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WO2002005945A1 - Verfahren zur herstelkung von mikroarray-chips mit nukleinsäuren, proteinen oder anderen testsubstraten - Google Patents

Verfahren zur herstelkung von mikroarray-chips mit nukleinsäuren, proteinen oder anderen testsubstraten Download PDF

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WO2002005945A1
WO2002005945A1 PCT/DE2001/002559 DE0102559W WO0205945A1 WO 2002005945 A1 WO2002005945 A1 WO 2002005945A1 DE 0102559 W DE0102559 W DE 0102559W WO 0205945 A1 WO0205945 A1 WO 0205945A1
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WO
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carrier substance
fibers
strips
chips
Prior art date
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Application number
PCT/DE2001/002559
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French (fr)
Inventor
Kang-Hun Lee
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Max Delbrueck Centrum fuer Molekulare in der Helmholtz Gemeinschaft
Original Assignee
Max Delbrueck Centrum fuer Molekulare in der Helmholtz Gemeinschaft
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/10—Libraries containing peptides or polypeptides, or derivatives thereof

Definitions

  • the human genome project which is about to be fully decoded, is currently undergoing a drastic change in the biomedical field.
  • the so-called microarray technology appears to be the first technical novelty that has the potential to be comparable to PCR technology in the 1980s (see “insighf” article in the Nature edition of June 15, 2000, vol. 405, from page 819: Functional genomics).
  • the production of so-called microarray chips for biomedical research is mainly implemented by two methods: 1.
  • the substrates DNA or protein
  • the dots are applied through nozzles which are adapted from the nozzles of inkjet printers.
  • the object of the present invention is a new method for the production of microarray chips.
  • the main objectives of the invention are a low variability of the chips (quality improvement) and a higher economy in the production, especially of large quantities of the same chips.
  • the object of the invention is achieved according to the claims.
  • the inventive method is characterized in that
  • a substrate e.g. DNA, protein or chemical substance
  • a carrier substance e.g.
  • Paraffin, polyacrylamide Paraffin, polyacrylamide
  • Micrometer range is cast, shaped or cut, various fibrous carrier substances with the respective substrate in any
  • Composition are combined into a bundle, the individual fibers are isolated from each other in the bundle by separating material, the combination of different fibers is brought in a defined arrangement, alternatively the carrier substance with the substrate is poured, shaped or cut in layers, different layers are stacked in layers and separating layers separate layers with different substrates, the entire layer is cut into strips, different strips are put together to form a block, again
  • Separating layers are integrated between strips, the different layers and strips are produced in a defined arrangement, the separating material or the separating layer consists of the same carrier material without a substrate, the separating material or the separating layer consists of a different material, which
  • Carrier material adheres, the bundles or blocks are cut into thin slices of a few micrometers, the slices are applied to a suitable solid surface, the carrier substance is removed from the surface and the substrate is immobilized at the respective location on the surface, alternatively: the carrier substance is not removed, but the substrate on the surface of the
  • the substrate is homogeneously distributed in a carrier substance as the first step.
  • a carrier substance A wide variety of test substances can be used as a substrate, which are available in large numbers, in particular DNA for gene expression analyzes and proteins for proteome analyzes, but also chemical substances, such as those being investigated in the search for new drugs.
  • a wide variety of substances can be used as the carrier substance, which enable a homogeneous mixture of the substrate and do not damage the substrate.
  • the carrier substance can first be shaped, is then converted into a solid state either chemically (by a chemical reaction, for example polyacrylamide gel) or physically (by cooling, for example paraffin).
  • the carrier substance with the substrate contained therein is cast, drawn or cut in the form of microscopic fibers (up to diameters of less than 100 micrometers). Fibers with different substrates are bundled in a defined arrangement. Separating material separates different fibers so that the substrates are isolated from each other. Alternatively, the carrier substance with the substrate is applied to one another in layers (up to thicknesses of less than 100 micrometers) in layers. Here, too, separating layers isolate layers with different substrates from one another. The entire layer is cut into fine strips (up to widths of less than 100 micrometers). Different strips are combined into a block. The separating material or the separating layer either consists of the same carrier material without a substrate or of a different material that can be adhered to the carrier material.
  • the fiber bundle or strip block is cut across the longitudinal axis into thin slices (up to thicknesses of less than 100 microns), placed on a firm surface and fixed.
  • Glass plates, metal plates or other plates which are suitable for immobilizing the substrate covalently or non-covalently are used as supports.
  • the discs are fixed chemically (e.g. by covalently binding the separating material to the chemically pretreated surface) or physically (e.g. by gluing, pressing or burning).
  • the carrier substance is removed and the substrate is immobilized on the support.
  • the carrier substance is left, for this purpose the substrate is brought from the carrier substance to the surface (e.g. by an electric field with a polyacrylamide gel as carrier substance) and is thus fixed.
  • microarray chips with substrates in the order of 10 6 and more can be produced in a series of 1000 to 10 6 pieces.
  • the number and dimensions of the substrate points correspond to the dimension in the case of chips currently being produced by others
  • DNA microchips for example, have already found their way into research institutes and the pharmaceutical industry, and further areas of application are opening up in rapid succession. A potentially even larger market is expected to be in clinical use for screening tests.
  • the previous manufacturing techniques are relatively inefficient, i.e. measured by the financial and time expenditure, the production is low. As a result, demand is already greater than supply, and this will intensify in the coming years, especially after the completion of the human genome project. It is even more important that the conventional chips are very expensive due to the high technical complexity, making the chips financially unaffordable for many applications that would make scientific and medical sense. The process presented here will be able to drastically reduce production costs and thus prices, while at the same time achieving a qualitative improvement in the chips.

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Abstract

Die Erfindung betrifft die Herstellung von Mikroarray-Chips für die Untersuchung einer grossen Anzahl von Einzelwerten, insbesondere von DNS- oder Protein-Mikroarray-Chips. Bei diesem Verfahren wird das Substrat (z-B. DNS, Protein oder sonstige Testsubstanzen) in einer Trägersubstanz homogen verteilt. Die Trägersubstanz mit dem darin enthaltenen Substrat wird in Form von mikroskopisch dünnen Fasern gebracht und verschiedene Fasern werden gebündelt. Alternativ wird die Trägersubstanz mit dem Substrat in Schichten aufeinander aufgetragen, die Gesamtschicht in Streifen geschnitten und verschiedene Streifen zu einem Block vereint. Das Bündel bzw. der Block wird quer zur Längsachse in dünne Scheiben geschnitten, auf eine feste Unterlage gebracht und fixiert. Die Trägersubstanz wird entfernt und das Substrat auf der Unterlage immobilisiert. Dieses Verfahren erlaubt die Herstellung Mikroarray-Chips mit beliebig vielen Substraten hergestellt werden. Die herausragenden Vorteile dieser Methode sind: 1. Die einfache Herstellung von nahezu unbegrenzt vielen Chips (ein Bündel/Block von 10 cm Länge ergeben 1000 Scheiben = Chips à 100 Mikrometer Dicke), 2. Die geringe Variabilität unter den Chips einer Serie (die 1000 Scheiben sind von Substratgehalt nahezu identisch). Dadurch ist eine effiziente und ökonomische Herstellung von Mikroarray-Chips für den steigenden Bedarf in der biomedizinischen Forschung und Industrie möglich.

Description

Verfahren zur Herstellung von Mikroarray-Chips mit Nukleinsäuren, Proteinen oder anderen Testsubstraten
Beschreibung
Nicht zuletzt mit dem Humanen Genomprojekt, das kurz vor der vollständigen Entschlüsselung der menschlichen Erbinformation steht, findet zur Zeit ein drastischer Umbruch im biomedizinischen Feld statt. In diesem Zusammenhang scheint die sogenannte Mikroarray-Technik als erste technische Neuheit hervorzugehen, die ein Potenzial hat vergleichbar der PCR-Technik in den 80er Jahren (siehe „insighf'-Artikel der Nature- Ausgabe vom 15 Juni 2000, Vol.405, ab Seite 819: Functional genomics). Gegenwärtig wird die Herstellung von sogenannten Mikroarray-Chips für die biomedizinische Forschung vor allem durch zwei Verfahren realisiert: 1. Auf einer Unterlage (Glas oder Membran) werden die Substrate (DNA oder Protein) als Punkte durch mechanisch betriebene feine Metallspitzen aufgetragen; 2. Das Auftragen der Punkte geschieht durch Düsen, die aus den Düsen von Tintenstrahldruckern adaptiert sind.
Beide Verfaliren sind zwar in der Lage, Chips mit bis zu Millionen von individuellen Punkten von ca. 10-100 Mikrometer Durchmesser herzustellen, jedoch die Herstellung ist aufwendig aufgrund des Herstellungsprinzips, dass jeder Punkt auf jedem Chip einzeln aufgebracht werden muss. Dieser Nachteil nimmt proportional mit der Anzahl der Substrate (Punkte pro Chip) und der Anzahl der Chips zu. Ein weiterer, qualitativer Nachteil ist die Variabilität der Punkte von Chip zu Chip sogar in derselben Herstellungsserie. Dies ist einerseits durch die mechanische Limitation der Pinspitzen der Auftragungsroboter, andererseits wieder im Herstellungsverfahren (das Auftragen von individuellen Punkten) begründet und beeinträchtigt die Vergleichbarkeit der Resultate.
Vor diesem Hintergrund ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein neues Verfahren für die Herstellung von Mikroarray-Chips. Die Hauptziele der Erfindung sind eine geringe Variabilität der Chips (Qualitätsverbesserung) und eine höhere Ökonomie der Herstellung vor allem von großen Mengen gleicher Chips. Die Aufgabe der Erfindung wird gemäß den Ansprüchen realisiert. Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß
ein Substrat (z.B. DNA, Protein oder chemische Substanz) in einer Trägersubstanz (z.B.
Paraffin, Polyacrylamid) homogen aufgelöst wird, die Trägersubstanz unter Bedingungen, die das enthaltene Substrat nicht zerstören, in festen Aggregatzustand überführt wird, die Trägersubstanz mit dem Substrat in eine faserförmige Form mit Durchmesser im
Mikrometerbereich gegossen, geformt oder geschnitten wird, verschiedene faserförmige Trägersubstanzen mit dem jeweiligen Substrat in beliebiger
Zusammensetzung zu einem Bündel kombiniert werden, die einzelnen Fasern durch Trennmaterial voneinander isoliert im Bündel vorliegen, die Kombination von verschiedenen Fasern in definierter Anordnung gebracht werden, alternativ die Trägersubstanz mit dem Substrat in Schichten gegossen, geformt oder geschnitten wird, verschiedene Schichten in Lagen übereinander geschichtet werden und Trennschichten jeweils Schichten mit unterschiedlichen Substraten separieren, die Gesamtschicht in Streifen geschnitten wird, verschiedene Streifen zu einem Block zusammengesetzt werden, wobei wiederum
Trennschichten zwischen Streifen integriert werden, die verschiedenen Schichten und Streifen in definierter Anordnung hergestellt werden, das Trennmaterial bzw. die Trennschicht aus demselben Trägermaterial ohne Substrat besteht, das Trennmaterial bzw. die Trennschicht aus einem anderen Material besteht, das am
Trägermaterial haftet, die Bündel oder die Blöcke in dünnen Scheiben von wenigen Mikrometern geschnitten werden, die Scheiben auf einer geeigneten festen Unterlage aufgetragen werden, die Trägersubstanz von der Unterlage entfernt wird und dabei das Substrat an der jeweiligen Stelle auf der Unterlage immobilisiert wird, alternativ: die Trägersubstranz nicht entfernt, jedoch das Substrat auf die Oberfläche der
Scheibe gebracht und mitsamt der Trägersubstanz auf der Unterlage immobilisiert wird. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird als erster Schritt das Substrat in einer Trägersubstanz homogen verteilt. Als Substrat können verschiedenste Testsubstanzen verwendet werden, die in großer Anzahl vorliegen, insbesondere DNS für Genexpressionsanalysen und Proteine für Proteomanalysen, aber auch chemische Substanzen, wie sie bei der Suche nach neuen Medikamenten untersucht werden. Als Trägersubstanz können verschiedenste Substanzen verwendet werden, die eine homogene Mischung des Substrats ermöglichen und nicht das Substrat beschädigen. Die Trägersubstanz ist zunächst formbar, wird dann entweder chemisch (durch eine chemische Reaktion, z.B. Polyacrylamidgel) oder physikalisch (durch Abkühlung, z.B. Paraffin) in einen festen Zustand überfuhrt.
Die Trägersubstanz mit dem darin enthaltenen Substrat wird in Form von mikroskopisch dünnen Fasern (bis zu Durchmessern von unter 100 Mikrometer) gegossen, gezogen oder geschnitten. Fasern mit unterschiedlichen Substaten werden in definierter Anordung gebündelt. Trennmaterial separiert verschiedene Fasern, so dass die Substrate voneinander isoliert sind. Alternativ wird die Trägersubstanz mit dem Substrat in dünnen Schichten (bis zu Dicken von unter 100 Mikrometer) in Lagen aufeinander aufgetragen. Auch hier isolieren Trennschichten Lagen mit verschiedenen Substraten voneinander. Die Gesamtschicht wird in feinen Streifen (bis zu Breiten von unter 100 Mikrometer) geschnitten. Verschiedene Streifen werden zu einem Block vereint. Das Trennmaterial bzw. die Trennschicht besteht entweder aus demselben Trägermaterial ohne Substrat oder aus einem anderen Material, das sich an das Trägermaterial haften lässt.
Das Faserbündel bzw. der Streifenblock wird quer zur Längsachse in dünne Scheiben (bis zu Dicken von unter 100 Mikrometer) geschnitten, auf eine feste Unterlage gebracht und fixiert. Als Unterlagen werden Glasplatten, Metallplatten oder sonstige Platten verwendet, die geeignet sind, das Substrat kovalent oder nicht-kovalent zu immobilisieren. Die Fixation der Scheiben erfolgt chemisch (z.B. durch kovalente Bindung des Trennmaterial an die chemisch vorbehandelte Unterlage) oder physikalisch (z.B. durch Kleben, Pressen oder Aufbrennen). Während oder nach der Fixierung wird die Trägersubstanz entfernt und das Substrat auf der Unterlage immobilisiert. Alternativ wird die Trägersubstanz belassen, dafür das Substrat aus der Trägersubstanz an die Oberfläche gebracht (z.B. durch ein elektrisches Feld bei einem Polyacrylamidgel als Trägersubstanz) und so fixiert.
Auf diese Weise können Mikroarray-Chips mit Substraten in der Größenordnung von 106 und mehr in einer Serie von 1000 bis 106 Stückzahlen hergestellt werden. Beispielsweise ist ein Chip mit 104 Substrat-Punkten von 100 Mikrometer Durchmesser und einer Trennschichtdicke von ebenfalls 100 Mikrometer (lOOx 2x 100 Mikrometer)2 = 2 x 2 cm2 = 4 cm2 groß, und bei einer Scheibendicke von 100 Mikrometer gehen aus einem Block von 10 cm Länge 1000 Scheiben, also Chips, hervor. Anzahl und Abmessungen der Substrat-Punkte entsprechen der Dimension bei zur Zeit hergestellten Chips durch andere
Herstellungsverfahren.
Die herausragenden Vorteile dieser Methode sind:
1. Die ökonomische und schnelle Herstellung von einem Vielfachen der Chipmengen, die nach den bisher üblichen Herstellungsverfahren in einer Serie produziert werden. Beispielsweise ergibt ein Faserbündel von 10 cm Länge 1000 Chips. Diese Zahl erreicht bei den Streifenblöcken eine Million Chips, da bei einer Schichtabmessung von 10 cm x 10 cm parallel 1000 Blöcke verarbeitet werden.
2. Die geringe Variabilität der Chips einer Serie. Dadurch, dass alle Substrate in dem Faserbündel oder Streifenblock in der Längsachse absolut homogen sind und die einzelnen Substrat-Punkte alle die gleiche Größe haben, hängt die Variabilität unter den Chips einer Serie lediglich von der Präzision des Schneidevorgangs ab. Anders als die individuelle Punkt- Auftragung bei der konventionellen Technik der Mikroarray-Chipherstellung, erfolgt der Schnitt in einem Zug durch den gesamten Block, so dass die Variabilität der individuellen Substrat-Punkte prinzipiell geringer ist.
Die Anwendungsgebiete sind bereits jetzt als immens einzuschätzen, eine genaue Abschätzung des gesamten potenziellen Anwendungsgebiets ist kaum möglich. Angespornt durch das Humane Genomprojekt haben beispielsweise DNS-Mikrochips bereits massiven Einzug in Forschungsinstitute und in die pharmazeutische Industrie erhalten, und weitere Anwendungsbereiche eröffiien sich in rasanter Folge. Ein möglicherweise noch größerer Markt ist voraussichtlich in der klinischen Anwendung für Screening-Untersuchungen. Die bisherigen Herstellungtechniken sind relativ ineffizient, d.h. gemessen an dem finanziellen und zeitlichen Aufwand ist die Produktion gering. Dadurch ist bereits jetzt die Nachfrage größer als das Angebot, und dies wird sich in den kommenden Jahren verschärfen, vor allem nach der Fertigstellung des Humanen Genomprojekts. Wichtiger noch ist, dass aufgrund des hohen technischen Aufwandes die konventionellen Chips sehr teuer sind und damit die Chips für viele Anwendungen, die wissenschaftlich und medizinisch sinnvoll wären, finanziell unerschwinglich machen. Das hier vorgestellte Verfahren wird die Produktionskosten und damit die Preise drastisch senken können und gleichzeitig eine qualitative Verbesserung der Chips erreichen.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung von Mikroarray-Chips, dadurch gekennzeichnet, dass
- ein Substrat mit einer Trägersubstanz homogen vermischt wird,
- die Trägersubstanz mit dem Substrat in eine Form gebracht wird,
- verschiedene Substrat-Trägersubstanz-Gemische zu einem Bündel zusammensetzt werden,
- anschließend das Bündel in dünne Scheiben geschnitten wird,
- die Scheiben auf eine geeignete feste Unterlage gebracht werden und
- schließlich die Trägersubstanz entfernt und dabei das Substrat auf der Unterlage immobilisiert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch ein biologisches oder chemisches Testmaterial als Substrat.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet durch Nukleotidsequenzen als Substrat.
4. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet durch Peptidsequenzen als Substrat.
5. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch ein Material als Trägersubstanz, das von einem formbaren Zustand in einen festen Aggregatzustand versetzt werden kann, ohne das Substrat zu beschädigen.
6. Verfahren nach Anspruch 1 und 5, gekennzeichnet durch Paraffin als Trägersubstanz.
7. Verfahren nach Anspruch 1 und 5, gekennzeichnet durch Polyacrylamid als Trägersubstanz.
8. Methode zur Verarbeitung und Bündelung von Substrat-Trägersubstanz-Gemischen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass
- das Substrat-Trägersubstanz-Gemisch in Form von Fasern gezogen oder gegossen wird und
- eine gewünschte Anzahl von Fasern mit unterschiedlichen Substraten zu einem geordneten Bündel zusammengesetzt werden.
9. Methode nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass Fasern von beliebigem Durchmesser, insbesondere auch von Durchmessern unter 100 Mikrometer, hergestellt werden.
10. Methode nach Anspruch 8, gekennzeichnet durch eine sonstige Anordnung der Fasern mit verschiedenen Substraten, die geignet ist, um die Fasern im Querschnitt eindeutig zu identifizieren.
11. Methode nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass Fasern von beliebigem Querschnitt, insbesondere auch von quadratischem Querschnitt, hergestellt werden.
12. Methode nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass Fasern mit verschiedenen Substraten in einem konzentrischen Raster (Abb. la) geordnet werden.
13. Methode nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass Fasern mit verschiedenen Substraten in einem rechteckigen Raster (Abb. lb) geordnet werden.
14. Methode zur Verarbeitung und Bündelung von Substrat-Trägersubstanz-Gemischen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass
- das Substrat-Trägersubstanz-Gemisch in Form von Schichten gebracht wird,
- beliebig viele Schichten mit unterschiedlichen Substraten aufeinander geschichtet werden, die Schichten in Streifen geschnitten werden und schließlich die Streifen zu einem Bündel zusammengesetzt werden.
15. Methode nach Anspruch 14, gekennzeichnet durch eine beliebige Dicke der Schichten, insbesondere auch Dicken von unter 100 Mikrometer.
16. Methode nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass zwei übereinander liegende Schichten durch eine Trennschicht separiert sind (Abb. 2a).
17. Methode nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die zusammengesetzten Schichten mit beliebig vielen Lagen in Streifen (Abb. 2b) geschnitten werden.
18. Methode nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass geschnittenen Streifen eine beliebige Breite haben, insbesondere Breiten von unter 100 Mikrometer.
19. Methode nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass geschnittenen Streifen mit anderen Streifen an den Schnittstellen zusammengesetzt werden (Abb. 2c).
20. Methode nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass zusammengesetzten Streifen durch eine Trennschicht separiert sind (Abb. 2c).
21. Methode zur Herstellung von Mikroarray-Chips aus Bündeln nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Bündel quer zur Längsachse in Scheiben geschnitten wird,
- die Scheiben auf eine geeignete feste Unterlage gebracht werden,
- die Trägersubstanz entfernt und das Substrat auf der Unterlage immobilisiert wird.
22. Methode nach Anspruch 21, gekennzeichnet durch Scheiben beliebiger Dicke, insbesondere von Dicken unter 100 Mikrometer.
23. Methode nach Anspruch 21, gekennzeichnet durch ein festes Material als Unterlage, das die Haftung des Substrates gewährleistet.
24. Methode nach Anspruch 21, gekennzeichnet durch unbehandeltes Glas als Material der festen Unterlage.
25. Methode nach Anspruch 21, gekennzeichnet durch behandeltes Glas als Material der festen Unterlage.
26. Methode nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Trägersubstanz chemisch herausgelöst wird.
27. Methode nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Trägersubstanz physikalisch herausgelöst wird, z.B. Verdampfung durch Wärme-Einwirkung.
28. Methode nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Trägersubstanz biologisch herausgelöst wird, z.B. Verdauung durch Enzyme.
29. Methode nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat nicht-kovalent auf der Unterlage immobilisiert wird.
30. Methode nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat kovalent an der Unterlage gebunden wird.
31. Methode nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß
- das Trägermaterial nicht entfernt wird,
- das Substrat an die Oberfläche der Scheibe gebracht wird,
- das oberflächliche Substrat mit dem darunter liegenden Trägermatrial an der Unterlage fixiert wird.
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