WO2002045732A1

WO2002045732A1 - Proliferation promoters for enteric bifidobacteria

Info

Publication number: WO2002045732A1
Application number: PCT/JP2001/010127
Authority: WO
Inventors: Fumiyasu Ishikawa; Tohru Iino; Yasuhisa Shimakawa; Emi Yasuda
Original assignee: Yakult Honsha Co Ltd
Current assignee: Yakult Honsha Co Ltd
Priority date: 2000-12-05
Filing date: 2001-11-20
Publication date: 2002-06-13
Anticipated expiration: 2003-06-05
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Description

腸内ビフィドパクテリゥム属細菌の増殖促進剤

技術分野

本発明は、腸内に存在するビフィ明ドバクテリゥム属細菌の増殖促進剤に関する ( 細

京技術

プロバイオテイクスとは、生菌で、経口投与により宿主の腸内フローラを改善し、宿主の健康に寄与するものと定義されている（Gibson, G. R. & Roberfroi d, M. B. , J. Nut r. , Vo l. 125, ρρ1401-1412, 1995 年）。ビフイドバクテリウム属細菌は腸内フローラの主要な菌属であるとともに、ビフィドバクテリゥム属細菌の少ないフローラが疾病と密接に関連しているために、ビフィドバクテリゥム属細菌が多いフローラは健康維持に役立つ 1つの指標とされている。投与菌がプロバィォテイクスとして生きた状態で腸管内で働くためには、宿主の上部消化管バリァーを通過し、作用部位である下部消化管に達する必要があり、場合によっては消化管内で増殖する必要がある。従って、プロバイオテイクスとしての生菌の関与を言及する場合、下部消化管での投与菌の生存を確認することが必須である。そのために、糞便からの投与菌の回収性を調査する方法が良く採用されている (松本一政ら、腸内フローラとプロバイオテイクス、学会出版セン夕一、 1 9 9 8年、 5 6— 7 3頁)。近年、腸内フローラを健全な状態に保つ効果を示す乳酸菌やビフィドバクテリゥム属細菌を含む食品が特定保健用食品として認可されて巿場に受け入れられてきた。しかし、生菌の関与を示す根拠の 1つである投与菌の回収性について言及する例は少なく（田中隆一郎、大脇真、腸内フローラと食餌、学会出版センター、 1 9 9 4年、 8 5— 1 0 4頁)、多くの場合、腸管内に生きた状態で届くことには全く触れていない。特にビフィドバクテリゥム属細菌の場合、むしろ生きた状態で腸管内に届きにくいとさえいわれている。

このように、生菌含有食品であっても腸管内に生きて届くことが確認されないものやそのために生菌の効果が検証できないものがあり、プロバイオテイクスとしての条件を満足させるものは少なかった。特に、ビフィドバクテリゥム属細菌については消化管パリァ一に対して抵抗性が低いので、生理効果を示し且つ糞便回収性を示した例は極めて限定されている。田中らは、糞便からの回収性が比較的良好な Bi f idobacterium breve YIT4006株を用いてガラクトオリゴ糖の併用効果を調査したところ、投与ビフィドバクテリゥム属細菌の回収菌数の増加が大腸菌群ゃパクテロイデス属細菌の減少及び尿中インディカン排出量の低下に関連することを報告している（Tanaka, R. , et al.， Bi f idobacteri a Microf lora,

Vol . 2, ppl 7-24, 1983 年）。また同様の効果は、小林らにより、大豆オリゴ糖ゃコンニヤクマンナン分解物の併用でも観察されている（小林洋一ら、腸内フローラと食物因子、学会出版センター、 1 9 8 4年、 6 9— 9 0頁）。これらの例では、投与ビフィドバクテリゥム属細菌の回収菌数を増加させる方法としてガラクトォリゴ糖ゃコンニヤクマンナン分解物が有効であつたが、それらの有効量として 1 日あたり 3 g以上の投与が必要であった。また、大豆オリゴ糖を用いた場合、 1 日あたり 1 0 gの投与でも増加傾向を示すのみであり、その回収菌数は、高いポランティアサンプルでも糞便 1 gあたり 1 0 ⁸個程度に留まっていた。以上のように、大豆オリゴ糖に関する報告例では、大豆オリゴ糖による腸内ビフイドバクテリウム属細菌の増加と投与ビフィドバクテリゥム属細菌の回収性との間に関連性が認められておらず、またこの関連性を示す明確な事例もない。

大豆製品は、栄養的に優秀な食品であるばかりでなく、動脈硬化やがん、更年期症、骨粗鬆症等の成人病予防にも優れた効果を持っていることが確認されており、現在では、これら製品を西洋化した食生活の中に積極的に採り入れることが臨床栄養学的に推奨されている。また、古来より本邦では、大豆は重要な食材として、多くの食品に利用されている。特に、大豆タンパク質の特性を利用して、豆乳、豆腐、がんもどき、ゆばなどの大豆調製物、あるいは納豆、味噌、醤油などの大豆醱酵物、更にハム、ソーセージ、ハンバーグ、かまぼこ、はんぺん、ちくわなどの加工食品等が作られている。これまでに広範な食品に利用されている大豆であるが、乳製品とは異なり、乳酸産生菌、特にビフイドパクテリゥム属細菌の生菌を含む食品として利用された例はあまり多くなかった（特開平 9— 2 3 8 6 4 7号、特開平 1 0— 1 3 0 1 6 0号、特開平 1 1— 7 5 6 8 7号、特開平 1 1— 7 5 8 2 8号）。

本発明の目的は、ビフィドバクテリゥム属細菌が生きたまま腸管内に到達するだけでなく、腸内に存在するビフィドバクテリゥム属細菌の増殖を積極的に促進させる組成物を提供することにある。発明の開示

本発明者は、各種のビフイドパクテリゥム属細菌生菌含有醱酵物を調製し、それをヒトに投与して糞便から回収される菌について種々検討した結果、ビフィドパクテリゥム属細菌による大豆酷酵物に、ヒト糞便からの投与ビフィドパクテリゥム属細菌の回収性改善作用だけでなく、腸内ビフィドバクテリゥム属細菌の増殖促進作用があることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は、大豆又は大豆加工物のビフイドバクテリゥム属細菌による醱酵物を有効成分とする腸内ビフィドパクテリゥム属細菌の増殖促進剤を提供するものである。

また本発明は、大豆又は大豆加工物のビフィドバクテリゥム属細菌による醱酵物を有効成分とするビフィドバクテリゥム属細菌の腸内到達度向上剤を提供するものである。

また本発明は、大豆又は大豆加工物のビフィドバクテリゥム属細菌による醱酵物を有効成分とする腸内環境改善剤を提供するものである。また本発明は、大豆又は大豆加工物のビフィドバクテリゥム属細菌による醱酵物を投与することを特徴とする腸内ビフィドバクテリゥム属細菌の増殖促進方法を提供するものである。

また本発明は、大豆又は大豆加工物のビフィドパクテリゥム属細菌による醱酵物を投与することを特徴とするビフィドバクテリゥム属細菌の腸内到達向上方法を提供するものである。

さらにまた本発明は、大豆又は大豆加工物のビフィドバクテリゥム属細菌による醱酵物を投与することを特徴とする腸内環境改善方法を提供するものである。図面の簡単な説明

図 1は、ビフィドバクテリゥム属細菌による醱酵豆乳中での大豆オリゴ糖の含量変化を示す図である。

図 2は、ビフイドバクテリウム ·ブレーべ Y I T 4 0 1 4による醱酵豆乳と醒酵乳の保存日数と酸胆汁処理後の生菌数との関係を示す図である。

図 3は、ビフイドバクテリウム ·ロンガム Y I T 4 0 2 1による醱酵豆乳と醱酵乳の保存日数と酸胆汁処理後の生菌数との関係を示す図である。

図 4は、ビフイドバクテリウム ·ロンガム Y I T 4 0 3 7による醱酵豆乳と醱酵乳の保存日数と酸胆汁処理後の生藺数との関係を示す図である。発明を実施するための最良の形態

本発明に用いられる醱酵物は、大豆又は大豆加工物のビフィドパクテリゥム属細菌醱酵物であってビフィドバクテリゥム属細菌生菌を含有しているものである。大豆又は大豆加工物としては、取扱の簡便さから大豆抽出液や大豆タンパク懸濁液などの液状の加工物が好ましく、豆乳は更に好ましい。また、大豆抽出液や大豆タンパク質懸濁液などの液状の大豆加工物は、予め糖質、脂質、タンパク質、ール等に対する分解あるいは変換酵素によつて処理することができるし、またイオン交換担体、疎水結合性担体、ァフィ二ティクロマトグラフィー担体等の各種吸着剤によって処理することもできる。大豆又は大豆加工物の醱酵物としては、取扱の簡便さから大豆抽出液や大豆タンパク懸濁液などの液状の加工物の醱酵物が好ましく、特に豆乳醱酵物が好ましい。大豆又は大豆加工物の醱酵物には、大豆又は大豆加工物以外の植物性食品材料又は動物性食品材料を適宜割合、添加物として添加しても良い。更に食品又は経口医薬品に通常使用されている添加物を加えても良い。

ここで用いる添加物としては、糖類、タンパク質、ペプチド、脂質、ビタミン類、ミネラル類、野菜、穀物、果実などの植物成分、血液、乳、肝臓、骨、筋肉などの動物成分、細菌、カビ、酵母、キノコなどの微生物成分あるいは培養物成分、ゲル化剤、固化剤、増粘剤、香料、着色料、ビフィドバクテリゥム属細菌増殖促進剤、乳酸菌増殖促進剤等が挙げられる。

より具体的には、グルコース、シユークロース、フラクトース、マルト一ス、ブドウ糖果糖液糖、蜂蜜、メイプルシロップ、甘酒等の各種甘味料、ソルビトール、キシリトール、エリスリトール、ラクチトール、パラチニット等の各種糖ァルコール、スクラロース、アスパルテーム等の各種高甘味度甘味料、甘草、ステビア、グリチルリチン酸配糖体などの各種天然甘味料、ショ糖脂肪酸エステル、グリセリン糖脂肪酸エステル、レシチン等の各種乳化剤、寒天、ゼラチン、カラギーナン、グァーガム、アラビアガム、キサンタンガム、ぺクチン、ローカストビーンガム等の各種増粘（安定）剤が挙げられる。

このほかにも、夕ガト一ス、ラクト一ス、トレ八ロース、トレハルロース、ァガロオリゴ糖、ニゲロオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、フラクトオリゴ糖、キシロオリゴ糖、ラフイノース、スタキオース、ラクチュロース、マルトトリオース、イソマルトオリゴ糖、シクロデキストリン、ダルコサミン、 N—ァセチルダルコサミン等の各種糖質、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、フコィダン、サルガッサン、フルセラン、フノラン、ボルフイラン、ァミナラン、プルラン、タラガム、コンニヤクマンナン、ィヌリン、キチン、キトサン、ポリデキストロース、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、 j3—グルカン、マンナン、ガラクタン、フルクタン、キシラン、ァラビナン、ァラビノガラクタン、ダルコマンナン、ガラク卜マンナン、ビートファイバ一、オート麦ファイバ一、小麦ファイバー、大豆ファイバ一、米ファイバー、大麦ファイバー、キサンタンガム、コーンファイバ ―、リンゴファイバー、シトラスファイバー、サイリュームファイバ一、パインファイバー、プル一ンファイバー、エンドゥ豆ファイバー、バナナファイバー、酢酸菌バクテリアセルロース、乳酸菌菌体細胞壁、ビフイドパクテリゥム属細菌菌体細胞壁、酵母菌体細胞壁、納豆フラクタン、コラーゲン、納豆ポリダルタミン酸等の各種食物繊維あるいはそれら食物繊維の各種加水分解物、小麦フスマ、大麦フスマ、米フスマ、カラス麦フスマ、オーツ麦フスマ、ライ麦フスマ、サイリュウム、米糠、玄米、チッコリー、大豆おから、アップルパルプ、レジスタントスターチ、大麦麦芽、トウモロコシ種子外皮、乳酸菌菌体、ビフイドパクテリゥム属細菌菌体、ビール酵母菌体、ワイン酵母菌体、ワイン粕、酒粕、しょうゆ粕、ビール粕、米麹、麦麹、豆麹、紅麹、黄麹、納豆粘質物、ブドウ種子抽出物、ローヤルゼリー、プロポリス、クロレラ、スピルリナ、ユーグレナ、ワカメ、コンブ、ホンダワラ、ァラメ、カジメ、アサクサノリ、ァオノリ、ヒジキ、ァォサ、モズク等の難消化性の食物繊維を多く含む各種素材が挙げられる。

さらに、カルシウム、マグネシウム、亜鉛、鉄、マンガン、ヨウ素、セレン、銅、コバルト、ドロマイト等の各種ミネラル類あるいはそれらミネラルの各種塩類、クェン酸、リンゴ酸、酒石酸、ピルビン酸、ダルコン酸、コハク酸、フマル酸、ァスコルビン酸、乳酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、リン酸、クレアチン、メチォニン、システィン、グルタミン酸などのアミノ酸等の各種酸類あるいはそれらの酸類の各種塩類、ダルタチオン、フィチン、フィチン酸、リグニン、ポリ

—ァーグルタミン酸およびその分解物、サポニン、フェルラ酸、ァーァミノ酪酸、 r一オリザノール、カルコン、フラバノン、フラボン、フラボノール、イソフラボン、アントシアン、カテキン、プロアントシァニジン、茶葉ポリフエノール、クルクミド、カブサイシノイド、セサミノ一ル、ゴマリグナン、テアフラビン、 βジケトン類、カロチノイド類、ァリルィォゥ化合物、イソチオシアナ一ト類、テルペン類、クロロフィル類、スフインゴ脂質、ガンダリオシド、 η _ 3多価不飽和脂肪酸類、 η— 6多価不飽和脂肪酸類、共役リノール酸類、リン脂質類、植物ステロール類等の各種成分、グリシニン、コングリシニン等の大豆タンパク、オボアルブミン、オボムコイド等の卵タンパク、カゼイン、ラク卜アルブミン、ラクトフエリン等の乳タンパクおよび乳清タンパク、カゼインホスホペプチド、ォリゼニン等の米タンパク、グルテニン、グリアジン等の小麦タンパク、魚肉夕ンパク等の各種夕ンパク類およびそれらの酵素分解べプチドおよび酸分解べプチド類、ビタミン Α、ビタミン Β群、ビタミン C、ビタミン D群、ビタミン E、ビタミン K群、 βカロチン、レチノイン酸、葉酸等の各種ビタミン類、ブラックコホッシュ、セィヨウカポチヤ種子、ザクロ種子、セィヨウオトギリソゥ、パッシヨンフラワー、バレリアン、プエラリア ·ミリフイカ、ローズマリ一、ペパーミント、パセリ、マリーゴールド、レモンバ一ム、ョモギ、サフラワー、ダイコン種子、コ一ヒーノキ、ゥコギ、ユウガオ果実、ミカン科果皮、イチヨウ葉、ナツメ、クコシ、甘草、霊芝、高麗ニンジン、ガラナ等の各種エキス類、緑茶、紅茶、ウーロン茶、ギムネマ茶、グアバ葉等の各種植物抽出物、コショウ、サンショウ、シナモン、タ一メリック、セイジ、タイム、バジル、トウガラシ、ナツメグ等の各種香辛料が挙げられる。

また、米、玄米、大麦、小麦、オーツ麦、ライ麦、ハトムギ、アマランサス、ァヮ、キビ、ソバ、モロコシ、トウモロコシ等の各種穀物の成分あるいはそれら穀物の種子の各種発芽物成分、ァズキ、シロアズキ、キントキマメ、インゲンマメ、エンドゥマメ、ムラサキハナマメ、チヤナマメ、クロダイズ、ァオダィズ、リヨクトウ、ソラマメ、ダイフクマメ、ァシタバ、ケ一ル、ゥコン、ジャガイモ、サツマィモ、紫サツマィモ、ャマィモ、カポチヤ、ナス、トマト、二ガウリ、ピ —マン、ゴマ、キャベツ、ブロッコリ一、カリフラワー、レタス、エダマメ、シヨウガ、ゴボウ、セロリ、ダイコン、ヮサビ、アボカド、ニンジン、ホウレンソゥ、夕マネギ、ニンニク、ユリ、ラツキヨウ、シソ、ネギ、ニラ、パース二ップ、ヮラビ、タケノコ、シィタケ、マッシュルーム等の各種野菜成分、レモン、リンゴ、ブドウ、イチゴ、才レンジ、カキ、グアバ、バナナ、ブル一ベリー、ブラックベリ一、クランベリー、キイチゴ、コケモモ、ャマモモ、フェイジョァ、タマリロ、ァセロラ、ライム、シークヮ一サ一、メロン、モモ、マンゴー、ュズ、パパイァ、パインアップル、ナシ、プラム、グレープフルーツ、カリン、アンズ、ミカン、ザクロ、スイカ、ブルーン、キウイ等の果実成分、ピーナッツ、ァ一モンド、ココナッツ、カシュ一ナッツ、マカデミアナッツ、カカオ、クリ、ギンナン、クルミ等の各種ナッツ成分、牛乳、脱脂乳、乳清、クリーム、醱酵乳、ョ一ダルト、乳タンパク、カゼイン、清乳タンパク等の各種乳製品およびそれらの成分、清酒、ブドウ酒、紹興酒、ビール等の醸造酒類、ウイスキー、ブランデー、ゥォッ力等の蒸留酒類等が挙げられる。

本発明に用いる醱酵物の製造に用いるビフィドバクテリゥム属細菌は、ビフィドパクテリゥム属に属する微生物であれば種類は問わないが、人間の腸内フ口一ラの主要なメンバーであるビフィドバクテリゥム ·ブレーべ（Bifidobacterium breve) > ビフィドバクテリゥム ·ロンガム（Bifidobacterium longum)、ビフィドパクテリゥム ·インファンテイス (Bifidobacterium infantis), ビフイドバクテリウム 'アドレセンティス（Bifidobacterium adolescentis)、ビフイドバクテリゥム · ビフィダム（Bifidobacterium bifidum), ビフィドバクテリゥム ·カテヌラ夕ム（Bifidobacterium catenulatum), ビフィドバクテリゥム ·シュ一ドカテヌラタム（Bifidobacterium pseudocatenulatum)、ビフイドバクテリゥム 'アンギユラタム（Bifidobacterium angulatum) などが好ましく、特にプロバイオティ認められている Bifidobacterium breve YIT4065 (FERM BP- 6223)であれば更に好ましい。そして更に Bifidobacteri腿 breve YIT4065 を親株とする子孫株であっても十分に利用できる。ここで云う子孫株は自然変異株、変異処理による変異株、遺伝子操作による変異株等を含む。また人間の腸内から分離される経験を持つビフィドバクテリゥム属細菌であるビフィドバクテリゥム ·ガリカム

(Bifidobacterium gal li cum) や食品に利用されているビフィドバクテリゥム属細菌であるビフイドバクテリウム · ラクテイス（Bifidobacterium lactis)、ビフィドバクテリゥム ·アニマリス（Bifidobacterium animalis) なども利用できる。愛玩動物や家畜などに対しては、ビフィドバクテリゥム · シュ一ドロンガム (Bifidobacterium pseudolongum)、ヒフィ卜、ノクテリゥム · グ ππポサム ( Bifidobacterium globosum ) 、ビフイドノクテリゥム ' スイス (Bifidobacterium suis )、ビフィドノクテリゥム · サ一モフィラス (Bifidobacterium thermophi lus) なども禾 U用できる。

本発明に用いる醱酵物の製造には、ビフィドバクテリゥム属細菌以外の微生物を併用することも可能である。ラクトバチルス 'ァシドフィルス（Lactobacillus acidophilus), ラクトバチルス ·ガセリ (Lactobacillus gasseri), ラクトバチルス ' マリ (Lactobacillus mali )、ラク卜バチルス · プランタラム

(Lactobacillus plantarum)、ラク卜ノ^チフレス · ペントサス (Lactobacillus pentosus)、ラクトバチルス · ブヒネリ (Lactobacillus buchneri)、ラクトバチルス · カゼィ (Lactobacillus casei )、ラクトバチルス · ジョンソニー

(Lactobacillus johnsonii) ラクトノチルス · ガリナラム (Lactobacillus gallinarum)、ラクトノチレス ·ァミロポラス (Lactobacillus amylovorus)、ラクトバチルス ·ブレビス（Lactobacillus brevis)、ラクトバチルス ·ラムノーザス (Lactobacillus rhamnosus)、ラクトバチルス ' ケフィァ (Lactobacillus kefir), ラクトバチルス ·パラカゼィ（Lactobacillus paracasei), ラクトバチルス · クリスパタス (Lactobacillus crispatus) ラクトバチルス ·デルブルッキ一サブスピ一シーズデルブルツキ一（Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii), ラクトバチルス 'デルブルツキ一サブスピーシ一ズブフレガリクス (Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus)、ラクトノ^チリレス ' フアーメンタム（Lactobacillus fermentum) , ラクトバチルス · ロイテリ

(Lactobacillus reuteri), ラクトバチルス ·ァリメン夕リウス (Lactobacillus alimentarius ) , ラクトノチルス - マル夕口ミクス（ Lactobacillus maltaromkus) 等のラクトバチルス属細菌、ストレプトコッカス .サーモフィルス（Streptococcus thermophilus) 等のストレプトコッカス属細菌、ラクトコッカス · ラクチスサブスピーシ一ズラクチス（Lactococcus lactis subsp. lactis), ラクトコッカス，ラクチスサブスピーシーズラクチスバリアン卜ダイァセチレラクチス ( Lactococcus lactis subsp. lactis var diacetilactis), ラクトコッカス · ラクチスサブスピーシーズクレモリス

(Lactococcus lactis subsp. cremoris; 等のラクトコッカス属糸田菌、ロイコノストツク ' メセンテロイデスサブスピ一シーズクレモリス（Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris) 等のロイコノストック属細菌、バチルス ·ズブチリス（Bacillus subtilis)、ノチルス · コアギュランス（Bacillus coagulans) 等のバチルス属細菌、ァセトバクタ一 ·ァセチ（Acetobacter aceti)、ァセトパク夕一·キシリナム（Acetobacter xylinum) 等のァセトパクター属細菌、サッカロマイセス ·セレビシェ (Saccharomyces cerevisiae), サッカロマイセス ·ユニスポラス (Saccharomyces unisporus), クルイべロマイセス ·マルキシアヌス ( Kluyveromyces mar ianus )、トルラスボラ ' テルブルッキ一

(Torulaspora delbrueckii), キャンジダ 'ケフィァ（Candida kefyr) 等のサッカロマイセス属、トルラスボラ属、キャンジダ属等に属する酵母等が望ましい微生物として挙げられる。

本発明に用いる醱酵物は、例えば大豆又は大豆加工物を含む組成物にビフィドバクテリゥム属細菌を接種し、培養して作製した生菌を含有する醱酵物として製造できる。その際の培養条件は、細菌が十分に増殖可能であれば特に限定されない。例えば、培養温度は 30°C〜37°C、培養時間は 15時間〜 48時間が好ましい。また培養雰囲気は特に空気の有無を問わないが、培養中には通気性のない密封した容器を用いて培養することが好ましく、窒素などの不活性ガスを十分通過させた培地を入れた密封容器あるいは培地上の気相を不活性ガスで置換した密封容器を用いて培養することが更に好ましい。また培養の停止時期は PH4 . 0〜 pH 6 . 0とすることがビフイドパクテリゥム属細菌の腸内到達性、腸内ビフイドパクテリゥム属細菌の増殖促進、腸内環境改善等の点から好ましく、 PH4 . 5〜 5 . 5であれば更に好ましい。また培養時に必要に応じて前記醱酵物に添加できるものとして列挙した糖質、植物成分、動物成分、微生物成分、栄養素、酸等の添加物を適宜割合添加してもよい。

本発明では、これらの醱酵物をそのまま用いても良く、また液状素材で希釈して用いることもできる。更に乾燥させて粉末状、顆粒状、錠剤状等の形状に加工して使用することもできる。また更に濃縮して濃縮液、高粘度液、ゲル状、固型等の形状に加工して使用することもできる。そしてまた凍結させて、アイス状、シャーベット状等の形状に加工して使用することもできる。すなわち、各種の操作、添加物等により、以上のような形態や形状に加工したものを食品として提供することができる。

本発明の腸内ビフィドバクテリゥム属細菌増殖促進剤、腸内到達度向上剤及び腸内環境改善剤を使用する場合の投与量は、投与方法、患者の年齢、体重、容態によって異なるが、成人患者 1日あたり醱酵物として、 2 0 g〜 5 0 0 gとするのが好ましい。

本発明の醱酵物には、更に公知のビフィドバクテリゥム属細菌増殖促進剤を添加することができる。当該促進剤としてはビフィドパクテリゥム属細菌の増殖を促進する活性を持っているものであれば、特に指定はしないが、食品に使用されている難消化性糖質が好ましく、ガラクトオリゴ糖、フラクトオリゴ糖等のオリゴ糖であれば更に好ましい。これらビフィドバクテリゥム属細菌増殖促進剤の添加量は、成人患者 1日あたり 0 . 1 g〜l 0 gとするのが好ましい。また本発明の腸内ビフィドバクテリゥム属細菌増殖促進剤、腸内到達度向上剤及び腸内環境改善剤は、そのまま食品として用いることもできるし、任意の範囲ですベての食品に添加することができる。好ましい食品としては、牛乳や乳酸菌飲料、ヨーグルト、醱酵乳、チーズ、プリン、アイスクリームなどの乳類、アルコール飲料や豆乳、ジュース、お茶、甘酒、野菜汁などの嗜好飲料類、生菓子や半生菓子などの菓子類、スープなどの調理加工品類、マヨネーズなどの卵加工品類や栄養ドリンクが挙げられる。これらの食品に添加する場合、前記醱酵物として、 0 . 1重量％〜9 9 . 9重量％、好ましくは 5 0重量％〜9 9重量％含有させることができる。

本発明の腸内ビフィドバクテリゥム属細菌増殖促進剤、腸内到達库向上剤及び腸内環境改善剤は、酸素透過性の低い密封容器、カプセル、包装用袋等に充填して提供することもできるし、また酸素透過性のある密封容器、カプセル、包装用袋等に充填して提供できる。またこれらの密封容器内を不活性ガスで充填させて提供できる。

本発明の腸内ビフィドバクテリゥム属細菌増殖促進剤、腸内到達度向上剤及び腸内環境改善剤は、 — 1 9 6 °C〜5 0 °Cで保存することが可能であり'、 4 °C〜 1 0 °C程度で保存するのが好ましい。

本発明の腸内ビフィドバクテリゥム属細菌増殖促進剤、腸内到達度向上剤及び腸内環境改善剤は、人間のみならず、ィヌ、ネコ、ゥシ、ゥマ、ヒッジ、ャギ、カンガル一、ブタ、ニヮトリ、ダチョウ、ゥサギ、モルモット、ラット、マウス、ハムスター、ライオン、トラ、キリン、ゾゥ、サル、チンパンジー、オランウータン、ゴリラ等の家畜、愛玩動物、野生動物にも使用できる。実施例

以下実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、菌数は、検出プレート上のコロニー形成単位 (Colony Forming Unit, CFU) を測定し、実数値あるいは対数値で表示した。

(実施例 1) ビフィドバクテリゥム ·ブレーべ Y I T4065株醱酵豆乳中での大豆ォリゴ糖の変化

本実施例では、ビフィドバクテリゥム ·ブレーべ Y I T4065株（以下、単に Y I T4065株という）で作製した醱酵豆乳に含まれる大豆オリゴ糖濃度と培養 pHとの関係を示す。

(1) 方法 ' 豆乳（四国化工機製、固形分 12%、タンパク含量 5. 4%) を 100°C90 分間蒸気滅菌後、豆乳で作製した Y I T4065株のシードカルチヤ一を 1 %接種し、 37 で静置培養し、経時的に培養物を採取し、 pH と大豆オリゴ糖（ス夕キオース及びラフィノース) を測定した。オリゴ糖の測定は、豆乳又は醱酵豆乳の遠心上清を Shodex SUGAR KS-802 の本カラム（8ιηιηφΧ 300 mm, 昭和電工製）及び Shodex SUGAR KS-G のガードカラム（6ΐΜφ Χ 50腿，昭和電工製）を装着した高速液体クロマトグラフィー装置にかけて、移動相として精製水、流速 0. 5mL/min、カラム温度 80°Cの条件下でサンプルを流し、示差屈折計 RI- 98 (ラボシステム機器製）を用いて糖を検出した。

(2) 結果

図 1で示すように、ラフイノースは pHの低下に伴って直線的に減少し、 pH5になるとほぼ消滅した。またスタキオースは、 pH の低下とともに減少するが、 pH5. 7から 5. 4の間で激減し、ラフイノース同様に pH5では殆ど残存していなかつた。この結果、豆乳中の大豆オリゴ糖は、 Y I T4065株により、効率的に利用されることが示された。

(実施例 2 ) 醱酵豆乳の 3日間投与試験

本実施例では、 Y I T4065株で培養した醌酵乳及び醱酵豆乳を同一ポランティアに投与して、糞便から回収される投与ビフィドバクテリゥム属細菌である

Y I T4065株の菌数を調べた例を示す。 (1) 投与サンプルの調製

3日間連続投与試験に用いるビフィドバクテリゥム属細菌生菌含有醱酵物としての Y I T4065株の醱酵豆乳の調製方法を以下に示す。豆乳（四国化工機製、固形分 12%) を 100 °C 90分間蒸気滅菌後、豆乳で作製した Y I T4065 株のシードカルチャーをそれぞれ 0. 1%接種し、 37°C 16時間培養して、 pH 4. 8の醱酵豆乳を得た。この醱酵豆乳投与サンプルのビフイドパクテリゥム属細菌菌数は、 1. 5 X 10⁹CFU/mL であり、このサンプルには大豆オリゴ糖は含まれていなかった。投与時まで 4 で嫌気的に保存した。

(2) 投与対照サンプルの調製

ビフィドバクテリゥム属細菌生菌含有醱酵物の 3日間連続投与試験の対照サンプルとしての Y I T4065株の醱酵乳の調製方法を以下に示す。全脂粉乳（よつ葉乳業製）を 12 %になるように水に溶かし、 100°C90分間蒸気滅菌後、別に 121°C15分間蒸気滅菌した酵母エキスを終濃度 0. 03%になるように添加した。これに全脂粉乳で作製した Y I T4065株のシードカルチャーを接種し、 35°C16時間培養して、 pH5. 6の醱酵乳を得た。この醱酵乳の投与サンプルのビフィドバクテリゥム属細菌菌数は、 1. 4X 10⁹CFU/mL であり、投与時まで 4°Cで嫌気的に保存した。

(3) 投与方法

ポランティアである健康成人男子 1名には、投与前 3日間及び投与期間中 3日間、生菌を含む食品及びオリゴ糖の摂取を禁止した。ポランティアは、 1種類の試験品の投与試験を終了した後、 1ヶ月の休止期間を経て、別の試験品の投与試験を行った。投与期間中、醱酵豆乳あるいは醌酵乳を昼食後及び夕食後それぞれ 20 OmL ずつ飲用してもらった。投与前日及び 3日間の投与終了直後の糞便について、 Y I T4065株の菌数を測定した（松本一政ら、腸内フローラとプロバィォテイクス、学会出版センタ一、 1998年、 56— 73頁)。

(4) 結果表 1に示すように、醱酵豆乳投与では投与ビフィドパクテリゥム属細菌である Y I T4065株が実数値として糞便 1 gあたり 1. 5 X 10^SCFU 回収され、また醱酵乳投与では 8 X 10⁷CFU 回収された。 Y I T4065株は、遺伝的に類縁関係にある他株、例えばビフィドバクテリゥム ·ブレーべ Y I T4006株

(Tanaka, R. , et al. , Bifidobacteria Microflora, Vol.2, ppl7-24, 1983 年、及び小林洋一ら、腸内フローラと食物因子、学会出版センター、 1984年、 69-90 頁）に比べて回収性が改善された菌株である。本試験例によると、 Y I T406 5のように回収性に優れた菌株を用いた場合でも醱酵豆乳は醱酵乳に比べて投与ビフィドバクテリゥム属細菌が効率よく回収されることが分かった。すなわち、これは、投与ビフィドバクテリゥム属細菌を生きて腸管に到達させるためには醱酵豆乳が極めて優れていることを示している。更に、この醱酵豆乳投与サンプルにはオリゴ糖が含まれていないので、醱酵豆乳による投与ビフィドバクテリゥム属細菌回収性改善作用はオリゴ糖によるものではないことも示している。

Bifidobacterium breve YIT4065株の醌酵豆乳または醌酵乳の 3日間投与にぉレて投与直後の糞便中から回収される投与ビフイドパクテリゥム属細菌菌数 ^a

a:糞便 1 gあたりに検出される菌数の実数値（CFU/g糞便） (実施例 3) 醱酵豆乳の単回投与試験

本実施例では、 Y I T4065株で培養した醱酵乳あるいは醱酵豆乳に糖を加えた製品をそれぞれ調製し、それらを 10°Cで保存したサンプルを同一ポランティァに単回投与して、糞便から回収される投与ビフィドバクテリゥム属細菌である Y I T4065株の菌数を調べた例を示す。 (1) 投与サンプルの調製

1 o°c保存製品の単回投与試験に用いるビフィドバクテリゥム属細菌生菌含有醱酵物としての Y I T4065株の醱酵豆乳の調製方法を以下に示す。豆乳（四国化工機製、固形分 12%) を UHT殺菌（135^、 3. 5秒）したのち、豆乳で作製した Y I T4065株のシードカルチャーを 0. 3%接種し、 34°Cにて

17時間培養した。この醱酵豆乳に終濃度が 6. 5%になるようにショ糖溶液を加え、攪拌後、ガラス容器に分注してゴム栓で密封した。これを 10°Cにて 8日間保存したサンプルを醱酵豆乳の投与サンプルとした。この投与サンプルには Y

I T 4065株が 2. 23 X 10⁹CFU/mL含まれ、 pH4. 85であり、大豆オリゴ糖は含まれていなかった。

(2) 投与対照サンプルの調製

ビフィドバクテリゥム属細菌生菌含有醱酵物の単回投与試験に用いる対照サンプルとしての Y I T4065株の醱酵乳の調製方法を以下に示す。全脂粉乳（よつば乳業製）を 12 %になるように水に溶解し、 UHT 殺菌（1 35°C、 3. 5 秒）した後、別滅菌した酵母エキスを終濃度 0. 03%加えた。ここに 10%脱脂粉乳で作製した Y I T4065株のシードを 2%接種し、 34°Cにて 20. 5 時間培養した。この醱酵乳に終濃度が 6. 5%になるようにショ糖溶液を加え、攪拌後、ガラス容器に分注してゴム栓で密封した。これを 10°Cにて 8日間保存したサンプルを醱酵乳の投与サンプルとした。この投与サンプルには Y I T40 65株力 3. 2X 10^sCFUZmL含まれ、 pH5. 42であった。

(3) 投与方法

ポランティアである健康成人男子 1名には、投与前 3日間及び投与当日の 4日間、生菌を含む食品及びオリゴ糖の摂取を禁止した。ポランティアには、昼食直後に醱酵豆乳 200mL を飲用してもらった。この投与試験終了後、同一のポランティアに 1週間の休止期間を経て、同様な条件で醒酵乳 20 OmL を飲用してもらつた。投与翌朝の糞便を回収し、 Y I T4065株の菌数を測定した（松本一政ら、腸内フローラとプロバイオテイクス、学会出版センター、 1998年、 56 -73頁）。

(4 ) 結果

表 2に示すように、 1回の醱酵豆乳投与では投与ビフィドバクテリゥム属細菌である Y I T4065株が実数値として糞便 1 gあたり 2. 9 X 10⁸CFU 回収され、また 1回の醒酵乳投与では 1. 4X 10^SCFU 回収された。また Y I T406 5株の回収率を投与ビフィドパクテリゥム属細菌の総菌数に対する糞便に回収される投与ビフィドバクテリゥム属細菌の総菌数の割合から算出したところ、醱酵豆乳は醱酵乳に比べて 26倍高い回収率を示すことが明らかとなった。この結果は、醱酵豆乳では 10°Cに 8日間密封保存した加糖タイプの製品を単回投与した場合でも便から高い割合で投与ビフィドバクテリゥム属細菌が回収されることを示している。

表 2

Bifidobacterium breve YIT4065株の醱酵豆乳または醱酵乳の単回投与

におレて投与翌日の糞便から回収される投与ビフイドパクテリゥム属細菌菌数 ^a

a:糞便 1 gあたりに検出される菌数の実数値（CFU/g糞便）

(実施例 4) ヒト糞便培養系での Y I T4065株の増殖性

本実施例では、ヒト糞便培養におけるビフィドバクテリゥム属細菌の増殖性が醱酵物によって異なることを示す。

(1) サンプルの調製

豆乳（四国化工機製、固形分 12%) を 100 °C 90分間蒸気滅菌後、豆乳で作製した Y I T4065株のシードカルチャーを 0. 1 %接種し、 34°C20時間静置培養後、 pH 5で培養を停止した菌液をそのまま醱酵豆乳サンプルとして用いた。また、全脂粉乳（よつ葉乳業製）を 12%になるように水に溶かし、 10 0°C 90分間蒸気滅菌後、別に 121°C 15分間蒸気滅菌した酵母エキスを終濃度 0. 03 %になるように添加したものに、全脂粉乳で作製した Y I T4065 株のシードカルチャーを接種し、 34°C20時間培養後、 PH5で培養を停止した菌液をそのまま醱酵乳サンプルとして用いた。各醱酵サンプルは、培養実験開始まで 10°Cで嫌気的に保存した。

(2) 糞便培養の方法

糞便培地として、健康成人の新鮮糞便を嫌気水で 4倍に希釈した後、 121°C 15分間蒸気滅菌したものを 4. 5mL分注したものを調製し、培養は、同一新鮮糞便の未滅菌 300倍希釈液 50 il 及び上記醌酵豆乳又は醱酵乳の各醱酵サンプルの 10倍希釈液 50 nl をそれぞれ接種し、嫌気的条件下で 37°C、 24時間で行った。培養終了後、投与ビフイドパクテリゥム属細菌及び腸内ビフイドバクテリウム属細菌総菌数を測定した（石川文保ら、ビフィズス、 9巻、 5— 18 頁、 1995年、及び松本一政ら、腸内フローラとプロバイオテイクス、学会出版センタ一、 1998年、 56— 73頁）。

(3) 結果

表 3で示すように、醱酵豆乳を用いた場合、醱酵サンプルの保存期間の違いに拘わらず Y I T4065株および糞便中に内在する腸内ビフィドバクテリゥム属細菌の増殖性はあまり変化しなかった。一方、醱酵乳では保存期間が長くなることにより増殖倍数の低下が観察され、 14日間の保存では保存なしに比べて Y I

T4065株の増殖倍数が 6分の 1に低下し、糞便中に内在する腸内ビフィドバクテリゥム属細菌も 2分の 1に低下した。本例で採用した培養方法は糞便培養後のフローラ構成が用いた糞便のフローラ構成と同じであることを確認した諸富らの方 (Morotomi, M.， et al. , Recent Advances in Germfree Research, Tokai Univ Press, 1981 年、 293-301 頁）に準じており、ここで観察される Y I T 4 0 6 5株および腸内ビフィドバクテリゥム属細菌の増殖性は腸管内での増殖性を反映しているものと考えられる。従って、本例で得られた結果は、醱酵豆乳中のビフィドバクテリゥム属細菌が腸管内で良好に増殖すること、及びその腸管内増殖性が長期間保存した場合でも醱酵乳に比べて良好に保たれることを示唆している。また、この結果より、醱酵豆乳では腸内ビフイドパクテリゥム属細菌の増殖を良好に保つことが示された。

表 3 ヒト糞便における Bindobacterium breve YIT4065株の増殖性および糞便中に内在する腸内ビフィドバクテリゥム属細菌の増殖性に及ぼす醌酵物の影響

サンプルの糞便培養 3中の B. breve YIT4065株糞便培養物中 (7 〕腸内ビフィドバクリウム属細菌保存日数初発菌数培養後菌数増殖倍数培養後菌数増殖倍数 (曰） (CFU/mL) (CFU/mL) (CFU/mL) (CFU/mL)

0 10X10⁵ 4X10⁷ 40 2X10⁷ 1X10⁹ 50 醱酵豆乳

14 8X10⁵ 2X10⁷ 25 2X10⁷ 1X10⁹ 50

0 7X10⁵ 3X10⁷ 43 2X10⁷ 1X10⁹ 50 麵乳

14 5X10⁵ 0.4X10⁷ 7 2X10⁷ 0.5X10⁹ 25

(実施例 5 ) 醌酵豆乳の 14日間投与試験

本実施例では、 Y I T4065株の醱酵豆乳及び豆乳を 14日間連続投与して、糞便から回収される投与ビフィドバクテリゥム属細菌である Y I T4065株及び腸内ビフィドバクテリゥム属細菌を調べた例を示す。

(1) 投与サンプルの調製法

14日間連続投与試験に用いるビフィドバクテリゥム属細菌生菌含有醱酵物としての Y I T4065株の醱酵豆乳の調製方法を以下に示す。豆乳 7. 5リツ夕 ― (四国化工機製、固形分 12. 3 %) をジャーファメン夕一内で 100°C90 分間蒸気滅菌後窒素置換し、豆乳で作製した Y I T4065株のシ一ドカルチヤ一を 0. 5%接種し、 32°C18時間、 6 Orpmで攪拌培養した。 pH5. 3で培養停止後、添加液（アスパルテーム 2. l g、食添用クェン酸 17. 3 gを滅菌水で 1. 6リツタ一にフルアップしたものを 105°C 15分間蒸気滅菌） 1. 6 リツターを攪拌しながら添加して、醱酵豆乳サンプル (pH 4. 8、 1. 6 X 10 ⁹CFU/mL) を得た。培養終了後、投与時まで 4°Cで嫌気的に保存した。また、豆乳サンプルとしては、上記醱酵豆乳の醱酵前のものを用いた。

(2) 投与方法

ポランティアである健康成人男子 1 5名には、投与前 7日間及び投与期間中 1 4日間、生菌を含む食品及びオリゴ糖の摂取を禁止した。投与期間中、 8名に醱酵豆乳を 7名に豆乳を昼食後及び夕食後それぞれ 25 OmLずつ飲用してもらった。投与前日及び 14日間の投与終了直後の糞便について、投与ビフィドバクテリウム属細菌菌数及び腸内ビフィドバクテリゥム属細菌の菌数、糞便総菌数を測定した（石川文保ら、ビフィズス、 9巻、 5— 18頁、 1995年、及び松本一政ら、腸内フローラとプロバイオテイクス、学会出版センター、 1998年、 56— 7 3頁)。

(3) 結果

表 4に示すように、醱酵豆乳投与により投与ビフィドバクテリゥム属細菌が糞便 l gあたり実数値で 1· 7 X 1 0⁸〜2. 14 X 10⁹CFU 回収され、平均 1. 0 2 X 10⁹CFU (対数値で 9. 1) 回収された。また醱酵豆乳の投与により、 8名中 7名で腸内のビフィドバクテリゥム属細菌の菌数が増加し、減少した人はいなかった。一方、豆乳投与は、 7名中 4名で腸内ビフイドバクテリゥム属細菌の菌数が増加したのみであり、統計的に菌の増加を示すことはできなかった（表 5)。本実施例では、 14日間の醱酵豆乳連続投与において、すべてのボランティアで 10⁸CFUZg糞便以上の回収性が示され、更に平均 10⁹CFU/g糞便と云う極めて高い回収性を示すことが示された。またこの結果により、ビフイドバクテリゥム属細菌生菌を含んだ醱酵豆乳は腸管内をビフィドバクテリゥム属細菌優位な環境に改善できることが分かった。このことは、ビフイドバクテリゥム属細菌を含んだ醌酵豆乳が投与菌の回収性改善作用のみならず、腸管内に存在する腸内ビフィドバクテリゥム属細菌の増殖促進作用を持っていることを示しており、腸内環境を改善できる製品であることを示唆している。

表 4

Bifidobacterium breve YIT4065株で製造した醱酵豆乳投与において糞便から回収される投与ビフィドバクテリゥム属細菌菌数と腸内ビフィドパクテリゥム属細菌菌数 ^a

a:糞便 lgあたりに検出される菌数の対数値（log_1Q(CFU)/g糞便）

b:未検出菌数を検出限界値 2.3として計算した。表 5

豆乳投与において糞便から回収される腸内ビフィドバクテリゥム

属細菌菌数 ^a

a:糞便 lgあたりに検出される菌数の対数値（log^CFT /g糞便）

b:未検出菌数を検出限界値 2.3として計算した。

(実施例 6 ) オリゴ糖添加醱酵豆乳の 3日間投与試験

本実施例では、 Y I T4065株の醱酵豆乳にオリゴ糖を添加することにより調製したオリゴ糖添加醱酵豆乳又はオリゴ糖無添加醱酵豆乳をヒトに投与して、糞便から回収される投与ビフィドバクテリゥム属細菌である Y I T4065株及び腸内ビフィドバクテリゥム属細菌、パクテロイデス属細菌を調べた例を示す。

(1) 投与サンプルの調製

ビフィドバクテリゥム属細菌生菌含有醱酵物としての Y I T4065株の醱酵豆乳にオリゴ糖を添加したオリゴ糖添加醱酵豆乳の調製方法を以下に示す。豆乳

(四国化工機製、固形分 12%) を 100°C90分間蒸気滅菌後、豆乳で作製した Y I T4065株のシードカルチャーを 0. 1 %接種し、 34 °C 17時間静置培養後、 pHが約 6付近から攪拌して pH 5の醱酵豆乳菌液を得た。培養後、この菌液にアスパルテーム 0. 1 %とクェン酸 1 %とミルクフレーバー少量含んだ添加液を混合してオリゴ糖無添加醱酵豆乳サンプル（PH4. 8、 3 X 10⁹CFU/mL) を調製した。培養終了後、投与時まで 4°Cで嫌気的に保存した。投与直前に、この醌酵豆乳サンプル 25 OmL に対して、オリゴ糖として 4' 一ガラクトシルラクトース溶液（20%) 5mL混合することにより、オリゴ糖添加醱酵豆乳サンプルを調製した。

(2) 投与方法

ポランティアである健康成人男子 7名には、投与前 7日間及び投与期間中 3日間、生菌を含む食品及びオリゴ糖の摂取を禁止した。 3日間の投与期間中、 4名にはオリゴ糖添加醱酵豆乳を昼食後及び夕食後それぞれ 255mL ずつ飲用してもらつた。この時の 1日あたりのオリゴ糖摂取量は 1人あたり 2 gである。また 3 名にはオリゴ糖無添加醱酵豆乳を昼食後及び夕食後それぞれ 25 OmLずつ飲用してもらった。投与前日及び 3日間の投与終了直後の糞便について、 Y I T406 5株の菌数及び腸内ビフィドバクテリゥム属細菌菌数、バクテロイデス属細菌菌数、糞便総菌数を測定した（石川文保ら、ビフィズス、 9卷、 5— 18頁、 19

95年、及び松本一政ら、腸内フローラとプロバイオテイクス、学会出版セン夕 —、 1998年、 56— 73頁）。

(3) 結果

表 6に示すように、オリゴ糖添加醱酵豆乳投与により、 Y I T4065株が糞便 l gあたり実数値で 7. 4X 10⁸〜3. 5 X 10⁹CFU 回収され、平均 1. 8X

10⁹CFU (対数値で 9. 2) が回収された。更に、ポランティア全員において、腸内ビフィドバクテリゥム属細菌の増加とパクテロイデス属細菌の減少が観察され、両菌属ともに投与前後で統計的有意差が見られた。また、表 7に示すように、オリゴ糖無添加醱酵豆乳投与でも、投与された Y I T4065株が糞便 1 gあたり実数値で 1. 8 X 10⁸〜5. 4 X 10⁹CFU 回収され、平均 2. 7 X 10⁹CFU

(対数値で 9. 4) 回収された。

さらに、オリゴ糖無添加醱酵豆乳における腸内ビフィドバクテリゥム属細菌の菌数も、 Y I T4065株の回収菌数が非常に高かった 2名のポランティア（糞便 l gあたり 2. 5X 10⁹CFU以上、対数値で 9. 4以上）において増加したが、投与菌の回収性が低かったポランティァでは増加しなかった。

これらの結果は、本発明の腸内ビフィドバクテリゥム属細菌増殖促進剤は、ォリゴ糖の添加および無添加の条件に関わらず、投与ビフィドバクテリゥム属細菌の回収性を高めるとともに、腸内ビフィドバクテリゥム属細菌の増加を促進することを示している。また、本発明の腸内ビフイドパクテリゥム属細菌増殖促進剤にオリゴ糖を添加することによって、腸内腐敗の原因菌を含むバクテロイデス属菌の菌数を効率的に低減させることも期待できる。

表 6 オリゴ糖を添加した Bifidobacterium breve YIT4065株醃酵豆乳投与において

糞便から回収される投与ビフィドバクテリゥム属細菌菌数と腸内ビフィドバクテリゥム属細菌バクテロイデス属細菌の菌数 ^a

a:糞便 lgあたりに検出される菌数の対数値（lo_gl。(CFU)/_g糞便）

b:未検出を検出限界値 4.3として計算した。

表 7

オリゴ糖を添加していない Bifidobacterium breve YIT4065株醱酵豆乳投与において糞便から回収される投与ビフィドバクテリゥム属細菌菌数と腸内ビフィドバクテリゥム属細菌の菌数 a

a:糞便 lgあたりに検出される菌数の対数値（log₁₍₎(CFU)/g) (実施例 7) 耐性試験

Bifidobacterium breve Y I T 4014株（AT C C 15700。以下、単に Y I Τ4014株という）、 Bifidobacterium longum Y I T4021株 (AT CC 15707。以下、単に Y I Τ4021株という）、 Bifidobacterium longum

Y I T4037株（ATCC 15708。以下、単に Y I Τ4037株という）の醱酵豆乳および醱酵乳の酸胆汁耐性を調べた。

(1) サンプルの調製法

Y I T4014株、 Y I T4021株、 Y I Τ 4037株の醱酵豆乳および醱酵乳の調製方法を以下に示す。豆乳（四国化工機製、固形分 12%) を 100°C 90分間蒸気滅菌後窒素置換し、豆乳で作製した Y I T4014株、 Y I T40 21株、 Y I T4037株のシードカルチヤ一を 0. 5 %接種し、 34°C19時間培養し、 PH4. 6まで培養した。また全脂粉乳（北海道乳業）を固形分 12% になるように溶解し、豆乳と同様に滅菌した。別滅菌した酵母エキスを終濃度 0. 05%添加した後、全脂粉乳で作製した Y I T4014株、 Y I T4021株、

Y I T4037株のシードカルチャーを 0. 5%接種し、 34°C19時間培養し、 pH4. 6まで培養した。これらの菌液に滅菌したブドウ糖溶液を終濃度 5%になるように添加し混和後、ガラス試験管に分注し、プチル栓をして、 10°Cにて嫌気的に 7日間保存した。

(2) 酸処理液および胆汁処理液の調製法

トリプチケースペプトン 1 %、酵母エキス 0. 5%、トリプトース 0. 3%、塩化ナトリウム 0. 2%、クェン酸アンモニゥム 0. 2%、システィン塩酸塩 0. 05%、ラク！ス 1%、ピルピン酸 0. 1%、ツイーン 80 0. 1%、硫酸マグネシウム 0575 %、硫酸第一鉄 0. 0034%、硫酸マンガン 0. 0 12 %を含む水溶液に酸を添加して、 pH4. 3に調整し、 121°C15分間蒸気滅菌したものを酸処理液とした。また、トリプチケースペプトン 1%、酵母ェキス 0. 5%、トリプトース 0. 3%、リン酸水素ニナトリウム 12水塩 2. 0 3%、リン酸二水素ナトリウム 2水塩 0. 156%、クェン酸アンモニゥム 0.

2 %> システィン塩酸塩 0. 05%、ラク！ ^一ス 1%、ピルビン酸 0. 1%、ッィーン 80 0. 1%、硫酸マグネシウム 0. 0575 %、硫酸第一鉄 0. 00

34%、硫酸マンガン 0. 012 %を含む水溶液に Oxgallを 1 %加えた後、水酸化ナトリウム溶液を用いて PH8. 0に調整し、 121°C15分間蒸気滅菌したものを胆汁処理液とした。

(3) 生菌数の測定方法

保存サンプルを適宜希釈し、 M I L S寒天平板に塗抹し、 37°C、 3日間嫌気培養後、コロニ一を計測した。

(4) 酸胆汁耐性の測定方法

前述の酸処理液 1 OmLに各保存サンプルを lmL加え、 37 で 30分間培養した。次に、この培養液 ImLを前述の胆汁処理液 1 OmLに加え、 37°Cで 30分間培養した。ここで得られた培養液を適宜希釈し、生菌数を測定した。

(5) 結果

各保存サンプルの酸胆汁耐性を図 2〜 4に示す。酸および胆汁の連続処理後の生菌数を醱酵豆乳と醱酵乳で比べると、 Y I T 4 0 1 4、 Y I T 4 0 2 1、 Y I T 4 0 3 7のすベての菌で 7日間保存において醱酵豆乳は生菌数が維持されているが、醱酵乳では検出限界以下であった。

これらの結果は、ビフィドバクテリゥム属細菌の腸内到達度を評価できる方法である酸胆汁耐性試験において、ビフィドバクテリゥム ·ブレーべ、ビフィドバクテリウム ·ロンガム等のビフィドバクテリゥム属細菌による醃酵豆乳が優れた耐性を持つことを示している。すなわち、ビフイドパクテリゥム ·ブレーべ、ビフィドバクテリゥム ·ロンガム等のビフィドバクテリゥム属細菌による醱酵豆乳はこれらのビフィドバクテリゥム属細菌の腸内到達度を向上できる醱酵物であることを示唆している。さらに、実施例 5および 6で明らかなように、投与ビフィドパクテリゥム属細菌の腸内到達度の向上が腸内ビフィドバクテリゥム属細菌の増殖促進を引き起こすことから、ビフィドバクテリゥム ·ブレーべ、ビフィドバクテリゥム ·ロンガム等のビフィドバクテリゥム属細菌による醱酵豆乳は腸内ビフィドバクテリゥム属細菌を増殖促進することが可能である。産業上の利用可能性

本発明の腸内ビフィドパクテリゥム属細菌増殖促進剤、腸内到達度向上剤及び腸内環境改善剤によれば投与されたビフィドパクテリゥム属細菌の腸管内への到達性を高め、腸内フローラをビフィドパクテリゥム属細菌優勢の状態に変えるだけでなく、いわゆる悪玉菌を包含したバクテロイデス属細菌の腸管内菌数を低下させることができ、優れた腸内環境改善効果が期待できる。これに用いる醱酵物は、大豆又は大豆加工物のビフィドバクテリゥム属細菌による醱酵物であるので、安全性にも全く問題がなく、また官能的にも優れたビフィドバクテリゥム属細菌生菌含有醱酵物であり、プロバイオティクス食品として健康の維持及び病気の予防に有用である。

Claims

請求の範囲

1 . 大豆又は大豆加工物のビフィドバクテリゥム属細菌による醱酵物を有効成分とする腸内ビフイドパクテリゥム属細菌の増殖促進剤。

2 . 大豆又は大豆加工物が、豆乳である請求項 1記載の増殖促進剤。

3 . ビフィドバクテリゥム属細菌が、ビフィドバクテリゥム ·ブレーべ又はビフィドバクテリゥム ·ロンガムである請求項 1又は 2記載の増殖促進剤。

4 . ビフイドパクテリゥム属細菌が、ビフイドバクテリウム ·ブレーべ Y I T 4 0 6 5株である請求項 1〜 3のいずれか 1項記載の増殖促進剤。

5 . 大豆又は大豆加工物のビフィドバクテリゥム属細菌による醱酵物を有効成分とするビフィドパクテリゥム属細菌の腸内到達度向上剤。

6 . 大豆又は大豆加工物が、豆乳である請求項 5記載の腸内到達度向上剤。

7 . ビフィドバクテリゥム属細菌が、ビフィドバクテリゥム ·ブレ一ベ又はビフィドパクテリゥム ·ロンガムである請求項 5又は 6記載の腸内到達度向上剤。

8 . ビフィドバクテリゥム属細菌が、ビフィドバクテリゥム ·ブレーべ Y I T 4 0 6 5株である請求項 5〜 7のいずれか 1項記載の腸内到達度向上剤。

9 . 大豆又は大豆加工物のビフィドバクテリゥム属細菌による醱酵物を有効成分とする腸内環境改善剤。

10. 大豆又は大豆加工物が、豆乳である請求項 9記載の腸内環境改善剤。

11. ビフィドバクテリゥム属細菌が、ビフィドバクテリゥム ·ブレ一ベ又はビフィドバクテリゥム ·ロンガムである請求項 9又は 1 0記載の腸内環境改善剤。

12. ビフイドバクテリゥム属細菌が、ビフイドパクテリゥム 'ブレーべ Y I T 4 0 6 5株である請求項 9〜 1 1のいずれか 1項記載の腸内環境改善剤。

13. 大豆又は大豆加工物のビフィドバクテリゥム属細菌による醱酵物を投与することを特徴とする腸内ビフィドバクテリゥム属細菌の増殖促進方法。

14. 大豆又は大豆加工物のビフィドバクテリゥム属細菌による醱酵物を投与することを特徴とするビフイドパクテリゥム属細菌腸内到達度向上方法。

15. 大豆又は大豆加工物のビフィドバクテリゥム属細菌による醱酵物を投与することを特徴とする腸内環境改善方法。