WO2002102845A1

WO2002102845A1 - Procede de production d'un polypeptide fonctionnel provenant de fibroine de soie, et son utilisation

Info

Publication number: WO2002102845A1
Application number: PCT/JP2002/005663
Authority: WO
Inventors: Kozo Tsubouchi; Hiroo Yamada; Yoko Takasu; Hiroshi Nakao
Original assignee: National Institute of Agrobiological Sciences; Kowa Co Ltd
Current assignee: National Institute of Agrobiological Sciences; Kowa Co Ltd
Priority date: 2001-06-14
Filing date: 2002-06-07
Publication date: 2002-12-27
Anticipated expiration: 2003-12-14
Also published as: JPWO2002102845A1

Description

明細

絹フィプロイン由来機能性ポリぺプチドの製造法及びその利用技術分野

本発明は優れた細胞増殖促進作用を有する絹フイブ口イン L鎖ポリべプチドの製造法及びその医薬分野、化粧料分野への応用に関する。背景技術

従来より、絹フイブ口インには創傷、火傷等により欠損した皮膚組織の治癒促進作用があること力、ら、粉末状ゃフィルム状にして創傷被覆材として研究されている（特開平 1— 2 5 4 1 6 4号、同平 8— 1 9 8 9 7 0号、同平 9 一 1 9 2 2 1 0号、同平 1 1— 1 0 4 2 2 8号）。また絹フイブ口インは、このような作用を有することから化粧料としても応用されている。

しかしながら、これら従来の絹フイブロインを利用した創傷被覆材の治癒促進作用は充分満足すべきものではなく、さらに効果の優れた創傷治癒促進剤の提供が望まれている。

本発明は、欠損した皮膚組織の再生能力、すなわち細胞増殖促進効果に優れた天然由来成分の取得及びその利用を提供することを目的とする。発明の開示

かかる観点から本発明者らは、未分解絹フイブ口イン、すなわち、分子量約 3 5万の H鎖が優れた線維芽細胞増殖作用を有することを見出し、先に特許出願した（特願平 1 1 _ 1 9 8 2 3 3号）。

しかし、絹フイブ口イン H鎖は分子量が大きいため、水溶液におけるゲル化は 1日以内で起き、取り扱いが容易でない。

そこでゲル化の起きにくい細胞増殖促進作用を有する成分を取得すべくさらに検討した結果、絹フイブロイン H鎖及びその分解物とは別の低分子量の絹フィブ口イン L鎖の単離に成功した。そしてさらに、当該絹フイブ口イン L鎖は優れた皮膚の線維芽細胞増殖促進作用を有し、創傷治癒促進剤、細胞培養床及び化粧料として有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、生繭、乾繭もしくは煮繭した繭の繭層もしくは繭糸又は生糸、絹織物もしくはそれらの残糸を精練し、得られたフイブ口イン繊維を中性塩水溶液に溶解し、次いで分別沈澱することを特徴とする絹フイブ口イン L鎖ポリペプチドの製造法を提供するものである。

また本発明は、絹フイブ口イン L鎖ポリペプチドを有効成分とする細胞増殖促進剤を提供するものである。

また本発明は、絹フイブ口イン L鎖ポリぺプチドを有効成分とする創傷治癒促進剤を提供するものである。

また本発明は、絹フイブ口イン L鎖ポリペプチドを含有する細胞培養床を提供するものである。

また本発明は、絹フイブ口イン L鎖ポリペプチドを含有する化粧料を提供するものである。

また本発明は、細胞増殖促進剤又は創傷治癒促進剤を製造するための絹フィブ口イン L鎖ポリぺプチドの使用を提供するものである。

更に本発明は、絹フイブ口イン L鎖ポリペプチドを投与することを特徴とする創傷治癒の促進方法を提供するものである。図面の簡単な説明

図 1は、各沈澱物の電気泳動（S D S— P A G E) 像を示す図である。

図 2は、フイブ口インを C a C 1 ₂で溶解した場合と L i S C Nで溶解した場合のフィブロインの電気泳動像を示す図である。発明を実施するための最良の形態

蚕は体内の絹糸腺腔に液状の絹を分泌し、液状絹と言われている。液状絹は絹フイブ口インと絹セリシンから成り、液状絹フイブ口インは分子量約 3 7万である (Tasi ro Yutaka and Otsuki Ei ichi, Jounal of Cel l Biology, Vol. 46, P I (1970) ) 。分子量約 3 7万の絹フイブ口インは還元により分子量約 3 5万と 2 . 5万に分かれるが、ここでは分子量約 2 . 5万の絹フイブ口インを絹フイブ口イン L鎖と言い、分子量約 3 5万の絹フイブ口インを絹フイブ口イン H鎖という。

蚕は営繭時に液状絹を吐糸して繭（繭糸と蛹で構成）を作る。繭糸には中心部に絹フイブ口イン、周囲に絹セリシンが存在し、存在比は 7 0〜8 0 (フイブ口イン）： 2 0〜3 0 (セリシン）であることが知られている。生糸は繭糸を数本から数 1 0本集合（繰糸）して作られる。繭糸、生糸又は生織から絹セリシンを除去する工程を精練といい、精練後の繊維を絹糸又は絹糸フイブ口インと言う。精練によって絹セリシンを完全に除去すると限らない。 5分練りや 7分練りといつて、セリシンの半分又は 7 0 %程度を除去することもあるが、この場合も精練工程を経ているので絹糸という。生織とは未精練の絹織物を言う。一般に、絹はフイブ口イン単独、セリシン単独、又はフイブ口インとセリシンが同時に存在するものを言い、フイブ口イン、セリシンのいずれに対しても、またフィルム、粉末、繊維等のいずれの形態に対しても絹と言う。従って、絹フイブ口インとフィブロイン及び絹セリシンとセリシンは同じ意味である。絹フイブロインは絹フィプロインフィルム、絹フイブ口イン粉末、絹糸フイブ口イン等を言うが、このうちの絹糸フイブ口インは繭糸、生糸、生織又はそれらの残糸を精練して得られた繊維を言う。

従来の絹糸の製造法は、まず、養蚕農家で生産された生繭（生繭：貯蔵のため処理をしていない繭）を乾繭、煮繭、繰糸して生糸とし、生織を作る。次いでこの生糸又は生織の精練を行い、絹糸また絹織物とする。また、これらの工程で生じる屑を残糸という。乾繭は生繭を 1 1 5〜1 2 O :の温度から 5〜 6時間かけて 8 0 °C程度の温度に徐々に下げて行う。煮繭では 1 0 0〜 1 0 5 °Cの水蒸気及び熱水で 1 0分間程度処理される。

一方、絹フイブ口インは液状絹からも得ることができる。例えば、蚕の絹糸腺の中部及び後部糸腺からゲル状の内容物（液状絹）を取り出し、水溶液等で洗净することにより付着している少量の絹セリシンを除く方法で、未分解の絹フイブ口インを得ることができる。しかし、この方法は蚕を解剖して蚕体内から絹糸腺を取り出し、さらに絹糸腺腔から絹フイブ口インを取り出さなければならない。蚕 1頭から得られる絹フイブ口インは最大で 0 . 4 g程度であり、蚕体液や絹糸腺細胞等の不純物を含みやすいこと、及び絹フイブロインを得るのに手間がかかること等により、工業的な生産方法にはならない。

本発明においては工業的に有利な生繭、乾繭もしくは煮繭した繭の繭層もしくは繭糸を、あるいは生糸、絹織物又はそれらの残糸を材料として用いる。絹フィブロインは保存中に分解しやすいので、新鮮な生繭を原料とするのが最も望ましい。生繭、乾繭、生糸、絹糸及びそれらの残糸の保存は室温以下の温度で光を遮断することが好ましい。

本発明方法ではまず、これらの原料を精練してセリシンを除去する。精練手段としては、尿素水溶液処理、アルカリ水溶液処理、酵素水溶液処理、高圧熱水処理が挙げられるが、尿素水溶液処理が温和であることから特に好ましい。いずれの処理においても、原料が分繊しているほど精練は容易に、速くできる。

尿素水溶液による処理は、例えば絹フイブ口インの分解防止、反応効率及びェ業的操作性の点から、 3 0 % ( (重量（g ) 容量（mlj 以下、単に％で示す。）以上の尿素水溶液で 7 0〜9 0 °C、 6 0〜 1 8 0分処理する。より好ましくは 4 5 %以上の尿素水溶液で 7 5〜8 5 °C、 9 0〜 1 5 0分処理される。尿素水溶液には、メルカプトエタノール等を加えてもよい。

ここにおける処理とは、前記原料が尿素水溶液に浸漬されていればよく、この間撹拌してもよい。

アルカリ水溶液による処理は、例えば pH l 0〜 1 2のアルカリ水溶液で、大気圧下の沸騰温度、 2〜 6 0分の範囲で条件を適宜変えて処理する。 pHが 1 0未満では精練が充分でなく、 PHが 1 2を超えると絹フィブロインの分解が速く、コントロールが困難となる。また好ましい pHは 1 0 . 5〜1 1 . 5である。用いるァルカリ水溶液としては、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、ケィ酸ナトリウム、メタケイ酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、水酸化ナトリウム等のアルカリ性ナトリウム塩の水溶液が挙げられ、アルカリ精練の場合、炭酸ナトリウム水溶液は適度なバッファー効果があるため、特に好ましい。

絹を分解することなく精練するには精練時の PH、温度、時間等の処理条件を適宜変化させてコントロールすればよく、例えば沸縢温度以上の温度（例えば 1 1 0 や 1 2 0 °C) で処理するとき、 pHを中性寄りに、又は時間を短くする。沸縢温度以下の温度で処理するときは PHを高く、時間を長くする等適宜条件を変える。さらに、炭酸ナトリウムの他のナトリウム塩を使う時も炭酸ナトリウムに合わせ、適宜条件を変えることは言うまでもない。ここにおける処理とは、前記原料がアルカリ水溶液中に浸漬されていればよく、この間撹拌してもよい。酵素水溶液精練は夕ンパク質分解酵素を生糸や生繭の精練に応用した方法である。従来はパパインがよく利用されていたが、近年はアルカラ一ゼ（幸新堂化学工業所）が使われている。アルカラ一ゼによる酵素水溶液精練では前処理が必要で、前処理は pH 9〜 1 0、好ましくは pH 9 . 0〜9 . 6において、処理時間は 8 0ででは 1 0分以内、好ましくは 5分以内、 6 0 では 6 0分以内、好ましくは 1 0分以内で行う。その後、本処理としてアルカラーゼを添加して 5 0〜 6 0 °Cで精練する。精練時間は 6 0分以内、特に 2 0分以内が好ましい。この場合、繭層をできるだけ分繊することが好ましい。また、この間撹拌してもよい。絹精練は通常は大気圧下での水の沸騰点付近の温度で行われる。しかし、

10 o°c以上の高温で精練（高圧熱水処理又は高圧精練ともいう）することもできる。絹セリシンの溶解度は水の温度の影響が大きく、例えば 110°Cで 30〜 100分、 120 °Cで 20〜 60分、 130°Cで 10〜30分間、熱水に浸漬すればセッケンやアルカリ等の溶解剤を使用しなくても精練ができ、分解しない L 鎖が得られる。

精練により得られたフイブロイン繊維は中性塩水溶液に溶解して分別沈澱に付す。

中性塩としては、チォシアン酸リチウム、塩化カルシウム、臭化リチウム、チオシアン酸ナトリウム等が挙げられる。当該中性塩の濃度は中性塩の種類によつて異なるが、いずれの中性塩においても飽和水溶液又は 50%飽和以上の濃度が好ましい。特に 80%飽和水溶液以上の濃度が好ましい。チォシアン酸リチウムの場合飽和水溶液は約 80%である。なお、これらの中性塩水溶液の pHは 5〜 8 である。

原料が溶解した後の分別沈澱には非結晶絹フィブロインを結晶化させるァセ卜ンゃアルコール、特にエタノールを用いるのが好ましい。この操作は、例えばェ夕ノールを順次添加して沈澱物を採取するのが好ましい。アルコールやアセトンの濃度が低いと H鎖が選択的に沈澱し、濃度を高くすると L鎖が選択的に沈澱するので、これらの溶剤の濃度を調整することにより、 L鎖を選択的に沈澱させることができる。例えば塩化カルシウム水溶液にエタノールを加えて沈澱させる場合には、エタノール濃度 82. 4%未満では主に H鎖が沈澱し、 82. 4%を超えると主に L鎖が沈澱する。

かくして得られる絹フイブ口イン L鎖ポリペプチドは、優れた細胞増殖促進作用を示すので、種々の細胞培養添加剤（特に、ヒトを含む動物細胞用添加剤）、細胞培養床、創傷治癒促進剤や化粧料（以下、あわせて外用剤ということもある）として有用である。創傷治癒促進剤、細胞培養床又は化粧料として用いる場合には、絹：ン L鎖をハイド口ゲル、フィルム、粉末等にして創傷部又は皮膚に適用する外用剤として用いるのが好ましい。フィルム状にするには、絹フイブ口イン L鎖水溶液を平板上に流し、乾燥すればよい。また粉末にするにはこのフィルムを粉碎又は絹フイブロイン L鎖水溶液を空中噴霧又は絹フイブ口イン L鎖水溶液を撹拌や絹フイブ口イン L鎖水溶液にアルコール添加等により得た沈澱物を、水洗、乾燥、粉砕すればよい。

一方、絹フイブ口イン L鎖は、通常の外用剤、例えば軟膏剤、クリーム剤、パップ剤等の形態で用いることもできる。かかる軟膏剤、クリーム剤、パップ剤等にするには、通常の軟膏基剤、クリーム基剤、パップ基剤等に絹フイブ口イン L 鎖を配合すればよい。

これら外用剤への絹フイブ口イン L鎖の配合量は、剤型、基剤によって異なるが、 0 . 0 0 1〜3 0 (重量/重量）％、特に 0 . 1〜： L 0 (重量/重量）％が好ましい。実施例

次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに何ら限定されるものではない。

実施例 1 (細胞培養容器へコートした場合の細胞生育促進機能）

A. 材料及び方法

( 1 ) フイブ口イン

日中交雑種（日 1 3 7 X支 1 4 6 ) の繭層を 5、 6枚に剥離し、よく分繊した。次いで 3 0倍量（VZW) の 5 M尿素水溶液で 1 0 0 ° (：、 5分間よく撹拌しながら処理して、セリシンを溶解除去した。残りの繊維質（フイブ口イン繊維）を水洗、乾燥し、これをフイブ口イン（原料）として使用した。

( 2 ) フイブ口イン H鎖、 L鎖の試料溶液の調製エタノール 26 g、水 42 g、塩化カルシウム 32 gの混合液にトリス（ヒドロキシル）ァミノメタン 1. 21 gを入れた液の 1 0. 5DILにメルカプトエタノール 2 10 1を加え、 7 0〜80でにあたためておき、脱セリシンした繭層 523mgを入れて完全に溶解した。これにエタノールを添加し、添加したェ夕ノール濃度が 0〜7 1. 8% ( 1) 、 7 1. 9〜72. 5% (Π) 、 72. 6〜 78 % (ΙΠ) 、 78. ：!〜 82. 3 % (IV) 、 82. 4〜84. 7 % (V) 、 84. 8-89. 2% (VI) 、 89. 3〜91. 7% (VE) で得られた各沈澱を集め、それぞれの成分分析を行った。図 1にこれらの沈澱物の電気泳動（SDS -PAGE) 像を示す。この像より I、 Πの画分を H鎖、 Wの画分を L鎖とした。 ΠΙ、 IV等の画分では H鎖が分解し、低分子化しているので、除外した。次に、これらの H鎖と L鎖の沈澱物を 9M L i SCNに溶解した後、 50倍量の水で 30分、 4回透析した。さらに、これらのタンパク量を UV法で測定し、水で希釈してそれぞれ 0. 0 2 5 %、 0. 0 0 2 5 %に調整した。

(3) タンパクの定量 · UV法

タンパク溶液の 275mnの吸光度を測定し、吸光度 1 · 0のときのタンパク濃度を lmg/mLとして計算した。

(4) 細胞培養シャーレへのフイブ口インポリペプチドのコート

ポリスチレンのシャーレ（35ππηφ、ファルコン）にフイブ口イン Η鎖、 L鎖の 0. 025%又は0. 0025%水溶液を l L入れて風乾し、 PBS (リン酸緩衝生理食塩水） 2 mLで 3回洗った後再度風乾し、 70%エタノールに浸漬して滅菌した。フイブ口インポリペプチド無添加の対照区用シャーレには、フイブ口インポリペプチドの代りに水を IfflL入れて風乾し、以下同様に処理した。

(5) 細胞

細胞はクラボウから購入した凍結ヒト皮膚線維芽細胞（成人由来）を使用した。

(6) 培地培地は、クラボウから購入したヒ卜皮膚線維芽細胞増殖用低血?青培地を使用した。

(7) 細胞培養

フイブロインポリぺプチドをコ一トしたシャーレによる細胞培養実験では、シヤーレ 1枚につき培地 2mLを入れ約 10万の細胞を接種した。

(8) 生細胞数の測定

シャーレ 1枚につき培地 2mL、アラマ一ブル一（IWAK I) 0. 1 mLの割合で入れ、 37Ϊ：、 2時間培養した後、 570mn、 60 Onmの吸光度から計算した色素の還元量を生細胞数とした。

B. 結果

細胞培養を 4日間行った後に、フイブ口インポリペプチド無添加の場合を 100%としたヒ卜皮膚繊維芽細胞の生細胞数を表 1に示した。

表 1

フイブ口インポリペプチドをコートしたシャーレでのヒト皮膚繊維芽細胞の生育

生細胞数（％) 対照区との有意差の信頼率対照区 100±6.5*

無添加）

H鎖（25 w g/mL) 183±23.5 99.9%

H鎖（2. 5 g/mL) 220土 30.5 99%

L鎖（25 g/mL) 218±11.5 98%

L鎖（2. 5 z g/mL) 189±16.8 98%

*：標準偏差

フイブ口インポリペプチドをコートしたシャーレでは、 H鎖、 L鎖ともに対照区より生育率が優れていた。

実施例 2 (細胞培養用の培地へ添加した場合の細胞生育促進機能）

実験方法は、下記以外は実施例 1と同じである。

フイブ口イン H鎖、 L鎖水溶液の培地への添加実験は下記のように行った。マルチウエルプレート（6穴、ファルコン）に培地 2niLを入れ、約 10万の細胞を接種し、 1日後にフイブ口イン H鎖、 L鎖の水溶液（25 ^gZmL) を添加した培地と交換し、さらに培養を 4日間続けた。フイブ口インポリペプチド無添加の場合の生細胞数を 100%とした対照区に対し、フイブ口インポリペプチドを添加した場合の生細胞数を表 2に示した。

表 2

リベプチドを添加した培地でのヒト皮膚繊維芽細胞の生育生細胞数（％) 対照区との有意差の信頼率対照区 100土 1.3»

H鎖（25 ^ g/niL) 108±0.8 99%

L鎖（25 /mL) 11は 1.8 99%

*：標準偏差

表 2のように培地にフイブ口インポリペプチドを添加した場合も、対照区より生育率が良かった。

実施例 3 (未分解 L鎖が含まれている場合の細胞生育促進機能）

絹夕ンパクの溶剤として、中性塩水溶液が使われることはよく知られている。この中で L i SCN (チオシアン酸リチウム）の飽和水溶液は絹タンパクの分子量を低下することなく絹タンパクを溶解する。しかし、 L i SCNは高価で重量当たり CaC l ₂ (塩化カルシウム）の約 100倍の価格で市販されている。 C aC 1₂は絹タンパクをよく溶解させるが、加熱を要するため、絹タンパクの分子量を低下させやすい。特に、 L鎖より H鎖は熱、酸、アルカリ、光等で分子量が低下しやすい。そこで、実施例 1のように、 80 C以下で絹タンパクを溶解すれば、 C a C 1₂を用いても H鎖の回収はできる。しカし、 CaC l ₂を用いた場合、 H鎖の一部は分解するが L鎖はほとんど分解されない。

フイブ口インを C a C 1₂ (85で）及び L i SCN (室温）で溶解した溶解液中のフイブ口インの電気泳動像を図 2に示した。図 2において、 CaC l ₂で溶解したフイブ口インには H鎖が確認できない。 CaC 1₂を用いてフイブロインを溶解する場合、溶解温度を 85 °C程度で行うと、 H鎖はほとんど分解するが、 L鎖のほとんどは分解されずに残る。このように、 L鎖は H鎖に比べて安定であり、取り扱いが容易である。

CaC 1₂を用いてフイブ口インを溶解した場合は、溶解温度にもよるが、 H 鎖の多くは平均分子量 10万程度にまで分解し、 L鎖はほとんど分解していなレ^ このようなフイブ口インを用いて、実施例 1と同様の実験を行った。その結果、生細胞数は 133%を示し、 L鎖力 S含まれていることで細胞増殖促進作用があり、その作用を利用できることが分かった。

実施例 4

実施例 1で得られた H鎖及び L鎖のそれぞれ 0. 1 %、 0. 5%水溶液を調製し、室温に保って溶液の状態を観察した結果を表 3に示した。

表 3

1曰後 7曰後 14曰後

H鎖（0. 1 %) やや粘性ゆるいゲルかたいゲル

(0. 5 ) ゆるいゲルかたいゲルかたいゲル

L鎖（0. 1 %) 液状液状液状

(0. 5%) 液状液状やや粘性

表 3にみられるように H鎖の水溶液は、 0. 5 %の濃度では 1日後ですでにゲル化が始まり、 7日後には完全にゲル化した。また 0. 1%でも、 1日後にゲル化の兆候である粘性の増加がみられ、 7日後にはゆるいゲルを形成し、 14日後には完全にゲル化した。

これに対して L鎖の水溶液は、 0. 5%の濃度でも 7日後までは完全に液状であり、 14日後にわずかに粘性の増加がみられる程度であった。また 0. 1%の濃度では 14日間以上安定であった。産業上の利用可能性

本発明の絹フイブ口イン L鎖は、優れた細胞増殖促進作用を有し、かつ安定性が高いので、創傷治癒促進剤等の医薬、皮膚ケア用の化粧料として有用である。

Claims

請求の範囲

1 . 生繭、乾繭もしくは煮繭した繭の繭層もしくは繭糸又は生糸、絹織物もしくはそれらの残糸を精練し、得られたフイブロイン繊維を中性塩水溶液に溶解し、次いで分別沈澱することを特徴とする絹フイブロイン L鎖ポリぺプチドの製造法。

2 . 精練が、尿素水溶液処理、アルカリ水溶液処理、酵素水溶液処理及び高圧熱水処理から選ばれる処理である請求項 1記載の製造法。

3 . 中性塩水溶液が、塩化カルシウム水溶液、チォシアン酸リチウム水溶液、臭化リチウム水溶液及びチォシアン酸ナトリゥム水溶液から選ばれる水溶液である請求項 1又は 2記載の製造法。

4. 分別沈澱が、アルコール及びアセトンから選ばれる溶剤の濃度変化によるものである請求項 1〜 3のいずれか 1項記載の製造法。

5 . 絹フイブ口イン L鎖ポリペプチドを有効成分とする細胞増殖促進剤。

6 . 絹フィプロイン L鎖ポリぺプチドを有効成分とする創傷治癒促進剤。

7 . 絹フイブ口イン L鎖ポリペプチドを含有する細胞培養床。

8 . 絹フイブ口イン L鎖ポリペプチドを含有する化粧料。

9 . 細胞増殖促進剤又は創傷治癒促進剤を製造するための絹フイブロイン L鎖ポリペプチドの使用。

1 0 . 絹フイブ口イン L鎖ポリペプチドを投与することを特徴とする創傷治癒の促進方法。