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WO2002038800A1 - Dispositif de test permettant de doser le cholesterol hdl (lipoproteine a haute densite) - Google Patents

Dispositif de test permettant de doser le cholesterol hdl (lipoproteine a haute densite) Download PDF

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Publication number
WO2002038800A1
WO2002038800A1 PCT/JP2001/009712 JP0109712W WO0238800A1 WO 2002038800 A1 WO2002038800 A1 WO 2002038800A1 JP 0109712 W JP0109712 W JP 0109712W WO 0238800 A1 WO0238800 A1 WO 0238800A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
surfactant
cholesterol
layer
test piece
hdl
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2001/009712
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hiroshi Tamura
Susumu Nishino
Takehiro Yamaguchi
Koichi Hino
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Arkray Inc
Sekisui Medical Co Ltd
Original Assignee
Arkray Inc
Daiichi Pure Chemicals Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Arkray Inc, Daiichi Pure Chemicals Co Ltd filed Critical Arkray Inc
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Priority to AU2002212717A priority patent/AU2002212717A1/en
Priority to US10/415,726 priority patent/US6939682B2/en
Priority to DE60142792T priority patent/DE60142792D1/de
Publication of WO2002038800A1 publication Critical patent/WO2002038800A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Priority to US11/184,117 priority patent/US7575884B2/en
Ceased legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q1/60—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving cholesterol
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
    • G01N33/521—Single-layer analytical elements
    • G01N33/523—Single-layer analytical elements the element being adapted for a specific analyte

Definitions

  • HDL High-density lipoprotein
  • the present invention relates to a test strip for measuring high density lipoprotein (HDL) cholesterol.
  • HDL high density lipoprotein
  • HDL cholesterol is one of the important measurement items in health examinations and clinical medical examinations from the epidemiological point of view that it is inversely correlated with the incidence of coronary artery disease.
  • test pieces in which a reagent is impregnated with filter paper and dried and dried are widely used.
  • HD L cholesterol As a method of measuring HD L cholesterol, for example, there is a method of separating HDL from other lipoproteins (eg, LDL, VLDL, etc.) by ultracentrifugation, and then measuring only HD L cholesterol using an enzyme. is there. Another method is to separate HDL from other lipoproteins by electrophoresis, stain the lipids, and measure the color intensity. These are general methods, but they are not performed in clinical tests and the like because the operation is complicated and it is difficult to process a large number of samples. For this reason, various methods for measuring HD L cholesterol capable of treating a large number of samples have been proposed and some of them have been implemented. These methods are described below.
  • the present invention has been made in view of such circumstances, and an object of the present invention is to provide a test piece having a simple structure and capable of easily measuring HD L cholesterol with a small sample amount.
  • the test piece for measuring HD L cholesterol of the present invention has a higher solubilizing performance on HD L than an enzyme reagent for measuring cholesterol and lipoproteins other than high-density lipoprotein (HDL).
  • 4 is a test piece having a first surfactant and a second surfactant that inhibits dissolution of lipoproteins other than HDL.
  • the test strip of the present invention has the two types of surfactants, so that it can be easily used as an enzyme reagent for measuring cholesterol in HDL cholesterol. Can be measured specifically.
  • friendsAlso since this test piece does not use a special reaction such as agglutination reaction, there is no need to take a special structure, a simple structure is possible, and a small sample volume is required.
  • the test strip of the present invention has a configuration in which, for example, a reagent layer is formed on a support, and the reagent layer has the enzyme reagent, the first surfactant, and the second surfactant. Can be taken.
  • the reagent layer has a sample supply layer and a detection layer
  • the sample supply layer has the first surfactant and the second surfactant
  • the detection layer contains the enzyme reagent. It may be configured to have.
  • the inside of the sample supply layer has the second surfactant in an upper portion (upper layer) and the first surfactant in a lower portion (lower layer).
  • the sample supply layer has a part of the enzyme reagent, the first surfactant and the second surfactant, and the detection layer has the remaining part of the enzyme reagent.
  • the first surfactant is preferably a polyoxyethylene alkylene phenyl ether, and these may be used alone or in combination. Among them, more preferred is polyoxyethylene alkylene tribenzyl phenyl ether.
  • the second surfactant is preferably a polyoxyethylene alkyl ether, a polyoxyethylene alkyl phenyl ether, a polyoxyethylene-polyoxypropylene condensate, a polyoxyethylene alkyl ether sulfate and an alkylbenzene sulfonate. These may be used alone or in combination of two or more. Among these, a polyoxyethylene-polyoxypropylene condensate is more preferable.
  • the enzyme reagent is cholesterol esterase and cholesterol Preference is given to a combination of oxidases or a combination of cholesterol esterase and cholesterol dehydrogenase. More preferred is the combination of the former.
  • the ratio of cholesterol esterase when the sample is added and mixed with the reagent is, for example, in the range of 5 to 100 U U mL, preferably in the range of 10 to: L U U Z mL, and more preferably. Ranges from 30 to 70 U Zml.
  • the ratio of cholesterol oxidase in all the components during the enzymatic reaction is, for example, in the range of 5 to 1000 UZmL, preferably in the range of 100 to 100 UZmL, and more preferably in the range of 100 UZmL.
  • the proportion of cholesterol dehydrogenase in all components during the enzymatic reaction is, for example, in the range of 5 to 100 UZmL, preferably in the range of 10 to 100 UZmL, and more preferably in the range of 30 to 100 UZmL. It is in the range of 70 U / mL.
  • the enzyme to be used commercially available enzymes can be used. Among them, for example, in view of the reaction principle of the present invention, a contaminant that inhibits a series of reactions (for example, the first surfactant or the second surfactant) is used.
  • the ratio in all components at the time of the enzyme reaction is a ratio in all components when a sample (sample) is added, and the total components are the sample, the enzyme reagent, and the Refers to all components present during the enzymatic reaction, such as the first surfactant and the second surfactant.
  • the amount of a sample is predictable or determinable depending on its type.
  • the ratio of the first surfactant in all components during the enzymatic reaction is preferably in the range of 1 to 10% by mass, more preferably in the range of 3 to 7% by mass.
  • the ratio of the second surfactant in all the components during the enzymatic reaction is preferably in the range of 1 to 20% by mass, and more preferably in the range of 7 to 13% by mass. These ratios are considerably higher than those of liquid systems. Concentration.
  • the mass ratio (AZB) of the first surfactant (A) to the second surfactant (B) is preferably in the range of 110 to 11 and more preferably 1Z3 to 2Z3. Range.
  • the test piece of the present invention is preferably adjusted so that the pH during the enzyme reaction is in the range of pH 6 to 9. A more preferred range for the pH is in the range of pH 7-8, optimally PH 7.7.
  • the sample to be measured by the test strip of the present invention is not particularly limited, and is, for example, a sample (particularly, a biological fluid) that may contain HDL cholesterol, such as whole blood, plasma, and serum.
  • FIG. 1 (A) is a cross-sectional view showing the configuration of an example of the test piece of the present invention
  • FIG. 1 (B) is a cross-sectional view showing the configuration of another example of the test piece of the present invention
  • (C) is a sectional view showing the configuration of still another example of the test piece of the present invention.
  • FIG. 2 is a graph showing a time course of reflectance in still another example of the test piece of the present invention.
  • FIG. 3 is a graph showing a correlation between a measured value of HDL cholesterol according to still another example of the test piece of the present invention and a measured value by an agglutination method.
  • FIG. 4 is a graph showing a correlation between a measured value of HD L cholesterol according to still another example of the test piece of the present invention and a measured value by a direct method.
  • test piece of the present invention will be described with reference to examples.
  • the enzyme reagent for measuring cholesterol used in the present invention includes, for example, those of the above two combinations, Preference is given to the combination of zeolites and cholesterol oxidase. That is,
  • HDL cholesterol is usually classified in the living body into two types, a free form and a state in which the HDL cholesterol is esterified with a fatty acid, and the latter is hydrolyzed into cholesterol and fatty acids by cholesterol esterase.
  • a free form When the resulting cholesterol is treated with cholesterol oxidase, cholesterone and hydrogen peroxide are produced. Then, by measuring this hydrogen peroxide, the amount of HD L cholesterol can be determined.
  • Hydrogen peroxide can be measured by electrochemical measurement or chemical measurement. Chemical measurement using peroxidase (POD) and a substrate that develops a color when oxidized (hereinafter referred to as an “oxidized chromogenic substrate”). Measurement is preferred.
  • POD peroxidase
  • oxidized chromogenic substrate a substrate that develops a color when oxidized
  • the color of the oxidized chromogenic substrate may be measured by optical means. Therefore, in this case, POD and oxidative chromogenic substrate are also included in the enzyme reagent.
  • the ratio of POD in all components during the enzymatic reaction is, for example, in the range of 50 to 500 UZmL, preferably in the range of 100 to 1500 UZmL, and more preferably in the range of 700 to 800 UZmL. Range.
  • the ratio of the oxidative chromogenic substrate in all components at the time of the enzymatic reaction is appropriately determined depending on the type and the like, and is, for example, in the range of 10 to: I 00 mmO 1, preferably in the range of 20 to 200. mmO 1 ZL, more preferably in the range of 30 to 70 mm O 1 / L.
  • the oxidative chromogenic substrate examples include AL PS [NE thy 1-N— (3-su 1 fopropyl) ani 1 ine, sodi um sa 1 t], DAOS [NE thyl -N- (2-hydroxy) — 3 — su 1 fopropy 1) ⁇ 3, 5— di me thoxyani 1 ine, sodi um salt], MAOS [NE thyl -N- (2 — hydroxy— 3— sulfopropyl) — 3, 5— di me thylani 1 ine , sodi um salt, mo nohydr ate], TOO S [N—E thyl—N— (2-hydroxy—3—su 1 fopropy 1) —3—me thylani 1 ine, sodi urn salt, dihydrate], phenol, etc.
  • a substrate exhibiting a color matching the wavelength used by the measuring instrument can be appropriately selected.
  • the first surfactant is not particularly limited as long as it has a higher solubilizing performance on HDL than lipoproteins other than HDL (LDL, VLDL, etc.).
  • This first surfactant has a function of solubilizing cholesterol or cholesterol ester contained in HDL, and as a result, promotes the reaction between cholesterol or its ester and the enzyme reagent.
  • a commercially available product may be used. Examples of commercially available products of the polyoxyethylene alkylene ether include “Emalgen A-60” (manufactured by Kao Corporation) and the like. Polyoxyethylene alkylene alkylene tribenzyl ether is commercially available. Examples of commercially available products include Emargen B666 (trade name, manufactured by Kao Corporation).
  • the second surfactant is not particularly limited as long as it inhibits the dissolution of lipoproteins other than HDL (such as LDL and VLDL).
  • the second surfactant inhibits dissolution, the reaction between cholesterol or its ester and the enzyme reagent is inhibited.
  • the second surfactant those described above can be preferably used.
  • polyoxyethylene cetyl ether for example, trade name “Emulgen 220” manufactured by Kao Corporation
  • polyoxyethylene phenyl ether for example, trade name “Emulgen 220” manufactured by Kao Corporation
  • a polyoxyethylene phenyl nonylphenyl ether for example, trade name “Emulgen 913” manufactured by Kao Corporation
  • Kao Corporation is a polyoxyethylene-polyoxypropylene condensate.
  • Polyethyleneethylene lauryl ether sodium sulfate (for example, trade name “Emal 20C” manufactured by Kao Corporation) is preferred as the alkylene sulfate, and sodium dodecylbenzenesulfonate is preferred as the alkylbenzene sulfonate.
  • a time zone occurs in which HDL cholesterol and the enzyme reagent specifically react with each other.
  • HDL cholesterol can be measured specifically.
  • the time period is from the start of the reaction (after the addition of the sample), for example, after 1 minute to 20 minutes, preferably after 3 minutes to 15 minutes. It is preferably after 5 minutes to 10 minutes.
  • the test strip of the present invention may contain, in addition to the enzyme reagent, the first surfactant and the second surfactant, an antioxidant, a reduction inhibitor, an interfering substance removing reagent, and the like, if necessary. May be added.
  • the mixing ratio of such additives is within a range that does not impair the functions of the enzyme reagent, the first surfactant, and the second surfactant.
  • the test piece in FIG. 1 (A) has a configuration in which a reagent layer 2 is formed on a support 1.
  • the reagent layer 2 contains the enzyme reagent, the first surfactant, and the second surfactant.
  • the support 1 can be manufactured by using, for example, a resin such as polyethylene terephthalate (PET), polystyrene, polyester, or cellulose acetate, and among them, PET is preferable.
  • PET polyethylene terephthalate
  • the thickness of the support 1 is not particularly limited, but is, for example, in the range of 0.1 to 1 mm, preferably in the range of 0.1 to 0.5 mm, and more preferably in the range of 0.2 to 0.3 mm. .
  • the reagent layer 2 includes, for example, the enzyme reagent, the first surfactant, the second surfactant, and a hydrophilic polymer.
  • a hydrophilic polymer include polyvinylpyrrolidone, hydroxypropylcellulose, methylcellulose, sodium alginate, polyacrylic acid, gelatin, acid-hydrolyzed gelatin, polyacrylamide, agarose, and the like.
  • the solvent include a phosphate buffer, a Good's buffer, and a Tris-HCl buffer. Of these, the Good's buffer is preferable.
  • the pH of the buffer solution is preferably adjusted to a range of pH 6 to 9, and more preferably adjusted to a range of pH 7 to 8, so that the pH during the enzyme reaction falls within the above-mentioned predetermined range. Yes, optimally to adjust to pH 7.7.
  • the mixing ratio of the hydrophilic polymer is, for example, in the range of 0 to 40% by mass, and preferably in the range of 10 to 30% by mass, based on the entire coating solution, and is appropriately adjusted depending on the type. it can.
  • Reagents such as the enzyme reagent, the first surfactant, and the second surfactant are adjusted in advance so as to have the above-described ratio, and then mixed with the solvent.
  • the method of application is not particularly limited, and examples thereof include a method using a brush or the like, a spray coating method, a method using a roll coater, a dipping method, and the like.
  • the thickness of the reagent layer 2 is, for example, in the range of 50 to 250; am, preferably in the range of 80 to 200 m, and more preferably in the range of 100 to 150. is there.
  • the reagent layer 2 may contain the above-mentioned additives such as an antioxidant, if necessary, in addition to the above components.
  • the shape of the test piece is not particularly limited, but is usually a plate or a strip.
  • the size in the case of a strip is, for example, a width of 3 to 15 mm in a total length of 50 to 150 mm, preferably a width of 5 to 150 mm in a range of L 00 mm. It is in the range of 1 Omm.
  • This test piece is used, for example, as follows. First, a sample such as blood is dropped on the reagent layer 2. The dropped sample reacts with the reagent in the reagent layer 2, but due to the action of the first surfactant and the second surfactant, the time period during which HDL cholesterol specifically reacts with the enzyme reagent is limited. Occurs.
  • the measurement is performed during the above-mentioned time period.
  • the reagent layer 2 contains POD and the oxidative chromogenic substrate
  • the color of the substrate is measured by an optical measuring device such as a spectrophotometer or a reflectometer.
  • the sample is plasma or serum
  • the support 1 is light-transmissive
  • the transmitted light and the reflected light can be measured by irradiating light from the support 1 side or the reagent layer 2 side.
  • a known blood cell shielding layer and a light reflecting layer are provided between the detection layer and the sample supply layer to prevent photometry due to coloring of red blood cells, and light transmission is performed. It is preferable that the measurement is performed from the side of the support using a non-conductive support.
  • a detection layer 2b is formed on the support 1, a sample supply layer 2a is formed thereon, and the reagent layer 2 is composed of both layers.
  • the sample supply layer 2a contains a first surfactant and a second surfactant
  • the detection layer 2b contains the enzyme reagent.
  • This reagent layer 2 can be formed, for example, as follows. First, a solution prepared by dissolving the enzyme reagent and the hydrophilic polymer in a solvent is coated on a support 1 and dried to form a detection layer 2b. On the other hand, the porous member is impregnated with a solution in which the first surfactant and the second surfactant are dissolved and dried.
  • the porous member becomes the sample supply layer 2a, and the reagent layer 2 is formed.
  • the type and concentration of the hydrophilic polymer and the solvent are the same as described above.
  • the sample supply layer 2a Is preferably porous.
  • a knitted fabric can be used as the porous member.
  • the knitted fabric include polyethylene knitted fabric, polyester knitted fabric, polytetrafluoroethylene knitted fabric, polysulfone knitted fabric, polypropylene knitted fabric, polyvinylidene difluoride knitted fabric, cellulose mixed ester knitted fabric, and glass fiber There are knitted products.
  • the thickness of the sample supply layer 2a is, for example, in the range of 50 to 400 m, preferably in the range of 200 to 300 m, and more preferably in the range of 220 to 270 / m. .
  • the thickness of the detection layer 2b is, for example, in the range of 5 to 100 zzm, preferably in the range of 5 to 50 m, and more preferably in the range of 5 to 20 °.
  • the method of using this test piece is the same as in the above example. In this test piece, since the sample comes into contact with the first and second surfactants and then with the enzyme reagent, it is possible to more specifically measure HDL cholesterol.
  • the sample supply layer has a part of the enzyme reagent and the two types of surfactants, and the detection layer has the rest of the enzyme reagent.
  • the sample supply layer contains the second surfactant in the upper layer inside, and the first surfactant in the lower layer inside the sample supply layer 2a.
  • Surfactant may be contained. This example is shown in Fig. 1 (C).
  • 21 is the upper layer of the sample supply layer 2a
  • 22 is the lower layer of the sample supply layer 2a
  • the same parts as those in FIG. 1 (B) are denoted by the same reference numerals.
  • the specimen first contacts the second surfactant, then contacts the first surfactant, and contacts the enzyme reagent.
  • the sample supply layer 2a is formed, for example, by forming the detection layer 2b as described above, and then applying a solution obtained by dissolving a first surfactant and a hydrophilic polymer in a solvent. It can be formed by applying a solution in which a second surfactant and a hydrophilic polymer are dissolved in a solvent, followed by drying.
  • the type and concentration of the hydrophilic polymer and the solvent are the same as described above, and the coating method is also the same as described above.
  • the lower layer is formed by impregnating the porous member with the first surfactant, and the upper layer is formed by applying the second surfactant on one surface thereof.
  • the test piece shown in FIG. 1 (C) can be formed by laminating the lower layer so as to be in contact with the detection layer 2b.
  • a blood cell separation layer may be formed on the reagent layer, if necessary. This can be achieved by disposing a porous member capable of filtering blood cells and, if necessary, a known reflective layer.
  • a porous member capable of filtering blood cells and, if necessary, a known reflective layer.
  • a known blood cell separation material such as a glass filter can be used. If a blood cell separation layer is provided, HDL cholesterol in serum or plasma can be measured simply by supplying whole blood as it is.
  • the “KZS” value is a variable calculated by the following equation, and is used when converting reflectance (R) into density.
  • a solution for forming a detection layer having the following composition was applied on a white PET film (thickness: 125 m) to a thickness of 150 ⁇ , and then dried at 40 for 10 minutes to form a detection layer.
  • a polyethylene knitted fabric (thickness 250 / m) was impregnated with an impregnating liquid having the following composition, and dried at 4 Ot: for 10 minutes.
  • the coating impregnating solution described below was applied to one side of the polyethylene knitted fabric, and dried at 40 for 10 minutes to form a sample supply layer.
  • the target test piece was prepared.
  • This test piece has the configuration shown in Fig. 1 (C).
  • the following composition is the final concentration (concentration during enzyme reaction) when a 5 L sample was supplied.
  • the pH of this test piece during the enzyme reaction was 7.7.
  • TE S buffer (manufactured by Dojin Chemical Co., pH 7.7) 30 mm o 1 / L cholesterol esterase 39 U / mL cholesterol oxidase 23 U / mL e. Lioxyethylene alkylene triphenyl ether 5% by mass
  • Example 1 except that neither polyoxyethylene alkylene tribenzylphenyl ether (first surfactant) nor polyoxyethylene-polyoxypropylene condensate (second surfactant) was used.
  • a test piece was prepared in the same manner as in Example 1 (Comparative Example 1).
  • a test piece was prepared in the same manner as in Example 1 except that only the first surfactant was used (the second surfactant was not used) (Comparative Example 2).
  • the reflectance (time course) of the test piece was measured using a serum as a sample, and a dedicated reflectometer (trade name: Spotchem, (Arclay Co., Ltd.). The measurement wavelength is 610 nm.
  • the horizontal axis is the measurement time (seconds), and the vertical axis is the KZS value.
  • the reaction reached the end point in a short time, and the HD L cholesterol was observed. It can be seen that only the measurement was possible.
  • the reaction was so low that HDL cholesterol could not be substantially measured.
  • the test piece of Comparative Example 2 using only the first surfactant only the HD L cholesterol could not be specifically measured.
  • test pieces Three kinds of test pieces (A, B, C) were prepared in the same manner as in Example 1 except that the final concentrations of the first surfactant and the second surfactant were adjusted to the ratios shown in Table 1 below. did.
  • the reflectance was measured in the same manner as in Example 1 for 60 serum samples with a known HDL cholesterol concentration, and the amount of HDL cholesterol was determined from the above “KZS” value. . Then, the correlation between the actually measured density and the known density was examined. The results are also shown in the table.
  • Example 2 The same test piece as in Example 1 was produced. Using this test piece, HDL cholesterol in 60 serum samples was measured in the same manner as in Example 2. In addition, HDL cholesterol in the sample was measured by the following agglutination method and direct method. Then, the correlation between the value measured by the test piece and the value measured by the aggregation method and the direct method was examined. Of the test piece The correlation between the measured value and the measured value of the agglutination method is shown in the graph of FIG. 3, and the correlation between the measured value of the test piece and the measured value of the direct method is shown in the graph of FIG.
  • the measurement was carried out using a commercially available serum HDL cholesterol measurement kit (trade name: HDL-C555, manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.) according to the method of use. After mixing the reagent and the sample, centrifugation was performed at 30000 r111 for 10 minutes.
  • a commercially available serum HDL cholesterol measurement kit (trade name: HDL-C555, manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.) according to the method of use. After mixing the reagent and the sample, centrifugation was performed at 30000 r111 for 10 minutes.
  • the measurement was carried out using a commercially available serum HDL cholesterol measurement kit (trade name: Choletest HDL, manufactured by Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd.) according to the method of use.
  • serum HDL cholesterol measurement kit trade name: Choletest HDL, manufactured by Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd.
  • the test strip of the present invention has a simple structure, and can easily measure HDL cholesterol with a small sample amount. Therefore, by using the test piece of the present invention, it is possible to process a large number of samples in a short time, and it is possible to contribute to the efficiency of the test especially in clinical tests.

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Description

明 細 書 高密度リポタンパク質 （HDL) コレステロール測定用試験片 技術分野
本発明は、 高密度リポタンパク質 （HDL) コレステロールを測定す るための試験片に関する。 背景技術
HD Lコレステロールは、 冠動脈疾患の発症頻度と逆相関するという 疫学的見地から、 健康診断や臨床医療の検査等において、 重要な測定項 目の一つとなっている。 他方、 臨床検査等では、 大量の検体を処理する 必要があることから、 試薬をろ紙等に含浸し、 これを乾燥させた試験片 が、 汎用されている。
HD Lコレステロールの測定方法としては、 例えば、 超遠心分離によ り HDLを他のリポタンパク質 （例えば、 LDL、 VLDL等） と分離 したのち、 酵素を用いて、 HD Lコレステロールのみを測定する方法が ある。 また、 電気泳動により、 HDLを他のリポタンパク質から分離し た後、 脂質の染色を行い、 その発色強度を測定する方法もある。 これら は、 一般的な方法であるが、 操作が煩雑であり、 多数の検体を処理する ことが困難であるため、臨床検査等で実施されることはない。このため、 多数の検体を処理可能な HD Lコレステロールの測定方法が、 種々提案 されており、 一部で実施されている。 これらの方法を以下に示す。
例えば、 コレステロールエステラーゼおよびコレステロールォキシダ ーゼを化学修飾し、 シクロデキストリン等の包接化合物の存在下、 HD L中のコレステロールを特異的に捕らえる方法がある （特開平 7— 3 0 1 6 3 6号公報） 。 また、 検体に凝集剤を加え、 HDL以外のリポタン パク質を凝集沈殿させ、 上清にある HD Lコレステロールを測定する方 法がある （例えば、 特開平 8— 1 3 1 1 9 7号公報、 特許第 2 6 0 0 0 6 5号公報、 特開平 8— 2 0 1 3 9 3号公報、 特許第 2 79 9 8 3 5号 公報） 。 そして、 界面活性剤を使用し、 HDLコレステロールと酵素と が特異的に反応する時間を作り出し、 この時間帯において、 HDLコレ ステロールを測定する方法がある （特開平 1 1一 5 6 3 95号公報） 。 しかしながら、 これらは、 液系の測定方法であり、 乾燥系 （ドライ系） の測定方法である試験片にそのまま適用することはできない。
試験片を用いた測定方法として、 前記の凝集反応を利用した測定方法 がある （特開平 2 - 2 1 02 6 5号公報、 特開平 3 - 9 92 6 8号公報 等） 。 しかしながら、 この方法では、 ろ過分離機構等が必要となって試 験片の構造が複雑となり、 また、 多量の検体量を必要とするという問題 がある。 発明の開示
本発明は、このような事情に鑑みなされたもので、構造が簡単であり、 少量の検体量で HD Lコレステロールを簡単に測定できる試験片の提供 をその目的とする。
前記目的を達成するために、 本発明の HD Lコレステロール測定用試 験片は、 コレステロール測定用酵素試薬と、 高密度リポタンパク質 （H D L) 以外のリポタンパク質に比べて HD Lに対する可溶化性能が高い 第 1の界面活性剤と、 HDL以外のリポタンパク質の溶解を阻害する第 2の界面活性剤とを有する試験片である。
このように、 本発明の試験片は、 前記 2種類の界面活性剤を有するこ とにより、 コレステロール測定用酵素試薬で簡単に HD Lコレステロ一 ルを特異的に測定することが可能である。 „また、 この試験片では、 凝集 反応等の特殊な反応を利用しないから、 特別な構造をとる必要も無く、 簡単な構造が可能であり、 検体量も少量でよい。
本発明の試験片は、 例えば、 支持体の上に試薬層が形成され、 この試 薬層が、 前記酵素試薬、 前記第 1の界面活性剤および前記第 2の界面活 性剤を有するという構成をとることができる。この場合、前記試薬層は、 試料供給層と検出層とを有し、 前記試料供給層が前記第 1の界面活性剤 および第 2の界面活性剤を有し、 前記検出層が前記酵素試薬を有すると いう構成であってもよい。 さらに、 前記試料供給層内部において、 その 上部 （上層） に前記第 2の界面活性剤を有し、 その下部 （下層） に前記 第 1の界面活性剤を有する構成であることが好ましい。 また、 前記試料 供給層が前記酵素試薬の一部、 前記第 1の界面活性剤および前記第 2の 界面活性剤を有し、 前記検出層が、 前記酵素試薬の残部を有することも 好ましい。
前記第 1の界面活性剤は、 ポリオキシエチレンアルキレンフエニルェ テルが好ましく、 これらは単独で使用してもよいし、 併用してもよい。 このなかで、 より好ましいのは、 ポリオキシエチレンアルキレントリべ ンジルフエニルエーテルである。
前記第 2の界面活性剤は、 ポリオキシエチレンアルキルエーテル、 ポ リォキシエチレンアルキルフエニルエーテル、 ポリオキシエチレンーポ リォキシプロピレン縮合体、 ポリォキシエチレンアルキルエーテル硫酸 塩およびアルキルベンゼンスルホン酸塩が好ましく、 これらは単独で使 用してもよく、 2種類以上併用してもよい。 このなかでより好ましいの は、 ポリオキシエチレン—ポリオキシプロピレン縮合体である。
前記酵素試薬は、 コレステロールエステラーゼおよびコレステロール ォキシダーゼの組み合わせ、 またはコレステロールエステラーゼおよび コレステロールデヒドロゲナ一ゼの組み合わせが好ましい。 より好まし いのは、 前者の組み合わせである。 試料が添加され、 試薬と混合された 際のコレステロールエステラーゼの割合は、 例えば、 5〜 1 0 0 0 Uノ m Lの範囲、 好ましくは 1 0〜： L 0 0 U Zm Lの範囲、 より好ましくは 3 0〜 7 0 U Zm Lの範囲である。 酵素反応時における全成分中のコレ ステロールォキシダーゼの割合は、 例えば、 5〜 1 0 0 0 UZm Lの範 囲、 好ましくは 1 0〜： 1 0 0 U Zm Lの範囲、 より好ましくは 2 0〜5 0 U Zm Lの範囲である。 酵素反応時における全成分中のコレステロ一 ルデヒドロゲナーゼの割合は、 例えば、 5〜 1 0 0 0 U Zm Lの範囲、 好ましくは 1 0〜 1 0 0 U Zm Lの範囲、 より好ましくは 3 0〜7 0 U /m Lの範囲である。 なお、 使用する酵素としては市販のものが使用で きるが、 その中でも、 例えば、 本発明の反応原理を鑑みて、 一連の反応 を阻害する夾雑物 （例えば、 第一の界面活性剤あるいは第二の界面活性 剤の特性を損なうような物質） 等を含まない純正品や、 遺伝子組換え製 品等を好ましく使用することができる。 また、 本発明において、 酵素反 応時における全成分中の割合とは、 検体 （試料） を添加した場合の全成 分中の割合であり、 全成分とは、 前記試料、 前記酵素試薬、 前記第 1の 界面活性剤および前記第 2の界面活性剤等の酵素反応時に存在する成分 全てをいう。 通常、 一検体の量は、 その種類により予測可能若しくは決 定可能である。
酵素反応時における全成分中の前記第 1の界面活性剤の割合は、 1〜 1 0質量％の範囲が好ましく、 より好ましくは、 3〜7質量％の範囲で ある。 また、 酵素反応時における全成分中の前記第 2の界面活性剤の割 合は、 1〜2 0質量％の範囲が好ましく、より好ましくは 7〜 1 3質量％ の範囲である。 なお、 これらの割合は、 液系の場合にくらべ、 かなり高 濃度である。 前記第 1の界面活性剤 （A) と前記第 2の界面活性剤 （B) との質量比 （AZB) は、 1 1 0〜 1 1の範囲が好ましく、 より好 ましくは 1 Z3〜2Z3の範囲である。 また、 本発明の試験片は、 酵素 反応時における p Hが p H 6〜 9の範囲になるように調整されているこ とが好ましレ 。前記 p Hのより好ましい範囲は p H 7〜 8の範囲であり、 最適には PH 7. 7である。
本発明の試験片の測定対象となる検体は、 特に制限されず、 例えば、 全血、 血漿、 血清等の HD Lコレステロールを含有する可能性のある検 体 （特に生物学的液体） である。 図面の簡単な説明
図 1 (A) は、 本発明の試験片の一例の構成を示す断面図であり、 図 1 (B) は、 本発明の試験片のその他の例の構成を示す断面図であり、 図 1 (C) は、 本発明の試験片のさらにその他の例の構成を示す断面図 である。
図 2は、 本発明の試験片のさらにその他の例における反射率のタイム コースを示すグラフである。
図 3は、 本発明の試験片のさらにその他の例による HDLコレステロ ールの測定値と、凝集法による測定値との相関関係を示すグラフである。 図 4は、 本発明の試験片のさらにその他の例による HD Lコレステロ —ルの測定値と、直接法による測定値との相関関係を示すグラフである。 発明を実施するための最良の形態
つぎに、 本発明の試験片について、 例を挙げながら説明する。
まず、 本発明に使用するコレステロール測定用酵素試薬は、 例えば、 前述の 2つの組み合わせのものが挙げられ、 コレステロールエステラー ゼとコレステロールォキシダーゼの組み合わせが好ましい。 すなわち、
HDLコレステロールは、 通常、 生体内では、 遊離型状態と、 脂肪酸と エステル結合している状態の二種類に分類されるため、 後者をコレステ ロールエステラーゼにより、コレステロールと脂肪酸とに加水分解する。 そして、 生じたコレステロールを、 コレステロールォキシダーゼで処理 すれば、 コレステノンと過酸化水素を生じる。 そして、 この過酸化水素 を測定すれば、 HD Lコレステロール量を求めることができる。 過酸化 水素の測定は、 電気化学的測定もしくは化学的測定があるが、 パーォキ シダ一ゼ （POD) 及び、 酸化されると発色する基質 （以下 「酸化発色 性基質」 という） を用いた化学的測定が好ましい。 この場合、 前記酸化 発色性基質の発色を光学的手段で測定すればよい。 したがって、 この場 合は、 PODと酸化発色性基質も前記酵素試薬に含まれることになる。 酵素反応時における全成分中の P ODの割合は、 例えば、 50〜 5 0 0 O UZmLの範囲、 好ましくは 1 0 0〜 1 5 00 UZmLの範囲、 より 好ましくは 7 0 0〜 80 0 UZmLの範囲である。 酵素反応時における 全成分中の前記酸化発色性基質の割合は、 その種類等により適宜決定さ れるが、 例えば、 1 0〜： I 0 0 0 mm o 1 の範囲、 好ましくは 2 0 〜 20 0 mm o 1 ZLの範囲、 より好ましくは 3 0〜 7 0 mm o 1 /L の範囲である。
前記酸化発色性基質としては、 例えば、 AL P S [N-E t h y 1 - N— ( 3— s u 1 f o p r o p y l ) a n i 1 i n e , s o d i um s a 1 t ] 、 D AO S [N-E t h y l -N- (2— h y d r o x y— 3 — s u 1 f o p r o p y 1 ) ― 3 , 5— d i me t h o x y a n i 1 i n e , s o d i um s a l t ] 、 MAOS [N-E t h y l -N- (2 — h y d r o x y— 3— s u l f o p r o p y l ) — 3, 5— d i me t h y l a n i 1 i n e , s o d i um s a l t , mo n o h y d r a t e] 、 TOO S [N— E t h y l — N— (2— h y d r o x y— 3 — s u 1 f o p r o p y 1 ) — 3— me t h y l a n i 1 i n e , s o d i urn s a l t , d i h y d r a t e] , フエノール等があり、 こ のなかから、 測定機器が用いる波長に合う発色を呈する基質を適宜選択 することができる。
前記第 1の界面活性剤は、 HDL以外のリポタンパク質 （LDLや V LDL等） に比べ HD Lに対する可溶化性能が高いものであれば、 特に 制限されない。 この第 1の界面活性剤は、 HD Lに内包されるコレステ ロール若しくはコレステロールエステルを可溶化する働きを有し、 その 結果として、 コレステロール若しくはそのエステルと前記酵素試薬の反 応を促進することになる。 この第 1の界面活性剤は、 市販品を使用して もよい。 ポリォキシエチレンアルキレンフエ二ルェ一テルの市販品とし ては、 例えば、 商品名 「ェマルゲン A— 6 0」 （花王社製） 等があり、 ポリォキシエチレンアルキレントリベンジルフエ二ルェ一テルの市販品 としては、 商品名 「ェマルゲン B 6 6」 （花王社製） 等がある。
前記第 2の界面活性剤は、 HDL以外のリポタンパク質 （LDLや V LDL等） の溶解を阻害するものであれば、 特に制限されない。 なお、 この第 2の界面活性剤が溶解を阻害することにより、 コレステロール若 しくはそのエステルと前記酵素試薬との反応を阻害することになる。 こ の第 2の界面活性剤としては、前述のものが好ましく使用でき、例えば、 ポリォキシエチレンアルキルエーテルとしては、 ポリォキシエチレンセ チルエーテル （例えば、 商品名 「ェマルゲン 2 2 0」 花王社製） が、 ポ リォキシエチレンアルキルフエニルエーテルとしては、 ポリォキシェチ レンノニルフエ二ルェ一テル （例えば、 商品名 「ェマルゲン 9 1 3」 花 王社製） が、 ポリオキシエチレン—ポリオキシプロピレン縮合体として は、 商品名 「プル口ニック F_ 8 8」 （旭電化社製） が、 ポリオキシェ チレンアルキルエーテル硫酸塩としては、 ポリォキシエチレンラウリル エーテル硫酸ナトリゥム （例えば、 商品名 「エマール 2 0 C」 花王社製） が、 アルキルベンゼンスルホン酸塩としては、 ドデシルベンゼンスルホ ン酸ナトリウムが、 それぞれ好ましく使用できる。 これらは単独で、 若 しくは 2種類以上で併用できる。
このように、 第 1の界面活性剤および第 2の界面活性剤を併用するこ とにより、 H D Lコレステロールと前記酵素試薬とが特異的に反応する 時間帯が発生し、 この時間帯に測定すれば、 H D Lコレステロールを特 異的に測定することができる。 前記時間帯は、 反応開始後（検体添加後） から、 例えば、 1分経過後〜 2 0分経過後の間であり、 好ましくは 3分 経過後〜 1 5分経過後の間であり、 より好ましくは 5分経過後〜 1 0分 経過後の間である。 なお、 本発明の試験片は、 前記酵素試薬、 第 1の界 面活性剤および第 2の界面活性剤に加え、 必要に応じ、 酸化防止剤、 還 元防止剤、 干渉物質除去試薬等のその他の添加剤を有していてもよい。 このような添加剤の配合割合は、 前記酵素試薬、 第 1の界面活性剤およ び第 2の界面活性剤の機能を損なわないような範囲である。
つぎに、 本発明の試験片の構造の一例を図 1の断面図に示す。
図 1 ( A ) の試験片は、 支持体 1の上に試薬層 2が形成されていると いう構成である。 この試薬層 2に、 前記酵素試薬、 前記第 1の界面活性 剤および前記第 2の界面活性剤が含まれる。 前記支持体 1は、 例えば、 ポリエチレンテレフタレート （P E T )、 ポリスチレン、 ポリエステル、 酢酸セルロース等の樹脂を用いて製造でき、 このなかでも P E Tが好ま しい。 支持体 1の厚みは、 特に制限されないが、 例えば、 0 . l〜 l m mの範囲、 好ましくは 0 . 1〜 0 . 5 mmの範囲、 より好ましくは 0 . 2〜 0 . 3 mmの範囲である。 また、 試薬層 2は、 例えば、 前記酵素試 薬、 前記第 1の界面活性剤、 前記第 2の界面活性剤および親水性ポリマ 一を溶媒に溶解して混合し、 これを塗布し、 その後乾燥させれば作製で きる。 前記親水性ポリマーとしては、 例えば、 ポリビニルピロリ ドン、 ヒドロキシプロピルセルロース、 メチルセルロース、 アルギン酸ナトリ ゥム、 ポリアクリル酸、 ゼラチン、 酸加水分解ゼラチン、 ポリアクリル アミ ド、 ァガロース等があげられる。 また、前記溶媒としては、例えば、 リン酸緩衝液、 グッドの緩衝液、 トリス塩酸緩衝液があげられ、 このな かでも、グッドの緩衝液が好ましい。グッドの緩衝液としては、例えば、 P I P E S, TE S、 HE P E S、 D I P S O、 TAP S O、 ME Sが 好ましく、 より好ましくは TE Sである。 酵素反応時における pHが前 記所定の範囲になるように、 前記緩衝液の pHは、 pH 6〜9の範囲に 調整することが好ましく、 より好ましくは pH 7〜8の範囲に調整する ことであり、 最適には pH 7. 7に調整することである。 前記親水性ポ リマーの配合割合は、 塗布溶液全体に対し、 例えば、 0〜4 0質量％の 範囲であり、 好ましくは 1 0〜3 0質量％の範囲であり、 その種類によ り適宜調整できる。 前記酵素試薬、 前記第 1の界面活性剤および前記第 2の界面活性剤などの試薬類は、 前述の割合になるように予め調整して 前記溶媒に配合する。 塗布の方法も特に制限されず、 例えば、 刷毛等を 用いる方法、 スプレーコート法、 ロールコ一夕一を用いる方法、 デイツ ビング法等がある。 試薬層 2の厚みは、 例えば、 5 0〜 2 5 0 ;amの範 囲であり、 好ましくは 8 0〜2 0 0 mの範囲であり、 より好ましくは 1 0 0〜 1 5 0 の範囲である。 試薬層 2は、 前記成分の他に、 必要 に応じ、 酸化防止剤等の前述の添加剤を含んでいてもよい。 また、 この 試験片の形状は特に制限されないが、通常は板状もしくは短冊状である。 短冊状の場合の大きさは、 例えば、 全長 5 0〜 1 5 0 mmの範囲で幅 3 〜： 1 5 mmの範囲、 好ましくは、 全長 6 0〜： L 0 0 mmの範囲で幅 5〜 1 Ommの範囲である。 この試験片は、 例えば、 つぎのようにして使用する。 まず、 試薬層 2 の上から、 血液等の検体を滴下する。 滴下された検体は、 試薬層 2中の 試薬と反応するが、 第 1の界面活性剤および第 2の界面活性剤の作用に より、 H D Lコレステロールが特異的に前記酵素試薬と反応する時間帯 が生じる。 そして、 反応開始後 （滴下後） 、 前述の時間帯の間に測定す る。 試薬層 2に P O Dと前記酸化発色性基質が含まれている場合は、 分 光光度計や反射率計等の光学的測定機器により、 前記基質の発色を測定 する。 試料が血漿や血清の場合、 支持体 1が光透過性の場合は、 支持体 1側又は試薬層 2側から光照射して透過光や反射光を測定することがで き、 支持体 1が光非透過性の場合は、 試薬層 2側から光照射して反射率 等を測定することが好ましい。 なお、 後述のように、 全血を試料とする 場合には、 赤血球の着色による測光妨害のため、 検出層と試料供給層と の間に公知の血球遮蔽層および光反射層を設け、光透過性支持体を用い、 この支持体側から測定することが好ましい。
つぎに、 図 1 ( B ) の試験片では、 支持体 1の上に、 検出層 2 bが形 成され、 この上に試料供給層 2 aが形成され、 これら両層で試薬層 2が 構成されている。 前記試料供給層 2 aには、 第 1の界面活性剤および第 2の界面活性剤が含有されており、 前記検出層 2 bには、 前記酵素試薬 が含有されている。 この試薬層 2は、 例えば、 つぎのようにして形成で きる。 まず、 前記酵素試薬および親水性ポリマーを溶媒に溶解して調製 した溶液を、 支持体 1の上に塗布して乾燥し、 検出層 2 bを形成する。 他方、 第 1の界面活性剤、 第 2の界面活性剤を溶解した溶液を多孔性部 材に含浸させ乾燥させる。 そして、 この多孔性部材を前記検出層 2の上 に重ね両者をラミネートすると、 前記多孔性部材が試料供給層 2 aとな り、 試薬層 2が形成される。 この場合の前記親水性ポリマー、 前記溶媒 の種類や濃度などは、 前述と同様である。 このように、 試料供給層 2 a は、 多孔性であることが好ましい。 前記多孔性部材としては、 例えば、 編物が使用できる。 編物としては、 例えば、 ポリエチレン製編物、 ポリ エステル製編物、 ポリテトラフルォロエチレン製編物、 ポリスルホン製 編物、 ポリプロピレン製編物、 ポリビニリデンジフロライ ド製編物、 セ ルロース混合エステル製編物、 ガラスファイバー製編物等がある。 前記 試料供給層 2 aの厚みは、 例えば、 50〜40 0 ^mの範囲、 好ましく は 2 0 0〜 3 0 0 mの範囲、 より好ましくは 2 2 0〜27 0 / mの範 囲である。検出層 2 bの厚みは、例えば、 5〜 1 0 0 zzmの範囲であり、 好ましくは 5〜 50 mの範囲であり、 より好ましくは 5〜2 0 ΠΙの 範囲である。 この試験片の使用方法も前述の例と同じである。 なお、 こ の試験片では、 検体が、 第 1の界面活性剤および第 2の界面活性剤に接 触した後、 前記酵素試薬に接触するので、 HDLコレステロールをより 特異的に測定することが可能となる。 また、 前述のように、 前記試料供 給層が前記酵素試薬の一部および前記 2種類の界面活性剤を有し、 前記 検出層が、 前記酵素試薬の残部を有することも好ましい。 例えば、 コレ ステロールエステラーゼ、 コレステロールォキシダーゼ、 前記第 1の界 面活性剤および前記第 2の界面活性剤を試料供給層に含有させ、 P〇D、 酸化発色性基質等の酵素試薬の残りを検出層に含有させることができる 図 1 (B) に示される試験片の例において、 試料供給層 2 aは、 その 内部の上層に第 2の界面活性剤を含有し、 その内部の下層に第 1の界面 活性剤を含有していてもよい。 この例を図 1 (C) に示す。 同図におい て、 2 1が試料供給層 2 a上層であり、 2 2が試料供給層 2 a下層であ り、 その他、 図 1 (B) と同一部分に同一符号を付している。 このよう にすれば、 検体は、 まず第 2の界面活性剤に接触し、 ついで第 1の界面 活性剤に接触し、 そして前記酵素試薬と接触する。 このようにすれば、 さらに HD Lコレステロールを特異的に測定することが可能となる。 こ のような試料供給層 2 aは、 例えば、 前述のようにして検出層 2 bを形 成した後、 この上に、 第 1の界面活性剤と親水性ポリマーを溶剤に溶解 した溶液を塗布して乾燥し、 この上に、 第 2の界面活性剤と親水性ポリ マーを溶剤に溶解した溶液を塗布して乾燥すれば形成できる。 この場合 の、 親水性ポリマー、 溶媒の種類や濃度等は、 前述と同様であり、 塗布 の方法も前述と同様である。 このとき、 溶液を重層する方法の他に、 多 孔性部材に第 1の界面活性剤を含浸させて下層を形成し、 その片面に第 2の界面活性剤を塗布することで上層を形成し、 前記下層が検出層 2 b に接するようにラミネートして、 図 1 ( C ) に示す試験片を形成するこ ともできる。
さらに、 本発明の試験片は、 必要に応じ、 前記試薬層の上に、 血球分 離層を形成してもよい。これは、血球をろ過できるような多孔性部材と、 場合により公知の反射層を配置すればよい。 前記多孔性部材としては、 例えば、 ガラスフィルターなどの公知の血球分離素材が使用できる。 こ のように血球分離層を備えていれば、 全血をそのまま供給するだけで、 血清若しくは血漿中の H D Lコレステロールを測定できる。
(実施例）
つぎに、 実施例について比較例と併せて説明する。 なお、 以下におい て、 「K Z S」 値とは、 下記式で計算される変数であり、 反射率 （R ) を濃度に換算する際に使用される。
K / S = ( 1 - R ) V 2 R
R ：反射率 (実施例 1)
白色 P ETフィルム （厚み 1 2 5 m) の上に、 下記組成の検出層形 成用の溶液を厚み 1 50 πιで塗布した後、 40でで 1 0分間乾燥する ことで検出層を形成した。 一方、 ポリエチレン製編物 （厚み 2 5 0 / m) に下記組成の含浸液を含浸し、 4 Ot:で 1 0分間乾燥した。 このポリェ チレン製編物の片面に下記塗工含浸液を塗布し、 40 で 1 0分間乾燥 して、 試料供給層を形成した。 そして、 前記検出層表面に蒸留水を噴霧 し、 この上に、 前記試料供給層を、 前記塗工含浸液塗布面が上になるよ うにしてラミネートし、 40°Cで 1 0分間乾燥して、 目的とする試験片 を作製した。 なお、 この試験片は、 図 1 (C) に示す構成である。 下記 組成は、 5 Lの試料を供給した際の最終濃度 （酵素反応時の濃度） で ある。 また、 この試験片における酵素反応時の pHは 7. 7である。
(含浸液の組成）
TE Sバッファー （同仁化学社製、 pH 7. 7 ) 30 mm o 1 /L コレステロールエステラーゼ 3 9 U/mL コレステロールォキシダーゼ 2 3 U/mL ホ。リオキシエチレンアルキレントリへ'ンシ'ルフエニルエ-テル 5質量％
(花王社製、 商品名 ： ェマルゲン B 6 6)
(塗工含浸液の組成）
ホ。リオキシエチレン-ホ。リオキシフ° Dピレン縮合体 1 0質量％
(旭電化社製、 商品名 ： プル口ニック F— 8 8) (検出層形成用溶液の組成）
POD (東洋紡社製） 6 9 3 U/mL
4ーァミノアンチピリン （キシダ化学社製） 43 mm o \ /L
DAOS (同仁化学社製） 5 1 mm o 1 / L
TE Sハ'ツファ- (同仁化学社製、 PH 7. 7) 3 0 0 mm o 1 /L
(比較例 1および比較例 2)
ポリォキシエチレンアルキレントリベンジルフエ二ルェ一テル （第 1 の界面活性剤） およびポリォキシエチレン一ポリォキシプロピレン縮合 体 （第 2の界面活性剤） のいずれも使用しない以外は、 実施例 1と同様 にして試験片を作製した （比較例 1 ) 。 また、 前記第 1の界面活性剤の みを使用 （前記第 2の界面活性剤は不使用） した以外は、 実施例 1と同 様にして試験片を作製した （比較例 2) 。 このようにして得られた、 実施例 1、 比較例 1および比較例 2の試験 片について、 血清を検体として、 試験片の反射率 （タイムコース） を、 専用反射率計 （商品名スポットケム、 アークレイ株式会社製） を用いて 測定した。 測定波長は、 6 1 0 nmである。 この結果を、 図 2のグラフ に示す。 このグラフにおいて、 横軸が測定時間 （秒） であり、 縦軸が前 記 KZS値である。 図 2のグラフから明らかなように、 第 1の界面活性剤と第 2の界面活 性剤とを併用している実施例 1の試験片では、 早い時間で反応が終点に 達し、 HD Lコレステロールのみが測定できていることが分かる。 これ に対し、前記 2つの界面活性剤を使用していない比較例 1の試験片では、 反応が低く実質的に HD Lコレステロールの測定ができなかった。また、 第 1の界面活性剤のみを使用した比較例 2の試験片では、 HD Lコレス テロールのみを特異的に測定できなかった。
(実施例 2)
第 1の界面活性剤および第 2の界面活性剤の最終濃度を、 下記表 1の 割合に調整した以外は、実施例 1と同様にして 3種類の試験片（A、 B、 C) を作製した。 これらの試験片を用い、 HD Lコレステロール濃度が 既知の血清試料 6 0検体について、 実施例 1と同様にして反射率を測定 し、 これから前記 「KZS」 値を用いて HD Lコレステロール量を求め た。 そして、 この実測値濃度と前記既知濃度との相関関係を調べた。 こ の結果も同表に示す。
(表 1 )
第 1の界面活性剤—第 2の界面活性剤 相関係数（ r) 試験片 A ： 1質量％ 0. 8 7 試験片 B 2質量％ 2質量％ 0. 94 試験片 C 4質量％ 4質量％ 0. 9 7 前記表 1に示すように、 3つの試験片八、 Bおよび Cにおいて、 高い 相関係数が得られた。
(実施例 3)
実施例 1と同じ試験片を作製した。 この試験片を用い、 6 0検体の血 清試料中の HDLコレステロールを実施例 2と同様にして測定した。 ま た、 併せて、 前記試料中の HD Lコレステロールを下記の凝集法および 直接法により測定した。 そして、 前記試験片による測定値と、 前記凝集 法および前記直接法による測定値との相関関係を調べた。 前記試験片の 測定値と前記凝集法の測定値との相関関係を図 3のグラフに示し、 前記 試験片の測定値と前記直接法の測定値との相関関係を図 4のグラフに示 す。
(凝集法）
市販の血清 H D Lコレステロール測定キット （商品名 H D L - C 5 5 5、 栄研化学株式会社製） を用い、 その使用方法に従い測定を行った。 試薬と検体を混和した後に、 3 0 0 0 r 111で 1 0分間の遠心分離を行 つた。
(直接法）
市販の血清 H D Lコレステロール測定キット （商品名コレステスト H D L、 第一化学薬品株式会社製） を用い、 その使用方法に従い測定を行 つた。 図 3のグラフに示すように、 前記試験片の測定値と前記凝集法の測定 値とは、 良好な相関関係を示し、 その相関係数は r = 0 . 9 6 2であつ た。 同様に、 図 4のグラフに示すように、 前記試験片の測定値と前記直 接法の測定値とは、 良好な相関関係を示し、 その相関係数は r = 0 . 9 7 4であった。 産業上の利用の可能性
以上のように、 本発明の試験片は、 構造が簡単であり、 少量の検体量 で H D Lコレステロールを簡単に測定できる。 したがって、 本発明の試 験片を用いれば、 数多くの検体を短時間で処理することが可能であり、 特に、 臨床検査において検査の効率化に寄与できる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . コレステロール測定用酵素試薬と、 高密度リポタンパク質 （H D L ) 以外のリボタンパク質に比べて H D Lに対する可溶化性能が高い第 1の 界面活性剤と、 H D L以外のリポタンパク質の溶解を阻害する第 2の界 面活性剤とを有する H D Lコレステロール測定用試験片。
2 . 支持体の上に試薬層が形成され、 この試薬層が、 前記酵素試薬、 前 記第 1の界面活性剤および前記第 2の界面活性剤を有する請求の範囲第 1項に記載の試験片。
3 . 試薬層が、 試料供給層と検出層とを有し、 前記試料供給層が前記第 1の界面活性剤および第 2の界面活性剤を有し、 前記検出層が前記酵素 試薬を有する請求の範囲第 2項に記載の試験片。
4 . 前記試料供給層の上部に前記第 2の界面活性剤を有し、 前記試料供 給層の下部に前記第 1の界面活性剤を有する請求の範囲第 3項に記載の 試験片。
5 . 前記試料供給層が、 前記酵素試薬の一部、 前記第 1の界面活性剤お よび前記第 2の界面活性剤を有し、 前記検出層が、 前記酵素試薬の残部 を有する請求の範囲第 3項に記載の試験片。
6 . 前記第 1の界面活性剤が、 ポリオキシエチレンアルキレンフエニル エーテルおよびポリォキシエチレンアルキレントリベンジルフエニルェ 一テルの少なくとも一方の界面活性剤である請求の範囲第 1項に記載の 試験片'
7. 前記第 2の界面活性剤が、 ポリオキシエチレンアルキルエーテル、 ポリォキシエチレンアルキルフエニルエーテル、 ポリォキシエチレン一 ポリオキシプロピレン縮合体、 ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫 酸塩およびアルキルベンゼンスルホン酸塩からなる群から選択される少 なくとも一つの界面活性剤である請求の範囲第 1項に記載の試験片。
8. 前記酵素試薬が、 コレステロールエステラーゼおよびコレステロ一 ルォキシダーゼを含む請求の範囲第 1項に記載の試験片。
9. 前記酵素試薬が、 コレステロールエステラーゼおよびコレステロ一 ルデヒドロゲナーゼを含む請求の範囲第 1項に記載の試験片。
1 0. 酵素反応時における全成分中の前記第 1の界面活性剤の割合が、 1〜 1 0質量％の範囲である請求の範囲第 1項に記載の試験片。
1 1. 酵素反応時における全成分中の前記第 2の界面活性剤の割合が、 1〜 2 0質量％の範囲である請求の範囲第 1項に記載の試験片。
1 2. 前記第 1の界面活性剤 （A) と前記第 2の界面活性剤 （B) との 質量比 （A/B) が、 1 / 1 0〜 1 1の範囲である請求の範囲第 1項 に記載の試験片。
1 3. 酵素反応時における p Hが p H 6〜 9の範囲になるように調整さ れている請求の範囲第 1項に記載の試験片。
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