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WO2002022847A1 - Process for producing purified anthocyanin and crystalline anthocyanin - Google Patents

Process for producing purified anthocyanin and crystalline anthocyanin Download PDF

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WO2002022847A1
WO2002022847A1 PCT/JP2001/007891 JP0107891W WO0222847A1 WO 2002022847 A1 WO2002022847 A1 WO 2002022847A1 JP 0107891 W JP0107891 W JP 0107891W WO 0222847 A1 WO0222847 A1 WO 0222847A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
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anthocyanidin
rutinoside
anthocyanin
crystalline
dalcoside
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2001/007891
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hitoshi Matsumoto
Satoshi Hanamura
Masao Hirayama
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Meiji Seika Kaisha Ltd
Original Assignee
Meiji Seika Kaisha Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Meiji Seika Kaisha Ltd filed Critical Meiji Seika Kaisha Ltd
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Priority to AU2001284529A priority patent/AU2001284529A1/en
Priority to EP01963597A priority patent/EP1318201B1/en
Priority to AT01963597T priority patent/ATE309262T1/de
Priority to CA002421954A priority patent/CA2421954C/en
Priority to JP2002527289A priority patent/JPWO2002022847A1/ja
Priority to US10/380,056 priority patent/US7211413B2/en
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H17/00—Compounds containing heterocyclic radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H17/00—Compounds containing heterocyclic radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H17/04—Heterocyclic radicals containing only oxygen as ring hetero atoms
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    • C07H17/065—Benzo[b]pyrans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
    • C09B61/00—Dyes of natural origin prepared from natural sources, e.g. vegetable sources
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing purified anthocyanin from natural product-derived antomyosinin, a method for producing fine crystalline anthocyanin by finely crystallizing the purified anthocyanin, and a crystalline anthocyanin prepared by the production method. More specifically, the anthocyanidin rutinoside or anthocyanidin dalcoside constituting anthocyanins is enzymatically converted or removed to further reduce the amount of anthocyanidin rutinoside or anthocyanidin dalcoside. The method is characterized by facilitating the crystallization step.
  • Anthocyan is a generic term for anthocyanidins having a skeleton represented by the following formula (I) and anthocyanins that are bound to sugars to form glycosides.
  • Anthocyanidins which are petunidin OCH3 OH aglycones include, for example, delphinidin
  • Anthocyanin is referred to as anthocyanidin dalcoside, for example, when glucose is bound to the above-described anthocyanidin as a glycoside.
  • the sugars found in anthocyanins include glucose, a monosaccharide, galactose, arabinose, and disaccharides, such as rutinose and sophorose.
  • Anthocyans exist widely in the natural world, and are widely used as foods, mainly as natural pigments, or in Europe for pharmaceuticals, quasi-drugs, and cosmetics due to their functionality. For example, use as a scar forming agent as described in JP-B-59-53883, or disease of peripheral blood vessels using anthocyanin derived from blueberry as described in JP-A-3-81220 Valuable pharmacological properties have been found for treatment. Recently, attention has been paid to the functionality of anthocyanin as a use other than the dye of anthocyanin in Japan as well. The present inventors have also found and reported (WO01 / 01798) some useful effects on anthocyanins of cassis (English name: Black currant, Japanese name: Black Fussadari).
  • anthocyanin has been produced in large quantities.
  • high purity anthocyanin is preferably required to be a crystalline product from the viewpoints of stability and hygroscopicity, but there has been no case in which crystalline anthocyanin has been produced in a large amount in the past.
  • anthocyanin compositions are mainly blueberry-derived preparations, but have an anthocyanin content of 25% by weight or less. mg must also be administered, and it is practically impossible to produce a pharmacological effect with a small amount of ingestion. Therefore, a high anthocyanin-rich composition containing high-purity purified anthocyanin has been required.
  • cassis-derived anthocyanins examples include cyanidin-3-O-darcoside (hereinafter abbreviated as C3G), cyanidin-3-O-rutinoside (hereinafter abbreviated as C3R), and delphinidin-3.
  • C3G cyanidin-3-O-darcoside
  • C3R cyanidin-3-O-rutinoside
  • delphinidin-3 -0-darcoside
  • D3R delphinidin-3-0-rutinoside
  • anthocyanin for conventional pharmaceutical applications can be synthesized through a number of steps, for example, by the method of synthesizing delphinididine hydrochloride (an anthocyanidin hydrochloride of aglycone instead of a glycoside) described in Patent No. 3030509.
  • delphinididine hydrochloride an anthocyanidin hydrochloride of aglycone instead of a glycoside
  • Anthocyanidin hydrochloride produced by the synthetic method is stable under strongly acidic conditions, but is more easily degraded than glycosides in the weakly acidic to neutral range. Was very narrow. Therefore, it has been required to prepare a more stable anthocyanin as a crystal in an acidic to neutral region, but it is not possible at present to prepare a large amount of anthocyanin by an organic synthesis method.
  • anthocyanin shellfish The characteristics of anthocyanin shellfish are listed in the Dictionary of natural products (Chapman & HALL, 1994, London). By quoting by way of example, no crystal of D3R has been reported so far, and although there is a report on the crystal form of D3G hydrochloride, it is understood that it was difficult to prepare a large amount without mentioning the melting point. Similarly, the melting point and crystal form of C3R hydrochloride are described, but the melting point of C3G hydrochloride is not described, indicating that it was difficult to prepare a large amount. Until now, crystalline and non-crystalline Since only small amounts of purified anthocyanin could be prepared, regardless of the enzyme, few studies examined the reactivity of various enzymes to anthocyanin.
  • the present invention uses rhamnosidase to cleave the rhamnose end of anthocyanidin rutinoside, convert the anthocyanidin rutinoside component to anthocyanidin dalcoside, and then purify and isolate the anthocyanidin dalcoside component. And a method for producing a crystalline anthocyanidin dalcoside salt hydrate by further crystallizing the purified anthocyanin.
  • the present invention provides a purified anthocyanidin lucinoside component, wherein the glucose terminus of anthocyanidin dalcoside is cleaved with dalcosidase, degraded and removed, and then the anthocyanidin rutinoside component is purified and isolated.
  • the present invention relates to a method for producing tosocyanin, or a method for producing a crystalline anthocyanidin rutinoside salt hydrate by further crystallizing the purified anthocyanin.
  • Still another aspect of the present invention relates to a crystalline anthocyanin salt hydrate prepared by using these production methods.
  • the present invention is directed to a first invention in which rhamnosidase is allowed to act on an anthocyanin composition containing at least one or more anthocyanidin rutinoside, and the anthocyanidin rutinoside is hydrolyzed to cause anthocyanidin rutinoside.
  • Isolating and purifying anthocyanidin dalcoside after conversion to A method for producing a purified anthocyanidin dalcoside characterized in that:
  • an anthocyanidin composition containing at least one or more anthocyanidin dalcoside and anthocyanidin rutinoside is allowed to act on ⁇ -darcosidase, hydrolyze the anthocyanidin dalcoside, and hydrolyze the anthocyanidin dalcoside.
  • a method for producing a purified anthocyanidin rutinoside comprising isolating and purifying anthocyanidin rutinoside after reducing cosid.
  • anthocyanin composition fruit juice obtained from at least one kind of fruit selected from power cis, figs, coffee, bananas, blackberries, etc. and / or american makomo, taro, etc. And the resulting anthocyanin concentrate.
  • rhamnosidase include hesperidinase, naringinase and the like.
  • 3-dalcosidase is an enzyme capable of selectively decomposing only the / 3-dalcoside bond of anthocyanidin dalcoside without decomposing the] 3-darcoside bond of anthocyanidin rutinoside. And those derived from almonds.
  • the third invention provides a method for producing crystalline anthocyanidin-3-0-darcoside hydrochloride monohydrate through the following steps.
  • Rhamnosidase is allowed to act on an anthocyanin composition containing at least one or more anthocyanidin rutinoside, and the anthocyanidin rutinoside is hydrolyzed to be converted into anthocyanidin darcoside.
  • the anthocyanidin glucoside is purified to obtain anthocyanidin glucoside having a purity of 99% or more.
  • a fourth invention is a crystalline anthocyanidin obtained by the method of the third invention. Provides -3-0-darcoside hydrochloride hydrate.
  • the fifth invention provides a method for producing crystalline anthocyanidin-3-0-rutinoside hydrochloride monohydrate through the following steps.
  • anthocyanidin rutinoside having a purity of 99% or more is obtained.
  • a sixth invention provides crystalline anthocyanidin-3-0-rutinoside hydrochloride monohydrate obtained by the method of the fifth invention.
  • ion-exchange adsorption chromatography and / or HPLC can be used as the purification method in step b), and the hydrochloric acid / alcohol-based mixed solvent in step c) can be 5 or less.
  • % (V / V) Hydrochloric acid / 95% (V / V) Methanol can be used.
  • the seventh invention provides crystalline delphinidin-3-0-darcoside hydrochloride ⁇ hemihydrate having the following physical properties.
  • the eighth invention provides crystalline cyanidin-3-O-darcoside hydrochloride ⁇ hemihydrate having the following physical properties.
  • a ninth invention is crystalline delphinidin-3-0-rutinoside hydrochloride • 1.5 hydrate having the following physical properties.
  • a tenth invention provides crystalline cyanidin-3-O-rutinoside hydrochloride hemihydrate having the following physical properties.
  • anthocyanin indicates a glycoside in which a saccharide is bonded to an aglycone, anthocyanidin. Includes alappinoside, galactoside, and the like.
  • the anthocyanin composition containing at least one or more anthocyanidin darcoside and / or anthocyanidin rutinoside used in the enzyme reaction in the present invention may be any composition including anthocyanin, and may be any of commercially available juices, concentrated juices, beverages , A dye solution, or a powder used as a raw material for foods and pharmaceuticals.
  • the concentrated juice is a fruit juice obtained from one or more fruits selected from cassis, fig, coffee, banana, blackberry and the like, and / or an anthocyanin concentrate obtained from American makomo, taro and the like. After dissolving the powder in water or a buffer solution, it is used for the reaction.
  • anthocyanin-rich composition prepared by the method reported by the present inventors in WO01 / 01798, and since acids, sugars, polyphenols and the like have been removed in advance, The operation becomes easy in the purification step after the enzymatic reaction.
  • the type of aglycone of anthocyanin in the method for producing purified anthocyanin of the present invention is not particularly limited.
  • cassis-derived anthocyanins and salts thereof are good.
  • the only aglycone part of anthocyanin derived from cassis is delphinidin and cyanidin.However, in the enzymatic reaction, it is not considered that there is a specificity for these two types of anthocyanidins, and glycosides of other anthocyanidins, for example,
  • the present invention is also applicable to glycosides represented by the formula (I) such as malvidin, pelargidine, petunidin, and ponidine.
  • the types of salts constituting the crystalline anthocyanin salts include salts of mineral acids such as hydrochloric acid and sulfuric acid, salts of organic acids such as phosphoric acid, trifluoroacetic acid (TFA), and acetic acid (flapiedum salts). Salts with hydrochloric acid, TFA and phosphoric acid are preferred from the viewpoint of simplicity.
  • the rhamnosidase used in the present invention may be of any origin such as animals, plants, and microorganisms, but may be any as long as it has an anthocyanin-terminal -rhamnosidase activity as a mechanism of action. What is important is that the activity of the / 3-Darcosidase is low.
  • anthocyanin is decomposed when left in a neutral to basic region for a long time, and it is known that the decomposition is promoted by heating. Therefore, it is necessary to have high activity at a pH of 4.0 or less and a temperature of 40 or less.
  • hesberidinase or naringinase is used, and more preferably, hesveridinase is used.
  • Hesperidinase is derived from Aspergillus niger, which is industrially produced for the purpose of decomposing hesperidin, a cloudy component of Unshu mandarin orange.
  • Naringinase is also used to improve the taste by decomposing naringin, a bitter component such as fruit oranges and summer oranges
  • i3-darcosidase used in the present invention is not particularly limited, but it is necessary to react with anthocyanin. Without, Anthocyanidin Substrate specificity is required to break down only the / 3 -darcoside bond of the coside. In other words, those that react only to the terminal glucose and do not react to the central glucose in the molecule are suitable. Also, as with rhamnosidase, it must have high activity at pH 4.0 or lower and temperature of 40 ° C or lower.
  • almond-derived j3-dalcosidase is used.
  • j8_darcosidase derived from almonds is a typical; 8-darcosidase, but no studies have examined the reactivity to anthocyanin.
  • Examples of the reaction treatment of 3 / 3-dalcosidase to anthocyanin include the fruit juice industry such as grape juice and peach nectar and the spa industry including wine, champagne, etc .; and the wine industry such as cling wine; and 8-darcosidase.
  • Anthocyanase is used for decolorization and debittering.
  • anthocyanase is not suitable for producing purified anthocyanin because it reacts with and decomposes both anthocyanin darcoside and rutinoside.
  • reaction conditions for causing these enzymes to act on anthocyanin are not particularly limited, but as described above, it is known that anthocyanin decomposes when left in a neutral to basic region for a long time, and decomposition is accelerated by high temperatures. It is known that the reaction is carried out in an acidic region, and it is preferable not to carry out the reaction at a high temperature. Specifically, it is considered that the reaction is most preferably carried out at a pH of 4.0 or less and a temperature of 40 ° C or less. .
  • the concentration of the substrate in the anthocyanin-containing substance used in the enzymatic reaction is not particularly limited, but if the concentration is extremely high, the viscosity of the reaction solution increases, the reaction speed decreases, and an inhibition reaction due to substances present in the reaction solution occurs.
  • the concentration of the substrate is preferably 10 (w / v)% or less, more preferably 5 (w / v)% or less, since there is a concern about a transfer reaction to the substrate or the like.
  • the amount of the enzyme to be added is not particularly limited in relation to the reaction time.
  • anthocyanin-containing substance i.e., anthocyanidin rutinoside or anthocyanidin dalcoside
  • a commonly used method is used.
  • the purification method after completion of the enzymatic reaction can be carried out by appropriately combining other chromatographic methods, resin adsorption methods, membrane separation methods, and the like, if necessary, in addition to column chromatography. is there. Above all, a chromatographic method using ODS silica gel is most preferable. If necessary, an anthocyanin component may be adsorbed on a cation exchange resin or the like in advance, and then eluted to purify the preliminarily purified product in the same manner.
  • anthocyanin content is PCT / JP00 / 09204 or
  • an anthocyanin sample with a known weight is analyzed by HPLC, a calibration curve is prepared from the peak area at 520 nm, and the content of each anthocyanin component is determined. Further, a response coefficient obtained by dividing the content of each component by the peak area, that is, mg / peak area is obtained. Next, the anthocyanin-containing sample was analyzed by HPLC, and the peak area of each component was multiplied by the response coefficient obtained from the sample to calculate the content of each component. / w) Calculate as%. That Therefore, the purity of anthocyanin is calculated to include not only the amount of aglycone, anthocyanidin, but also the amount of bound sugar. The purity of the purified anthocyanin of the present invention is 99% or more according to HPLC analysis.
  • crystallization mainly from an organic solvent is preferred, and methanol is preferably used as a crystallization solvent.
  • methanol is preferably used as a crystallization solvent.
  • the anthocyanins form a salt with an acid to form a crystal
  • it is preferable to add the acid to the crystallization solvent and about 1% to 5% (VV) of hydrochloric acid, TFA, phosphorus It is preferable to add an acid or the like.
  • D3G has a melting point of 258 ° C
  • D3R has a melting point of 224 ° C
  • C3G has a melting point of 245 ° C
  • C3R has a melting point of 214-226 ° C.
  • the crystalline anthocyanin salt of the present invention is a crystal having a purity of 99% or more by polarization microscope observation, elemental analysis, melting point measurement, and HPLC analysis, and is a very stable substance having no hygroscopicity and a melting point of 200 ° C or more. .
  • high-purity purified anthocyanin and crystalline anthocyanin salt could not be produced, but by using the production method of the present invention, high-purity purified anthocyanin and crystalline anthocyanin salt can be purified from natural products. could be manufactured.
  • the crystalline anthocyanin salt thus produced did not show hygroscopicity and had stable properties.
  • anthocyanin-rich composition Preparation of an anthocyanin-rich composition according to the method described in WO01 / 01798 did. That is, 3 Kg of a commercially available concentrated cassis juice (purity of anthocyanin per solid content: 2.8%) was diluted with water to prepare a concentration of Bx.10. After removing the foreign substances by filtering the diluted juice with filter paper, membrane separation was performed using a membrane separator (NTR-7410) manufactured by Nitto Denko Corporation. The concentrated liquid obtained by membrane separation was spray-dried to obtain a powdery anthocyanin-rich composition. The anthocyanin purity of this composition was 14.1% per solid. This composition had a hygroscopic property when left at room temperature.
  • Hesperidinase (trade name: Hesperidinase Tanabe No. 2) manufactured by Tanabe Seiyaku Co., Ltd. was dissolved in 1 L of 50 mM acetate buffer (pH 3.5) to prepare an enzyme solution. (Equivalent to 42.5 U / ml of ramnosidase activity)
  • This concentrated solution is detected using an ODS-120T silica gel column (manufactured by Tosoichi, ID5.5x30cm, 20 ⁇ ) with a 9% (V / V) acetonitrile aqueous solution containing 0.1% TFA at a flow rate of 80 ml / min and a wavelength of 520 nm. Then, a D3G fraction with an RT (Retention Time) of 66-90 minutes and a C3G fraction of 158-200 minutes were obtained. These fractions were a single peak by HPLC analysis, and purified delphinidin 13-O-darcoside and purified cyanidin-3-O-darcoside having a purity of 99% or more could be prepared.
  • HPLC analysis conditions for the purity measurement are as follows. That is, the analysis was carried out using a Hewlett Packard Series 1100 (Yokogawa Analytical Systems) HPLC system under the following gradient conditions.
  • the column used was Zoi'bax SB-C18, 4.6 mm x 250 nnn, 5 ⁇ , manufactured by Hewlett Packard's company.
  • the flow rate was measured at lml / niin, and the detection was performed at a wavelength of 520 nm.
  • the R.T. of the D3G and C3G samples were 10.54 minutes and 14.60 minutes, respectively.
  • the D3G fraction and the C3G fraction obtained in Example 1 were concentrated on a rotary evaporator overnight, 30 ml of heptane was added thereto, and the mixture was again concentrated to dryness to remove TFA mixed during the separation operation. The weight was measured, and the obtained D3G fraction was 1.51 g and the C3G fraction was 0.98 g.
  • the amount of C3G hydrochloride was 0.59 g.
  • Root ij fixed value 48.00 4.50 6.80
  • Table 2 shows the anthocyanin content in the substrate solution before the reaction and the solution after the reaction measured by HPLC. According to Table 2, only anthocyanidin dalcoside was decomposed, and most of the anthocyanidin rutinoside remained undegraded, and a reaction solution having an optimum composition for purification was obtained. Table 2
  • a precipitate was obtained through the same crystallization step as in Example 2. Observation with a polarizing microscope revealed that both of the obtained precipitates were polarized, indicating that they were in a crystalline form. The yield was 58 mg for crystalline C3R hydrochloride and 88 mg for crystalline D3R hydrochloride.
  • Crystalline D3R hydrochloride
  • the anthocyanin composition before and after the reaction was measured by HPLC.
  • the content and composition of anthocyanin before and after the reaction are shown in Table 3 below. Both anthocyanidin dalcoside and anthocyanidin rutinoside were degraded, which proved to be unsuitable for the purification of anthocyanin glycosides. Table 3
  • purified anthocyanin and crystalline anthocyanin salt having high purity can be produced in a form purified from natural products.
  • the crystalline anthocyanin salt thus produced did not show hygroscopicity and had stable properties.

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Description

ニンの製造法および結晶性アントシァニン 技術分野
本発明は、天然物由来のアント明シァニンから精製アントシァニンを製造する方 法および精製アントシァニンをさら細に結晶化して結晶性アントシァニンを製造 する方法、 ならびに該製造法で調製される結晶性アントシァニンに関する。 さらに詳しくは、アントシァニン類を構成するアントシァニジンルチノシドま たはアントシァニジンダルコシドを酵素的に変換または除去して、アントシァニ ジンルチノシドまたはアントシァニジンダルコシドをより減少させることによ り、 以降の精製 ·結晶化工程を容易にすることを特徴とする方法である。
背景技術
アントシアンとは、 下記の式 (I)に示される骨格を有するアントシァニジンと それに糖が結合して配糖体となったアントシァニンとの総称である。
( I )
Figure imgf000003_0001
デルフィ二ジン OH OH
シァニジン OH H
マゾレビジン OCH3 OCH3
ペラルゴ二ジン H H
ぺ才ニジン OCH3 H
ペチュニジン OCH3 OH ァグリコンであるアントシァニジンとしては、 例えばデルフィ二ジン
(Delphinidin)、 シァニジン （Cyanidin)、 マルビジン （Malvidin)、 ペラルゴ ニンノ (Pelargoniain)、 ぺォニジン (Peonidin)、 へチュニジン (Petunidin) などがある。アントシァニンは例えば、上記アントシァニジンにグルコースが配 糖体として結合している場合はアントシァニジンダルコシドと呼ぶ。また、アン トシァニンに見いだされる糖としては単糖類であるグルコース以外に、ガラクト ース、 ァラビノースや 2糖類であるルチノ一ス、 ソフォロースなどがある。 アントシアン類は自然界に幅広く存在し、主に天然系色素として食品、あるい はその機能性から欧州では、 医薬品、 医薬部外品、化粧品などに幅広く使用され ている。例えば特公昭 59-53883号に記載されるような瘢痕形成剤としての利用、 あるいは、 特開平 3-81220号公報に記載されるようなブルーべリ一由来のアン トシァニンを用いた末梢血管の疾病治療について価値ある薬理学的性質が見出 されている。昨今日本国内でもアントシァニンの色素以外の利用法としてアント シァニンの機能性に注目が集まってきている。本発明者らも、カシス（英名 Black currant, 和名黒フサスダリ） のアントシァニンにいくつかの有用な効能を見出 し、 報告 （WO01/01798) している。
しかし、薬理学的性質を持つこれらアントシァニンを医薬品などとして用いる 場合には、高純度に精製されたものが求められるのに対して、高純度に精製され
- 2 . た精製アントシァニンが大量に製造された例は過去になかった。また高純度アン トシァニンは安定性 ·吸湿性などの面から好ましくは結晶製品が求められるが、 結晶性アントシァニンが大量に製造された例も過去に無かった。
また、従来の医薬品用のアントシァニン組成物は主にブルーベリー由来の製剤 であるが、 アントシァニン含有量が 25重量％以下であり、 有効性を発揮するた めにはアントシァニン製剤として少なくとも 1回当たり数百 mgも投与しなく てはならず、少量の摂取で薬理学的な効果を出すことは事実上不可能であり、高 純度の精製アントシァニンを含有したアントシァニン高含有組成物が求められ ていた。
高純度の精製アントシァニンが存在しなかった理由は、ブルーベリー由来のァ ントシァニンを例に取るとアントシァニン成分が 15種も存在しており、 それら の物質の物理化学的性質が非常に似ているために分取用カラムなどによる精製 においてそれぞれの流出ピークが重なってしまうことや、 また、それぞれの成分 が非常に少量であるために分離精製が不可能であつたためである。
また、 カシス由来のアントシァニンを例にあげると、 シァニジン- 3-O-ダルコ シド （以下 C3Gと略記する。）、 シァニジン- 3-O-ルチノシド （以下 C3Rと略記 する。）、 デルフィ二ジン- 3-0-ダルコシド （以下 D3Gと略記する。） およびデル フィニジン- 3-0-ルチノシド （以下 D3Rと略記する。） の 4成分がアントシァニ ン類として含まれているが、 ブル一ベリー由来のアントシァニンと同様に該 4 物質の物理化学的性質が非常に似ているために、 これら 4成分の混合物であつ てもクロマトピークが接近しており、分取用クロマトグラフィーや遠心分配クロ マトグラフィーを用いて精製ァントシァニンを得ようとしても極端な収率の低 下を伴うため大量調製は不可能であった。また、カシス中の代表的なアントシァ ニン類の量比は D3G, D3R, C3G及び C3Rがそれぞれ、 12.5%、 47.9 %、 4.1% 及び 35.5%であり、 含有量の低い D3G， C3G成分を大量精製するのは更に困難 であり、 精製アントシァニンを大量に製造する方法が求められていた。
一方、従来からアントシアンは安定性に問題のあることが判っており、本発明 者らは、 アントシァニン高含有物の安定化剤としてフィチン酸、 糖類、糖アルコ 一ル類を添加することによる安定化法を特許出願（PCT/JP00/09204)している。 しかし、アントシァニンを高含有量で使用して製剤化する時には、 このような添 加物を入れる余地がないために、さらに安定性の高い物性が要請されており、 よ り物理的に安定な結晶形態のアントシァニンを使用した製剤が求められていた。 そのため、 従来医薬品用途として高純度アントシァニンは、 例えば特許第 3030509号に記載のデルフィ二ジン塩酸塩 （配糖体ではなくァグリコンのアン トシァニジン塩酸塩）の合成法などにより、 いくつもの段階を経て有機合成され ていたが、 天然物から大量に調製された例はなかった。
また、合成法によって製造されたアントシァニジン塩酸塩は、強酸性条件下で は安定であるが、弱酸性から中性領域では配糖体に比べ分解されやすいことが判 明しており、その応用範囲は甚だ狭いものになっていた。従って、酸性から中性 領域でより安定なァントシァニンを結晶として調製することが求められていた が、有機合成法によりアントシァニンを大量に調製することは現状ではできてい ない。
アン卜シァニン类貝の特'性は、 Dictionary of natural products(Chapman & HALL社刊， 1994, London)に列記されている。 例を挙げて引用すると、 D3Rの 結晶は従来報告されておらず、 D3G塩酸塩の結晶形に関する報告はあるが融点 の記載はなく大量に調製することが難しかったことがわかる。 同様に C3R塩酸 塩については、 融点、 結晶形共に記載があるが、 C3G塩酸塩では融点の記載は なく大量に調製することが難しかったことがわかる。従来までは、 結晶、非結晶 を問わず精製されたアントシァニンが、微量にしか調製できなかったため、各種 酵素のアントシァニンへの反応性を調べた研究はほとんどなかった。特に、 ラム ノシダーゼのアントシァニンに対する反応性を述べたものは皆無であった。以上 のことより、煩雑な合成法を用いずに高純度の精製ァントシァニンを天然物より 大量に製造する方法が求められ、さらに精製アントシァニンを結晶化した結晶性 アントシァニン塩を大量に製造する方法が求められていた。
発明の開示
本発明はラムノシダーゼを用いて、アントシァニジンルチノシドのラムノース 末端を切断し、アントシァニジンルチノシド成分をアントシァニジンダルコシド に変換させた後、アントシァニジンダルコシド成分を精製して単離することを特 徵とする精製アントシァニンの製造法、あるいはこの精製アントシァニンをさら に結晶化して、結晶性アントシァニジンダルコシド塩 ·水和物を製造する方法に 関する。
また別の本発明は、 ダルコシダーゼを用いて、 アントシァニジンダルコシ ドのグルコース末端を切断し、分解除去した後に、アントシァニジンルチノシド 成分を精製して単離することを特徴とする精製アン卜シァニンの製造法、あるい はこの精製アントシァニンをさらに結晶化して、結晶性アントシァニジンルチノ シド塩 ·水和物を製造する方法に関する。
さらにまた別の本発明は、これらの製造法を用いて調製された結晶性アントシ ァニン塩 ·水和物に関するものである。
本発明を具体的に説明すると、 第 1発明は少なくとも 1種以上のアントシァ 二ジンルチノシドを含有するアントシァニン組成物にラムノシダーゼを作用さ せ、アントシァニジンルチノシドを加水分解することによりアントシァニジング ルコシドに変換させた後、アントシァニジンダルコシドを単離し、精製すること を特徴とする、 精製アントシァニジンダルコシドを製造する方法を提供する。 第 2の発明は少なくとも 1種以上のアントシァニジンダルコシドとアントシ ァニジンルチノシドを含有するアントシァニン組成物に β -ダルコシダーゼを作 用させ、 アントシァニジンダルコシドを加水分解し、アントシァニジンダルコシ ドを減じせしめた後、アントシァニジンルチノシドを単離し、精製することを特 徴とする、 精製アントシァニジンルチノシドを製造する方法を提供する。
上記の第 1及び第 2の発明において、 アントシァニン組成物としては力シス、 イチジク、 コーヒー、バナナ、 ブラックベリーなどから選択される一種以上の果 実から得られる果汁および/またはアメリカマコモ、 サトイモなどから得られる アントシァニン濃縮物が挙げられる。ラムノシダーゼとしてはヘスペリジナ一ゼ、 ナリンジナ一ゼ等が挙げられる。 また、 3 -ダルコシダ—ゼとしてはアントシァ 二ジンルチノシドの ]3 -ダルコシド結合は分解せずに、 アントシァニジンダルコ シドの /3 -ダルコシド結合のみを選択的に分解できる酵素であり、 その具体例と してはアーモンド由来のものが挙げられる。
第 3の発明は下記の工程を経て結晶性アントシァニジン- 3-0-ダルコシド塩酸 塩 ·水和物を製造する方法を提供する。
a)少なくとも 1 種以上のアントシァニジンルチノシドを含有するアントシァ ニン組成物にラムノシダ一ゼを作用させ、アントシァニジンルチノシドを加水 分解することによりアントシァニジンダルコシドに変換する。
b ) 該アントシァニジンダルコシドを精製することにより純度 99%以上のァ ントシァニジングルコシドを得る。
c ) 該アントシァニジンダルコシドを塩酸/ァルコール系の混合溶媒を用いて 結晶化する。
第 4 の発明は上記第 3の発明の方法により得られる結晶性アントシァニジン -3-0-ダルコシド塩酸塩 ·水和物を提供する。
第 5の発明は下記の工程を経て結晶性アントシァニジン- 3-0-ルチノシド塩酸 塩 ·水和物を製造する方法を提供する。
a)少なくとも 1種以上のアントシァニジンダルコシドとアントシァニジンル チノシドを含有するァン卜シァニン組成物に /3 -ダルコシダ一ゼを作用させ、 アントシァニジンダルコシドを加水分解することによりアントシァニジング ルコシドを減じせしめる。
b ) 該アントシァニジンルチノシドを精製することにより純度 99 %以上のァ ントシァニジンルチノシドを得る。
c ) 該アントシァニジンルチノシドを塩酸/アルコ一ル系の混合溶媒を用いて 結晶化する。
第 6の発明は上記第 5の発明の方法により得られる結晶性アントシァニジン -3-0-ルチノシド塩酸塩 ·水和物を提供する。
上記の第 3及び第 5の発明において、 b )工程の精製法としてはイオン交換吸 着クロマトグラフィーおよび/または HPLC を用いることができ、 c) 工程の塩 酸/アルコール系の混合溶媒としては 5% (V/V) 塩酸 /95% (V/V) メタノールを もちいることがでできる。
第 7の発明は下記の物理的性質を有する結晶性デルフィ二ジン- 3-0-ダルコシ ド塩酸塩 · 0.5水和物を提供する。
熱分析による融点： 258°C .
Uv A max(e)： 517nm (27500)
FAB-MS m/z： M+： 465
組成式： C2iH210i2Cl · 0.5H2O
元素分析値： C H C1 測定値： 48.00 4.50 6.80
第 8の発明は下記の物理的性質を有する結晶性シァニジン- 3-O-ダルコシド塩 酸塩 · 0.5水和物を提供する。
熱分析による融点： 245°C
ϋνλιη χ(ε)： 510 nm (26300)
FAB-MS m/z： M+： 449
組成式： C2iH210iiCl · 0.5H2O
元素分析値： C H C1
測定値： 48.80 4.70 6.90
第 9の発明は下記の物理的性質を有する結晶性デルフィ二ジン- 3-0-ルチノシ ド塩酸塩 · 1.5水和物。
熱分析による融点： 224で
UvA max(e)： 520 nm (27800)
FAB-MS m/z： M+： 611
組成式： C27H3iOi6Cl · 1.5H2O
元素分析値： C H C1
測定値： 45.80 5.30 5.20
第 10 の発明は下記の物理的性質を有する結晶性シァニジン- 3-O-ルチノシド 塩酸塩 · 0.5水和物を提供する。
熱分析による融点： 214〜226°C
UvA max(e)： 512 nm (27400)
FAB-MS m/z： M+： 595
組成式： C27H3iOi5Cl · 0.5H2O
元素分析値： C H C1 測定値： 50.00 5.30 5.30 本明細書においてアントシァニンとは、ァグリコンであるアントシァニジンに 糖類が結合した配糖体のことを示し、 グルコース、 ルチノース、 ァラビノース、 ガラクト一スなどの糖類が結合したダルコシド、 ルチノシド、 ァラピノシド、 ガ ラクトシドなどを含む。
本発明において酵素反応に用いられる少なくとも 1種以上のアントシァニジ ンダルコシドおよび/またはアントシァニジンルチノシドを含有するアントシァ 二ン組成物としては、アントシァニンを含むいかなるものでもよく、市販の果汁、 濃縮ジュース、飲料、色素溶液、 あるいは食品医薬品などの原料となる粉末など があげられる。 濃縮ジュースとして好ましくは、 カシス、 イチジク、 コーヒー、 バナナ、ブラックベリーなどから選択される一種以上の果実から得られる果汁お よび/またはアメリカマコモ、 サトイモなどから得られるアントシァニン濃縮物 がよい。 また、 該粉末を水や緩衝液などに溶解してから、 反応に用いる。 より好 ましくは、 本発明者らが WO01/01798に報告した方法で調製したアントシァニ ン高含有組成物を用いるのがよく、事前に酸類 ·糖類 ·ポリフエノール類などが 除去されているので、 酵素反応後の精製工程において操作が容易になる。
本発明の精製アン卜シァニンの製造法におけるアントシァニンのァグリコン の種類は、特に限定はしない。好ましくはカシス由来のアントシァニン類および その塩がよい。カシス由来のアントシァニンのァグリコン部分は、デルフィニジ ンとシァニジンのみであるが、酵素反応では、特にこの 2種類のアントシァニジ ンにおける特異性があるとは考えられず、他のアントシァニジンの配糖体、例え ば、 式（I )に示されるマルビジン、 ペラルゴ二ジン、 ペチュニジン、 ぺォニジン などの配糖体にも応用可能である。なお、カシス由来のアントシァニン成分の組 成は、 シァニジン- 3-O-グルコシド (C3G)、 シァニジン- 3-O-ルチノシド (C3R)、 デルフィ二ジン- 3Ό-ダルコシド (D3G)、 デルフィ二ジン- 3-0-ルチノシド (D3R) の 4成分からなっている。
また、結晶性ァントシァニン塩を構成する塩の種類は、塩酸、硫酸などの鉱酸、 リン酸、 トリフルォロ酢酸 (TFA)、 酢酸などの有機酸の塩 （フラピエゥム塩） が 含まれるが、 結晶のしゃすさなどから、 塩酸、 TFA、 リン酸との塩が好ましい。 本発明に用いられるラムノシダーゼとしては、動物、植物、微生物など特に起 源は問わないが、 作用機作としてアントシァニン末端の -ラムノシダーゼ活性 をもつものであればよいが、 この際に注意しなくてはならないのは /3 -ダルコシ ダ一ゼ活性が低いことが重要である。 さらには、 アントシァニンは、 中性から塩 基性領域に長時間放置すると分解することが知られており、さらに加温により分 解が促進されることが知られている。 よって、 pH4.0以下、 温度 40 以下で高 い活性を持つことが必要である。好ましくは、ヘスベリジナーゼまたはナリンジ ナーゼがあげられ、 より好ましくは、 ヘスベリジナーゼがあげられる。 ヘスペリ ジナ一ゼは、温州みかんの白濁成分であるヘスペリジンを分解することを目的と して工業的に生産されている Aspergillus niger由来のものがあげられる。なお、 これまで Aspergillus niger由来のヘスペリジナーゼのアントシァニンに対する 反応作用は知られていなかった。ナリンジナ一ゼも落果みかんや夏みかんなどの 苦味成分であるナリンジンを分解して呈味改善などに用いられている
Aspergillus niger由来のものなどが、あげられる。なお、 Aspergillus niger由来 のナリンジナーゼのアントシァニンに対しての応用は報告されていなかった。 本発明に用いられる i3 -ダルコシダ一ゼとしては、特にその起源は問わないが、 アントシァニンに対して反応しなくてはならないのは当然のこととして、アント シ 7二ジンルチノシドの jS -ダルコシド結合を分解せず、 アントシァニジンダル コシドの /3 -ダルコシド結合のみを分解する基質特異性が必要である。 つまり、 末端のグルコースにのみ反応し、分子内の中央部のグルコースには反応しないも のが適している。 また、 ラムノシダーゼと同様に pH4.0以下、 温度 40°C以下で 高い活性を持つことが必要である。 好ましくは、 アーモンド由来の j3 -ダルコシ ダーゼがあげられる。 なお、 アーモンド由来の j8 _ダルコシダ一ゼは、 代表的な ;8 -ダルコシダーゼであるが、 アントシァニンに対する反応性を調べた研究は存 在しなかった。
/3 -ダルコシダーゼのアントシァニンに対する反応処理の例としては、 従来か らブドウ汁、 ピーチネクター等の果汁工業やワイン、シャンパンなどを含むスパ —クリングワインなどのワイン工業で; 8 -ダルコシダーゼの一種であるアントシ アナーゼを脱色、脱苦味に用いていることがあげられる。 しかし、 アントシアナ —ゼは、アントシァニンのダルコシドとルチノシド双方に反応し、分解してしま うために、 精製アントシァニンの製造には不向きである。
これらの酵素をアントシァニンに作用させる反応条件は、とくに限定はしない が上記のようにアントシァニンは、中性から塩基性領域に長時間放置すると分解 することが知られており、さらに高温により分解が促進されることが知られてい るため、酸性領域が好ましく、高温で反応させないことが好ましレ^具体的には、 pH4.0以下、 温度 40°C以下で反応させるのが最も好ましいと考えられる。 酵素反応に用いるアントシァニン含有物中の基質の濃度は、特に限定されない が、 極端に高濃度であると、 反応液の粘性が増大し反応速度が落ち、 また反応液 中に存在する物質による阻害反応や、基質に対する転移反応などが心配されるた め、基質濃度として 10 (w/v ) %以下が好ましく、 より好ましくは 5 (w/v ) % 以下である。 また、酵素の添加量は、 反応時間との関連で特に限定するものでは ない。 ラムノシダーゼまたは j6 -ダルコシダーゼによる酵素反応によってアントシァ ニン含有物における基質、すなわち、アントシァニジンルチノシドまたはアント シァニジンダルコシドの含有量を減じせしめた後の酵素反応の停止法としては、 通常用いられる方法である、 加熱する温度上昇法、 酸アルカリなどを加える pH 調整法、有機溶媒添加法などが可能であるが、上記のようにアントシァニン類は 中性から塩基性領域では不安定であり、加熱によって分解が促進されるため、好 ましくは、 塩酸、 TFA、 リン酸などの強酸の添加による pH低下法、 あるいはメ 夕ノールなどの有機溶媒添加法による酵素反応停止が望ましい。
本発明において、酵素反応終了後の精製方法は、カラムクロマトグラフ法以外 にも、必要に応じて他のクロマトグラフ法、樹脂吸着法や膜分離法などを適宜組 み合わせて行うことが可能である。 中でも、 ODSシリカゲルを用いたクロマト グラフ法が最も好ましい。また、必要に応じて予め陽イオン交換樹脂などにアン トシァニン成分を吸着させた後、溶出させることにより、予備精製を行ったもの を同様に精製してもよい。
本明細書においてアントシァニン含有量は、 PCT/JP00/09204または
WO01/01798に記載してあると同様に、 含まれるアントシァニンの各成分の含 有量を合計したものであり、 HPLCによるアントシァニンのピーク面積比によ つて算出する。
すなわち、最初に、重量既知のアントシァニン標品を HPLCで分析し、 520nm におけるピーク面積から検量線を作成し、各アントシァニン成分の含量を求める。 さらに、 各成分の含量をピーク面積で除した応答係数、 即ち mg/ピーク面積を 得る。 次に、 アントシァニン含有サンプルを HPLC分析し、 それぞれの成分の ピーク面積に標品から求めた応答係数を乗じて、それぞれの成分含有量を計算し、 注入量との比からアントシァニン純度を重量 （w/w) %として求める。 そのた め、アントシァニンの純度はァグリコンであるアントシァニジンの量だけでなく、 結合している糖の量も含むものとして算出される。本発明の精製アントシァニン の純度は、 H P L C分析によれば純度 99%以上である。
本発明における結晶化方法は、主に有機溶媒からの結晶化が好ましく、 メタノ —ルを結晶化溶媒とするのが好ましい。 この際に、 アントシァニン類は、 酸との 塩を作って結晶となるため、 結晶化溶媒中に酸を添加しておくことが好ましく、 1%〜5% (V V)程度の塩酸、 TFA、リン酸などを添加しておくことが好ましい。 後記の実施例 1または 3で調製された結晶 D3G、 結晶 D3R、結晶 C3G、 結晶 C3Rの熱分析を行つたところ、 以下のような結果となつた。
D3Gの 融点は 258°Cであり、 D3Rの 融点は 224°Cであり、 C3Gの 融点は 245°Cであり、 C3Rの 融点は 214〜226°Cである。
本発明の結晶性アントシァニン塩は、 偏光顕微鏡観察、 元素分析、 融点測定、 HPLC分析により 99%以上の純度を有する結晶であり、 吸湿性もなく融点も 200°C以上で大変安定な物質である。
従来は高純度の精製ァントシァニンや結晶性ァントシァニン塩を製造するこ とはできなかったが、本発明の製造法を用いることにより、天然物から精製する 形で高純度の精製アントシァニンならびに結晶性アントシァニン塩を製造する ことができた。このようにして製造された結晶性アントシァニン塩は吸湿性を示 さず、 安定な性状であった。
発明を実施するための最良の形態
本発明を以下の実施例、 参考例および比較例によりさらに具体的に説明する。 ただし、 本発明はこれら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。 参考例 1 アントシァニン高含有組成物の調製
WO01/01798に記載される方法に従ってアントシァニン高含有組成物を調製 した。 すなわち、 市販のカシス濃縮果汁 3Kg (固形分当たりのアントシァニン 純度 2.8%) を水で希釈し、 Bx.10の濃度に調製した。 この希釈果汁を濾紙で濾 過して異物を除去した後、 日東電工社製の膜分離装置 （NTR-7410) を用い、 膜 分離を行つた。膜分離により得られた濃縮液をスプレードライすることにより粉 末状のアントシァニン高含有組成物を得た。本組成物のアントシァニン純度は固 形分当たり 14.1%であった。 本組成物は、 室温に放置しておくと吸湿性を有し た。
実施例 1 ヘスペリジナ一ゼを用いた精製デルフィ二ジン一 3— O—ダルコシ ドと精製シァニジン一 3—0—ダルコシドの製造
参考例 1で得られた粉末 40g (アントシァニン純度は 14.1 %であり、 アント シァニンの各成分割合は、 D3G ,D3R ,C3G及び C3Rはそれぞれ、 12.5%、 47.9%、 4.1 %及び 35.5%である。）を 50mM酢酸緩衝液 (pH3.5) 1Lに溶解してアントシ ァニン基質溶液とした。なお、基質溶液中のアントシァニンの含有量は計算では 5.64gであり、 D3G, D3R, C3G及び C3Rの含有量はそれぞれ 0.71g、 2.70g、 0.23g及び 2.00gとなる。
別途、 田辺製薬社製ヘスペリジナ一ゼ （商品名ヘスペリジナ一ゼ田辺二号） 79.35gを 50mM酢酸緩衝液 (pH3.5) 1Lに溶解しておき、 酵素溶液とした。 （ラ ムノシダーゼ活性 42.5U/mlに相当する）
基質溶液と酵素溶液をそれぞれ 40°Cに加温した後、 混合し反応を開始した。 反応は 40°Cで 6時間行い、 3% (W/V)リン酸溶液 2Lを加え反応を停止させた。 続いてイオン交換樹脂 XAD-7 (ロームアンドハース社製） 4 Lをカラム （内径 13 c m X 長さ 30 c m) に充填し、 その反応混合液 （4 L) を通液させ、 アントシァニン成分を吸着させた。 次に、 0.1% (W/V) TFA( 2 L)を通液し非吸 着成分を洗浄した。 さらに、 0.1%TFAを含む 80% (V/V) メタノール水溶液を 通液し、吸着成分を溶出した。 このメタノール溶液を口一タリーエバポレーター で濃縮し、 固形分濃度として 10% (W/V) になるように 3%リン酸水溶液に転 溶することにより濃縮液を得た。
本濃縮液を ODS-120Tシリカゲルカラムを用い （東ソ一社製、 ID5.5x30cm, 20μπι)、 0.1%TFAを含む 9% (V/V) ァセトニトリル水溶液で流速 80ml/分で 520nmの波長で検出し、 R.T. (Retention Time) が 66— 90分の D3G画分と 158-200分の C3G画分を得た。 これらの画分は、 HPLC分析により単一ピーク であり、 純度 99 %以上の精製デルフィ二ジン一 3— O—ダルコシドと精製シァ 二ジン- 3— O _ダルコシドを調製することが出来た。
なお、 純度測定の HPLC分析条件は以下の通りである。 即ち、 ヒューレット パッカ一ドシリーズ 1100(横川アナリチカルシステムズ社製) HPLCシステムを 用いて以下のようなグラジェン卜条件で分析を実施した。
HPLCグラジェント条件：
時間 (分） A液 （0.5%リン酸水溶液） B液 （メタノール）
0 80 20
15 77 23
20 77 23
30 50 50
40 50 50
カラムは、 ヒユーレツトパッカード'社製 Zoi'bax SB-C18, 4.6mm x 250nnn, 5μιηを用いた。 流速は lml/niin、 検出は波長 520nmで測定した。 標品の D3G および C3Gの R.T.はそれぞれ、 10.54分、 14.60分であった。
また、酵素反応前の基質溶液と酵素反応を停止させた溶液の一部を採取し、孔 径 0.45μιηのマイクロフィルタ一で異物を除去してアントシァニジンダルコシ ド液を調製した。反応前と反応後のアントシァニン成分の含有量を測定した。結 果は表 1に示したとおりである。基質溶液中のアントシァニジンルチノシドが分 解されてアントシァニジンダルコシドが生成し、アントシァニジンダルコシドの みの組成となっていることが示されている。しかも、反応前と比べて D3Gで 3.36 倍、 C3Gで 6.78倍に増加していることが示されている。
アントシァニン含有量の変化
D3G D3R C3G C3R
反 、目 0.71 g 2.70 g 0.23 g 2.00 g 反応後 2.39 g 0.00 g 1.56 g 0.00 g
実施例 2 結晶性デルフィ二ジン— 3— O—ダルコシド塩酸塩 ·水和物と結晶 性シァニジン- 3— O—ダルコシド塩酸塩 ·水和物の製造
実施例 1で得られた D3G画分と C3G画分をロータリーエバポレー夕一で濃 縮し、 30mlのヘプタンを加え再度濃縮乾固し、 分離操作中に混入する TFAを 除去した。 重量測定したところ、 得られた D3G画分は 1.51gであり、 C3G画分 は 0.98gであった。
上記の D3G画分及び C3G画分をそれぞれ別個に 5%塩酸/ 95%メタノ一ル に溶解後、 5°Cで 24時間静置し結晶化を行った。 桐山ロートと Whatman社製 N0.2の濾紙を用いて固液分離を行い、 さらに少量のアセトンで洗浄後乾燥し、 析出物を得た。 得られた両析出物は偏光顕微鏡で観察すると偏光が観測され結 晶形であることがわかった。 収量は結晶性 D3G塩酸塩が 1.06gであり、 結晶性
C 3G塩酸塩は 0.59gであった。
得られた結晶性 D3G塩酸塩と結晶性 C3G塩酸塩について NMRによる構造 決定を実施した。 これらの 2種のアントシァニンは従来報告のあるスぺクトル データと一致した。 また、 結晶性 D3G塩酸塩と結晶性 C3G塩酸塩のその他の物性値は以下の通 りである。
結晶性 D3G塩酸塩：
熱分析による融点： 258°C
UvA max(e) ： 517腿 (27500)
FAB-MS m/z ： M+ ： 465
組成式： C2iH2iOi2Cl · 0.5H2O
元素分析値： C H C1
根 ij定値： 48.00 4.50 6.80
計算値： 47.78 4.58 6.72
結晶性 C3G塩酸塩：
熱分析による融点： 245°C
UvA max(e) ： 510 nm (26300)
FAB-MS m/z ： M+ ： 449
組成式： C HsiOuCl · 0.5H2O
元素分析値： C H C1
測定値： 48.80 4.70 6.90
計算値： 49.57 4.73 6.93 実施例 3 ァーモンド由来の β -ダルコシダーゼを用いた精製デルフィニジ -3-0-ルチノシドと精製シァニジン- 3-0-ルチノシドの製造
参考例 1で得られた粉末 3.42gを 50mM酢酸緩衝液 (pH3.5)lLに溶解して、 アントシァニン基質溶液とした。
別途、 SIGMA社製のァ一モンド由来の ダルコシダ一ゼ 208gを 50mM酢 酸緩衝液 (pH3.5)l Lに溶解して酵素液とした （500U/mlに相当）。 基質溶液 1L を 40°Cで 10分間保温して温度を安定させた後、 酵素溶液 1Lを加えてよく攪拌 し反応を開始した。 60分経過後、 2Lの 0.3N塩酸を加え反応を停止した。 続いて反応を停止させた反応混合液 4Lを実施例 1に記載されている方法と 同様にイオン交換樹脂吸着によって処理して、 さらに、 ODSシリカゲルカラム を用いた HPLCによつて精製することにより R.T.が 69-96分の D3R画分と 144-174分の C3R画分を得た。
これらの画分は、 実施例 1記載の HPLC分析条件 （標品 D3Rおよび C3Rの R.T.はそれぞれ、 12.63分、 18.19分） で分析した結果、 上記 D3R画分と C3R 画分は単一ピークであった。 従って、 純度 99%以上の精製デルフィ二ジン- 3-0 -ルチノシドと精製シァニンジン- 3-0-ルチノシドが調製できた。
また、 HPLCにより測定した反応前の基質溶液と反応後の溶液におけるアン トシァニン含有量を表 2に示した。 表 2によればアントシァニジンダルコシド のみが分解され、 アントシァニジンルチノシドは大部分が分解されずに残って おり、 精製に最適な組成の反応液が得られていた。 表 2
アン卜シァニン含有量の変化
D3G D3R C3G C3R 反 、刖 60.3mg 231mg 19.8mg 171mg 反応後 5.6mg 207mg O.Omg 162mg
実施例 4 結晶性デルフィ二ジン一 3— O—ルチノシド塩酸塩 ·水和物と結晶 性シァニジン- 3一 O—ルチノシド塩酸塩 ·水和物の製造
実施例 2と同様の結晶化工程を経て、 析出物を得た。 得られた両析出物は 偏光顕微鏡で観察すると偏光が観測され結晶形であることがわかった。収量は結 晶 C3R塩酸塩が 58mgであり、 結晶 D3R塩酸塩が 88mgであつた。
得られた結晶性 D3R塩酸塩と結晶性 C3R塩酸塩について NMRによる構造 決定を実施した。これらの 2種のアントシァニンは従来報告のあるスぺクトルデ 一夕と一致した。
また、結晶性 D3R塩酸塩と結晶性 C3R塩酸塩の物性値は下記の通りである。 結晶性 D3R塩酸塩：
熱分析による融点： 224°C
Uv A max(e)： 520 nm (27800
FAB-MS m/z： M+： 611
組成式： C27H3iOi6Cl · 1.5H20
元素分析値： C H C1
測定値： 45.80 5.30 5.20
計算値： 45.86 5.38 4.98 結晶性 C3R塩酸塩：
熱分析による融点： 214〜226°C
UvA max(e)： 512腿 (27400)
FAB-MS m/z： M+： 595
組成式： C27H31Oi5Cl · 0.5H2O
元素分析値： C H C1
測定値： 50.00 5.30 5.30
計算値： 49.97 5.13 5.46 比較例 1 市販のアントシアナ一ゼを用いた酵素反応
参考例 1で得られた粉末 342mgを 50mM酢酸緩衝液 (ρΗ3·5) 100mlに溶解し て、 アントシァニン基質溶液とした。
別途、 果汁工業に用いられる代表的なアントシアナーゼの一種、
GIST-brocades社製 商品名 CYTOLASE PCL5を 50mM酢酸緩衝液 (pH3.5) で 10倍に希釈することにより酵素液を得た。
基質溶液 2mlを 40°Cで 10分間保温して温度を安定させた後、 酵素溶液 2ml を加えてよく攪拌し反応を開始した。 15分経過後 200μ1の反応液をサンプリン グし、 200μ1の 0.3Ν塩酸を加え反応を停止した。
反応前と反応後のアントシァニン組成を HPLCで測定した。 反応前後のアン トシァニンの含有量と組成を以下の表 3に示した。 アントシァニジンダルコシ ド、 アントシァニジンルチノシドの双方が分解されておりアントシァニン配糖 体の精製には適さないことが判明した。 表 3
アントシァニン含有量の変化
D3G D3R C3G C3R 反 、刖 0.60mg 2.31mg 0.2Qmg 1.71mg 反応後 0.23mg 0.09mg 0.26mg 0.04mg
産業上の利用の可能性
本発明により、天然物から精製する形で高純度の精製アントシァニン並びに結 晶性アントシァニン塩を製造することができた。このようにして製造された結晶 性アントシァニン塩は吸湿性を示さず、安定な性状であつた。
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願 2000-276540号の明細 書に記載された内容を包含する。 そして、本明細書中で引用した全ての刊行物、 特許、特許出願をそのまま参考として本明細書中に取り入れるものとする。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 少なくとも 1種以上のアントシァニジンルチノシドを含有するアントシァニ ン組成物にラムノシダーゼを作用させ、 アントシァニジンルチノシドをアン トシァニジンダルコシドに変換させた後、 アントシァニジンダルコシドを単 離し、 精製することを特徴とする、 精製アントシァニジンダルコシドを製造 する方法。
2. アントシァニン組成物がカシス、 イチジク、 コーヒー、 バナナ、 ブラックべ リ一から選択される一種以上の果実から得られる果汁および/またはァメリ 力マコモ、 サトイモから得られるアントシァニン濃縮物である請求項 1記載 の精製アントシァニジンダルコシドを製造する方法。
3. ラムノシダーゼがヘスペリジナーゼ、 ナリンジナーゼである請求項 1または 2記載の精製ァントシァニジンダルコシドを製造する方法。
4. 少なくとも 1種以上のアントシァニジンダルコシドとアントシァニジンルチ ノシドを含有するアントシァニン組成物に β -ダルコシダーゼを作用させて アントシァニジンダルコシドを減じせしめた後、 アントシァニジンルチノシ ドを単離し、 精製することを特徴とする、 精製アン卜シァニジンルチノシド を製造する方法。
5. アントシァニン組成物がカシス、 イチジク、 コーヒー、 バナナ、 ブラックべ リーから選択される一種以上の果実から得られる果汁および/またはァメリ 力マコモ、 サトイモから得られるアン卜シァニン濃縮物である請求項 4記載 の精製アントシァニジンルチノシドを製造する方法。
6. β -ダルコシダ一ゼがアントシァニジンルチノシドの j3 -グルコシド結合は分 解せずに、アントシァニジンダルコシドの -ダルコシド結合のみを選択的に 分解できる酵素である請求項 4または 5記載の精製アントシァニジンルチノ シドを製造する方法。
7. j3 -ダルコシダーゼがアーモンド由来の j3 -ダルコシダーゼである請求項 4乃 至 6記載の精製ァントシァニジンルチノシドを製造する方法。
8. 下記の工程を経て結晶性アントシァニジン- 3-0-ダルコシド塩酸塩，水和物を 製造する方法。
a)少なくとも 1 種以上のアントシァニジンルチノシドを含有するアントシァ 二ン組成物にラ厶ノシダ一ゼを作用させ、アントシァニジンルチノシドをアン トシァニジンダルコシドに変換する。
b ) 該アントシァニジンダルコシドを精製することにより純度 99%以上のァ ントシァニジンダルコシドを得る。
c ) 該アン卜シァニジンダルコシドを塩酸/アルコール系の混合溶媒を用いて 結晶化する。
9. 請求の範囲 8記載の b ) 工程の精製法がイオン交換吸着クロマトグラフィー および/または HPLCを用いた精製法である請求項 8記載の結晶性アントシ ァニジン- 3-0-ダルコシド塩酸塩 ·水和物を製造する方法。
10.塩酸/アルコール系の混合溶媒が 5% (V/V) 塩酸 /95% (V/V) メタノールで ある請求項 8または 9記載の結晶性アントシァニジン- 3-0-ダルコシド塩酸 塩 ·水和物を製造する方法。
11. 請求項 8乃至 10のいずれか 1項記載の方法で得られた結晶性アントシァニ ジン- 3-0-ダルコシド塩酸塩 ·水和物。
12.下記の工程を経て結晶性アントシァニジン- 3-0-ルチノシド塩酸塩 ·水和物 を製造する方法。
a)少なくとも 1 種以上のアントシァニジンダルコシドとアントシァニジンル チノシドを含有するアントシァニン組成物に βダルコシダーゼを作用させて アントシァニジンダルコシドを減じせしめる。
b ) 該アントシァニジンルチノシドを精製することにより純度 99%以上のァ ントシァニジンルチノシドを得る。
c ) 該アントシァニジンルチノシドを塩酸/アルコール系の混合溶媒を用いて 結晶化する。
13. 請求項 12記載の b ) 工程の精製法がイオン交換吸着クロマトグラフィーお よび/または HPLCを用いた精製法である請求の範囲 12記載の結晶性アント シァニジン- 3-0-ルチノシド塩酸塩 ·水和物を製造する方法。
14. 塩酸/アルコール系の混合溶媒が 5% (V/V) 塩酸 /95% (V/V) メタノールで ある請求項 12または 13記載の結晶性アントシァニジン- 3-O-ルチノシド塩 酸塩 ·水和物を製造する方法。
15. 請求項 12乃至 14のいずれか 1項記載の方法で得られた結晶性アントシァ 二ジン- 3-O-ルチノシド塩酸塩 ·水和物。
16. 下記の物理的性質を有する結晶性デルフィ二ジン- 3-0-ダルコシド塩酸塩 · 0.5水和物。
熱分析による融点：258°C
UvA max(e)： 517nm (27500)
FAB-MS m/z： M+： 465
組成式： C21H21O12CI · 0.5H2O
元素分析値： C H C1
視 ij定 ί直： 48.00 4.50 6.80
17.下記の物理的性質を有する結晶性シァニジン- 3-Ο-ダルコシド塩酸塩 · 0.5水 和物。 熱分析による融点： 245°C
UvA max(e) ： 510nm (26300)
FAB-MS m/z ： M+ ： 449
組成式： C21H21O11CI · 0.5H2O
元素分析値： C H C1
測定値： 48.80 4.70 6.90
18.下記の物理的性質を有する結晶性デルフィ二ジン- 3-0
1.5水和物。
熱分析による融点： 224°C
UvA max(s) ： 520謹 (27800)
FAB-MS m/z ： M+ ： 611
組成式： C27H31016C1 · I.5H2O
元素分析値： C H C1
測定値： 45.80 5.30 5.20
19.下記の物理的性質を有する結晶性シァニ 3-0-ルチノシド塩酸塩 · 0.5水 和物。
熱分析による融点： 214〜226°C
UvA max(e) ： 512讓 (27400)
FAB-MS m/z ： M+ ： 595
組成式： C27H3i015Cl · O.5H2O
元素分析値： C H C1
測定値： 50.00 5.30 5.30
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