WO2001038553A1

WO2001038553A1 - Process for producing fatty acid lower alcohol ester

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Publication number: WO2001038553A1
Application number: PCT/JP2000/008185
Authority: WO
Inventors: Hideki Fukuda; Hideo Noda
Original assignee: Kansai Chemical Engineering Co Ltd
Current assignee: Kansai Chemical Engineering Co Ltd
Priority date: 1999-11-26
Filing date: 2000-11-20
Publication date: 2001-05-31
Anticipated expiration: 2002-05-26
Also published as: AU1417901A; US6982155B1

Description

明細書脂肪酸低級アルコールエステルの製造方法技術分野

本発明は、リパーゼを用いる脂肪酸低級アルコールエステルの製造方法、ならびにその方法に適したリパーゼを含有する微生物に関する。背景技術

自動車の燃料として、一般に石油、軽油に代表される化石燃料が用いられている。これらの化石燃料、特にディーゼル自動車に用いられている軽油には、窒素化合物、ィォゥ化合物が多く含まれているため、ディーゼル自動車などの自動車からは、 C O ₂、 N O x、 S O xなどのガスが多量に排出されている。これらの排出ガスは、地球温暖化の原因、環境汚染の原因となっており、その排出量の削減が緊急の解決課題である。

この軽油などの化石燃料に代わる燃料として、天然に存在する植物、動物、魚あるいは微生物が生産する油脂を用いる、いわゆるバイオディーゼル燃料が期待されている。これらの油脂のうち、食品製造のために用いられた油脂は環境に廃棄される場合が多く、環境問題を引き起こすので、廃油からのバィォディーゼル燃料は、大気汚染の防止と廃油の有効利用の点から、特に期待されている。

バイオディーゼル燃料としては脂肪酸低級アルコールエステルが好ましく用いられる。油脂から脂肪酸低級アルコールエステルを製造するためには、油脂をグリセリンとそれを構成する脂肪酸とに分離し、ついで、アルコールと脂肪酸とからエステルを製造する技術が要求される。その方法の一つとして、リパーゼを用いる脂肪酸エステルの製造研究が種々、行われている。しかし、現在行われている方法は、もっぱら、油脂を溶媒（例えばへキサン等）に溶解し、アルコールの存在下、リパーゼと反応させる方法である。この方法では、溶媒から脂肪酸エステルを分離する必要があり、溶媒を回収する操作が必要となって、プロセスが煩雑になる上、コストも上昇するという欠点に加え、爆発の危険性も含んでいる。そのため、無溶媒系での開発が検討されている。

無溶媒系における実験例としては、 JA0CS 73卷、 1191〜1195頁（1996)に記載がある。この実験によれば、イソプロパノール、イソブタノール、 2 -ブタノールなどの分岐アルコールを用いた場合は、 90%以上の脂肪酸エステルが得られるが、メタノール、エタノール等の工業的に用いられる安価なアルコール類では、脂肪酸エステル化反応がほとんど進行しないことが記載されている。このように、無溶媒系での安価なアルコールを用いる、非エネルギ一消費型のバイオディーゼル（脂肪酸エステル）の生産方法は未だ確立されていないのが現状である。

他方で、リパーゼを用いる脂肪酸エステルの合成反応において、リパーゼを単離し、固定化して利用する方法が最もよく検討されている。しかし、この方法ではリパーゼの単離と固定化にコストと時間がかかるという問題がある。

また、微生物菌体自体を用いる検討も行われているが、細胞膜の透過性を考慮する必要が指摘され、アルコールなどの溶媒による微生物の処理が検討されている（例えば、 Fel ixら、 Anal. Biochem. 120： 211-234 ( 1982)を参照）。この溶媒処理も、処理および溶媒の回収に時間とコストを要し、かつ爆発のおそれもあるという問題がある。

さらに、リパーゼによるエステル交換反応は、生じる脂肪酸エステルの加水分解を考慮して、非水系で行われており、特に水分を多く含む廃油等を用いる場合には、反応の進行が妨げられるので、水分除去設備が必要となり、コストが高くなるという問題が生じる。水の存在下、脂肪酸低級アルコールエステルを生産する方法は、特開昭 6 4— 1 0 9 9 4号公報に記載されている。しかし、この方法は、特殊な酵素を用いなければならず、酵素の単離にもコストと時間がかかるので、実用化されるには至っていない。

このように、リパーゼを用いるエステル交換反応においては、上記問題のいずれもが解決されておらず、より効率的な脂肪酸エステルの製造方法が求められている。

本発明は、上記問題点を解決するために行われたものであり、本発明により、メタノーノレ、エタノールなどの安価なアルコールを原料として、リパーゼおよびリパーゼを含有する微生物を細胞膜透過性向上のための処理等を行うことなく（すなわち、インタタトな微生物を用いて）、無溶媒系ないし微溶媒系で、かつ、水分の存在下でも、効率よく脂肪酸エステルが製造される方法が提供される。本発明により、上記課題が一度に解決される。発明の開示

本発明は、微ないし無溶媒系において、水の存在下、リパーゼまたはリパーゼを含有するインタタトな微生物と油脂と直鎖低級アルコールとを反応させることを特徴とする、脂肪酸ェステルの製造方法に関する。

好ましい実施態様においては、前記インタタトな微生物が、多孔質担体に固定されている。

好ましい実施態様では、前記微生物が分泌に関与する配列が欠失した組換えリパーゼを発現し得る微生物である。

また、好ましい実施態様においては、前記水が、反応液中に 0 . 3重量％以上含有される。

好ましい実施態様においては、前記油脂が、植物油脂、動物油脂、魚油、微生物によって生産される油脂、これらの混合油脂、またはこれらの廃油である。

別の好ましい実施態様においては、前記直鎖低級アルコールがメタノ一ルであり、該メタノールがメタノールと水との合計量に対して 3 0重量％以下となるように調整されている。

好ましい実施態様においては、直鎖低級アルコールが分割添加される。さらに、本発明は、分泌に関与する配列を欠失したリバ一ゼを発現し得る D N A配列を有し、微生物体内にリパーゼを含有し得る組換え微生物に関する。図面の簡単な説明

図 1はプラスミド p W I 3を出発材料として菌体内にリパーゼを蓄積する遺伝子を有するプラスミド p WI 3 p m R O L 7を作成する模式図である。図 2は、プラスミド p WI 3 p m R O L 7を有し、菌体内にリパーゼを蓄積するインタクトな固定化酵母を用いて、水の存在下、脂肪酸エステルが製造されることを示す図である。

図 3は、メタノールがメタノールと水との合計量に対して 2 0重量％および 3 2重量％の割合で反応系に含まれる場合の脂肪酸ェステル合成を示す図である。発明を実施するための最良の形態

本発明の特徴は、微ないし無溶媒系で、水の存在下、油脂と直鎖低級アルコールとリパーゼとを反応させて脂肪酸エステルを合成するに際し、リパーゼとしてインタタトな微生物を使用する点にある。また、本発明は、この微生物が、分泌に関与する配列が欠失した組換えリパーゼを発現し得る微生物、すなわち菌体内にリパーゼを蓄積する微生物である点にも特徴がある。

本明細書において、「リパーゼ」とは、グリセリドに作用して、グリセリドをグリセリンまたは部分グリセリドと脂肪酸とに分解する能力を意味する。「インタタトな微生物」とは、細胞膜の透過性を良くするための処理（例えば、溶媒処理等）を施していない微生物を意味する。単に乾燥した微生物は、インタタトな微生物に含まれる。

また、「直鎖低級アルコール」とは、炭素数 1〜8の直鎖アルコールをいう。特に、メタノール、エタノール、プロパノールが好適である。

「無溶媒系」とは、油脂を溶解するための溶媒を含まない意味であり、ェステル化反応に用いられる直鎖低級アルコールは、本願明細書に言う溶媒ではない。

「微溶媒系」とは、油脂をエステル化反応に用いる直鎖低級アルコールに溶解させるために、補助的に溶媒が添カ卩された系を意味する。油脂が直鎖低級アルコールに完全に溶解しない場合でも、反応は進行するため、必ずしも、溶媒を添加する必要もない。溶媒の添カ卩により油脂が溶解され、反応速度が大きくなる可能性がある。

(微生物）

本発明の特徴の一つは、「インタタトな微生物」を使用することである。リパーゼを産生する微生物であれば、どのような微生物でも使用できる。再使用の面からは、固定化微生物が好ましい。インタタトな微生物が用いられる結果、従来細胞膜の透過性向上などの目的で行われていた溶媒（例えば、アルコール、アセトン、クロ口ホルムなど）による処理が不要となり、溶媒回収設備あるいは防爆設備が不要となり、製造コストも大きく低下できる。リパーゼは、 1 , 3—特異的であってもよく、非特異的であってもよい。脂肪酸エステルの製造の面からは、非特異的である方が好ましい。このようなリパーゼを生産する微生物であればどのような微生物でもよい。糸状菌、細菌、酵母等が例示される。糸状菌としては、ァスペルギルス（Aspergi l lus)属、ガラタトミセス（Gala ctomyces)属、グォトリカム (Geotricum)属、ムコーノレ (Mucor)属、フィコミセス (Phycomyces)属、リゾムコール (Rhizomucor)属、ぺニシリウム (Penici l lium)属、リゾプス（Rhizopus)属等に属する微生物が挙げられる。

細菌としては、シユードモナス（Pseudomonas)属、アル力リゲネス（Alkal i genes)属等に属する細菌が挙げられる。

酵母としては、キャンディダ（Candida)属、タリプトコッカス（Cryptococc us)属、ピヒア（Pichia)属、ロードトルラ（Rhodotorula)属、ャロウィァ（Yar rowia)属に属する酵母が挙げられる。

上記微生物が耐熱性であれば、反応温度を高くすることができるので、より好ましい。

また、リパーゼ遺伝子が導入された組換え微生物を用いることも好ましレ、。この組換え微生物は、リパーゼが微生物体外へ分泌されなレ、微生物であることが好ましい。従って、分泌に関与する配列が欠失した組換えリパーゼを発現し得る微生物であることが好ましい。ここで、「分泌に関与する配列」とは、いわゆるプレ配列（シグナル配列）をいい、欠失とは、すべてのプレ配列（シグナル配列）が欠失した場合、一部の欠失により分泌が起こらない場合、およびプレ配列が破壊されて（例えば、アミノ酸の置換、欠失、付加などにより）分泌機能が破壊された場合などの、分泌が生じないようなすべての変異が含まれる。

このような分泌に関与する配列が欠失した遺伝子は、既知のリパーゼ遺伝子を基にして、当業者が通常用いる遺伝子組換え技法を用いて作成される。従来、リパーゼは分泌されて発現すると考えられていたが、本発明者らが、初めて、遊離型の（すなわち、プレ配列を有しない）リパーゼが微生物体内で発現され、蓄積されること、および、微生物の細胞内に存在するにもかかわらず、何らの微生物の処理も行うことなく、細胞内のリパーゼが脂肪酸ァルコールエステル合成に関与し得ることを見出して、本発明の一つを完成させたものである。

上記微生物は固定化されていることが、再利用の点から好ましい。固定化は、当業者が微生物に応じて、適宜選択する適切な方法で行われる。例えば、包括法、物理的吸着法、担体への付着法等が挙げられるが、担体に微生物を吸着ないし付着させる方法が、作製が容易であるので、好ましい。

本発明において、「担体」とは、微生物を固定化することができる物質を意味し、好ましくは、水またはある特定の溶媒に対して不溶性の物質である。本発明に用いる担体の材質としては、例えば、ポリビュルアルコール、ポリウレタンフォーム、ポリスチレンフォーム、ポリアクリルアミド、ポリビニルフォルマール樹脂多孔質体、シリコンフォーム、セルロース多孔質体、発泡セラミック等の発泡体あるいは樹脂が好ましい。多孔質体あるいは発泡体の開口部の大きさは、固定化する微生物によっても異なるが、細胞が十分に入り込めて、増殖できる大きさが適当である。大腸菌、枯草菌などのバクテリァの場合は、約 1 0 /X m〜 5 0 0 μ m、糸状菌、酵母などの場合は 5 0 i π！〜 1 , 0 0 0 mが好適であるが、これに限定されない。

また、担体の形状は問わない。担体の強度、培養効率等を考慮すると、球状あるいは立方体状で、大きさは、球状の場合、直径が 2 mm〜5 0 mm、立方体状の場合、 2 mn！〜 5 0 mm角が好ましレ、。

上記のように、微生物と担体とを混合して培養するだけで、微生物は担体に固定され、アセトン、アルコール等の処理を行うことなく、そのまま使用されるか、あるいは乾燥されて（すなわち、インタタトな固定化微生物として）使用される。

このようにして得られるインタクトな固定化微生物は、浮遊状態で反応に用いられる力、カラム等に充填されて、いわゆるバイオリアクターとして用いることができ、連続的にあるいはバツチで繰り返し反応に用いることがでさる。

(酵素）

本発明においては、酵素（リパーゼ）自体を用いることができる。リパーゼとしては、上記微生物に由来するリパーゼが挙げられ、市販のリパーゼも用いられる。例えば、ナガセ生化学工業（株）製の商品名リリパーゼ A _ 1 O F G (リゾプス ' ジャポニカス由来）、商品名 S M酵素（セラチア 'マルセセンス由来）、商品名リパーゼ Pなど；天野製薬（株）製の商品名リパーゼ F (リゾプス ·ォリゼ由来）、商品名リパーゼ L (キヤンディダ · リポリティカ由来）など；および名糖産業（株）製のリパーゼ- O F (キャンディダ ·ルゴーサ由来）などが挙げられる。

担体としては、上記材質、形状のものが挙げられるが、多孔質担体の場合、その開口部は必ずしも上記の大きさでなくともよく、 1 Ο μ πι以下であってもよい。 (油脂）

油脂としては、グリセリド、中でもトリグリセリドを多く含む油脂が好ましい。油脂としては、植物油脂、動物油脂、魚油、微生物が生産する油脂、これらの混合油脂、あるいはこれらの廃油が好ましく用いられる。植物油脂としては、大豆油、菜種油、パーム油、ォリーブ油等が挙げられる。動物油脂としては、牛脂、豚脂、鯨油、羊脂等が挙げられる。魚油としては、イワシ油、マグロ油、イカ油等が挙げられる。微生物が生産する油脂としては、モノレティエレラ属 (Mortierella) ゃシゾキ卜リウム属 (Schizochytrium) 等に属する微生物によって生産される油脂が挙げられる。本発明の方法では、反応液に水が含まれていても問題がないので、水分を多く含む廃油も好ましい原料の一つである。 (水の存在下におけるエステル合成反応）

本発明においては、水の存在下で、脂肪酸直鎖低級アルコールエステル合成反応を行う。 '一般に、リパーゼによる脂肪酸直鎖低級アルコールエステル合成反応において、水分はエステル分解反応が生じるので好ましくないと考えられていた。

他方で、油脂のうち、トリグリセリド（以下、 T Gと略することがある）と直鎖低級アルコールとから脂肪酸直鎖低級アルコールエステルを最も効率よく合成する場合には、理論的には、 T G 1モル (mol)に対して、直鎖低級アルコールを 3モル（mol)加える必要がある。しかし、直鎖低級アルコールがある濃度以上になると、リパーゼまたは微生物中のリパーゼを阻害ないし失活する傾向にある。

そこで、本発明者等は、これらを同時に解決すべく検討した結果、リパーゼ、あるいはインタクトな微生物を用いて、水の存在下、脂肪酸直鎖低級ァルコールエステルの合成反応を行うことにより、上記 2つの問題が一度に解決されることを見出し、本発明を完成させた。すなわち、水を添加することにより、リパーゼの不活性化あるいは不可逆的失活が防止できること、および水の存在下でも、合成された脂肪酸エステルが分解されないことを見出した。その結果、脂肪酸エステルが効率的に合成される。さらに、水の存在下、アルコールを分割添加することにより、脂肪酸エステルが効率よく合成されることも見出した。

水は、反応系全量に対して、 0 . 3重量％以上含まれることが好ましく、約 1〜 5 0重量％含まれることがより好ましく、約 3〜 3 0重量％含まれることがさらに好ましレ、。

水を添カ卩して反応を行う場合、直鎖低級アルコールの濃度は、用いるアルコールの種類によって適切な範囲が異なるが、要は、アルコールによる阻害が生じない程度であればよい。メタノールの場合は、メタノールと水との合計量に対して 3 0重量％以下とすることが好ましい。 2 5重量％以下がより好ましく、 2 0重量％以下がさらに好ましい。この場合、反応系に直鎖低級アルコールが油脂 1モルに対して 3モル以上存在しても、微生物のリパーゼは阻害されず、また不活性化もされない。従って、微生物はリサイクルできる。

水と直鎖低級アルコールとは、別々に加えてもよいが、適切な濃度を有する水溶液として、油脂（例えば T G) に加えてもよい。

また、本発明においては、直鎖低級アルコールを添加し、このアルコール濃度を、上記適切な濃度となるように維持しながら、反応物を回収し、生じる脂肪酸エステルとグリセリンとを分離（例えば静置分離）することにより、連続的に、脂肪酸エステル合成を行うこともできる。

さらに、別の方法として、直鎖低級アルコール阻害を回避するために、直鎖低級アルコールを分割添加することもできる。すなわち、リパーゼ阻害濃度よりも低い濃度となるように、直鎖低級アルコールを添加する。なお、「リパーゼ阻害濃度」とは、微生物中のリパーゼの活性が阻害され、あるいはリパーゼが不可逆的に失活する濃度をいう。

直鎖低級アルコールの分割添カ卩の方法は、特に制限されない。バッチ式でもよく、連続式でもよレ、。バッチ式の場合、リパーゼ阻害濃度より低い直鎖低級アルコール濃度で反応を行い、ついで、この反応終了液に、直鎖低級ァルコールを、リパーゼ阻害濃度よりも低い濃度となるように加えて、さらにエステル交換反応を行う方法（多段形式）でもよい。直鎖低級アルコールの濃度により、 2バッチ（2段反応）で反応を終了させることもできるし、 3 バッチ（3段）またはそれ以上で反応を終了させてもよい。例えば、インタクトな固定化微生物を用い、直鎖低級アルコールとしてメタノールを用いる場合は、 T G 1モルに対して約 2モルのメタノールでリパーゼ阻害が起こるように思われる（実施例 1参照）ので、それ以下のメタノール濃度とする必要がある。例えば、最初に T G 1モルに対してメタノールを 1モルカ卩えて第 1段階の反応を行い、第一段階の反応が終了した後に、さらに T G 1モルに対してメタノールを 1モル加えて第 2段階の反応を行い、第 2段階の反応終了後、さらに T G 1モルに対してメタノール 1モル加えて第 3段階の反応を行って、反応が完結する。

また、生じる脂肪酸低級アルコ一ルェステルあるいは消費されるアルコールの量をモニターしながら、直鎖低級アルコールが常に T G 1モルに対して 1モル以下の濃度となるように、直鎖低級アルコールを滴下することも、分割添加の一態様である。

さらに、脂肪酸エステルによってリパーゼ阻害が解除されるので、予め、脂肪酸エステルと直鎖低級アルコールとを混合した溶液を分割添加してもよレ、。分割添カ卩はバッチ式でも、連続式でもよい。添加する脂肪酸エステルは、油脂と直鎖低級アルコールとの反応により生じる脂肪酸ェステルと同じでも良いし、異なっていてもよい。脂肪酸エステルは、反応開始時に、反応液の 5〜8 0重量％、好ましくは 1 0〜8 0重量％、より好ましくは、 2 0〜7

0重量％、最も好ましくは、 3 0〜5 0重量％となるように添加される。ェステル合成反応により新たに脂肪酸エステルが生成するので、脂肪酸エステルの添加量は、阻害を解除できる範囲で、できるだけ少ない方がよい。

油脂と直鎖低級アルコールとインタクトな微生物との間のエステル交換反応は、一般的には、約 5〜8 0 ° (：、好ましくは、約 1 5〜5 0 °C、より好ましくは、約 2 5〜4 5 °Cで行われる。反応温度は用いる微生物により決定すればよく、例えば、耐熱性の微生物であれば、比較的高温で反応できる。反応時間は、油脂と直鎖低級アルコールの組成と酵素量で決定される。反応終了後、生じた脂肪酸エステルは、静置、遠心分離、膜分離、分子蒸留、精密蒸留等の分離操作の常法によりグリセリンと未反応のグリセリドとから分離され、回収される。 (実施例）

以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明がこれらの実施例に限定されないことは言うまでもない。

(インタクトな固定化微生物および溶媒処理微生物の調製）

リパーゼ生産微生物として、リゾプス .ォリゼ（Rhizopus oryzae) IF046 97を用いた。 80。C以上の蒸留水にポテトデキストロースァガー（Difco 製）を 39 g/ l、およびァガー（Difco製）を 20 gZ 1加えて攪拌しながら溶解し、 pHを 5. 5に調整した後、試験管に 5m lずつ加え、オートクレーブで 121°C、 20分滅菌してスラントを作成し、このスラントに菌体を接種し、 30 °C、 70時間培養した。

以下の組成：

グノレコース 3 g

ポリぺプトン 70 g/

N a N0₃ 1 g /

Mg S〇₄ · 7 H₂0 0. 5 g/

KH₂P0₄ 1 /

p H 5. 6

の培地 1 00m lに 6 mm角のポリウレタンフォーム（ブリジストン社製：形式 HR— 50 :以下、 B S Pという） 1 50個を入れ、 B SPに培地を十分に馴染ませた後、 500m 1の坂口フラスコに入れ、ォレイン酸を 30 g Z 1加え、オートクレーブで 1 21°C、 20分殺菌した。

殺菌後、 35 °Cまで冷却した液体培地 1 00m l当り、上記スラント 1本分の胞子を接種し、振幅 70 mm, 振盪数 1 50 o p m、 35°Cで 90時間振盪培養した。培養終了後、 B S Pに固定化された菌体（以下、 B S P固定化菌体という）を濾過により回収し、水で洗浄した。得られた B S P固定化菌体から菌体が剥離しない程度に水分を除去し、 4 8時間、室温で乾燥させて、インタタトな固定化された微生物を得た。他方で、 BS P固定化菌体を、それぞれ、メタノール、エタノール、アセトン、およびイソプロピルアルコールを用いて、 30°Cで、 30分、 60分、および 1 20分間処理し、溶媒処理固定化微生物とした。

(実施例 1 )

大豆油 9. 6 5 gとメタノール 0. 3 5 gの混合物（モル（mol)比 1 ： 1) 10 gおよび大豆油 9. 32 gとメタノール 0. 68 gの混合物（モル (raol)比 1 ： 2) 1 0 gに、それぞれ水を 1 g加えた反応液を準備した。この反応液にインタクトな固定化微生物あるいは溶媒処理固定化微生物を、それぞれ 50個加えて、 30°C、 1 30 r pmで振盪しながら 20時間反応した。反応終了後、生じた脂肪酸エステルをガスクロマトグラフィー（GC) で定量した。 GCは、トリカプリリンを内部標準として用い、以下の条件によった。

GC条件：

カラム： DB— 5 (J & W Scientific 1 OmX 25 mm)

初期カラム温度： 1 50°C (0. 5分）

昇温速度： 10 °CZ分

最終温度： 300 °C ( 3分）

インジェクター温度： 245°C

ディテクター温度： 320°C

キャリアガス：ヘリウム（2. 5 cm/分）

スピリット比： 1 Z 100

結果を表 1に示す。表中、変換率は、メタノールのメチルエステルへの変換率を意味する。微生物処理時間（分）

大豆油 ZMeOH 処理浴 30 60 120

変換率(％)

モル比 = 1 : 2 無処理 81 81 81

メタノ一■/レ 10 3 0

エタノーレ 50 20 8

ァセ卜ン 80 62 30

iso-PrOH 69 65 41

モル比 = 1 : 1 無処理 100 100 100

メタノール 5 5 5

エタノール 48 30 12

アセトン 80 64 43

iso-PrOH 75 70 54

iso-PrOHは、イソプロピルアルコールを示す

この結果は、大豆油とメタノールが 1 ： 1のモル比で添加された場合、反応が 1 0 0 %進行したのに対し、大豆油とメタノールが 1 ： 2のモル比で添加された場合、エステル合成反応が 1 0 0 %進行せず、リパーゼ活性が 2 0 %ほど阻害されることを示している。さらに、メタノール処理した場合、固定化微生物のリパーゼはほとんど失活することがわかり、エタノール処理では半分程度にリパーゼ活性が低下した。ァセトン処理、ィソプロピルアルコール処理では、処理時間の増加とともにリパーゼ活性の低下が見られた。このことから、リパーゼ生産微生物を溶媒処理することなく、そのまま乾燥しても、十分にリパーゼ活性（脂肪酸低級アルコールエステル合成活性）を有することがわかった。

(実施例 2 ) 大豆油 9 . 6 5 g とメタノール 0 . 3 5 gの混合物（モル（mol)比 1 ： 1 ) 1 0 gを準備し、表 2に記載の量の水を加えた反応液を準備した。それぞれの反応液にインタクトな固定化微生物、アセトン処理固定化微生物またはィソプロピルアルコール処理固定化微生物をそれぞれ 5 0個添加して、 3 0 °C、 1 3 0振盪 /分で振盪しながら、 1 日反応させた。この反応液にメタノールを 0 . 3 1 g添カ卩してさらに 2 4時間反応を行い（2日目）、再度、メタノールを 0 . 3 1 g添カ卩してさらに 1日反応させた（3日目）。その後、さらに 3日間（合計 6日間）反応させた。結果を表 2に示す。なお、表 2の変換率は、大豆油を構成する脂肪酸のメチルエステル化率で表した。

表 2

この結果は、水分が約 3〜3 0重量％存在しても、インタクトな固定化微生物では、ほぼ理論ィ直に近いエステル合成反応が進行したことを示している。他方、従来必要とされていたァセトン処理あるいはイソプロピルアルコール処理などの溶媒処理を行った溶媒処理固定化微生物では、活性が安定せず、反応もインタクトな固定化微生物と比べて、かなり劣ることがわかった。

(実施例 3 )

分泌に関与する配列が欠失した組換えリパーゼを発現し得る微生物を調製した。

分泌に関与する配列が欠失した組換えリパーゼをコ一ドするプラスミドを作成するための出発ベクターとしてプラスミド pWI 3を用いた。プラスミド pWI3の作製方法は、（Kanai Tら、 Appl. Microbiol. Biotechnol. 199 6, 44 (6), 759 - 765に記載されている。図 1にプラスミド pWI 3の制限酵素地図を示す。

まず、 R. oryzae IF0 4697の染色体を常法により調製した。この染色体 D

NAから、 pfuTurboポリメラーゼ（Stratagene社製 #600250) を用いる PC R法により、 R. oryzae由来のリパーゼ（R0L) 遺伝子を增幅した。 PC尺に用レヽたプフィマ¹ ~は、 Ics (5 -ctccggatccatggttcctgtttctggtaaatctggatct _3' ：酉己歹 IJ番号 2) および ROLrvSall (5' -cgatgtcgacttacaaacagcttcc-3' ：配列番号 3) であった。この 2種の合成オリゴヌクレオチドを用いて増幅される R0L遺伝子は、分泌シグナルぺプチドをコ一ドしているプレ配列を持たず、プロ配列と成熟タンパク質領域の両方の遺伝子配列を有していた。この配列を配列番号 1に示す。

P CR増幅により得られた配列（ROL) を制限酵素 B a mH Iおよび S a 1 Iで消化し、 ROLの B a mH I—S a 1 I断片を精製した。

他方、プラスミド pWI 3を B g I IIおよび S a 1 Iで消化した後、上記 ROLの B g 1 II-S a 1 I断片を混合して、接続し、 ROL遺伝子が正しく挿入されていることを確認した。得られたプラスミドを pWI3 pmRO L 7 (図 1参照）と命名した。

プラスミド pWI 3 ρ mRO L 7を酵母 Saccharomyces cerevisiae MT8-1

(MATa ura3-l trpl- 1 ade2- 1 leu2- 3， 112 his3)に、酢酸リチウム法により形質転換し、 SD— W選択培地寒天プレート（2%グルコース、 0.67 yeast nitrogen base w/o amino acids, 0.003%ロイシン、 0.002%アデニン、 0. 002%ヒスチジン、 0.002%ゥラシル、 2%寒天）で形質転換株を選択した。得られた形質転換株 S. cerevisiae (_PWI3pmR0L7) を、初発グルコース濃度 0.

5〜8. 0、 2%のカザミノ酸を含有する SD—W液体培地に植菌し、坂口フラスコで培養してリパーゼ遺伝子を発現させた。培養して得られた形質転換株をガラスビーズで破碎し、菌体内リパーゼを、リパーゼキット S (大日本製薬）を用いて測定した。比較として、菌体外にリパーゼを分泌する酵母

(Takahashi S.ら、 J. Fermentation and Bioengineering 86 (2)： 164 - 168， 1 998) を用いた（表 3中、分泌型 R0Lと表記する）。また、コントロールとしてプラスミド p W I 3を有する酵母を用いた。結果を表 3に示す。

表 3

表 3カゝらわかるように、形質転換株 S. cerevisiae (pWI3pmR0L7) は、菌体内に多量のリパーゼを蓄積し、菌体内リパーセの比活性は、分泌型の約 7 0 倍もあることがわかった。

得られた形質転換株 S. cerevisiae (pWI3pmR0L7) を以下のように培養して、固定化酵母を作成した。まず、前記 S D一 W液体培地 1 0 0 m 1に 6 mm角の B S P (プリジストン社製） 1 5 0個を入れ、 B S Pに培地を十分に馴染ませた後、 5 0 O m 1の坂口フラスコに入れ、ォレイン酸 3 0 g / 1を加え、オートクレーブで 1 2 1 °C、 2 0分殺菌した。

3 5 °Cまで冷却した液体培地 1 0 0 m lに形質転換株 S. cerevisiae (pWI3 praR0L7) を接種し、 3 0 °Cで 2 4時間振盪培養した。培養終了後、 B S Pに固定化された酵母菌体（以下、 B S P固定化酵母菌体という）を濾過により回収し、水で洗浄した。

得られた B S P固定化酵母菌体から菌体が剥離しない程度に水分を除去し、 48時間、室温で乾燥させて、インタタトな B S P固定化酵母菌体を得た。大豆油 9. 6 5 gとメタノール 0. 35 gの混合物（モル（mol)比 1 ： 1) 10 gに、水を 1 g加えた反応液を準備し、この反応液にインタタトな B S P固定化酵母菌体を 50個加えて、 30°C、 1 30 r pmで振盪しながら 20時間反応した。反応終了後、生じた脂肪酸エステルを、実施例 1と同じ条件で、 GCで定量した。

結果を図 2に示す。図 2の 100時間目および 300時間目の矢印は、それぞれ、メタノールを 0. 35 g添加したことを示す。 ME含量は、脂肪酸メチルエステルの含量を意味する。

この結果は、リパーゼを細胞内に発現する酵母を、全く溶媒処理することなく用いることにより十分に脂肪酸エステル化反応が進行することを示している。

(実施例 4)

大豆油 308. 0 gに、メタノール 36. 0 g、水 144. 0 gを混合した（反応系 A) 。この反応系 Aの油脂とメタノールのモル比は 1 : 3. 2であり、メタノール濃度は、メタノールと水との合計量に対して 20重量％であり、反応系の水分含量は 29. 5%であった。

他方、比較として、大豆油 308. 0 gに、メタノール 68. 0 _§、水1 44. 0 gを混合した（反応系 B) 。この反応系 Bの油脂とメタノールのモル比は 1 ： 6であり、メタノール濃度は、メタノールと水との合計量に対して 32重量％であり、反応系の水分含量は 27. 7 %であった。

B S Pに固定した微生物をカラムの中段に詰めて固定化微生物層を設け、固定化微生物層の下に分離層を設け、分離層の上部から反応液を抜き出し、カラム上部から固定化微生物層に散布して、反応液を循環することにより、エステル化反応を進行させた。脂肪酸エステルは、実施例 1と同様に測定した。

結果を図 3に示す。図 3の▲は反応系 Aの第一バッチの反応であり、〇は反応系 Aの第 2バッチの反応である。きは、反応系 Bの第一バッチである。図 3から明らかなように、メタノール濃度が低い反応系 Aは、反応はほぼ 9 0%以上進行し、 2バッチ目でもリパーゼが失活することはなかった。他方、メタノ一ル濃度が 32重量。 /₀の反応系 Bでは、 50時間でリパーゼが失活した。

(実施例 5)

大豆油 308. 0 gに、メタノール 68. 0 g、水 200. 0 gを混合した。この反応系の油脂とメタノールのモル比は 1 ： 6であり、メタノール濃度は、メタノールと水との合計量に対して 25. 3重量％であり、反応系の水分含量は 34. 7重量％であった。この混合液を用いて、実施例 4と同じ装置を用いて反応を行った。その結果、上記実施例 4と異なり、メタノールの濃度が低下したため、リパーゼは失活することなく、反応は進行した（結果は図示せず）。

(実施例 6 )

大豆油 308. 0 _§と水144. 0 gにキャンディダ ·ルゴーサ由来のリパーゼを 9. 24 g (大豆油に対して 0. 3重量％) 添加し、攪拌槽に入れて、 30°C、 1 10 r pmで攪拌した。これに、メタノールを 1 2 g添加し反応を開始した。 8時間後、 1 6時間後にそれぞれ、メタノールを 1 2 g添加し、反応を行った。添加したメタノールは合計で 36. 0 gであり、最終的に、大豆油に対して 3. 2モルであった。脂肪酸エステルは、実施例 1と同様に測定した。 2回実験を行い、 24時間目の脂肪酸エステルの収率は、それぞれ、 85 %および 9 1 %であつた。産業上の利用可能性

本発明のエステル合成方法は、リパーゼあるいは微生物をそのまま用い、無溶媒系で行われ、かつ水の存在下でも行われるので、操作が簡便であり、効率よく行われる。特に、水分を多く含む廃油の利用が可能になり、環境に廃棄される廃油のリサイクルが可能になると同時に、環境汚染の少ないバイォディーゼル燃料が提供される。

さらに、酵素を単離する必要がないために、酵素の精製に要する工程、およびコストが不要となり、工程の簡略ィ匕とコストの低減につながる。また、従来用いられていた微生物の処理用および反応用の溶媒が不要となり、そのために要する溶媒回収、防爆設備等が不要となるとともに、コストも大幅に低減できる。

Claims

請求の範囲

1 . 微ないし無溶媒系において、水の存在下、リパーゼまたはリバーゼを含有するインタタトな微生物と油脂と直鎖低級アルコールとを反応させることを特徴とする、脂肪酸エステルの製造方法。

2 . 前記インタタトな微生物が多孔質担体に固定されている、請求項 1に記載の方法。

3 . 前記微生物が、分泌に関与する配列が欠失した組換えリパーゼを発現し得る微生物である、請求項 1または 2に記載の方法。

4 . 前記水が反応液中に 0 . 3重量％以上含有される、請求項 1から 3のいずれかの項に記載の方法。

5 . 前記油脂が、植物油脂、動物油脂、魚油、微生物によって生産される油脂、これらの混合油脂、またはこれらの廃油である、請求項 1から

4のいずれかの項に記載の方法。

6 . 前記直鎖低級アルコールがメタノールであり、該メタノールがメタノールと水との合計量に対して 3 0重量％以下となるように調整されている、請求項 1から 5のいずれかの項に記載の方法。

7 . 前記直鎖低級アルコールが分割添加される、請求項 1から 5のいずれかの項に記載の方法。

8 . 分泌に関与する配列を欠失したリパーゼを発現し得る D N A配列を有し、微生物体内にリパーゼを含有し得る組換え微生物。