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WO2002027001A2 - Pflanzen mit maskierter fruchtbarkeit - Google Patents

Pflanzen mit maskierter fruchtbarkeit Download PDF

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WO2002027001A2
WO2002027001A2 PCT/DE2001/003746 DE0103746W WO0227001A2 WO 2002027001 A2 WO2002027001 A2 WO 2002027001A2 DE 0103746 W DE0103746 W DE 0103746W WO 0227001 A2 WO0227001 A2 WO 0227001A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
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nucleic acid
acid sequence
promoter
seq
sequence according
Prior art date
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PCT/DE2001/003746
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English (en)
French (fr)
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WO2002027001A3 (de
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Sabine Steiner-Lange
Anna Sorensen
Teresa Mozo
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Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften
Original Assignee
Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften
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Publication date
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Priority to DE10194113T priority patent/DE10194113D2/de
Publication of WO2002027001A2 publication Critical patent/WO2002027001A2/de
Publication of WO2002027001A3 publication Critical patent/WO2002027001A3/de
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C12N15/8255—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving lignin biosynthesis

Definitions

  • the present invention relates to transgenic plants with masked fertility, the masked fertility by an altered expression of the nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 2 or its homolog, or by a change in the biological activity of the nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 2 or its homolog encoded gene product.
  • the present invention further relates to the regulatory nucleic acid sequence which naturally controls the expression of the MYB26 gene in Arabidopsis thaliana.
  • the present invention further relates to ner processes for producing the transgenic plants according to the invention.
  • MYB-type proteins form a superfamily of structurally similar transcription factors. MYB proteins are found in both plant and animal organisms and influence a variety of different metabolic pathways. The common structural motif of this protein family is the MYB domain, which can bind to a specific D ⁇ A sequence. The classic MYB domain consists of two or three very similar sequence repeats (repeats: Rl, R2, R3) of 50-53 AS length. Most plant-based MYB proteins have only two sequence i? Epe ⁇ t.s R2, R3). Arabidopsis has already detected 97 different R2R3-type proteins. This group forms the largest regulatory gene family known to date in plants.
  • MYB genes that have so far been characterized functionally are known to regulate, inter alia, the phenylpropanoid metabolism, to influence cell shape and differentiation, to be involved in the hormone response or to be activated in the course of plant defense reactions.
  • Summary information on the MYB family can be found in, among others, Romero et al .: More than 80 R2R3-MYB regulatory genes in the genome of Arabidopsis thaliana. Plant J. 14, 273-284 (1998), Kranz et al: Towards functional characterization of the members of the R2R3-MYB gene family from Arabidopsis thaliana. Plant J. 16, 263-276 (1998) and Martin and Paz-Ares: MYB transcription factors in plants.
  • the MYB26 gene belongs to the MYB family described above.
  • a cDNA clone from Arabidopsis thaliana (Genbank Accession No. 175997) is available from this MYB26 gene, but it has not hitherto been known in which specific metabolic pathways this gene intervenes or in which tissues it is expressed.
  • a genomic clone (MDC16) is under Genbank Accession number AB019229 registered.
  • male sterile plants can be produced by different methods. In the simplest case, the male flower organs are isolated from the rest of the plant by bags or simply cut off. However, these procedures are very time, personnel and cost intensive. In addition, a large number of useful plants contain male and female organs within the same flower, which makes these processes even more difficult.
  • Male sterile plants can also be created with the help of pollen-killing or pollen-blocking chemicals (gametoids).
  • gametoids pollen-killing or pollen-blocking chemicals
  • the advantage of these chemical processes is that only temporary sterility occurs, which only persists for the duration of the treatment. However, most of these gametocides have additional phytotoxic properties. Furthermore, the treatment for plants with a long flowering phase must be repeated several times.
  • US Pat. No. 5,955,653 uses a beta-1,3-glucanase which is specifically expressed in wallpaper unicells to induce sterility.
  • US 5,962,769 achieves the same goal by increasing the endogenous avidin concentrations.
  • WO 9008830 describes the expression of protein inhibitor genes or of so-called killer genes in the male inflorescences which are intended to cause the anthers and associated tissues to die off.
  • WO 90/08831 seeks a similar effect through the expression of disruptor genes which prevent mitochondrial cell respiration.
  • WO 89/10396 very generally proposes to transform the plant genome with exogenous so-called “male sterility DNAs” (for example coding for noses, doses, proteases, lipases etc.), which, when expressed in cells of the stamens, metabolism, function or interfere with the development of this cell.
  • EP 0329308 describes antisense DNAs for influencing the Pollen production used.
  • the hybrids are often characterized by uniformity, increased growth, higher yield or increased resistance to pathogens. This effect, known as heterosis, is of great commercial interest for agricultural businesses or plant breeders and requires targeted crossings.
  • Male sterile plants facilitate these crossbreeding techniques because they are easier to obtain hybrid offspring.
  • male sterile and male fertile plants are planted side by side in one field.
  • the male sterile plants can only be fertilized by pollen from the male fertile plants and accordingly only produce hybrid seeds. It is particularly advantageous if the sterility is not permanent, as in most known sterile mutants, but is reversible, so that e.g. controlled self-fertilization attempts will be possible as part of later selection and characterization processes.
  • the object of the present invention is therefore to provide novel male sterile plants and processes for their production.
  • Figure 1 shows the promoter region of the Arabidopsis thaliana MYB26 gene. The start ATG is highlighted in bold.
  • Figure 2 shows the genomic nucleic acid sequence of the Arabidopsis thaliana MYB26 gene. The start ATG and stop codon are highlighted in bold. Underlined regions represent introns. The numbering continues the numbering from FIG. 1.
  • Figure 3 shows the amino acid sequence of MYB26 derived from the open reading frame of Figure 1.
  • Figure 4 shows a Southern analysis of individuals on line 7AAB12.
  • DNA from 14 F2 progeny from 7AAB12 [five plants that do not carry a mutant allele for andl (1-5), four heterozygous plants for andl (6-9) and five sterile plants (10-14)] were digested with EcoRI separated on a 0.8% agarose gel and transferred to a nylon membrane.
  • the left photo shows the hybridization with the left end of the transposon.
  • Each individual shows 6-10 bands, of which only one with a size of 3.8 kb occurs exclusively in plants with at least one mutated allele from andl, whereas they are absent in the plants which carry the wild type allele of this locus homozygously.
  • the corresponding gang is marked with an arrow.
  • the right photo shows the hybridization of the same membrane with a MYB26-specific probe (without MYB domain).
  • the 3.8 kb band which occurs in conjunction with the mutation in andl, also hybridizes with AtMYB26.
  • Plants that carry the andl wild type allele homozygously (1-5) show a band of 6.3 kb, which corresponds to the wild type focus of AtMYB26. Both bands occur in andl-heterozygous plants (6-9) with approximately the same intensity.
  • a weak signal at the level of the wild-type band in sterile plants can be explained by the transposon jumping out in some cells of the plant (somatic sectors).
  • FIG. 5 shows the original sequence of the N-terminus of the MYB26 protein compared to the corresponding sequence of a stable mutant.
  • the first line shows the N-terminus of the MYB26 protein.
  • the original en insertion site is marked.
  • the N-terminus of the MYB26 protein is shown after the transposon did not jump out.
  • Three amino acids were deleted.
  • FIG. 6 shows a microscopic view of a cross section through anther tissue in MYB26 mutants (left) and wild type (right). While radial cell wall thickenings (arrow) can be seen in the wild type, these are absent in the MYB26 mutant.
  • FIG. 7 shows a male sterile plant of the Arabidopsis thaliana species with a gene defect in the MYB26 gene in comparison with the wild type plant.
  • masked fertility used here denotes a non-release of the pollen from the pollen sacs as a result of a morphological and cellular change in the pollen sac tissue, as a result of which the plants concerned are male-sterile.
  • homologs or “homologous sequences” used here denote nucleic acid or amino acid sequences with significant similarity to the comparison sequence or parts thereof. Homologous sequences are thus nucleic acid sequences which hybridize with the comparison sequences or parts of these sequences under stringent or less stringent conditions (for stringent and less stringent conditions see Sambrook et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1989), ISBN 0-87969- 309-6).
  • stringent hybridization conditions is: Hybridization in 4 x SSC at 65 ° C (alternatively in 50% formamide and 4 X SSC at 42 ° C), followed by several washing steps in 0.1 x SSC at 65 ° C for a total of about one Hour.
  • the homologous sequences are further to be considered nucleic acid or amino acid sequences or parts thereof which, with the aid of the BLAST similarity algorithm (Basic Local Alignment Search Tool, Altschul et al, Journal of Molecular Biology 215, 403-410 (1990)) have a significant similarity to comparison sequences Sequences are described as significantly similar, as used here, which, for example using standard parameters in the BLAST service of the NCBI, have a significance level (E-Value or Probability) of P ⁇ 10 "5 if they are compared with the comparison sequences.
  • BLAST similarity algorithm Basic Local Alignment Search Tool, Altschul et al, Journal of Molecular Biology 215, 403-410 (1990)
  • derivatives used here denotes nucleic acid sequences which, compared to the comparison sequence, have modifications in the form of one or more deletions, substitutions, additions, insertions and / or inversions. Introns are also derivatives containing genomic equivalents of EST or cDNA sequences. Derivative also means that a nucleic acid sequence is composed of one or more nucleic acid fragments of a gene and one or more nucleic acid fragments of one or more other genes. The individual domains can be both unmodified and modified.
  • fragments denotes parts of amino acid sequences or their genetic information in the form of nucleic acids, provided that they have at least one functionally important region (domain, sequence or structure motif) of the comparison sequence, such as, for example, catalytic centers or motifs interacting with proteins, furthermore Elements of DNA binding such as a MYB DNA binding domain repeat signature 1 (Prosite Accession number PS00037) MYB_1 with the consensus sequence W- [ST] -x (2) -E- [DE] -x (2) - [LIV ] or a MYB DNA-binding domain repeat signature 2 (Prosite Accession number PS00334) MYB_2 with the consensus sequence Wx (2) - [LI] - [SAG] -x (4,5) -Rx (8) - [YW] - x (3) - [LIVM]
  • the corresponding database entries come from the PROSITE database (Hofmann et al .: The PROSITE database, its Status in 1999. Nucleic Acids Res.
  • a regulatory sequence such as a promoter controls the expression of a gene or another functional nucleic acid or that a nucleic acid sequence is expressed starting from the promoter.
  • nucleic acid or “functional nucleic acid sequence” as used herein means a nucleic acid sequence that does not encode a naturally occurring gene product, e.g. a ribozyme, an antisense DNA or RNA or a sequence composed of different exons.
  • vector used here denotes naturally occurring or artificially created constructs for the uptake, multiplication, expression or transfer of nucleic acids, for example plasmids, phagemids, cosmids, artificial chromosomes, bacteriophages, viruses, retroviruses.
  • transgenic plant used here relates to plants which were produced by means of recombinant genetic engineering and / or microbiological processes and not by means of conventional breeding processes.
  • expression system means any combination of vectors, restriction enzymes, transformation methods, cell extracts, living cells e.g. prokaryotic or eukaryotic cells or organisms for the purpose of endogenous or exogenous expression of genes.
  • One aspect of the present invention relates to transgenic plants with masked fertility, the masked fertility by an altered expression of the nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 2 or its homolog compared to wild type plants, or by changing the biological activity of the by the nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 2 or whose homologously encoded gene product is produced.
  • the present invention further relates to methods for producing the transgenic plants according to the invention.
  • Another aspect of the present invention relates to the use of the Nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 2 or its homolog, derivative or fragment for the production of plants with an altered lignin content, the altered lignin content being caused by an expression changed compared to wild type plants, or by changing the biological activity of the nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 2 or its homolog, derivative or fragment encoded gene product.
  • changed expression here means that the expression can be increased, reduced or completely switched off. Accordingly, in the sense of the invention, a changed lignin content means that the lignin content is increased or decreased.
  • Enhanced expression can e.g. by combining the nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 2 or its homolog with a strong promoter.
  • suitable promoters which can lead to an increased constitutive expression of the MYB26 gene or its homolog are the CaMV 35S promoter from the cauliflower mosaic virus and the ubiquitin promoter from maize.
  • either the endogenous promoter which controls the expression of the nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 2 or its homolog can be replaced by the strong promoter, or an additional copy of the nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 2 or its homologue can be inserted into the genome can be integrated, the additional copy being functionally linked to the strong promoter.
  • Increased expression can also be achieved by integrating more than one additional copy of the nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 2 or its homolog, in particular two, three, four, five or more copies, into the genome. These copies can be integrated individually or contiguously. Furthermore, the copies are functionally linked to a promoter, which can be a strong promoter, an endogenous or an exogenous promoter that controls the expression of the nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 2 or its homolog, or a tissue-specific or inducible promoter.
  • a promoter which can be a strong promoter, an endogenous or an exogenous promoter that controls the expression of the nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 2 or its homolog, or a tissue-specific or inducible promoter.
  • Constructs comprising a corresponding promoter and a nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 2, or its homolog, which is functionally linked thereto, can be used by conventional methods for the transformation of plant cells and subsequently for the regeneration of complete plants.
  • the introduction of nucleic acid sequences into plant organisms and cells is state of the art and used, for example of T-DNA vectors, easy to do.
  • a multiple of the proteins encoded by these nucleic acid sequences is correspondingly formed.
  • Enhanced gene expression of the nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 2 or its homolog can also be achieved by changing or adding functional components of the promoter which naturally regulates the expression of the MYB26 gene.
  • corresponding functional components are TATA box, CAAT box, GC box, enhancer or binding sites for other transcription factors.
  • Suitable methods for changing the nucleic acid sequence of the promoter which naturally regulates the expression of the MYB26 gene are known to the person skilled in the art.
  • Known mutagenesis techniques are, for example, the generation of deletion mutants or the introduction of point mutations by "site directed mutagenesis".
  • Preferred methods for mutagenesis or for changing the expression are furthermore chimeric RNA / DNA oligonucleotides, homologous recombination or RNA interference (RNAi).
  • Transgenic plants that produce an increased amount of MYB26 transcripts or their homologues compared to the wild type due to increased gene expression or additional MYB26 gene copies have a severely disturbed MYB26 gene balance. Due to the change in tissue metabolism in the pollen sac, the function of the anthers is no longer ensured, so that masked fertility occurs.
  • a reduced expression of the nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 2 or its homolog can be achieved by changing or removing essential functional components of the promoter which naturally regulates the expression of the MYB26 gene.
  • corresponding components are TATA-Box, CAAT-Box, GC-Box, enhancers or binding sites for other transcription factors. Suitable processes for this are known to the person skilled in the art.
  • Known mutagenesis techniques are, for example, the generation of deletion mutants or the introduction of point mutations by "site directed mutagenesis”.
  • Preferred methods are also chimeric RNA / DNA oligonucleotides, homologous recombination or RNA interference (RNAi).
  • Transgenic plants with a reduced MYB26 gene expression only produce small amounts of the transcription factor necessary for the formation of secondary cell wall thickenings in the anthers. By reducing the corresponding lignifications, the anthers can no longer open, resulting in masked fertility.
  • a complete deactivation of the gene expression of the nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 2 or its homolog can be achieved by introducing new start or stop codons or by shifting the reading frame. As a result of the changed nucleic acid sequence, functionally inactive proteins are synthesized.
  • Preferred methods for a targeted gene knockout of the MYB26 gene are the introduction of point mutations by "site directed mutagenesis”.
  • Preferred methods for mutagenesis or for changing the expression are furthermore chimeric RNA / DNA oligonucleotides, homologous recombination or RNA interference (RNAi).
  • Transgenic plants with MYB26 gene knockout have anthers without lignifications of the endothelial cell wall, as are characteristic of the wild type. After the pollen ripens, the anther walls do not recede, which results in masked fertility.
  • antisense copies of the MYB26 nucleic acid sequence and their fragments, homologs or derivatives can also be stably integrated into the genome. Due to the reverse orientation of the antisense nucleic acid sequence relative to the promoter, antisense RNAs are formed during transcription, which form duplex molecules with the naturally formed MYB26 mRNAs and thus prevent translation.
  • the corresponding technology is established and e.g. in Izant and Weintraub: Inhibition of thymidine kinase gene expression -by antisense RNA: a molecular approach to genetic analysis. Cell 36, 1007-1015 (1984).
  • the antisense gene or its fragment, homolog or derivative can e.g. are placed under the control of an inducible promoter, whereby the production of antisense RNA can be regulated.
  • a change in the biological activity of the gene product encoded by the nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 2 or its homolog can be achieved by introducing modifications in gene segments which code for functional protein domains such as, for example, receptor binding sites, phosphorylation domains or DNA binding sites. Modifications in the MYB-DNA binding domain in particular have a considerable influence on the properties of the protein. In this way, proteins can be formed that are, for example, inactive are, have a changed substrate specificity or a changed Km value or are no longer subject to the regulatory mechanisms normally present in the cell via allosteric regulation or covalent modification. Correspondingly modified MYB26 proteins are no longer able to perform the physiological functions of the MYB26 wild type protein.
  • Suitable methods for changing the sequence of the MYB26 gene are known to the person skilled in the art.
  • Known mutagenesis techniques are, for example, the generation of deletion mutants or the introduction of point mutations by "site directed mutagenesis”.
  • Preferred methods for mutagenesis or for changing the expression are furthermore chimeric RNA / DNA oligonucleotides, homologous recombination or RNA interference (RNAi).
  • RNAi RNA interference
  • the MYB26 genes introduced into the genome can be the nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 2 or its fragment or homolog or derivative, for example any MYB26 sequence from other plants.
  • the nucleic acids used can be of natural origin or have been produced artificially.
  • the nucleic acid sequences can be in either sense or antisense orientation.
  • the regulatory DNA sequence functionally linked to the nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 2 or its fragment or homolog or derivative, for example a promoter can be the regulatory DNA sequence according to SEQ ID NO: 1 endogenously present with the nucleic acid sequence as well as any other regulatory DNA sequence.
  • the regulatory DNA sequence can be either an endogenous promoter of the organism to be transformed or an exogenous promoter which is located, for example, on the vector used.
  • any regulatory sequence that can control the expression of foreign genes in organisms, for example plants is suitable as a promoter, for example the CaMV 35S promoter from the cauliflower mosaic virus; see. Franck et al., Cell 21, 285-294 (1980) or the ubiquitin promoter from corn.
  • the expression of the nucleic acid sequences can also be achieved by a chemically inducible promoter.
  • chemically inducible promoters are the PRPI promoter (Ward et al., Plant Molecular Biology 22, 361-366 (1993)), a promoter induced by salicylic acid (WO 95/19443), a promoter inducible by benzenesulfonamide (EP-A 388186), a promoter inducible by tetracycline (Gatz et al., Plant Journal 2, 397-404 (1992)), a promoter inducible by abscisic acid (EP-A 335528) or by Ethanol or cyclohexanone inducible promoter (WO 93/21334).
  • Promoters can also be used which are active, for example, in certain plant tissues or parts of plants.
  • Examples of corresponding promoters are the phaseolin promoter (US 5504200), the isoflavone reductase promoter (US 5750399), a seed-specific promoter, for example from tobacco (US 5824863) or the ST-LSI promoter from potato (Stockhaus et al., (1989) EMBO J ' 8, 2445-2452).
  • the regulatory DNA sequence functionally linked to the nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 2 or its fragment or homolog or derivative for producing a transgenic plant with an altered lignin content can, for. B. be a promoter, the tissue-specific z. B. in the phloem or vascular tissue of plants leads to a strong expression of the nucleic acid sequences functionally linked to it.
  • promoters are, for example, the glutamine synthase promoter (Edwards et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3459-3463), the maize sucrose synthetase 1 promoter (Yang et al. ( Ward 93) Proc. Natl. Acad.
  • the nucleic acid sequences used can be endogenous or exogenous nucleic acid sequences or their fragments or derivatives or homologues.
  • Endogenous means that the nucleic acid sequence comes from the same organism into which it is integrated with the method according to the invention, e.g. a MYB26 gene from Arabidopsis thaliana is integrated into Arabidopsis thaliana using the method according to the invention.
  • Exogenous means that the nucleic acid sequence comes from another organism, e.g. a MYB26 gene from Arabidopsis thaliana is described in e.g. Wheat integrated.
  • nucleic acid sequences compared to the naturally occurring nucleic acid sequences deletions, substitutions, additions, Lisertions and / or inversions.
  • the present invention further relates to a transformed cell, in particular a transformed plant cell or a transformed plant tissue, in which a regulatory Nucleic acid sequence, for example the nucleic acid sequence according to the invention according to SEQ ID NO: 1, and the nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 2, or their fragments or homologs or derivatives, are stably integrated.
  • the present invention also relates to a plant cell or a transformed plant cell or a transformed plant tissue transformed with the regulatory nucleic acid sequence, for example the nucleic acid sequence according to the invention according to SEQ ID NO: 1, and the nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 2, or its fragments or homologues or derivatives can be regenerated into a seed-producing plant.
  • the present invention relates to a plant which can be obtained by the process according to the invention.
  • the present invention further relates to seed obtained from plants obtained by the process according to the invention.
  • the invention further relates to the fruits, seeds, leaves, shoots and storage organs produced by the plants, for example fruits, berries, grapes, cereals and potatoes.
  • a nucleic acid sequence is used which is composed of nucleic acid fragments from different MYB26 genes.
  • This composite nucleic acid sequence can also contain modifications such as deletions, additions or substitutions.
  • the methods for producing such nucleic acid sequences are state of the art and can be easily carried out by a person skilled in the art.
  • the present invention can be applied to any plant organism.
  • the present invention provides male sterile mono- and dicotyledonous plants.
  • Particularly preferred plants are cultivated plants such as soybean, cotton, flax, hemp, sunflower, potato, tobacco, tomato, zucchini, eggplant, cucumber, summer rape, winter rape, alfalfa, lettuce, chicory, asparagus, salsify, pea, bean, lentils, carrot , Onion, leek, olive, radish, radish, beetroot, turnip, kohlrabi, sugar beet, beet, sugar cane, spinach, chard, the different tree, nut and wine species, the different types of cabbage such as Brussels sprouts, cauliflower, broccoli, white cabbage, red cabbage , Savoy cabbage, Chinese cabbage, also cereals such as barley, wheat, rye, oats, corn, rice, forage grasses, furthermore types of fruit such as mango, apple, pear, peach, plum, raspberry, blackberry, gooseberry, strawberry
  • the plants transformed with the nucleic acid sequence can be unmodified wild-type plants or plants obtained by breeding or modified plants, for example transgenic plants.
  • the invention can also be used in plant tissues and in plant cells, for example in a cell culture or in expression systems, to change the expression pattern of MYB26 genes or fragments or derivatives or homologues of these genes.
  • the method according to the invention is suitable for temporary sterilization by exchanging the MYB26-specific promoter for an inducible promoter. Through targeted induction of fertility e.g. be reacted to special environmental conditions.
  • the present invention further relates to vectors comprising a nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 2, or its fragment or derivative or homolog and a regulatory DNA sequence.
  • Suitable vectors for the uptake and transfer of the nucleic acid sequences can be the multiplication and / or the expression of the uptake nucleic acids in single cells such as e.g. Ensure Escherichia coli or Agrobacterium tumefaciens or in plant cells, plant tissues or plants. Corresponding vectors can of course occur or can be produced artificially.
  • the vectors can include selection markers, terminator sequences, polylinkers, promoter elements, enhancers, polyadenylation sites and other genetic elements.
  • Vectors suitable for cloning are e.g.
  • Plasmids of the pBluescript series, plasmids of the pUC series, plasmids of the pGEM series or vectors based on the bacteriophage ⁇ are e.g. pBinl9; see. Bevan et al., (1984), Nucleic Acids Research 12, 8711-8721.
  • vectors which can be used on the Ti plasmid of Agrobacterium species or constructs based on plant viruses are usable and are known to the person skilled in the art.
  • Transformation methods for the transfer of foreign genes (transformation) into the genome of plants are presented below.
  • the choice of the method for introducing the nucleic acid sequence according to the invention and the nucleic acid sequences which are functionally linked thereto and which code for a gene product into plant cells is not restricted to this list. Transformation methods used to date in plants are, for example, gene transfer using Agrobacterium tumefaciens (e.g.
  • Another aspect of the present invention relates to the regulatory nucleic acid sequence (hereinafter also referred to as promoter), which naturally controls the expression of the MYB26 gene in Arabidopsis thaliana.
  • This nucleic acid sequence according to the invention is listed in SEQ ID NO: 1.
  • the invention further relates to fragments or homologs or derivatives of the nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 1, which have the biological function of a promoter, preferably a promoter active in the male flower organs.
  • the invention further relates to nucleic acid sequences which hybridize with the nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 1 and which have the biological form of a promoter, preferably a promoter active in the male flower organs.
  • Preferred are nucleic acid sequences which hybridize under stringent conditions with the nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 1 and which have the biological form of a promoter, preferably a promoter active in the male flower organs.
  • the regulatory nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 1 or its fragment or homolog or derivative is suitable, for example, for identifying and isolating genes homologous to the MYB26 gene in other organisms and / or regulatory sequences related to SEQ ID NO: 1 in, for example, Arabidopsis thaliana or other organisms using special hybridization or screening methods, for example as a probe for screening in DNA libraries with the help of hybridization to single-stranded nucleic acids Base sequence.
  • the regulatory nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 1 or its fragment or homolog or derivative is also suitable for the specific control of the expression of genes or other functional nucleic acids in organisms or cells, due to their tissue specificity preferably for the specific control of genes in the male flower organs.
  • tissue specificity preferably for the specific control of genes in the male flower organs.
  • the genes or other functional nucleic acids functionally linked to the regulatory nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 1 or its fragment or homolog or derivative can be endogenous, exogenous genomic DNA segments or cDNAs or their fragments or derivatives or synthetic or semisynthetic nucleic acids.
  • Endogenous means that the nucleic acid sequence comes from the same organism into which it is integrated with the method according to the invention, e.g. a nucleic acid sequence from Arabidopsis thaliana is integrated into Arabidopsis thaliana using the method according to the invention.
  • Exogenous means that the nucleic acid sequence comes from another organism, e.g.
  • nucleic acid sequence from Arabidopsis thaliana is obtained with the method according to the invention in e.g. Wheat integrated.
  • the functionally linked genes or other functional nucleic acid sequences can have deletions, substitutions, additions, iterations and / or inversions compared to the naturally occurring nucleic acid sequences.
  • nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 1 or its fragment or homolog or derivative can be used for regulating the expression of the MYB26 gene which is naturally associated with it, so that plants with increased, reduced or completely absent MYB26 expression are present, which affects the MYB26 metabolic pathway and consequently leads to a structural change in the pollen sac tissue and the associated masked fertility.
  • the regulatory nucleic acid sequence according to the invention is also suitable for the Regulation of expression of other gene sequences.
  • the promoter can be present in combination with any genes, both in a vector and in transgenic organisms.
  • the promoter can be used for the regulation of the expression of genes in the flower organs, particularly for the regulation of the expression of genes in the anthers, especially in the pollen sac tissue.
  • genes from all plant metabolic pathways can be regulated by the promoter, for example genes coding for components of fat metabolism (e.g. acyl-CoA synthase, acetyl-CoA carboxylase etc.), carbohydrate metabolism (e.g.
  • phosphofructokinase fructose-1, 6-bisphosphatase
  • Glucose-6-phosphate dehydrogenase etc. amino acid metabolism (e.g. aminotransferases, deaminases etc.), hormone metabolism (e.g. genes for the synthesis of auxins, gibberellins, abscisic acid etc.), photosynthesis (e.g. Rieske protein, psaE etc.) , Cell architecture (e.g. tubulin, actin etc.), respiration (e.g. cytochrome C, cytochrome C oxidase etc.), defense against pathogens (flavonoids, terpenes etc.) etc. etc.
  • amino acid metabolism e.g. aminotransferases, deaminases etc.
  • hormone metabolism e.g. genes for the synthesis of auxins, gibberellins, abscisic acid etc.
  • photosynthesis e.g. Rieske protein, ps
  • Particularly suitable genes to be regulated influence e.g. structure, size or metabolism of the pollen sac, so that transgenic plants with modified male flower organs, eg larger, more stable or shape-changing pollen sacs, can arise.
  • Corresponding genes can be involved in the construction of pollen sac structures, for example, in the synthesis or incorporation of lignin or cellulose for secondary cell wall thickening.
  • An example of a corresponding anther-specific gene is the CHSLK gene (Genbank Accession Number Y14506), presumably involved in lignin synthesis, coding for a putative chalcone synthase.
  • Genes for the enzymes that modify or degrade the cell wall structures can also be mentioned here, for example A6, a gene for an anther-specific ⁇ -1,3-glucanase (Genbank Accession number X62716). Further examples of anther-specific genes with partially still unknown functions are sf2 (Genbank accession number X62716), RA8 (Genbank accession number AF042275) ATA20 (Genbank accession number AF037362) and MZm3-3 (Genbank accession number AJ224355). Also particularly suitable for regulation with the aid of the promoter are genes which, when specifically expressed in the male flower organs, also produce male sterility in plants, for example as a result of the death of the affected cells. A wide variety of proteins can be expressed for this purpose, which significantly disrupt the normal metabolism of the cell. Kataboh enzymes such as nucleases, proteases, lipases or glucanases are particularly suitable for this.
  • the regulatory nucleic acid sequences according to the invention according to SEQ ID NO: 1 or their fragments or homologs or derivatives can be of natural origin or have been produced artificially.
  • the functionally linked genes or the other functional nucleic acid sequences can be in either sense or antisense orientation.
  • the regulatory nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 1 or its fragments or homologs or derivatives can be used in vectors, expression systems or plants, plant tissues or plant cells or animal cells or microorganisms to change the expression patterns of a wide variety of gene products.
  • the expression of the gene products can be both increased and reduced compared to their natural expression.
  • the present invention accordingly also relates to vectors comprising a regulatory nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 1 or its fragment or derivative or homolog.
  • Suitable vectors for the uptake and transfer of the nucleic acid sequences can ensure the multiplication and / or the expression of the uptake nucleic acids in single cells such as, for example, Escherichia coli or Agrobacterium tumefaciens or in plant cells, plant tissues or plants.
  • Corresponding vectors can of course occur or can be produced artificially.
  • the vectors can include selection markers, terminator sequences, polylinkers, promoter elements, enhancers, polyadenylation sites and other genetic elements.
  • Vectors suitable for cloning are, for example, plasmids of the pBluescript series, plasmids of the pUC series, plasmids of the pGEM series or vectors based on the bacteriophage ⁇ .
  • a plasmid vector used for use in Agrobacterium is, for example, pBin19; see. Bevan et al., (1984), Nucleic Acids Research 12, 8711-8721.
  • vectors which can be used on the Ti plasmid of Agrobacterium species or constructs based on plant viruses are usable and are known to the person skilled in the art.
  • transformation methods such as microinjection, protoplast transformation and microprojectile bombardment also use the abovementioned cloning vectors or linearized DNA instead of Ti plasmids.
  • a summary description of vectors used to date can be found in Guerineau and MuUineaux, Plant Transformation and Expression Vectors, in: Plant Molecular Biology Labfax, published by Croy, Oxford, BIOS Scientific Publishers, 121-148 (1993).
  • Some of the transformation methods used in commercial transformation and expression systems for the transfer of foreign genes (transformation) into the genome of plants are presented below.
  • the choice of the method for introducing the nucleic acid sequence according to the invention and the nucleic acid sequences which are functionally linked thereto and which code for a gene product into plant cells is not restricted to this list.
  • Transformation methods used to date in plants are, for example, gene transfer using Agrobacterium tumefaciens (e.g. by bathing seeds, inflorescences or leaf fragments in an agrobacterial solution), using plant viruses, by electroporation, by injecting (microprojectile bombardment) or by injecting (microinjection) and incubating dry ones Embryos in DNA-containing liquids and the transformation of protoplasts with the help of polyethylene glycol. More detailed descriptions of the methods mentioned can be found, for example, in Jens et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, edited by Kung and Wu, Academic Press 128-143 (1993).
  • the invention also relates to transgenic plants with a regulatory nucleic acid sequence according to SEQ ED NO: 1 which is stably integrated into the genome, or its fragment or derivative or homolog with the biological function of a promoter, preferably a promoter active in the male flower organs, and one with this nucleic acid sequence functionally linked for a gene product or another functional nucleic acid sequence corresponding to the examples of such coding or other functional nucleic acid sequences listed and described above.
  • a promoter preferably a promoter active in the male flower organs
  • the present invention further relates to a method for producing a plant with modified gene expression, comprising the stable integration of a regulatory sequence according to SEQ ID NO: 1 or its fragment or homolog or derivative with the biological function of a promoter, preferably a promoter active in the male flower organs , and a nucleic acid sequence coding for a gene product or another functional nucleic acid sequence that is functionally linked to this sequence into the genome of plant cells or plant tissues and regeneration of the plant cells or plant tissues obtained to plants.
  • the method according to the invention can be applied to any plant organisms.
  • the method according to the invention can be used to change the gene expression of mono- and dicotyledonous plants.
  • Particularly preferred plants are cultivated plants such as soybean, cotton, flax, hemp, sunflower, potato, tobacco, tomato, zucchini, eggplant, cucumber, summer rape, winter rape, alfalfa, lettuce, chicory, asparagus, salsify, pea, bean, lentils, carrot , Onion, leek, olive, radish, radish, beetroot, turnip, kohlrabi, sugar beet, beet, sugar cane, spinach, chard, the different tree, nut and wine species, the different types of cabbage such as Brussels sprouts, cauliflower, broccoli, white cabbage, red cabbage , Savoy cabbage, Chinese cabbage, also cereals such as barley, wheat, rye, oats, corn, rice, forage grasses, furthermore types of fruit such as mango, apple, pear, peach, plum, raspberry, blackberry, gooseberry, strawberry, cherry, currant, guava, banana , Melon, pumpkin and citrus fruits eg lemon, orange, grapefruit or tangerine
  • the plants transformed with the nucleic acid sequence can be unmodified wild-type plants or plants obtained by breeding or modified plants, for example transgenic plants.
  • the method according to the invention can also be used in plant tissues and in plant cells, for example in a cell culture or in expression systems, to change the expression pattern of MYB26 genes or fragments or derivatives or homologues of these genes.
  • cloning steps carried out in the context of the present invention such as e.g. Restriction cleavage, agarose gel electrophoresis, purification of nucleic acid fragments, transfer of nucleic acids to filter materials, transformation and cultivation of bacterial cells, etc. were performed as in Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1989), ISBN 0-87969-309-6.
  • Example 2 Preparation of a knockout population of Arabidopsis thaliana The present invention was obtained by screening a knockout population mutagenized with the transposon En-1 / Spm (Pereira et al, EMBO Journal 5, 835-841 (1986)) from plants of the species Arabidopsis thaliana Ecotyp Columbia. The integration of the transposable elements in genes of the mother plant often leads to the failure of the corresponding gene function and in many cases to a wild-type appearance of the affected plant. To build up the knockout population, the autonomous En-1 element from Zea mays was transferred to Arabidopsis using Agrobacterium tumefaciens.
  • the corresponding transposon tagging system is described in Cardon et al., Plant Molecular Biology 23, 157-178 (1993).
  • the Ti plasmid used, pGV3850HPT :: pkEn2 contained the complete En-1 element as an integrate.
  • this vector carries the HPT gene under the control of the viral CaMV 35S promoter. Seeds of a transformant with a single T-DNA insert were sown on hygromycin-containing medium. Seeds of the resulting hygromycin-resistant plants (T 2 generation) were then sown on a medium containing kanamycin. In the plants selected in this way (T 3 generation), the Enl element was transposed out of the T-DNA.
  • T 4 generation Those plants of the T 4 generation which carried one or more transposed En-1 elements but no longer any En-1 elements in the T-DNA were identified by means of PCR. However, these plants still contained the T-DNAs without integrated En-1 elements.
  • T-DNA negative plants To generate En-1 positive, T-DNA negative plants, the T 4 generation was crossed with the wild-type Arabidopis thaliana ecotype Columbia and En-1 positive, T-DNA negative plants (S 0 generation) were identified by PCR.
  • the mutant phenotype is linked to the homozygous state of a particular integration of the transposons.
  • 18 sister plants of the en line 7AAB12 were analyzed. Six of these plants were sterile, indicating a recessive mutation. Phenotypic analysis of 18 offspring each of the fertile individuals showed that seven of the 18 parent plants also produced sterile offspring and were therefore heterozygous for andl, whereas five plants showed no sterile offspring and were therefore homozygous for the wild type allele.
  • flanking DNA from eight different en insertions was obtained by “transposon insertion display” (TID), cf. Yephremov and Saedler, The Plant Journal 21, 495-505, 2000, and cloned into the pGemTeasy vector (company Promega)
  • TID transposon insertion display
  • cf. Yephremov and Saedler The Plant Journal 21, 495-505, 2000
  • cloned into the pGemTeasy vector company Promega
  • the inserts of the resulting plasmids were sequenced. Sequence comparisons with sequence databases yielded 100% agreement with genomic Arabidopsis sequences in five cases.
  • the lengths of restriction fragments calculated from the sequence were compared with the fragments obtained in Southern blot analyzes.
  • a sequence shows agreement between calculated fragment lengths with the experimentally determined lengths for the band which occurs coupled with the andl mutation.
  • This sequence of the PI clone MDC16 bears in the region of the transposon integration site an open reading frame which has 100% identity to the cDNA of the putative transcription factor AfMYB26 the AtMYB26 cDNA (without MYB dom ane) showed that all sterile plants homozygously carry an En insertion in AtMYB26, whereas all plants which do not carry the mutation, and also have no insertion in AtMYB26.
  • the fifth oldest still closed bud of wild type and MYB26 mutant was fixed in 2% paraformaldehyde / 0.25% glutaraldehyde for 2 h and then embedded in paraffin. Semi-thin sections were stained with Calcofluor White as described in Dawson et al., 1999 (New Phytologist 144: 213-222).

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft transgene Pflanzen mit maskierter Fruchtbarkeit, wobei die maskierte Fruchtbarkeit durch eine veränderte Expression der Nukleinsäuresequenz gemäss SEQ ID NO:2 oder deren Homolog, oder durch die Veränderung der biologischen Aktivität des durch die Nukleinsäuresequenz gemäss SEQ ID NO: 2 oder deren Homolog kodierten Genprodukts hervorgerufen wird. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die regulatorische Nukleinsäuresequenz, die natürlicherweise in <i>Arabidopsis thaliana</i> die Expression des MYB26-Gens steuert. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemässen transgenen Pflanzen.

Description

Pflanzen mit maskierter Fruchtbarkeit
Die vorliegende Erfindung betrifft transgene Pflanzen mit maskierter Fruchtbarkeit, wobei die maskierte Fruchtbarkeit durch eine veränderte Expression der Nukleinsauresequenz gemäß SEQ ID NO:2 oder deren Homolog, oder durch die Veränderung der biologischen Aktivität des durch die Nukleinsauresequenz gemäß SEQ ID NO:2 oder deren Homolog kodierten Genprodukts hervorgerufen wird. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die regulatorische Nukleinsäuresequeriz, die natürlicherweise in Arabidopsis thaliana die Expression des MYB26- Gens steuert. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Nerfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen.
Proteine vom MYB-Typus bilden eine Superfamilie von strukturell ähnlichen Transkriptionsfaktoren. MYB-Proteine kommen sowohl in pflanzlichen als auch in tierischen Organismen vor und beeinflussen eine Vielzahl unterschiedlicher Stoffwechselwege. Das gemeinsame Strukturmotiv dieser Proteinfamilie ist die MYB-Domäne, die an eine spezifische DΝA-Sequenz binden kann. Die klassische MYB-Domäne besteht aus zwei oder drei untereinander sehr ähnlichen Sequenzwiederholungen (Repeats: Rl, R2, R3) von 50-53 AS Länge. Die meisten pflanzlichen MYB-Proteine besitzen nur zwei Sequenz-i?epeαt.s R2, R3). In Arabidopsis wurden bereits 97 verschiedene Proteine vom R2R3-Typ nachgewiesen. Damit bildet diese Gruppe die größte bislang in Pflanzen bekannte regulatorische Genfamilie. Von den wenigen bislang ftinktionell charakterisierten MYB-Genen ist bekannt, daß sie u.a. den Phenylpropanoid-Metabolismus regulieren, die Zellform- und Differenzierung beeinflussen, an der Hormonantwort beteiligt sind oder im Laufe von pflanzlichen Abwehrreaktionen eingeschaltet werden. Zusammenfassende Informationen zur MYB-Familie finden sich in u.a. in Romero et al.: More than 80 R2R3-MYB regulatory genes in the genome of Arabidopsis thaliana. Plant J. 14, 273-284 (1998), Kranz et al: Towards functional characterisation of the members of the R2R3-MYB gene family from Arabidopsis thaliana. Plant J. 16, 263-276 (1998) sowie Martin und Paz-Ares: MYB transcription factors in plants. Trends in Genetics 13, 67-73 (1997). Zur vorstehend beschriebenen MYB-Familie zählt das MYB26-Gen. Von diesem MYB26-Gen ist ein cDNA-Klon aus Arabidopsis thaliana (Genbank Accession Nummer 175997 verfügbar, jedoch war bislang nicht bekannt, in welche konkreten Stoffwechselwege dieses Gen eingreift bzw. in welchen Geweben es exprimiert wird. Ein genomischer Klon (MDC16) ist unter der Genbank Accession Nummer AB019229 registriert.
Populationen männlich steriler Pflanzen können durch unterschiedliche Verfahrensweisen produziert werden. Im einfachsten Fall werden die männlichen Blütenorgane durch Eintüten vom Rest der Pflanze isoliert oder kurzerhand abgeschnitten. Diese Prozeduren sind jedoch sehr zeit-, personal- und kostenintensiv. Zudem finden sich bei einer großen Zahl der Nutzpflanzen männliche und weibliche Organe innerhalb derselben Blüte, was diese Verfahren noch weiter erschwert.
Auch mit Hilfe von pollenabtötenden oder die Pollenbildung blockierenden Chemikalien (Gametoziden) lassen sich männlich sterile Pflanzen erzeugen. Der Vorteil dieser chemischen Verfahren ist, daß nur eine vorübergehende Sterilität eintritt, die lediglich für die Dauer der Behandlung bestehenbleibt. Allerdings zeigen die meisten dieser Gametozide zusätzliche phytotoxische Eigenschaften. Des weiteren muß die Behandlung bei Pflanzen mit einer langen Blühphase mehrfach wiederholt werden.
In jüngerer Zeit werden mehrere genetische Verfahren zur Hervorbringung männlich steriler Pflanzen diskutiert und angewendet. In der Patentschrift US 5,955,653 wird eine spezifisch in Tapetunizellen exprimierte beta-l,3-Glucanase zur Induzierung der Sterilität eingesetzt. US 5,962,769 erreicht dasselbe Ziel durch eine Erhöhung der endogenen Avidin-Konzentrationen. WO 9008830 beschreibt die Expression von Proteininhibitorgenen oder von sogenannten Killergenen in den männlichen Infloreszenzen, die das Absterben der Antheren und assoziierten Gewebe bewirken sollen. In WO 90/08831 wird ein ähnlicher Effekt durch die Expression von Disruptor-Genen angestrebt, die die mitochondriale Zellatmung verhindern. WO 89/10396 schlägt sehr allgemein vor, das pflanzliche Genom mit exogenen sogenannten „Male Sterility DNAs" (z.B. kodierend für Rnasen, Dnasen, Proteasen, Lipasen etc.) zu transformieren, die bei Expression in Zellen der Staubblätter den Metabolismus, die Funktion oder die Entwicklung dieser Zelle stören. In EP 0329308 werden Antisense-DNAs zur Beeinflussung der Pollenproduktion verwendet.
Die Grundversorgung der rasch anwachsenden Weltbevölkerung mit Nahrungsmitteln und pflanzlichen Rohstoffen stellt hohe Anforderungen an die moderne Agrarwirtschaft. Bemühungen zur Verbesserung des pflanzlichen Ertrages stoßen mittlerweile an die Grenzen der traditionellen Züchtung und sind zudem sehr zeit- und arbeitsintensiv. Einen Ausweg zeigt die moderne Gentechnik auf. Diese erlaubt eine gezielte Modifikation bestimmter Stoffwechselwege durch die Einfuhrung neuer Gensequenzen oder Manipulation von bereits im Organismus vorhandenen Genen. Da bei den gentechnologischen Verfahren die Veränderungen im Erbgut in der Regel genau bekannt sind, lassen sich diese Methoden zudem meist auf weitere Pflanzenarten übertragen. Für entsprechende übertragbare Techniken besteht demnach erhöhter Bedarf, insbesondere wenn dadurch klassische Züchtungsverfahren sinnvoll ergänzt werden können. So zeigt die Nachkommenschaft von Pflanzen, die mit Pollen genetisch divergenter Varietäten derselben Spezies fremdbestäubt wurde, im Vergleich zur Nachkommenschaft von selbstbestäubten Pflanzen oftmals verbesserte Eigenschaften. Die Hybride zeichnen sich häufig durch Uniformität, verstärktes Wachstum, höheren Ertrag oder eine vermehrte Widerstandskraft gegenüber Pathogenen aus. Dieser als Heterosis bekannte Effekt ist von hohem kommerziellen Interesse für landwirtschaftliche Betriebe bzw. Pflanzεnzüchter und verlangt gezielte Kreuzungen. Männlich sterile Pflanzen erleichtern diese Kreuzungstechniken, da von Ihnen leichter hybride Nachkommen zu erhalten sind. Bei entsprechenden Kreuzungen werden männlich sterile und männlich fertile Pflanzen nebeneinander in einem Feld angepflanzt. Die männlich sterilen Pflanzen können nur durch Pollen der männlich fertilen Pflanzen befruchtet werden und bringen dementsprechend ausschließlich hybride Samen hervor. Besonders vorteilhaft ist es, wenn die Sterilität nicht wie bei den meisten bekannten sterilen Mutanten permanent, sondern reversibel ist, wodurch z.B. kontrollierte Selbstbefruchtungsversuche im Rahmen späterer Selektions- und Charakterisierungsprozesse möglich werden.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, neuartige männlich sterile Pflanzen sowie Verfahren zu ihrer Herstellung bereitzustellen.
Die Aufgabe wird durch den in den Patentansprüchen definierten Gegenstand gelöst.
Die Erfindung wird durch die folgenden Figuren erläutert. Figur 1 zeigt die Promotorregion des MYB26-Gens von Arabidopsis thaliana. Das Start- ATG ist fett hervorgehoben.
Figur 2 zeigt die genomische Nukleinsauresequenz des MYB26-Gens von Arabidopsis thaliana. Start-ATG und Stop-Codon sind fett hervorgehoben. Unterstrichene Regionen stellen Introns dar. Die Numerierung setzt die Numerierung aus Figur 1 fort.
Figur 3 zeigt die aus dem offenen Leserahmen gemäß Figur 1 abgeleitete Aminosäuresequenz vonMYB26.
Figur 4 zeigt eine Southernanalyse von Individuen der Linie 7AAB12. DNA von 14 F2 Nachkommen von 7AAB12 [fünf Pflanzen, die kein mutantes Allel für andl tragen (1-5), vier heterozygote Pflanzen für andl (6-9) und fünf sterile Pflanzen (10-14)] wurde mit EcoRI gespalten, auf einem 0,8 %igen Agarosegel aufgetrennt und auf eine Nylonmembran übertragen. Das linke Foto zeigt die Hybridisierung mit dem linken Ende des Transposons. Jedes Individuum zeigt 6-10 Banden, von denen jedoch nur eine mit einer Größe von 3,8 kb ausschließlich in Pflanzen mit zumindest einem mutierten Allel von andl auftritt, wohingegen sie in den Pflanzen fehlt, die homozygot das Wildtypallel dieses Locus tragen. Die entsprechende Bande ist mit einem Pfeil gekennzeichnet. Das rechte Foto zeigt die Hybridisierung derselben Membran mit einer MYB26-spezifischen Sonde (ohne MYB-Domäne). Die 3,8 kb Bande, die gekoppelt mit der Mutation in andl auftritt, hybridisiert auch mit AtMYB26. Pflanzen, die homozygot das andl-Wildtypallel tragen (1-5) zeigen hingegen eine Bande von 6,3 kb, die dem Wildtyplocus von AtMYB26 entspricht. Beide Banden treten in andl-heterozygoten Pflanzen (6-9) mit etwa gleicher Intensität auf. Ein schwaches Signal auf Höhe der Wildtyp-Bande in sterilen Pflanzen kann durch das Herausspringen des Transposons in einigen Zellen der Pflanze (somatische Sektoren) erklärt werden.
Figur 5 zeigt die ursprüngliche Sequenz des N-Terminus des MYB26-Proteins im Vergleich zur entsprechenden Sequenz einer stabilen Mutante. In der ersten Zeile ist der N-Terminus des MYB26-Proteins dargestellt. Die ursprüngliche En-Insertionsstelle ist gekennzeichnet. In der zweiten Zeile ist der N-Terminus des MYB26-Proteins nach ungenauem Herausspringen des Transposons gezeigt. Drei Aminosäuren wurden deletiert. Figur 6 zeigt eine mikroskopische Ansicht eines Querschnittes durch Antheren-Gewebe in MYB26-Mutanten (links) und Wildtyp (rechts). Während im Wildtyp radiale Zellwand- verdickungen (Pfeil) zu sehen sind, fehlen diese in der MYB26-Mutante.
Figur 7 zeigt eine männlich sterile Pflanze der Art Arabidopsis thaliana mit Gendefekt im MYB26-Gen im Vergleich mit der Wildtyppflanze.
Der hier verwendete Ausdruck „maskierte Fruchtbarkeit" bezeichnet eine Nichtfreisetzung der Pollen aus den Pollensäcken infolge einer morphologischen und zellulären Veränderung des Pollensackgewebes, wodurch die betroffenen Pflanzen männlich steril sind.
Die hier verwendeten Ausdrücke „Homologe" oder „homologe Sequenzen" bezeichnen Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen mit signifikanter Ähnlichkeit zur Vergleichssequenz oder Teilen davon. Als homologe Sequenzen gelten somit Nukleinsäuresequenzen, die mit den Vergleichssequenzen oder Teilen dieser Sequenzen unter stringenten oder wenig stringenten Bedingungen hybridisieren (zu stringenten und wenig stringenten Bedingungen siehe Sambrook et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory (1989), ISBN 0-87969-309-6). Ein Beispiel für stringente Hybridisierungsbedingungen ist: Hybridisierung in 4 x SSC bei 65° C (alternativ in 50% Formamid und 4 X SSC bei 42° C), gefolgt von mehreren Waschschritten in 0,1 x SSC bei 65 °C für insgesamt etwa eine Stunde. Ein Beispiel für wenig stringente Hybridisierungsbedingungen ist Hybridisierung in 4 x SSC bei 37° C, gefolgt von mehreren Waschritten in 1 x SSC bei Raumtemperatur. Als homologe Sequenzen sollen des weiteren Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen oder Teile davon gelten, die unter Zuhilfenahme des Similaritätsalgorithmus BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, Altschul et al, Journal of Molecular Biology 215, 403-410 (1990) eine signifikante Ähnlichkeit mit Vergleichssequenzen aufweisen. Als signifikant ähnlich werden, wie hier verwendet, Sequenzen bezeichnet, die z.B. unter Verwendung von Standardparametern im BLAST-Service des NCBI ein Signifikanzniveau (E-Value oder Probability) von P < 10"5 aufweisen, wenn Sie mit den Vergleichssequenzen verglichen werden.
Der hier verwendete Ausdruck "Derivate" bezeichnet Nukleinsäuresequenzen, die gegenüber der Vergleichssequenz Modifikationen in Form von einer oder mehreren Deletionen, Substitutionen, Additionen, Insertionen und/oder Inversionen aufweisen. Als Derivate sind auch Introns beinhaltende genomische Äquivalente von EST- bzw. cDNA-Sequenzen anzusehen. Derivat bedeutet ferner, daß eine Nukleinsauresequenz zusammengesetzt ist aus einem oder mehreren Nukleinsäurefragmenten eines Gens und einem oder mehreren Nukleinsäurefragmenten eines oder mehrerer anderer Gene. Die einzelnen Domänen können dabei sowohl unmodifiziert als auch modifiziert sein.
Der hier verwendete Ausdruck „Fragmente" bezeichnet Teile von Aminosäuresequenzen oder deren Erbinformation in Form von Nukleinsäuren, sofern sie über zumindest einen funktionell wichtigen Bereich (Domäne, Sequenz- oder Slrukturmotiv) der Vergleichssequenz verfugen, wie z.B. katalytische Zentren oder mit Proteinen wechselwirkende Motive, femer Elemente der DNA-Bindung wie z.B. eine MYB DNA-binding domain repeat signature 1 (Prosite Accession Nummer PS00037) MYB_1 mit der Konsensussequenz W-[ST]-x(2)-E-[DE]-x(2)-[LIV] oder eine MYB DNA-binding domain repeat signature 2 (Prosite Accession Nummer PS00334) MYB_2 mit der Konsensussequenz W-x(2)-[LI]-[SAG]-x(4,5)-R-x(8)-[YW]-x(3)-[LIVM]. Die entsprechenden Datenbankeinträge stammen aus der PROSITE-Datenbank (Hofmann et al.: The PROSITE database, its Status in 1999. Nucleic Acids Res. 27:215-219 (1999)) und können online unter http://www.expasy.ch/prosite/ abgefragt werden.
Der hier verwendete Ausdruck "funktionell verbunden" bedeutet, daß eine regulatorische Sequenz wie ein Promotor die Expression eines Gens oder einer anderen funktionellen Nukleinsäure steuert oder das eine Nukleinsauresequenz von dem Promotor ausgehend exprimiert wird.
Der hier verwendete Ausdruck "funktionelle Nukleinsäure" oder "funktioneile Nukleinsauresequenz" bedeutet eine Nukleinsauresequenz, die nicht ein natürlicherweise vorkommendes Genprodukt kodiert, z.B. ein Ribozym, eine Antisense-DNA oder RNA oder eine aus verschiedenen Exons zusammengesetzte Sequenz.
Der hier verwendete Ausdruck "Vektor" bezeichnet natürlich vorkommende oder künstlich erschaffene Konstrukte zur Aufnahme, Vermehrung, Expression oder Übertragung von Nukleinsäuren, z.B. Plasmide, Phagemide, Cosmide, künstliche Chromosomen, Bakteriophagen, Viren, Retroviren. Der hier verwendete Ausdruck „transgene Pflanze" betrifft Pflanzen, die mittels rekombinanter Gentechnik und/oder mikrobiologischen Verfahren und nicht mittels herkömmlicher Züchtungsverfahren hergestellt wurden.
Der hier verwendete Ausdruck "Expressionssystem" bezeichnet jedwede Kombination von Vektoren, Restriktionsenzymen, Transformationsmethoden, Zellextrakten, lebenden Zellen z.B. prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen oder Organismen mit dem Zweck der endogenen oder exogenen Expression von Genen.
Es wurde anhand genetischer Veränderungen am Modellorganismus Arabidopsis thaliana überraschenderweise gefunden, daß die Manipulation einer für einen MYB26- Transkriptionsfaktor kodierenden endogenen Nukleinsauresequenz zu einer strukturellen Veränderung des pflanzlichen Pollensackgewebes führt. Aufgrund des Fehlens von funktionellen Zellwandverdickungen kann der Pollensack den Pollen nicht mehr freisetzen, wodurch die betroffenen Pflanzen in den männlichen Organen steril sind. Im engeren Sinne liegt keine echte Sterilität, sondern lediglich eine PseudoSterilität bzw. eine maskierte Fruchtbarkeit vor. Diese PseudoSterilität läßt sich jedoch durch manuelle Öffnung der Pollensäcke aufheben. Die erfindungsgemäßen männlichen sterilen Pflanzen mit manipuliertem MYB26-Gen weisen eine Strukturveränderung des Pollensackgewebes auf.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft transgene Pflanzen mit maskierter Fruchtbarkeit, wobei die maskierte Fruchtbarkeit durch eine gegenüber Wildtyppflanzen veränderte Expression der Nukleinsauresequenz gemäß SEQ ID NO:2 oder deren Homolog, oder durch die Veränderung der biologischen Aktivität des durch die Nukleinsauresequenz gemäß SEQ ID NO:2 oder deren Homolog kodierten Genprodukts hervorgerufen wird. Femer betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen.
Fluoreszenmokroskopische Untersuchungen von Gewebeschnitten des Modellorganismus Arabidopsis thaliana zeigten, daß die Manipulation einer für einen MYB26-Transkriptionsfaktor kodierendes endogenen Nukleinsauresequenz überraschenderweise zu einer Änderung der Lignifizierung in den Zellwänden des Pollensackgewebes führte.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung der Nukleinsauresequenz gemäß SEQ ID NO:2 oder deren Homolog, Derivat oder Fragments zur Herstellung von Pflanzen mit einem veränderten Ligningehalt, wobei der veränderte Ligningehalt durch eine gegenüber Wildtyppflanzen veränderte Expression, oder durch die Veränderung der biologischen Aktivität des durch die Nukleinsauresequenz gemäß SEQ ID NO:2 oder deren Homolog, Derivat oder Fragments kodierten Genprodukts hervorgerufen wird.
Im Sinne der Erfindung bedeutet veränderte Expression hierbei, daß die Expression verstärkt, verringert oder komplett ausgeschaltet sein kann. Demzufolge bedeutet im Sinne der Erfindung ein veränderter Ligningehalt, dass der Ligningehalt erhöht oder verringert ist.
Eine verstärkte Expression kann z.B. durch Kombination der Nukleinsauresequenz gemäß SEQ ID NO:2 oder deren Homolog mit einem starken Promotor erreicht werden. Beispiele für geeignete Promotoren, die zu einer verstärkten konstitutiven Expression des MYB26-Gens oder dessen Homolog führen können, sind der CaMV 35S-Promotor aus dem Blumenkohl-Mosaik- Virus sowie der Ubiquitin-Promotor aus Mais. Dazu kann entweder der endogene Promotor, der die Expression der Nukleinsauresequenz gemäß SEQ ID NO:2 oder deren Homolog steuert, durch den starken Promotor ersetzt werden, oder es kann eine zusätzliche Kopie der Nukleinsauresequenz gemäß SEQ ID NO:2 oder deren Homolog in das Genom integriert werden, wobei die zusätzliche Kopie mit dem starken Promotor funktionell verbunden ist.
Eine verstärkte Expression kami femer erreicht werden, indem mehr als eine zusätzliche Kopie der Nukleinsauresequenz gemäß SEQ ID NO:2 oder deren Homolog, insbesondere zwei, drei, vier, fünf oder mehr Kopien, in das Genom integriert werden. Diese Kopien können einzeln oder zusammenhängend integriert werden. Femer sind die Kopien mit einem Promotor funktionell verbunden, der ein starker Promotor, ein endogener oder ein exogener, die Expression der Nukleinsauresequenz gemäß SEQ ID NO:2 oder deren Homolog steuernder, Promotor, oder ein gewebespezifischer oder induzierbarer Promotor sein kann.
Konstrukte umfassend einen entsprechenden Promotor und eine mit diesem funktionell verbundenen Nukleinsauresequenz gemäß SEQ ID NO:2 oder deren Homolog können durch übliche Methoden zur Transformation von Pflanzenzellen und nachfolgend zur Regeneration von kompletten Pflanzen verwendet werden. Die Einbringung von Nukleinsäuresequenzen in pflanzliche Organismen und Zellen ist Stand der Technik und, beispielsweise unter Verwendung von T-DNA-Vektoren, leicht durchzuführen. Durch die verstärkte Expression der Nukleinsauresequenz gemäß SEQ ID NO:2 oder deren Homolog wird entsprechend ein Vielfaches an durch diese Nukleinsäuresequenzen codierten Proteinen gebildet.
Eine verstärkte Genexpression der Nukleinsauresequenz gemäß SEQ ID NO:2 oder deren Homolog kann ferner durch die Veränderung oder das Hinzufügen funktioneller Komponenten des natürlicherweise die Expression des MYB26-Gens regulierenden Promotors erreicht werden. Beispiele für entsprechende funktioneile Komponenten sind TATA-Box, CAAT-Box, GC-Box, Enhancer oder Bindestellen für weitere Transkriptionsfaktoren. Geeignete Verfahren zur Veränderung der Nukleinsauresequenz des natürhcherweise die Expression des MYB26-Gens regulierenden Promotors sind dem Fachmann bekannt. Bekannte Mutagenesetechniken sind beispielsweise die Erzeugung von Deletionsmutanten oder die Einführung von Punktmutationen durch "Site Directed Mutagenesis". Bevorzugte Verfahren zur Mutagenese bzw. zur Veränderung der Expression sind weiterhin chimäre RNA/DNA-Oligonukleotide, homologe Rekombination oder RNA-Interferenz (RNAi).
Transgene Pflanzen, die aufgrund einer verstärkten Genexpression oder durch zusätzliche MYB26-Genkopien eine gegenüber dem Wildtyp gesteigerte Menge an MYB26-Transkripten oder deren Homologen produzieren, besitzen eine schwer gestörte MYB26-Genbalance. Durch den derart veränderten Gewebsstoffwechsel im Pollensack ist die Funktion der Antheren nicht mehr sichergestellt, so daß es zu einer maskierten Fruchtbarkeit kommt.
Eine verringerte Expression der Nukleinsauresequenz gemäß SEQ ID NO:2 oder deren Homolog kann durch die Veränderung oder das Entfernen wesentlicher funktioneller Komponenten des natürlicherweise die Expression des MYB26-Gens regulierenden Promotors erreicht werden. Beispiele für entsprechende Komponenten sind TATA-Box, CAAT-Box, GC-Box, Enhancer oder Bindestellen für weitere Transkriptionsfaktoren. Geeignete Verfahren hierfür sind dem Fachmann bekannt. Bekannte Mutagenesetechniken sind beispielsweise die Erzeugung von Deletionsmutanten oder die Einführung von Punktmutationen durch "Site Directed Mutagenesis". Bevorzugte Verfahren sind weiterhin chimäre RNA/DNA-Oligonukleotide, homologe Rekombination oder RNA-Interferenz (RNAi). Transgene Pflanzen mit einer verringerten MYB26-Genexpression produzieren nur noch geringe Mengen des für die Bildung von sekundären Zellwandverdickungen in den Antheren notwendigen Transkripitonsfaktors. Durch die Reduktion entsprechender Lignifizierungen können sich die Antheren nicht mehr öffnen, so daß es zu einer maskierten Fruchtbarkeit kommt.
Eine vollständiges Ausschalten der Genexpression der Nukleinsauresequenz gemäß SEQ ID NO:2 oder deren Homolog kann durch Einfuhren von neuen Start- oder Stop-Codons oder durch Verschiebung des Leserasters erreicht werden. Infolge der veränderten Nukleinsauresequenz werden funktionell inaktive Proteine synthetisiert. Bevorzugte Verfahren für einen gezielten Gen-Knockout des MYB26-Gens sind die Einführung von Punktmutationen durch "Site Directed Mutagenesis". Bevorzugte Verfahren zur Mutagenese bzw. zur Veränderung der Expression sind weiterhin chimäre RNA/DNA-Oligonukleotide, homologe Rekombination oder RNA-Interferenz (RNAi). Transgene Pflanzen mit MYB26-Gen-Knockout besitzen Antheren ohne Lignifizierungen der endothelialen Zellwand, wie sie für den Wildtyp charakteristisch sind. Nach der Pollenreifung weichen die Antherenwände nicht zurück, so daß eine maskierte Fruchtbarkeit die Folge ist.
Soll die Expression des MYB26-Gens verringert oder komplett ausgeschaltet werden, können auch Antisense-Kopien der MYB26-Nukleinsäuresequenz sowie deren Fragmente, Homologe oder Derivate stabil in das Genom integriert werden. Aufgrund der reversen Orientierung der Antisense-Nul einsäuresequenz relativ zum Promotor werden bei der Transkription Antisense- RNA's gebildet, die mit den natürhcherweise gebildeten MYB26-mRNA's Duplexmoleküle formen und somit die Translation verhindern. Die entsprechende Technik ist etabliert und z.B. in Izant und Weintraub: Inhibition of thymidine kinase gene expression -by antisense RNA: a molecular approach to genetic Analysis. Cell 36, 1007-1015 (1984) nachzulesen. Dabei kann das Antisense-Gen oder dessen Fragment, Homolog oder Derivat z.B. unter die Kontrolle eines induzierbaren Promotors gestellt werden, wodurch die Produktion von Antisense-RNA reguliert werden kann.
Eine Veränderung der biologischen Aktivität des durch die Nukleinsauresequenz gemäß SEQ ID NO:2 oder deren Homolog kodierten Genprodukts ist durch die Einführung von Modifikationen in Genabschnitten, die für funktionelle Proteindomänen wie z.B. Rezeptorbindungsstellen, Phosphorylierungsdomänen oder DNA-Bindestellen kodieren, zu erreichen. Insbesondere Modifikationen in der MYB-DNA-Bindedomäne haben einen erheblichen Einfluß auf die Eigenschaften des Proteins. Auf diese Weise können Proteine gebildet werden, die z.B inaktiv sind, eine veränderte Substratspezifität oder einen veränderten Km- Wert besitzen oder nicht mehr den normalerweise in der Zelle vorliegenden Regulationsmechanismen über allosterische Regulation oder kovalente Modifizierung unterliegen. Entsprechend veränderte MYB26- Proteine sind nicht mehr in der Lage, die physiologischen Funktionen des MYB26- Wildtypproteins auszuüben. Geeignete Verfahren zur Veränderung der Sequenz des MYB26- Gens sind dem Fachmann bekannt. Bekannte Mutagenesetechniken sind beispielsweise die Erzeugung von Deletionsmutanten oder die Einführung von Punktmutationen durch "Site Directed Mutagenesis". Bevorzugte Verfahren zur Mutagenese bzw. zur Veränderung der Expression sind weiterhin chimäre RNA/DNA-Oligonukleotide, homologe Rekombination oder RNA-Interferenz (RNAi). Transgene Pflanzen mit derart modifizierten MYB26-Genen weisen ein verändertes Pollensackgewebe auf, wodurch es zu einer maskierten Fruchtbarkeit kommt.
Bei den in das Genom eingeführten MYB26-Genen kann es sich um die Nukleinsauresequenz gemäß SEQ ID NO:2 oder deren Fragment oder Homolog oder Derivat handeln, beispielsweise um jede beliebige MYB26-Sequenz aus anderen Pflanzen. Die verwendeten Nukleinsäuren können natürlichen Ursprungs sein oder künstlich hergestellt worden sein. Die Nukleinsäuresequenzen können sowohl in Sense- als auch in Antisense-Orientierung vorliegen.
Die mit der Nukleinsauresequenz gemäß SEQ ID NO:2 oder deren Fragment oder Homolog oder Derivat funktional verbundene regulatorische DNA-Sequenz, z.B. ein Promotor, kann sowohl die mit der Nukleinsauresequenz endogen vorliegende regulatorische DNA-Sequenz gemäß SEQ ID NO:l als auch jede andere regulatorische DNA-Sequenz sein. Die regulatorische DNA- Sequenz kann sowohl ein endogener Promotor des zu transformierenden Organismus oder ein exogener Promotor sein, der sich z.B. auf dem verwendeten Vektor befindet. Als Promotor ist dabei grundsätzlich jede regulatorische Sequenz geeignet, die die Expression von Fremdgenen in Organsimen, z.B. Pflanzen, steuern kann, z.B. der CaMV 35S-Promotor aus dem Blumenkohl- Mosaik-Virus; vgl. Franck et al., Cell 21, 285-294 (1980) oder der Ubiquitin-Promotor aus Mais. Die Expression der Nukleinsäuresequenzen kann auch durch einen chemisch induzierbaren Promotor erreicht werden. Beispiele für chemisch induzierbare Promotoren sind der PRPI- Promotor (Ward et al., Plant Molecular Biology 22, 361-366 (1993)), ein durch Salizylsäure induzierbarer Promotor (WO 95/19443), ein durch Benzolsulfonamid induzierbarer Promotor (EP-A 388186), ein durch Tetrazyklin induzierbarer Promotor (Gatz et al., Plant Journal 2, 397- 404 (1992)), ein durch Abscisinsäure induzierbarer Promotor (EP-A 335528) oder ein durch Ethanol oder Cyclohexanon induzierbarer Promotor (WO 93/21334). Es können auch Promotoren verwendet werden, die z.B. in bestimmten Pflanzengeweben oder Pflanzenteilen aktiv sind. Beispiele für entsprechende Promotoren sind der Phaseolin-Promotor (US 5504200), der Isoflavon-Reduktase-Promotor (US 5750399), ein samenspezifischer Promotor, z.B. aus Tabak (US 5824863) oder der ST-LSI Promotor aus Kartoffel (Stockhaus et al., (1989), EMBO J ' 8, 2445-2452).
Die mit der Nukleinsauresequenz gemäß SEQ ID NO:2 oder deren Fragment oder Homolog oder Derivat funktional verbundene regulatorische DNA-Sequenz zur Herstellung einer transgene Pflanze mit einem veränderten Ligningehalt kann z. B. ein Promotor sein, der gewebespezifisch z. B. im Phloem oder vaskulärem Gewebe von Pflanzen zu einer starken Expression der mit ihm funktional verbundenen Nukleinsäuresequenzen fuhrt. Solche Promotoren sind beispielsweise der Glutamin-Synthase-Promotor (Edwards et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:3459- 3463), der Mais-Sucrose-Synthetase-1-Promotor (Yang et al. (Ward 93) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:4144-4148), der Promotor des Rol-C Gens der TLDNA des Ri-Plasmids (Sagaya et al., Plant Cell Physiol., 3:649-653), und die Phloem-spezifische Region des pRVC-S-3A Promotor das (Aoyagi et al., Mol. Gen. Genet, 213:179-185 (1988)).
Die verwendeten Nukleinsäuresequenzen können endogene oder exogene Nukleinsäuresequenzen oder deren Fragmente oder Derivate oder Homologe sein. Endogen bedeutet, daß die Nukleinsauresequenz aus dem gleichen Organismus stammt, in den sie mit dem erfindungsgemäßen Verfahren integriert wird, z.B. ein MYB26-Gen aus Arabidopsis thaliana wird mit dem erfindungsgemäßen Verfahren in Arabidopsis thaliana integriert. Exogen bedeutet, daß die Nukleinsauresequenz aus einem anderen Organismus stammt, z.B. ein MYB26-Gen aus Arabidopsis thaliana wird mit dem erfindungsgemäßen Verfahren in z.B. Weizen integriert.
Nach der stabilen Integration der transformierten Nukleinsauresequenz liegen dann zwei oder mehr MYB26-Gene im Genom vor, so daß eine gesteigerte Menge an entsprechenden
Genprodukten zu erwarten ist. In einer bevorzugten Aus_ruhrungsform weisen die
Nukleinsäuresequenzen gegenüber den natürlich vorkommenden Nukleinsäuresequenzen Deletionen, Substitutionen, Additionen, Lisertionen und/oder Inversionen auf.
Die vorliegende Erfindung betrifft femer eine transformierte Zelle, insbesondere eine transformierte Pflanzenzelle oder ein transformiertes Pflanzengewebe, in der eine regulatorische Nukleinsauresequenz, z.B. die erfindungsgemäße Nukleinsauresequenz gemäß SEQ ID NO:l, und die Nukleinsauresequenz gemäß SEQ ID NO:2, oder deren Fragmente oder Homologe oder Derivate, stabil integriert sind. Femer betrifft die vorliegende Erfindung eine mit der regulatorischen Nukleinsauresequenz, z.B. der erfindungsgemäßen Nukleinsauresequenz gemäß SEQ ID NO:l, und der Nukleinsauresequenz gemäß SEQ ID NO:2, oder deren Fragmenten oder Homologen oder Derivaten, transformierte Pflanzenzelle oder ein transformiertes Pflanzengewebe, die oder das zu einer samenproduzierenden Pflanze regenerierbar ist. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung eine Pflanze, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich ist. Femer betrifft die vorliegende Erfindung Saatgut, das von Pflanzen erhalten wird, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten werden. Die Erfindung betrifft femer die von den Pflanzen produzierten Früchte, Samen, Blätter, Sprosse und Speicherorgane, z.B. Obst, Beeren, Trauben, Getreide und Kartoffeln.
In einer weiteren Ausführungsform wird eine Nukleinsauresequenz verwendet, die aus Nukleinsäurefragmenten verschiedener MYB26-Gene zusammengesetzt ist. Diese zusammengesetzte Nukleinsauresequenz kann femer ebenfalls Modifikationen wie Deletionen, Additionen oder Substitutionen enthalten. Die Nerfahren zur Herstellung solcher Nukleinsäuresequenzen sind Stand der Technik und vom Fachmann leicht durchzuführen.
Das vorliegende Erfindung läßt sich auf alle beliebigen pflanzlichen Organismen anwenden. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung männliche sterile mono- und dikotyle Pflanzen bereit. Besonders bevorzugte Pflanzen sind dabei Kulturpflanzen z.B. Soja, Baumwolle, Flachs, Hanf, Sonnenblume, Kartoffel, Tabak, Tomate, Zucchini, Aubergine, Gurke, Sommerraps, Winterraps, Alfalfa, Salat, Chicoree, Spargel, Schwarzwurzel, Erbse, Bohne, Linsen, Karotte, Zwiebel, Lauch, Olive, Rettich, Radieschen, Rote Beete, Steckrübe, Kohlrabi, Zuckerrübe, Futterrübe, Zuckerrohr, Spinat, Mangold, die verschiedenen Baum, Nuß- und Weinspezies, die verschiedenen Kohlsorten wie Rosenkohl, Blumenkohl, Broccoli, Weißkohl, Rotkohl, Wirsing, Chinakohl, femer Getreide z.B. Gerste, Weizen, Roggen, Hafer, Mais, Reis, Futtergräser, femer Obstsorten z.B. Mango, Apfel, Birne, Pfirsich, Pflaume, Himbeere, Brombeere, Stachelbeere, Erdbeere, Kirsche, Johannisbeere, Guave, Banane, Melone, Kürbis und Zitrusfrüchte z.B. Zitrone, Apfelsine, Pampelmuse oder Mandarine. Die mit der Nukleinsauresequenz transformierten Pflanzen können unmodifizierte Wildtyppflanzen oder durch Züchtung erhaltene Pflanzen oder modifizierte Pflanzen z.B. transgene Pflanzen sein. Das erfindungsgemäße Verfahren kann ferner auch in Pflanzengeweben und in Pflanzenzellen, z.B. in einer Zellkultur oder in Expressionssystemen, zur Veränderung der Expressionsmuster von MYB26-Genen oder Fragmenten oder Derivaten oder Homologen dieser Gene verwendet werden.
Außerdem ist das erfindungsgemäße Verfahren zur temporären Sterilisation geeignet, indem der MYB26-spezifische Promotor gegen einen induzierbaren Promotor ausgetauscht wird. Durch eine gezielte Induktion der Fertilität kann z.B. auf besondere Umweltbedingungen reagiert werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft femer Vektoren, umfassend eine Nukleinsauresequenz gemäß SEQ ID NO:2, oder deren Fragment oder Derivat oder Homolog und eine regulatorische DNA- Sequenz.
Geeignete Vektoren zur Aufnahme und Überführung der Nukleinsäuresequenzen können die Vermehrung und/oder die Expression der aufgenommenen Nukleinsäuren in Einzellern wie z.B. Escherichia coli oder Agrobacterium tumefaciens oder in Pflanzenzellen, Pflanzengeweben oder Pflanzen gewährleisten. Entsprechende Vektoren können natürlich vorkommen oder aber künstlich hergestellt sein. Die Vektoren können Selektionsmarker, Terminatorsequenzen, Polylinker, Promotorelemente, Enhancer, Polyadenylierungsstellen und andere genetische Elemente umfassen. Zur Klonierung geeignete Vektoren sind z.B. Plasmide der pBluescript- Serie, Plasmide der pUC-Serie, Plasmide der pGEM-Reihe oder auf dem Bakteriophagen λ basierende Vektoren. Ein zur Verwendung in Agrobacterium benutzter Plasmidvektor ist z.B. pBinl9; vgl. Bevan et al., (1984), Nucleic Acids Research 12, 8711-8721. Zur Transformation und Expression in Pflanzen stellen auf dem Ti-Plasmid von Agrobacterium-Arten oder auf Pflanzenviren aufbauende Konstrukte verwendungsfähige Vektoren dar und sind dem Fachmann bekannt. Des weiteren werden bei bestimmten Transformationsmethoden wie z.B. Mikroinjektion, Protoplasten-Transformation und Einschießen (microprojectile bombardment) anstelle von Ti-Plasmiden auch obengenannte Klonierungsvektoren oder linearisierte DNA eingesetzt. Eine zusammenfassende Beschreibung bislang benutzter Vektoren findet sich in Guerineau und MuUineaux, Plant Transformation and Expression Vectors, in: Plant Molecular Biology Labfax, herausgegeben von Croy, Oxford, BIOS Scientific Publishers, 121-148 (1993).
Einige der in handelsüblichen Transformations- und Expressionssystemen angewendeten Transformationsmethoden zur Übertragung von Fremdgenen (Transformation) in das Genom von Pflanzen werden im folgenden vorgestellt. Die Wahl der Methode zur Einbringung der erfindungsgemäßen Nukleinsauresequenz und der mit ihr funktional verbundenen für ein Genprodukt kodierenden Nukleinsäuresequenzen in pflanzliche Zellen ist jedoch nicht auf diese Liste beschränkt. Bislang eingesetzte Transformationsverfahren bei Pflanzen sind z.B. der Gentransfer mittels Agrobacterium tumefaciens (z.B durch Baden von Samen, Infloreszenzen oder Blattstückchen in einer Agrobakterienlösung), mittels pflanzlicher Viren, durch Elektroporation, durch Einschießen (microprojectile bombardment) oder Einspritzen (Mikroinjektion) sowie die Inkubation von trockenen Embryonen in DNA-haltigen Flüssigkeiten und die Transformation von Protoplasten unter Zuhilfenahme von Polyethylenglykol. Genauere Beschreibungen der angesprochenen Verfahren finden sich z.B. in Jens et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von Kung und Wu, Academic Press 128-143 (1993).
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindimg betrifft die regulatorische Nukleinsauresequenz (im folgenden auch als Promotor bezeichnet), die natürlicherweise in Arabidopsis thaliana die Expression des MYB26-Gens steuert. Diese erfindungsgemäße Nukleinsauresequenz ist in SEQ ID NO:l aufgeführt. Femer betrifft die Erfindung Fragmente oder Homologe oder Derivate der Nukleinsauresequenz gemäß SEQ ID NO:l, die die biologische Funktion eines Promotors besitzen, vorzugsweise eines in den männlichen Blütenorganen aktiven Promotors. Femer betrifft die Erfindung Nukleinsäuresequenzen, die mit der Nukleinsauresequenz gemäß SEQ ID NO:l hybridisieren und die biologische Form eines Promotors besitzen, vorzugsweise eines in den männlichen Blütenorganen aktiven Promotors. Bevorzugt sind Nukleinsäuresequenzen, die unter stringenten Bedingungen mit der Nukleinsauresequenz gemäß SEQ ID NO:l hybridisieren und die biologische Form eines Promotors besitzen, vorzugsweise eines in den männlichen Blütenorganen aktiven Promotors.
Die erfindungsgemäße regulatorische Nukleinsauresequenz gemäß SEQ ID NO:l oder deren Fragment oder Homolog oder Derivat eignet sich z.B. zur Identifizierung und Isolierung von zum MYB26-Gen homologen Genen in anderen Organismen und/oder von zur SEQ ID NO:l verwandten regulatorischen Sequenzen in z.B. Arabidopsis thaliana oder anderen Organismen mit Hilfe spezieller Hybridisierungs- oder Screening- Verfahren, z.B. als Sonde für das Screening in DNA-Bibliotheken mit Hilfe der Hybridisierung an einzelsträngige Nukleinsäuren ähnlicher Basenabfolge.
Die erfindungsgemäße regulatorische Nukleinsauresequenz gemäß SEQ ID NO:l oder deren Fragment oder Homolog oder Derivat eignet sich femer zur spezifischen Steuerung der Expression von Genen oder anderen funktionellen Nukleinsäuren in Organismen oder Zellen, infolge Ihrer Gewebespezifität bevorzugt zur spezifischen Steuerung von Genen in den männlichen Blütenorganen. Nach der stabilen Integration der transformierten Nukleinsauresequenz liegen dann zwei oder mehr MYB26-Promotoren im Genom vor, so daß die nachgeschalteten Nukleinsäuresequenzen eine diesen Promotoren entsprechende Expressionsregulation aufweisen.
Die mit der erfindungsgemäßen regulatorischen Nukleinsauresequenz gemäß SEQ ID NO:l oder deren Fragment oder Homolog oder Derivat funktionell verbundenen Gene oder andere funktionellen Nukleinsäuren können endogene, exogene genomische DNA-Abschnitte oder cDNAs oder deren Fragmente oder Derivate oder synthetische oder semisynthetische Nukleinsäuren sein. Endogen bedeutet dabei, daß die Nukleinsauresequenz aus dem gleichen Organismus stammt, in den sie mit dem erfindungsgemäßen Verfahren integriert wird, z.B. eine Nukleinsauresequenz aus Arabidopsis thaliana wird mit dem erfindungsgemäßen Verfahren in Arabidopsis thaliana integriert. Exogen bedeutet, daß die Nukleinsauresequenz aus einem anderen Organismus stammt, z.B. eine Nukleinsauresequenz aus Arabidopsis thaliana wird mit dem erfindungsgemäßen Verfahren in z.B. Weizen integriert. Die funktionell verbundenen Gene oder andere funktionellen Nukleinsäuresequenzen können gegenüber den natürlich vorkommenden Nukleinsäuresequenzen Deletionen, Substitutionen, Additionen, I sertionen und/oder Inversionen aufweisen.
Beispielsweise kann die erfindungsgemäße Nukleinsauresequenz gemäß SEQ ID NO:l oder deren Fragment oder Homolog oder Derivat für die Regulation der Expression des natürlicherweise mit ihr verbundenen MYB26-Gens verwendet werden, so daß Pflanzen mit gesteigerter, reduzierter oder vollkommen fehlender MYB26-Expression vorliegen, was zu einer Beeinflussung des MYB26-Stoffwechselweges und demzufolge zu einer Strukturveränderung des Pollensackgewebes sowie einer damit verbundenen maskierten Fruchtbarkeit führt.
Femer eignet sich die erfindungsgemäße regulatorische Nukleinsauresequenz auch für die Regulation der Expression anderer Gensequenzen. Dabei kann der Promotor in Kombination mit beliebigen Genen vorliegen, sowohl in einem Vektor als auch in transgenen Organismen. Insbesondere ist der Promotor für die Regulation der Expression von Genen in den Blütenorganen verwendbar, in besonderem Maße für die Regulation der Expression von Genen in den Antheren, speziell im Pollensackgewebe. Dabei können prinzipiell Gene aus sämtlichen pflanzlichen Stoffwechselwegen vom Promotor reguliert werden, z.B. Gene, kodierend für Komponenten des Fettstoffwechsels (z.B. Acyl-CoA-Synthase, Acetyl-CoA-Carboxylase etc.), Kohlenhydratstoffwechsels (z.B. Phosphofructokinase, Fructose-l,6-bisphosphatase, Glucose-6- Phosphat-Dehydrogenase etc.), Aminosäurestoffwechsels (z.B. Aminotransferasen, Desaminasen etc.), Hormonstoffwechsels (z.B. Gene für die Synthese von Auxinen, Gibberellinen, Abscisinsäure etc.), Photosynthese (z.B. Rieske-Protein, psaE etc.), Zellarchitektur (z.B. Tubulin, Aktin etc), Atmung (z.B. Cytochrom C, Cytochrom C-Oxidase etc.), Pathogenabwehr (Flavonoide, Terpene etc.) usw.. Besonders geeignete zu regulierende Gene beeinflussen z.B. Struktur, Größe oder Stoffwechsel des Pollensacks, so daß transgene Pflanzen mit veränderten männlichen Blütenorganen, z.B. größeren, stabileren oder formveränderten Pollensäcken, entstehen können. So können entsprechende Gene unter anderem am Aufbau von Pollensackstrukturen beteiligt sein, z.B. an der Synthese oder dem Einbau von Lignin oder Cellulose für sekundäre Zellwandverdickungen. Ein Beispiel für ein entsprechendes antherenspezifisches Gen ist das vermutlich an der Ligninsynthese beteiligte CHSLK-Gen (Genbank Accession Nummer Y14506), kodierend für eine putative Chalcon-Synthase. Auch Gene für die Zellwandstrukturen modifizierende oder abbauende Enzyme sind hier zu nennen, z.B. A6, ein Gen für eine antherenspezifische ß-l,3-Glucanase (Genbank Accession Nummer X62716). Weitere Beispiele für antherenspezifische Gene mit teilweise noch unbekannter Funktion sind sf2 (Genbank Accession Nummer X62716), RA8 (Genbank Accession Nummer AF042275) ATA20 (Genbank Accession Nummer AF037362) und MZm3-3 (Genbank Accession Nummer AJ224355). Weiterhin besonders zur Regulation mit Hilfe des Promotors geeignet sind Gene, die bei spezifischer Expression in den männlichen Blütenorganen ebenfalls männliche Sterilität in Pflanzen erzeugen, z.B. infolge des Absterbens der betroffenen Zellen. Für diesen Zweck können verschiedenste Proteine exprimiert werden, die den normalen Stoffwechsel der Zelle erheblich stören. Besonders geeignet sind hierfür katabohsche Enzyme r wie Nucleasen, Proteasen, Lipasen oder Glucanasen.
Die erfindungsgemäßen regulatorischen Nukleinsäuresequenzen gemäß SEQ ID NO:l oder deren Fragmente oder Homologe oder Derivate können natürlichen Ursprungs sein oder künstlich hergestellt worden sein. Die funktionell verbundenen Gene oder die anderen funktionellen Nukleinsäuresequenzen können sowohl in Sense- als auch in Antisense- Orientierung vorliegen.
Die erfindungsgemäße regulatorische Nukleinsauresequenz gemäß SEQ ID NO:l oder deren Fragmente oder Homologe oder Derivate können in Vektoren, Expressionssystemen oder Pflanzen, Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen oder tierischen Zellen oder Mikroorganismen zur Veränderung der Expressionsmuster verschiedenster Genprodukte verwendet werden. Die Expression der Genprodukte kann dabei gegenüber Ihrer natürlichen Expression sowohl verstärkt als auch verringert sein.
Die vorliegende Erfindung betrifft demzufolge femer Vektoren, umfassend eine regulatorische Nukleinsauresequenz gemäß SEQ ID NO:l oder deren Fragment oder Derivat oder Homolog.
Geeignete Vektoren zur Aufnahme und Übe_r_l_ührung der Nukleinsäuresequenzen können die Vermehrung und/oder die Expression der aufgenommenen Nukleinsäuren in Einzellern wie z.B. Escherichia coli oder Agrobacterium tumefaciens oder in Pflanzenzellen, Pflanzengeweben oder Pflanzen gewährleisten. Entsprechende Vektoren können natürlich vorkommen oder aber künstlich hergestellt sein. Die Vektoren können Selektionsmarker, Terminatorsequenzen, Polylinker, Promotorelemente, Enhancer, Polyadenylierungsstellen und andere genetische Elemente umfassen. Zur Klonierung geeignete Vektoren sind z.B. Plasmide der pBluescript- Serie, Plasmide der pUC-Serie, Plasmide der pGEM-Reihe oder auf dem Bakteriophagen λ basierende Vektoren. Ein zur Verwendung in Agrobacterium benutzter Plasmidvektor ist z.B. pBinl9; vgl. Bevan et al., (1984), Nucleic Acids Research 12, 8711-8721. Zur Transformation und Expression in Pflanzen stellen auf dem Ti-Plasmid von Agrobacterium-Arten oder auf Pflanzenviren aufbauende Konstrukte verwendungsfähige Vektoren dar und sind dem Fachmann bekannt. Des weiteren werden bei bestimmten Transformationsmethoden wie z.B. Mikroinjektion, Protoplasten-Transformation und Einschießen (microprojectile bombardment) anstelle von Ti-Plasmiden auch obengenannte Klonierungsvektoren oder linearisierte DNA eingesetzt. Eine zusammenfassende Beschreibung bislang benutzter Vektoren findet sich in Guerineau und MuUineaux, Plant Transformation and Expression Vectors, in: Plant Molecular Biology Labfax, herausgegeben von Croy, Oxford, BIOS Scientific Publishers, 121-148 (1993). Einige der in handelsüblichen Transformations- und Expressionssystemen angewendeten Transformationsmethoden zur Übertragung von Fremdgenen (Transformation) in das Genom von Pflanzen werden im folgenden vorgestellt. Die Wahl der Methode zur Einbringung der erfindungsgemäßen Nukleinsauresequenz und der mit ihr funktional verbundenen für ein Genprodukt kodierenden Nukleinsäuresequenzen in pflanzliche Zellen ist jedoch nicht auf diese Liste beschränkt. Bislang eingesetzte Transformationsverfahren bei Pflanzen sind z.B. der Gentransfer mittels Agrobacterium tumefaciens (z.B durch Baden von Samen, Infloreszenzen oder Blattstückchen in einer Agrobakterienlösung), mittels pflanzlicher Viren, durch Elektroporation, durch Einschießen (microprojectile bombardment) oder Einspritzen (Mikroinjektion) sowie die Inkubation von trockenen Embryonen in DNA-haltigen Flüssigkeiten und die Transformation von Protoplasten unter Zuhilfenahme von Polyethylenglykol. Genauere Beschreibungen der angesprochenen Verfahren finden sich z.B. in Jens et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von Kung und Wu, Academic Press 128-143 (1993).
Die Erfindung betrifft femer transgene Pflanzen mit einer stabil in das Genom integrierten regulatorischen Nukleinsauresequenz gemäß SEQ ED NO:l, oder deren Fragment oder Derivat oder Homolog mit der biologischen Funktion eines Promotors, vorzugsweise eines in den männlichen Blütenorganen aktiven Promotors, und einer mit dieser Nukleinsauresequenz funktionell verbundenen für ein Genprodukt codierenden oder einer anderen funktionellen Nukleinsauresequenz entsprechend den vorstehend aufgeführten und beschriebenen Beispielen für solche codierenden oder anderen funktionellen Nukleinsäuresequenzen.
Femer betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Pflanze mit veränderter Genexpression, umfassend das stabile Integrieren einer regulatorischen Sequenz gemäß SEQ ID NO:l oder deren Fragment oder Homolog oder Derivat mit der biologischen Funktion eines Promotors, vorzugsweise eines in den männlichen Blütenorganen aktiven Promotors, und einer mit dieser Sequenz funktionell verbundenen für ein Genprodukt codierenden oder einer anderen funktionellen Nukleinsauresequenz in das Genom von Pflanzenzellen oder Pflanzengeweben sowie Regeneration der erhaltenen Pflanzenzellen oder Pflanzengeweben zu Pflanzen. Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich auf alle beliebigen pflanzlichen Organismen anwenden. Insbesondere ist das erfindungsgemäße Verfahren zur Veränderung der Genexpression von mono- und dikotylen Pflanzen einsetzbar. Besonders bevorzugte Pflanzen sind dabei Kulturpflanzen z.B. Soja, Baumwolle, Flachs, Hanf, Sonnenblume, Kartoffel, Tabak, Tomate, Zucchini, Aubergine, Gurke, Sommerraps, Winterraps, Alfalfa, Salat, Chicoree, Spargel, Schwarzwurzel, Erbse, Bohne, Linsen, Karotte, Zwiebel, Lauch, Olive, Rettich, Radieschen, Rote Beete, Steckrübe, Kohlrabi, Zuckerrübe, Futterrübe, Zuckerrohr, Spinat, Mangold, die verschiedenen Baum, Nuß- und Weinspezies, die verschiedenen Kohlsorten wie Rosenkohl, Blumenkohl, Broccoli, Weißkohl, Rotkohl, Wirsing, Chinakohl, femer Getreide z.B. Gerste, Weizen, Roggen, Hafer, Mais, Reis, Futtergräser, femer Obstsorten z.B. Mango, Apfel, Birne, Pfirsich, Pflaume, Himbeere, Brombeere, Stachelbeere, Erdbeere, Kirsche, Johannisbeere, Guave, Banane, Melone, Kürbis und Zitrasfrüchte z.B. Zitrone, Apfelsine, Pampelmuse oder Mandarine. Die mit der Nukleinsauresequenz transformierten Pflanzen können unmodifizierte Wildtyppflanzen oder durch Züchtung erhaltene Pflanzen oder modifizierte Pflanzen z.B. transgene Pflanzen sein. Das erfindungsgemäße Verfahren kann femer auch in Pflanzengeweben und in Pflanzenzellen, z.B. in einer Zellkultur oder in Expressionssystemen, zur Veränderung der Expressionsmuster von MYB26-Genen oder Fragmenten oder Derivaten oder Homologen dieser Gene verwendet werden.
BEISPIELE
Die Erfindung w ird durch die nun folgenden Beispiele erläutert, ist aber nicht auf diese beschränkt:
Beispiel 1 : Allgemeine Ellonierungsverfahren
Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Klonierungsschritte wie z.B. Restriktionsspaltungen, Agarose-Gelelektrophorese, Reinigung von Nukleinsäurefragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Filtermateriahen, Transformation und Anzucht von Bakterienzellen u.s.w. wurden wie bei Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory (1989), ISBN 0-87969-309-6, durchgeführt.
Beispiel 2: Herstellung einer Knockout-Population von Arabidopsis thaliana Die vorliegende Erfindung wurde durch das Screening einer mit dem Transposon En-l/Spm (Pereira et al, EMBO Journal 5, 835-841 (1986)) mutagenisierten Knockout-Population von Pflanzen der Spezies Arabidopsis thaliana Ecotyp Columbia erhalten. Die Integration der transposablen Elemente in Gene der Mutterpflanze führt häufig zum Ausfall der entsprechenden Genfunktion und in vielen Fällen zu einem vom Wildtyp unterscheidbaren Erscheinungsbild der betroffenen Pflanze. Zum Aufbau der Knockout-Population wurde das autonome En-1 Element aus Zea mays mittels Agrobacterium tumefaciens in Arabidopsis übertragen. Das entsprechende Transposon tagging System ist in Cardon et al., Plant Molecular Biology 23, 157-178 (1993) beschrieben. Das verwendete Ti-Plasmid, pGV3850HPT::pkEn2, beinhaltete das komplette En-1 Element als Integrat. Zur Selektion von Hygromycin-resistenten Transformanten trägt dieser Vektor das HPT-Gen unter der Kontrolle des viralen CaMV 35S Promotors. Samen einer Transformante mit einer einzelnen T-DNA-Insertion wurden auf Hygromycin-haltigem Medium ausgesät. Samen der so entstandenen, gegen Hygromycin resistenten Pflanzen (T2-Generation) wurden anschließend auf Kanamycin-haltigem Medium ausgesät. Bei den auf diese Weise selektionierten Pflanzen (T3-Generation) war das Enl-Element aus der T-DNA heraus transponiert. Mittels PCR wurde diejenigen Pflanzen der T4-Generation identifiziert, die ein oder mehrere transponierte En-1 Elemente, jedoch keine En-1 Elemente mehr in der T-DNA trugen. Diese Pflanzen beeinhalteten jedoch noch die T-DNAs ohne integrierte En-1 Elemente. Zur Erzeugung von En-1 positiven, T-DNA negativen Pflanzen wurde die T4-Generation mit dem Wildtyp Arabidopis thaliana Ecotyp Columbia gekreuzt und En-1 positive, T-DNA negative Pflanzen (S0-Generation) durch PCR identifiziert. Samen jeder dieser Pflanzen wurden über 6-12 Generationen (bis zur S6- bzw. S12-Generation) hinweg vermehrt, bis insgesamt 3.000 Linien mit insgesamt 15.000 unabhängigen En-1 Insertionen zur Verfügung standen (Wisman et al., Plant Molecular Biology 37, 989-999 (1998), Baumann et al., Theoretical and Applied Genetics 97, 729-734 (1998)).
Beispiel 3: Screening nach sterilen Mutanten
Zur Identifizierung von phänotypisch auffälligen Mutanten der entstandenen En-1 Population wurden Familien der S7-Generation (mit jeweils 18 Individuen) per Auge nach Auffälligkeiten durchmustert. Dabei konnte eine Linie (7AAB12) identifiziert werden, die für kleine, leere Schoten segregierte. Mikroskopische Analysen der Blüte steriler Individuen ergäben, daß sich in Mutanten die Pollensäcke nicht öffnen, wohingegen die Pollen normal erscheinen. Die Mutation wurde daher mit andl (anther non dehiscence) bezeichnet. Bei allen sterilen Pflanzen traten vereinzelt normale Schoten mit keimungsfähigen Samen auf. Diese stellen vermutlich somatische Reversionsereignisse dar, was auf die Integration eines intakten Transposons als Mutationsursache hindeutet.
Zur Klonierung des mutierten Gens wurde zunächst bestimmt, ob der mutante Phänotyp mit dem homozygoten Zustand einer bestimmten Integration der Transposons gekoppelt ist. Für diesen Zweck wurden 18 Schwesterpflanzen der En-Linie 7AAB12 analysiert. Sechs dieser Pflanzen wiesen Sterilität auf, was auf eine rezessive Mutation hindeutet. Phänotypische Analyse von je 18 Nachkommen der fertilen Individuen ergab, daß sieben der 18 Ausgangspflanzen auch sterile Nachkommen produzierten und somit heterozygot für andl waren, wohingegen fünf Pflanzen keine sterilen Nachkommen zeigten und somit homozygot für das Wildtypallel waren. Mittels Southern Blot Analysen konnten in allen 18 Pflanzen durch Hybridisierung mit einer En-Sonde mehrere Kopien des Transposons nachgewiesen werden, wobei sich eine Kopie in allen sterilen Pflanzen sowie in den sieben für die Mutation heterozygoten fertilen Pflanzen fand nicht jedoch in den übrigen fünf Pflanzen, die homozygot für das Wildtypallel waren. Fig. 4 zeigt eine Southern Blot Analyse mit EcoRI gespaltener DNA von je einem Nachkommen von 14 der ursprünglich 18 analysierten Pflanzen. Als Sonde diente das 5 '-Ende des Transposons. In den das Fehlen einer Integration in den Pflanzen, die homozygot das Wildtypallel tragen, ist deutlich sichtbar.
Die flankierende DNA von acht verschiedenen En-Insertionen wurde durch „Transposon- Insertion-Display" (TID), vgl. Yephremov und Saedler, The Plant Journal 21, 495-505, 2000, gewonnen und in den pGemTeasy Vektor (Firma Promega) Moniert. Die Inserts der resultierenden Plasmide wurden sequenziert. Sequenzvergleiche mit Sequenzdatenbanken ergaben in fünf Fällen 100%ige Übereinstimmung mit genomischen Arabidopsis-Sequenzen. Die anhand der Sequenz berechneten Längen von Restriktionsfragmenten wurden mit den in Southern Blot Analysen erhaltenen Fragmenten verglichen. Eine Sequenz zeigt Übereinstimmung der errechneten Fragmentlängen mit den experimentell bestimmten Längen für die Bande, die gekoppelt mit der andl Mutation auftritt. Diese Sequenz des Pl-Clons MDC16 trägt im Bereich der Transposonintegrationsstelle ein offenes Leseraster, das 100% Identität zur cDNA des putativen Transkriptionsfaktors AfMYB26 aufweist. Hybridisierungen unter Verwendung der AtMYB26 cDNA (ohne MYB-Domäne) zeigten, daß alle sterilen Pflanzen homozygot eine En-Insertion in AtMYB26 tragen, wohingegen alle Pflanzen, welche die Mutation nicht tragen, auch keine Insertion in AtMYB26 aufweisen.
Beispiel 6: Reversion der andl Mutation
Um zu überprüfen, ob die Sterilität in den untersuchten Pflanzen tatsächlich durch die En- Insertion in AtMYB26 hervorgerufen wird, wurden 12 Nachkommen einer sterilen Pflanze mit fertilen Sektoren (7AAB-14-3) auf Verlust der En-Insertion in AtMYB26 untersucht. Alle 11 fertilen Nachkommen zeigten Verlust der En-Insertion in einer Kopie von AtMYB26, wohingegen eine sterile Tochterpflanze noch immer homozygot die Insertion in AtMYB26 aufwies. Der Verlust der En-Insertion in mindestens einer Kopie von AtMYB26 führt somit zum Verlust des mutanten Phänotyps.
Beispiel 7: Selektion einer stabilen Mutante
Eine stabile Mutante wurde während Southern- Analysen von Nachkommen der Linie 7AAB12 gefunden. Einige Individuen zeigten trotz des Verlustes der Integration in AtMYB26 Sterilität. In diesen Pflanzen ergab die Sequenzanalyse des PCR-amplifizerten 5 '-Bereichs von MYB26, daß drei Codons im Bereich der MYB-Domäne deletiert waren.
Beispiel 8: Mikroskopische Untersuchung von Antheren
Die fünftälteste noch geschlossenen Knospe von Wildtyp und MYB26-Mutante wurde in 2% Paraformaldehyd / 0,25 % Glutaraldehyd für 2 h fixiert und anschließend in Paraffin eingebettet. Semidünnschnitte wurden mit Calcofluor White gefärbt, wie in Dawson et al., 1999 (New Phytologist 144: 213-222) beschrieben.

Claims

Patentansprüche
1. Transgene Pflanze mit maskierter Fruchtbarkeit, wobei die maskierte Fruchtbarkeit durch eine veränderte Expression der Nukleinsauresequenz gemäß SEQ ID NO:2 oder deren
Homolog, oder durch die Veränderung der biologischen Aktivität des durch die
Nukleinsauresequenz gemäß SEQ ID NO:2 oder deren Homolog kodierten Genprodukts hervorgerufen wird.
2. Transgene Pflanze nach Anspruch 1, wobei die Expression verstärkt, verringert oder komplett ausgeschaltet ist.
3. Transgene Pflanze nach einem der Ansprüche 1 oder 2 mit einer verstärkten Expression der Nukleinsauresequenz gemäß SEQ ID NO:2 oder deren Homolog, umfassend eine zur endogenen Nukleinsauresequenz gemäß SEQ ID NO:2 oder deren Homolog zusätzlich stabil in das Genom integrierten Nukleinsauresequenz gemäß SEQ ID NO:2, oder deren Homolog, und einer mit dieser Nukleinsauresequenz funktionell verbundenen regulatorischen Nukleinsauresequenz.
4. Transgene Pflanze nach Ansprach 3, umfassend mindestens zwei Kopien der Nukleinsauresequenz gemäß SEQ ID NO:2 oder deren Homolog.
5. Transgene Pflanze nach einem der Ansprüche 1 oder 2 mit einer verringerten oder komplett ausgeschalteten Expression der Nukleinsauresequenz gemäß SEQ ID NO:2 oder deren Homolog, umfassend die Nukleinsauresequenz gemäß SEQ ID NO:2, oder deren
Fragment oder Derivat oder Homolog, in Antisense-Orientierung.
6. Transgene Pflanze nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die regulatorische Nukleinsauresequenz ausgewählt ist aus der Gruppe der Promotoren CaMV 35S-Promotor, Ubiquitin-Promotor, PRPI-Promotor, Phaseolin-Promotor, Isoflavon-Reduktase Promotor,
ST-LSI Promotor, durch Salizylsäure induzierbarer Promotor, durch Benzolsulfonamid induzierbarer Promotor, durch Tetrazyklin induzierbarer Promotor,, durch Abscisinsäure induzierbarer Promotor, durch Ethanol oder Cyclohexanon induzierbarer Promotor, Promotor nach einem der Ansprüche 8 bis 10, oder deren Fragment oder Derivat oder Homolog mit der biologischen Funktion eines Promotors, oder ein samenspezifischer Promotor aus Tabak.
7. Transgene Pflanze nach einem der Ansprüche 1 oder 2 mit einer komplett ausgeschalteten Expression der Nukleinsauresequenz gemäß SEQ ID NO:2 oder deren Homolog, umfassend Deletionen, Substitutionen, Additionen oder Inversionen.
8. Transgene Pflanze nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei die Expression der Nuklemsäuresequenz gemäß SEQ ID NO:2 oder deren Homolog durch Modifikation funktioneller Komponenten der regulatorischen Nukleinsauresequenz verändert wird.
9. Transgene Pflanze nach Ansprach 8 wobei die funktionellen Komponenten TATA-Box, CAAT-Box, GC-Box, Enhancer oder Bindestellen für weitere Transkriptionsfaktoren umfassen.
10. Transgene Pflanze nach Anspruch 1 mit veränderter biologischer Aktivität, umfassend Modifikation der Nukleinsauresequenz gemäß SEQ ID NO:2 oder deren Homolog.
11. Transgene Pflanze nach Ansprach 10, wobei die Modifikationen Deletionen, Additionen oder Substitutionen umfassen.
12. Nukleinsauresequenz nach SEQ ID NO: 1.
13. Fragment oder Derivat der Nukleinsauresequenz nach Ansprach 12 oder eine Nukleinsauresequenz, die mit der Nukleinsauresequenz gemäß SEQ ID NO:l hybridisiert und die biologische Aktivität eines für die männlichen Blütenorgane spezifischen Promotors besitzt.
14. Nukleinsauresequenz nach Ansprach 13, wobei die hybridisierende Nukleinsauresequenz unter stringenten Bedingungen mit der Nukleinsauresequenz gemäß SEQ ID NO:l hybridisiert.
15. Transgene Pflanze mit einer stabil in das Genom integrierten regulatorischen Nukleinsauresequenz nach einem der Ansprüche 12 bis 14, und einer mit dieser Nukleinsauresequenz funktionell verbundenen für ein Genprodukt codierenden oder einer anderen funktionellen Nukleinsauresequenz.
16. Transgene Pflanze nach Ansprach 15, wobei für die für ein Genprodukt codierende oder für die andere funktioneile Nukleinsauresequenz eine endogene oder exogene Nukleinsauresequenz verwendet wird.
17. Verfahren zur Herstellung einer Pflanze nach einem der Ansprüche 1 bis 11, 15 oder 16, umfassend das stabile Integrieren einer regulatorischen Nukleinsauresequenz, insbesondere einer Nukleinsauresequenz nach einem der Ansprüche 12 bis 14, und einer mit dieser Nukleinsauresequenz funktionell verbundenen für ein Genprodukt codierenden oder einer anderen funktionellen Nukleinsauresequenz, insbesondere der Nukleinsauresequenz gemäß SEQ ID NO:2, oder deren Fragment oder Derivat oder Homolog, in das Genom von
Pflanzenzellen oder Pflanzengeweben und Regeneration der erhaltenen Pflanzenzellen oder Pflanzengeweben zu Pflanzen.
18. Transformierte Pflanzenzelle oder transformiertes Pflanzengewebe mit einer stabil in das Genom integrierten regulatorischen Nukleinsauresequenz, insbesondere einer
Nukleinsauresequenz nach einem der Ansprüche 12 bis 14 und eine mit dieser Nukleinsauresequenz funktionell verbundenen für ein Genprodukt codierenden oder einer anderen funktionellen Nukleinsauresequenz, insbesondere der Nukleinsauresequenz gemäß SEQ ID NO:2, oder deren Fragment oder Derivat oder Homolog.
19. Pflanzenzelle oder Pflanzengewebe nach Anspruch 18, regenerierbar zu einer samenproduzierenden Pflanze.
20. Saatgut, erhalten von Pflanzen nach einem der Ansprüche 1 bis 11, 15 oder 16.
21. Vektor, umfassend eine Nukleinsauresequenz nach einem der Ansprüche 12 bis 14.
22. Verwendung der Nukleinsauresequenz gemäß SEQ ID NO:2 oder deren Fragment oder Derivat oder Homolog zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit einem veränderten Ligningehalt.
23. Verwendung nach Ansprach 22, wobei die Nukleinsauresequenz gemäß SEQ ID NO:2 oder deren Fragment oder Derivat oder Homolog funktional mit einem gewebespezifischen Promotor verknüpft ist.
24. Verwendung nach Anspruch 23, wobei der gewebespezifische Promotor ausgewählt ist aus dem Glutamin-Synthase-Promotor, dem Mais-Sucrose-Synthetase-1-Promotor, dem
Promotor des Rol-C Gens der TLDNA des Ri-Plasmids und der Phloem-spezifischen Region des pRVC-S-3A Promotors.
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