[go: up one dir, main page]

WO2002076927A2 - Verfahren zur herstellung von carbonsäureamiden - Google Patents

Verfahren zur herstellung von carbonsäureamiden Download PDF

Info

Publication number
WO2002076927A2
WO2002076927A2 PCT/EP2002/003153 EP0203153W WO02076927A2 WO 2002076927 A2 WO2002076927 A2 WO 2002076927A2 EP 0203153 W EP0203153 W EP 0203153W WO 02076927 A2 WO02076927 A2 WO 02076927A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
coupling
resin
amine component
acid component
group
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/EP2002/003153
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2002076927A3 (de
Inventor
Joachim Rudolph
Günther Jung
Bernd Thern
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bayer AG
Original Assignee
Bayer AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE10157882A external-priority patent/DE10157882A1/de
Application filed by Bayer AG filed Critical Bayer AG
Priority to EP02735153A priority Critical patent/EP1373190A2/de
Publication of WO2002076927A2 publication Critical patent/WO2002076927A2/de
Publication of WO2002076927A3 publication Critical patent/WO2002076927A3/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/06—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents
    • C07K1/08—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents using activating agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C213/00—Preparation of compounds containing amino and hydroxy, amino and etherified hydroxy or amino and esterified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C213/02—Preparation of compounds containing amino and hydroxy, amino and etherified hydroxy or amino and esterified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton by reactions involving the formation of amino groups from compounds containing hydroxy groups or etherified or esterified hydroxy groups

Definitions

  • the invention relates to a process for the preparation of carboxamides, in particular peptides.
  • Carboxamides are usually made by forming an amide bond CO-N between the carbonyl group of an acid component, e.g. a carboxylic acid and the nitrogen atom of an amine component, e.g. a primary or secondary amine. This bond formation is also referred to as condensation, but is referred to below as coupling.
  • an acid component e.g. a carboxylic acid
  • an amine component e.g. a primary or secondary amine
  • Coupling is of particular importance for peptide synthesis.
  • the aim of peptide synthesis is to build peptides from amino acids in such a way that the desired order of the amino acid building blocks is adhered to, the highest possible yield (efficiency) is achieved and epimerization - or racemization in the case of only one asymmetric carbon atom present - Avoid largely or completely during the reaction in favor of higher product purity.
  • the first step of the peptide synthesis is accordingly the synthesis of the partially protected amino acids 1, PG "-N (R") - CH (R ") - COOH, and 2, FfN (R) -CH (R) -CO-PG ' , These are reacted with one another in the second step, the coupling step, but this requires activation of the carboxy group.
  • the third step in peptide synthesis is deprotection, for which specific reagents have been introduced, e.g. treatment with
  • the PG 'protecting groups of the carboxy group e.g. Methyl, ethyl, benzyl, 4-nitrobenzyl and tert-butyl esters are split off similarly and by alkaline saponification.
  • the dipeptide which can be isolated after removal of one or both protective groups can be used in analogous reaction steps as the basis for the synthesis of higher (longer) peptides.
  • segment couplings e.g. to produce a dodecapeptide - instead of consecutively in 11 coupling steps - by linking three tetrapeptides, or even be required to develop special synthesis strategies.
  • Solid-phase synthesis or solid-phase technology means working methods, at which have at least one reactant - in the case of peptide synthesis, the acid or amine component, for example an amino acid or a peptide - in solid-phase-bound form. This is done by immobilizing the reaction partner on suitable carriers such as synthetic resins of various compositions. Either the carboxy group of the amino acid or the carboxy
  • Terminus (short: C-terminus / -terminal) of the peptide or the amino group of the amino acid or amino-terminus (short: N-terminus / -terminal) of the peptide on the support.
  • the dosing, reprocessing and separation of reaction products is made considerably easier.
  • the best-known solid-phase peptide synthesis is the Merrifield technology introduced by Merrifield and now largely automated.
  • the C-terminal amino acid unit of the peptide to be synthesized is usually linked to the insoluble support via its carboxy group. All functional groups of the amino acid side chains must be provided with permanent protective groups which are stable to the reaction conditions of the subsequent couplings.
  • the temporary protective group which initially masks the ⁇ -amino group during loading of the carrier, is then removed. An excess of a second amino acid is introduced, the carboxy group of this amino acid being activated with an activating reagent for the formation of the amide bond. After the coupling, the excess of reagents is removed by a washing process and the protective group of the N-terminus of the dipeptide is removed before the third amino acid is added. This process is repeated until the desired peptide sequence is assembled.
  • the peptide is cleaved from the carrier and the side chain protecting groups are removed.
  • the nature of the side chains and the immobilization are coordinated so that the deprotection and the release of the peptide from the solid phase can be carried out in one step.
  • the immobilization and transition via heterogeneous mixtures such as dispersions, in particular suspensions, to the homogeneous phase or the combination of solid and liquid phase technique is increasing.
  • DCC N, N'-dicyclohexylcarbodiimide
  • DIC diisopropylcarbodiimide
  • EDC N-ethyl-N '- (3-d
  • a coupling yield of 95% per coupling for the production of a pentapeptide, starting from a first amino acid means a yield of 81%, based on the first amino acid, after 4 couplings.
  • N-alkylamino acids are part of a variety of biologically active peptides (J.M. Humphrey, A.R. Chamberlin, Chem. Rev. 1997, 97, 2243-2266).
  • highly active activation reagents such as the iminium or uronium salts derived from HOBt or HOAt, e.g. BOP-Cl or the expensive HATU are known, so far has not achieved a breakthrough for the problem of the solid-phase coupling of sterically hindered N-alkylamino acids. For this reason, it has previously been necessary to circumvent this problem by using segment couplings and selective methylation on the resin, e.g.
  • Li et al described the activation reagents BEMT and BEP and their use in the total synthesis of cyclosporin O ((a) P. Li, J. Cheng Xu,
  • the object of the present invention was to provide a process for the preparation of carboxamides which enables the coupling of sterically hindered amino acids in high yields.
  • the task is solved by a special activation reagent in combination with the use of certain bases both together with the acid component in the activation step and together with the amine component for the coupling step.
  • the invention relates to a process for the preparation of carboxamides, in particular peptides, from an acid component in the form of a compound having at least one carboxy group and an amine component in the form of a compound having at least one primary or secondary amino group, in which
  • the amine component is initially introduced together with a coupling base in the form of an organic base with at least one nitrogen atom in a solvent,
  • an activation base in the form of an organic base with at least one nitrogen atom is added to a solvent
  • the process according to the invention is highly efficient and enables couplings which only took place in very low yields with the processes known hitherto and were therefore unsuitable, in particular, for the solid-phase synthesis of peptides.
  • an efficient solid and liquid phase synthesis of the naturally occurring peptides with N-alkylated and sterically hindered amino acids is possible.
  • the process is simple to carry out, the reaction proceeds very quickly and is completely epimerization-free even with high steric hindrance. Harmful heating when carrying out the reaction can also be dispensed with. It also allows the use of cheap coupling reagents such as
  • the present method is also suitable for the production of numerous N-methylated cyclopeptidic biologically active natural products, for example cyclosporins, tentoxins, dolastatins, jasamides, didemnides, nodularins and a number of other representatives (JM Humphrey, AR Chamberlin, Chem. Rev. 1997, 97 , 2243-2266). Furthermore, it can be used for a functionality screening of peptides by - instead of normal non-N-alkyl-substituted amino acids - N-methyl amino acids instead of normal non-N-alkyl substituted amino acids. N-methyl peptides are also more hydrophobic and stable towards proteolytic enzymes, which can improve their bioavailability and therapeutic potential.
  • the acid component and / or the amine component is preferably an amino acid or a peptide, the remaining carboxy and / or amino groups of which are protected.
  • the acid component and the amine component are usually used in a ratio, based on the amount of substance, of at least 1 to 1, preferably from 1 to 1 to 10 to 1, in particular from 1 to 1 to 5 to 1.
  • either the acid component and the amine component are identical or different amino acids or the acid component is an amino acid and the amine component is a peptide or the amine component is an amino acid and the acid component is Peptide, wherein further carboxy or primary or secondary amino groups present in addition to the at least one carboxy group and the at least one primary or secondary amino group are protected.
  • the amino group of the amine component is a secondary amino group and / or that on the ⁇ -C atom of the acid component bonded amino group is a secondary amino group
  • the amino group of the amine component and the protected or peptide-linked amino group of the acid component are both N-alkylated, preferably independently of one another N-alkylated with a methyl, ethyl or propyl -, Iso-propyl, cyclolhexyl or benzyl group or with one of these groups which is substituted with one or more amino and / or carboxy groups, these amino or carboxy groups in turn being protected by appropriate protective groups.
  • the unit (-OX) 2 represents two separate groups in the case of separate electron-withdrawing groups X.
  • a carbonate of the formula I is usually used as the activation reagent, in which one or both groups X independently of one another represent a group CH -n Y n , where n is one of the numbers 1, 2 or 3 and Y n is one, two or three the same or different halogen atoms, or a halogenated 1,3-dioxolan-2-one derivative whose four hydrogen atoms in the 4- and 5-positions are wholly or partly by one, two, three or four identical or different halogen atoms are substituted, or a monohalide of the formula II in which X represents a group CH 3 .
  • n is Y n , where n is one of the numbers 1, 2 or 3 and Y n is one, two or three identical or different halogen atoms, or a dihalide of the formula III.
  • halogen atoms are fluorine, chlorine and bromine, in particular chlorine, and in the case of two or three halogen atoms bonded to a carbon atom, these are preferably the same.
  • the acid component and the activation reagent are usually used in a ratio, based on the amount of substance, of at least 1 to 1, preferably from 1 to 1 to 4 to 1, in particular from 2 to 1 to 3 to 1.
  • a ratio of 3: 1 for diphosgene of 2: 1 and for phosgene and halogenated dioxolanones of 1: 1 is particularly preferred.
  • the coupling base and the activation base are usually selected independently of one another from the group comprising pyridine and the mono- or polysubstituted pyridine derivatives, preferably from the collidines, 2,4,6-tritert-butylpyridine, 2,6-ditert-butylpyridine, 2.6 -Ditert-butyl-4-methylpyridine, 2,6-
  • DIEA diisopropylethylamine
  • the collidines are the various trimethylpyridines and ethylmethylpyridines, for example 2,3,5-collidine and in particular 2,4,6-collidine. Mixtures of two or more bases can also be used.
  • the coupling efficiency can be increased by the targeted selection of the coupling and / or activation base.
  • the coupling base used together with the amine component is
  • 2,4,6-collidine pyridine, triethylamine or a sterically hindered trialkylamine, preferably a sterically hindered trialkylamine, in particular diisopropylethylamine or triisopropylamine, particularly preferably diisopropylethylamine.
  • the activation base used together with the acid component is a sterically hindered one- or multiple-alkyl-substituted pyridine derivative, preferably 2,4,6-collidine, 2,4,6-titer.
  • butylpyridine 2,6-ditert-butylpyridine, 2,6-ditert-butyl-4-methylpyridine, 2,6-dimethylpyridine or 2,3,5,6-tetramethylpyridine, particularly preferably 2,4,6-collidine.
  • the coupling efficiency increases particularly high when a steric with the sterically hindered pyridine derivative, preferably 2,4,6-collidine or 2,4,6-tri-tert-butylpyridine, in particular 2,4,6-collidine, is used as the activation base hindered trialkylamine, especially DIEA, is combined as a coupling base.
  • 2,4,6-tritert-butylpyridine generally increases the coupling efficiency less than 2,4,6-
  • the coupling base and / or the activation base are usually particularly preferred in a ratio to the amine component, based on the amount of substance, of at least 2 to 1, preferably 4 to 1 to 30 to 1, in particular 8 to 1 to 20 to 1 from 12 to 1 to 16 to 1.
  • the solvents according to (i) and (ii) are selected independently of one another from the organic and inorganic solvents which are liquid under the process conditions, usually from tetrahydrofuran, 1,4-dioxane, tetrahydropyran,
  • the solvents according to (i) and (ii) are particularly preferably identical.
  • DIEA as the coupling base
  • triphosgene as the activation reagent
  • 2,4,6- as the activation base
  • Collidine and tetrahydrofuran (THF) are used as solvents, in particular special, based on the amine component, 8 eq. DIEA, 1.15 eq. Triphosgene and 10 eq. 2,4,6-collidine.
  • the acid component is preferably used in a ratio of 3 to 1, based on the amount of triphosgene, ie, based on the amine component, about 3.5 eq. the acid component.
  • the process is usually carried out at a temperature of from 15 to 30 ° C., preferably from 18 to 25 ° C., in particular from 20 to 22 ° C.
  • 3 min is sufficient, preferably 10 s to 2 min, in particular 30 s to 1 min.
  • the reaction is preferably allowed to take place for a period of 5 minutes to 4 hours. It is usually shaken or stirred.
  • the amine component or the acid component is reversibly bound to a solid phase, preferably to a resin, in particular to a trityl resin, Wang polystyrene resin or Rink amide MBHA resin and particularly preferably to TCP resin:
  • the Wang resins and Sasrin resins based on a benzyl alcohol carrier are less suitable for the coupling of sterically hindered amino acids because of the
  • the TCP (trityl chloride polystyrene) resin a trityl resin available from RepChem Goldammer & Clausen (D-72076 Tübingen), is particularly suitable for the sequential construction of N-methyl peptides.
  • the TCP resin is an excellently balanced resin in terms of stability and cleavage, and prevents the formation of diketopiperazine on the dipeptide level due to the bulky trityl linker.
  • the TCP resin like the commercial product available from RepChem Goldammer & Clausen, is preferably hardly or not at all contaminated with Friedel-Crafts by-products, which can be problematic in solid-phase syntheses.
  • the method according to the invention is ideally suited for the attachment of an N-methylated Fmoc-protected amino acid to an N-methylated or non-methylated amino group of a peptidyl resin.
  • Activation is preferably used at least twice the amount of N-protected amino acid, based on the amount of substance of the activation reagent, in order to prevent that unreacted activation reagent can possibly have a decomposing influence on the coupling reaction.
  • liquid phase synthesis based on the amount of amine component,
  • Acid component in particular Fmoc-protected amino acid
  • an activation reagent in particular triphosgene
  • an activation base in particular 2,4,6-collidine
  • the coupling base and the activation base are used in an amount of at least 2 eq., preferably from 4 to 30 eq., in particular from 8 to 20 eq., particularly preferably from 12 to 16 eq., for example from 14 eq.
  • Liquid phase synthesis also proceeds in sterically hindered cases, e.g. the coupling of MeVal with MeVal, extremely fast, in high yields and free of epimerization.
  • the present method is suitable for automation, for example in a peptide synthesizer.
  • triphosgene was prepared as a stock solution in anhydrous tetrahydrofuran (THF (abs)) by adding 13.7 mg triphosgene per 1 ml
  • the Fmoc-amino acid (5 eq.) was in a polypropylene tube with a lid in the triphosgene / THF stock solution (1.65 eq. Triphosgene / 7.14 ml per mmol Amino acid) dissolved while swirling. As soon as the amino acid was completely dissolved, 2,4,6-collidine (14 eq. 371 ⁇ l per mmol amino acid) or 2,4,6-tri-tert-butylpyridine (14 eq.) was added, in the case of collidine a colorless precipitate was formed. The mixture was swirled for about 30 to 60 s to mix all the reagents and to activate the amino acid.
  • the suspension was then added to the pre-swollen resin using a Pasteur pipette.
  • the syringe was sealed and shaken on a shaker for 5 to 30 minutes at 20 ° C.
  • the resin was then washed successively 3 times with THF, methanol (MeOH), dimethylformamide (DMF), MeOH, dichloromethane (DCM), MeOH.
  • the dipeptide was then cleaved from the resin with 1% trifluoroacetic acid (TFA) in dichloromethane (DCM).
  • TFA trifluoroacetic acid
  • DCM dichloromethane
  • Diastereomer mixture recorded (Fig. 2).
  • the HPLC chromatograms (UV detection) of the isolated DLLL isomer (FIG. 3) and the product of the coupling of pure L-FmocMeVal (FIG. 4) were also recorded under the same RP-HPLC conditions. In the latter case, only the LLLL diastereomer signal was found (Fig. 4), i.e. no epimerization occurred.
  • Fig. 3 RP-HPLC chromatogram of the DLLL isomer.
  • Fig. 4 RP-HPLC chromatogram of the LLLL isomer.
  • the protected N-methyl-L-amino acids FmocMeVal-OH and MeVal-OBn were coupled to the dipeptide FmocMeVal-MeVal-Obn.
  • TCP resin 150 mg were coated with 55 mg of Fmoc-MeLeu-OH (3 eq) in
  • the tetrapeptide Fmoc-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeLeu-OH was obtained in a purity of over 99% exclusively via couplings according to the invention with triphosgene, which were carried out as described in Example 1. Only the first one The coupling had to be repeated once.
  • the HPLC spectrum of the tetrapeptide is shown in FIG. 5.
  • the tenth coupling shows that the coupling according to the invention with triphosgene of a non-N-methylated amino acid to an N-methylated can also proceed almost quantitatively.
  • Hexafluoroisopropanol was used to cleave the linear peptide from the resin. After freeze-drying, the crude peptide was obtained directly and without further
  • the occupancy of the resin with the first amino acid was 0.4 mmol / g resin.
  • Fig. 7 HPLC chromatogram of the crude product of the cyclization reaction to
  • Fig. 8 Mass spectrum of the purified cyclosporin O.
  • Example 6 Synthesis of Omphalotin A
  • Omphalotin A is a cyclododecapeptide with a high nematicidal activity, especially against the important phytopathogenic agents
  • Nematodes Meloidogyne incognita A. Mayer, H. Anke, O. Stemer, Nat. Prod. Lett. 1997, 10, 25-32; O. Sterner, W. Etzel, A. Mayer, H. Anke, Nat. Prod. Lett. 1997, 10, 33-38; WO 97/20857).
  • the dodecapeptide was then constructed with eleven couplings. After each coupling, the chloranil test or the Kaiser test was carried out (Fmoc Solid Phase Synthesis, W.C. Chan, P.D. White (ed.), Oxford University Press, 2000, pp. 61 ff). In the event of a negative test result, the clutch was coupled again. In
  • the occupancy of the resin with the first amino acid was 0.56 mmol / g resin.
  • a total of 2.0 g of resin were used, which corresponds to an amount of 1.12 mmol of peptide
  • ⁇ -NMR spectroscopy confirmed the identity of synthetic omphalotin A with the natural product (Fig. 13) (NMR data published in: O. Sterner, W. Etzel, A. Mayer, H. Anke, Nat. Prod. Lett. 1997, 10, 33-38).
  • the mass spectrum of the purified omphalotin A is shown in Fig. 14.
  • Fig. 11 HPLC chromatogram of the crude product of the cyclization reaction (Example 6).
  • Fig. 12 HPLC chromatogram of the purified end product, omphalotin A.
  • Fig. 13 ⁇ -NMR spectrum (700 MHz, CD 3 OD) of the purified end product, omphalotin A (Example 6).
  • Fig. 14 ESI mass spectrum of the purified end product, omphalotin A (Example 6).
  • the optically inactive amino acid Fmoc-sarcosine was coupled as the first amino acid onto the carrier polymer.
  • a solution of 1 eq Fmoc-SarOH and 3 eq DIEA in DCM (abs) was added to 200 mg TCP resin (substitution 1.04 mmol / g) and the suspension was shaken for 3 h.
  • Triphosgene was prepared as a stock solution with a concentration of 61.5 mmol / 1 (corresponding to 18.27 mg BTC per milliliter THF (abs)), of which per mmol
  • the HOAt coupling was used, which was carried out as in Example 6.
  • the HATU coupling was also used in some cases.
  • the procedure was as follows: The Fmoc-amino acid to be coupled (3.5 eq) was weighed out together with HATU (3.5 eq) and in the smallest possible amount of DCM (abs) / DMF (abs) (1: 1) solved. DIEA (7 eq) was added to the solution and left for 15 min for preactivation. This solution was then added directly to the deprotected peptidyl resin which had been pre-swollen in DMF (abs) and shaken for the time indicated in each case. The reaction solution was suctioned off and the resin was washed with DMF, DCM, DMF, DCM, MeOH (3 times each).
  • Fig. 15 HPLC chromatogram of the Fmoc-deprotected, linear dodecapeptide (Example 7).
  • Fig. 16 HPLC chromatogram of the crude product of the cyclization reaction
  • Fig. 17 HPLC chromatogram of the purified, optically pure omphalotin A (Example 7).

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Carbonsäureamiden, insbesondere Peptiden, aus einer Säure-Komponente in Form einer mindestens eine Carboxy-Gruppe aufweisenden Verbindung und einer Amin-Komponente in Form einer mindestens eine primäre oder sekundäre Amino-Gruppe aufweisenden Verbindung unter Verwendung eines Kohlensäureesters oder -halogenids wie z.B. Triphosgen als Aktivierungsreagens sowie dessen Verwendung.

Description

Verfahren zur Herstellung von Carbonsäureamiden
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Carbonsäureamiden, insbesondere Peptiden.
Carbonsäureamide werden üblicherweise durch Knüpfung einer Amidbindung CO-N zwischen der Carbonyl-Gruppe einer Säure-Komponente, z.B. einer Carbonsäure, und dem Stickstoff-Atom einer Amin-Komponente, z.B. einem primären oder sekundären Amin, hergestellt. Diese Bindungsknüpfung wird auch als Kondensation, im Folgenden aber als Kupplung bezeichnet.
Von besonderer Bedeutung ist die Kupplung für die Peptid-Synthese. Das Ziel der Peptid-Synthese ist der Aufbau von Peptiden aus Aminosäuren derart, dass genau die gewünschte Reihenfolge der Aminosäure-Bausteine eingehalten wird, eine möglichst hohe Ausbeute (Effizienz) erzielt und Epimerisierungen - bzw. Racemisierungen im Falle nur eines vorhandenen asymmetrischen Kohlenstoff-Atoms - während der Reaktion weitgehend oder vollständig vermieden werden zugunsten einer höheren Produktreinheit.
Am Anfang steht die Synthese von Dipeptiden, wobei wie in allen folgenden
Schritten darauf zu achten ist, dass von den beiden funktionellen Gruppen der Aminosäuren (bzw. der Peptide) jeweils nur die eine in Reaktion tritt. Durch Blockierung der jeweils anderen Gruppen mittels Schutzgruppen, im Folgenden symbolisch als PG" und PG' dargestellt, erreicht man so, dass die Acylierung der freien Amino-Gruppe einer Aminosäure der allgemeinen Formel AS,
HN(R)-CH(R)-COOH, (R, R = H, optional substituierte Alkyl- oder Aryl-Gruppe; z.B. AS = Tryptophan, Lysin, Asparagin, Serin, etc.) nur durch die Carboxy-Gruppe einer anderen Aminosäure stattfinden kann. Erster Schritt der Peptid-Synthese ist demnach die Synthese der partiell geschützten Aminosäuren 1, PG"-N(R")-CH(R")-COOH, und 2, FfN(R)-CH(R)-CO-PG'. Diese werden im zweiten Schritt, dem Kupplungsschritt, miteinander in Reaktion gebracht, wozu jedoch eine Aktivierung der Carboxy-Gruppe erforderlich ist. Dazu überführt man diese üblicherweise zunächst in einem vorgeschalteten Aktivierungsschritt mit Aktivierungsreagenzien intermediär in eine labile und besonders reaktionsfähige Form, meist eine elektronenarme Spezies wie ein Anhydrid, Ester oder Halogenid. Dadurch wird nucleophile Angriff der Amin-Komponente 1 begünstigt.
Die Umsetzung der partiell geschützten, aktivierten Komponenten 1 und 2 im Kup- plungsschritt in Gegenwart von Kupplungsreagenzien (Kondensationsreagenzien) führt schließlich zum gewünschten Dipeptid PG"-N(R",)-CH(R")-CO-N(R,)- CHt^-CO-PC.
Der dritte Schritt der Peptid-Synthese besteht in der Abspaltung der Schutzgruppen, wofür sich spezifische Reagenzien eingeführt haben, z.B. die Behandlung mit
Halogenwasserstoffsäuren und/oder Trifluoressigsäure im Fall von PG"-Schutz- gruppen wie der Benzyloxycarbonyl- (PG" = Cbz), der tert.-Butoxycarbonyl- (Boc), der Fluoren-9-ylmethoxycarbonyl- (Fmoc), der Triphenylmethyl- (Trt) oder der Nitrobenzolsulfenyl-Gruppe (Nps). Die PG'-Schutzgruppen der Carboxy-Gruppe, z.B. Methyl-, Ethyl-, Benzyl-, 4-Nitrobenzyl- und tert-Butylester, werden ähnlich sowie durch alkalische Verseifung abgespalten.
Das nach Entfernung einer oder beider Schutzgruppen isolierbare Dipeptid kann in analog durchzuführenden Reaktionsschritten als Basis für die Synthese höherer (längerer) Peptide eingesetzt werden. Je nach Struktur des Peptids kann es jedoch vorteilhafter sein Segmentkupplungen anzuwenden, z.B. ein Dodecapeptid - statt konsekutiv in 11 Kupplungsschritten - durch Verknüpfung dreier Tetrapeptide herzustellen, oder sogar erforderlich sein, spezielle Synthese-Strategien zu entwickeln.
Die meisten Peptid-Synthesen werden als Festphasen-Synthesen durchgeführt. Unter
Festphasen-Synthese bzw. Festphasen-Technik versteht man Arbeitsweisen, bei denen mindestens ein Reaktionspartner - im Falle der Peptid-Synthese die Säureoder Amin-Komponente, z.B. eine Aminosäure oder ein Peptid - in festphasen- gebundener Form vorliegt. Dies geschieht durch Immobilisierung des Reaktionspartners auf geeigneten Trägern wie Kunstharzen verschiedener Zusammensetzung. Dabei kann entweder die Carboxy-Gruppe der Aminosäure bzw. des Carboxy-
Terminus (kurz: C-Terminus/-terminal) des Peptids oder die Amino-Gruppe der Aminosäure bzw. des Amino-Terminus (kurz: N-Terminus/-terminal) des Peptids am Träger fixiert werden. Die Dosierung, Wiederaufbereitung und Abtrennung von Reaktionsprodukten wird erheblich erleichtert. Die bekannteste Festphasen-Peptid- Synthese ist die von Merrifield eingeführte und inzwischen weitgehend automatisierte Merrifield-Technik.
Bei der Festphasen-Synthese wird üblicherweise die C-terminale Aminosäureeinheit des zu synthetisierenden Peptids über seine Carboxy-Gruppe an den unlöslichen Träger geknüpft. Alle funktionellen Gruppen der Aminosäure-Seitenketten müssen mit permanenten Schutzgruppen versehen werden, die gegenüber den Reaktionsbedingungen der nachfolgenden Kupplungen stabil sind. Die temporäre Schutzgruppe, die die α-Aminogruppe während der Beladung des Trägers zunächst maskiert, wird anschließend entfernt. Ein Überschuss einer zweiten Aminosäure wird eingebracht, wobei die Carboxy-Gruppe dieser Aminosäure mit einem Aktivierungsreagenz für die Amidbindungsbildung aktiviert wird. Im Anschluss an die Kupplung wird der Überschuss an Reagenzien durch einen Waschprozess entfernt und die Schutzgruppe des N-Terminus des Dipeptids abgespalten, bevor die dritte Aminosäure zugegeben wird. Dieser Vorgang wird solange wiederholt, bis die gewünschte Peptidsequenz zusammengesetzt ist. In einem letzten Schritt wird das Peptid vom Träger abgespalten und die Seitenketten-Schutzgruppen werden entfernt. Im allgemeinen werden die Beschaffenheit der Seitenketten und die Immobilisierung so aufeinander abgestimmt, dass die Schutzgruppenabspaltung und die Freisetzung des Peptids von der Festphase in einem Schritt vorgenommen werden kann. Neben der Festphasen-Technik nimmt der Verzicht auf die Immobilisierung und Übergang über heterogene Gemische wie Dispersionen, insbesondere Suspensionen, bis zur homogenen Phase oder die Kombination von Fest- und Flüssigphasen- Technik zu.
Als Aktivierungsreagenzien haben sich bei der Kupplung von Aminosäuren 1 und 2 mit R' = R" = H neben klassischen Reagenzien zur Bildung von Säurechloriden, gemischten Anhydriden, Pentafluorophenylestem etc. Kombinationen aus verschieden substituierten Carbodiimiden, z.B. DCC (N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid), DIC (Di- isopropylcarbodiimid) oder EDC (N-Ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)-carbodi- imid-HCl), und einem Benzotriazol wie HOBt (1-Hydroxybenzotriazol) oder Aza- benzotriazol wie HOAt (7-Aza-l-hydroxybenzotriazol) bewährt.
Für die speziellen Aktivierungsreagenz-Kombinationen DCC/HOAt und DIC/HOAt ist bekannt, dass die Verwendung einer schwachen Base wie Collidin für die
Aktivierung der Säure-Komponente und der Zusatz einer stärkeren Base beim Kupplungsschritt unter Umständen die Effizienz und Geschwindigkeit der Gesamtreaktion erheblich verbessern kann (L. A. Carpino, A. El-Faham, Tetrahedron 1999, 55, 6813-6830).
Die Ausbeute der Kupplung gewinnt mit zunehmender Länge (Höhe) des herzustellenden Peptids erheblich an Bedeutung. So bedeutet eine Kupplungsausbeute von 95 % je Kupplung für die Herstellung eines Pentapeptids, ausgehend von einer ersten Aminosäure, nach 4 Kupplungen eine Ausbeute von 81 %, bezogen auf die erste Aminosäure. Bei der Herstellung eines Decapeptids beträgt die Ausbeute nach 9
Kupplungen dagegen nur noch 63 %.
Geringe Kupplungsausbeuten treten meist dann auf, wenn sterisch gehinderte
Aminosäuren die Kupplung erschweren. Das ist beispielsweise der Fall bei Amino- säuren mit raumerfüllenden Seitenketten, z.B. Valin (AS: R = iso-Propyl) oder Isoleucin (AS: R = .sert-Butyl), oder bei iV-Alkylaminosäuren, d. h. Aminosäuren mit N-Alkylgruppen, z.B. N-Methylaminosäuren (AS: R' = Me).
N-Alkylaminosäuren sind Bestandteil einer Vielzahl biologisch aktiver Peptide (J. M. Humphrey, A. R. Chamberlin, Chem. Rev. 1997, 97, 2243-2266). Obwohl zahlreiche hochaktive Aktivierungsreagenzien wie die von HOBt oder HOAt abgeleiteten Iminium- bzw. Uroniumsalze, z.B. BOP-Cl oder das teure HATU, bekannt sind, ist bisher noch kein Durchbruch für das Problem der Festphasen-Kupplung sterisch gehinderter N-Alkylaminosäuren gelungen. Aus diesem Grund war man bisher auf eine Umgehung dieses Problems durch Anwendung von Segmentkupplungen und selektiver Methylierung am Harz angewiesen, z.B. bei der Totalsynthese des Cyclo- peptids Cyclosporin A, bei dem 7 von insgesamt 11 Amidbindungen methyliert sind ((a) R. M. Wenger, He/v. Chim. Acta 1983, 66, 2672; (b) W. J. Colucci, R. D. Tung, J. A. Petri, D. A. Rieh, J Org. Chem. 1990, 55, 2895; (c) P. Raman, S. S. Stokes, Y. M. Angell, G. R. Flentke, D. A. Rieh, J Org. Chem. 1998, 63, 5734-5735).
Figure imgf000006_0001
Von Li et al wurden die Aktivierungsreagenzien BEMT und BEP und deren Einsatz in der Totalsynthese von Cyclosporin O beschrieben ((a) P. Li, J. Cheng Xu,
Tetrahedron Leu. 1999, 40, 8301-8304; (b) P. Li, J. Cheng Xu, Chem. Lett. 2000, 204-205; (c) P. Li, j. Cheng Xu, J Org. Chem. 2000, 65, 2951-2958). Bei ihrem Einsatz als Festphasen-Aktivierungsreagenz sind BEMT und BEP dem Reagenz ΗATU deutlich überlegen, jedoch nach wie vor nicht effizient genug für den Einsatz in der Festphasen-Kupplung N-methylierter Aminosäuren. Speziell für den Fall der
Kupplung zweier N-Methylaminosäuren mit sperrigen Seitenketten, z.B. Fmoc- MeVal-OH an MeVal-Peptidyl-Harz, sind die Ausbeuten eigenen Versuchen zufolge mit weniger als 30 % generell niedrig.
Aus WO 00/02898 ist eine Verfahren zur Peptid-Synthese mit dem Aktivierungsreagenz Triphosgen und Collidin bekannt, welches bei der Kupplung von N-Methylaminosäuren mit sperrigen Seitenketten höhere Kupplungsausbeuten als HATU, BOP-Cl, TFFH oder andere Reagenzien erbringt (E. Falb, T. Yechezkel, Y. Salitra, C. Gilon, J Peptide Res. 1999, 53, 507-517).
Figure imgf000007_0001
Triphosgen 2,4,6-Collidin
Die Kupplung von Fmoc-geschützten Aminosäuren an N-Alkyl-Aminosäuren, die an einen Peptidyl-Rinkamid-Harzrest gebunden sind, geschieht dabei folgendermaßen: Eine Fmoc-geschützte Aminosäure wird mit 1 ,65 eq. (eq. = Stoffmengen-Äquivalent) Triphosgen und 14 eq. Collidin in THF umgesetzt und nach 1 min Aktivierungszeit
1 h bei 50°C mit der am Peptidyl-Harz-Rest gebundenen Aminosäure zur Reaktion gebracht.
Auch dieses Verfahren weist eine Reihe von Nachteilen auf. Die Kupplung sterisch gehinderter N-Methylaminosäuren gelingt zwar gut, die für die Synthese höherer
Peptide essentiellen Kupplungsausbeuten von über 90 % können jedoch nicht erreicht werden. Die erforderliche hohe Reaktionstemperatur ist für die Festphasen- Synthese unpraktisch und führt in erhöhtem Maße zu Νebenreaktionen. Das verwendete Rink-Amid-Harz benötigt stark saure Abspaltungsbedingungen, welche im Fall von vielfach N-methylierten Peptiden bekanntermaßen zur Zersetzung führen
(j. Urban, T. Vaisar, R. Shen, M. S. Lee, Int. J. Peptide Protein Res. 1996, 47, 182- 189). Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, ein Verfahren zur Herstellung von Carbonsäureamiden bereitzustellen, das die Kupplung sterisch gehinderter Aminosäuren in hohen Ausbeuten ermöglicht.
Gelöst wird die Aufgabe durch ein spezielles Aktivierungsreagenz in Kombination mit dem Einsatz von bestimmten Basen sowohl zusammen mit der Säure-Komponente im Aktivierungsschritt als auch zusammen mit der Amin-Komponente für den Kupplungsschritt.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Carbonsäureamiden, insbesondere Peptiden, aus einer Säure-Komponente in Form einer mindestens eine Carboxy-Gruppe aufweisenden Verbindung und einer Amin-Komponente in Form einer mindestens eine primäre oder sekundäre Amino-Gruppe aufweisenden Ver- bindung, bei dem
(i) die Amin-Komponente zusammen mit einer Kupplungsbase in Form einer organischen Base mit mindestens einem Stickstoffatom in einem Lösungsmittel vorgelegt wird,
(ii) die Säure-Komponente mit einem Aktivierungsreagenz in Form eines Carbonats der Formel I,
O=C(-OX)2 (I)
das die beiden gleichen oder verschiedenen, getrennten oder miteinander verbundenen, elektronenziehenden Gruppen X aufweist,
dessen Monohalogenids der Formel II,
O=C(-OX)Y (II) in der X die gleiche Bedeutung wie in Formel I hat und Y für ein Halogenatom steht,
oder dessen Dihalogenids der Formel III,
O=CYY' (III)
in der Y und Y' unabhängig voneinander für je ein Halogenatom stehen,
und einer Aktivierungsbase in Form einer organischen Base mit mindestens einem Stickstoffatom in ein Lösungsmittel gegeben wird,
(iii) das die Säure-Komponente enthaltende Gemisch gemäß (ii) zu dem die Amin-Komponente enthaltenden Gemisch gemäß (i) gegeben wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist hocheffizient und ermöglicht Kupplungen, die mit den bisher bekannten Verfahren nur in sehr geringen Ausbeuten abliefen und daher insbesondere für die Festphasen-Synthese von Peptiden ungeeignet waren. Damit ist erstmals eine effiziente Fest- und Flüssigphasen-Synthese von den in der Natur vielfach vorkommenden Peptiden mit N-alkylierten und sterisch gehinderten Aminosäuren möglich. Das Verfahren ist einfach durchführbar, die Reaktion läuft sehr schnell ab und ist auch bei hoher sterischer Hinderung komplett epimerisierungsfrei. Auch kann auf das schädliche Erhitzen bei der Reaktionsdurchführung verzichtet werden. Weiterhin erlaubt es den Einsatz billiger Kupplungsreagenzien wie
Triphosgen, während die meisten der bekannten modernen Aktivierungsreagenzien sehr teuer sind. Damit eignet sich das Verfahren auch aus wirtschaftlicher Sicht universell zur Knüpfung von Amidbindungen an der Festphase wie auch in Flüssigphase bzw. Lösung, und zwar insbesondere in Fällen, bei denen die herkömmlichen Ver- fahren zur Knüpfung von Amidbindungen nicht effizient genug sind. Das vorliegende Verfahren bietet sich speziell für die Herstellung zahlreicher biologisch aktiver N-Alkylamide an, deren Herstellung oft problematisch ist und teure Reagenzien benötigt. Ebenso bietet sich das vorliegende Verfahren für die Herstellung zahlreicher N-methylierter cyclopeptidischer biologisch aktiver Naturstoffe, z.B. Cyclosporine, Tentoxine, Dolastatine, Jaspamide, Didemnide, Nodularine und eine Reihe weiterer Vertreter an (J. M. Humphrey, A. R. Chamberlin, Chem. Rev. 1997, 97, 2243-2266). Weiterhin kann es für ein Funktionalitätsscreening von Peptiden genutzt werden, indem - zur gezielten Unterbindung bestimmter Wasserstoffbrücken - anstelle normaler nicht-N-alkylsubstituierter Aminosäuren N- Methylaminosäuren eingebaut werden. N-Methylpeptide sind zudem hydrophober und stabiler gegenüber proteolytischen Enzymen, was ihre Bio Verfügbarkeit und ihr therapeutisches Potential verbessern kann.
Die Säure-Komponente und/oder die Amin-Komponente ist vorzugsweise eine Aminosäure oder ein Peptid, deren übrige Carboxy- und/oder Amino-Gruppen geschützt sind.
Die Säure-Komponente und die Amin-Komponente werden üblicherweise in einem Verhältnis, bezogen auf die Stoffmenge, von mindestens 1 zu 1, vorzugsweise von 1 zu 1 bis 10 zu 1, insbesondere von 1 zu 1 bis 5 zu 1, eingesetzt.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens sind entweder die Säure- Komponente und die Amin-Komponente gleiche oder verschiedene Aminosäuren oder ist die Säure-Komponente eine Aminosäure und die Amin-Komponente ein Peptid oder ist die Amin-Komponente eine Aminosäure und die Säure-Komponente ein Peptid, wobei über die mindestens eine Carboxy-Gruppe und die mindestens eine primäre oder sekundäre Amino-Gruppe hinaus vorhandene weitere Carboxy- bzw. primäre oder sekundäre Amino-Gruppen geschützt sind.
Hierbei ist es besonders bevorzugt, dass die Amino-Gruppe der Amin-Komponente eine sekundäre Amino-Gruppe und/oder die an das α-C-Atom der Säure-Komponente gebundene Aminogruppe eine sekundäre Amino-Gruppe ist, insbesondere die Amino-Gruppe der Amin-Komponente und die geschützte oder peptidisch verknüpfte Aminogruppe der Säure-Komponente beide N-alkyliert sind, vorzugsweise unabhängig voneinander N-alkyliert mit einer Methyl-, Ethyl-, Propyl-, iso-Propyl-, Cyclolhexyl- oder Benzylgruppe oder mit einer dieser Gruppen, die mit einer oder mehreren Amino- und/oder Carboxygruppen substituiert ist, wobei diese Amino- bzw. Carboxygruppen ihrerseits durch entsprechende Schutzgruppen geschützt sind.
Bei dem Aktivierungsreagenz in Form eines Carbonats der Formel I stellt die Einheit (-OX)2 im Falle getrennter elektronenziehenden Gruppen X zwei getrennte Gruppen
-OX dar, während sie im Falle miteinander verbundener elektronenziehender Gruppen X eine Einheit -OX-XO- darstellt, beispielsweise bei einem 1,3-Di- oxolan-2-onderivat.
Als Aktivierungsreagenz wird üblicherweise eingesetzt ein Carbonat der Formel I, in der eine oder beide Gruppen X unabhängig voneinander für eine Gruppe CH -nYn stehen, wobei n für eine der Zahlen 1, 2 oder 3 und Yn für ein, zwei oder drei gleiche oder verschiedene Halogenatome steht, stehen, oder ein halogeniertes 1,3-Dioxo- lan-2-onderivat, dessen vier Wasserstoffatome in 4- und 5-Position ganz oder teil- weise durch ein, zwei, drei oder vier gleiche oder verschiedene Halogenatome substituiert sind, oder ein Monohalogenid der Formel II, in der X für eine Gruppe CH3.nYn steht, wobei n für eine der Zahlen 1 , 2 oder 3 und Yn für ein, zwei oder drei gleiche oder verschiedene Halogenatome steht, stehen, oder ein Dihalogenid der Formel III.
Bevorzugte Halogenatome sind dabei Fluor, Chlor und Brom, insbesondere Chlor, wobei im Falle von zwei oder drei an ein Kohlenstoffatom gebundenen Halogenatomen diese vorzugsweise gleich sind. Dementsprechend stehen die Gruppen X in Formeln I bzw. II unabhängig voneinander insbesondere für eine der Gruppen CC13, CF3, CBr3, CHC12, CHF2, CHBr2, CHI2, CH2C1, CH2F oder CH2Br und sind bevor- zugte Dihalogenide der Formel III O=CF2, O=CCl2 (Phosgen) und O=CBr2. Vorzugsweise wird als Aktivierungsreagenz Triphosgen (O=C(-OCCl )2, Bis-(Tri- chlormethyl)-carbonat, BTC), Diphosgen (O=C(-OCCl3)Cl), Phosgen (O=CCl2) und/oder 4,4,5, 5-Tetrachlor-l,3-dioxolan-2-on und besonders bevorzugt Triphosgen eingesetzt.
Die Säure-Komponente und das Aktivierungsreagenz werden üblicherweise in einem Verhältnis, bezogen auf die Stoffmenge, von mindestens 1 zu 1, vorzugsweise von 1 zu 1 bis 4 zu 1, insbesondere von 2 zu 1 bis 3 zu 1, eingesetzt. Bei dem Einsatz von Triphosgen als Aktivierungsreagenz ist ein Verhältnis von 3:1, bei Diphosgen von 2:1 und bei Phosgen und halogenierten Dioxolanonen von 1 : 1 besonders bevorzugt.
Die Kupplungsbase und die Aktivierungsbase werden üblicherweise unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe umfassend Pyridin und die ein- oder mehrfach alkylsubstituierten Pyridinderivate, vorzugsweise aus den Collidinen, 2,4,6- Tritert-butylpyridin, 2,6-Ditert-butylpyridin, 2,6-Ditert-butyl-4-methylpyridin, 2,6-
Dimethylpyridin, 2,3,5,6-Tetramethylpyridin, 2-Methylpyridin und Pyridin, oder aus der Gruppe der Trialkylamine, vorzugsweise aus Diisopropylethylamin (DIEA), Tri- isopropylamin, N-Methylmorpholin, Triethylamin. Die Collidine sind die verschiedenen Trimethylpyridine und Ethylmethylpyridine, beispielsweise 2,3,5- Collidin und insbesondere 2,4,6-Collidin. Genauso können Mischungen von zwei oder mehr Basen eingesetzt werden.
Die Kupplungseffizienz läßt sich durch die gezielte Auswahl von Kupplungsund/oder Aktivierungsbase steigern. In einer bevorzugten Ausführungsform des Ver- fahrens ist die zusammen mit der Amin-Komponente eingesetzte Kupplungsbase
2,4,6-Collidin, Pyridin, Triethylamin oder ein sterisch gehindertes Trialkylamin, vorzugsweise ein sterisch gehindertes Trialkylamin, insbesondere Diisopropylethylamin oder Triisopropylamin, besonders bevorzugt Diisopropylethylamin. In einer ebenfalls bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens ist die zusammen mit der Säure- Komponente eingesetzte Aktivierungsbase ein sterisch gehindertes ein- oder mehrfach alkylsubstituiertes Pyridinderivat, vorzugsweise 2,4,6-Collidin, 2,4,6-Tritert- butylpyridin, 2,6-Ditert-butylpyridin, 2,6-Ditert-butyl-4-methylpyridin, 2,6-Di- methylpyridin oder 2,3,5,6-Tetramethylpyridin, besonders bevorzugt 2,4,6-Collidin.
In einer weiteren bevorzugten Ausf hrungsform des Verfahrens werden die beiden vorstehenden bevorzugten Ausführungsform miteinander kombiniert. Dabei fällt die
Steigerung der Kupplungseffϊzienz besonders hoch aus, wenn mit dem sterisch gehinderten Pyridinderivat, vorzugsweise 2,4,6-Collidin oder 2,4,6-Tri-tert-butyl- pyridin, insbesondere 2,4,6-Collidin, als Aktivierungsbase ein sterisch gehindertes Trialkylamin, insbesondere DIEA, als Kupplungsbase kombiniert wird. 2,4,6-Tri- tert-butylpyridin steigert die Kupplungseffizienz in der Regel weniger als 2,4,6-
Collidin, ergibt jedoch während der Aktivierung in THF eine homogene Lösung.
Die Kupplungsbase und/oder die Aktivierungsbase werden üblicherweise in einem Verhältnis zur Amin-Komponente, bezogen auf die Stoffmenge, von mindestens 2 zu 1, vorzugsweise von 4 zu 1 bis 30 zu 1, insbesondere von 8 zu 1 bis 20 zu 1, besonders bevorzugt von 12 zu 1 bis 16 zu 1, eingesetzt.
Die Lösungsmittel gemäß (i) und (ii) sind unabhängig voneinander ausgewählt aus den bei den Verfahrensbedingungen flüssigen organischen und anorganischen Lösungsmittel, üblicherweise aus Tetrahydrofuran, 1,4-Dioxan, Tetrahydropyran,
Ethylenglykoldimethylether, Diethylenglykoldimethylether, Trichlormethan, 1,3-Di- chlorpropan, 1,2-Dichlorethan, Nitromethan oder ein Gemisch zweier oder mehrerer davon, vorzugsweise Tetrahydrofuran, 1,4-Dioxan, Tetrahydropyran, Ethylenglykoldimethylether oder Diethylenglykoldimethylether oder ein Gemisch zweier oder mehrerer davon, insbesondere Tetrahydrofuran.
Besonders bevorzugt sind die Lösungsmittel gemäß (i) und (ii) identisch.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird als Kupp- lungsbase DIEA, als Aktivierungsreagenz Triphosgen, als Aktivierungsbase 2,4,6-
Collidin und als Lösungsmittel jeweils Tetrahydrofuran (THF) eingesetzt, insbe- sondere, bezogen auf die Amin-Komponente, 8 eq. DIEA, 1,15 eq. Triphosgen und 10 eq. 2,4,6-Collidin. Die Säurekomponente wird dabei vorzugsweise in einem Verhältnis, bezogen auf die Stoffmenge an Triphosgen, von 3 zu 1 eingesetzt, d. h., bezogen auf die Amin-Komponente, etwa 3,5 eq. der Säurekomponente.
Das Verfahren wird üblicherweise bei einer Temperatur von 15 bis 30°C, bevorzugt von 18 bis 25°C, insbesondere von 20 bis 22°C, durchgeführt. Nach (ii) 3 min ausreichend, vorzugsweise 10 s bis 2 min, insbesondere 30 s bis 1 min. Nach der Zugabe gemäß (iii) läßt man vorzugsweise für eine Dauer von 5 min bis 4 h reagieren. Dabei wird üblicherweise geschüttelt oder gerührt.
In einer besonderen Ausfuhrungsform des Verfahrens ist die Amin-Komponente oder die Säure-Komponente reversibel an eine feste Phase gebunden, vorzugsweise an ein Harz, insbesondere an ein Tritylharz, Wang-Polystyrol-Harz oder Rink-Amid- MBHA-Harz und besonders bevorzugt an TCP-Harz:
Figure imgf000014_0001
Die auf einer Benzylalkohol-Trägerung basierenden Wang-Harze und Sasrin-Harze sind für die Kupplung sterisch gehinderter Aminosäuren weniger geeignet, da auf der
Dipeptidstufe eine sehr hohe Tendenz zur Bildung von Diketopiperazinen auftreten kann, was mit hohen Ausbeuteverlusten verbunden ist. Besonders geeignet für den sequentiellen Aufbau von N-Methylpeptiden ist das TCP (Tritylchlorid-Polystyrol)-Harz, ein von der Firma RepChem Goldammer & Clausen (D-72076 Tübingen) erhältliches Tritylharz. Das TCP-Harz ist ein hervorragend ausgewogenes Harz, was die Stabilität und Abspaltbarkeit betrifft, und verhindert durch den sperrigen Trityl-Linker die Diketopiperazin-Bildung auf der Dipeptidstufe. Das TCP-Harz ist vorzugsweise wie das von der Firma RepChem Goldammer & Clausen erhältliche Handelsprodukt kaum oder sogar gar nicht mit Friedel-Crafts- Νebenprodukten verunreinigt, die sich bei Festphasen-Synthesen als problematisch erweisen können.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist in idealer Weise für die Anknüpfung einer N- methylierten Fmoc-geschützten Aminosäure an eine N-methylierte oder nicht- methylierte Aminogruppe eines Peptidyl-Harzes geeignet.
Bei der Durchführung des Verfahrens als Flüssigphasen-Synthese wird bei der
Aktivierung vorzugsweise mindestens die doppelte Menge N-geschützte Aminosäure, bezogen auf die Stoffmenge an Aktivierungsreagenz, eingesetzt, um zu verhindern, dass nicht umgesetztes Aktivierungsreagenz gegebenenfalls einen zersetzenden Einfluss auf die Kupplungsreaktion nehmen kann.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Flüssigphasen-Synthese werden, bezogen auf die Stoffmenge an Amin-Komponente,
(i) 1 eq. Amin-Komponente, insbesondere Carboxy-geschützte Aminosäure oder Peptid, zusammen mit einer Kupplungsbase, insbesondere DIEA, in einem
Lösungsmittel, insbesondere THF, vorgelegt wird,
(ii) 1,1 eq. Säure-Komponente, insbesondere Fmoc-geschützte Aminosäure, mit einem Aktivierungsreagenz, insbesondere Triphosgen, und einer Aktivie- rungsbase, insbesondere 2,4,6-Collidin, in ein Lösungsmittel, insbesondere
THF, gegeben wird, (iii) das die Säure-Komponente enthaltende Gemisch gemäß (ii) zu dem die Amin-Komponente enthaltenden Gemisch gemäß (i) gegeben,
wobei Kupplungsbase und Aktivierungsbase in einer Menge von mindestens 2 eq., vorzugsweise von 4 bis 30 eq., insbesondere von 8 bis 20 eq., besonders bevorzugt von 12 bis 16 eq., beispielsweise von 14 eq., eingesetzt werden.
Die Flüssigphasen-Synthese verläuft auch in sterisch stark gehinderten Fällen, z.B. der Kupplung von MeVal mit MeVal, extrem schnell, in hohen Ausbeuten und epimerisierungsfrei.
Das vorliegende Verfahren eignet sich zur Automatisierung, beispielsweise in einem Peptidsynthesizer.
Beispiele
Beispiel 1 Festphasen-Kupplungen mit Triphosgen
Ausgehend von den am Harz gebundenen N-methylierten Aminosäuren Meile (He =
L-Isoleucin) bzw. MeLeu (Leu = L-Leucin) wurden das permethylierte Pentapeptid MeVal-MeVal-Sar-MeVal-Melle (Val = L-Valin, Sar = L-Sarcosin) bzw. das permethylierte Tetrapeptid MeLeu-MeLeu-MeVal-MeLeu durch vier bzw. drei Kupplungen hergestellt und dabei in einer Produktreinheit von über 98 % erhalten.
Bezogen auf die am Harz vorhandenen Aminofunktionen wurde bei jeder Kupplung mit folgenden Überschüssen gearbeitet (eq. = Stoffmengen-Äquivalent): Fmoc-Aminosäure: 5 eq. Triphosgen: 1,65 eq. Collidin: 14 eq.
DIEA: 14 eq.
Die Konzentration der Reaktionslösung wurde, bezogen auf die Fmoc-Aminosäure auf 0,14 mol/1 eingestellt. Dazu wurde Triphosgen als Stammlösung in wasserfreiem Tetrahydrofuran (THF(abs)) hergestellt, indem 13,7 mg Triphosgen pro 1 ml
THF(abs) gelöst wurden. Von dieser Lösung wurden pro mmol Fmoc-Aminosäure 7,14 ml benötigt.
Vorgehensweise: Das getrocknete, vorbelegte Harz (TCP-Harz von der Firma RepChem, Belegung ca. 0,4 mmol Amin-Komponente pro g Harz) wurde in einer
Kunststoffspritze mit Kunststofffritte und Verschlußstopfen mit DIEA/THF(abs) vorbehandelt. Dazu wurden je 100 mg Harz, 100 μl THF(abs) und 100 μl DIEA zum Harz gegeben. Die Vorquellzeit bis zur Zugabe der weiteren Reagenzien betrug zwischen 5 und 10 min.
Die Fmoc-Aminosäure (5 eq.) wurde in in einem Polypropylen-Röhrchen mit Deckel in der Triphosgen/THF-Stammlösung (1,65 eq. Triphosgen / 7,14 ml pro mmol Aminosäure) unter Umschwenken gelöst. Sobald die Aminosäure vollständig gelöst war, wurde 2,4,6-Collidin (14 eq. 371 μl pro mmol Aminosäure) oder 2,4,6-Tri-tert- butylpyridin (14 eq.) zugegeben, wobei es im Fall von Collidin zu der Bildung eines farblosen Niederschlags kam. Die Mischung wurde für etwa 30 bis 60 s umge- schwenkt, um alle Reagenzien zu durchmischen und die Aminosäure zu aktivieren.
Dann wurde die Suspension mit einer Pasteurpipette auf das vorgequollene Harz gegeben. Die Spritze wurde verschlossen und auf einem Schüttler für 5 bis 30 min bei 20°C geschüttelt. Danach wurde das Harz nacheinander mit THF, Methanol (MeOH), Dimethylformamid (DMF), MeOH, Dichlormethan (DCM), MeOH jeweils 3 mal gewaschen.
Beispiel 2
Zur Veranschaulichung der Leistungsfähigkeit des Verfahrens wurde folgende Modellkupplung unter Verwendung dreier verschiedener Kupplungsverfahren
(HATU/DIEA/DCM, BEMT/DIEA/DCM und Triphosgen/Collidin/ DIEA/THF) durchgeführt. Als Modellsystem wurde die Kupplung zweier sterisch gehinderter N- methylierter Aminosäuren (MeVal) gewählt, wobei das als Amin-Komponente dienende MeVal als Bestandteil des Tripeptids MeNal-Melle-Sar am Harz (P) gebunden war. Als Säure-Komponente wurden jeweils 5 eq. Fmoc-MeVal verwendet und die Reaktion jeweils nach 30 min abgebrochen.
Im Schlüsselschritt wurden die folgenden drei verschiedenen Kupplungsbedingungen angewendet:
1) HATU/DIEA/DCM, 30 min.
2) BEMT/DIEA/DCM, 30 min.
3) Triphosgen Collidin/DIEA/THF, 30 min.
Anschließend wurde das Dipeptid mit 1 %iger Trifluoressigsäure (TFA) in Dichlormethan (DCM) vom Harz abgespalten.
Figure imgf000019_0001
Fmoc- eVal - MeVal - Meile - Sar - P
Figure imgf000019_0002
Fmoc-MeVal ■ MeVal - Meile - Sar-OH
Wie anhand der HPLC-Chromatogramme der Rohprodukte (Fig. 1) ersichtlich ist, führt das üblicherweise für Problemkupplungen eingesetzte Reagenz HATU im gezeigten Fall zu keinerlei Umsatz, auch mit BEMT ist der Umsatz unbefriedigend. Demgegenüber ist bei Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens bereits nach 30 min ein hoher Umsatz erreicht. Wiederholung dieser Kupplung unter den gleichen Bedingungen führt zu quantitativer Produktbildung. Im vorliegenden Fall konnte explizit nachgewiesen werden, dass keine Epimerisierung stattfindet, d.h. es wird ausschließlich das Per-L-Tetrapeptid gebildet (siehe Beispiel 3).
Fig. I: HPLC-Chromatogramme der Reaktionsprodukte der drei Umsetzungen unter verschiedenen Bedingungen (UV-Detektion, λ = 214 nm). Die Kurven für die Um- setzungen mit BEMT und Triphosgen sind perspektivisch versetzt dargestellt (d.h. die Grundlinie aller drei Kurven beginnt bei 0 AU).
Beispiel 3
Um herauszufinden, ob bei der Modellkupplung von Beispiel 2 Epimerisierung eingetreten ist, wurde ein 50:50-Gemisch von L- und D-FmocMeVal mit dem Tripeptid gekuppelt, das erhaltene Gemisch der beiden diastereomeren Tetrapeptide, DLLL- und LLLL-Isomer, mittels RP-HPLC (Reverse Phase-High Pressure Liquid Cromatography) getrennt und mittels UV-Detektion das Chromatogramm des
Diastereomerengemischs aufgezeichnet (Fig. 2). Unter den gleichen RP-HPLC- Bedingungen wurden auch die HPLC-Chromatogramme (UV-Detektion) des isolierten DLLL-Isomers (Fig. 3) und des Produktes der Kupplung von reinem L- FmocMeVal (Fig. 4) aufgezeichnet. Im letzteren Fall wurde ausschließlich das Signal des LLLL-Diastereomers gefunden (Fig. 4), d.h. es trat keine Epimerisierung auf.
Fig. 2: RP-HPLC-Chromatogramm eines Gemischs aus DLLL- und LLLL-Isomer (mAU = 10"3 Absorptionseinheiten).
Fig. 3: RP-HPLC-Chromatogramm des DLLL-Isomers.
Fig. 4: RP-HPLC-Chromatogramm des LLLL-Isomers.
A) Beispiel 4: Flüssigphasen-Synthese eines Dipeptids
Die geschützten N-Methyl-L-aminosäuren FmocMeVal-OH und MeVal-OBn wurden zum Dipeptid FmocMeVal-MeVal-Obn gekuppelt.
Dazu wurden 1,1 eq. der Fmoc-Aminosäure in THF in Gegenwart von 14 eq. 2,4,6- Collidin mit 0,5 eq. Triphosgen versetzt und die entstandene Aktivierungslösung in die Lösung von 1 eq. der Carboxy-geschützten Aminosäure und 14 eq. DIEA in THF gegeben.
Die Reaktion benötigte 5 min zur vollständigen Umsetzung. Es traten weder Neben- produkte auf noch fand Epimerisierung statt.
Beispiel 5 Synthese von Cyclosporin O
Zunächst wurde als Vorstufe das lineare Undecapeptid mit der Sequenz
H-Nva-Sar-MeLeu-Val-MeLeu-Ala-D-Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeLeu-(TCP- Harz)
am TCP-Harz aufgebaut und dieses nach der Abspaltung vom Harz zum Cyclosporin O (IV) cyclisiert.
Figure imgf000021_0001
1) Aufbau der linearen Undecapeptid- Vorstufe:
Die Belegung von 150 mg TCP-Harz erfolgte mit 55 mg Fmoc-MeLeu-OH (3 eq) in
77 μl DCM mit 3 eq DIEA über 3 Stunden. Anschließend wurde das Undecapeptid mit zehn Kupplungen aufgebaut. Nach jeder Kupplung wurde der Chloranil-Test oder der Kaiser-Test durchgeführt (Fmoc Solid Phase Synthesis, W. C. Chan, P. D. White (Hrsg.), Oxford University Press, 2000, S. 61 ff). Im Falle eines negativen Testergebnisses wurde erneut gekuppelt.
In Ergänzung zu erfindungsgemäßen Kupplungen mit Triphosgen als Aktivierungsreagenz wurden an speziellen Syntheseabschnitten zusätzlich Kupplungen mit der Aktivierungsreagenz-Kombination aus Diisopropylcarbodiimid (DIC) und Hydroxyazabenzotriazol (HOAt) durchgeführt. Der Einsatz dieser Reagenzien erfolgte in der folgenden Weise: 3 eq. der N-geschützten Aminosäure wurden jeweils in einer Lösung von 3 eq. HOAt und 3 eq. DIEA in CH2C12 gelöst. Zu dieser Lösung wurden 3 eq. DIC gegeben. Nach 5- bis 10-minütiger Voraktivierung wurde die Reaktionslösung zum Peptidylharz gegeben. Die Reaktionszeit betrug jeweils 12 Stunden. Die Kupplungen mit Triphosgen wurden wie Beispiel 1 beschrieben durchgeführt, wobei die Reaktionszeit jeweils 2,5 oder 3 Stunden betrug.
Die Kupplungen wurden im Einzelnen wie folgt durchgeführt, wobei unter anderem das Aktivierungsreagenz und die Reaktionszeit in Stunden angegeben ist:
1.) MeVal- MeLeu-(TCP-Harz): Triphosgen, 3 h:
IR-Kontrolle zeigt Fmoc-Bande, Chloranil-Test positiv •^ erneute Kupplung über die Triphosgen, 3 h: Chloranil-Test negativ
2.) MeLeu- MeVal: Triphosgen, 3 h:
Chloranil-Test negativ, HPLC: 100 % Fläche Produktpeak
3.) MeLeu - MeLeu: Triphosgen, 3 h:
Chloranil-Test negativ, HPLC: 99 % Fläche Produktpeak 4.) D-Ala-> MeLeu: Triphosgen, 3 h:
Chloranil-Test positiv., HPLC: 10 % Fläche Produktpeak ■» anschließende Kupplung mit HOAt/DIC, 12 h: Chloranil-Test negativ, HPLC: 95 % Fläche Produktpeak
5.) Ala- D-Ala: Triphosgen, 3 h:
Kaiser-Test pos. HPLC: 80 % Fläche Produktpeak ■ anschließende Kupplung mit HOAt/DIC, 12 h: Kaiser-Test negativ, HPLC: 98 % Fläche Produktpeak
6.) MeLeu-> Ala: Triphosgen, 3 h: Kaiser-Test negativ
7.) Val-^ MeLeu: Triphosgen, 3 h: Chloranil-Test positiv, HPLC: 60 % Fläche Produktpeak
•*■ anschließende Kupplung mit HOAt/DIC, 12 h: Chloranil-Test negativ
8.) MeLeu -> Val: Triphosgen, 3 h: Kaiser-Test negativ
9.) Sar- MeLeu: Triphosgen, 2,5 h: Chloranil-Test negativ
10.) Nva-> Sar: Triphosgen, 2,5 h:
Chloranil-Test negativ, HPLC: 96 % Fläche Produktpeak
Das Tetrapeptid Fmoc-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeLeu-OH wurde in einer Reinheit von über 99 % ausschließlich über erfindungsgemäße Kupplungen mit Triphosgen erhalten, die wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt wurden. Nur die erste Kupplung musste dabei einmal wiederholt werden. Das HPLC-Spektrum des Tetrapeptids ist in Fig. 5 gezeigt.
Nach erfindungsgemäßer Kupplung des 5. Restes (Fmoc-D-Ala-OH) mit Triphosgen zeigte das HPLC nur 10 % Umsatz. Jedoch konnte die Reaktion durch zusätzlichen
Einsatz von HOAt/DIC-Kupplung zu vollständigem Umsatz geführt werden.
Die zehnte Kupplung zeigt, dass auch die erfindungsgemäße Kupplung mit Triphosgen einer nicht N-methylierten Aminosäure auf eine N-methylierte nahezu quantitativ verlaufen kann.
Mit der Kombination aus erfindungsgemäßen Kupplungen mit Triphosgen und Kupplungen mit HOAt/DIC wurde die lineare ungeschützte Undecapeptid- Vorstufe des Cyclosporins in einer HPLC-Ausbeute von 90 % erhalten (HPLC-Spektrum: s. Fig. 6).
2) Cyclisierung und Reinigung
Für die Abspaltung des linearen Peptids vom Harz wurde Hexafluorisopropanol verwendet. Das Rohpeptid wurde nach Gefriertrocknung direkt und ohne weitere
Aufarbeitung cyclisiert. Die Cyclisierung wurde in Dichlormethan mit HOAt, EDCI und DIEA über einen Zeitraum von 16 Stunden durchgeführt. Die Rohausbeute betrug ca. 75 bis 80 % (HPLC-Spektrum: s. Fig. 7).
3) Ausbeuteberechnung und Reinheitskontrolle
Die Belegung des Harzes mit der ersten Aminosäure betrug 0,4 mmol/g Harz. Es wurden 150 mg Harz eingesetzt, was einer Menge von 60 μmol Peptid am Harz entspricht (theoretische Ausbeute an linearer Vorstufe von Cyclosporin O (M = 1160,60) bei einem angenommenen Umsatz von 100 % pro Schritt: 69,6 mg). Nach Durchführung der gesamten Sequenz wurde eine Ausbeute an linearem Rohprodukt (M = 1178,62) von 36,0 mg (30,5 μmol, 50,8 %) erhalten.
Anschließend wurden 10,0 mg (8,5 μmol) Rohprodukt cyclisiert. Die Ausbeute betrug 8,1 mg (7,0 μmol; 82,4 %). Die Gesamtausbeute an Rohprodukt von
Cyclosporin O beträgt damit 41,8 %.
Die erhaltenen 8,1 mg Rohprodukt wurden mittels präparativer HPLC gereinigt, wobei 2,9 mg (2,5 μmol; 35,7 % des Rohproduktes) erhalten wurden. Die Gesamt- ausbeute bei der Herstellung von Cyclosporin in Bezug auf die erste Harzbeladung betrug damit 14,9 %.
Diese Ausbeute liegt innerhalb der Grenzen der meisten Flüssigphasen-Synthesen, die für verschiedene Cyclosporin- Analoga erhalten wurden. Η-NMR belegte die Identität des synthetischen Cyclosporin O mit dem Naturstoff. Es wurden keine
Diastereomere gefunden. Das Massenspektrum des gereinigten Cyclosporin O ist in Fig. 8 gezeigt.
Fig. 5: HPLC-Chromatogramm des Fmoc-geschützten Tetrapeptids Fmoc-MeL- MeL-MeV-MeL-OH (UV-Detektion: λ = 214 nm)
Fig. 6: HPLC-Chromatogramm des linearen entschützten Undecapeptides (UV- Detektion: λ = 214 nm)
Fig. 7: HPLC-Chromatogramm des Rohprodukts der Cyclisierungsreaktion zum
Cyclosporin O (UV-Detektion: λ = 214 nm).
Fig. 8: Massenspektrum des gereinigten Cyclosporin O. Beispiel 6 Synthese von Omphalotin A
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gelang erstmals die Totalsynthese von Omphalotin A. Omphalotin A ist ein Cyclododecapeptid mit einer hohen nematiziden Wirkung, insbesondere gegen den wichtigen pflanzenpathogenen
Nematoden Meloidogyne incognita (A. Mayer, H. Anke, O. Stemer, Nat. Prod. Lett. 1997, 10, 25-32; O. Sterner, W. Etzel, A. Mayer, H. Anke, Nat. Prod. Lett. 1997, 10, 33-38; WO 97/20857).
Zunächst wurde als Vorstufe das lineare Dodecapeptid mit der Sequenz
H-Sar-Val-MeΙle-Sar-Trp-MeVal-Ile-MeVal-MeVal-Sar-MeVal-MeΙle-(TCP-Harz)
am TCP-Harz aufgebaut und dieses nach der Abspaltung vom Harz zum Omphalotin A (V) cyclisiert.
Figure imgf000026_0001
1) Aufbau der linearen Dodecapeptid- Vorstufe
Die Belegung von 2 g TCP-Harz erfolgte mit 733 mg Fmoc-Melle-OH (3 eq) in 15 mL DCM mit 1 mL DIEA (3 eq) über 3 Stunden. Es wurde eine Beladung von 0,56 mmol/g ermittelt.
Anschließend wurde das Dodecapeptid mit elf Kupplungen aufgebaut. Nach jeder Kupplung wurde der Chloranil-Test oder der Kaiser-Test durchgeführt (Fmoc Solid Phase Synthesis, W. C. Chan, P. D. White (Hrsg.), Oxford University Press, 2000, S. 61 ff). Im Falle eines negativen Testergebnisses wurde erneut gekuppelt. In
Ergänzung zur erfindungsgemäßen Kupplung mit Triphosgen wurden an speziellen Syntheseabschnitten Kupplungen mit Diisopropylcarbodiimid (DIC) und Hydroxy- azabenzotriazol (HOAt) durchgeführt. Der Einsatz dieser Reagenzien erfolgte in der folgenden Weise: 3 eq. der N-geschützten Aminosäure wurden in einer Lösung von 3 eq. HOAt und 3 eq. DIEA in CH2CI2 gelöst. Zu dieser Lösung wurden 3 eq. DIC gegeben. Nach 5-10 min. Voraktivierung wurde die Reaktionslösung zum Peptidyl- harz gegeben (Reaktionszeiten wie angegeben).
Die Kupplungen wurden im Einzelnen wie folgt durchgeführt, wobei unter anderem das Aktivierungsreagenz und die Reaktionszeit in Stunden angegeben ist:
1.) Kupplung MeVal-> Meile: Triphosgen (wie Beispiel 1), 2,5 h: Chloranil-Test negativ.
2.) Kupplung Sar-^ MeVal: Triphosgen (wie Beispiel 1), 4 h:
Chloranil-Test negativ
3.) Kupplung MeVal - San Triphosgen (wie Beispiel 1), 3 h: Chloranil-Test negativ 4.) MeVal- MeVal: Triphosgen (wie Beispiel 1), 3 h:
Chloranil-Test negativ, HPLC 96 % Fläche Produktpeak (nach Fmoc- Entschützung).
5.) Ile- MeVal: HOAt/DIC, 16 h:
Chloranil-Test positiv, HPLC: ca. 80 % Fläche Produktpeak -» Nachkupplung mit HOAt/DIC, 20 h: Kaiser-Test negativ
6.) MeVal - He: Triphosgen (wie Beispiel 1), 1 h:
Kaiser-Test negativ, HPLC: ca. 95 % Fläche Produktpeak.
7.) Trp^ MeVal: HOAt, 18 h:
Chloranil-Test minimal positiv, HPLC: ca. 93 % Fläche Produktpeak.
8.) Sar-> Trp: Triphosgen (wie Beispiel 1), 1 h:
Kaiser-Test negativ, HPLC: 93 % Fläche Produktpeak.
9.) MeIle-> Sar: Triphosgen (wie Beispiel 1), 1 h: Chloranil-Test negativ, HPLC: 96 % Fläche Produktpeak.
10.) Val-» Meile: HOAt/DIC, 16 h:
Chloranil-Test positiv, HPLC: 85 % Fläche Produktpeak, ■ Nachkupplung mit HOAt/DIC, 15 h: Chloranil-Test negativ, HPLC: Fläche Produktpeak > 90% (Integration nicht möglich, da Peak am Anschlag des Detektors)
11.) Sar-> Val: Triphosgen (wie Beispiel 1), 1 h:
Kaiser-Test negativ, HPLC: 93 % Fläche Produktpeak.
(Alle HPLC-Reinheiten gelten für Fmoc-entschützte Peptide, λ = 214 nm) 2) Cyclisierung und Reinigung
Für die Abspaltung des linearen Peptids vom Harz wurde Hexafluorisopropanol verwendet. Das Rohpeptid (HPLC-Spektrum: s. Fig. 9, ESI-Massenspektrum: s. Fig.
10) wurde nach Gefriertrocknung direkt und ohne weitere Aufarbeitung cyclisiert. Es wurden aus vier Festphasenläufen 1,29 g (0.965 mmol) Rohprodukt an linearem Dodecapeptid für die Cyclisierung eingesetzt. Die Cyclisierung wurde in Dichlor- methan mit HOAt, EDCI und DIEA über einen Zeitraum von 16 Stunden durch- geführt. Die Rohausbeute betrug ca. 78 % (HPLC-Spektrum: s. Fig. 11).
3) Ausbeuteberechnung und Reinheitskontrolle
Die Belegung des Harzes mit der ersten Aminosäure betrug 0,56 mmol/g Harz. Es wurden insgesamt 2,0 g Harz eingesetzt, was einer Menge von 1,12 mmol Peptid am
Harz entspricht (theoretische Ausbeute an linearer Vorstufe von Omphalotin A (M = 1318,77) bei einem angenommenen Umsatz von 100 % pro Schritt: 1,48 g). Nach Durchführung der gesamten Sequenz wurde eine Ausbeute an linearem Rohprodukt (M = 1336,78) von 1,336 g (1,0 mmol, 89,2 %) erhalten.
Anschließend wurden 1,29 g (0,965 mmol) Rohprodukt, aufgeteilt in vier gleich große Ansätze, cyclisiert. Die Ausbeute betrug 1,11 g (0,842 mmol; 87,2 %). Die Gesamtausbeute an Rohprodukt von Omphalotin A beträgt damit 77,8 %.
70 mg Rohprodukt wurden mittels präparativer HPLC gereinigt, wobei 24,5 mg
(18,6 μmol; 35,0 % des Rohproduktes) erhalten wurden (HPLC-Spektrum: s. Fig. 12). Die Gesamtausbeute bei der Herstellung von Omphalotin A in Bezug auf die erste Harzbeladung betrug damit 27,2 %.
Η-NMR-Spektroskopie belegte die Identität des synthetischen Omphalotin A mit dem Naturstoff (Fig. 13) (NMR-Daten publiziert in: O. Sterner, W. Etzel, A. Mayer, H. Anke, Nat. Prod. Lett. 1997, 10, 33-38). Das Massenspektrum des gereinigten Omphalotin A ist in Fig. 14 gezeigt.
4) Racemisierungskontrolle von Omphalotin A (OmA)
Die Racemisierungstests wurden nach der Methode von König (W. König, I. Benecke, N. Lucht, E. Schmidt, J. Schulze, S. Sievers, J. Chromagogr. 1983, 279, 555-562) durchgeführt. Dazu wurde nach Totalhydrolyse des Peptids in DCl/D2O mit Isopropylisocyanat derivatisiert und die Derivate auf einer chiralen GC-Phase mit GC/MS vermessen. Die Hydrolyse in deuteriertem Lösungsmittel erlaubt die
Korrektur der Ergebnisse um den Anteil der Epimerisierung, der durch die Hydrolyse selbst verursacht wurde, da diese Derivate ein Deuteriumatom enthalten und aufgrund ihrer um 1 Da verschobenen Masse in der GC/MS -Analytik vernachlässigt werden können.
N-Me-D-MeVal N-Me-D-Melle N-Me-D-Melle
(Cyclisierungs- stelle)
Naturstoff 0,86 % 1,76 % -
Lineares Dodekapeptid 0,66 % 0,97 % -
OmA Rohprodukt 0,76 % 15,4 % ca. 30 %
OmA aufgereinigt 0,31 % 6,9 % ca. 14 %
Die Analyse der Epimerisierung des zeigt deutlich, dass die Kupplungsmethode an sich nahezu völlig racemisierungsfrei ist. Allerdings tritt während der Zyklisierung starke Epimerisierung ein. Das dabei entstehende falsche Diastereomer lässt sich säulenchromatographisch nicht vollständig abtrennen und verunreinigt dadurch das
Endprodukt (vgl. HPLC-Chromatogramme Fig. 11 und 12, das falsche Diastereomer eluiert selbst bei isokratischem Lauf als Schulter kurz nach dem Omphalotin A). Fig. 9: HPLC-Chromatogramm des linearen, entschützten Dodecapeptides (Rohprodukt nach Abspaltung vom Harz; Beispiel 6).
Fig. 10: ESI-Massenspektrum des linearen, entschützten Dodecapeptides (Rohprodukt nach Abspaltung vom Harz; Beispiel 6).
Fig. 11: HPLC-Chromatogramm des Rohprodukts der Cyclisierungsreaktion (Beispiel 6).
Fig. 12: HPLC-Chromatogramm des gereinigten Endprodukts, Omphalotin A
(Beispiel 6).
Fig. 13: Η-NMR-Spektrum (700 MHz, CD3OD) des gereinigten Endprodukts, Omphalotin A (Beispiel 6).
Fig. 14: ESI-Massenspektrum des gereinigten Endprodukts, Omphalotin A (Beispiel 6).
Beispiel 7 Verbesserte Synthese von Omphalotin A (V)
Um das Problem der Epimerisierung der C-terminalen Aminosäure während der Cyclisierung zu vermeiden, wurde die optisch nicht aktive Aminosäure Fmoc- Sarcosin als erste Aminosäure auf das Trägerpolymer gekuppelt. Dazu wurden 200 mg TCP-Harz (Substitution 1,04 mmol/g) mit einer Lösung von 1 eq Fmoc-Sar- OH und 3 eq DIEA in DCM(abs) versetzt und die Suspension für 3 h geschüttelt.
Danach wurde zu der Suspension etwa 0,5 ml Methanol gegeben, um die verbliebenen Tritylchloridfunktionen als Methylether zu cappen. Eine Fmoc- Bestimmung ergab eine Belegung von 0,58 mmol/g. Unter Berücksichtigung des theoretischen Massenzuwachses des Harzes von ca. 40 mg bedeutet dies, dass auf dem Syntheseharz 0,14 mmol Fmoc-Sarcosin immobilisiert waren. Bezogen auf diese Stoffmenge wurden für die BTC-Kupplung folgende Reagenzienüberschüsse eingesetzt:
Fmoc-Aminosäure: 3,5 eq
Triphosgen: 1,15 eq
Collidin: 10,0 eq
DIEA: 8,0 eq
Triphosgen wurde als Stammlösung mit einer Konzentration von 61,5 mmol/1 hergestellt (entsprechend 18,27 mg BTC pro Milliliter THF(abs)), von der pro mmol
Aminosäure 5,36 ml eingesetzt wurden. Daraus resultiert eine Aminosäurekonzentration von 0,19 mol/1.
Die grundsätzliche Vorgehensweise bei der Triphosgenkupplung ist bis auf zwei Ausnahmen analog zu Beispiel 6:
1.) Die Zugabe der nunmehr fast halbierten Menge an DIEA zum entschützten Peptidylharz erfolgte erst unmittelbar vor der Zugabe der Aktivierungslösung (Fmoc-Aminosäure, Triphosgen, Collidin in THF(abs)).
2.) Die Fmoc-Entschützung des Peptidylharzes mit Piperidin wurde zeitlich so kurz wie möglich gehalten, d.h. das Fmoc-geschützte Harz wurde 1 x 3 min und 1 x 8 min mit 20% Piperidin/DMF behandelt.
Beide genannten Maßnahmen sollten den Kontakt des Fmoc-entschützten Harzes mit
Base minimieren, um einen basenkatalysierten nucleophilen Angriff des freien Aminoterminus an der Tritylesterbindung des Sarcosin und die daraus folgende zyklisierende Abspaltung zu unterbinden. Diese Nebenreaktion, die auf der Stufe des Dipeptides zur bereits erwähnten Bildung von Diketopiperazinen führt, ist vermutlich verantwortlich für das Scheitern früherer Syntheseversuche von Omphalotin A und kürzerer Peptidsegmente mit Sarcosin als C-terminaler Aminosäure unter Anwendung der Triphosgenkupplung.
In einigen Fällen kam die Anwendung der HOAt-Kupplung zur Anwendung, die wie in Beispiel 6 durchgeführt wurde.
Weiterhin wurde in einigen Fällen die HATU-Kupplung verwendet. Bei dieser wurde wie folgt vorgegangen: Die zu kuppelnde Fmoc-Aminosäure (3,5 eq) wurde gemeinsam mit HATU (3,5 eq) eingewogen und in einer möglichst geringen Menge DCM(abs)/DMF(abs) (1:1) gelöst. Zu der Lösung wurde DIEA (7 eq) gegeben und für 15 min zur Voraktivierung stehengelassen. Danach wurde diese Lösung direkt zu dem in DMF(abs) vorgequollenen, entschützten Peptidylharz gegeben und für die jeweils angegebene Zeit geschüttelt. Die Reaktionslösung wurde abgesaugt und das Harz mit DMF, DCM, DMF, DCM, MeOH (jeweils 3x) gewaschen.
Die beschriebenen Änderungen ermöglichten die Synthese von optisch hochreinem Omphalotin A ausgehend von mit Fmoc-Sar belegtem TCP-Harz. Dabei wurde jedes der drei im Zielmolekül vorkommenden Sarcosine als C-terminale Aminosäure verwendet, was zu den folgenden drei unterschiedlichen linearen Vorläufermolekülen führte:
a.) H-Trp-MeVal-Ile-MeVal-MeVal-Sar-MeVal-Melle-Sar-Val-Melle-Sar-OH b.) H-Val-Melle-Sar-Trp-MeVal-Ile-MeVal-MeVal-Sar-MeVal-Melle-Sar-OH c.) H-MeVal-Melle-Sar-Val-Melle-Sar-Trp-MeVal-Ile-MeVal-MeVal-Sar-OH
Während die linearen Dodekapeptide in allen drei Fällen in sehr zufriedenstellenden Reinheiten anfielen, verlief die Zyklisierung nur in den Fällen a.) und b.) quantitativ; im Fall c.) waren im Endprodukt noch etwa 20 % des linearen Peptids vorhanden.
Exemplarisch soll hier die Synthesevariante über das lineare Dodekapeptid b.) gezeigt werden. Syntheseverlauf:
1.) Kupplung Meile -> Sar: Triphosgen, 3 h, Chloranil-Test negativ. 2.) Kupplung MeVal -> Meile: Triphosgen, 3 h, Chloranil-Test negativ. 3.) Kupplung Sar -> MeVal: Triphosgen, 2,5 h, Chloranil-Test negativ.
4.) Kupplung MeVal -> Sar: Triphosgen, 3 h, Chloranil-Test negativ.
HPLC-Reinheit: >98 %. 5.) Kupplung MeVal -> MeVal: Triphosgen 3 h, Chloranil-Test schwach positiv
Nachkupplung Triphosgen 3 h, Chloranil-Test negativ. HPLC-Reinheit: > 95 %.
6.) Kupplung Ile -> MeVal: HATU, 20 h, Chloranil-Test schwach positiv
Nachkupplung HATU 3 h, Chloranil-Test schwach positiv
Nachkupplung HOAt 16 h, Chloranil-Test negativ. HPLC-Reinheit: ca. 90 %. 7.) Kupplung MeV ->Ile: Triphosgen, 3 h, HPLC-Reinheit: 90 %. 8.) Kupplung Trp -> MeV: HATU 4 h, HPLC-Reinheit: 89 %.
9.) Kupplung Sar -> Trp: Triphosgen, 4 h, HPLC-Reinheit: 86 %. 10.) Kupplung Meile -> Sar: Triphosgen, 4 h, HPLC-Reinheit: 83 %. 11.) Kupplung Val -> Meile: HATU, 5 h, HPLC-Reinheit: 80 %.
Alle angegebenen HPLC-Reinheiten beziehen sich auf das Fmoc-geschützte Peptid
(λ=214 nm). Die verlängerten Reaktionszeiten der meisten BTC-Kupplungen resultieren in erster Linie aus der parallelen Reaktionsführung zur simultanen Synthese aller drei genannten linearen Vorläuferpeptide. Eine Verringerung der Kupplungseffizienz durch die Reduzierung der eingesetzten Reagenzienmengen wurde nicht beobachtet.
Die RacemisierungskontroUe des gemäß Beispiel 7 synthetisierten Omphalotin A (OmA) erfolgte wie unter Beispiel 6 beschrieben. N-Me-D-MeVal N-Me-D-Melle
Lineares Dodekapeptid 1,2 % 2,4 %
OmA Rohprodukt 1,5 % 3,2 %
Wie erwartet ist hier der Anteil an N-Me-D-Melle im zyklisierten Rohprodukt nicht deutlich erhöht gegenüber dem linearen Vorläuferpeptid, da es nicht an der Zykli- sierungsreaktion beteiligt ist. Diese Werte und die Peakschärfe des Zyklisierungs- produktes in den HPLC-Chromatogrammen (Fig. 15 und 16) bedeuten, dass die
Produktreinheit des gemäß Beispiel 7 synthetisierten Omphalotin A deutlich besser sein muss als die des gemäß Beispiel 6 erhaltenen Produkts. Das HPLC-Chromatogramm der aufgereinigten Verbindung (Fig 17) bestätigte dies. Eine Reinigung mittels präparativer HPLC lieferte das hochreine Produkt in einer Gesamtausbeute von 21 %.
Fig. 15: HPLC-Chromatogramm des Fmoc-entschützten, linearen Dodekapeptides (Beispiel 7).
Fig. 16: HPLC-Chromatogramm des Rohproduktes der Zyklisierungsreaktion
(Beispiel 7).
Fig. 17: HPLC-Chromatogramm des gereinigten, optisch reinen Omphalotin A (Beispiel 7).

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung von Carbonsäureamiden aus einer Säure-Komponente in Form einer mindestens eine Carboxy-Gruppe aufweisenden Ver- bindung und einer Amin-Komponente in Form einer mindestens eine primäre oder sekundäre Amino-Gruppe aufweisenden Verbindung, bei dem
(i) die Amin-Komponente zusammen mit einer Kupplungsbase in Form einer organischen Base mit mindestens einem Stickstoffatom in einem Lösungsmittel vorgelegt wird,
(ii) die Säure-Komponente mit einem Aktivierungsreagenz in Form eines Carbonats der Formel I,
O=C(-OX)2 (I)
das die beiden gleichen oder verschiedenen, getrennten oder miteinander verbundenen, elektronenziehenden Gruppen X aufweist,
dessen Monohalogenids der Formel II,
O=C(-OX)Y (II)
in der X die gleiche Bedeutung wie in Formel I hat und Y für ein Halogenatom steht,
oder dessen Dihalogenids der Formel III,
O=CYY' (III) in der Y und Y' unabhängig voneinander für je ein Halogenatom stehen,
und einer Aktivierungsbase in Form einer organischen Base mit mindestens einem Stickstoffatom in ein Lösungsmittel gegeben wird,
(üi) das die Säure-Komponente enthaltende Gemisch gemäß (ii) zu dem die Amin-Komponente enthaltenden Gemisch gemäß (i) gegeben wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Säure-Komponente und/oder die Amin-Komponente eine Aminosäure oder ein Peptid ist, deren übrige Carboxy- und/oder Amino-Gruppen geschützt sind.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass
a) die Säure-Komponente und die Amin-Komponente gleiche oder verschiedene Aminosäuren sind,
b) die Säure-Komponente eine Aminosäure und die Amin-Komponente ein Peptid ist oder
c) die Amin-Komponente eine Aminosäure und die Säure-Komponente ein Peptid ist,
wobei über die mindestens eine Carboxy-Gruppe und die mindestens eine primäre oder sekundäre Amino-Gruppe hinaus vorhandene weitere Carboxy- bzw. primäre oder sekundäre Amino-Gruppen geschützt sind.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Amino-Gruppe der Amin-Komponente eine sekundäre Amino-Gruppe und/oder die an das α-C-Atom der Säure-Komponente gebundene Aminogruppe eine tertiäre Amino-Gruppe ist, insbesondere die Amino-Gruppe der Amin-Komponente und die geschützte oder peptidisch verknüpfte Aminogruppe der Säure- Komponente beide N-alkyliert sind, vorzugsweise unabhängig voneinander N-alkyliert mit einer Methyl-, Ethyl-, Propyl-, iso-Propyl-, Cyclolhexyl- oder
Benzylgruppe.
5. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Amin-Komponente oder die Säure-Komponente reversibel an eine feste Phase gebunden ist, vorzugsweise an ein Harz, insbesondere an ein
Trityl-Harz, Wang-Polystyrol-Harz oder Rink-Amid-MBHA-Harz und besonders bevorzugt an TCP-Harz.
6. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Säure-Komponente und die Amin-Komponente in einem Verhältnis, bezogen auf die Stoffmenge, von mindestens 1 zu 1, vorzugsweise von 1 zu 1 bis 10 zu 1, insbesondere von 1 zu 1 bis 5 zu 1, eingesetzt werden.
7. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Säure-Komponente und das Aktivierungsreagenz in einem Verhältnis, bezogen auf die Stoffmenge, von mindestens 1 zu 1, vorzugsweise von 1 zu 1 bis 4 zu 1, insbesondere von 2 zu 1 bis 3 zu 1, eingesetzt werden.
8. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Kupplungsbase und/oder die Aktivierungsbase gemäß (ii) in einem
Verhältnis zur Amin-Komponente, bezogen auf die Stoffmenge, von mindestens 2 zu 1, vorzugsweise von 4 zu 1 bis 30 zu 1, insbesondere von 8 zu 1 bis 20 zu 1, besonders bevorzugt von 12 zu 1 bis 16 zu 1, eingesetzt werden.
. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Aktivierungsreagenz
ein Carbonat der Formel I, in der eine oder beide Gruppen X unabhängig voneinander für eine Gruppe CH3-nYn stehen, wobei n für eine der Zahlen 1, 2 oder 3 und Yn für ein, zwei oder drei gleiche oder verschiedene Halogenatome steht, stehen, insbesondere für eine der Gruppen CC13, CF3, CBr3, CHC12, CHF2, CHBr2, CHI2, CH2C1, CH2F oder CH2Br, oder
ein halogeniertes l,3-Dioxolan-2-onderivat, dessen vier Wasserstoffatome in
4- und 5-Position ganz oder teilweise durch ein, zwei, drei oder vier gleiche oder verschiedene Halogenatome substituiert sind, oder
ein Monohalogenid der Formel II, in der X für eine Gruppe CH3-nYn steht, wobei n für eine der Zahlen 1, 2 oder 3 und Yn für ein, zwei oder drei gleiche oder verschiedene Halogenatome steht, stehen, oder
ein Dihalogenid der Formel III,
vorzugsweise Triphosgen, Diphosgen, Phosgen und/oder 4,4,5,5-Tetrachlor- l,3-dioxolan-2-on,
besonders bevorzugt Triphosgen eingesetzt wird.
10. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Kupplungsbase und die Aktivierungsbase unabhängig voneinander ausgewählt sind
aus der Gruppe umfassend Pyridin und die ein- oder mehrfach alkylsub- stituierten Pyridinderivate, vorzugsweise aus den Collidinen, 2,4,6-Tritert- butylpyridin, 2,6-Ditert-butylpyridin, 2,6-Ditert-butyl-4-methylpyridin, 2,6- Dimethylpyridin, 2,3,5,6-Tetramethylpyridin, 2-Methylpyridin, Pyridin, oder
aus der Gruppe der Trialkylamine, vorzugsweise aus Diisopropylethylamin, Triisopropylamin, N-Methylmo holin, Triethylamin.
11. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Kupplungsbase 2,4,6-Collidin, Pyridin, Triethylamin oder ein sterisch gehindertes Trialkylamin ist, vorzugsweise ein sterisch gehindertes Trialkylamin, insbesondere Diisopropylethylamin oder Triisopropylamin, besonders bevorzugt Diisopropylethylamin.
12. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Aktivierungsbase ein sterisch gehindertes ein- oder mehrfach alkyl- substituiertes Pyridinderivat ist, vorzugsweise 2,4,6-Collidin, 2,4,6-Tritert- butylpyridin, 2,6-Ditert-butylpyridin, 2,6-Ditert-butyl-4-methylpyridin, 2,6-Dimethylpyridin oder 2,3,5,6-Tetramethylpyridin, besonders bevorzugt 2,4,6-Collidin.
13. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Lösungsmittel gemäß (i) und (ii) unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Tetrahydrofuran, 1,4-Dioxan, Tetrahydropyran, Ethylenglykoldimethylether, Diethylenglykoldimethylether, Trichlormethan, 1,3-Dichlor- propan, 1 ,2-Dichlorethan, Nitromethan oder ein Gemisch zweier oder mehrerer davon, vorzugsweise Tetrahydrofuran, 1,4-Dioxan, Tetrahydropyran, Ethylenglykoldimethylether oder Diethylenglykoldimethylether oder ein Gemisch zweier oder mehrerer davon, insbesondere Tetrahydrofuran.
14. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 13 bei der Herstellung biologisch aktiver N-Alkylamide.
15. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Herstellung biologisch aktiver N-Alkylamide.
16. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Herstellung N-methylierter cyclopeptidischer biologisch aktiver Naturstoffe, vorzugsweise von Cyclosporinen, Tentoxinen, Dolastatinen, Jaspamiden, Didemniden und Nodularinen, insbesondere von Cyclosporin O und Omphalotin A.
17. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur
Herstellung von Peptiden, die anstelle einer oder mehrerer nicht-N- alkylsubstituierter Aminosäuren eine oder mehrere N-Methylaminosäuren aufweisen, für den Einsatz in einem Funktionalitätsscreening.
PCT/EP2002/003153 2001-03-28 2002-03-21 Verfahren zur herstellung von carbonsäureamiden Ceased WO2002076927A2 (de)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP02735153A EP1373190A2 (de) 2001-03-28 2002-03-21 Verfahren zur herstellung von carbonsäureamiden

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10115213.2 2001-03-28
DE10115213 2001-03-28
DE10126431.3 2001-05-31
DE10126431 2001-05-31
DE10157882A DE10157882A1 (de) 2001-03-28 2001-11-26 Verfahren zur Herstellung von Carbonsäureamiden
DE10157882.2 2001-11-26

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2002076927A2 true WO2002076927A2 (de) 2002-10-03
WO2002076927A3 WO2002076927A3 (de) 2003-01-03

Family

ID=27214365

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2002/003153 Ceased WO2002076927A2 (de) 2001-03-28 2002-03-21 Verfahren zur herstellung von carbonsäureamiden

Country Status (3)

Country Link
US (1) US6982315B2 (de)
EP (1) EP1373190A2 (de)
WO (1) WO2002076927A2 (de)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008511543A (ja) * 2004-07-16 2008-04-17 ロンザ ア−ゲ− ペプチド合成の方法
US7361636B2 (en) 2004-10-06 2008-04-22 Amr Technology, Inc. Cyclosporin alkynes and their utility as pharmaceutical agents
US7378391B2 (en) 2004-09-29 2008-05-27 Amr Technology, Inc. Cyclosporin alkyne analogues and their pharmaceutical uses
US7511013B2 (en) 2004-09-29 2009-03-31 Amr Technology, Inc. Cyclosporin analogues and their pharmaceutical uses
US7538084B2 (en) 2003-03-17 2009-05-26 Amr Technology, Inc. Cyclosporins
US7696165B2 (en) 2006-03-28 2010-04-13 Albany Molecular Research, Inc. Use of cyclosporin alkyne analogues for preventing or treating viral-induced disorders
US7696166B2 (en) 2006-03-28 2010-04-13 Albany Molecular Research, Inc. Use of cyclosporin alkyne/alkene analogues for preventing or treating viral-induced disorders

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2472563B (en) * 2009-04-28 2013-02-27 Univ Leicester Method of preparing hairpin and cyclic polyamides
CN104744570A (zh) * 2013-12-31 2015-07-01 深圳先进技术研究院 一种环孢菌素的合成方法
CN107188816B (zh) * 2017-06-14 2023-06-06 上海欧睿生物科技有限公司 一种改进的脂肪酸单乙醇酰胺的合成方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS55145665A (en) * 1979-05-02 1980-11-13 Haruo Ogura Agent for forming active ester of amino acid
US5948693A (en) * 1994-09-01 1999-09-07 Wisconsin Alumni Research Foundation Solid phase synthesis of immunosuppressive agents
DE19545463A1 (de) * 1995-12-06 1997-06-12 Bayer Ag Organisch-chemische Verbindung und Verfahren zu ihrer Herstellung
IL125314A (en) * 1998-07-12 2004-07-25 Peptor Ltd Processes for attaching amino acids using a bite - (trichloromethyl) carbonate

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7538084B2 (en) 2003-03-17 2009-05-26 Amr Technology, Inc. Cyclosporins
JP2008511543A (ja) * 2004-07-16 2008-04-17 ロンザ ア−ゲ− ペプチド合成の方法
US7378391B2 (en) 2004-09-29 2008-05-27 Amr Technology, Inc. Cyclosporin alkyne analogues and their pharmaceutical uses
US7511013B2 (en) 2004-09-29 2009-03-31 Amr Technology, Inc. Cyclosporin analogues and their pharmaceutical uses
US7361636B2 (en) 2004-10-06 2008-04-22 Amr Technology, Inc. Cyclosporin alkynes and their utility as pharmaceutical agents
US7632807B2 (en) 2004-10-06 2009-12-15 Albany Molecular Research, Inc. Cyclosporin alkynes and their utility as pharmaceutical agents
US7696165B2 (en) 2006-03-28 2010-04-13 Albany Molecular Research, Inc. Use of cyclosporin alkyne analogues for preventing or treating viral-induced disorders
US7696166B2 (en) 2006-03-28 2010-04-13 Albany Molecular Research, Inc. Use of cyclosporin alkyne/alkene analogues for preventing or treating viral-induced disorders

Also Published As

Publication number Publication date
US6982315B2 (en) 2006-01-03
US20020193594A1 (en) 2002-12-19
EP1373190A2 (de) 2004-01-02
WO2002076927A3 (de) 2003-01-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69435011T2 (de) Selektiv spaltbare Linker, die auf einer Methionin- und einer Estergruppe basieren
DE69230610T2 (de) Peptide mit zyklischen Hauptketten, deren Herstellung und diese enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen
DE69216150T2 (de) Tachykininderivate, deren Herstellung und diese enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen
DE2540780C2 (de)
WO1980002560A1 (fr) Procede de prefabrication du polypeptide thymosine1 et de derives de celui-ci
CH645342A5 (de) Biologisch aktive peptide.
CH620196A5 (de)
DE3827415A1 (de) Peptidderivate, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
DE3177306T2 (de) Verfahren und Verbindungen zur Herstellung von H-ARG-X-Z-Y-TYR-R.
EP1163264B1 (de) Neue lhrh-antagonisten mit verbesserten löslichkeitseigenschaften
DE10107707A1 (de) Antagonisten für alpha¶4¶beta¶7¶-Integrin
EP1373190A2 (de) Verfahren zur herstellung von carbonsäureamiden
EP0729972A1 (de) Tetrahydronaphthalin-Peptidderivate
DE69105207T2 (de) Peptidverbindungen mit wachstumshormonfreisetzender aktivität.
DD200799A5 (de) Verfahren zur herstellung von peptiden
EP0292729B1 (de) Neue Festphasen-Peptidsynthesemethoden
DE69604759T2 (de) N alpha-2-(4-nitrophenylsulfonyl)ethoxycarbonyl-aminosäuren
EP0640618B1 (de) Tetrahydronaphthalin-Peptidderivate
DE19942624A1 (de) Verfahren zur Herstellung von zyklischen Peptidomimetika
DE60123115T2 (de) Verfahren für die synthese eines lhrh peptides
DE69511259T2 (de) N-amidino- dermorphin-derivat
EP0475184A1 (de) Verfahren zur Herstellung von Peptiden mittels Festphasensynthese
CH639941A5 (en) Polypeptides, process for their preparation and their use
EP0295540B1 (de) Allylische Seitenketten enthaltendes Festphasensystem, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung in Festphasenreaktionen
DE10157882A1 (de) Verfahren zur Herstellung von Carbonsäureamiden

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NO NZ OM PH PL PT RO RU SD SE SG SI SK SL TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
AK Designated states

Kind code of ref document: A3

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NO NZ OM PH PL PT RO RU SD SE SG SI SK SL TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A3

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2002735153

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2002735153

Country of ref document: EP

REG Reference to national code

Ref country code: DE

Ref legal event code: 8642

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Country of ref document: JP