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WO2002012167A1 - Derivados de acido araquidonico con afinidad por el transportador de anandamida - Google Patents

Derivados de acido araquidonico con afinidad por el transportador de anandamida Download PDF

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WO2002012167A1
WO2002012167A1 PCT/ES2001/000305 ES0100305W WO0212167A1 WO 2002012167 A1 WO2002012167 A1 WO 2002012167A1 ES 0100305 W ES0100305 W ES 0100305W WO 0212167 A1 WO0212167 A1 WO 0212167A1
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WO
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subunit
heteroatoms
furan
alkylaryl
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PCT/ES2001/000305
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English (en)
French (fr)
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Maria Luz Lopez Rodriguez
Alma Viso Beronda
Silvia Ortega Gutierrez
Isabel Lastres Becker
Sara Gonzalez Rodriguez De Castro
Javier J. Fernandez Ruiz
Jose Antonio Ramos Atance
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Universidad Complutense de Madrid
Original Assignee
Universidad Complutense de Madrid
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    • C07D333/20—Radicals substituted by singly bound hetero atoms other than halogen by nitrogen atoms

Definitions

  • the present invention relates to products derived from arachidonic acid with affinity for the anandamide transporter.
  • Cannabis is among the most widespread drug abuse in the world. However, its active ingredients and synthetic analogues are now being considered for their therapeutic potential, due to the recent description in the animal organism of an endogenous cannabinoid system (Pertwee, RG Pharmacol. Ther. 1997, 74, 129).
  • This system is made up of at least two types of protein-coupled receptors that bind GTP, called CB-i (present mainly in the central nervous system) and CB 2 (present mainly in the immune system) (Howlett, A. O Annu. Rev. Pharmacol. Toxico !. 1995, 35, 607; Pertwee, RG Pharmacol. Ther.
  • the endocannabinoid system seems to play a modulating role in different physiological processes, mainly in the brain (Di Marzo, V .; Melck, D .; Bisogno, T .; De Petrocellis, L. Trends Neurosci. 1998, 21, 521; Fernández- Ruiz, J .; Berrendero, F .; Hernández, M. L; Ramos, - A. Trends Neurosci. 2000, 23, 14), although also in the immune systems (Parolaro, D. Life Sci. 1999, 65, 637) and cardiovascular (Wagner, JA; Varga, K .; Kunos, GJ Mol. Med. 1998, 76, 824).
  • endocannabinoids participate in the regulation of motor activity, nociception, neuronal communication, appetite as well as learning and memory processes (Di Marzo, V .; Melck, D .; Bisogno, T .; De Petrocellis, L Trends Neurosci. 1998, 21, 521; Sa ⁇ udo-Pe ⁇ a, M. C; Tsou, K .; Walker, JM Life Sci.
  • the AEA is synthesized from the hydrolysis caused by the phospholipase D of a membrane precursor (N-arachidonylphosphatidylethanolamine), and is released to the extracellular medium and recaptured by a transport system present in neurons and in sexual cells (Di Marzo, V .; Melck, D .; Bisogno, T .; De Petrocellis, L. Trends Neurosci. 1998, 21, 521). Once inside the cell, it is degraded by the action of a specific hydrolase for fatty acid amides [FAAH (Di Marzo, V .; Melck, D .; Bisogno, T .; De Petrocellis, L. Trends Neurosci. 1998, 21, 52)].
  • FAAH Di Marzo, V .; Melck, D .; Bisogno, T .; De Petrocellis, L. Trends Neurosci. 1998, 21, 52
  • cannabinoid receptor agonists have developed: (i) that have greater metabolic stability than the SAA, such as f? -Methanedamide (Khanolkar, AD; Makriyannis, A. Life Sci. 1999, 65, 607 ), (ii) with selective affinity for the different receptor subtypes, such as HU-308 (first selective CB 2 receptor agonist) (Hanus, L .; Breuer, A .; Tchilibon, S .; Shiloah, S. ; Golde ⁇ berg, D .; Horowitz, M .; Pertwee, RG; Ross, RA; Mechoulam, R .; Fride, EP Nati. Acad. Sci.
  • SAA such as f? -Methanedamide
  • HU-308 first selective CB 2 receptor agonist
  • FAAH inhibitors such as AM374, have been developed that can therefore prolong endocannabinoid activity (Gifford, AN; Bruneus, M .; Lin, SY; Goutopoulos, A .; Makriyannis, A .; Volkow, ND; Gatley, SJ Eur. J. Pharmacol. 1999, 383, 9).
  • the first endocannabinoid transporter inhibitors that act by enhancing their action in those processes whose completion involves a reuptake system (Beltramo, M .; Stella, N .; Calignano, A .; Un, SY; Makriyannis, have also been developed A .; Piomelli, D. Science 1997, 277, 1094).
  • the promising therapeutic applications for these inhibitors in the treatment of Huntington's chorea or multiple sclerosis have been described (Baker, D .; Pryce, G .; Croxford, J.
  • AM404 does not selectively act on the endocannabinoid transporter but may bind to other pharmacological targets such as vanilloid receptors (Zygmunt, PM; Chuang, H .; Movahed, P .; Julius D. ; Hógestátt, ED Eur. J. Pharmacol. 2000, 396, 39).
  • vanilloid receptors Zygmunt, PM; Chuang, H .; Movahed, P .; Julius D. ; Hógestátt, ED Eur. J. Pharmacol. 2000, 396, 39.
  • the metabolic fate of these inhibitors is another point to consider, as it has been described (Klaasen, CD Casarett &Doull's Toxicology The Basic Science of Poisons, 5th ed .; Me Graw-Hill Companies, Inc. USA, 1996; p.
  • X represents CO, CS or CH 2
  • Y represents CH 2 , O, S, NH or NR (R represents alkyl, alkylaryl or aryl)
  • Z represents H or an alkyl, alkylaryl or aryl group.
  • Heterocycle represents an aromatic monocyclic subunit or an aliphatic monocyclic subunit or its benzofused derivatives.
  • aromatic monocyclic subunit refers to an aromatic ring with one or two optionally substituted heteroatoms (with the provision that is not pyridine), e.g., thiophene, pyrrole, furan, isoxazole, substituted furan and the like.
  • aliphatic monocyclic subunit refers to an aliphatic ring containing one or two heteroatoms (with the provision that is not a 1,3-dioxolane system) and optionally substituted methylene units (with the provision that the substituent is not a hydroxyl group ).
  • the compounds described herein are capable of inhibiting the endocannabinoid transporter with greater potency than Structurally closer compounds known in the art. In addition, unlike these, they have a potential evolution to non-toxic metabolites, also exhibiting selectivity by the transporter against the CBi and CE ⁇ cannabinoid receptors and VR-
  • Noncommercial II and III derivatives are prepared following synthetic routes described in the literature (Hudiicky, M. Reductions in Organic Chemistry, 2 ⁇ d ed .; American Chemical Society: Washington DC, 1996; pp 187-190; Nahm, S .; Weinreb, SM Tetrahedron Lett. 1981, 22, 3815).
  • the final products have been structurally characterized by IR, NMR and quantitative elemental analysis techniques. For greater ease of handling when the final product is not crystalline it is transformed into a pharmaceutically acceptable salt, derived from an inorganic or organic acid.
  • reaction mixture was stirred at room temperature for "one hour” and then the solvent was removed using a vacuum pump, obtaining a solid residue that was redissolved in anhydrous methylene chloride (15 mL / mmol arachidonic acid), always under argon atmosphere. On the residue formed 10 equivalents of the corresponding derivative II dissolved in anhydrous methylene chloride (1 ml Jmmol) were added. The reaction was followed by thin layer chromatography (ccf) until the disappearance of the starting product using as eluent chloroform methanol, 95: 5. Finally, the reaction was hydrolyzed with distilled water (15 mL / mmol arachidonic acid).
  • Method B In a two-mouth flask, under an argon atmosphere, at 1 equivalent of arachidonic acid, (0.33 mmol, 111, 1 mg) (Sigma, 90% pure) in anhydrous methylene chloride (1.5 mL / mmol) and 1.5 equivalents of the corresponding derivative II dissolved in anhydrous methylene chloride (1 mL / mmol), cooled in an ice bath, a mixture of 1 equivalent (0.33 mmol, 68.1 mg) was added ) of dicyclohexylcarbodiimide (DCC) and 0.068 equivalents (0.022 mmol, 2.7 mg) of 4-dimethylaminopyridine (DMAP) in anhydrous methylene chloride (3 mL Jmmol DCC).
  • DCC dicyclohexylcarbodiimide
  • DMAP 4-dimethylaminopyridine
  • EXAMPLE 2 Determination of the inhibitory capacity of the endocannabinoid transporter
  • the determination of the ability of the different synthesized compounds to inhibit the reuptake of endocannabinoids has been carried out in cultures of the U937 human lymphoma cell line, using [ 3 H] -anandamide as a tracer in the presence or absence of different concentrations of each compound under study.
  • the anandamide reuptake assay was performed with intact cells in complete medium at a concentration of 10 6 cells / mL.
  • the cell suspensions (1 mL) were pre-incubated at 37 ° C for 10 minutes in the presence or absence of a concentration range (5x10 "5 -10 " 7 M) of the compound under study.
  • the inhibition of [ 3 H] -anandamide reuptake by the different compounds tested was determined by calculating the percentage of specific reuptake with respect to total reuptake in the absence of inhibitor. Specific reuptake was obtained after subtraction of quantified nonspecific reuptake in control experiments performed at 4 ° C. The IC 5 or for each compound was determined from the adjustment of the specific reuptake percentages found for each of the tested concentrations of the different compounds.
  • IC50 2.2 ⁇ 0.2 ⁇ M (Piomelli, D .; Beltramo, M .; Glasnapp, S .; Lin, SY; Goutopoulos, A .; Xie, X.-Q .; Makriyannis, AP Nati. Acad. Sci. USA. 1999, 96, 5802).
  • IC50 value 4 ⁇ 2 ⁇ M was obtained, which is in excellent agreement with the data previously described for this compound and confirmed the reliability of the assay.
  • Table 1 shows the data on the ability to inhibit the reuptake of anandamide expressed as IC50 ( ⁇ M) shown by the synthesized compounds, including that of AM404 as a reference value.
  • the determination of the binding capacity of the different compounds synthesized to the CB-] subtype of the cannabinoid receptor has been performed by in vitro radioligand displacement assays using rat cerebellum membranes and [ 3 H] -WIN55,212- 2 as a radioactive ligand.
  • incubation buffer 50 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA, 3 mM MgCI 2 and 5 mg / mL free fatty acid BSA
  • the specific binding of the compounds was calculated as the difference between total binding and non-specific binding.
  • Table 1 shows the receptor affinity data expressed as (nM) shown by the synthesized compounds, including as reference the affinity value of the WIN55,212-2 ligand.
  • Determining the binding capacity of the different compounds synthesized to subtype CB 2 cannabinoid receptor was performed using displacement assays vitro in radioligand using as membranes tissue cells HEK293 transfected with the receptor CB 2 human (commercial kit) and [ 3 H] -CP55,940 as a radioactive ligand.
  • the binding assay was performed in borosilicate tubes previously siliconized with Sigmacote.
  • the cell membranes were incubated in a final volume of 0.2 mL of 50 mM Tris-HCI buffer, 2.5 mM EGTA,
  • the specific binding of the compounds was calculated as the difference between total binding and non-specific binding.
  • the calculation of IC 50 has been performed as detailed in example 3.
  • Table 1 shows the receptor affinity data expressed as ⁇ (nM) shown by the synthesized compounds, including as reference the affinity value of the WIN55.212-2 ligand.
  • the determination of the binding capacity of the different synthesized compounds to the VR ⁇ subtype of the vanilloid receptor has been performed by in vitro radioligand displacement assays using rat spinal cord membranes and [ 3 H] -RTX as radioactive ligand as tissue.
  • the specific binding of the compounds was calculated as the difference between total binding and non-specific binding.
  • the calculation of IC 50 has been performed as detailed in example 3.
  • Table 1 shows the receptor affinity data expressed as K ⁇ (nM) shown by the synthesized compounds, including as reference the affinity value of the RTX ligand.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

La presente invención se refiere a los compuestos derivados de ácido araquidónico de formula general (I), así como a sus estereoisómeros y sus mezclas, y las sales y solvatos farmacéuticamente aceptables de todos ellos. También se describe un procedimiento para la preparación de los compuestos mencionados, la caracterización farmacología y las aplicaciones terapéuticas. En donde: X representa CO, CS o CH2; Y representa CH2, O, S, NH, o NR (R representa alquilo, alquilarilo o arilo), Z representa H o un grupo alquilo, alquilarilo o arilo. Heterociclo representa una subunidad monocíclica aromática o una subunidad monocíclica alifática constituida por uno o dos heteroátomos y unidades metilénicas o los derivados benzofusionados de ambas subunidades.

Description

TITULO
DERIVADOS DE ÁCIDO ARAQUIDÓNICO CON AFINIDAD POR EL TRANSPORTADOR DE ANANDAMIDA
La presente invención se refiere a productos derivados de ácido araquidónico con afinidad por el transportador de anandamida.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
El cannabis se encuentra entre las drogas de abuso de consumo más extendido en el mundo. Sin embargo, sus principios activos y análogos sintéticos están siendo ahora considerados por su potencial terapéutico, debido a la reciente descripción en el organismo animal de un sistema cannabinoide endógeno (Pertwee, R. G. Pharmacol. Ther. 1997, 74, 129). Este sistema está formado por al menos dos tipos de receptores acoplados a proteínas que unen GTP, llamados CB-i (presente principalmente en el sistema nervioso central) y CB2 (presente principalmente en el sistema inmune) (Howlett, A. O Annu. Rev. Pharmacol. Toxico!. 1995, 35, 607; Pertwee, R. G. Pharmacol. Ther. 1997, 74, 129), y por los ligandos endógenos que activan estos receptores (Martin, B. R.; Mechoulam, R.; Razdan, R. K. Ufe Sci. 1999, 65 , 573). Estos ligandos, llamados endocannabinoides, son principalmente derivados del ácido araquidónico como la araquidoniletanolamida (AEA), el 2-araquidonilglicerol (Martin, B.R.; Mechoulam, R.; Razdan, R.K. Life Sci. 1999, 65 , 573) y el araquidil 2-gliceril éter (Hanus, L; Abu-Lafi, S.; Fríde, E.; Brever, A.; Vogel, Z.; Shalev, D. E.; Kustanovich, I.; Mechoulam, R. P. Nati. Acad. Sci. USA 2001, 98, 3662).
El sistema endocannabinoide parece jugar un papel modulador en diferentes procesos fisiológicos, principalmente en el cerebro (Di Marzo, V.; Melck, D.; Bisogno, T.; De Petrocellis, L. Trends Neurosci. 1998, 21, 521; Fernández-Ruiz, J.; Berrendero, F.; Hernández, M. L; Ramos,- . A. Trends Neurosci. 2000, 23, 14), aunque también en los sistemas inmune (Parolaro, D. Life Sci. 1999, 65, 637) y cardiovascular (Wagner, J. A.; Varga, K.; Kunos, G. J. Mol. Med. 1998, 76, 824). En el cerebro, los endocannabinoides participan en la regulación de la actividad motora, de la nocicepción, de la comunicación neuronal, del apetito así como de los procesos de aprendizaje y memoria (Di Marzo, V.; Melck, D.; Bisogno, T.; De Petrocellis, L Trends Neurosci. 1998, 21, 521; Sañudo-Peña, M. C; Tsou, K.; Walker, J. M. Life Sci. 1999, 65, 703; Wilson, R. I.; Nicoll, R. A. Nature 2001, 410, 588; Di Marzo, V.; Goparaju, S. K.; Wang, L; Liu, J.; Bátkai, S.; Járai, Z.; Fezza, F.; Miura, G. I.; Palmiter, R. D.; Sugiura, T.; Kunos, G. Nature 2001 , 410, 822; Hampson, R. E.; Deadwyler, S. A. Life Sci. 1999, 65, 715), y en el desarrollo cerebral (Fernández-Ruiz, J.; Berrendero, F.; Hernández, M. L; Ramos, J. A. Trends Neurosci. 2000, 23, 14). Esto se ha demostrado a partir del estudio de la distribución de los receptores CBi en el cerebro y de los efectos neurobiológicos asociados a los cannabinoides sintéticos, naturales y a los propios endocannabinoides. Se sabe cómo los endocannabinoides son sintetizados, liberados, recaptados y degradados a nivel de las células nerviosas, lo que confirma su posible función como neuromoduladores (Di Marzo, V.; Melck, D.; Bisogno, T.; De Petrocellis, L. Trends Neurosci. 1998, 21, 521). La AEA se sintetiza a partir de la hidrólisis provocada por la fosfolipasa D de un precursor de membrana (N-araquidonilfosfatidiletanolamina), y es liberada al medio extracelular y recaptada por un sistema transportador presente en las neuronas y en las células guales (Di Marzo, V.; Melck, D.; Bisogno, T.; De Petrocellis, L. Trends Neurosci. 1998, 21, 521). Una vez dentro de la célula, es degradada por la acción de una hidrolasa específica para amidas de ácidos grasos [FAAH (Di Marzo, V.; Melck, D.; Bisogno, T.; De Petrocellis, L. Trends Neurosci. 1998, 21, 52 )]. Sin embargo, no se conoce la distribución exacta de las neuronas que producen AEA, lo que ha limitado hasta ahora el conocimiento de la función concreta de este endocannabinoide en los procesos cerebrales en los que ha sido implicado. Desdé la caracterización del sistema éndocannabinoide, se han realizado notables avances en la síntesis de compuestos con una acción selectiva sobre las proteínas claves del funcionamiento de este sistema (receptores, transportador, enzimas) y que pudieran ser susceptibles de usarse en algunas patologías (Pertwee, R. G. Expert Opin. Invest. Drugs 2000, 9, 1553). Estos compuestos podrían servir como una nueva línea de tratamiento farmacológico en diversas enfermedades para las que ya se han presentado las primeras evidencias de un posible efecto terapéutico de los cannabinoides. Entre éstos, se pueden destacar sus propiedades antinociceptivas (Calignano, A.; La Rana, G.; Giuffrida, A.; Piomelli, D. Nature 1998, 394, 277), su relevancia como agentes antiespásticos y antiespásmicos tanto en modelos de esclerosis múltiple (Baker, D.; Pryce, G.; Croxford, L. J.; Brown, P.; Pertwee, R. G.; Huffman, J. W.; Layward, L. Nature 2000, 404, 84) como en caso de lesiones a nivel de médula espinal (Pertwee, R. G. Current Med. Chem. 1999, 6, 635) y su eficacia como inhibidores del crecimiento de gliomas malignos (Galve-Roperh, I.; Sánchez, O; Cortés, M. L; Gómez del Pulgar, T.; Izquierdo, M.; Guzmán, M. Nat. Med. 2000, 6, 313).
En los últimos años, se han desarrollado agonistas de los receptores para cannabinoides: (i) que poseen mayor estabilidad metabólica que la AEA, como la f?-metanandamida (Khanolkar, A. D.; Makriyannis, A. Life Sci. 1999, 65, 607), (ii) con afinidad selectiva por los diferentes subtipos de receptor, como el HU-308 (primer agonista selectivo de los receptores CB2) (Hanus, L.; Breuer, A.; Tchilibon, S.; Shiloah, S.; Goldeπberg, D.; Horowitz, M.; Pertwee, R. G.; Ross, R. A.; Mechoulam, R.; Fride, E. P. Nati. Acad. Sci. USA 1999, 96, 14228), o (iii) que mejoran las condiciones de solubilidad acuosa de los cannabinoides, como el O-1057 (Pertwee, R. G. Expert Opin. Invest. Drugs 2000, 9, 1553). Estos compuestos podrían ser útiles en aquellas patologías en las que se ha demostrado una pérdida de actividad endocannabinoide. También se han desarrollado antagonistas selectivos de los receptores CBi y CB2 capaces de bloquear las acciones in vivo e in vitro de los cannabinoides y que serían útiles en aquellas disfunciones en las que sé postula una hipéractividad del sistema endocannabinoide (Pertwee, R. G. Expert Opin. Invest. Drugs 2000, 9, 1553). Otra serie de compuestos interesantes desde el punto de vista de su posible utilización terapéutica serían los inhibidores del proceso de terminación de la acción biológica de los endocannabinoides (Pertwee, R. G. Expert Opin. Invest. Drugs 2000, 9, 1553). Se han desarrollado inhibidores de la FAAH, como el AM374, que pueden, por tanto, prolongar la actividad endocannabinoide (Gifford, A. N.; Bruneus, M.; Lin, S. Y.; Goutopoulos, A.; Makriyannis, A.; Volkow, N. D.; Gatley, S. J. Eur. J. Pharmacol. 1999, 383, 9). También se han desarrollado los primeros inhibidores del transportador de endocannabinoides que actúan potenciando la acción de éstos en aquellos procesos cuya finalización implica un sistema de recaptación (Beltramo, M.; Stella, N.; Calignano, A.; Un, S. Y.; Makriyannis, A.; Piomelli, D. Science 1997, 277, 1094). En particular, se han descrito las prometedoras aplicaciones terapéuticas para estos inhibidores en el tratamiento del corea de Huntington o de la esclerosis múltiple (Baker, D.; Pryce, G.; Croxford, J. L; Brown, P.; Pertwee, R. G.; Makriyannis, A.; Khanolkar, A.; Layward, L; Fezza, F.; Bisogno, T.; Di Marzo, V. FASEB J. Express 10.1096/fj.00- 0399fje). Sin embargo, a pesar del enorme esfuerzo realizado hasta la fecha, el transportador no ha sido aún caracterizado a nivel molecular y únicamente se ha descrito un compuesto, el AM404, capaz de inhibir el transportador de una forma potente y selectiva [Cl50 = 2,2 ± 0,2 μM (Piomelli, D.; Beltramo, M.; Glasnapp, S.; Lin, S. Y.; Goutopoulos, A.; Xie, X.-Q.; Makriyannis, A. P. Nati. Acad. Sci. USA 1999, 96, 5802)]. Además, datos muy recientes apuntan que el AM404 no actúa de forma selectiva sobre el transportador de endocannabinoides sino que puede unirse a otras dianas farmacológicas como los receptores para vanilloides (Zygmunt, P. M.; Chuang, H.; Movahed, P.; Julius D.; Hógestátt, E. D. Eur. J. Pharmacol. 2000, 396, 39). Asimismo, el destino metabólico de estos inhibidores es otro punto a tener en cuenta, ya que ha sido descrita (Klaasen, C. D. Casarett & Doull's Toxicology The Basic Science of Poisons, 5th ed.; Me Graw-Hill Companies, Inc. USA, 1996; p. 345) la capacidad dé ciertos aminofenoles -compuestos que se generarían en la hidrólisis de inhibidores del tipo del AM404- para generar metahemoglobina tanto in vivo como in vitro. Por tanto, resulta fundamental disponer de nuevos inhibidores desprovistos de esta potencial toxicidad y que exhiban al mismo tiempo una elevada potencia y selectividad por el transportador de endocannabinoides, induciendo así un aumento en los niveles fisiológicos de estos ligandos con las interesantes aplicaciones terapéuticas que esto conlleva.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Según un aspecto de la presente invención se proporcionan compuestos de fórmula general I:
Figure imgf000006_0001
En donde:
X representa CO, CS o CH2
Y representa CH2, O, S, NH o NR (R representa alquilo, alquilarilo o arilo)
Z representa H o un grupo alquilo, alquilarilo o arilo Heterociclo representa una subunídad monocíclica aromática o una subunidad monocíclica alifática o sus derivados benzofusionados. El término subunidad monocíclica aromática se refiere a un anillo aromático con uno o dos heteroátomos opcionalmente sustituido (con la provisión que no es piridina), e.g., tiofeno, pirrol, furano, isoxazol, furano sustituido y semejantes. El término subunidad monocíclica alifática se refiere a un anillo alifático que contiene uno o dos heteroátomos (con la provisión que no es un sistema de 1 ,3-dioxolano) y unidades metilénicas opcionalmente sustituidas (con la provisión que el sustituyente no es un grupo hidroxilo).
Los compuestos que aquí se describen son capaces de inhibir el transportador de endocannabinoides con mayor potencia que los compuestos estructu raímente más próximos conocidos en la técnica. Además, a diferencia de éstos, presentan una potencial evolución a metabolitos no tóxicos exhibiendo asimismo selectividad por el transportador frente a los receptores de cannabinoides CBi y CE^ y de vanilloides VR-|.
Según otro aspecto de la presente invención se proporciona un procedimiento para la preparación de los compuestos de fórmula general I, según se representa en los Esquemas 1 y 2.
Figure imgf000007_0001
X = C0, Y = CH X = CO, Y = NH, NR, O, S- X = CS, Y = CH, > X = CS, Y = NH, NR, 0, SVv ] d
X = CH2, Y = NH, NR
Figure imgf000007_0002
z
Reactivos: (a) (COCIfe o DCC/D AP; (b) II: YH > — , ; (c) Reactivo Lawesson;
(d) LiAlHψ (e) NHCH3(0CH3); (f) III: "M ( = MgCI, Li)
^ LtÜl
Esquema 1
Figure imgf000008_0001
X= CH2, Y = 0 AA = y= /==' Λ' \-=,C5H11 z
Reactivos: (a) CHjPfOPhy; (b)II:HY"'H¡ΪD
Esquema 2
Las definiciones de X, Y, Z y heterociclo mostradas en estos Esquemas son idénticas a las realizadas anteriormente para los productos de la invención.
Los derivados no comerciales II y III se preparan siguiendo rutas sintéticas descritas en la literatura (Hudiicky, M. Reductions in Organic Chemistry, 2πd ed.; American Chemical Society: Washington DC, 1996; pp 187-190; Nahm, S.; Weinreb, S. M. Tetrahedron Lett. 1981 , 22, 3815).
Los productos finales se han caracterizado estructuralmente mediante técnicas de IR, RMN y análisis elemental cuantitativo. Para una mayor facilidad de manejo cuando el producto final no es cristalino se transforma en una sal aceptable farmacéuticamente, derivada de un ácido inorgánico u orgánico.
Se ha evaluado la capacidad para inhibir el transportador de endocannabinoides así como la afinidad receptorial CBi, CB2 y VRi de los compuestos de fórmula general I.
La determinación de la capacidad de los diferentes compuestos sintetizados para inhibir la recaptación de endocannabinoides se ha llevado a cabo en cultivos de la línea celular de linfoma humano U937 utilizando [3H]-anandamida como trazador, en presencia o ausencia de diferentes concentraciones de cada compuesto objeto de estudio.
La determinación de la afinidad ( ¡) de los compuestos de estructura general I por los dos subtipos de receptores de cannabinoides CB! y CB2 así como por el receptor de vanilloides VR^ se ha llevado a cabo mediante técnicas de desplazamiento de radioligandos in vitro, utilizando, respectivamente, los siguientes tipos de tejido y de radioligandos específicos: (a) receptores CBi, cerebelo de rata y [3H]-WIN55,212-2 (b) receptores CB2, membranas procedentes de células transfectadas con el receptor CB2 humano y [3H]-CP55,940 y (c) receptores VR-i, médula espinal de rata y [3H]resiniferatoxina ([3H]RTX).
MODO DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se ilustra con los siguientes ejemplos no limitativos.
EJEMPLOS
EJEMPLO 1 : Síntesis de los compuestos de fórmula general I
Procedimiento general:
Método A. En un matraz de dos bocas, bajo atmósfera de argón, a 1 equivalente de ácido araquidónico, (0,33 mmol, 111 ,1 mg) (Sigma, 90 % de pureza) en cloruro de metileno anhidro (1,5 mL/mmol) se le adicionó DMF anhidra (1 equivalente; 0,1 mL/mmoi), y cloruro de oxalilo (2 equivalentes; 0,2 mlJmmol) previamente disueltos en cloruro de metileno anhidro (0,5 mL mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante „ una hora y_ a continuación se eliminó el disolvente utilizando una bomba de vacío, obteniéndose un residuo sólido que se redisolvió en cloruro de metileno anhidro (15 mL/mmol de ácido araquidónico), siempre bajo atmósfera de argón. Sobre el residuo formado se añadieron 10 equivalentes del derivado II correspondiente disueltos en cloruro de metileno anhidro (1 mlJmmol). La reacción se siguió por cromatografía en capa fina (c.c.f.) hasta la desaparición del producto de partida utilizando como eluyente cloroformo.metanol, 95:5. Finalmente, la reacción se hidrolizó con agua destilada (15 mL/mmol de ácido araquidónico). A continuación, el crudo se extrajo con cloroformo (3 x 10 mL/mmol de ácido araquidónico) y se lavó con una disolución saturada de cloruro sódico. La fase orgánica se secó sobre sulfato magnésico anhidro, eliminando después el disolvente a presión reducida. Finalmente, el crudo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice utilizando el eluyente adecuado.
Método B. En un matraz de dos bocas, bajo atmósfera de argón, a 1 equivalente de ácido araquidónico, (0,33 mmol, 111 ,1 mg) (Sigma, 90 % de pureza) en cloruro de metileno anhidro (1,5 mL/mmol) y 1 ,5 equivalentes del derivado II correspondiente disueltos en cloruro de metileno anhidro (1 mL/mmol), enfriado en baño de hielo, se le añadió una mezcla de 1 equivalente (0,33 mmol, 68,1 mg) de diciclohexilcarbodiimida (DCC) y 0,068 equivalentes (0,022 mmol, 2,7 mg) de 4-dimetilaminopiridina (DMAP) en cloruro de metileno anhidro (3 mLJmmol DCC). La mezcla de reacción se agitó a esta temperatura durante cinco minutos y después a temperatura ambiente, siempre bajo atmósfera de argón, siguiéndose por c.c.f. hasta la desaparición del producto de partida utilizando como eluyente cloroformo:metanol, 95:5. A continuación, se filtró la diciclohexilurea formada y el disolvente se eliminó a presión reducida. El residuo así obtenido se redisolvió en cloruro de metileno anhidro (20 mL/mmol) lavándose consecutivamente con una disolución de ácido clorhídrico 0,5 M y con disolución saturada de cloruro sódico. La fase orgánica se secó sobre sulfato magnésico anhidro, eliminando después el disolvente a presión reducida. Finalmente, el crudo se purificó por cromatografía en columna dé gel de sílice utilizando el eluyente adecuado. Síntesis del eicosa-5,8.11.14-tetraenoato de 2-furilmetilo, 1.
Siguiendo el método A, se obtuvo 1 coma aceite con un rendimiento del 57%.
1H-RMN (200 MHz, CDCI3-δ): 0,78 (t, 3H, J = 6,8 Hz), 1 ,15-1,36 (m, 6H), 1 ,60 (qt, 2H, J = 7,5 Hz), 1 ,93-2,08 (m, 4H), 2,28 (t, 2H, J = 7,4 Hz), 2,74 (m, 6H), 4,99 (s, 2H), 5,30 (m, 8H), 6,35 (dd, 1H, J = 3,2, 1,8 Hz), 6,39 (dm, 1 H, J = 3,1 Hz) 7,41 (dd, 1 H, J = 1 ,8, 0,8 Hz).
Síntesis del eicosa-5.8.11 ,14-tetraenoato de 3-furilmetilo, 2. Siguiendo el método A, se obtuvo 2 como aceite con un rendimiento del 55%.
1H-RMN (300 MHz, CDCI3-δ): 0,88 (t, 3H, J = 6,6 Hz), 1 ,22-1,37 (m, 6H), 1 ,70 (qt, 2H, J = 7,5 Hz), 2,07 (m, 4H), 2,32 (t, 2H, J = 7,5 Hz), 2,80 (m, 6H), 4,97 (s, 2H), 5,35 (m, 8H), 6,41 (m, 1H), 7,38 (m, 1H), 7,45 (m, 1 H).
Síntesis del (+)-eicosa-5.8.11 ,14-tetraenoato de 2-tetrahidrofurilmetilo, 3.
Siguiendo el método A, se obtuvo 3 como aceite con un rendimiento del 48%. H-RMN (300 MHz, CDCI3-δ): 0,86 (t, 3H, J = 6,9 Hz), 1 ,22-1,38 (m, 6H), 1 ,53-1 ,63 (m, 2H), 1 ,70 (qt, 2H, J = 7,5 Hz), 1 ,83-1 ,95 (m, 2H) 1 ,98-2,12 (m, 4H), 2,33 (t, 2H, J = 7,6 Hz), 2,76-2,82 (m, 6H), 3,74 (m, 1H), 3,79 (m, 1H), 3,92 (m, 1 H), 4,05-4,20 (m, 2H), 5,32-5,35 (m, 8H).
Síntesis del (+)-eicosa-5.8,11 ,14-tetraenoato de 3-tetrahidrofurilmetilo, 4. Siguiendo el método A, se obtuvo 4 como aceite con un rendimiento del 38%.
1H-RMN (200 MHz, CDCI3-δ): 0,88 (t, 3H, J = 6,8 Hz), 1,30 (m, 6H), 1 ,54- 1 ,77 (m, 3H), 1 ,95-2,16 (m, 5H), 2,32 (t, 2H, J = 7,8 Hz), 2,50-2,64 (m, 1H), 2,78-2,86 (m, 6H), 3,56 (dd, 1 H, J = 8,8, 5,6 Hz), 3,69-4,13 (m, 5H), 5,26- 5,41 (m, 8H). Síntesis del eicosa-5.8.11.14-tetraenoato de 2-tienilmetilo. 5.
Siguiendo el método A, se obtuvo 5 como aceite con un rendimiento del 49%.
1H-RMN (300 MHz, CDCI3-δ): 0,88 (t, 3H, J = 6,9 Hz), 1,25-1,37 (m, 6H), 1 ,70 (qt, 2H, J = 7,5 Hz), 2,07 (m, 4H), 2,33 (t, 2H, J = 7,8 Hz), 2,75-2,84 (m, 6H), 5,26 (s, 2H), 5,35 (m, 8H), 6,97 (dd, 1H, J = 5,1, 3,6 Hz), 7,08 (d, 1H, J = 3,3 Hz), 7,30 (d, 1 H, J = 5,4 Hz).
Síntesis del eicosa-5,8,11,14-tetraenoato de 3-tienilmetilo, 6. Siguiendo el método A, se obtuvo 6 como aceite con un rendimiento del 89%.
1H-RMN (300 MHz, CDCI3-δ): 0,88 (t, 3H, J = 7,2 Hz), 1,29 (m, 6H), 1 ,71 (qt, 2H, J = 7,5 Hz), 2,07 (m, 4H), 2,34 (t, 2H, J = 7,5 Hz), 2,75-2,84 (m, 6H), 5,11 (s, 2H), 5,30-5,41 (m, 8H), 7,07 (dd, 1H, J = 4,8, 1,2 Hz), 7,28-7,31 (m, 2H).
Síntesis de la Λ/-(2-furilmetil)eicosa-5.8.11.14-tetraenamida. 7.
Siguiendo el método A, se obtuvo 7 como aceite con un rendimiento del 57%. 1H-RMN (300 MHz, CDCI3-δ): 0,87 (t, 3H, J = 6,8 Hz), 1 ,24-1,28 (m, 6H), 1,75 (qt, 2H, J = 7,1 Hz), 1,97-2,22 (m, 6H), 2,79 (m, 6H), 4,41 (d, 2H, J = 5,4 Hz), 5,35 (m, 8H), 5,83 (s ancho, 1H), 6,20 (dm, 1H, J = 7,4 Hz), 6,30 (m, 1H), 7,30 (m, 1 H).
Síntesis de la (±)-Λ-(2-tetrahidrofurilmetil)eicosa-5.8,11.14-tetraenamida. 8. Siguiendo el método A, se obtuvo 8 como aceite con un rendimiento del 83%.
1H-RMN (300 MHz, CDCI3-δ): 0,85 (t, 3H, J = 6,0 Hz), 1,22-1,35 (m, 6H),
1,46-1,55 (m, 1H), 1 ,71 (qt, 2H, J = 7,8 Hz), 1,87 (m, 4H), 1 ,97-2,11 (m, 3H), 2,16 (t, 2H, J = 7,2 Hz), 2,76-2,82 (m, 6H), 3,07 (ddd, 1H, J = 13,5, 7,5, 4,5
Hz), 3,57 (ddd, 1H, J = 13,8, 6,6, 3,3 Hz), 3,70 (q, 1H, J = 6,9 Hz), 3,81 (q, 1 H, J = 6,6 Hz), 3,91 (qd, 1 H, J = 7,5, 3,3 Hz), 5,26-5,39 (m, 8H) 5,81 (s ancho, 1 H).
Síntesis de la Λ/-(3-furilmetil)eicosa-5,8.11.14-tetraenamida, 9. Siguiendo el método A, se obtuvo 9 como aceite con un rendimiento del 45%.
1H-RMN (200 MHz, CDCI3-δ): 0,88 (t, 3H, J = 6,0 Hz), 1 ,22-1,35 (m, 6H), 1 ,73 (qt, 2H, J = 7,4 Hz), 2,00-2,23 (m, 6H), 2,80 (m, 6H), 4,28 (d, 2H, J = 5,6 Hz), 5,36 (m, 8H), 5,58 (s ancho, 1 H), 6,36 (m, 1 H), 7,37 (m, 2H).
Síntesis de la /V-r2-(1-metilpirrolil)met¡neicosa-5.8.11.14-tetraenamida. 10.
Siguiendo el método A, se obtuvo 10 como aceite con un rendimiento del 48%.
1H-RMN (200 MHz, CDCI3-δ): 0,88 (t, 3H, J = 6,0 Hz), 1 ,25-1,39 (m, 6H), 1 ,72 (qt, 2H, J = 7,3 Hz), 2,00-2,24 (m, 6H), 2,81 (m, 6H), 3,57 (s, 3H), 4,43 (d, 2H, J = 5,1 Hz), 5,36 (m, 8H), 5,43 (s ancho, 1H), 6,06 (d, 2H, J = 2,4 Hz), 6,61 (t, 1H, J = 2,2 Hz).
Síntesis de la /V-(2-tienilmetil)eicosa-5,8,11 ,14-tetraenamida, 11. Siguiendo el método A, se obtuvo 11 como aceite con un rendimiento del 72%.
1H-RMN (300 MHz, CDCI3-δ): 0,92 (t, 3H, J = 6,6 Hz), 1,33 (m, 6H), 1 ,75 (qt, 2H, J = 7,4 Hz), 2,05-2,17 (m, 4H), 2,22 (t, 2H, J = 7,5 Hz), 2,84 (m, 6H), 4,61 (d, 2H, J = 5,4 Hz), 5,32-5,39 (m, 8H), 6,08 (s ancho, 1H), 6,96 ( , 2H), 7,22-7,24 (m, 1 H).
Síntesis del (±)-eicosa-5.8,11.14-tetraenoato de 1-(2-furil)etilo, 12.
Siguiendo el método B, se obtuvo 12 como aceite con un rendimiento del 68%. 1H-RMN (300 MHz, CDCl3-δ): 0,87 (t, 3H, J = 6,8 Hz), 1 ,24-1,36 (m, 6H), 1,56 (d, 3H, J - 6,9 Hz), 1,68 (qt, 2H, J = 7,5 Hz), 2,00-2,11 (m, 4H), 2,30 (t, 2H, J = 7,5 Hz), 2,74-2,83 (m, 6H), 5,28-5,42 (m, 8H), 5,96 (q, 1H, J = 6,6 Hz), 6,28-6,32 (m, 2H), 7,35-7,36 (m, 1H).
Síntesis del (RH+ eicosa-δ.δ.H .H-tetraenoato de 1-(2-fur¡l)etilo. 13. Siguiendo el método B, se obtuvo 13 como aceite con un rendimiento del 55%.
Los datos de 13 coinciden con el racémico 12 exceptuando la rotación óptica con un valor de [α]D 20= + 29,6 (c = 3,0, EtOH).
Síntesis del (SH-)-eicosa-5,8,11,14-tetraenoato de 1-(2-furil)etilo. 14.
Siguiendo el método B, se obtuvo 14 como aceite con un rendimiento del 55%.
Los datos de 14 coinciden con el racémico 12 exceptuando la rotación óptica con un valor de [α]D 20 = - 31 ,7 (c = 2,9, EtOH).
Síntesis del eicosa-5,8,11.14-tetraenotioato de S-2-furilmetilo, 15.
Siguiendo el método B, se obtuvo 15 como aceite con un rendimiento del 59%.
1H-RMN (200 MHz, CDCI3-δ): 0,89 (t, 3H, J = 6,6 Hz), 1,25-1,40 (m, 6H), 1,75 (qtm, 2H, J = 7,3 Hz), 2,01-2,16 (m, 4H), 2,58 (t, 2H, J = 7,8 Hz), 2,76- 2,86 (m, 6H), 4,15 (s, 2H), 5,27-5,47 (m, 8H), 6,21 (dq, 1 H, J = 3,2, 0,7 Hz), 6,28 (dd, 1 H, J = 3,2, 1 ,7 Hz) 7,32 (dd, 1 H, J = 1 ,7, 0,7 Hz).
EJEMPLO 2: Determinación de la capacidad inhibitoria del transportador de endocannabinoides
La determinación de la capacidad de los diferentes compuestos sintetizados para inhibir la recaptación de endocannabinoides se ha llevado a cabo en cultivos de la línea celular de linfoma humano U937, utilizando [3H]-anandamida como trazador en presencia o ausencia de diferentes concentraciones de cada compuesto objeto de estudio. El ensayo de recaptación de anandamida se realizó con células intactas en medio completo a una concentración de 106 células/mL. Las suspensiones de células (1 mL) se preincubaron a 37 °C durante 10 minutos en presencia o ausencia de un intervalo de concentraciones (5x10"5-10"7 M) del compuesto objeto de estudio. A continuación las muestras se incubaron a 37 °C durante 7 minutos en un medio con una concentración final de anandamida de 100 nM, de la cual 0,45 nM corresponde a [3H]-anandamida (220 Ci/mmol). La incubación se terminó mediante filtración a vacío de la suspensión de células utilizando filtros Whatman GF/C, previamente equilibrados en un disolución de albúmina de suero bovino al 0,25 %. Las células retenidas en el filtro se lavaron cuatro veces con una disolución de albúmina de suero bovino (BSA) libre de ácidos grasos al 1 % en tampón Krebs-Hepes (pH = 7,4) y la radioactividad correspondiente a la [3H]- anandamida recaptada por las células se midió en un contador de centelleo β.
La inhibición de la recaptación de [3H]-anandamida por los diferentes compuestos ensayados se determinó mediante el cálculo del porcentaje de recaptación específica respecto a la recaptación total en ausencia de inhibidor. La recaptación específica se obtuvo previa sustracción de la recaptación inespecífica cuantificada en experimentos control realizados a 4 °C. La CI5o para cada compuesto se determinó a partir del ajuste de los porcentajes de recaptación específica encontrados para cada una de las concentraciones ensayadas de los distintos compuestos. El ajuste se realizó mediante regresión no lineal a la curva sigmoidea descrita por la ecuación %R = 100 (1 - Cb)/(Cl5ob + Cb), obtenida con el programa Prism (GraphPad), donde %R representa el porcentaje de anandamida recaptada, b es la pendiente de la curva y C la concentración del compuesto objeto de estudio.
Para realizar la puesta a punto de este ensayo de recaptación y comprobar la validez de los resultados con él obtenidos se determinó en primer lugar la CI50 del AM4Ó4, descrita en la literatura como CI50 = 2,2 ± 0,2 μM (Piomelli, D.; Beltramo, M.; Glasnapp, S.; Lin, S. Y.; Goutopoulos, A.; Xie, X.-Q.; Makriyannis, A. P. Nati. Acad. Sci. USA. 1999, 96, 5802). En este experimento se obtuvo un valor de CI50 = 4 ± 2 μM, lo que está en excelente acuerdo con los datos descritos previamente para este compuesto y confirmó la fiabilidad del ensayo. En la Tabla 1 se recogen los datos de la capacidad para inhibir la recaptación de anandamida expresados como CI50 (μM) mostrada por los compuestos sintetizados, incluyéndose como valor de referencia el del AM404.
EJEMPLO 3: Determinación de la afinidad receptorial CB1
La determinación de la capacidad de unión de los diferentes compuestos sintetizados al subtipo CB-] del receptor de cannabinoides se ha realizado mediante ensayos de desplazamiento de radioligando in vitro utilizando como tejido membranas de cerebelo de rata y [3H]-WIN55,212-2 como ligando radioactivo.
Las membranas se obtuvieron mediante homogeneización del cerebelo con un Polytron durante 20 segundos en tampón Tris-HCI 50 mM (pH = 7,4) y posterior centrifugación a 48000g durante 10 minutos a 4 °C. Tras varios lavados, el sedimento de membranas se resuspendió en 20 volúmenes de tampón de incubación (Tris-HCI 50 mM, EDTA 1 mM, MgCI2 3 mM y BSA libre de ácidos grasos 5 mg/mL) para alcanzar una concentración de proteínas en la suspensión de alrededor de 5 mg/mL.
El ensayo de unión se realizó en tubos de borosilicato previamente siliconizados con Sigmacote. Las membranas de cerebelo se incubaron en un volumen final de 0,5 mL de tampón Tris-HCI 50 mM, EDTA 1 mM, MgCI2 3 mM y BSA libre de ácidos grasos 5 mg/mL (pH = 7,4) durante 90 minutos a 30 °C en presencia o ausencia de un intervalo de concentraciones (10"5-10"10M) de los diferentes compuestos objeto de estudio y con una concentración de radioligando [3H]-WIÑ55,212-2 de 0,5 nM. La unión inespecífica se determinó en presencia de SR141716A a una concentración de 10 μM. La separación del ligando unido a membrana del ligando libre se realizó mediante filtración a vacío utilizando un aparato de filtración múltiple con filtros Whatman GF/C previamente equilibrados en una disolución de BSA 1 mg/mL en tampón Tris-HCI 50 mM (pH = 7,4). Los filtros se lavaron tres veces con 5 mL del mismo tampón y la radioactividad retenida en el filtro se midió en un contador de centelleo β.
La unión específica de los compuestos se calculó como la diferencia entre la unión total y la unión inespecífica. El cálculo de la CI50 se ha realizado mediante regresión no lineal de la curva de desplazamiento, obtenida con el programa Prism (GradPad), utilizando la ecuación % U.E. = (1 - Cb)/(Cl5ob + Cb), donde % U.E. representa el porcentaje de unión específica del radioligando, b es la pendiente de la curva y C la concentración del compuesto objeto de estudio. La conversión de CI50 a ¡ se ha llevado a cabo mediante la ecuación de Cheng-Prusoff: ¡ = CI50 /(1 + UKD) donde L es la concentración de radioligando y KD SU constante de disociación.
En la Tabla 1 se recogen los datos de afinidad receptorial expresados como
Figure imgf000017_0001
(nM) mostrada por los compuestos sintetizados, incluyéndose como referencia el valor de la afinidad del ligando WIN55,212-2.
EJEMPLO 4: Determinación de la afinidad receptorial CB2
La determinación de la capacidad de unión de los diferentes compuestos sintetizados al subtipo CB2 del receptor de cannabinoides se ha realizado mediante ensayos de desplazamiento de radioligando in vitro utilizando como tejido membranas de células HEK293EBNA transfectadas con el receptor CB2 humano (kit comercial) y [3H]-CP55,940 como ligando radioactivo.
Las membranas se resuspendieron en tampón de incubación Tris-HCI 50 mM, EGTA 2,5 mM, MgCfe 5 mM y BSA libre de ácidos grasos 1 mg/mL (pH = 7,5) para alcanzar una concentración de proteínas en la suspensión de alrededor de 1 ,44 mg/mL. El ensayo de unión se realizó en tubos de borosilicato previamente siliconizados con Sigmacote. Las membranas de las células se incubaron en un volumen final de 0,2 mL de tampón Tris-HCI 50 mM, EGTA 2,5 mM,
MgCI2 5 mM y BSA libre de ácidos grasos 1 mg/mL (pH = 7,5) durante 90 minutos a 30 °C en presencia o ausencia de un intervalo de concentraciones
(10"5-10"10 M) de los diferentes compuestos objeto de estudio y con una concentración de radioligando [3H]-CP55,940 de 0,3 nM. La unión inespecífica se determinó en presencia de CP-55,940 a una concentración de 5 μM. La separación del ligando unido a membrana del ligando libre se realizó mediante filtración a vacío utilizando un aparato de filtración múltiple con filtros Whatman GF/C previamente equilibrados en una disolución de polietilenimina (PEÍ) al 0,05 %. Los filtros se lavaron tres veces con 5 mL de tampón Tris-HCI 50 mM y BSA libre de ácidos grasos 1 mg/mL (pH = 7,4) y la radioactividad retenida en el filtro se midió en un contador de centelleo β.
La unión específica de los compuestos se calculó como la diferencia entre la unión total y la unión inespecífica. El cálculo de la CI50 se ha realizado según se detalla en el ejemplo 3.
En la Tabla 1 se recogen los datos de afinidad receptorial expresados como ¡ (nM) mostrada por los compuestos sintetizados, incluyéndose como referencia el valor de la afinidad del ligando WIN55.212-2.
EJEMPLO 5: Determinación de la afinidad receptorial VR1
La determinación de la capacidad de unión de los diferentes compuestos sintetizados al subtipo VRι del receptor de vanilloides se ha realizado mediante ensayos de desplazamiento de radioligando in vitro utilizando como tejido membranas de médula espinal de rata y [3H]-RTX como ligando radioactivo. Las membranas se obtuvieron mediante homogeneización en incubación en tampón HEPES 10 mM, KCI 5 mM, NaCI 5,8 mM, CaCI2 0,75 mM, MgCI2 2 mM y sacarosa 320 mM (pH = 7,4) y centrifugación a 1000g durante 10 minutos a 4 °C. El sobrenadante se retiró y las membranas se centrifugaron de nuevo a 35000g durante 30 minutos a 4 °C. Finalmente, el sedimento se resuspendió en 10 volúmenes de tampón HEPES 10 mM, KCI 5 mM, NaCI 5,8 mM, CaCI20,75 mM, MgCI2 2 mM y sacarosa 320 mM (pH = 7,4) para alcanzar una concentración de proteínas en la suspensión de alrededor de 1 mg/mL.
Las membranas de las células se incubaron en un volumen final de 0,5 mL de tampón HEPES 10 mM, KCI 5 mM, NaCI 5,8 mM, CaCI20,75 mM, MgCI2 2 mM y sacarosa 320 mM (pH = 7,4) durante 60 minutos a 37 °C en presencia o ausencia de un intervalo de concentraciones (10"5-10"10 M) de los diferentes compuestos objeto de estudio y con una concentración de radioligando [3H]-RTX de 25 pM. La unión inespecífica se determinó en presencia de RTX a una concentración de 1 μM. La reacción se detuvo por enfriamiento en baño de hielo. A continuación se adicionaron 100 μg de glicoproteína acida αi bovina en 50 μL de tampón para disminuir la unión inespecífica. La separación del ligando unido a membrana del ligando libre se realizó mediante centrifugación. Tras centrifugar, el sobrenadante se retiró cuidadosamente y el sedimento se secó. A continuación, se cortó el extremo de los tubos eppendorf los cuales contenían el sedimento y se midió la radioactividad aquí retenida en un contador de centelleo β.
La unión específica de los compuestos se calculó como la diferencia entre la unión total y la unión inespecífica. El cálculo de la CI50 se ha realizado según se detalla en el ejemplo 3.
En la Tabla 1 se recogen los datos de afinidad receptorial expresados como K\ (nM) mostrada por los compuestos sintetizados, incluyéndose como referencia el valor de la afinidad del ligando RTX.
Figure imgf000020_0001
aEstos compuestos presentan una cierta afinidad por el receptor VRi (K¡ < 5000 nM). bEste compuesto presenta una curva de inhibición distinta que no ajusta a la tendencia sigmoidal dosis-respuesta característica del resto de los compuestos.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Compuestos de fórmula general I:
Figure imgf000021_0001
I sus estereoisómeros y sus mezclas, y las sales y solvatos farmacéuticamente aceptables, en la que:
X es CO, CS o CH2
Y es CH2, O, S, NH o NR (R es alquilo, alquilarilo o arilo) Z es H o un grupo alquilo, alquilarilo o arilo
Heterociclo es una subunidad monocíclica aromática con uno o dos heteroátomos (tiofeno, pirrol, furano, isoxazol, furano sustituido) con la provisión que no es piridina, o una subunidad monocíclica alifática con uno o dos heteroátomos (con la provisión que no es un sistema de 1,3-dioxolano) y unidades metilénicas opcionaimente sustituidas (con la provisión que el sustituyente no es un grupo hidroxilo) o los derivados benzofusionados de ambas subunidades.
2. Compuestos según la reivindicación 1 , donde X es CO o CS; Y es NH o NR (R es alquilo, alquilarilo o arilo); Z es H, alquilo, alquilarilo o ariio y el heterociclo es una subunidad monocíclica aromática con uno o dos heteroátomos (tiofeno, pirrol, furano, isoxazol, furano sustituido) con la provisión que no es piridina, o una subunidad monocíclica alifática con uno o dos heteroátomos (con la provisión que no es un sistema de 1 ,3-dioxolano) y unidades metilénicas opcionalmente sustituidas (con la provisión que el sustituyente no es un grupo hidroxilo) o los derivados benzofusionados de ambas subunidades.
3. Compuestos según la reivindicación 1 , donde X es CO o CS; Y es O; Z es H, alquilo, alquilarilo o arilo y el heterociclo es una subunidad monocíclica aromática con uno o dos heteroátomos (tiofeno, pirrol, furano, isoxazol, furano sustituido) con la provisión que no es piridina, o una subunidad monocíclica alifática con uno o dos heteroátomos (con la provisión que no es un sistema de 1,3-dioxolano) y unidades metilénicas opcionalmente sustituidas (con la provisión que el sustituyente no es un grupo hidroxilo) o los derivados benzofusionados de ambas subunidades.
4. Compuestos según la reivindicación 1 , donde X es CO o CS; Y es CH2; Z es H, alquilo, alquilarilo o arilo y el heterociclo es es una subunidad monocíclica aromática con uno o dos heteroátomos (tiofeno, pirrol, furano, isoxazol, furano sustituido) con la provisión que no es piridina, o una subunidad monocíclica alifática con uno o dos heteroátomos (con la provisión que no es un sistema de 1,3-dioxolano) y unidades metilénicas opcionalmente sustituidas (con la provisión que el sustituyente no es un grupo hidroxilo) o los derivados benzofusionados de ambas subunidades.
5. Compuestos según la reivindicación 1, donde X es CH2; Y es O; Z es H, alquilo, alquilarilo o arilo y el heterociclo es es una subunidad monocíclica aromática con uno o dos heteroátomos (tiofeno, pirrol, furano, isoxazol, furano sustituido) con la provisión que no es piridina, o una subunidad monocíclica alifática con uno o dos heteroátomos (con la provisión que no es un sistema de 1 ,3-dioxolano) y unidades metilénicas opcionalmente sustituidas (con la provisión que el sustituyente no es un grupo hidroxilo) o los derivados benzofusionados de ambas subunidades.
6. Compuestos según la reivindicación 1, donde X es CH2; Y es NH o NR (R representa alquilo, alquilarilo o arilo); Z es H, alquilo, alquilarilo o arilo y el heterociclo es una subunidad monocíclica aromática con uno o dos heteroátomos (tiofeno, pirrol, furano, isoxazol, furano sustituido) con la provisión que no es piridiña, o una subúnidád monocíclica alifática con uno o dos heteroátomos (con la provisión que no es un sistema de 1 ,3-dioxolano) y unidades metilénicas opcionalmente sustituidas (con la provisión que el sustituyente no es un grupo hidroxilo) o los derivados benzofusionados de ambas subunidades.
7. Compuestos según la reivindicación 1 , donde X es CO; Y es NH o O; Z es H y el heterociclo es una subunidad monocíclica aromática con un heteroátomo (tiofeno o furano).
8. Procedimiento para la preparación de compuestos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado por la reacción de II o III
Figure imgf000023_0001
con el derivado del ácido araquidónico conveniente donde Y es O, S, NH, o NR (R es alquilo, alquilarilo o arilo), M es MgCI o Li, Z es H, alquilo, alquilarilo o arilo y el heterocicio es una subunidad monocíclica aromática con uno o dos heteroátomos (tiofeno, pirrol, furano, isoxazol, furano sustituido) con la provisión que no es piridina, o una subunidad monocíclica alifática con uno o dos heteroátomos (con la provisión que no es un sistema de 1,3-dioxolano) y unidades metilénicas opcionaimente sustituidas (con la provisión que el sustituyente no es un grupo hidroxilo) o los derivados benzofusionados de ambas subunidades.
9. Composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de cualquiera de los productos definidos en las reivindicaciones de la 1 a la 7 junto con excipientes farmacéuticamente aceptables.
10. Uso de un compuesto definido en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 7, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas y de procesos tumorales.
11. Uso de un compuesto definido en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 7, para la preparación de un medicamento para el tratamiento del corea de Huntington o de la esclerosis múltiple.
12. Uso de un compuesto definido en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 7, para la preparación de un medicamento para el tratamiento tumores de próstata y gliomas malignos.
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