WO2002022799A2

WO2002022799A2 - Verfahren zur mikrobiellen herstellung von stoffwechselprodukten, polynukleotide aus coryneformen bakterien sowie deren verwendung

Info

Publication number: WO2002022799A2
Application number: PCT/DE2001/003485
Authority: WO
Inventors: Michael Bott; Axel Niebisch; Brigitte Bathe; Achim Marx; Thomas Hermann
Original assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH; Degussa GmbH
Current assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH; Evonik Operations GmbH
Priority date: 2000-09-14
Filing date: 2001-09-08
Publication date: 2002-03-21
Anticipated expiration: 2003-03-14
Also published as: WO2002022799A3; US20040014180A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Stoffwechselprodukten, Polynukleotide aus coryneformen Bakterien sowie deren Verwendung. Durch das erfindungsgemässe Verfahren und die Polynukleotide ist es nunmehr möglich, die Synthese von ATP gezielt zu beeinflussen und damit auch die Synthese von Stoffwechselprodukten zu steuern. Die Erfindung betrifft für Cytochrom aa3 Oxidase und den Cytochrom bc1 Komplex kodierende Gene aus Corynebacterium glutamicum. Das monocistronische ctaD Gen kodiert für ein 65 kDa grosses Protein, dessen Primärstruktur alle typischen Eigenschaften der Untereinheit I der Cytochrom aa3 Oxidase aufweist. Die Gene, die für die Untereinheit III des Cytochroms aa3 (ctaE) und die drei charakteristischen Untereinheiten des Cytochrom bc1 Komplexes (qcrABC) kodieren, sind in einer Gruppe mit der Reihenfolge ctaE-qcrCAB angeordnet.

Description

B e s c h r e i b u n g

Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Stoffwechselprodukten, Polynukleotide aus coryneformen Bakterien sowie deren Verwendung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Stoffwechselprodukten, Polynukleotide aus coryneformen Bakterien sowie deren Verwendung. i Corynebacterium glutamicum ( C. glutamicum) , ein gram posi- tives Bodenbakterium mit einem hohen G+C Gehalt (54 mol%) , wird für die industrielle Produktion von Aminosäuren, insbesondere zur Produktion von L-Glutamat und L-Lysin eingesetzt. Der Syntheseweg dieser Aminosäuren, der Zentralstoffwechsel, welcher die relevanten Vorstufen bereitstellt sowie der Kohlenstoff-Fluss und der Stickstoff-Fluss dieses Organismus ist intensiv untersucht worden (Sahm et al . 1995; Eggeling und Sahm 1999) .

Wenig untersucht ist die Zusammensetzung und Leistungsfähigkeit der Atmungskette bei coryneformen Bakterien. Atmen- de Organismen können ATP durch oxidative Phosphorylierung synthetisieren. Dabei werden die bei der Oxidation von Substraten enstehenden Reduktionsäquivalente (H oder Elektronen) in die membranständige Atmungskette eingeschleust und die Elektronen letztendlich auf Sauerstoff oder andere ter- minale Elektronen-Akzeptoren übertragen. Energieerzeugende und ernergieverbrauchende Stoffwechselwege sind über ATP und das elektrochemische Protonenpotential bzw. das elektrochemische Natriumionen-Potential als universelle zelluläre Energieformen miteinander gekoppelt . Die Synthese von ATP kann entweder über Substratstufenphosphorylierung oder durch Elektronentransportphosphorylierung erfolgen. Der Aufbau des elektrochemischen Protonenpotentials erfolgt durch die Atmungskette oder die Hydrolyse von ATP durch die membranständige F₀Fι-ATP-Synthase . Die Komponenten der Atmungskette sind Enzyme, die i.d.R. kovalent oder nicht- kovalent gebundene niedermolekulare Gruppen enthalten, z.B. Flavine (Flavoproteine) , Eisen-Schwefel-Zentren (Eisen- Schwefel-Proteine) und Häm-Gruppen (Cytochrome) . Ein weiterer essentieller Bestandteil von Atmungsketten sind Chino- ne, d.h. niedermolekulare, membranständige Elektronen- und Protonenüberträger, wie z.B. Ubichinon und Menachinon.

In C. glutamicum ist hinsichtlich der Chinone der Atmungskette nur Menachinon (MK) bekannt . Neben der vorherrschenden Form MKH₂-9, d.h. dem reduzierten Chinon mit neun Isopren-Einheiten, gibt es auch geringe Mengen an MK-9 und MKH₂-8 (Collins et al . 1977). Bei C. glutamicum ATCC 13032 ließen sich anhand von reduziert-minus-oxidiert- Differenzspektren Cytochrome vom a-Typ (Absorptionsmaximum bei circa 600 nm) , vom b-Typ (Absorptionsmaximum bei circa 560 nm) und vom c-Typ (Absorptionsmaximum bei circa 550 nm) nachweisen (Trutko et al . 1982). Das CO-reduziert-minus- reduziert Differenzspektrum zeigte einen Peak bei 427 nm und einen weiteren bei 443 nm, was auf eine terminale Oxidase vom Cytochrom aa-Typ hinweist. Isolierte Membranen zeigten NADH- , NADPH-, Succinat- und Lactat-Oxidase- Aktivität, wobei NADH eine 5- bis 8-fach höhere Rate als die übrigen Substrate aufwies (Trutko et al . 1982; Matsushita et al . 1998) . Die Oxidase-Aktivität mit dem Elektronendonator Tetramethyl-p-phenylendiamin (TMPD) betrug ungefähr 50% der Aktivität, die mit NADH erhalten wurde, wohin- gegen die Rate der Cytochrom c-Oxidation nur 1% Oxidations- rate von NADH betrug. Mit dem TMPD-Oxidase-System lag der K_m Wert für Sauerstoff bei 56 μM, wohingegen das NADH- Oxidase-System zwei K_m Werte von 18 μM und 48 μM aufwies. Die TMPD-Oxidase-Aktivität , die mit der Cytochrom a- Fraktion von solubilisierten Membranproteinen assoziiert ist, wurde durch 0,1 mM Cyanid komplett inhibiert. Die NADH-Oxidase-Aktivität, die nur mit Membranen, nicht aber mit solubilisierten Membranproteinen erhalten wurde, wurde nur zu 50% durch 0 , 1 mM Cyanid inhibiert und sogar nach Behandlung mit ~5 mM Cyanid wurde noch eine Aktivität von 20% beobachtet (Matsushita et al . 1998). Ausgehend von diesen Ergebnissen kann auf das Vorhandensein von zwei terminalen Oxidasen geschlossen werden: (i) eine Cytochrom aa₂ termi- nale Oxidase, die durch mikromolare Konzentrationen von Cyanid inhibiert wird, eine geringe TMPD : Cytochrom c-Oxidase- Aktivität besitzt und einen K_m Wert von circa 50 μM für Sauerstoff aufweist; (ii) eine alternative Oxidase, die erst bei millimolaren Cyanid-Konzentrationen inhibiert wird, kein TMPD oxidiert und einen K_m Wert für Sauerstoff von etwa 20 μM aufweist.

Obwohl in den Redox-Differenzspektren kein Cytochrom d- spezifischer Peak beobachtet wurde (Trutko er al . 1982, Matsushita at al . 1998), weisen die Ergebnisse von Kusumoto et al . (2000) eindeutig darauf hin, daß die alternative Oxidase-Aktivität zumindest partiell von einer Menachinon- Oxidase vom jbd-Typ stammt. Redox-Differenzspektren zeigten neben den Peaks bei 550, 560, und 603 nm einen Peak bei 630 nm, welcher für Cytochrom d charakteristisch ist. Die auf- gereinigte Cytochrom bd Oxidase besteht aus zwei Polypepti- den mit einem Molekulargewicht von 556 und 42 kDa, wird durch Inkubation mit Menachinon aktiviert und zeigt einen Ki Wert von 5,3 mM für Cynid. Die cydAB Gene kodieren für die Untereinheit I und II de bd-Terminalen Oxidase und bilden ein Operon (Kusumoto et al . 2000) .

Nach diesen Daten besitzt C. glutamicum eine verzweigte Atmungskette mit mindestens zwei Ästen. Gemeinsam ist beiden die initiale Übertragung von Reduktionsäquivalenten von NADH, Succinat, Lactat oder Malat (Molenaar et al . 1998) auf Menachinon. Von dort können sie entweder auf den Cytochrom bcj_. Komplex, dessen Existenz durch die c-Typ Cytochrome nahegelegt wird, übertragen werden und anschließend auf die terminale Cytochrom aa₃-Oxidase. Alternativ können die Reduktionsäquivalente vom reduzierten Menachinon auf die terminale Cytochrom jbd-Oxidase übertragen werden. Um die unterschiedliche Funktion dieser beiden Wege und ihren Einfluß auf die Aminosäureproduktion zu untersuchen, ist es notwendig, Mikroorganismenstämme zu verwenden, denen entweder die Cytochrom aa₃-Oxidase oder die Cytochrom Jbd-Oxidase fehlt. Den Erfindern ist es gelungen, die Gene zu identifizieren, die für die Untereinheiten I und III der Cytochrom aa₃-Oxidase sowie für den Cytochrom Jbcj-Komplex kodieren. Das u.a. durch die Reaktionen der Atmungskette gewonnene

ATP ist der universelle Überträger chemischer Energie zwischen energieerzeugenden und energievebrauchenden Reaktionen und bedient so heterogene Prozesse wie die Synthese von Bausteinen und Makromolekülen. Energieerzeugende und erner- gieverbrauchende Stoffwechselwege können u. a. über den

Energiehaushalt der Zelle bzw. ihren ATP-Gehalt gesteuert werden.

Es ist daher Aufgabe der Erfindung, Substanzen zu finden und ein Verfahren zu schaffen, mit dem der Stoffwechsel von

Zellen reguliert werden kann. Es ist weiterhin Aufgabe der Erfindung, Substanzen zu finden, mit denen RNA, cDNA und DNA Sequenzen gefunden werden, die zur Isolation von Nukleinsäuren, Polynukleotiden oder Genen genutzt werden kön- nen.

Ausgehend vom Oberbegriff des Anspruchs 1 wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst mit den im kennzeichnenden Teil des Anspruchs 1 angegebenen Merkmalen. Weiterhin wird die Aufgabe ausgehend vom Oberbegriff des Anspruchs 9 erfindungs- gemäß gelöst mit den im kennzeichnenden Teil des Anspruchs 9 angegebenen Merkmalen. Die Aufgabe wird ferner ausgehend vom Oberbegriff des Anspruchs 15 erfindungsgemäß gelöst mit den im kennzeichnenden Teil des Anspruchs 15 angegebenen Merkmalen.

Durch die erfindungsgemäßen Polynukleotide und das Verfah- ren ist es nunmehr möglich, die Synthese von ATP durch

Elektronentransportphosphorylierung sowie den Aufbau des elektrochemischen Protonenpotentials über die Atmungskette gezielt zu beeinflussen und damit eine Steuerung der Synthese von StoffWechselprodukten zu ermöglichen. So kann beispielsweise die mikrobielle Produktion von StoffWechsel- Produkten wie beispielsweise Aminosäuren (L-Asparagin, L- Threonin, L-Serin, L-Glutamat, L-Glycin, L-Alanin, L- Cystein, L-Valin, L-Methionin, L-Isoleucin, L-Leucin, L- Tyrosin, L-Phenylalanin, L-Histidin, L-Lysin, L-Tryptophan, L-Arginin) organischen Säuren (Essigsäure, Citronensäure,

Isocitronensäure, Milchsäure, Bernsteinsäure, Fumarsäure, Ketoglutarsäure, Brenztraubensäure, Äpfelsäure) , Vitaminen, Nukleosiden, Nukleotiden und ein- oder mehrwertiger Alkohole durch Einstellung einer geeigneten Energieladung positiv beeinflußt werden. Weiterhin können die erfindungsgemäßen Polynukleotide als Hybridisierungssonden zum Auffinden von RNA, cDNA und DNA sowie zur Isolation von Nukleinsäuren, Polynukleotiden oder Genen verwendet werden.

Vorteilhafte Weiterbildungen sind in den Unteransprüchen angegeben . Die Figuren zeigen modellhaft die an der Atmungskette beteiligten Komponenten mit den zugehörigen Genen sowie experimentelle Ergebnisse der durchgeführten Methoden unter Verwendung der erfindungsgemäßen Polynukleotide:

Es zeigt:

Fig. 1: Darstellung der Genomregion von Corynebacterium glutamicum mit der ctaD Genregion (A) und der ctaE-qcrCAB Genregion (B) . Die DNA-Bereiche, die im Stamm 13032ΔctaD bzw. im Stamm 13032Δgcr deletiert wurden, sind markiert.

Fig. 2: Sequenzvergleich der Untereinheit I der Cytochrom aa₃ Oxidase aus C. glutamicum (vorliegende Erfindung) , M. tuberculosis (Cole et al . 1998), Streptomyces coelicolor und P. deni trificans (Raitio et al . 1990) . Aminosäuren, die in mindestens drei der vier Sequenzen identisch sind, wurden schwarz unterlegt, konservierte Aminosäure- Austausche wurden grau unterlegt. Die 12 Transmembran- Helices, die in der Kristallstruktur der Cytochrom aa₃ Oxidase von P. deni trificans identifiziert wurden (Iwata et al . 1995), sind durch schwarze Balken markiert. Die Histi- din-Reste, die als Liganden für Cu_B, Häm a und Häm a₃ dienen, sind mit Dreiecken, schwarzen Quadraten und offenen Quadraten dargestellt.

Fig. 3: Sequenzvergleich der Untereinheit III von Cytochrom aa₃ Oxidase aus C. glutamicum (vorliegende Erfindung) , M. tuberculosis (Cole et al . 1998), S . coelicolor and P. deni trificans (Raitio et al . 1990). Aminosäuren, die in mindestens drei der vier Sequenzen identisch sind, wurden schwarz unterlegt, konservierte Aminosäure-Austausche wur- den grau unterlegt. Die Transmembran-Helices I - VII, die in der Kristallstruktur der Cytochrom aa₃ Oxidase von P. deni trificans identifiziert wurden (Iwata et al . 1995), sind durch schwarze Balken markiert. Die für CtaE aus C. glutamicum (A - E) vorhergesagten Transmembran-Helices wer- den durch Doppellinien markiert. Fig. 4: Sequenzvergleich der Cytochrom c Untereinheit des bei Komplexes aus C. glutamicum (vorliegende Erfindung) , M. tuberculosis (Cole et al . 1998), S. coelicolor und Rind (Wakabayashi et al . 1982). Aminosäuren, die in mindestens drei der vier Sequenzen identisch sind, wurden schwarz unterlegt, konservierte Aminosäure-Austausche wurden grau unterlegt. Die Transmembran-Helix, die in der Kristallstruktur von Rinder-Cytochrom c identi iziert wurde (Xia et al . 1997; Zhang et al . 1998; Iwata et al . 1998), ist mit einem schwarzen Balken markiert. Die zwei möglichen Transmembran- Helices, die für QcrC aus C. glutamicum vorhergesagt wurden, sind durch Doppellinien dargestellt. Die beiden Häm- Bindungsmotive werden durch gefüllte Dreiecke markiert, potentielle Methionin-Liganden des QcrC Häm-Eisen-Atoms wer- den durch gefüllte Quadrate markiert, der nachgewiesene Me- thionin-Ligand des Rinder-Cytochrom c durch ein offenes Quadrat .

Fig. 5: Sequenzvergleich der Eisen-Schwefel-Protein Untereinheit des bc Komplexes aus C. glutamicum (vorliegende Erfindung), M. tuberculosis (Cole et al . 1998), S. coelicolor und Rind (Schägger et al . 1987) . Aminosäuren, die in mindestens drei der vier Sequenzen identisch sind, wurden schwarz unterlegt, konservierte Aminosäure-Austausche wurden grau unterlegt. Die Transmembran-Helix, die in der Kri- stallstruktur des Eisen-Schwefel-Proteins aus Rind identifiziert wurde (Xia et al . 1997; Zhang et al . 1998; Iwata et al . 1998), ist mit einem schwarzen Balken markiert. Die drei möglichen Transmembran-Helices, die für QcrC aus C. glutamicum vorhergesagt wurden, sind durch Doppellinien dargestellt. Die beiden Cystein-Reste, die eines der Eisen- Atome koordinieren, sind durch ausgefüllte Quadrate markiert, und diejenigen, die eine Disulfidbrücke bilden, durch Dreiecke. Die beiden Histidin-Reste, die das zweite Eisen-Atom koordinieren, sind durch offene Quadrate mar- kiert. Fig. 6: Sequenzvergleich der Cytochrom b Untereinheit des jCi Komplexes aus C. glutamicum (vorliegende Erfindung) , M. tuberculosis (Cole et al . 1998), S. coelicolor und Rind (Anderson et al . 1982). Aminosäuren, die in mindestens drei der vier Sequenzen identisch sind, wurden schwarz unterlegt, konservierte Aminosäure-Austausche wurden grau unterlegt. Die Transmembran-Helices I - VIII, die in der Kristallstruktur von Cytochrom b aus Rind identifiziert wurden (Xia et al . 1997; Zhang et al . 1998; Iwata et al . 1998), sind durch schwarze Balken markiert. Die Histidinreste, die als Liganden für die Häm-Eisen-Atome mit geringem (Jb_L) und hohem (b_α) Potential dienen, werden durch gefüllte und offene Quadrate markiert.

Fig. 7: Southern Blot Analyse der chromosomalen DNA von C. glutamicum Wild Typ (Spur 1) und der Mutante 13032ΔctaD

(Spur 2) . Genomische DNA geschnitten mit Sall und hybridisiert mit einem DIG-markierten 1.0 kb Sall Insert des pK19ms-ΔctaD als Sonde.

Fig. 8: Redox-Differenzspektren (Dithionit-reduziert minus Ferricyanid-oxidiert) von Membranen (30 mg Protein/ml) , die aus C. glutamicum ATCC13032 (Wt) , ATCC13032ΔctaD (ΔctaD) und ATCC13032Δgcr (Δqcr) isoliert wurden. Die Zellen wurden aerob in BHI-Medium mit 2 % (w/v) Glucose gezüchtet.

Fig. 9: Wachstum in CGXII-Minimalmedium mit 4% (w/v) Gluco- se von C. glutamicum ATCC13032 mit pWKO (offene Kreise), ATCC13032 mit pWKO-ctal? (gefüllte Kreise) , ATCC13032ΔctaD mit pWKO (offene Dreiecke) , und ATCC13032Δcta_D mit pWKO- ctaD (gefüllte Dreiecke) .

Fig. 10: C. glutamicum Proteine wurden durch SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese getrennt und anschliessend die Proteine mit einer kovalent gebundenen Häm-Gruppe, d.h. die c-Typ Cytochrome, durch Färbung mit Tetramethylbenzidin und H₂0₂ sichtbar gemacht (Thomas et al . 1980). Die Position von Cytochrom Ci ist angezeigt. Spur 1, Gesamtzellex- trakt (80 μg Protein) ; Spur 2, Membranen (50 μg Protein) von Stamm 13032 mit dem Plasmid pWKO; Spur 3, Membranen (50 μg Protein) von Stamm 13032ΔctaD mit dem Plasmid pWKO; Spur 4, Membranen (50 μg Protein) von Stamm 13032Δgcr mit dem Plasmid pJCl; Spur 5, vorgefärbter Protein-Standard (New England Biolabs) .

Fig. 11: Modell der verzweigten Atmungskette von C. gluta- mi cum .

Im Folgenden sollen die verwendeten Methoden beschrieben werden.

1. Kultivierung der verwendeten Mikroorganismen

In Tab. 1 und Tab. 2 sind die verwendeten Organismenstämme und Plasmide aufgelistet.

CoryneJbacte ium glutamicum wurde bei 30°C entweder in Luria Bertani (LB) Medium (Sambrook et al . 1989) oder in Brain Heart Infusion (BHI) Medium (Difco Laboratories, Detroit, USA) mit 2% (w/v) Glucose oder in CGXII Minimal Medium mit 4% Glucose als Kohlenstoff- und Energiequelle (Keilhauer et al . 1993) kultiviert. Falls erforderlich wurde Kanamycin (25 μg/ml) zugegeben. Esch.erich.ia coli (E. coli) wurde bei 37°C in LB Medium kul- tiviert. Gegebenenfalls wurde Kanamycin (50 μg/ml) oder Carbenicillin (100 μg/ml) zugegeben.

2. DNA-Isolation und Transformation

Chromosomale DNA aus C. glutamicum wurde wie bei Eikmanns et al . (1994) beschrieben isoliert. Plasmide aus E. coli wurden entweder mit dem QIAprep Spin Miniprep Kit von Quia- gen oder mit dem Plasmid Maxi Kit von Quiagen isoliert. E. coli wurde mit CaCl₂ nach der Methode von Cohen et al .

(1972) oder mittels Elektroporation nach Dower et al .

(1988) transformiert. C. glutamicum wurde wie bei van der Rest et al . (1999) durch Elektroporation transformiert.

3. DNA Sequenz Analyse

Die DNA-Sequenzanalyse wurde mittels der Didesoxynukleotid- Kettenabbruch-Methode (Sanger et al . 1977) unter Verwendung des Thermosequenase-Fluoreszenz-Sequenzierungs-Kits (Araer- sham Pharmacia Biotech) und Einsatz eines automatisierten DNA-Sequenzierers (LI-COR DNASequencer 4200, MWG-Biotech) durchgeführt. Alternativ dazu wurde die DNA durch MWG Bio- tech sequenziert. Die Sequenzvergleiche wurden mit Hilfe der Boxshade-Software schattiert. Die Vorhersage der Trans- membran Helices wurde mit der TopPred II-Software (Claros und von Heijne 1994) durchgeführt.

4. DNA Veränderungen

Restriktions-Enzyme, T4 DNA-Ligase, Klenow-Polymerase und Kälberdarm-alkalische Phosphatase wurden entweder von Röche Diagnostics oder New England Biolabs bezogen.

Für die Southern-Hybridisierung (Southern 1975) wurden 1 bis 5 μg genomische DNA oder 1 ng Plasmid DNA mit geeigneten Restriktions-Enzymen vollständig verdaut, auf einem 1%- igen Agarose-Gel fraktioniert und anschliessend mittels Vakuum-unterstützter Diffusion auf eine Nylon-Membran übertragen. Die Markierung der Proben mit Digoxigenin, die Hy- bridisierung, die Waschschritte und die Detektion wurden mit dem DIG Chem-Link Markierungs- und Detektionskit nach Anweisung des Herstellers Röche Diagnostics durchgeführt . Zur Größenmarkierung wurden die DIG-markierten DNA- Molekulargewichts-Marker II und III (Röche Diagniostics) eingesetzt.

Zur Kolonie-Hybridisierung wurden die Kolonien auf eine Nylon-Membran (Hybond-N+, Amersham Pharmacia Biotech) übertragen. Die Zell-Lyse und die Fixierung der DNA an die Membran wurde durch Autoklavieren (3 min bei 105°C) der Filter durchgeführt (Kullik und Giachino 1997) . Nach der Entfernung von Zelltrümmern durch Waschen mit 2xSSC (300 mM NaCl, 30 mM Na₃-Citrat, pH 7) wurden die Membranen direkt zur Prähybridisierung eingesetzt.

Für die routinemäßige PCR wurde die Taq-DNA-Polymerase ein- gesetzt. Um PCR-Produkte mit einer hohen Genauigkeit zu erhalten, wurde das Expand High Fidelity PCR System (Röche Diagnostics) eingesetzt. Für Standard-Reaktionen wurde eine 100 μl Lösung mit folgenden Komponenten eingesetzt: 0,5μM der beiden verwendeten Primer, 1 μg Matrizen-DNA, je 200 μM dATP, dGTP, dCTP, und dTTP sowie 2,5 U Taq-DNA-Polymerase . Für eine PCR mit degenerierten Primern wurde die Primer- Konzentration auf 4 μM erhöht. Die Reaktionen wurden in einem Primus 25 Thermocycler (MWG Biotech) durchgeführt. Zum Screening von E. coli-Transformanten nach der Anwesenheit von rekombinanten Plasmiden wurden einzelne Kolonien in 5 μl Wasser resuspendiert und anschliessend als Matrize in einen PCR-Ansatz mit insgesamt 20 μl Volumen eingesetzt. Um die Zellen zu lysieren und die Plasmid-DNA freizusetzen wurde der Ansatz vor Start der eigentlichen PCR 10 min bei 95°C inkubiert.

5. Herstellung von ctaD und qcrCAB Deletions-Mutanten

Eine „in-frame" ctaD Deletionsmutante von C. glutamicum wurde mit Hilfe der „Crossover"-PCR nach Link et al . (1997) und Einsatz des Suizid-Vektors pK19mojbsaαB, der nicht in C. glutamicum repliziert werden kann, hergestellt. Zunächst wurden zwei PCR-Produkte generiert, von denen eines die 5 flankierende Region von ctaD einschliesslich der ersten sechs ctaD-Kodons (Primer Paar ΔctaD-l/ΔctaD-2) umfasste und das andere die 3 ^{^}flankierenden Region von ctaD einschliesslich der letzten 16 ctaD-Kodons (Primer Paar ΔctaD- 3/ΔctaD-4) . Die Primer ΔctaD-1 und ΔctaD-4 enthalten eine Sall-Restriktionsschnittstelle am 5'Ende, während die Primer ΔctaD-2 und ΔctaD-3 am 5' -Ende 21 Basenpaare (bp) um- fassend „tagⁿ-Sequenzen enthielten, die zueinander komplementär waren (s. Tab. 2) .

Im zweiten Schritt werden die beiden resultierenden PCR- Produkte (543 bp und 534 bp) mit einem PCR-Reinigungs-Kit aufgereinigt . Anschließend wurden sie vermischt und als Ma- trize für die Crossover-PCR mit den Primern ΔσtaD-1 und ΔctaD-4 eingesetzt. Die beiden Matrizen-Fragmente können über die 21 Basenpaar lange komplementäre „tag"-Sequenz miteinander einen Doppelstrang bilden. Das resultierende Fusionsprodukt von 1056 Basenpaaren wurde mit Sall behan- delt, gereinigt und in den mit Sall verdauten und mit alka- φ m

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für eine Crossover-PCR mit den Primern Dqcr-1 und Dqcr-4 eingesetzt, wobei ein 1062 bp großes PCR-Produkt gebildet wurde. Nach Verdau dieses Fragments mit Sall und Behandlung mit alkalischer Phosphatase wurde es in den Vektor pK19mojbsacB kloniert, woraus das Plasmid pK19ms-Δgcr resultierte. Mit Hilfe dieses Plasmids wurde dann der Stamm 13032Δqcr konstruiert. Die erfolgreiche Deletion der qcrCAB-Gene wurde zunächst durch PCR mit genomischer DNA des Stammes und den Primmern Δqcr-1 und Δqcr-4 kontrol- liert und anschließend durch Southern-Blot-Analyse mit Sall-verdauter chromosomaler DNA und dem DIG-markierten 1.0- kb Sall-Fragment aus pK19ms-Δgcr als Sonde. In der Wildtyp- DNA wurde ein hybridisierendes Fragment von 12 kb detek- tiert, während in der Δgcr-Mutante ein hybridisierendes Fragment von 8 kb gefunden wurde. Damit konnte die Deletion des 3.7 kb gcrCAB-Fragments aus dem Chromosom bestätigt werden.

6. Membran-Isolation, Häm-Färbung und Differenz-Spektroskopie

10 g Zellmasse (Feuchtgewicht) wurden in 15 ml 100 mM

Tris/HCl, pH 7,5 mit 1 mM PMSF suspendiert. Es wurde ein Zellaufschluß durchgeführt, in dem die Suspension 5 mal bei

207 MPa durch eine French-Press (SLM Aminco) geleitet wurde. Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation bei 8000 g für 15 min entfernt. Der Überstand (zellfreier Extrakt) wurde für 90 min bei 150000 g erneut zentifugiert . Der Rückstand mit der Cytoplasmamembran wurde in 10 mM Tris/HCl bei pH 7,5 resuspendiert (60-80 mg Protein/ml) und für weitere Analysen aufbewahrt. SDS-PAGE wurde gemäß Laemmli (1970) durchgeführt mit der Ausnahme, daß die Proben zunächst für

30 min bei 40°C inkubiert wurden. Das Anfärben von Proteinen mit kovalent gebundenen Häm-Gruppen wurde mit Tetrame- thylbenzidin gemäß Thomas et al . (1980) durchgeführt. Dit- hionit-reduzierte minus Ferricyanid-oxidierte Differenz- Spektren wurden bei Raumtemperatur mit einem Jasco V560 Spektrophotometer, welches mit einem Silicium-Photodioden- Detektor für trübe Proben ausgestattet war, durchgeführt (Castiglioni et al . 1997). Dabei wurde eine Küvette mit einem 5 mm breiten Detektionsfenster eingesetzt. Die Protein- konzentration wurde mit dem Bicinchoninsäure (BCA) Protein Assay (Smith et al . 1985) und Rinderserum-Albumin als Standard durchgeführt .

Ausführungsbeispiele :

A) Identifizierung des ctaD-Gens, das für die Untereinheit I einer terminalen Oxidase der Häm-Kupfer-Familie kodiert

Reduziert-minus-oxidiert-Differenzspektren sowie C0- reduziert-minus-reduziert-Differenzspektren wiesen auf die Existenz einer Cytochrom c-Oxidase vom aa₃-Typ in C. gluta- micum hin (Trutko et al . 1982) . Um die zugehörigen Gene zu klonieren, wurde in der vorliegenden Erfindung die Tatsache genutzt, daß die Primärsequenz der Untereinheit I der Häm- Kupfer-Oxidasen, zu denen Cytochrom aa₃ gehört, hoch konserviert ist . Basierend auf früheren Sequenzvergleichen (Bott et al . 1990; Bott et al . 1992) wurden drei Regionen für die Ableitung von degenerierten Primern ausgewählt (Tab. 1) : WFFGHPE, welche einen der Cu_B Histidin-Liganden enthält (Primer ctaD-forl) ; VWAHHM, welche den zweiten Cu_B Histidin-Liganden enthält (Primer ctaD-for2, ctaD-rev2), und AHFHYV, welche einen Häm a und einen Häm a₃ Histidin- Liganden enthält (Primer ctaD-revl) . Mit chromosomaler C. glutamicum- DNA als Matrize wurden mit allen Primer- Kombinationen PCR Produkte der erwarteten Größe erhalten: ein 0,43 kb DNA Fragment mit ctaD-forl/ctaD-revl, ein 0,17 kb Produkt mit ctaD-forl/ctaD-rev2 und ein 0,28 kb Produkt mit ctaD-for2/ctaD-revl . Das 0,17 kb und das 0,28 kb große PCR Produkt wurden auch erhalten, wenn als Matrize das aufgereinigte 0,43 kb PCR-Produkt an Stelle der chromosomalen DNA eingesetzt wurde. Die abschließende Bestätigung, daß die PCR-Produkte einen Teil des ctaD-Gens darstellen, wel- ches für Untereinheit I einer Häm-Kupfer-Oxidase kodiert, wurde durch die Sequenzanalyse des 0,43-kb Fragments erhalten. Diese Analyse wurde nach Klonierung des 0,43-kb Fragments in den Vektor pCR2.1-TOPO, woraus das Plasmid pCR.2- ctaD resultierte, durchgeführt. Eine Southern-Blot-Analyse mit dem DIG-markierten 0,43-kb Fragment als Sonde zeigte, daß das ctaD Gen von C. glutamicum auf einem chromosomalen BamHI-Fragment von 3.5 kb, einem EcoRI-Fragment von 9.0 kb, einem HindiII-Fragment von 2.8 kb, einem Sa!I-Fragment von 5.2 kb und einem Xhol-Fragment von 8.0 kb lokalisiert war.

Um die vollständige ctaD-Gensequenz zu klonieren, wurde eine Cosmid-Genbank von C. glutamicum (Börmann et al . 1992) mit dem DIG-markierten 0,43-kb ctaD-Fragment hybridisiert. Cosmid-DNA einer der positiven Klone wurde mit EcoRI ver- daut und das dabei entstehende 9.0-kb Fragment wurde in pUC18 subkloniert, wodurch pUC18-CE entstand. Eine Restriktionsanalyse von pUC18-CE bewies, daß es das ctaD-Gen enthielt. Zur Sequenzanalyse wurde ein 4,0-kb EcoRl/NcoI Fragment und ein 2,4-kb Ncol/BamHI Fragment von pUC18-CE in pUC-BM20 kloniert und auf diese Weise die Plasmide pBM20- CEN sowie pBM20-CNB erhalten. Beide Stränge einer 3000 bp großen Region, die das ctaD-Gen umfasst, wurden mittels einer „Primer-Walking"-Strategie sequenziert. Die Sequenz- Analyse offenbarte drei Gene (Fig. 1A) : Position 1 bis 608 war identisch mit dem 3 '-Ende des nrdF Gens, welches für die ß-Untereinheit der Ribonukleotid-Reduktase kodiert (Oelmann und Auling 1999) . Das ctaD Gen, welches für die Untereinheit I einer Häm-Kupfer-Oxidase kodiert, beginnt 521 bp hinter dem nrdF Stopcodon bei Position 1129 mit ATG und endet an Position 2883 mit TAA.

B) Charakterisierung der Primärstruktur von CtaD

Das Protein, welches vom ctaD Gen abgeleitet wird, besteht aus 584 Aminosäuren mit einer molekularen Masse von 65102 Da. Durch den Sequenzvergleich (s. Fig. 2) ist erkennbar, daß das CtaD-Protein die Untereinheit I einer terminalen

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siert sind, und diejenigen, die als Liganden für das Häm- Eisen-Atom mit hohem Potential (Jbπ) dienen, an Position 117 und 219. Die Kristallstruktur des hei Komplexes aus Rinderherz (Xia et al. 1997; Iwata et al . 1998) zeigte, daß Cyto- chrom b acht Transmembran-Helices (TMH) enthält, die mit A bis H bezeichnet werden. Die Histidin-Liganden sind in B und D lokalisiert. Ausserdem gibt es noch vier „horizontale" Helices, die auf der positiven Seite der Membran lokalisiert sind (entspricht dem periplasmatischen oder ex- tracytoplasmatischen Raum bei Bakterien) , die mit ab, cdl, cd2, und ef bezeichnet werden. Hydrophobizitätsanalysen ergaben neun Transmembran-Helices für die QcrB Sequenzen aus C. glutamicum, M. tuberculosis und S. coelicolor. Die vierte dieser Helices korrespondiert mit den peripheren cdl und cd2 Helices. Die zwei größten Unterschiede zwischen der

QcrB Sequenz und der Sequenz von Cytochrom b aus Rind sind aus Fig. 6 ersichtlich: eine Ausdehnung von 17 Aminosäuren in dem extracytoplasmatischen Teil, der die Helices A und B verbindet, und eine große Domäne von ca. 120 Aminosäuren am C-Terminus von QcrB, welche in Cytochrom b aus Rinderherz nicht vorhanden ist. Diese zusätzliche C-terminale Domäne ist in allen zur Zeit bekannten Cytochrom b Sequenzen aus Corynebacterium- , Mycobacterium- und Streptomyces-Arten nachweisbar.

E) Konstruktion und Phänotyp einer C. glutamicum ctaD Dele- tions Mutante

Um nachzuweisen, daß das ctaD Genprodukt eine Untereinheit der Cytochrom aa₃ Oxidase ist und nicht einer zusätzlichen Oxidase aus der Häm-Kupfer-Superfamilie, die in C. glutami - cum vorhanden sein könnte, wurde eine Deletionsmutante konstruiert. Zu diesem Zweck wurde die Crossover-PCR (Link et al . 19979 und der Suizid-Vektor pK19mobsacB (Schäfer et al . 1994) eingesetzt. Im resultierenden Stamm 13032ΔctaD wurden die Codons 7 bis 569 von ctaD durch einen 21 bp großen Se- quenz-„Tag" ausgetauscht (s. Beschreibung der Methoden) . Um 95

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Die Identifizierung eines Cytochrom c in C. glutamicum mit zwei CXXCH-Motiven für eine kovalente Häm-Bindung deutet darauf hin, daß dieses Protein ein Di-Häm Cytochrom c ist. Eine mögliche Funktion der zweiten Häm Gruppe könnte der Elektronen- ransfer zur Cytochrom aa₃ Oxidase sein, wobei ein separates Cytochrom c ersetzt würde, welches normalerweise an diesem Prozeß beteiligt wäre. Um die Anzahl und Größe der c-Typ Cytochrome in C. glutamicum zu bestimmen, wurde eine Membran-Fraktion und eine lösliche Fraktion von Wildtyp-Zellen, die aerob in Vollmedium gezüchtet wurden, hergestellt. Aliquots beider Fraktionen wurden mittels SDS- PAGE getrennt und Proteine mit kovalent gebundenen Häm- Gruppen angefärbt (Thomas et al . 1980) . Wie in Fig. 10 erkennbar, wurde mit Hilfe dieser Methode in der Membranfrak- tion ein einzelnes c-Typ Cytochrom nachgewiesen, welches auf Grund der apparenten molekularen Masse von ca. 31 kDa mit Cytochrom c (molekulare Masse der Apo-Form 30 kDa) identisch sein könnte. Die gefärbte Bande mit der apparenten molekularen Masse von ca. 100 kDa repräsentiert eventu- eil die undissoziierte Form des bc Komplexes und nicht ein weiteres c-Typ Cytochrom. In der löslichen Fraktion von C. glutamicum konnten nach Anfärben keine Proteine mit kovalent gebundenen Häm nachgewiesen werden.

G) Konstruktion und Phänotyp einer C. glutamicum qcrCAB De- letionsmutante

Um nachzuweisen, daß das c-Typ Cytochrom mit einer apparenten molekularen Masse von 32 kDa tatsächlich Cytochrom c repräsentiert, wurde eine C. glutamicum qcrCAB Deletions- mutante konstruiert und durch Southern-Blot-Analyse kon- trolliert. Eine Häm-Färbung der Membranfraktion von Stamm 13032Δqcr nach SDS-PAGE zeigte, daß das 31-kDa-Häm-Protein fehlte und daher wie erwartet identisch ist mit Cytochrom Ci. Ein weiterer Unterstützung dafür ergab sich aus redu- ziert-minus-oxidiert Differenzspektren von Membranen von Stamm 13032Δgcr, in denen der 550-nm Peak für c-Typ Cyto-

sätzlichen Domäne des Cytochroms b von C. glutamicum ist noch ungeklärt .

Der interessanteste Gesichtspunkt innerhalb des Cytochrom bc Komplexes von C. glutamicum wurde im Cytochrom c_x ge- funden: im Gegensatz zum traditionellen bc_x Komplex wurden zwei CXXCH-Motive für die kovalente Bindung von Häm B in der Primärstruktur gefunden (Fig. 4) . Dies deutet mit großer Wahrscheinlichkeit darauf hin, daß das Protein ein Di- Häm und kein Mono-Häm c-Typ Cytochrom ist. Da Cytochrom c wahrscheinlich das einzige c-Typ Cytochrom in aerob gewachsenen Zellen von C. glutamicum darstellt (Fig.10), ist es naheliegend zu vermuten, daß die zweite Hämgruppe im Cytochrom c die Funktion eines zweiten c-Typ Cytochroms übernimmt und den Elektronentransfer vom Cytochrom c zum Cu_A- Zentrum der Untereinheit II der Cytochrom aa3 Oxidase übernimmt. Wenn diese Vermutung richtig ist, fungiert der Cytochrom bθ Komplex aus C. glutamicum (und eventuell auch aus M. tuberculosis und 8. coelicolor) als Menachinon-Cytochrom aa₃ Oxidoreduktase . Diese Funktion würde einen engen Kon- takt zwischen Cytochrom c und der Cu_A-Elektronen-

Eintrittsstelle im Cytochrom aa₃ erfordern. Es ist möglich, daß beide Komplexe einen Superkomplex bilden, wie er schon für P. deni trificans (Berry und Trumpower, 1985) , das ther- mophile Bakterium PS3 (Sone et al . 1987) und Mitochondrien (Schägger und Pfeiffer 2000; Cruciat et al . 2000) beschrieben wurde. Wenn kein bc_x- aa₃ Superkomplex gebildet wird, muß die Frequenz des Zusammenstoßens der beiden Komplexe in der Membran so schnell sein, daß eine ausreichend hohe Elektronentransfer-Rate erreicht wird. Ein Cytochrom bc_x Komplex mit einem Di-Häm Cytochrom Ci wird auch bei Heliob- acillus mobilis vermutet, da das petX Genprodukt zwei CXXCH Muster für die kovalente Häm-Bindung enthält (Xiong et al . 1998) .

In vielen Bakterien wie z. B. in P. deni trificans (Stein- rücke et al . 1991) oder Bradyrhizobium japonicum (Bott et al . 1990, 1992) wirkt sich die Deletion oder Inaktivierung der Cytochrom aa₃ Oxidase-Gene nicht signifikant auf das Wachstumsverhalten aus, da die Funktion von einer der anderen alternativen Oxidasen übernommen wird. Dagegen wuchs eine ctaD Deletionsmutante des C. glutamicum Stammes 13032 zwar gut in BHI Medium, aber extrem schlecht in Glucose- Minimalmedium (Fig. 9) . Obwohl der Grund für diesen Unterschied bisher noch nicht bekannt ist, so zeigt er doch die Bedeutung des bc_x-aa₃ Weges der Atmungskette für das Wachs- turn in Minimalmedium.

In Fig. 11 ist die verzweigte Atmungskette von C. glutami cum dargestellt. Das durch die Oxidation der Kohlenstoff- quellen gebildete NADH wird durch das Produkt des ndh Gens oxidiert (Zugangsnummer AJ238250) , welches für eine mem- brangebundene, nicht Protonen pumpende NADH-Dehydrogenase, bezeichnet als NDH-2, kodiert (Molenaar et al . 2000). Ob C. glutamicum auch eine Protonen-pumpende NADH Dehydrogenase (NDH-1) besitzt, wie sie durch die Existenz der Gene nuoü, nuoV und nuoW angedeutet wird, ist bisher nicht eindeutig geklärt. Neben der NADH Dehydrogenase existieren mindestens noch zwei weitere Enzyme, die Elektronen während des aeroben Wachstums zu Menachinon transportieren: die Succinat- Dehydrogenase und Malat:Chinon Oxidoreduktase (Molenaar et al . 1998) . Das durch diese Enzyme reduzierte Menachinon wird entweder durch den Cytochrom bc Komplex, welcher

Elektronen vermutlich direkt zur terminalen Cytochrom aa₃ Oxidase transportiert, oxidiert oder alternativ durch die Cytochrom bd terminale Oxidase. Diese beiden Wege unterscheiden sich hinsichtlich der bioenergetischen Effizienz. Entsprechend allgemein anerkannter Werte sollte das H⁺/2e^"- Verhältnis für den jcι-a ₃ Weg bei sechs liegen (Nicholls und Ferguson 1992) , wohingegen es für den Cytochrom bd terminierten Weg nur zwei betragen sollte (Miller und Gennis 1985; Puustinen et al . 1991) . Basierend auf diesen Annahmen liegt das P/O Verhältnis des Jbcι-aa₃ Wegs um den Faktor 3 über dem des Cytochrom bd Wegs . Bei der Beurteilung der Effizienz der Atmungskette von C. glutamicum müssen die Ergebnisse von Schirawski und Unden (1998) einbezogen werden, die darauf hindeuten, daß der Elektronentranport vom Succinat (E₀ = + 30 mV) zum Menachinon (E₀ = -80 mV) , katalysiert durch die Succinat

Dehydrogenase, einen revertierten Elektronentransport durch die Cytoplasmamembran beinhaltet, der durch das elektrochemische Protonenpotential angetrieben wird. D.h. , ein Teil des elektrochemischen Protonenpotentials, das durch die At- mung aufgebaut wird, müsste für die Oxidation von Succinat im Citratzyklus genutzt werden statt für die ATP-Synthese durch die F₀Fι-ATP-Synthase . Falls die Cytochrom bd Oxidase die einzige Kopplungsstelle in der Atmungskette darstellt, wie es vermutlich in der ActaD Mutante der Fall ist, wäre es möglich, daß C. glutamicum ATP ausschließlich über Substratstufenphosporylierung gewinnt und nicht über die oxidative Phosphorylierung.

Tab . 1 : Verwendete Bakterienstämme und Plasmide

Stamm/Plasmid Relevante Charakteristika Quelle oder Referenz

Stämme Escherichia coli DH5α F^" Φ80dlacZΔM15 A (lacZYA-argF) U169 Gibco BRL endAl recAl hsdRll deoR thi -1 supE44 λ^" gyrA96 relAl

TOP10 F^" Φ80lacZΔM15 AlacX74 mcrA A (mrr- Invitrogen hsdRMS- crBC) deoR recAl araD139 Δ(ara-Ieu) 7697 galU galK rpsL (Str^R) endAl nupG

Coryn ebacte- rium glutamicum ATCC13032 Wild Typ Abe et al. 1967 13032ΔctaD Markierte in-frame ctaD DeletionsThis work mutante von ATCC13032

13032Δςrcr Markierte qcrCAB Deletionsmutante This work von ATCC13032

Plasmide pCR2.1-TOPO Ap^R Km^R; Klonierungsvektor für PCR Invitrogen Produkte mit 3 ' -A-Überhang pUC18 Ap^R; Klonierungsvektor Yanish-Perron et al .

1985 pUC-BM20 Ap^R; Klonierungsvektor Boehringer Mannheim

pKl BmobsacB Km^R; mobiler E. coli Vektor für die Schäfer et al. 1994

Konstruktion von C. glutamicum In- sertions- und Deletionsmutanten pWKO Km^R; mobiler, low-copy number E. Reinscheid et al . 1994 coli -C. glutamicum Shuttle Vektor pCR2.1-ctaD Ap^R Km^R; pCR2.1-T0P0 abgeleitet vom Vorliegende Erfindung

0.43 kb ctaD PCR Fragment erhalten mit den Primern ctaD-forl und ctaD- revl

PUC18-CE Ap^R; pUC18 abgeleitet vom ctaD- Vorliegende Erfindung enthält 9 kb BcoRI Fragment aus Cosmid pHC79-ctaD pBM20-CEN Ap^R; pUC-BM20 abgeleitet vom 4.0 kb Vorliegende Erfindung EcoRI -Ncol Fragment aus pUC18-CE pBM20-CNB Ap^R; pUC-BM20 abgeleitet vom 2.4 kb Vorliegende Erfindung J\TcoI-Ba_ HI Fragment aus pUC18-CE pCR2.1-cta/qcr Ap^R; pCR2.1-TOPO abgeleitet mit dem Vorliegende Erfindung 2.2 kb PCR Fragment erhalten mit den Primern ctaE-for1 und qcrA-rev; enthält das 3 ' -Ende von ctaE, das komplette qcrC, und das 5 ' -Ende von qcrA pK19ms-ΔctaD Kan^R; pK19mojbsacB-Derivat, das ein Vorliegende Erfindung 1056 bp Crossover-PCR-Produkt in der Sall-Schnittstelle trägt, welches den 5'- und den 3'- flankierenden Bereich des C. gluta micum ctaD-Gens umfasst. pWKO-ctaD Kan^R; pWKO abgeleitet enthält ein Vorliegende Erfindung 2.53 kb Dral-Wael Fragment mit dem C. glutamicum ctaD Gene kloniert in die Sall Site nach einer Klenow fill-in Reaktion pK19ms-Δqcr Kan^R; pK19mojbsacB-Derivat, das ein 1062 bp Crossover-PCR-Produkt in der Sall-Schnittstelle trägt, welches den 5' -flankierenden Bereich von qcrC und den 3 ' -flankierenden Bereich von qcrB umfasst. pJCl Kan^R; E. coli -C. glutamicum Cremer et al. 1990 „Shuttle"-Vektor pJCl-bCπis Kan^R; pJCl-Derivat mit einem 5.0 kb Vorliegende Erfindung PCR-Fragment, das mit den Primern bc-h6-for und bc-h6-rev erhalten wurden und die C. glutamicum ctaE- qcrCAB-Gene entält. Das Fragment wurde in Sal -Xbal-verdauten pJCl- Vektor kloniert. Das qcrB-Gen trägt 6 zusätzliche Histidin-Codons am 3 ' -Ende Tab. 2: Verwendete Oligonucleotide

Name Sequence

CtaD- 5' -TTGTT(CT)TT(CT)GGICA(CT)CCIGA-3' [16-fold] forl ctaD- 5'-GTITGGGCICA(CT)CA(CT)ATGTT(CT) -3' [8-fold] for2 ctaD- 5' -AACAT(AG)TG(AG)TGIGCCCAIAC-3' [4-fold] rev2

CtaD- 5' -AC(AG)TA(AG)TG(AG)AA(AG)TGIGC-3' [16-fold] revl ctaE- 5' -ACIGGITT(CT)CA(CT)GGI (CT) TICA (CT) GT-3 ' [16-fold] forl ctaE- 5' -TA(CT)TA(CT)TGGCA(CT)TT(CT)GTIGA(CT) -3' [32 -f old]

for2

CtaE- 5'- (AG) TCIAC (AG) AA (AG) TGCCA (AG) TA (AG) TA- 3' [32 -f old]

revl qcrC- 5'- (AG) TT (AG) TG (AG) CAI (GC) (AT) IGC(AG)CA-3' [64-fold]

rev qcrA- 5' - (GC) (AT) (CT) TG(AG) TG (AG) CAIGG (AG) CA-3 ' [64-fold]

rev

ΔctaD-1 ⁵ ' -ACTGTCGACGGCTGTAGTTAACTGCAACCG-3 '

ΔctaD-2 5 ' -CCCATCCACTAAACTTAAACAAGGCGCCACAGCGGTCATAGG-3 '

ΔctaD-3 5 ' -TGTTTAAGTTTAGTGGATGGGCCAGAATTGGGTACCGCCCCA-3 '

ΔctaD-4 5 ' -ACTGTCGACGGTCTCGACACGCTCAGG-3 ' Δqcr- 1 5 ' -ACTGTCGACCTCAACGTGCCCTACGCAC

Δqcr-2 5 ' -CCCATCCACTAAACTTAAACATGGGGTCTGCGGGTTGGTTCC

Δqcr- 3 5 ' -TGTTTAAGTTTAGTGGATGGGGAGGCAAACATTGAGCGTGACAA

Δqcr-4 5 ' -TGAGTCGACCTGCAATTTCAGGAAACTTCC

bc-h6 - 5 ' -ACTTCTAGATAGGGTTGAGCATTTTGTC

for bc -h6 - 5 ' -AGTGTCGACCTAATGGTGATGGTGATGGTGAGCTGCGTTCTTGCCCTCATT rev CTTGTC

Fußnote :

Das verwendete "I" kennzeichnet Inosin . Wo zutreffend, wurde die Variabilität der Oligonukleotide in Klammern angegeben . Die Sall und Xbal Restriktions- schnittsteilen in den Oligonucleotiden ΔctaD-1 , Δcta_D-4 , Δgcr-1 , Δgcr-4 , bc- h6-for, bc-h6-rev und die koplementaren 21 bp tag Sequenzen in ΔctaO-2 und ΔσtaD-3 bzw. Δgσr-2 und Δgcr-3 sowie die sechs Histdin-Codons von bc-h6-rev sind unterstrichen .

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Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e

1. Isoliertes Polynukleotid aus coryneformen Bakterien, enthaltend eine für das ctaD-Gen kodierende Polynukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe

a) Polynukleotid, das mindestens zu 70% identisch ist mit einem Polynukleotid, das für ein Poly- peptid kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2 enthält,

b) Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die zu mindestens zu 70% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No . 2 ,

c) Polynukleotid, das komplementär ist zu den Po- lynukleotiden von a) oder b) , und

d) Polynukleotid, enthaltend mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide der Polynukleotidsequenz von a) , b) , oder c) ,

wobei das Polypeptid bevorzugt die Aktivität der Cytochrom aa₃ Oxidase Untereinheit I aufweist .

2. Isoliertes Polynukleotid aus coryneformen Bakterien, enthaltend eine für das ctaB-Gen kodierende Polynukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe

a) Polynukleotid, das mindestens zu 70% identisch ist mit einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 4 enthält,

b) Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die zu min- destens zu 70% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No . 4 ,

wobei das Polypeptid bevorzugt die Aktivität der Cytochrom aa₃ Oxidase Untereinheit III aufweist .

3. Isoliertes Polynukleotid aus coryneformen Bakterien, enthaltend eine für das gcrC-Gen kodierende Polynukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe

a) Polynukleotid, das mindestens zu 70% identisch ist mit einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 6 enthält,

b) Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die zu mindestens zu 70% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 6,

wobei das Polypeptid bevorzugt die Aktivität des Cytochrom c aufweist.

4. Isoliertes Polynukleotid aus coryneformen Bakterien, enthaltend eine für das gcrÄ-Gen kodierende Polynukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe

a) Polynukleotid, das mindestens zu 70% identisch ist mit einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 8 enthält,

b) Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die zu mindestens zu 70% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 8,

wobei das Polypeptid bevorzugt die Aktivität des Rieske Fe-S-Proteins aufweist.

5. Isoliertes Polynukleotid aus coryneformen Bakterien, enthaltend eine für das gcrB-Gen kodierende Polynukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe

a) Polynukleotid, das mindestens zu 70% identisch ist mit einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 10 enthält,

b) Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die zu mindestens zu 70% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 10,

c) Polynukleotid, das komplementär ist zu den Po- lynukleotiden von a) oder b) , und d) Polynukleotid, enthaltend mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide der Polynukleotidsequenz von a) , b) , oder c) ,

wobei das Polypeptid bevorzugt die Aktivität des Cytochrom b aufweist.

Isoliertes Polynukleotid aus coryneformen Bakterien, enthaltend eine für das nuoU-Gen kodierende Polynukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe

a) Polynukleotid, das mindestens zu 70% identisch ist mit einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 12 enthält,

b) Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die zu mindestens zu 70% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No . 12,

wobei das Polypeptid bevorzugt die Aktivität der NADH-Dehydrogenase Untereinheit U aufweist .

Isoliertes Polynukleotid aus coryneformen Bakterien, enthaltend eine für das nuoV-Gen kodierende Polynukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe

a) Polynukleotid, das mindestens zu 70% identisch ist mit einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 14 enthält, b) Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die zu mindestens zu 70% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 14,

wobei das Polypeptid bevorzugt die Aktivität der NADH-Dehydrogenase Untereinheit V aufweist

Isoliertes Polynukleotid aus coryneformen Bakterien, enthaltend eine für das nuoW-Gen kodierende Polynukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe

a) Polynukleotid, das mindestens zu 70% identisch ist mit einem Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 16 enthält,

b) Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die zu mindestens zu 70% identisch ist mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 16,

wobei das Polypeptid bevorzugt die Aktivität der NADH-Dehydrogenase Untereinheit W aufweist .

9. Verfahren zur Herstellung von Stoffwechselproduk- ten, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß man folgende Schritte durchführt :

a) Fermentation der das gewünschte Stoffwechselprodukt produzierenden Bakterien, in denen man eines oder mehrere der Gene ausgewählt aus der Gruppe ctaD, ctaE, qcrC, qcrA, qcrB, nuoU, nuoV und nuoW abschwächt oder verstärkt .

b) Anreicherung des gewünschten Stoffwechselprodukts im Medium oder in den Zellen der Bakterien, und

c) Isolieren des StoffWechselprodukts .

10. Verfahren gemäß Anspruch 9 d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß das Stoffwechselprodukt eine Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe L-Asparagin, L-Threonin, L- Serin, L-Glutamat, L-Glycin, L-Alanin, L-Cystein, L-Valin, L-Methionin, L-Isoleucin, L-Leucin, L- Tyrosin, L-Phenylalanin, L-Histidin, L-Lysin, L- Tryptophan und L-Arginin ist .

11. Verfahren gemäß Anspruch 9 d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß das Stoffwechselprodukt eine organische Säure vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe Essigsäure, Citronensäure, Isocitronensäure, Milchsäure, Bernsteinsäure, Fumarsaure, Ketoglutarsaure, Brenztrau- bensäure und Äpfelsäure ist .

12. Verfahren gemäß Anspruch 9 d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß das Stoffwechselprodukt ein Vitamin ist .

13. Verfahren gemäß Anspruch 9 d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß das Stoffwechselprodukt ein Nukleosid oder Nu- kleotid ist.

14. Verfahren gemäß Anspruch 9 d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß das Stoffwechselprodukt ein ein- oder mehrwertiger Alkohol ist.

15. Verfahren zum Auffinden von RNA, cDNA und DNA, um Nukleinsäuren, beziehungsweise Polynukleotide oder Gene zu isolieren, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß man die Polynu- kleotidsequenzen gemäß den Ansprüchen 1 bis 8 als Hybridisierungssonden einsetzt.

16. Verfahren gemäß Anspruch 15 d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß die Hybridisierung unter einer Stringenz entsprechend höchstens 2x SSC durchgeführt wird.