine annähernd einheitliche Hybridisierung zu erreichen. Dies kann beispielsweise durch eine chemische Modifikation der immobilisierten Oligonukleotide etwa am Ribosebestandteil oder durch eine geeignete Wahl der Oligonukleotidlänge für jedes einzelne Oligonukleotidfeld erreicht werden.
Insgesamt besitzt das erfindungsgemäße Verfahren die folgenden Vorteile:
Eine Absolutquantifizierung wird möglich, die LNA- Technologie bei Punktmutationen kann umgangen werden, es entfällt weiterhin ein separater Markierungsschritt bei geeigneter Verfahrensführung und Nachweis mittels interkalierender Substanzen, das Gesamtverfahren ist automatisierbar und ermöglicht die Verwendung der genomischen DNA ohne jede chemische Modifi- kation bzw. ohne jede vorhergehende Vervielfältigung. Dies bedeutet einen geringen technischen und zeitlichen Aufwand bei der Probenvorbereitung. Bezüglich der Markierungstechnologie ist maximale Flexibilität gegeben, da unterschiedlichste Marker verwendet wer- den können.
Zusammenfassend unterscheiden folgende Besonderheiten die erfindungsgemäße Technologie von dem Stand der Technik:
• es wird ein selektiver Schritt des Abbaus, beispielsweise der Restriktionsspaltung auf dem Array durchgeführt;
# durch Abbau bzw. Verdau überstehender Enden der hybridisierten Nukleotide aus der Probe werden
diese entfernt, so daß eine Verwendung von Inter- kalationsfarbstoffen möglich ist ohne daß ein zusätzlicher Hintergrund entsteht;
• durch Abbau bzw. Verdau einzelsträngiger Abschnitte (überstehende Enden und unvollständig hybridisierte Oligonukleotide) wird unspezifischer Hintergrund entfernt;
• Es werden vorteilhafterweise stabilisierte immobilisierte Oligonukleotide eingesetzt um wiederholte Hybridisierungen zu ermöglichen;
• wesentliche Eigenschaft der immobilisierten Oligo- nukleotide ist ihre Widerstandsfähigkeit gegen den
Abbau einzelsträngiger DNA-Abschnitte, beispielsweise gegen Verdau durch einzelstrangspaltende Nu- kleasen;
• zusätzlich haben derart modifizierte Oligonukleotide eine höhere Bindeintensität. Hierdurch wird eine höhere, besser ausgleichbare Hybridisierungstemperatur ermöglicht;
• eingesetztes Restriktions-Enzym wird durch Temperaturerhöhung inaktiviert, was für den nächsten Zyklus ohnehin erforderlich ist;
• eine mehrfache Wiederholung des Vorganges bis zur Absättigung ist möglich;
• der Interkalationsfarbstoff kann erst am Ende des Verfahrens zugesetzt werden, dadurch Vermeidung von lichtgeschützter Handhabung während der vor- ausgehenden Hybridisierungen.
Im folgenden zeigen 4 Figuren eine erfindungsgemäße Vorrichtung und den prinzipiellen Verfahrensablauf.
Es zeigen:
Fig. 1 eine erfindungsgemäße Vorrichtung im Querschnitt;
Fig. 2 eine Aufsicht auf eine erfindungsgemäße Vorrichtung;
Fig. 3 eine Aufsicht auf einen Querschnitt durch eine erfindungsgemäße Vorrichtung und
Fig. 4 den prinzipiellen Verfahrensablauf des erfindungsgemäßen Verfahrens.
In Fig. 1 ist mit dem Bezugszeichen 1 eine erfindungsgemäße Vorrichtung zur Durchführung des erfin- dungsgemäßen Nachweisverfahrens bezeichnet. Diese weist einen Träger 2 auf, der eine Ausnehmung 3 als Hybridisierungskammer besitzt. Diese Hybridisierungskammer 3 ist mit einem Deckel 6 verschlossen, der auf dem Träger 2 aufliegt. Der Träger 2 enthält weiterhin ein Heizelement, um die Hybridisierungskammer aufzuheizen bzw. abzukühlen. Das Heizelement kann jedoch auch unterhalb/außerhalb des Trägers im umgebenden Gerät lokalisiert sein. Das Aufheizen bzw. Abkühlen kann beispielsweise durch ein Peltierelement erfol- gen. Die Hybridisierungskammer 3 besitzt eine weitere im Querschnitt schmalere Vertiefung, die als erfindungsgemäßer Oligonukleotid-Array ausgebildet ist.
Fig. 2 zeigt ebenfalls eine erfindungsgemäße Vorrich- tung, wobei hier wie im folgenden mit gleichen oder ähnlichen Bezugszeichen gleiche oder ähnliche Elemen-
te bezeichnet sind. Auch hier ist in einen Träger 2 eine Hybridisierungskammer 3 eingebracht, die als DNS-Chip ausgebildet ist. Über Zuläufe 6, 7, 8 und 9 können beispielsweise Probenflüssigkeiten oder Waschlösungen oder Nukleaselösungen über den DNS-Chip geleitet und über einen Ablauf 10 wieder abgeleitet werden. Die Steuerung der Zuläufe 6 bis 9 kann beispielsweise über magnetisch gesteuerte Ventile und eine entsprechende Mikroprozessorsteuerung erfolgen.
Fig. 3 zeigt wiederum eine Vorrichtung 1 mit einem Träger 2, einer Hybridisierungskammer 3 und einem Heiz- und Kühlelement 4, mit dem die Hybridisierungskammer 3 und damit der DNS-Chip aufgeheizt bzw. abge- kühlt werden kann. Prinzipiell ist es auch möglich, die Hybridisierungskammer 3 derart auszubilden, daß sie einen DNS-Chip aufnehmen kann, so daß der DNS- Chip austauschbar ist.
Fig. 4 zeigt den prinzipiellen Ablauf des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Fig. 4A zeigt dabei ein Feld eines DNS-Arrays mit einer Oberfläche 11, an die nicht durch Nukleasen spaltbare Oligonukleotide 12 mit feldweise gleicher Nukleotidsequenz angebunden sind.
In Fig. 4B ist dargestellt, wie nach Kontaktierung dieses Feldes mit einer Probenlösung beispielsweise • ein Oligonukleotid 13 aus der Probenlösung an ein Oligonukleotid 12 hybridisiert. Dies erfolgt unter Schlaufenbildung. Demgegenüber bindet Oligonukleotid 13 ' in regulärer Weise an das Oligonukleotid 12 unter Ausbildung eines Doppelstranges. Der überstehende Teil des Oligonukleotides 13 ' bindet seinerseits wiederum Oligonukleotide 14 aus der Probenlösung, die
jedoch einen störenden Hintergrund bilden.
Fig. 4C zeigt das Ergebnis nach einem Verdau durch Sl-Nuklease. Die nicht hybridisierten Schleifen des Oligonukleotides 13 sind nun entfernt, ebenso das über das Oligonukleotid 12 hinausstehende Ende des Nukleotids 13' und dort anhybridisierten Oligonukleotide 14. Es verbleiben folglich zwei kurze Bruchstük- ke 15, 16 und ein korrekter Doppelstrang 17.
Fig. 4C zeigt das Ergebnis nach Erwärmen des Oligonu- kleotid-Arrays auf ca. 65 bis 75°C. Dadurch wird die Sl-Nuklease zerstört und die kurzen Bruchstücke.15, 16 lösen sich von dem Oligonukleotid 12. Damit ver- bleibt lediglich noch das korrekte doppelsträngige Oligonukleotid 13', 17 und alle weiteren Nukleotide 12 sind für einen weiteren Zyklus zum Durchlaufen der Schritte gemäß der Abbildungen 4A bis 4D bereit.
Nach Abschluß mehrerer derartiger Zyklen sind ausreichend viele Oligonukleotide 12 korrekt doppelsträngig hybridisiert, so daß der Zyklus abgebrochen wird und nun die doppelsträngige DNA mit einem interkalieren- den Farbstoff angefärbt wird. Dies ermöglicht eine absolute Quantifizierung der in dem Feld des DNS- Arrays an der Oberfläche anhybridisierten Oligonukleotide aus der Probe.
In einem ersten Beispiel wurde nachgewiesen, ob das VDR-Gen eine Punktmutation enthält, die zu einer
Schnittstelle für die Restriktionsendonuklease FokI führt. Diese Punktmutation ist im folgenden dargestellt, wobei ein DNS-Abschnitt mit insgesamt 36 Nu- kleotiden dargestellt ist.
C (Mutation)
5'-CCCCTGCTCC TTCAGGGATG GAGGCAATGG CGGCCA -3' (Wildtyp)
TM=78,34 °C.
Zu diesem DNS-Abschnitt des Wildtyps wurde ein komplementäres Oligonukleotid hergestellt und immobilisiert. Dieses Oligonukleotid war bezüglich seines Rückgrats wie oben beschrieben als Thiophosphonat modifiziert. Dadurch ist es für die Sl-Nuklease M5761 der Firma Promega nicht zu verdauen.
Bindet nun eine den DNS-Abschnitt fragmentierter genomischer DNS vom Wildtyp an dieses Oligonukleotid, so erfolgt eine vollständig Hybridisierung mit einem Schmelzpunkt von TM = 78,30 °C. Da hier eine vollständige Hybridisierung und damit ausschließlich ein Doppelstrang vorliegt, wird in dem nachfolgenden Behandlungsschritt mit der genannten Sl-Nuklease lediglich der Überstand am 5' bzw. 3" Ende, der nicht mit dem Oligonukleotid hybri- disiert ist, weggeschnitten, so daß eine 36 Nukleotide lange doppelsträngige DNS entsteht.
Liegt jedoch die beschriebene Mutation vor, so erfolgt die Hybridisierung zwar an 35 der 36 Nukleotide jedoch nicht an dem Nukleotid, das ausgetauscht wurde. Hier liegt eine einzelsträngige DNS vor, so daß im nachfolgenden Behandlungsschritt die Sl Nuklease den anhybridisierten DNS-Abschnitt an dieser Stelle schneidet. Die entstehenden DNS-Bruchstücke sind im folgenden dargestellt
5'-C GCGGCCA-3 '
Weiterhin entfernt die Sl-Nuklease sowohl am 5' als auch am 3 ' Ende die jeweils überstehende einzelsträngige DNS. Dadurch sind nun an das immobilisierte Oligonukleotid
zwei DNS Fragmente mit jeweils ≤ 18 Nukleotiden hybridisiert. Diese beiden Nukleotide besitzen Schmelztemperaturen von
TM = 64,4 °C bzw. TM = 66,7 °C.
Wird für im nachfolgenden Schritt dann die Temperatur beispielsweise auf ca. 70 °C erhöht, so lösen sich die kurzen Abschnitte von dem immobilisierten Oligonukleotid, während der DNS-Abschnitt vom Wildtyp hybridisiert bleibt. Zugleich wird durch diesen Temperaturerhöhungsschritt die Sl Nuklease inaktiviert.
Im nächsten Schritt kann nun erneut fragmentierte DNS auf die Oligonukleotidanordnung gegeben werden. Auf diese Art und Weise werden im Laufe mehrerer Zyklen sämtliche Oligonukleotide mit Wildtyp-DNS-Abschnitten abgesättigt, sofern diese vorhanden sind. Beim anschließenden Nachweis mittels interkalierender Fluoreszenzfarbstoffe kann also festgestellt werden, ob in der ursprünglichen Probe DNS vom Wildtyp oder lediglich DNS gemäß der oben beschriebenen Mutation vorlag.
In einem weiteren Beispiel wurde wiederum das Vorliegen einer Mutation im VDR-Gen untersucht, bei der eine Schnittstelle für die Restriktionsendonuklease Bsml entsteht. Diese ist im folgenden dargestellt
A (Mutation) 5 ' -GCCACAGACA GGCCTGCGCA TTCCCAATAC TCAG -3' (Wildtyp)
TM = 74,3 °C
Auch hier wird wiederum ein Oligonukleotid hergestellt und immobilisiert auf der Oligonukleotidanordnung, das der hier dargestellten Nukleotidsequenz der DNS des Wildtyps komplementär ist.
Das weitere Verfahren verläuft wie beim obigen Beispiel beschrieben, wobei die im folgenden dargestellten Fragmente entstehen, wenn DNS von Mutationstyp an das Oligonukleotid bindet mit einer Fehlpaarung an der Punktmutationsstelle und anschließend durch die Sl-Nuklease M5761 dort geschnitten wird.
5 ' - TCAG -3'
Die Schmelztemperatur des hybridisierten Widtyp-DNS- Abschnitts mit 34 Nukleotiden beträgt 74,3 °C während für die beiden Fragmente die Schmelztemperaturen jeweils 64,4 °C bzw. 52,7 °C betragen.
Wird nun das obige Verfahren in gleicher Weise durchgeführt, so verbleiben letztlich an dem immobilisierten Oligonukleotid, das wie oben derart modifiziert ist, daß es durch die Sl-Nuklease M5761 nicht geschnitten werden kann, ausschließlich DNS-Bruchstücke mit 34 Nukleotiden vom Wildtyp hybridisiert. Damit kann nachgewiesen werden, ob in der ursprünglichen genomischen DNS Probe DNS vom Wildtyp vorlag.
Selbstverständlich können beide Beispiele auch derart variiert werden, daß das immobilisierte Nukleotid komplementär zur. Sequenz der jeweiligen Mutation ist, bzw. auf zwei Feldern der Oligonukleotidanordnung jeweils ver- schiedene Oligonukleotidsequenzen immobilisiert sind, wobei die eine Sequenz komplementär zum Wildtyp und die andere Sequenz komplementär zur Mutation ist. In diesem Falle ist eine genaue Unterscheidung zwischen homozygot- em Wildtyp, homozygotem Mutationstyp bzw. bei Nachweis von genomischer DNS in beiden Feldern heterozygotem Wildtyp/Mutation möglich.
Claims
1. Oligonukleotidanordnung mit einem Substrat, das mindestens ein Feld aufweist, wobei in dem zumindest einen Feld Oligonukleotide mit feldspezifischer Sequenz immobilisiert sind, dadurch gekennzeichnet, daß die immobilisierten Oligonukleotide des mindestens einen Feldes der- art modifiziert sind, daß sie gegen enzymati- schen, chemischen, physikalischen und/oder chemisch-physikalischen Abbau als Einzelstrang und/oder als Doppelstrang stabil sind.
2. Oligonukleotidanordnung nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß Oligonukleotide immobilisiert werden, die durch zumindest eine vorbestimmte oder alle Nukleasen, die spezifisch einzelsträngige Nukleinsäure spalten, nicht verdaubar sind.
3. Anordnung nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die Oligonukleotide des mindestens einen Feldes ansteller einer Phosphorsäureesterbindung im Zucker- Phosphatrückgrat der Oligonukleotide Thioester enthalten.
4. Anordnung nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch mindestens zwei voneinander getrennte Felder, wobei in den mindestens zwei getrennten Feldern Oligonukleo- tide mit von Feld zu Feld verschiedener, jedoch feldspezifischer Sequenz immobilisiert sind.
5. Anordnung nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die immobilisierten Oligonukleotide derart modifiziert sind, daß sie mit komplementären Nukleotidsequenzen im gleichen Temperaturbereich hybridisieren.
6. Anordnung nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die immobilisierten Oligonukleotide durch geeignete Länge oder che- mische Modifikation, beispielsweise des Ribose- bestandteils, modifiziert sind, daß sie mit komplementären Nukleotidsequenzen im gleichen Temperaturbereich hybridisieren.
7. Verfahren zum Nachweis einer Nukleotidsequenz in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, daß a) mit zumindest Abschnitten der nachzuweisenden Nukleotidsequenz komplementäre Oligonukleotide auf einem Substrat immobilisiert werden, und ein- oder mehrfach die folgenden Schritte b) und c) ausgeführt werden: b) das Substrat wird mit Material der Probe in Kontakt gebracht; c) einzelsträngige DNS wird chemisch, physika- lisch, chemisch-physikalisch, enzymatisch oder durch ein anderes geeignetes Verfahren spezifisch abgebaut; und d) abschließend das Vorhandensein doppelsträngi- ger Nukleinsäuren bzw. der nachzuweisenden Nukleotidsequenz auf dem Substrat nachgewiesen wird.
8. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen Schritt b) und c) in einem weiteren Schritt bl) das Sub- strat erwärmt wird.
9. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat auf größer 40°C erwärmt wird.
10. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat auf 60 bis 75°C erwärmt wird.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet daß mit zumindest Abschnitten der nachzuweisenden Nukleotidsequenzen komplementäre Oligonukleotide auf dem Substrat im- mobilisiert' erden, die derart modifiziert sind, daß sie durch eine vorbestimmte oder alle Nu- kleasen, die spezifisch einzelsträngige Nuklein- säure spalten, nicht verdaubar sind.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt c) die Oberfläche des Substrates einem Restriktionsverdau durch die vorbestimmte oder eine Nuklease, die spezifisch einzelsträngige Nukleinsäure spaltet, ausgesetzt wird.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt c) die einzelsträngige DNS chemisch abgebaut wird.
14. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt c) die einzelsträngige DNS mittels Hydroxylamin und Osmiumtetroxid gefolgt von Spaltung mit Piperi- din oder durch Hydrazin mit Piperidin oder durch Dimethylsulfoxid (DMS) , Ameisensäure und Piperidin abgebaut wird.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß in jedem Schritt b) weiteres Probenmaterial mit dem Substrat in Kontakt gebracht wird.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß vor jedem Schritt c) nicht-inaktivierte Nuklease zugegeben wird.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß als Nuklease Sl- Nuklease verwendet wird.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß als Probe eine Probe enthaltend fragmentierte, gescherte, und/oder in kleinere Fragmente vorher teilverdaute und/oder nicht-amplifizierte Nukleinsäuren verwendet wird.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß als Probe eine Probe enthaltend amplifizierte Nukleinsäure verwendet wird.
20. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die amplifizierten Nu- kleinsäuren markiert sind und in Schritt d) markierte Nukleinsäure auf dem Substrat nachgewiesen werden.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß zum Nachweis doppel- strängiger Nukleinsäure in Schritt d) das Sub- strat dl) in einem der vorhergehenden Schritte oder in Schritt d) mit einem in doppelsträngige Nukleinsäuren interkalierenden Stoff in Kontakt ge- bracht wird, d2) das Substrat gewaschen wird und d3) der auf dem Substrat verbliebene interkalie- rende Stoff erfaßt wird.
22. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß als interkalierender Stoff ein Farbstoff verwendet wird.
23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß als interkalierender
Stoff ein Fluoreszenzfarbstoff verwendet wird.
24. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß als interkalierender Stoff eine Substanz verwendet wird, an die vor oder nach der Interkalation in die doppelsträngige Nukleinsäure ein Marker, beispielsweise eine radioaktive Komponente, ein Farbstoff oder ein eine Farbreaktion, eine Biolumineszenzreak- tion und/oder eine Che ilumineszenzreaktion katalysierendes Enzym, gebunden werden kann.
25. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß zum Nachweis doppel- strängiger Nukleinsäure in Schritt d) d4) das Substrat in einem der dem Schritt d) vorhergehenden Schritt oder in Schritt d) mit einem an die nachzuweisende Nukleinsäure, nicht jedoch an einzelsträngig vorliegende i mobili- sierte Oligonnukleotide bindenden Stoff in Kontakt gebracht wird, d5) das Substrat gewaschen wird d6) der auf dem Substrat verbliebene an die nachzuweisende Nukleinsäure bindende Stoff erfaßt wird.
26. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß als bindender Stoff ein Farbstoff verwendet wird.
27. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß als bindender Stoff ein Fluoreszenzfarbstoff verwendet wird.
28. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß als bindender Stoff eine Substanz verwendet wird, an die vor oder nach der Bindung an die nachzuweisende Nukleinsäure ein Marker, beispielsweise eine radioaktive Komponente, ein Farbstoff oder ein eine Far- breaktion, eine Biolumineszenzreaktion und/oder eine Chemilumineszenzreaktion katalysierendes Enzym gebunden werden kann.
29. Verfahren nach einem der Ansprüche 25 bis 28, dadurch gekennzeichnet, daß der an die nachzuweisende Nukleinsäure bindender Stoff ein Stoff •verwendet wird, der an den randständigen Zucker der nachzuweisenden Nukleinsäure, vorteilhafterweise kovalent, bindet.
30. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß für Schritt d) die Temperatur des Substrats unter die Hybridisie- rungstemperatur der immobilisierten Oligonukleotide mit zu ihnen komplementären Nukleotiden ab- gesenkt wird.
31. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 30, dadurch gekennzeichnet, daß eine Oligonukleoti- danordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 verwendet wird.
32. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 7 bis 31 mit einer Halterung zur Anordnung einer Oligonukleotid-Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 auf einer Oberfläche der Halterung sowie eine Heiz/Kühlvorrichtung zum Aufheizen bzw. Abkühlen der Oligonukleotid-Anordnung.
33. Vorrichtung nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß Vorrichtungen zum Zuführen von Probelösungen, Nukleaselösungen, Chemikalien und/oder Waschlösungen zu der Ober- fläche der Halterung für die Olionukleotid-
Anordnung vorhanden sind.
34. Vorrichtung nach einem der beiden vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch einen Spektralapparat zur
Erfassung von von oberhalb der Oberfläche der Halterung eintreffenden elektromagnetischen Strahlung, insbesondere Röntgenstrahlung, UV- Licht, sichtbares Licht, IR-Licht oder Partikel- strahlen.
35. Vorrichtung nach einem der drei vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch eine Vorrichtung zur Ein- Strahlung von elektromagnetischer Strahlung, insbesondere UV-, sichtbares und/oder IR-Licht auf die Oberfläche der Halterung.
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