KR20020079761A

KR20020079761A - 세리신 함유소재, 그 제조방법 및 그 사용방법

Info

Publication number: KR20020079761A
Application number: KR1020027008220A
Authority: KR
Inventors: 고조 츠보우치; 히로미 야마다; 요코 다카스
Original assignee: 독립행정법인농업생물자원연구소
Priority date: 2000-10-24
Filing date: 2001-03-22
Publication date: 2002-10-19
Also published as: JP2002128691A; WO2002034885A1; EP1335018A1; US6815427B2; CN1406276A; US20030087433A1

Abstract

본 발명의 목적은, 미분해 세리신을 구성하는 성분의 생리활성기능을 해명하고, 그 기능성분을 이용한 새로운 의료용 재료, 화장소재 등을 제공하는 것.

가잠이 토사하는 섬유(견사 등)로부터 용출하여 얻어지는, 도데실 황산나트륨-폴리아크릴 아미드겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의한 분자량이 약 400,000인 세리신을 주체로 하는 세포생육 촉진제이다.

이 세포생육 촉진제(물질)는, 의료용으로서 창상 피복재, 혈관내피 형성재, 장기형성 소재로, 바이오용으로서 세포 배양상 소재로, 또 피부 케어용으로서 화장용 소재로 사용되는 것으로, 세포생육이 촉진되어 매우 유용하다.

Description

세리신 함유소재, 그 제조방법 및 그 사용방법{SERICIN-CONTAINING MATERIAL, PROCESS FOR PRODUCING THE SAME AND METHOD OF USING THE SAME}

가잠이 토사하는 섬유, 즉 견사 등은, 피브로인과 세리신의 2종의 단백으로 구성되어 있고, 세리신은 피브로인을 코팅한 상태로 존재하고 있다.

누에고치는 건견(乾繭), 자견(煮繭), 조사(繰絲) 등의 공정을 거친 후, 정련(탈세리신)되고, 정련된 견사(피브로인 섬유)는 견직물로서 이용되어 왔다.

또, 견사는 천연섬유 중에서 유일한 장섬유로, 결정성이 우수하고, 강도가 높아, 예로부터 의복재료외에 수술사로서도 이용되어 왔다.

근래 견단백은, 그 고유의 기능에 착안하여 여러가지 용도로 이용하는 것이 성행하고 있다.

견단백을 이용한 신소재 개발은 피브로인이 선행했는데, 근래는 피브로인의성과에 의거하여, 또 한쪽의 견단백인　세리신에 관해서도 연구개발의 대상이 되어오고 있다.

예를 들면, 세리신 가수 분해물을 기체(基體) 표면에 피복하여 이루어지는 화장용 분체(일본 특개평 10-226626호 공보), 피브로인 분산액 및/또는 세리신수용액을 함침시킨 셀룰로오스 섬유를 포함하여 이루어지는 화장료(일본 특개평 11-152206호 공보), 세리신 가수 분해물을 유효성분으로 하는 피부염증 방지제(일본 특개평 10-245345호 공보), 세리신 가수 분해물을 유효성분으로 하는 콜라겐생산 촉진제 및 노화 방지용 피부 외용제(일본 특개평 10-226653호 공보), 세리신 가수 분해물과 효모 분해물을 함유하는 피부 외용제(일본 특개평 11-193210호 공보), 가잠의 견단백(피브로인 및/또는 세리신)으로부터 작성된 필름으로 이루어지는 세포 배양상(미노우라 등「Attachment and growth of cultured fibroblast cells on Silk protein matrices, J. Biomedical Materials Res., Vol. 29, 1215-1221(1995))등이 보고되고 있다.

한편, 견사 등으로부터 세리신을 얻는 방법으로서, 종래의 정련 폐액으로부터 세리신을 회수하는 방법에서는, 평균 분자량 50,000 이하의 저분자량의 것밖에 얻을 수 없었다(일본 특개평 1-168906 공보, 일본 특개평 4-202435호 공보 등).

즉, 견사 중의 세리신은 결정화되어 있기때문에, 대부분 물에 녹지않지만, 알칼리성의 열수 중에서 분해함으로써, 제거되어 왔다.

최근에 와서, 평균 분자량 100,000 이상의 고분자량의 세리신을 효율좋게 취득할 수 있게 되고(일본 특개평 11-92564호 공보, 일본 특개평 11-131318호 공보등), 또, 분자량의 저하를 억제하도록 하여 견사 등으로부터 세리신 등을 용출하는 방법도 개발되어 오고 있다(일본 특개평 11-228837호 공보, 일본 특개 2000-38514호 공보 등).

가잠의 세리신은, 오래전부터 분자량 수만에서 수십만의 단백의 혼합물이라고 일컬어져 왔는데, 거대하기때문에 회합이나 불용화가 일어나기 쉬워, 취급이 곤란했었다.

그 때문에, 미분해상태에서의 분획·정제가 어떠한 단백성분으로 구성되어 있는지에 관해서는 미해결인 채로 남아 있었다.

또한, 생리활성 등의 기능이 시사되고 있는 종래의 보고에서도, 대부분은 추출단계에서 저분자화한 것이었다.

우리들은 최근, 미분해 세리신을 추출과 분획에 성공한 이래, 분획하여 얻어진 이들 성분의 이용연구가 과제로 되고 있었다.

본 발명은, 미분해 세리신을 구성하는 성분의 생리활성기능을 해명하고, 그 기능성분을 이용한 새로운 의료용 재료, 화장소재 등을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은, 가잠 세리신을 함유하여 이루어지는 세포육성 촉진제에 관한 것으로, 상세하게는 의료용 재료, 세포 배양상(培養床) 소재 및 화장용 소재에 관한 것이다.

또, 본 발명은, 가잠이 토사하는 섬유(견사 등)로부터 세포 생육기능을 가지는 세리신을 취득하는 방법에 관한 것이다.

제1도는, 견사단백의 전기 영동상이다.

제2도는, 각 침전물의 전기 영동상이다.

제3도는, 분획, 정제한 세리신의 주요 3성분(s-d, s-a, s-b)의 전기 영동상이다.

제4도는, 견층 단백의 전기 영동상이다.

제5도는, 추출 세리신의 전기 영동상이다.

(과제를 해결하기 위한 수단)

상기 과제를 해결하기 위해서, 본 발명자들은, 우선, 미분해 세리신을 구성하는 세리신의 분자량과 생리활성과의 관련에 관하여 추적한 바, 미분해 세리신을 구성하는 성분 중에서 특정한 분자량을 가지는 세리신이, 매우 높은 세포생육 촉진작용을 가진다는 지견을 얻었다.

본 발명은, 상기 지견에 의거하여 이루어진 것으로, 이하의 각 구성으로 이루어진다.

즉, 본 발명은, (1), 이 토사하는 섬유(견사 등)로부터 용출하여 얻어지는, 도데실 황산나트륨- 폴리아크릴 아미드겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의한 분자량이 약 400,000인 세리신을 주체로 하는 세포생육 촉진제에 있다.

그리고, (2), 가잠이 토사하는 섬유(견사 등)중의 세리신을, 요소 수용액으로 용해시킨 후, 도데실 황산나트륨-폴리아크릴 아미드겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의한 분자량이 약 400,000인 세리신을 분리 회수하는 방법에 있다.

그리고 또, (3), 4M 이상의 요소 수용액으로 용해시키는 것을 특징으로 하는 제 2항 기재의 분리회수하는 방법에 있다.

그리고 또, (4), 가잠이 토사하는 섬유(견사 등)를, 중성 염수용액으로 용해시켜서 얻어지는, 도데실 황산나트륨-폴리아크릴 아미드겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의한 분자량이 약 400,000인 세리신, 및 견피브로인을 함유하는 세포생육 촉진제에 있다.

그리고 또, (5), 분말상 또는 필름상의 형태를 가지는 세포생육 촉진제에 있다.

그리고 또, (6), 가잠이 토사하는 섬유(견사 등)를 온화한 조건으로 정련하여, 저분자량의 세리신을 제거함으로써 얻어지는, 피브로인 섬유 표면이 실질적으로 도데실 황산나트륨-폴리아크릴 아미드겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의한 분자량이약 400,000인 세리신 성분에 의해 피복된 상태의 섬유상소재로 이루어지는 세포생육 촉진제에 있다.

그리고 또, (7), 가잠이 토사하는 섬유(견사 등)를 온화한 조건으로 정련하여, 저분자량의 세리신을 제거하는 것으로 이루어지는, 피브로인 섬유 표면이 실질적으로 도데실 황산나트륨-폴리아크릴 아미드겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의한 분자량이 약 400,000인 세리신에 의해 피복된 상태의 섬유상 소재의 제조방법에 있다.

그리고 또, (8), 가능한 한 중성에 가까운 온화한 pH영역에서 자비정련을 행하는 섬유상 소재의 제조방법에 있다.

그리고 또, (9), 잠체내의 중부 사선(絲腺) 및 전부 사선의 액상견을 수중에 침지하여 얻어지는, 실질적으로 도데실 황산나트륨-폴리아크릴 아미드겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의한 분자량이 약 400,000인 세리신을 주체로 하는 세포생육 촉진제에 있다.

그리고 또, (10), 상기에 기재된 세포생육 촉진제를, 피부케어 소재로서의 화장소재, 의료용 재료로서의 창상 피복용 소재, 혈관내피 형성, 장기형성 소재, 및 바이오 재료로서의 세포 배양상 소재로 사용하는 방법에 있다.

(발명의 실시형태)

(1) 미분해의 세리신을 구성하는 각종 세리신의 분리와 동정

(a) 미분해 세리신의 취득

견사 등으로부터 미분해의 세리신을 빼내기 위한 수단으로서, 종래의 산, 알칼리수용액이나 효소처리에 의한 용출방법을 이용한 것에서는, 가수분해에 의해 분자량이 저하되기때문에, 이들의 용출방법은 채용할 수 없다.

그래서, 견사 등을 티오시안산 리튬 등의 중성 염수용액에 피브로인과 함께 용해하여, 피브로인과 세리신으로 이루어지는 견단백 용액을 작성한다.

이 중성 염수용액에 의한 용해방법에 의하면, 가수분해에 의한 분자량 저하를 억제하여 거의 미분해의 세리신을 함유하는 견단백용액을 얻을 수 있다. 이 미분해의 세리신을 함유하는 견단백용액을, 도데실 황산나트륨-폴리아크릴 아미드겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의한 분자량 측정 및 세리신의 분별에 제공한다.

(이하, 도데실 황산나트륨-폴리아크릴 아미드겔 전기영동은, SDS-PAGE로 축약한다.)

상기 중성 염수용액에 의한 용해방법에 있어서 사용하는 중성염으로서는, 티오시안산 리튬, 브롬화리튬, 염화칼슘, 질산칼슘 등을 들 수 있는데, 특히 티오시안산리튬, 브롬화리튬이 바람직하다.

견사 등은, 중성염의 농후 수용액 중에 투입되어, 용해된다.

용해에 있어서는, 견단백의 분자량 저하를 가능한 한 억제하기 위해서, 온화한 조건을 선정한다.

중성염은, 50％ 포화이상의 농도로 사용되고, 가열온도는 실온∼80℃의 범위로 한다.

80℃를 초과하면 견단백의 분자량 저하가 일어나므로, 용해시간이나 중성염의 종류와의 균형도 있지만, 가능한 한 저온인 것이 바람직하다.

용해시간은 1∼20분의 범위에서, 중성염의 종류, 온도 등의 조건을 고려하여, 완전하게 용해하고, 또한 분자량 저하가 일어나지 않도록 결정한다.

견단백을 용해한 중성염용액은, 투석을 거쳐서 순수한 견단백 수용액으로 한다.

(b) 전기 영동법에 의한 분자량 측정

견단백은, 전기 영동법에 의해서, 2성분의 피브로인(Ｈ 및 Ｌ) 및 4성분의 세리신(a, b, c, 및 d)으로 분리된다.

즉, 견사 등을 상기 중성 염수용액에 용해하고, 5M(5mol/l)요소액으로 치환한 것을, 환원제, 예를 들면 2-메르캅토 에탄올(ME)로 처리하고, 분자간 가교결합(SS결합)을 절단한다.

이것을 SDS-PAGE에 제공하여 견사의 구성 단백 각 성분의 분자량을 측정한다.

전기 영동법에 의한 측정의 결과, 견층 세리신의 약 45％를 분자량 약 400,000의 세리신(a)이, 약 34％를 약 250,000의 세리신(d)이, 약 15. 5％를 약 200,000의 세리신(b)이, 약 5. 3％를 약 35,000 세리신(c)이 각각 차지하는 것을 알아냈다.

(2) 세리신(a)성분으로 이루어지는 소재의 작성；

견사 등을 요소 수용액 중, 대기압하에서 가열하여 세리신(a) 성분을 용출한다.

요소 수용액의 농도는 4M이상, 바람직하게는 7M∼포화에서 70∼100℃에 3∼30분간 바람직하게는 5∼30분간 유지하여, 세리신을 추출한다.

요소 수용액의 농도는 낮을수록 요소량이 적기때문에, 비용이 적어도 된다.

그러나, 요소 농도가 낮으면 특히 세리신(a)의 용해가 저하되고 추출량이 적어지기때문에, 추출을 빠르고 회수량을 많게 하기위해서는 4M이상의 요소 농도로 하는 편이 좋다.

가열온도가 낮으면 추출되기 어렵고, 높으면 세리신이 분해되어 분자량이 저하된다.

추출시간이 짧으면 추출되기 어렵고, 길면 세리신이 분해되기 쉽다,

또, 요소 수용액에 1％이상의 환원제(ME등)를 첨가함으로써, 세리신의 회수율은 향상한다.

이상과 같이 하여 얻은 세리신 용해액에, 용량으로 하여 3∼5배량의 유기 용매(메탄올, 에탄올, 아세톤 등)를 첨가하여, 미분해 세리신의 침전을 얻는다.

이것을 1％이상의 환원제(ME등)를 포함하는 티오시안산 리튬 등의 중성 염수용액에 용해한 후, 에탄올 등의 유기용매를 순차적으로 첨가하여 침전시키고, SDS-PAGE로 확인하면서 각종 세리신의 분획을 행한다.

침전물의 용해·침전의 조작을 반복함으로써, 세리신(a) 함유율이 90％이상인 견단백을 얻는다.

또는, 견사 등을 티오시안산 리튬 등의 중성 염수용액에 용해하여 얻은 피브로인을 포함하는 견단백용액을 환원제(예를 들면 ME등)로 처리하고, 이어서 에탄올 등의 유기용매에 의한 침전 및 ME함유 티오시안산 리튬 수용액에 의한 용해를 반복하여 견단백성분의 분별을 행함으로써, 세리신(a) 함유율이 90％이상인 견단백을얻는다.

용해와 침전을 반복해서 정제된 세리신(a)을, 티오시안산 리튬 등의 중성 염수용액에 용해하고, 투석 등으로 탈염한다.

정제·탈염된 세리신(a) 수용액을 분무 건조하여 분말상 소재를 얻는다.

또, 정제·탈염된 세리신(a) 수용액을 평판상에서 건조하여 필름상 소재를 얻는다.

이 필름상 소재를 분쇄하여 분말상 소재로 하여도 좋다.

이상과 같이 하여 얻어진 세리신(a) 성분으로 이루어지는 분말상 또는 필름상 소재는, 바이오용으로서 세포 배양상 소재 등에, 의료용으로서 창상 피복재, 혈관내피 형성재(인공혈관), 장기 형성재 의료소재 등에, 또, 피부 케어용으로서 화장소재 등에, 일부 또는 전부로서 이용할 수 있다.

평균 입자 직경이 1∼1,000㎛, 바람직하게는 1∼100㎛이면, 분말은 피부 등의 움직임에 유연하게 대응할 수 있어, 창상 피복제로서도 이용할 수 있다.

(3) 세리신(a)와 피브로인으로 이루어지는 소재의 작성；

세리신(a)을 함유하는 소재를, 특히 필름상 소재로서 사용하는 경우에는, 세리신(a) 성분만으로 이루어지는 소재 자체의 강도가 충분하지 않기때문에, 그대로 창상 피복재나 인공혈관 등의 의료소재 등에 이용하는 것은 반드시 바람직하지는 않다.

그래서, 견사를 구성하는 또 한쪽의 단백성분으로, 생체 적합성이 좋고. 강도가 우수한 견사의 구성성분인　피브로인을 세리신(a)와 조합시켜서 이용함으로써, 창상 피복재나 인공혈관 등의 의료소재 등에 의해 적합한 소재를 얻을 수 있다.

세리신(a)와 피브로인을 조합시켜서 이용하는 양태로서는, 견사를 리튬염 등의 중성염의 수용액으로 용해한 피브로인 수용액과, 세리신(a)로 이루어지는 수용액을 혼합하여 얻어지는 세리신(a)-피브로인 혼합 수용액을 이용할 수가 있다.

중성 염수용액으로서는 티오시안산 리튬의 5M이상의 수용액, 바람직하게는 9M정도의 포화수용액이 효과적이다.

원료 단백에 대하여 용매량이 많을수록 용해되기 쉽지만, 정제·탈염 등은 비효율적으로 된다.

따라서, 원료단백에 대해서 용매량을 가능한 적게 하는 편이, 견단백을 효율적으로 회수할 수 있다.

이러한 이유에서 원료에 대한 중성 염수용액의 용량은 원료중량에 대해서 7배 이상, 바람직하게는 9∼50배가 좋다.

용액의 탈염은 물에 대한 투석에 의해 행한다.

투석은, 투석 외액이 AgNO₃첨가에 의해 침전이 생기지 않게 될 때까지 행한다.

이것에 의해서, 세리신(a)-피브로인 혼합 수용액을 얻는다.

얻어진 혼합 수용액을 평판상에서 건조시켜서 필름상의 소재로 한다.

필름을 만드는 경우는, 투석을 가능한 한 신속하게 행하는 것이 바람직하고,구체적으로는 3일 이내, 바람직하게는 2일 이내이다.

투석에 긴 일수가 걸리면, 견단백이 겔화하여, 덩어리상태가 되기때문에, 필름화가 곤란해진다.

견단백 수용액을 평판 위, 특히 아크릴 등의 플라스틱판 위에 흘려서, 결정화도가 10％미만이 되도록, 신속하게 건조하여 필름화한다.

예를 들면, 60％RH(상대습도)이하의 실내에서, 송풍하면서 건조하는 것이 바람직하다.

결정화도 10％이상의 필름은 흡수성이 낮기때문에, 창상부에 피복했을 때, 창상부의 삼출액을 충분히 흡수할 수 없고, 유연해질 수 없기때문에, 오히려 창상부를 손상시켜 버린다.

그 때문에, 창상 피복재에는 적합하지 않다.

분말상의 소재는, 탈염한 세리신(a)-피브로인 혼합 수용액을 분무 건조시키거나, 또는, 혼합 수용액을 동결 건조시키거나, 또는 알코올 등에 의해 침전시켜서, 건조후 분쇄하여 얻어진다.

또, 필름상의 소재를 분쇄함으로써 얻을 수도 있다.

분말의 형상은 필름과 다르기때문에, 분말의 결정화도는 0∼100％의 범위에서 창상 피복재로서 이용할 수 있다.

(4) 세리신(a) 성분이 피브로인 섬유 표면에 피복된 섬유상 소재；

견사 등의 원료를 정련할 때에, 물에 용해하기 쉬운 세리신(d)와 (b)는 최초의 단계에서 제거되고, 세리신의 40％정도가 제거된 단계에서는, 견사의 표면은 대부분 세리신(a)로 구성되어 있기 때문에, 이 단계에서 정련을 종료하여 얻어지는 생사를 원료로 하는 것이 바람직하다.

견사 등의 원료를 자비 정련할 때는, 정련액의 pH가 중성에서 멀어질수록 세리신은 취득하기 쉽지만, 이 경우, 분해하여 분자량이 저하되므로, 미분해의 세리신을 취득하기 위해서는, 가능한 한 중성에 가까운 온화한 pH영역에서 정련을 행하는 것이 바람직하다.

물로 정련하는 경우에는, 세리신(a)을 포함하는 원료를 수중에 침지하여 행한다.

이 경우, 수온은 높은 쪽이 효율적이고, 대기압하에서 물을 비등시키는 것은 효과적이다.

분자량의 저하를 막기 위해서, 자비시간은 수 시간이내, 바람직하게는 1시 간 이내가 좋다.

비누를 이용하여 정련하는 경우에는, 예를 들면 농도 0. 3％의 마르세유 비누 등, 수용액의 pH가 10 이하가 되는 비누를 이용하여 1시간 이내, 바람직하게는 30분 이내의 자비로 한다.

세리신(a)와 피브로인으로 이루어지는 소재는, 세리신(a) 함유율이 5％이상, 바람직하게는 20％이상인 것이 바람직하다.

견사 등의 원료를 상기의 방법에 의해 정련하여, 물에 용해되기 쉬운 세리신 (d, b) 등을 제거하고, 견사의 표면이 세리신(a)만으로 덮여진 상태의 섬유상 소재를, 그대로, 또는 직포, 부직포 등으로 가공하여, 수술용의 사(絲), 창상 피복재나인공혈관 등의 의료용 소재 및 화장용 소재로서 이용할 수가 있다.

또는, 표면을 주로 세리신(a)로 덮은 섬유상 소재를 상기 (1)(a)와 동일한 방법에 의해 용해, 탈염하여, 견단백 수용액을 얻는다.

이것을 평판 위에서 건조하여 필름상 소재를 얻는다.

또는 분무 건조하여 분말상 소재를 얻는다.

또, 필름상 소재를 분쇄하여 분말상 소재로 하여도 좋다.

이상과 같이 하여 얻어진 세리신(a)로 이루어지는 분말상 또는 필름상 소재는, 창상 피복재, 인공혈관 등의 의료소재로서, 또, 피부 케어용의 화장소재 등의 일부 또는 전부로서 이용할 수 있다.

평균 입자직경이 1∼1,000㎛, 바람직하게는 ｌ∼100㎛이면, 분말은 피부 등의 움직임에 유연하게 대응할 수 있어, 창상 피복제로서도 이용할 수 있다.

본 발명에서 세리신(a)(a가 90％이상) 및 세리신(a)를 함유하는 소재를 취득하기 위한 원료로서의 견사 등은, 가잠이 토사한 견사 세리신을 함유하는 물질로 한다.

견사 세리신을 함유하는 물질로서는 가잠의 견층, 견사, 생사, 견직편물 등의 미정련물, 또 그들의 불완전 정련물 및 세리신을 함유하는 섬유, 분말, 필름 등이 있고, 이들 중에서 세리신(a)가 함유되어 있는 것 전부를 원료로서 이용할 수 있다.

또, 피브로인을 포함하지 않고 세리신만을 토사하는 세리신 누에의 누에고치도 원료로 할 수 있다.

(5) 잠체내의 중부 사선 및 전부 사선 액상견으로부터의 세리신(a) 및 세리신(a)를 함유하는 소재；

토사 직전의 가잠의 견사선을 빼내어, 수중에서 견사선을 찢어 내용물인　 액상견과 견사선 세포를 나눈다.

견사선은 전부, 중부, 후부로 나누어진다.

전부, 중부 견사선의 액상견은 직경 수 ㎜의 액상 피브로인의 둘레를 액상 세리신이 0. 1㎜∼0. 5㎜의 두께로 덮고 있다.

액상 피브로인, 액상 세리신 모두 물에 용해되므로, 전부, 중부 견사선의 액상견을 수중에 침지하여 두면, 세리신과 피브로인의 혼합 수용액이 얻어진다.

세리신의 쪽이 빠르게 용해되기때문에, 10∼30분간의 침지에서는 세리신을 많이 포함하는 수용액이 얻어지지만, 침지시간이 길어지면 피브로인의 비율이 많아진다.

이 수용액에 스프레이 드라이의 방법을 이용하면, 분말이 얻어진다.

또, 동결건조, 또는 알코올 등으로 침전한 후에 건조 분쇄하면, 분말이 얻어진다.

또, 평판상에서 건조하면, 필름이 얻어지고, 이 필름을 분쇄하면 분말이 얻어진다.

(효과)

본 발명의, 가잠이 토사하는 섬유(견사 등)로부터 용출하여 얻어지는, SDS-PAGE에 의한 분자량이 약 400,000인 세리신을 주체로 하는 세포생육 촉진제(물질)는, 견사 등으로부터 거의 미분해로 용출되어 취득된 것으로, 견사 등을 구성하는 세리신이 가지는 세포생육 촉진작용의 실질적인 유효성분이다.

또, SDS-PAGE에 의한 분자량이 약 400,000인 세리신을 주체로 하는 세포생육 촉진제(물질)는 액상견으로부터 얻을 수도 있다.

이 세포생육 촉진제(물질)는, 세포의 생육 촉진작용을 가지기때문에, 의료용 으로서 창상 피복재, 혈관내피 형성재, 장기형성 소재로, 바이오용으로서 세포 배양상 소재로, 또 피부 케어용으로서 화장용 소재로, 사용되면 매우 유용하다.

이하, 본 발명의 세포생육 촉진제의 상기 용도에 대한 유용성을 나타내기 위해서, 그것에 관한 실험(실시예)을 했으므로 기술하기로 한다.

단, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

[세리신(a)의 분획, 정제］

빛, 열, 물 등의 처리를 하고 있지 않는 토사 후 1개월 이내의 가잠견을 원료로 하여, 견층을 약 70％(중량％) LiSCN(pH7)수용액에 용해하고, 농도 약 5％의 견단백 용액을 얻었다.

이 견단백 용액의 용매를 5M 요소 수용액으로 치환한 샘플(N)과, 그것에 1％의 2-메르캅토 에탄올(ME)을 첨가하고, SS결합을 절단한 샘플(R)의 SDS-PAGE(2-15％ 그라디엔트겔)를 도 1에 나타낸다.

도 1은, 견사 단백의 전기 영동상이다.

2-메르캅토 에탄올로 환원되어 있는 견사 단백(R)과 환원되지 않은 견사 단백(N)으로 한다.

세리신(s), 피브로인(f), 마커(M)로 한다.

견사 단백은 피브로인과 세리신으로 이루어지고, SS결합을 절단함으로써, 피브로인은, 2성분[H(피브로인 H사슬, 및 피브로인 L사슬)]으로, 세리신은 주로 4성분(a, b, c 및 d)으로 나누어지고, 이들을 견단백의 주성분으로 간주할 수가 있다.

견단백의 각 성분은 도 1의 R의 전기 영동상의 염색 농도로부터 추정하였다.

그 결과를 표 1에 나타낸다.

세리신에는 a와 d성분이 특히 많고, a,b,d의 3성분으로, 세리신의 약 95％를 차지하므로, 이들 3성분을 세리신의 주요 성분으로 하였다.

다음에, 상술의 5％ 견단백 용액을 ME로 환원한 것 10ml에 에틸 알코올 82ml을 11회로 나누어, 순차 첨가하였다.

1회마다 생성한 침전물을 원심 분리하여 회수하였다.

각 침전물의 전기 영동상을 도 2에 나타낸다.

도 2는, 견사 단백 용해액에 에탄올 첨가에 의한 11분획물의 전기 영동상이다.

도 2에 있어서, 세리신(d)는 제 1, 2침전물에, 세리신(a)는 제 2∼5침전물에, 세리신(b)는 제 2∼6침전물에, 세리신(c)는 제 10∼11 침전물에 존재하고 있는 것을 알 수 있다.

그래서, 세리신의 주요 3성분을 가능한 한 고순도로 얻기 위해서, 제 1, 3, 4, 5의 각 침전물 따로따로 1％의 ME를 포함하는 70％ 티오시안산 리튬수용액(pH7)에 재차 용해하고, 용해액에 에탄올을 순차 첨가하여 재침전시켰다.

얻어진 침전물 중에서 세리신(d, a, b)의 SDS-PAGE를 도 3에 나타낸다. 도 3은, 분획, 정제한 세리신의 주요 3성분(s-d, s-a, s-b)의 전기 영동상이다.

세리신(d, a) 및 b의 순도는 높아지고, b가 조금 포함되어 있다고 생각되는 세리신(a)에 있어서도 전기 영동상으로부터 추정하여 순도는 90％이상이었다.

실시예 2

[세리신 3성분의 세포생육 촉진작용]

세리신 3성분에 관하여, 정상적인 사람 피부 유래의 선유아 세포를 이용하여, 세포생육 촉진작용의 유무를 조사하였다.

선유아 세포는 동물 개체내의 거의 모든 조직중에 분산하여 존재하고, 조직에 외상이 가해지거나, 장기의 실질세포가 상실된 경우, 선유아 세포가 분열증식하여 결락한 부분을 수복하는 특징을 가진다.

분획 정제된 세리신 3성분은 70％ 티오시안산 리튬 수용액에 용해하여, 이것을 물로 투석하였다.

투석은 티오시안산 이온의 농도가 0. 01M 이하가 될 때까지 행하고, 이것을 폴리스티렌의 세포 배양 용기(35mmø)의 바닥에 코팅하였다.

코팅은 25마이크로그램/㎠의 비율로 행하였다.

코팅된 용기는 생리 식염수로 세정 후, 70％ 에탄올로 멸균하여, 세포 배양 용기로 하였다.

정상인의 피부유래의 선유아 세포는 세포 배양액 1ml에 20,000개를 현탁시켜서, 2ml을 세포 배양 용기에 접종하였다.

5일간 배양후의 세포수를 아라마 블루 색소법으로 측정하였다.

결과를 표 2에 나타낸다.

표 2에서는 세리신(a)이 선유아세포의 성육을 촉진하고 있는 것을 알 수 있다.

세리신(d)와 세리신(b)에는 세포생육 촉진작용은 확인되지 않는다.

실시예 3

[세리신(a)를 함유하는 소재의 세포생육 촉진작용〕

가잠의 견층을 8M 요소중에서, 80℃에 10분간 유지하여 세리신을 추출하였다.

이 세리신의 추출액에 알코올을 첨가하여, 세리신을 침전시켰다.

이 침전물은 도 1의 세리신(d, a, b, c)로 이루어져 있다.

이 세리신 침전물을 포화 티오시안산 리튬 수용액에 용해하고, 탈염후 세포 배양 용기의 바닥에 코팅하여, 사람 정상 피부세포 유래의 선유아세포의 생육촉진 작용을 검토하였다.

이 때의 공정은 실시예 2와 동일한 방법이다.

세리신의 각 성분을 함유하는 배양상에서 배양한 사람 정상 피부유래의 선유아세포 생육촉진작용에 관해서는, 결과를 표 3에 나타낸다.

표 3과 같이 세포생육 촉진작용을 갖는 세리신(a)를 함유하고 있으면, 그 소재는 세포생육 촉진작용을 가진다.

표 3의 시료는 세리신의 각 성분(세리신d, a, b 및 c)을 함유하고 있는데, 세리신(a)를 함유하고 있으면, 그 이외의 것은 피브로인의 성분이라도 좋다.

또, 세리신(a) 이외의 것은 분해되어 있어도 좋다.

세리신(a)의 확인은 도 1과 같이 SDS-PAGE의 밴드의 유무로 행한다.

실시예 4

[견사에 세리신(a)를 함유하는 소재의 제조］

견사는 피브로인 섬유의 표면을 세리신이 덮은 상태로 되어 있다.

견사로부터 세리신(d)를 제거하면, 세리신의 약 70％는 세리신(a)가 된다.

그래서, 가잠의 견층을 견층중량의 100배량의 물에 침지하여, 자비하였다.

자비시간을 5, 10, 15, 20, 30, 60분으로 했을 때의 견층 단백의 전기 영동상을 도 4에 나타낸다.

20분과 30분 후에는 세리신(a)와 세리신(c)만 피브로인 섬유의 표면에 남아 있는데, 15분 후에서는 세리신(b)도 약간 남아 있다.

한편, 세리신(a)는 견사 표면으로부터 떨어지기 어렵지만, 60분 후에는 매우 적어져 있다.

또, 가잠의 견층을 견층중량의 100배량의 물에 침지하여, 이것에 0. 2ｇ의 마르세유 비누를 첨가하여 자비하였다.

자비시간을 5, 10, 15, 20, 30, 60분으로 하여 견층을 처리하고, 처리시간과 견사표면의 세리신성분을 전기 영동으로 조사하였다.

그 결과, 원료의 견층에는 세리신의 각 성분이 보이지만, 20분과 30분 후에는 세리신(a)와 세리신(c)만 피브로인 섬유의 표면에 남아 있었다.

60분 후에서는 세리신(a)는 매우 적어져 있다.

따라서, 견층을 물 또는 비눗물 중에서 10∼60분 정도, 바람직하게는 15∼40분 정도 자비하면, 피브로인 섬유표면의 대부분을 세리신(a)로 할 수 있다.

실시예 5

[세리신의 분해〕

가잠의 견층을 80℃의 8M 요소중에 5분 침지하여 세리신을 추출하였다.

이 세리신 추출액을 100℃에서 5, 10, 15, 20, 30, 60분의 각 시간처리를 하였다.

처리후의 견사의 전기 영동상을 도 5에 나타낸다.

세리신(a) 성분은 (d)나 (b) 성분보다 분해속도가 빠르다.

처리시간이 20분간에서는 세리신(a) 성분은 명확하게 확인할 수 있지만, 30분의 처리에서는 매우 적어지고, 45분의 처리에서는 거의 확인할 수 없다.

도 5는, 추출 세리신의 전기 영동상, 가잠의 견층을 80℃의 8M 요소중에 5분간 침지하여 세리신을 추출하고, 이 세리신 추출액을 100℃에서 5, 10, 15, 20, 30, 60분의 각 시간처리를 하였다.

실시예 6

[동물실험]

이 실시예는, 털이 없는 개［니혼 농산공업(주)]를 이용하여 창상 피복재로서의　효과를 보다 상세하게 조사한 것이다.

사용한 창상 피복재로서, 우선 상기 실시예 1에서 얻은 세리신(a) 성분 90％ 이상의 침전물(a), 및 상기 실시예(3)에서 얻은 세리신 각 성분을 함유하는 침전물(Ｓ)을 사용하였다.

이들의 침전물은, 잘 수세한 후에 동결 건조하여, 분쇄하였다.

분말의 평균 입자직경은 10∼20㎛이다.

또, 상기 실시예 4에 있어서, 가잠 견층을 수중에서 15분 자비하여 얻은 세리신(a) 성분 함유 견사(Ｆa)에 관해서도, 동물실험에 이용하였다.

이 경우는 수세 후, 섬유길이를 0. 5mm 정도 이하로 재단하였다.

그리고 또, 액상견으로부터 세리신함유 필름(Ｌ-Ｓ)을 다음과 같이 제작하였다.

가잠(일본 137×중국 137호 )이 토사 직전이 되었을 때, 잠체를 알코올로 소독하고, 그 견사선을 적출하여, 물로 수세후에, 중부 사선(絲腺) 중구(中區)의 액상견을 빼내어, 수중에 침지하였다.

침지 20분 이내의 침지액을 플라스틱판상에서 실온으로 송풍하면서 건조하고, 두께 30㎛의 필름을 만들었다.

이 필름의 세리신 함유율은 약 70％로, 수용성을 나타낸다.

이상 외에, 비교를 위해서, 두께 40mμ로, 세리신이 1. 7％, 피브로인이 98. 3％의 수용성을 나타내는 필름(Ａ-1)을 창상 피복재로서 털이 없는 개를 사용하여 시험하였다.

이 필름(Ａ-1)은, 본 발명자가 발명한 특허 제2990239호에 있어서의, 실시 예 3의 표 4에 나타내는 Ａ-1의 필름과 동일한 필름작성 공정을 거쳐서 제조된 필름이다.

또, 견사를 120℃의 탄산소다수용액에 2시간 침지하고, 수세 건조 후, 분쇄 하여 얻은 피브로인 분말(Ｆ-1. 8)[평균 입자직경 1. 8mμ로 물에 수용성을 나타낸다]에 관해서도 창상 피복재로서 털이 없는 개를 사용하여 시험하였다.

이 피브로인 분말은, 본 발명자가 발명한 일본 특원평 11-259149호에 있어서의 실시예 3의 표 4에 나타내는 (3)의 피브로인분말과 동일한 조건으로 조제된 피브로인 분말이다.

또한, 창상 피복재를 사용하지 않는 경우를 대조구로 하였다.

우선, 털이 없는 개의 등부분 피부에 약 1㎠의 크기로 표피를 포함하여 진피까지 박리하고, 이 창상부를 히비텐 소독약으로 소독 후, 동물용 항생물질 벤질페니실린 프로카인[메이지제과(주)]를 적하하여, 각 창상 피복재로 피복하였다.

또한, 흡수 패드가 부착된 폴리우레탄 필름 OpSite〔스미스 앤드 네퓨(주)]로 덮었다.

또한, 창상 피복재의 탈락을 막기 위해서 개용 재킷을 장착하였다.

관찰

시험개시 후 1주째 및 2주째에, 시험부위의 관찰기록을 행하였다.

그 결과를 표 4에 나타낸다.

여기서, 「염증부의 삼출액의 정도」는, --(없음)이 치유의 정도가 좋은 것을 나타내고, 또「표피의 재생상태」는 +++(매우 있다)이 치유도가 높은 것을 나타내는 것이다.

어느 쪽의 창상 피복재도 대조구보다 창상의 치유를 촉진하고, 치유효과가 있었다. 세리신(a) 성분 또는 (a) 성분을 함유하는 창상 피복재(a, s, Ｆa)는 비교로서 사용한 아몰퍼스 피브로인 필름(세리신 1. 7％함유)Ａ-1와 동등하거나 그 이상의 치유효과가 있었다.

피복재(Ｓ)와 Ａ-1의 치유효과는, 표 4에서 나타낸 바와 같이 대부분은 동일하지만, Ｓ와 Ａ-1을 비교하면 Ｓ의 쪽이 Ａ-1보다 치유효과는 있었다.

본 발명에 의해 제조된 이 세포생육 촉진제는, 세포의 생육촉진작용을 가지기때문에, 그 세포생육 촉진제를 기대할 수 있는 각종 분야, 예를 들면, 의료용으로서 창상 피복재, 혈관내피 형성재, 장기형성소재로, 바이오용으로서 세포배양상 소재로, 또 피부 케어용으로서 화장용 소재로, 널리 사용가능하다.

Claims

가잠이 토사하는 섬유(견사 등)로부터 용출하여 얻어지는, 도데실 황산나트륨-폴리아크릴 아미드겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의한 분자량이 약 400,000인 세리신을 주체로 하는 것을 특징으로 하는 세포생육 촉진제.
가잠이 토사하는 섬유(견사 등)중의 세리신을, 요소 수용액으로 용해시킨 후, 도데실 황산나트륨-폴리아크릴 아미드겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의한 분자량이 약 400,000인 세리신을 분리 회수하는 방법.
제 2 항에 있어서, 4M 이상의 요소 수용액으로 용해시키는 것을 특징으로 하는 분리 회수 방법.
가잠이 토사하는 섬유(견사 등)를, 중성 염수용액으로 용해시켜서 얻어지는, 도데실 황산나트륨-폴리아크릴 아미드겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의한 분자량이 약 400,000인 세리신, 및 견 피브로인을 함유하는 것을 특징으로 하는 세포생육 촉진제.
제 1 항 또는 제 4 항에 있어서, 분말상 또는 필름상의 형태를 가지는 것을 특징으로 하는 세포생육 촉진제.
가잠이 토사하는 섬유(견사 등)를 온화한 조건으로 정련하고, 저분자량의 세리신을 제거함으로써 얻어지는, 피브로인 섬유표면이 실질적으로 도데실 황산나트륨-폴리아크릴 아미드겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의한 분자량이 약 400,000인 세리신 성분에 의해 피복된 상태의 섬유상 소재로 이루어지는 것을 특징으로 하는 세포생육 촉진제.
가잠이 토사하는 섬유(견사 등)를 온화한 조건으로 정련하고, 저분자량의 세리신 성분을 제거하는 것으로 이루어지는, 피브로인 섬유표면이 실질적으로 도데실 황산나트륨-폴리아크릴 아미드겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의한 분자량이 약 400,000인 세리신에 의해 피복된 상태를 특징으로 하는 섬유상 소재의 제조방법.
제 6항에 있어서, 가능한 한 중성에 가까운 온화한 pH영역에서 자비 정련을 행하는 것을 특징으로 하는 섬유상 소재의 제조방법.
잠체내의 중부 사선 및 전부 사선의 액상견을 수중에 침지하여 얻어지는, 실질적으로 도데실 황산나트륨-폴리아크릴 아미드겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의한 분자량이 약 400,000인 세리신을 주체로 하는 것을 특징으로 하는 세포생육 촉진제.
제 1 항, 제 4 항, 제 5 항, 제 6 항 또는 제 9 항에 기재된 세포생육 촉진제를, 피부 케어 소재로서의 화장소재, 의료용 재료로서의 창상 피복용 소재, 혈관내피형성, 장기형성 소재 및 바이오 재료로서의 세포 배양상 소재에 사용하는 방법.