WO2001013925A1

WO2001013925A1 - Remedies

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Publication number: WO2001013925A1
Application number: PCT/JP2000/005489
Authority: WO
Inventors: Takanari Tominaga; Syusaku Yamashita; Shigetoshi Mizutani; Hiroaki Sagawa; Ikunoshin Kato
Original assignee: Takara Shuzo Co Ltd
Current assignee: Takara Shuzo Co Ltd
Priority date: 1999-08-20
Filing date: 2000-08-17
Publication date: 2001-03-01
Anticipated expiration: 2002-02-20
Also published as: CN100384433C; KR20020031411A; KR100675541B1; EP1226826A1; EP1226826B1; ATE367166T1; JP2009051836A; AU6593400A; DE60035604D1; JP4202645B2; EP1226826A4; CN1382055A; DE60035604T2

Description

明細書治療剤技術分野

本発明は水生生物由来の生理活性物質の医薬、食品、飲料又は飼料としての用途に関する。背景技術

水生生物由来の生理活性物質としては、フコィダンが知られている。このフコイダンは藻類、棘皮動物等に含まれている硫酸化フコース含有多糖であり、硫酸化フコースを構成糖として含むものである。

フコィダンの生理作用としては癌増殖抑制活性、癌転移抑制活性、抗凝血活性、抗ウィルス活性等が知られており、医薬品としての用途開発が期待されている

発明の開示

本発明はフコィダンの新たな生理作用を見出すことにあり、その目的はフコィダンのサイト力イン類産生調節作用等を利用した医薬、食品、飲料又は飼料を提供することにある。なお、本明細書において本発明の治療剤又は予防剤を医薬という場合がある。

本発明を概説すれば、本発明の第 1の発明は、フコィダン及び又はその分解物を有効成分として含有することを特徴とするサイトカイン類産生調節を要する疾患、一酸化窒素産生を要する疾患、又はアレルギー性疾患の洽療剤又は予防剤に関する。

本発明の第 2の発明は、フコィダン及び Z又はその分解物を含有してなるサイトカイン類産生調節用食品、飲料又は飼料、一酸化窒素産生誘導用食品、飲料又は飼料、或いは抗アレルギー用食品、飲料又は飼料に関する。

また本発明の一態様としては、サイト力イン類産生調節を要する疾患、一酸化窒素産生を要する疾患、又はアレルギー性疾患を治療又は予防するためのフコィダン及び Z又はその分解物の使用；サイトカイン類産生調節を要する疾患、一酸化窒素産生を要する疾患、又はアレルギー性疾患の治療剤又は予防剤の製造のためのフコィダン及び又はその分解物の使用；或いはフコィダン及び又はその分解物を用いるサイトカイン類産生調節を要する疾患、一酸化窒素産生を要する疾患、又はァレルギ一性疾患の治療又は予防方法に関する。

さらに本発明の一態様としては、フコィダン及び/又はその分解物を有効成分として含有するサイト力イン類産生調節剤、一酸化窒素産生誘導剤、抗アレルギ一剤、又は I g E産生抑制剤に関する。

さらに本発明の一態様としては、サイト力イン類産生調節剤、一酸化窒素産生誘導剤、抗アレルギー剤、又は I g E産生抑制剤の製造のためのフコィダン及び又はその分解物の使用に関する。

さらに本発明の一態様としては、サイト力イン類産生調節用食品、飲料又は飼料、一酸化窒素産生誘導用食品、飲料又は飼料、或いは抗アレルギー用食品、飲料又は飼料の製造のためのフコィダン及び Z又はその分解物の使用に関する。さらに本発明の一態様としては、フコィダン及び Z又はその分解物を有効成分として使用するサイト力イン類産生調節方法、一酸化窒素産生誘導方法、アレルギー抑制方法、又は I g E産生抑制方法に関する。

さらに本発明の一態様としては、サイト力イン類産生調節、一酸化窒素産生誘導、アレルギー抑制又は I g E産生抑制のためのフコィダン及び Z又はその分解物の使用に関する。

本発明のさらに好ましい態様として、フコィダン及び/又はその分解物は抗原感作時、例えば抗原提示細胞と T細胞の抗原伝達時におけるサイトカイン類産生調節に顕著な効果を有する。又、フコィダン及び Z又はその分解物は抗原感作後のアレルギー性疾患の治療、特に抗原感作後の抗原特異的 I g E産生の抑制に著効を有する。なお、本発明において、サイト力イン類産生調節とは、サイトカイン類の産生増強、産生促進等により、サイト力イン類の産生量を調節することを含む。

従って、本発明の一態様としては、フコィダン及び /"又はその分解物を有効成分として含有することを特徴とする抗原感作時にサイトカイン類産生調節を要する疾患、又は抗原感作後のアレルギー性疾患の治療剤又は予防剤に関する。また、本発明の一態様としては、フコィダン及び/又はその分解物を含有してなる抗原感作時のサイト力イン類産生調節用食品、飲料又は飼料、或いは抗原感作後の抗アレルギー用食品、飲料又は飼料に関する。

また本発明の一態様としては、抗原感作時にサイトカイン類産生調節を要する疾患、又は抗原感作後のァレルギー性疾患を治療又は予防するためのフコィダン及び Z又はその分解物の使用；抗原感作時にサイトカイン類産生調節を要する疾患、又は抗原感作後のアレルギー性疾患の治療剤又は予防剤の製造のためのフコィダン及び Z又はその分解物の使用；或いはフコィダン及び Z又はその分解物を用いる抗原感作時にサイトカイン類産生調節を要する疾患、又は抗原感作後のァレルギ一性疾患の治療又は予防方法に関する。

さらに本発明の一態様としては、フコィダン及び Z又はその分解物を有効成分として含有する抗原感作時のサイトカイン類産生調節剤、抗原感作後の抗アレルギー剤、又は I g E産生抑制剤に関する。

さらに本発明の一態様としては、抗原感作時のサイト力イン類産生調節剤、抗原感作後の抗アレルギー剤、又は抗原感作後の I g E産生抑制剤の製造のためのフコィダン及び/又はその分解物の使用に関する。

さらに本発明の一態様としては、抗原感作時のサイトカイン類産生調節用食品、飲料又は飼料、或いは抗原感作後の抗アレルギー用食品、飲料又は飼料の製造のためのフコィダン及び Z又はその分解物の使用に関する。

さらに本発明の一態様としては、フコィダン及び又はその分解物を有効成分として使用する抗原感作時のサイトカイン類産生調節方法、抗原感作後のアレルギー抑制方法、又は抗原感作後の I g E産生抑制方法に関する。

さらに本発明の一態様としては、抗原感作時のサイト力イン類産生調節、抗原感作後のアレルギー抑制又は抗原感作後の I g E産生抑制のためのフコィダン及び又はその分解物の使用に関する。

本発明において使用するフコィダンに特に限定はないが、好ましくは藻類由来フコィダン又は棘皮動物由来フコィダンが例示される。

またフコィダンの分解物としては、例えばフコィダンの酸分解物、フコィダンの酵素分解物等が使用できる。

本発明に使用するフコィダン、フコィダンの分解物、例えばフコィダンの酸分解物、フコィダンの酵素分解物としては、サイト力イン類産生調節作用、一酸化窒素産生誘導作用、又は抗アレルギー作用、例えば I g E産生抑制作用等を示すものであれば特に限定はなく、かかる作用等を指標として適宜調製することができる。

また、本明細書にいうサイト力イン類とは、特にフコィダン又はその分解物が産生調節作用を示し得るサイトカイン類をいい、例えばインターロイキン類（例えばインタ一ロイキン一 1 2 ) 、インターフェロン類（例えばインターフェロン - r ) が例示される。

さらに、抗アレルギー作用とは、フコィダン又はその分解物が示し得るアレルギー抑制作用をいい、 I g E産生抑制作用が例示される。図面の簡単な説明

第 1図は、ガゴメ昆布由来フコィダンの D E A E—セル口ファイン A— 8 0 0 カラム溶出パターンを示す図である。第 2図は、 7— 1 2SFd— Fを添加して培養した時の培地中の N0₂ - 濃度を示す図である。

第 3図は、 I画分を添加して培養した時の培地中の N0₂ — 濃度を示す図であ。

第 4図は、 I I画分を添加して培養した時の培地中の NO ₂ - 濃度を示す図である。

第 5図は、 I I I画分を添加して培養した時の培地中の N0₂ - 濃度を示す図である。

第 6図は、陽性対照の LPSを添加して培養した時の培地中の NO ₂ - 濃度を示す図である。

第 7図は、フコィダン及びその分解物の I FN— 7産生誘導作用を示す図であ。

第 8図は、フコィダン及びその分解物の I L一 1 2産生誘導作用を示す図であ。

第 9図は、ガゴメ昆布由来フコィダンのマウス脾臓リンパ球の細胞傷害性免疫増強作用を示す図である。

第 1 0図は、 G—フコィダンの I FN— 7産生誘導作用を示す図である。第 1 1図は、 G—フコィダンの I L一 1 2産生誘導作用を示す図である。第 1 2図は、フコィダンの I FN— 7又は I L一 1 2産生誘導作用に対する各種抗体の作用を示す図である。

第 1 3図は、各フコィダンの I FN—ァ産生誘導作用を示す図である。発明を実施するための最良の形態

本発明に使用するフコィダンとは硫酸化フコースを構成成分として含む多糖であり、サイト力イン類産生調節作用、例えば抗原提示細胞（APC) と T細胞との抗原伝達反応時におけるインターフロン一 7産生調節作用、インターロイキン— 1 2産生調節作用；一酸化窒素産生誘導作用；又は抗アレルギー作用、例えば I g E産生抑制作用を有するものであれば特に限定はない。例えば、藻類であるガゴメ昆布、ト o口昆布、ヒバマ夕、ォキナヮモズク、ワカメ、クロメ、ァラメ、カジメ、ジャイアントゲルプ、レツソニァニグレセンス、ァスコフィラムノドッサム等の昆布目、ながもつも目、ひばまた目等の海藻は特に本発明の使用に好適なフコィダンを多く含んでおり、原料として好適である。また、棘皮動物、例えばナマコ、ゥニ、ヒトデ等由来のフコィダンを使用してもよい。

これらのフコィダンの調製はそれぞれ公知の方法で調製すれば良く、精製物又は当該フコィダン含有物等を本発明に使用することができる。

例えばガゴメ昆布からフコィダンを調製し、該フコィダンはさらにグルクロン酸含有フコィダン（U—フコィダンと称す）とグルクロン酸非含有フコィダン（ F—フコィダンと称す）とに分離することができる。それらのフコィダンは、本発明の治療剤又は予防剤等の有効成分として使用することが出来る。また、ガゴメ昆布から硫酸化フコガラクタン（G—フコィダンと称す）を調製し使用することもできる。

U—フコィダン及び F —フコィダンは、ガゴメ昆布からフコィダンを調製後、陰イオン交換樹脂、界面活性剤等を用いて分離される。ガゴメ昆布由来の U—フコィダン及び F —フコィダンの存在比は重量比で約 1 ： 2であり、 U—フコイダンはフコース、マンノース、ガラクトース、グルクロン酸等を含み硫酸含量は約 2 0重量、 F—フコイダンはフコースとガラクト一スを含み、硫酸含量は約 5 0重量％、分子量は両物質共に約 2 0万を中心に分布している（第 1 8回糖質シンポジゥム要旨集、第 1 5 9頁、 1 9 9 6年）。

例えばガゴメ昆布から調製したフコイダン溶液を D E A E -セル口ファイン A — 8 0 0カラムにアプライ後、 N a C 1含有緩衝液にて濃度勾配法により溶出させることにより、 U—フコィダンと F —フコィダンとに分離することができる。第 1図にその 1例を示す。すなわち第 1図は U—フコィダンと F —フコィダンの分離を示す図であり、図中前ピークが U—フコィダン、後ピークが F—フコイダンである。

また、ガゴメ昆布由来フコィダンをアルテロモナス s p. SN- 1 009 ( FERM BP— 574 7) が産生する F—フコィダン特異的分解酵素、及びフラボバクテリゥム s p. S A- 00 82 (F ERM BP— 5402) が産生する U—フコイダン特異的分解酵素で分解し、分解物を除去することにより、前出 G—フコィダンを精製することができる。

また例えばヒバマ夕由来フコィダン、ォキナヮモズク由来フコィダン、ワカメ由来フコィダン、ワカメメカブ由来フコィダンもそれぞれ公知の方法で調製し、本発明に使用することができる。

本発明において好適に用いられる棘皮動物由来のフコィダンとしては、例えば特開平 4— 9 1 027号公報に記載のナマコに含有されるフコィダンを挙げることができ、当該公報記載の方法にてナマコより当該フコィダンを調製することができる。

また本発明に使用するサイトカイン類産生調節作用、一酸化窒素産生誘導作用、抗アレルギー作用を有するフコィダンの分解物は、酵素学的方法、化学的方法、物理的方法等の公知の方法にて、目的のサイト力イン類産生調節作用、一酸化窒素産生誘導作用、抗アレルギー作用を有する分解物も選択し、使用することができる。

かかるフコィダンの分解物の調製方法としては、例えば酸分解法があり、当該フコィダンを酸分解することにより、サイト力イン類産生調節作用、免疫賦活作用、一酸化窒素産生誘導作用、抗アレルギー作用を有する分解物を調製することができる。

前記酸分解法における酸分解の条件は、サイト力イン類産生調節作用、一酸化窒素産生誘導作用、抗アレルギー作用を有する分解物（以下、本発明の分解物と称す）が生成する条件であれば、特に限定はない。例えばフコィダンを酸に溶解またはけん濁し、反応させることにより、本発明の分解物が生成する。また、反応時に加熱することにより、本発明の分解物の生成に必要な時間が短縮される。

フコィダンを溶解またはけん濁する酸の種類は、特に限定するものではないが、塩酸、硫酸、硝酸等の無機酸、クェン酸、ギ酸、酢酸、乳酸、ァスコルビン酸等の有機酸、また陽イオン交換樹脂、陽イオン交換織維、陽イオン交換膜等の固体酸が使用可能である。

酸の濃度も特に限定はないが、好ましくは 0 . 0 0 0 1〜5規定、より好ましくは 0 . 0 1〜1規定程度の濃度で使用可能である。また、反応温度も特に限定はないが好ましくは 0〜2 0 0 °C、より好ましくは 2 0〜1 3 0 °Cに設定すれば良い。

また、反応時間も特に限定するものではないが、好ましくは数秒〜数日に設定すれば良い。酸の種類と濃度、反応温度及び反応時間は本発明の分解物の生成量、分解物の重合度により適宜選択すれば良い。例えば、本発明の分解物の製造に際しては、好ましくは、クェン酸、乳酸、リンゴ酸等の有機酸を使用し、酸の濃度は数 1 0 111 ^^〜数1^、加熱温度は 5 0〜1 1 0 ；、より好適には 7 0〜 9 5 °C 、加熱時間は数分〜 2 4時間の範囲から適宜選択することにより、本発明の分解物を調製することができる。フコィダンの酸分解物としては、ガゴメ昆布由来フコィダンの酸分解物が例示され、当該分解物はサイト力イン類産生調節作用、特に A P Cと T細胞との抗原伝達反応時におけるインターフ Xロン— τ産生調節作用、一酸化窒素産生誘導作用、及び抗アレルギー作用の強い新生理機能を有する食物織維として使用することができる。

本発明の分解物はサイトカイン類産生調節作用、一酸化窒素産生誘導作用、抗アレルギー作用を指標として分画することができ、例えば酸分解物をゲルろ過法、分子量分画膜による分画法等によりさらに分子量分画することができる。

ゲルろ過法の例としては、セル口ファイン G C L— 3 0 0を使用し、例えば分子量 2500 0超、分子量 25 0 0 0〜 1 00 0 0超、分子量 1 0000〜 50 00超、分子量 500 0以下等の任意の分子量画分を調製でき、セル口ファイン GCL- 25を用い、例えば分子量 50 0 0以下の画分を分子量 5 000〜 30 00超、分子量 30 00〜 200 0超、分子量 200 0〜1 00 0超、分子量 1 00 0〜50 0超、分子量 50 0以下等の任意の分子量画分に調製することができる。

また、限外ろ過膜を用いて工業的に分子量分画を行うこともでき、例えばダイセル社製 FE 1 0 -FUSO 382を用いることにより分子量 30000以下の画分を、若しくは同 FE— FUS— T 6 5 3を使用することによって分子量 60 0 0以下の画分を調製することができる。更にナノフィルター膜を用いることにより分子量 500以下の画分を得ることもでき、これらのゲルろ過法、分子量分画法を組み合せることにより、任意の分子量画分を調製することができる。

本発明で使用できるサイトカイン類産生調節作用、一酸化窒素産生誘導作用、抗アレルギー作用を有するフコィダンの分解物としては、下記の式（ I) 〜式（ I V) で表される化合物が例示され、これらの化合物は国際公開第 97/26 8 9 6号パンフレツト、国際出願番号 PCTZJP 9 9 / 00 6 0 6号明細書、国際出願番号 PCTZJP 00 / 00 9 6 5号明細書に記載の方法で調製することができる。また、本発明のフコィダンの分解物としては、国際公開第 9 7/26 8 9 6号パンフレツト、国際出願番号 PCTZJP 9 9 /0 0 6 0 6号明細書、国際出願番号 PC TZ J P 00 / 0 0 9 65号明細書に記載のフコィダンの分解物も包含される。なお、式（ I) で表される化合物の繰返し構造を有するフコィダン、及びォリゴ糖も本発明において好適に使用することができる。

(式中、 Rは〇H又は 0S〇₃ Hである。）

(式中、 Rは〇H又は 0S〇₃ Hである。）

l o

(式中、 Rは〇H又は〇S〇₃ Hである。）

(式中、 Rは OH又は〇S0₃ Hである。）

なお、式（ I) で表される化合物の例としては後述の式（V) で表される化合物が挙げられる。

式（I) で表される化合物は、例えば前記 F—フコィダンを、アルテロモナス s p. SN- 1 009 (FERM BP— 5747) が産生するェンド型硫酸化多糖分解酵素（F—フコィダン特異的分解酵素）で処理し、その分解物より精製することにより得ることができる。当該化合物中の硫酸基の含量、部位についてはその分解物中より、任意のものを精製することができる。また当該分解物中には式（I) で表される化合物の多量体も含有されており、目的に応じて分離、精製することができる。

式（I I) で表わされる化合物、及び式（ I I I) で表される化合物は、それぞれ例えば前記 U—フコィダンを、フラボパクテリゥム s p. SA— 008 2 (FERM BP— 5402 ) が産生するエンド型硫酸化多糖分解酵素（U— フコィダン特異的分解酵素）で処理し、その分解物より精製することにより得ることができる。当該化合物中の硫酸基の含量、部位についてはその分解物中より、任意のものを精製することができる。また当該分解物中には式（I I) で表される化合物の二重結合のない化合物を基本骨格とする、その多量体も含有されており、目的に応じて分離、精製することができる。

式（ I V) で表される化合物は、例えばフラボパクテリゥム s p. S A— 0082 (FERM BP— 5402) より得られる G—フコィダンを特異的に分解するエンド型硫酸化多糖分解酵素（G—フコィダン特異的分解酵素）を G - フコィダンに作用させることにより当該 G—フコィダンの分解物を調製し、当該分解物より精製することにより得ることができる。当該化合物中の硫酸基の含量、部位についてはその分解物中より、任意のものを精製することができる。また当該分解物中には式（ IV) で表される化合物を基本骨格とする、その多量体も含有されており、目的に応じて分離、精製することができる。

なお、フコィダン又はその分解物のサイト力イン類産生調節作用、一酸化窒素産生誘導作用、又は抗アレルギー作用は、例えば後述の実施例 1、 2、 7及び 8 に記載の方法により検定する。被検対象であるフコィダン又はその分解物が、かかる作用を示す場合、それを指標として本発明に用い得るフコィダン又はその分解物を選択する。

本発明において、フコィダン又はその分解物により産生調節され得るサイトカィン類とは特に限定はないが、例えばインターロイキン（ I L) 一 1〜 18、ィンターフェロン（I F N) —ひ、 I FN-S、 I FN- r> リンホトキシン、腫瘍壊死因子（TNF)、幹細胞因子（SCF)、顆粒球 'マクロファージコロニ一刺激因子（GM - CSF)、顆粒球 · コロニー刺激因子（G— CSF)、マク口ファージコロニー刺激因子（M— CSF)等が例示される。

これらのサイトカイン類は遅延型過敏反応や標的細胞障害をはじめ、種々の細胞性免疫反応の発現や調節に関与するもの（ I L一 2、 I FN-r. TNF— 、 TNF— ^等）、抗体産生機構において、その調節機能に関与するもの（I L 一 2、 I L一 4、 I L一 5、 I L一 6等）、腫瘍細胞に対して直接増殖抑制作用や破壊作用を示すもの（TNF—ひ、 TNF— yS、 I FN等）、骨髄における造血幹細胞や前駆細胞の増殖，分化を促進するもの（I L一 1、 I L— 3、 I L- 4、 I L一 5、 I L—6、 I L - 7、 I L一 9、 I L- 1 G -CSF. G 一 CSF、 M— CSF等）、炎症反応に関与するもの（I L一 1、 I L— 6、 I L一 8、 TNF— 、 TNF—；8、 I FN等）、アレルギー反応に関与するもの (I L一 3、 I L一 4、 I L一 5等）、 NK細胞活性を増強するもの（ I L一 1 2)等がある。なお、本発明において使用するフコィダン及びノ又はその分解物が有するサイト力イン類産生調節作用とは、ウィルス感染、或いは癌等、体内に排除すべき抗原が存在し、細胞性免疫の増強が必要なときのみに選択的に生じさせ得るサイト力イン類の産生調節作用、例えば I F N—ァ、 I L一 12の産生誘導作用や、それらの産生増強作用又は産生促進作用をいう。それゆえ、該フコィダン及び Z又はその分解物は不必要な状態での免疫系の活性化やその増強を生じさせず、従ってアレルギー症状、自己免疫疾患等の疾病を惹起することがなく、極めて安全かつ有効な成分である。また、該フコィダン及び又はその分解物は、例えばリンパ球の細胞傷害活性を増強し、細胞傷害性免疫の増強をももたらし得る。

従って、フコィダン及び κ又はその分解物を使用し、これらのサイト力イン類の産生を調節することにより、サイト力イン類産生調節を要する疾患、例えば癌等の細胞性免疫反応の発現や調節を要する疾患、自己免疫症のような抗体産生の調節を要する疾患、貧血、糖尿病等の細胞の分化を要する疾患、敗血症性ショック、炎症性腸疾患、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、ブドウ膜炎等の炎症の抑制を要する疾患の治療又は予防が可能となる。

本発明で使用するフコィダン及びその分解物はサイトカイン類産生調節能を有し、これらの化合物を有効成分としてサイトカイン類の産生調節を要する上記疾患の治療剤又は予防剤を製造することができる。

また、本発明で使用するフコイダン及びその分解物は一酸化窒素産生誘導作用を有し、これらの化合物を有効成分として使用し、一酸化窒素産生を要する疾患、例えば血管平滑筋の弛緩、拴球、顆粒球及び単球の血管壁への付着の抑制、分泌性平滑筋の細胞の増殖阻止等を要する動脈硬化症の治療又は予防が可能となる。また、該フコィダン及びその分解物はかかる作用を介した免疫賦活効果をも奏する。なお、一酸化窒素産生誘導作用には、誘導増強作用若しくは誘導促進作用も含む。

さらに、本発明で使用するフコィダン及びその分解物は、抗アレルギー作用、例えば I g E産生抑制作用を有し、これらの化合物を有効成分として使用し、ァレルギ一性疾患、例えば I g E産生により媒介されるか悪化する症状、例えば I g Eが起因となるアレルギー性疾患、例えば気管支喘息、アレルギー性鼻炎、ァトビー性皮膚炎、アレルギー性結膜炎、じん麻疹、アナフィラキシーショック等を治療又は予防することができる。

なお、前記フコィダンの特定の分画物、特に F—フコィダン、 U—フコィダン、 G—フコィダンは、その基本構造が初めて明確となったフコィダン分画物であるという点において、各分画物に特異的に作用する酵素を用いて調製される各分解物、特にその分解物の分画物、例えば式（ I ) 〜（ I V) 等の化合物は分子量も、フコィダンと比較し低分子であり、かつフコィダンと同等の生理活性を有するという点において、構造、組成、物性が不明確な単に分離されたフコィダン若しくはフコィダン含有物に比べて顕著に優れる。

本発明においては、かかるフコィダン及び Z又はその分解物を有効成分として含有するサイトカイン類産生調節を要する疾患、一酸化窒素産生を要する疾患、又はアレルギー性疾患の治療剤又は予防剤を提供する。

特に、本発明のサイトカイン類産生調節を要する疾患の治療剤又は予防剤としては、有効性の観点から、好ましくはインターロイキン類又はインタ一フエロン類産生調節を要する疾患の治療剤又は予防剤であり、より好ましくはインターフェロン 7又はインターロイキン一 1 2産生調節を要する疾患の治療剤又は予防剤である。また、本発明のアレルギー性疾患の治療剤又は予防剤は抗原感作後の I g E産生抑制作用を有すること、経口投与で抗原感作後の I g E産生抑制作用を有する点において極めて有用な抗アレルギー剤である。さらに、本発明のアレルギー性疾患の治療剤又は予防剤は、特に花粉症の様に抗原感作された症状においての抗原特異的 I g E産生を経口投与で抑制し得るという点において顕著に優れる。従って、アレルギー性疾患の治療剤又は予防剤としては、 I g E産生抑制を要する疾患の治療剤又は予防剤が好ましい。

本発明の治療剤又は予防剤は、フコィダン及び Z又はその分解物を有効成分とし、これを公知の医薬用担体と組合せ製剤化することにより得られる。当該製剤の製造は一般的には、フコィダン及び Z又はその分解物を薬学的に許容できる液状又は固体状の担体と配合し、かつ必要に応じて溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等を加えて、錠剤、顆粒剤、散剤、粉末剤、カプセル剤等の固形剤、一般液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤とすることにより行う。また、使用直前に適当な担体の添加によって液状となし得る乾燥品とすることもできる。

医薬用担体は、本発明の治療剤又は予防剤の投与形態及び剤型に応じて適宜選択することができる。経口剤の場合は、例えばデンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩等が利用される。また経口剤の調製に当つては、更に結合剤、崩壊剤、界面活性剤、潤沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料等を配合することもできる。

一方、非経口剤の場合は、常法に従い本発明の有効成分であるフコィダン及び /又はその分解物を希釈剤としての注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、注射用植物油、ゴマ油、ラッカセィ油、ダイズ油、トウモロコシ油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等に溶解ないし懸濁させ、必要に応じ、殺菌剤、安定剤、等張化剤、無痛化剤等を加えることにより調製することができな。

本発明の治療剤又は予防剤は、製剤形態に応じた適当な投与経路で投与することができる。また、投与方法も特に限定はなく、内用、外用及び注射によることができる。注射剤は、例えば静脈内、筋肉内、皮下、皮内等に投与し得、外用剤には座剤等も包含される。なお、かかる治療剤又は予防剤は、その有効性の観点から、経口用治療剤又は経口用予防剤とするのが好ましい。

本発明の治療剤又は予防剤としての投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的及びこれに適用される患者の年齢、体重、症状によって適宜設定され一定ではないが、一般には製剤中に含有されるフコィダン及び Z又はその分解物の量で好ましくは成人 1 日当り 0 . 1〜2 0 0 O m g /k gとなる量である。従って、本発明の治療剤又は予防剤におけるフコィダン及び Z又はその分解物の含有量は、当該治療剤又は予防剤を投与することにより少なくとも前記範囲でフコィダン及び又はその分解物が投与され得るように適宜決定すればよい。なお、投与量は種々の条件によつて変動するので、上記投与量より少なレ、量で十分な場合もあるし、あるいは範囲を超えて必要な場合もある。本発明の治療剤又は予防剤は、そのまま経口投与するほか、任意の飲食品に添加して日常的に摂取させることもできる。またフコィダン及び又はその分解物をサイトカイン類産生調節用飲食品又は飼料、一酸化窒素産生誘導用飲食品又は飼料、抗アレルギー用飲食品又は飼料の原料として用いても良い。

また本発明の一態様として、サイト力イン類産生調節を要する疾患、一酸化窒素産生を要する疾患、又はアレルギー性疾患を治療又は予防するためのフコイダン及び/又はその分解物の使用；或いはフコィダン及び Z又はその分解物を用いるサイト力イン類産生調節を要する疾患、一酸化窒素産生を要する疾患、又はァレルギ一性疾患の治療又は予防方法を提供する。

サイト力イン類産生調節を要する疾患、一酸化窒素産生を要する疾患、又はァレルギ一性疾患の治療又は予防を行うには、例えばフコィダン及び z又はその分解物を前記例示する範囲で投与すればよく、例えば本発明の治療剤又は予防剤を適宜投与する。

さらに本発明の一態様として、フコイダン及び Z又はその分解物を有効成分として含有するサイト力イン類産生調節剤、例えば I F N— γ産生調節剤、 I L— 1 2産生調節剤；一酸化窒素産生誘導剤；又は抗アレルギー剤、例えば I g E産生抑制剤を提供する。これらの薬剤は上記治療剤又は予防剤に準じて製造され得る。例えばサイトカイン類産生調節剤は、サイトカイン類の機能研究、サイト力ィン類が関連する疾病用医薬のスクリーニングに有用である。これらの薬剤の剤型、使用量等は、各用途に応じて当該薬剤により奏される所望の効果が得られるようであれば特に限定されるものではない。なお、前記例示する疾患等に対し適用することもできる。

さらに本発明の一態様として、サイト力イン類産生調節、一酸化窒素産生誘導、アレルギー抑制又は I g E産生抑制のためのフコィダン及び Z又はその分解物の使用；又はフコィダン及び/又はその分解物を用いるサイトカイン類産生調節方法、一酸化窒素産生誘導方法、アレルギー抑制方法、又は I g E産生抑制方法を提供する。

サイトカイン類産生調節、一酸化窒素産生誘導、アレルギー抑制又は I g E産生抑制を行うには、例えば前記サイトカイン類産生調節剤、一酸化窒素産生誘導剤等を各用途に応じて所望の効果が得られるように使用すればよい。

本発明に使用されるフコィダン又はその分解物の推定される薬理作用を以下に説明する。

リンパ球からの I FN— 7の産生誘導には、 C 0 n A等のマイトジェンにおける T細胞の直接刺激による誘導、および抗原感作時における抗原提示細胞（AP C) と T細胞との細胞間相互作用による誘導が知られている。前者はマイトジェンの T細胞レセプターへの直接結合による誘導であり、後者は A PCと T細胞との各レセプターの刺激、及びそれにより APCから産生された I L— I 2による産生誘導である。 I L一 12産生誘導に関与するレセプターの反応として T細胞レセプター（TCR) /主要組織適合性複合体（MHC) の他、副刺激として T 細胞側の CD 40Lと APC側の CD40、及び T細胞側の CD 28と APC側の B 7の各反応が知られている。

従来、ラミナリアジャポニカ（Laminaria japonika) 由来のフコィダンが、正常マウス由来の脾臓リンパ球からの I FN— 7産生を誘導し、 NK細胞の活性化を増強する（中国海洋薬物雑誌、 1995第 3期、 9〜13) との報告があるが、これは静止期にあるナイ一ヴ T紬胞への直接刺激による誘導である。

—方、今回、本発明者らが確認したガゴメ昆布由来フコィダン、及びその画分の I FN—ァの產生誘導作用に関しては、実施例に示すように、リンパ球の直接刺激、またはァロ抗原刺激時における誘導作用は認められず、感作リンパ球の抗原刺激下でのみ I FN— < 産生を増強させた。さらにこのとき I L— 1 2の産生誘導も認められた。この抗原提示反応時における I FN -ァ産生誘導作用は抗 I L- 1 2抗体により産生された I L一 1 2を中和したときに約 50%が抑制され、抗 CD 40抗体及び抗 CD 28抗体でこれらのレセプターの反応を阻害したときには完全に抑制された。このことより、ガゴメ昆布由来フコィダン、及びその画分の I FN— 7の産生誘導の作用機序に関して、抗原提示反応時において AP Cに働いて I L一 1 2産生を増強させたことによるもの、及び A P Cと T細胞との相互作用により活性化された状態にある T細胞に働いて誘導した可能性が推測される。

静止期の T細胞に対する直接誘導作用を見ている前記報告に記載のフコィダンと本発明で使用するガゴメ昆布由来フコィダンは異なり、その結果は、全く異なる作用を示すものである。

また、抗原提示細胞の一つであるマクロファージの細胞株を用いた系で、フコイダン及ぴその分解物は、一酸化窒素產生を誘導し、その誘導により免疫賦活効果があることを示しているが、この系においても、フコィダン及びその分解物による I F N— 7の産生誘導は見られず、本発明に使用するフコィダン及びその分解物には、 I F N— 7を直接産生誘導する活性はなく、一酸化窒素の産生増強と I L - 1 2の産生増強がパラレルであると考えられることからも、本発明によるフコィダンおよびその分解物による I F N— 7の産生増強は、静止期 T細胞の直接刺激による誘導ではなく、抗原提示反応時において A P Cに働いて I L— 1 2 産生を増強させたことによるもの、及び A P Cと T細胞との相互作用により活性化された状態にある T細胞に働いて誘導した可能性が推測される。この点からも本発明に使用されるフコィダン及びその分解物は直接誘導作用を見ている前記報告とは、全く異なる作用を示すものである。

なお、 I F N—ァは T钿胞（T h 1 ) の T細胞レセプターが抗原提示細胞（ A P C) 等により刺激されたとき産生され、さらに A P Cから産生される I L一 1 2によって産生が増強される。 I F N— 7はウィルス、真菌感染、および癌疾患等において N K細胞、マクロファージ等の細胞性免疫を活性化させ、生体防御能の増強に働く。

一方、 I F N—ァは喘息、花粉症、アトピー性皮膚炎等に代表されるアレルギ —性疾患の発生の原因とされている T h 2細胞の活性化を抑制することが知られている。 T h 2細胞は免疫グロプリン E抗体（ I g E ) の産生を誘導する。産生された I g Eはマスト細胞の細胞膜上のレセプターに結合し、マスト細胞からのケミカルメディエーターの放出を惹起する。この炎症性のメディエーターが直接の原因となりアレルギー症伏が発症する。

本発明の抗アレルギー剤は抗原感作後の経口投与において、 I g E産生を抑制し、発症後の喘息、花粉症、アトピー性皮膚炎等に代表されるアレルギー性疾患の症状改善に極めて有用である。

さらに、本発明はフコィダン及び Z又はその分解物を含有してなるサイトカイン類產生調節用食品又は飲料、一酸化窒素産生誘導用食品又は飲料、或いは抗ァレルギ一用食品又は飲料を提供する。

特に、本発明のサイト力イン類産生調節用食品又は飲料としては、有効性の観点から、好ましくはインターロイキン類又はィンターフェ口ン類産生調節用食品又は飲料であり、より好ましくはインターフヱロンァ又はインターロイキン一 1 2産生調節用食品又は飲料である。

また、本発明の抗アレルギー用食品又は飲料は抗原感作後の I g E産生抑制作用を有すること、摂取により抗原感作後の I g E産生抑制作用を発揮する点において極めて有用な食品又は飲料である。従って、抗アレルギー用食品又は飲料としては、 I g E産生抑制用食品又は飲料が好ましい。

なお、後述の飼料についても、同様の観点から、これら作用を有する飼料が好ましい。

かかる食品又は飲料は、そのサイト力イン類産生調節作用、一酸化窒素産生誘導作用、抗アレルギー作用により、フコィダン又はその分解物に感受性を示すサイト力イン類產生調節を要する疾患、一酸化窒素産生を要する疾患、アレルギー性疾患の症状改善、予防に極めて有用である。

なお、本発明の食品、飲料又は飼料、後述の化粧料にいう「含有」の語は、含有、添加、希釈の意を含むものであり、含有とは食品、飲料等に本発明で使用される有効成分が含まれるという態様を、添加とは食品、飲料等の原料に、本発明で使用される有効成分を添加するという態様を、希釈とは本発明で使用される有効成分に、食品、飲料等の原料を添加するという態様をいうものである。

本発明の食品又は飲料の製造法は公知の方法に従えばよく特に限定はない。例えば、かかる製造法としては調理、加工及び一般に用いられている食品又は飲料の製造法を挙げることができ、製造された食品又は飲料にサイトカイン類産生調節作用、一酸化窒素産生誘導作用、及び抗アレルギー作用を有するフコィダン及び又はその分解物が有効成分として含有されていれば良い。

本発明の食品又は飲料は特に限定はないが、フコィダン及びノ又はその分解物を有効成分として含有する、例えば穀物加工品（小麦粉加工品、デンプン類加工品、プレミックス加工品、麵類、マカロニ類、パン類、あん類、そば類、麩、ビ一フン、はるさめ、包装餅等）、油脂加工品（可塑性油脂、てんぷら油、サラダ油、マヨネーズ類、ドレッシング等）、大豆加工品（豆腐類、味噌、納豆等）、食肉加工品（ハム、ベーコン、プレスハム、ソーセージ等）、水産製品（冷凍すりみ、かまぼこ、ちくわ、はんぺん、さつま揚げ、つみれ、すじ、魚肉ハム、ソ一セージ、かつお節、魚卵加工品、水産缶詰、つくだ煮等）、乳製品（原料乳、クリーム、ヨーグルト、バタ一、チーズ、練乳、粉乳、アイスクリーム等）、野菜，果実加工品（ペースト類、ジャム類、漬け物類、果実飲料、野菜飲料、ミックス飲料等）、菓子類（チョコレート、ビスケット類、菓子パン類、ケーキ、餅菓子、米菓類等）、アルコール飲料（日本酒、中国酒、ワイン、ウィスキー、焼酎、ウォッカ、ブランデー、ジン、ラム酒、ビール、清涼アルコール飲料、果実酒、リキュール等）、嗜好飲料（緑茶、紅茶、ウーロン茶、コーヒー、清涼飲料、乳酸飲料等）、調味料（しょうゆ、ソース、酢、みりん等）、缶詰 ·瓶詰め - 袋詰め食品（牛飯、釜飯、赤飯、カレ一、その他の各種調理済み食品）、半乾燥又は濃縮食品（レバーペースト、その他のスプレツド、そば . うどんの汁、濃縮スープ類）、乾燥食品（即席麵類、即席カレー、インスタントコーヒー、粉末ジユース、粉末スープ、即席味噌汁、調理済み食品、調理済み飲料、調理済みスープ等）、冷凍食品（すき焼き、茶碗蒸し、うなぎかば焼き、ハンバーグステーキ、シユウマイ、餃子、各種スティック、フルーツカクテル等）、固形食品、液体食品（スープ等）、香辛料類等の農産，林産加工品、畜産加工品、水産加工品等が挙げられる。

本発明の食品又は飲料としては、サイト力イン類産生調節作用、一酸化窒素産生誘導作用、抗アレルギー作用等から選択される生理作用を有するフコィダン及び Z又はその分解物が含有されており、その生理作用を発現するための必要量が含有されていれば特にその形状に限定はなく、夕ブレット状、顆粒状、カプセル状等の経口的に摂取可能な形状物も包含する。

フコィダン及び Z又はその分解物の食品又は飲料における含有量は、その官能と生理活性の点から適宜選択すればよいが、例えば、食品 1 0 0重量部当たり 1 0一⁹重量部以上、好ましくは 1 0— ⁷〜2重量部であり、例えば飲料 1 0 0重量部当たり 1 0 _ ⁹重量部以上、好ましくは 1 0— ⁷〜2重量部である。また、例えば、成人 1日当たりフコィダン及び Z又はその分解物が好ましくは 0 . 0 1〜2 0 0 O m g / k となるように摂取すればよい。

なお、サイト力イン類産生調節作用、一酸化窒素産生誘導作用、抗アレルギー作用等から選択される生理作用を有するフコィダン及びその分解物は、当該生理作用と食物繊維機能を合わせ持つ健康食品素材として、食品又は飲料の製造素材として極めて有用である。

さらに本発明により、サイト力イン類産生調節作用、一酸化窒素産生誘導作用、抗アレルギー作用等から選択される生理作用を有するフコィダン及び Z又はその分解物を有効成分として含有してなる生物用の飼料が提供される。

また本発明の一態様として、当該生理作用を有するフコイダン及び又はその分解物を生物に投与する生物の飼育方法が提供される。

また本発明の一態様として、当該生理作用を有するフコィダン及びノ又はその分解物を含有する生物飼育用剤が提供される。これらの発明において、生物とは例えば養殖動物、ぺット動物等であり、養殖動物としては家畜、実験動物、家禽、魚類、甲殻類又は貝類が例示される。飼料としてはフコィダン及び Z又はその分解物の生理作用に基づく体調改善用飼料が例示される。

生物飼育用剤としては浸漬用剤、飼料添加剤、飲料用添加剤が例示される。これらの発明において、当該生理作用を有するフコィダン及び Z又はその分解物は、生物の飼育効率、例えば生存率、肥育率、産卵率、産仔率、離乳率等を向上させる効果を有する。

フコィダン及びノ又はその分解物を生物に投与する生物の飼育方法においては

、当該生理作用を有するフコィダン及び Z又はその分解物を通常、対象生物の体重 l k g、 1 日当たり好ましくは 0 . 0 1〜2 0 0 O m g投与すればよい。投与は、例えばフコィダン及び Z又はその分解物を人工配合飼料の原料中に添加、混合するか、人工配合飼料の粉末原料と混合した後、その他の原料に添加、混合することにより行うことができる。また、かかるフコィダン及び Z又はその分解物の投与量が達成され得るように、本発明の飼料を投与してもよい。

当該生理作用を有するフコィダン及び又はその分解物の飼料中の含有量は特に限定はなく、目的に応じて使用すれば良いが、 0 . 0 0 1〜 1 5重量％の割合が好ましい。

人工配合飼料としては、魚粉、カゼイン、イカミールなどの動物性原料、大豆粕、小麦粉、デンプン、飼料用酵母などの植物性原料、タラ肝油、イカ肝油、などの動物性油脂、大豆油、菜種油等の植物性油脂、ビタミン類、ミネラル類、ァミノ酸、抗酸化剤等を原料とする人工配合飼料が挙げられる。また魚肉ミンチ等の魚類用飼料が挙げられる。

又、機能性オリゴ糖、例えばフラクトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖等、食物繊維、例えばボリデキストロース、難消化性デキストリン、 yS— 1 , 3—グルカン等、プロボリス、糖アルコール、例えばマルチトール、パラニチット、エリスリトール等、 E P A、 7—リノレン酸、ヘム鉄、クロレラ、スピルリナ、ホワイトベリ一エキス、難う触性素材、例えばポリフニノール等の機能性食品素材を本発明の飼料の原料として使用しても良い。なお本発明において飼料としては、飼料添加剤、飼料用栄養補助食も包含される。

本発明の飼料の製造方法に特に限定は無く、製造された飼料中にサイトカイン類産生調節作用、一酸化窒素産生誘導作用、抗アレルギー作用等から選択される生理作用を有するフコィダン及び Z又はその分解物の有効量が含有されていればよい。

また当該生理作用を有するフコィダン及び又はその分解物をプール、水槽、保持タンク又は飼育領域の水、海水等に直接添加し、対象生物を浸漬することにより、投与することもできる。この浸漬方法は対象生物の飼料摂取量が低下したときに特に有効である。

水又は海水中のフコィダン及びノ又はその分解物の濃度は特に限定はなく、目的に応じて使用すれば良いが、 0 . 0 0 0 0 1〜 1重量％の割合が好ましい。また当該生理作用を有するフコィダン及びノ又はその分解物を含有する飲料を飼育用飲料として対象生物に摂取させても良い。

飲料中の当該生理作用を有するフコィダン及び Z又はその分解物の濃度は特に限定はなく、目的に応じて使用すれば良いが、 0 . 0 0 0 〜 1重量％の割合が好ましい。

当該生理作用を有するフコィダン及び Z又はその分解物を有効成分とする生物飼育用剤、例えば浸漬用剤、飼料添加剤、飲料用添加剤はそれ自体公知の方法で作製すれば良い。

本発明が適用できる生物としては限定はないが、養殖動物としては、馬、牛、豚、羊、山羊、らくだ、ラマ等の家畜、マウス、ラット、モルモット、ゥサギ等の実験動物、鶏、ァヒル、七面鳥、駝鳥等の家禽、マダイ、イシダイ、ヒラメ、カレイ、プリ、ハマチ、ヒラマサ、マグロ、シマアジ、ァュ、サケ 'マス類、トラフグ、ゥナギ、ドジヨウ、ナマズ等の魚類、クルマエビ、ブラックタイガー、タイショウェビ、ガザミ等の甲殻類等、ァヮビ、サザェ、ホ夕テ貝、カキ等の貝類、ペット動物としてはィヌ、ネコ等が挙げられ、陸上 ·水中動物に広く適用できる。

サイト力イン類產生調節作用、一酸化窒素産生誘導作用、抗アレルギー作用等から選択される生理作用を有するフコィダン及び Z又はその分解物を含有する飼料を摂取すること、又は当該フコィダン及び又はその分解物の含有液に対象生物を浸漬することにより、家畜、実験動物、家禽、魚類、甲殻類、貝類、ペット動物等の体調、健康、生体の恒常性、新陳代謝等が顕著に改善され、本発明は生物の老化防止に極めて有用である。

さらに、サイト力イン類産生調節作用、一酸化窒素産生誘導作用、抗アレルギ一作用等から選択される生理作用を有するフコィダン及びノ又はその分解物は化粧料の有効成分として有用であり、本発明の一態様として、フコィダン及びノ又はその分解物を有効成分とするサイトカイン類産生調節用化粧料、一酸化窒素産生誘導用化粧料、抗アレルギー用化粧料等が提供される。

これらの化粧料等に含有されるフコィダン及び Z又はその分解物の含有量は通常、好ましくは 0 . 0 0 0 1〜2 0重量％、より好ましくは 0 . 0 0 1〜5重量 %である。

本発明の化粧料は経皮的、経口的使用に有効であり本発明により経皮投与、経口投与で有効な化粧料が提供される。特に抗アレルギー用化粧料はその抗ァトピ一作用により、アトピー性皮膚炎の治療、予防に有用な化粧料である。なお、その投与量又は適用量は、所望の効果が得られるように適宜調節すればよい。

本発明の化粧料は常法に従って製造することができ、サイトカイン類産生調節用化粧料、一酸化窒素産生誘導用化粧料、抗アレルギー用化粧料として、例えばローション類、乳液類、クリーム類、パック類、浴用剤、洗顔剤、浴用洗剤、毛髪剤、育毛剤又は洗髪剤を製造することができる。本発明に使用するサイト力イン類産生調節作用、一酸化窒素産生誘導作用、抗アレルギー作用を有するフコィダン及び/又はその分解物はラッ卜に対する経口投与において 1 gZk gを経口単回投与しても死亡例は認められない。実施例

以下、実施例を挙げて、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの記載に何ら限定されるものではない。なお、実施例における％は重量％を意味す。参考例 1

( 1 ) ガゴメ昆布を充分乾燥後、乾燥物 20 k gを自由粉砕機（奈良機械製作所製）により粉砕した。

水道水 900リツトルに塩化カルシウム二水和物（日本曹達社製） 7. 3 kg を溶解し、次にガゴメ昆布粉砕物 20 kgを混合した。液温 1 2°Cから液温 90 °Cとなるまで水蒸気吹込みにより 4 0分間昇温させ、次いでかくはん下 90〜9 5でに 1時間保温し、次いで冷却し、冷却物 1 1 00リツトルを得た。

次いで固液分離装置（ウェストファリアセパレーター社製 CNA型）を用い、冷却物の固液分離を行い、約 9 00リツトルの固液分離上清液を調製した。固液分離上清液 3 6 0リツトルをダイセル社製 FE 1 0 -FC-FUS 038 2 (分画分子量 3万）を用い、 20リツトルまで濃縮した。次いで水道水を 20 リットル加え、また 20リットルまで濃縮するという操作を 5回行い、脱塩処理を行い、ガゴメ昆布由来の抽出液 25リットルを調製した。

該溶液 1 リットルを凍結乾燥し、ガゴメ昆布由来フコィダン乾燥物 1 3 gを得た。

(2) 参考例 1一（ 1 ) 記載のフコィダン乾燥物 7 gを、 5 OmMの塩化ナトリゥムと 1 0 %のエタノールを含む 2 OmIV [のィミダブール緩衝液（pH 8. 0) 70 0 m lに溶解し、遠心分離により不溶物を除去した。 DEAE—セルロファイン A— 80 0カラム（01 1. 4 cmx 4 8 cm) を同緩衝液にて平衡化し、遠心分離上清をアプライ後、同緩衝液で洗い、塩化ナトリウムの 5 OmMから 1 . 95 Mの濃度勾配により溶出させた（ 1フラクション： 25 0m l ) 。フエノール硫酸法及び力ルバブール硫酸法にて、総糖量及びゥロン酸含量を求め、溶出順にフラクション 4 3〜4 9、フラクション 50〜5 5、フラクション 56〜6 7の画分を得た。次に、これらの画分を電気透折により脱塩後凍結乾燥し、フラクシヨン 43〜 4 9より I画分（34 0mg) 、フラクション 5 0〜 5 5より I I画分（8 70m g) 、フラクション 5 6〜 6 7より I I I画分（2. 64 g) をそれぞれ調製した。

第 1図にガゴメ昆布由来フコィダンの DEAE—セル口ファイン A— 8 0 0力ラム溶出パターンを示す。第 1図において縦軸は力ルバゾール硫酸法での 530 nmの吸光度（図中黒丸）、フエノール硫酸法での 4 8 0 nmの吸光度（図中白丸）、及び電導度（mSZcm：図中白四角）、横軸はフラクション番号を示す

参考例 2

( 1) アルテロモナス s p. SN- 1 0 0 9 (FERM BP— 5747) を、グルコース 0. 25%、ペプトン 1. 0%、酵母エキス 0. 0 5%を含む人工海水（ジャマリンラボラトリ一社製） p H 8. 2からなる培地 600 m

1を分注して殺菌した（ 1 20で、 20分間） 2リットルの三角フラスコに接種し、 25 °Cで 26時間培養して種培養液とした。ペプトン 1. 0%、酵母ェキス 0. 02 %、下記参考例 2 - （2) に記載の硫酸化多糖 0. 2%、及び消泡剤（信越化学工業社製 KM 70) 0. 0 1 %を含む人工海水 pH8. 0からなる培地 20リットルを 30リットル容のジャーファメンターに入れて 1 20°C、 20分間殺菌した。冷却後、上記の種培養液 600 m lを接種し、 24°Cで 24 時間、毎分 1 0リットルの通気量と毎分 25 0回転のかくはん速度の条件で培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体及び培養上清を得た。得られた培養上清を、排除分子量 1万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機により濃縮後 8 5%飽和硫安塩折し、生じた沈殿を遠心分離により集め、 1 0分の 1濃度の人工海水を含む 2 OmMのトリス—塩酸緩衝液（pH 8. 2) に対して充分透析し、 6 00 m lの硫酸化多糖に選択的に作用するェンド型硫酸化多糖分解酵素（ F—フコィダン特異的分解酵素）液を調製した。

(2) 乾燥したガゴメ昆布 2 Kgを直径 1 mmのスクリーンを装着させたカツ夕一ミル（増幸産業社製）により粉砕し、得られた昆布のチップを 20リットルの 80%エタノール中に懸濁し、 25でで 3時間かくはんし、ろ紙でろ過後、残渣を充分洗浄した。得られた残渣を、 95。Cに加温した 4 0リットルの 5 OmMの塩化ナトリゥムを含む 2 OmMリン酸ナトリゥム緩衝液 pH 6. 5に懸濁し、時々かくはんしながら 95 で 2時間処理し、硫酸化多裨を抽出した。

抽出液中の懸濁物を、ろ過し、ろ液を調製した後、ろ過残渣を 3. 5リットルの 1 0 OmM塩化ナトリウムにより洗浄し、更にろ液を得た。

両ろ液を合わせた後、 3 (TCまで温度を下げ、 3000 Uのアルギン酸リア一ゼ K (ナガセ生化学工業社製）を添加後、エタノールを 4リットル加え 25 で 24時間かくはんした。次に遠心分離を行い、得られた上清を排除分子量 1 0万のホロファイバーを備えた限外ろ過器により 4リットルに濃縮し、更に、 1 0% のエタノールを含む 1 0 OmMの塩化ナトリウムにより、着色性物質がろ過されなくなるまで限外ろ過を続けた。

非ろ過液中に生じた沈殿は遠心分離により除去し、この上清を 5 °Cまで温度を下げ、 0. 5N塩酸により pHを 2. 0とした後、生じたタンパク質等の沈殿を遠心分離により除去し、得られた上清を速やかに 1 N水酸化ナトリゥ厶により p Hを 8. 0とした。

次に、排除分子量 1 0万のホロファイバーを装着させた限外ろ過器により限外ろ過を行い、 2 OmM塩化ナトリウム pH8. 0により完全に溶媒置換後、再度 P Hを 8. 0として遠心分離後、凍結乾燥を行い、約 95 gの硫酸化多糖を調製した。

( 3 ) 乾燥したガゴメ昆布 2 K gを直径 1 m mのスクリーンを装着させたカツ夕一ミルにより粉砕し、得られた昆布のチップを 20リットルの 8 0 %エタノール中に懸濁し、 25°Cで 3時間かくはんし、ろ紙でろ過後、残渣を充分洗浄した。得られた残渣を、 30m lの上記参考例 2— ( 1 ) で調製したェンド型硫酸化多糖分解酵素、 1 0%のエタノール、 1 0 OmMの塩化ナトリウム、 50mMの塩化カルシウム、及び 5 OmMのィミダゾールを含む 20リットルの緩衝液（ρΗ 8. 2) に懸濁し、 25°Cで 4 8時間かくはんした。この懸濁液を網目の直径 3 2〃mのステンレス金網でろ過し、残渣を 5 OmMの塩化カルシウムを含む 1 0 %のエタノールで洗浄した。更にその残渣を 1 0リットルの 5 OmM塩化カルシゥムを含む 1 0 %のエタノール中に懸濁し、 3時間かくはん後、ステンレス金網でろ過、洗浄した。更にその残渣を同条件で懸濁後、 1 6時間かくはんし、直径 32 mのステンレス金網でろ過、洗浄した。

こうして得られたろ液及び洗浄液を集め、排除分子量 3000のホロファイバ —を装着させた限外ろ過機により限外ろ過し、ろ過液と非ろ過液に分離した。このろ過液をロータリーエバボレーターで約 3リットルに濃縮後、遠心分離して上清を得た。得られた上清を排除分子量 30 0の膜を装着させた電気透析器により脱塩し、この溶液に 0. 1 Mとなるように酢酸カルシウムを添加し、生じた沈殿を遠心分離により除去した。この上清をあらかじめ 5 OmMの酢酸カルシゥムにより平衡化させた DEAE—セル口ファイン（樹脂量 4リットル）にかけ、 5 OmMの酢酸カルシウム及び 5 OmMの塩化ナトリウムで充分洗浄後、 5 0m M〜80 OmMの塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出させた。この時の分取量は 1本当り 50 Om 1で行った。分取した画分をセルロースァセテ一ト膜電気泳動法 [アナリティカルバイオケミストリ一（An a 1 y t i c a 1 B i o c h em i s t r y) . 第 37巻、第 1 97〜 202頁（1 970) ] により分析したところ塩化ナトリウム濃度が約 0. 4 Mで溶出される硫酸化糖（フラクションナンバー 63付近）が均一であった。

そこで、まずフラクションナンバー 63の液を 1 50mlに濃縮後、濃度が 4 Mとなるように塩化ナトリゥムを添加し、あらかじめ 4 Mの塩化ナトリゥムにより平衡化した Ph e n y 1—セル口ファイン（樹脂量 200 ml) にかけ、 4M の塩化ナトリウムにより充分洗浄した。非吸着性の硫酸化糖画分を集め、排除分子量 300の膜を装着させた電気透析器により脱塩し、脱塩液 505 mlを得た o

得られた脱塩液のうち 40 m 1を 1 0 %のエタノールを含む 0. 2 Mの塩化ナトリウムによって平衡化させたセル口ファイン GCL— 90のカラム（4. 1 c mx 87 cm) にかけて、ゲルろ過を行った。分取は 1フラクション当り 9. 2 m 1で行った。

全フラクションに対して総糖量の分析をフヱノール硫酸法〔アナリティカルケミストリー（Analytical Chemistry)、第 28巻、第 350頁（1 956) 〕により行った。

この結果、硫酸化糖は 1つのピークを形成したので、そのピークの中央部分、フラクションナンバー 63〜70を集め、排除分子量 300の膜を装着させた電気透析器により脱塩後、凍結乾燥し、 1 12mgの下記式 Vで表される化合物の乾燥品を得た。

参考例 3

( 1 ) 乾燥ガゴメ昆布 2 K gを穴径 1 mmのスクリーンを装着した力ッタ一ミル (増幸産業社製）により破砕し、 2 0 リツトルの 8 0 %エタノール中で 25'C、 3時間攪拌後ろ過、洗浄した。得られた残渣を 5 OmMの塩化カルシウム、 1 0 OmMの塩化ナトリウム、 1 0%のエタノール、及び参考例 2— （ 1 ) で調製したアルテロモナス s p. SN- 1 0 0 9 (F ERM BP— 5 74 7 ) ェンド型硫酸化多糖分解酵素（F—フコィダン特異的分解酵素）を 1 U含む 2 0 リットルの 3 OmMイミダゾール緩衝液（pH 8. 2) に懸濁し、 2 5 °Cで 2日攪拌し、次いで穴径 3 2 mのステンレス金網でろ過し、洗浄した。得られた残渣を 1 0 OmMの塩化ナトリゥム、 1 0%のエタノール、及び 4 gのアルギン酸リアーゼ（ナガセ生化学工業製）を含む 4 0 リットルのリン酸ナトリゥム緩衝液（p H 6. 6) に懸濁し、 2 5て、 4日攪拌後、遠心分離し上清を得た。得られた上清中に含まれるアルギン酸の低分子化物を除去するため、排除分子量 1 0万のホ口ファイバーを装着した限外ろ過機により 2 リットルに濃縮後、 1 0 %のェタノールを含む 1 0 OmMの塩化ナトリウムで溶液交換した。この溶液に等量の 4 0 OmlV [酢酸カルシウムを添加攪拌後、遠心分離し、得られた上清を氷冷しながら、 1 Nの塩酸で pH2とした。生じた沈殿を遠心分離により除去し、得られた上清を 1 Nの水酸化ナトリウムにより pH 8. 0とした。この溶液を限外ろ過により 1 リツトルに濃縮後、 1 0 OmMの塩化ナトリウムで溶液交換した。この時生じた沈殿は遠心分離により除去した。得られた上清中の疎水性物質を除去するため、上清に 1 Mとなるように塩化ナトリウムを加えて、 1 Mの塩化ナトリウムで平衡化した 3 リットルのフヱニルセル口ファインカラム（生化学工業製）にかけ、素通り画分を集めた。この画分を限外ろ過機により濃縮後、 2 0mMの塩化ナトリウムで溶液交換し、凍結乾燥した。凍結乾燥物の重量は 2 9. 3 であった

(2) 上記の凍結乾燥物 1 5 gを 4 0 OmMの塩化ナトリウム及び国際公開第 9 7 2 6 8 9 6号パンフレット記載のフラボパクテリゥム s p. SA— 0 0 8 2 (FERM BP— 5 4 0 2) を培養し、参考例 2— ( 1 ) と同様にして該培養物から得られたェンド型硫酸化多糖分解酵素（U—フコィダン特異的分解酵素）を 9 U含む 1. 5 リットルの 5 OmMトリス塩酸緩衝液に溶解し、 2 5 で 6日反応後、エバポレーターで約 3 0 0 m lに濃縮した。濃縮液を排除分子量 3 5 0 0の透析チューブに入れて徹底的に透析し、透析チューブ内に残った液を、 5 OmMの塩化ナトリゥムで平衡化した 4 リットルの DEAE—セル口ファイン A— 8 0 0にかけ、 5 OmM塩化ナトリウムで充分洗浄後、 5 0〜 6 5 0 mMの塩化ナトリウムの濃度勾配による溶出を行った。更に同カラムを 6 5 OmMの塩化ナトリゥムで充分溶出させた。溶出画分のうち 6 5 OmMの塩化ナトリゥムで溶出した画分を硫酸化フコガラクタン画分として集め、排除分子量 1 0万の限外ろ過機により濃縮後、 1 OmMの塩化ナトリウムで溶液を置換し、凍結乾燥して硫酸化フコガラクタンの凍結乾燥物を 0. 8 5 g得た。得られた硫酸化フコガラクタン（G—フコィダン）は、構成糖としてガラクトースとフコースを含有し、そのモル比は、約 2 ： 1であった。参考例 4

市販のワカメメカブの乾燥物 1 Kgを穴の径が 1 mmのスクリーンを装着させたカッターミルにより破砕後、 1 0リツトルの 8 0 %エタノール中に懸濁し、 3時間攪拌後、ろ紙によりろ過し、残渣を得た。残渣を 5 OmMの塩化ナトリウムを含む 4 OmMのリン酸緩衝液（pH 6. 5) 20リットルに懸濁し 95 °C で 2時間処理した。処理液を 37でまで冷却後、 1 0%となるようにエタノールを添加し、市販のアルギン酸リア一ゼ K (ナガセ生化学工業社製）を 1 2000 U添加後、室温で 24時間攪拌した。得られた処理液を遠心分離し、その上清を排除分子量 1 0万のホロファイバ一を装着させた限外ろ過機により 2リットルに濃縮後、生じた沈殿を遠心分離により除去した。得られた上清を 5 に冷却後 0 . 5Nの塩酸を添加して pHを 2. 0とした後 30分間攪拌し、生じた沈殿を遠心分離により除去した。上清の pHを 0. 5 Nの水酸化ナトリウムにより 8. 0 とし、限外ろ過により溶液を 2 OmMの塩化ナトリウムに置換した。溶液の pH を 8. 0に調整後、遠心分離して得られた上清を凍結乾燥し、 90. 5 gのワカメメカブ由来フコィダンを得た。参考例 5

粉砕したヒバマ夕（Fucus vesiculosus ) の乾燥物 1 Kgを、 1 0リツトルの 8 0%エタノール中に懸濁し、 3時間攪拌後、ろ紙によりろ過し、残渣を得た。残渣を 1 0 OmMの塩化ナトリゥムを含む 3 OmMのリン酸緩衝液（pH 6. 0 ) 30リツトルに懸濁し 9 5°Cで 2時間処理した。処理液を 37°Cまで冷却後、 1 0 O gの活性炭を添加し 3 0分間攪拌した。市販のアルギン酸リアーゼ Kを 3 0 00 U添加後、 1 0 %となるようにエタノールを添加し室温で 24時間攪拌した。得られた処理液を遠心分離し、その上清を排除分子量 1 0万のホロファイバ一を装着させた限外ろ過機により 2リットルに濃縮後、生じた沈殿を遠心分離により除去した。この上清に抽出液を加えながら限外ろ過し、色素を除去した。得られた非ろ過液を 5 °Cに冷却後 0. 5 Nの塩酸を添加して pHを 2. 0とした後 3 0分間攪拌し、生じた沈殿を遠心分離により除去した。上清の pHを 0. 5N の水酸化ナトリウムにより 8. 0とし、限外ろ過により溶液を 2 OmMの塩化ナトリウムに置換した。溶液の pHを 8. 0に調整後、遠心分離して得られた上清を凍結乾燥し、 7 1 gのヒバマ夕由来フコィダンを得た。参考例 6

参考例 1一（ 1 ) 記載の方法で調製したガゴメ昆布由来フコィダン 2 gを 1 0 Om lの水に溶解し、その pHをクェン酸にて pH 3に調整後、 1 0 0 °Cで 3時間処理し、当該フコィダンの酸分解物を調製した。この酸分解物をセルロフアイン GCL— 3 0 0、又はセル口ファイン GCL— 2 5によるゲルろ過で分子量分画し、分子量 2 5 0 0 0超（A画分）、 25 0 0 0〜 1 0 0 0 0超（B画分）、 1 0 0 0 0〜5 0 0 0超（C画分）、 5 0 0 0〜20 0 0超（D画分）、 2 0 0 0〜5 0 0超（E面分）、 5 0 0以下（F画分）に分画した。更にこれらの画分及び酸分解物をそれぞれ脱塩後凍結乾燥を行い、酸分解物の各分画物及び酸分解物を調製した。参考例 7

マナマコを 5 k g解体し、内臓を除去し、体壁を集めた。体壁湿重量 2 0 O g 当り 5 0 0 m 1のァセトンを加え、ホモジナイザーで処理後ろ過し、残渣をこれ以上着色物質がなくなるまでアセトンで洗浄した。この残渣を吸引乾燥し、 1 4 0 gの乾燥物を得た。この乾燥物に 0. の食塩水 2. 8リットルを加え、 1 0 0°Cで 1時間処理後、ろ過し、残渣を 0. 4Mの食塩水で充分洗浄し、抽出液 3. 7リットルを得た。この抽出液に 5 %のセチルピリジニゥムクロリドを沈殿が生じなくなるまで加え、生じた沈殿を遠心分離で集めた。この沈殿を 0. 4M の食塩水に懸濁後再度遠心分離し、得られた沈殿に 1 リットルの 4M食塩水を添加し、ホモジナイザーで処理後、かくはんしながら 4 リットルのエタノールを添加し、 1時間かくはん後、ろ過し、沈殿を得た。この沈殿に対して、 8 0%エタノールに懸濁後ろ過という工程を上清の 2 6 0 nmの吸光度が 0になるまで繰り返した。得られた沈殿を 2リットルの 2 M食塩水に懸濁し、不溶物を遠心分離により除去した。上清を排除分子量 3万の膜を備えた限外ろ過装置により限外ろ過し、完全に脱塩後、凍結乾燥し 3. 7 gのナマコ由来フコィダンを得た。参考例 8

市販の塩蔵ォキナヮモズク 6 2 5 gを 4 3 7 5m lの 3 0 mMリン酸ナトリゥム緩衝液（pH 6. 0) に懸濁し、ホモジナイザーにより 8 0 0 0回転 Z分、 5 分処理後、 9 5°C、 1時間処理し、遠心分離により上清を得た。得られた上清に 1 0 gの活性炭を添加後 3 0分間攪拌し、遠心分離により上清を得た。得られた上清を排除分子量 1 0万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機により 2リットルに濃縮後、 2 OmMの塩化ナトリウムで溶液置換し、凍結乾燥して 1 0. 9 gのォキナヮモズク由来のフコィダン画分の乾燥物を得た。実施例 1

1 0%ゥシ胎児血清（ギブコ社製）含有、フヱノ一ルレッド不含、 2mM L 一グル夕ミン（ライフテックオリエンタル社製、 2 5 0 3 0— 1 4 9 ) 含有ダルべッコ改良イーグル培地（バイオウイタカ一社製、 1 2— 9 1 7 F) に RAW2 64. 7細胞（AT CC T I B 7 1 ) を 6 x 1 0⁵ c e 1 1 s Zm 1になるように懸濁し、 4 8穴マイクロタイタープレートのゥエルに 5 0 0 1ずつ加えて 5%炭酸ガス存在下、 3 7 で1 2時間若しくは 24時間培養した。各ゥエルに後述する試料の各水溶液を添加して前記規定時間培養した後、一酸化窒素（N 0) が培地中で酸化されることによって生ずる N0₂ - 濃度の測定を行った。試料として用いた、参考例 1— (2) 記載のガゴメ昆布由来フコィダンの I画分、 I I画分、及び I I I画分、参考例 2— (3)記載の式 Vで表される化合物（以下、 7— 1 2SFd— Fと称す）は、最終濃度が、 1、 1 0、 1 00 gZm 1 になるように添加した。また、対照は試料と同量の滅菌蒸留水を添加した。なお、陽性対照としては、リポポリサッカライド（LPS、シグマ社製）を最終濃度が、 1〃 gZm 1になるように添加した。

上記培養後、 1 00〃 1の培地に 1 00〃 1の 4%グリース試薬（シグマ社製、 G 44 1 0) を加え、室温で 1 5分間放置した後、 540 nmにおける吸光度を測定した。上記培地に予め既知の濃度で溶解させた NaN0₂ で作製した検量線から培地中の N0₂ - 濃度を計算した。測定はすべて 3連で行った。

この結果、 7— 1 2SFd— F、ガゴメ昆布由来フコィダンの I画分、 I I画分、及び I I I画分はどれも NO産生誘導を促進し、免疫賦活作用があることが明らかになった。その結果を第 2図〜第 5図に示す。すなわち、第 2図は 7— 1 2SFd-F, 第 3図は I画分、第 4図は I I画分、第 5図は I I I画分を添加して培養した時の培地中の N0₂ - 濃度を示す図である。また第 6図は陽性対照の LPSを添加して培養した時の培地中の N0₂ - 濃度を示す図である。第 2図〜第 6図において横軸は培養条件を、縦軸は NO ₂ — 濃度（ M) を示す。

これらの結果より、ガゴメ昆布由来フコィダンの I画分、 I I画分、 I I I画分、及び 7— 1 2SFd— Fには、 NO産生誘導作用、及び該作用を介した免疫賦活効果があることが明らかになつた。

なお、各参考例に記載のその他のフコィダン及びその分解物も同様の NO産生誘導作用を示した。

また、 N0₂ - 濃度を測定した培養液と同じ培養液中の I FN—ァ量を ELISA キット（Genzyme社）を用いて測定した。し力、し、この系においてはガゴメ昆布由来フコィダンの I画分、 I I画分、 I I I画分、 7— 12SFd— F、及びその他の各参考例に記載のフコィダン及びその分解物に I FN— 7の産生誘導は見られなカヽつた。実施例 2

(1)非刺激リンパ球からの I FN— 7産生誘導作用

ICRマウス（雌、 7週齢、体重約 25 g) は日本 SLCより購入し、 1週間の予備飼育の後、実験に用いた。マウスより脾臓を摘出し、細かく粉砕して 1 0% 牛胎児血清（ハイクローン社）を含んだ RPM I— 1 640培地（ギブコ社）に懸濁して単細胞液を得た。接着性細胞をプラスチックシャーレに接着させて除き、非接着性細胞を脾臓リンパ球として用いた。脾臓リンパ球は 1 0%牛胎児血清を含んだ RPM 1— 1 640培地に懸濁して 2 X 1 0⁶ c e 1 1 s Ίη 1に調整し、 1 80〃 1 ゥヱルで 96穴マイクロタイタープレートに播種した。各試料は蒸留水に溶解して 1 0 OmgZm 1の濃度に調整し、表示量の 1 0倍濃度に培地で希釈した。対照は試料と同量の培地を添加し、該対照群以外の各ゥエルに各濃度（ 1 0〜500 g/m 1 ) の参考例に記載の各フコィダン、ガゴメ昆布フコィダンの I画分、 I I画分、 I I I画分、 7— 123?0— ?または1 00 g/m 1のコンカナバリン A (C 0 n A；ナカライテスク社）溶液を 20 g/ ml添加し 37 、 5%炭酸ガス培養器で 2日間または 4日間培養した。培養後、培養上清を回収し、 I FN - 7量を ELISAキット（Genzyme社）を用いて測定した。

その結果、参考例に記載の各フコィダン、ガゴメ昆布由来フコィダンの I画分、 I I画分、 I I I画分、 7— 12 S F d -Fには 500 gZm 1以下の用量において非刺激リンパ球からの I FN—ァ産生誘導作用は認められなかった。一方、 C 0 n Aを添加した細胞では強レ、 I F N - 7の産生誘導が認められた。

(2) ァロ抗原刺激下における I FN— 7産生誘導作用 BALB/cマウス（雌、 6週齢、体重約 2 0 g) . C57BL/6 マウス（雌、 6週齢、体重約 2 0 g) は日本 SLCより購入し、 1週間の予備飼育の後、実験に用いた。 H- 2 のハプロタイプの異なったマウス（BALB/c； H-2d、 C57BL/6 ； H_2b) より脾臓を摘出し、上記の方法により脾臓リンパ球を得た。各細胞浮遊液の細胞濃度を 2 x l 0⁶ c e l l sZm lに調整し、 1 0 0 1づっを 9 6穴マイクロタイタープレートに播種した。該対照群以外の各ゥヱルに各濃度（ 1 0〜5 0 0 /m 1 ) の参考例に記載の各フコィダン、ガゴメ昆布由来フコィダンの I画分、 I I画分、 I I I画分、 7— 1 2 SF d— Fまたは 1 0〃 gZm 1の C o n Aを実施例 2— ( 1 ) と同様に添加した。また、対照は試料と同量の培地を添加した。これらを 3 7で、 5 %炭酸ガス培養器で 4日間培養した。培養後、培養上清を回収し、 I FN— 7量を ELISAキットを用いて測定した。

その結果、参考例に記載の各フコィダン、ガゴメ昆布由来フコィダンの I画分、 I I画分、 I I I画分、 7— 1 2 SF d-Fには 5 0 0 gZm 1以下の用量においてァロ抗原刺激状態のリンパ球に対する I FN— 7産生誘導作用は認められなかった。一方、 C 0 n Aを添加した細胞では強い I FN— 7の誘導が認められた。

(3) 感作リンパ球の抗原刺激下における I FN— 7産生誘導作用

C57BL/6 マウス（雌、 6週齢、体重約 2 0 g) は日本 SLCより購入し、 1週間の予備飼育の後、実験に用いた。マウスの腹腔内に 1 X 1 0 ^e c e 1 1 sの Me th-Aマウス肉腫細胞を接種して免疫した。腫瘍接種 1 4日後に脾臓を摘出し、上記の方法により脾臓リンパ球を得た。細胞浮遊液の細胞濃度を 2 X 1 0⁶ e e l

1 s/m 1に調整し、 1 0 0 1づっを 9 6穴マイクロタイ夕一プレー卜に播種した。刺激細胞の調製のため、 RPM I - 1 6 4 0培地に懸濁して 2 X 1 0⁶ c e l 1 sZm 1に調整した Meth- Aマウス肉腫細胞にマイトマイシン C (協和発酵社製）を 5 0 g Zm 1の濃度で添加して 3 7てで 3 0分間処理し、 2回洗浄後、 1 0%牛胎児血清を含んだ RPMI - 1 640培地に懸濁して 2x 1 0⁶ c e 1 1 s/m 1に調整した。調製した刺激細胞を 1 00 1 Zゥヱルで脾臓リンパ球を加えたプレートの各ゥエルに重層し、 37°C、 5 %炭酸ガス培養器で 4日間培養した。試料として用いた、ガゴメ昆布由来フコィダンは 1〜 1 00 / gZm 1となるよう、ガゴメ昆布由来フコィダンの I画分、 I I画分、 I I I画分、 7 - 12SFd— Fは各 1 0〜500 s/ \ となるように、また陽性対照には ConAを 1 0〃gZmlとなるように、実施例 2— (1) と同様に調製、添加し培養した。また、対照は試料と同量の培地を添加した。培養後、培養上清を回収し、 I FN—ァ量を ELISAキットを用いて測定した。同培養上清において I L - 12量を ELISAキット（END0GEN社）を用いて測定した。

その結果を第 7図、第 8図に示す。すなわち第 7図はフコィダン及びその分解物の I FN—ァ産生誘導作用を示す図であり、図中縦軸は I FN—ァ産生量（p gZm 1 ) 、横軸は各試料、及び添加量（ gZm 1 ) を示す。

また第 8図はフコィダン及びその分解物の I L一 1 2産生誘導作用を示す図であり、図中縦軸は I L一 12産生量（pg/ml) 、横軸は各試料、及び添加量 ( g/m 1 ) を示す。

第 7図、第 8図に示すように、感作リンパ球の抗原刺激下において、ガゴメ昆布由来フコィダンは 1〜 1 00〃 gZm 1の用量において、 I画分、 I I画分、 I I I画分、及び 7— 1 2SFd— Fは 1 0〜500 gZmlの用量において用量依存的な I FN—ァ、及び I L一 1 2産生の増強作用を示した。またその他の各参考例に記載のフコィダンおよびその分解物も同様の作用を示した。実施例 3

C57BL/6マウス（雌、 7週齢、体重約 20 g) は日本 SLCより購入し、 1週間の予備飼育の後、実験に用いた。マウスより脾臓を摘出し、細かく粉砕して 1 0%牛胎児血清（ハイクローン社）を含んだ RPM 1 - 1 640培地（バイオゥィッタカ一社）に懸濁して単細胞液を得た。脾臓リンパ球は 1 0 %牛胎児血清を含んだ RPM 1 - 1 6 4 0培地に懸濁して 3 1 0⁶ c e 1 1 s /m 1に調整し、 T 2 5フラスコ（イワキ社）に 1 0m l加えた。フラスコは同じものを 2つずつ用意し、一方には培地のみを、他方にはさらにガゴメ昆布由来フコィダンを 1 0 z gZm 1 となるように添加し、 3 7°C、 5 %C0₂ 存在下で培養した。培養開始より 1 0日後に細胞を回収し、所定の濃度になるように 1 0%牛胎児血清を含んだ RPM 1 - 1 6 4 0培地で希釈し、 9 6穴丸底マイクロプレートに 1 0 0 / 1ずつ分注した。

細胞の細胞傷害活性は、 ⁵¹C rでラベルした EL 4胸腺腫瘍細胞（以下、 EL 4細胞という）をターゲットとし、培養上清中に遊離してくる 7線量を測定した。すなわち、 E L 4細胞に Chromium-51 Radionuclide (ニュ一 Tングランドニュ —クリア社） 1 8 5 O kB qを加え 3 7°Cで一時間培養し、遠心操作にて RPM 1 - 1 6 4 0培地で 3回洗浄した。 1 0 %牛胎児血清を含んだ RPM 1 - 1 6 4 0培地に該細胞を懸濁して 1 X 1 0⁵ c e 1 1 s /m 1に調整した。これを上述の 9 6穴丸底マイクロプレートに 1 0 0 1ずつ分注し、 3 7。C、 5 %C0₂ 存在下で 5時間培養し、上清 1 0 0〃 1を採取後、 Ίシンチレーシヨンカウンターにて遊離した 7線量を測定した。細胞傷害活性は次のように算出した。細胞傷害活性 (%)= 〔（実験値 -対照値)/ (総放射活性値 -対照値）〕 X100 ここで、総放射活性値は、培養脾細胞の代わりに 0. 1 %Ίχ i t o n-X 1 0 0 1を用いた場合の 7線量を示す。また、対照値は培養脾細胞の代わりに培地 1 0 0 1を用いた場合の 7線量を、実験値は培養脾細胞を用いた場合の 7 線量を示す。

その結果を第 9図に示す。すなわち第 9図はガゴメ昆布由来フコィダンのマウス脾臓リンパ球の細胞傷害性免疫増強作用を示す図であり、縦軸は細胞傷害活性 (%) 、横軸は対照のエフクタ一細胞、及び参考例 1記載のガゴメ昆布由来フコィダンを 1 0 g/ 1 となるように添加して培養して得られたエフェクター細胞（E) とターゲット細胞（T) との比（EZT r a t i o) を示す。捧グラフは各群 5匹の平均値と標準誤差を示す。

第 9図に示すように、マウスの培養脾細胞（エフェクター細胞）は、 EL 4細胞（ターゲット細胞）に対して細胞傷害活性を示した（対照）。フコィダンを 1 0 zg/m 1 となるように加えて培養した細胞では、 EL 4紬胞に対する細胞傷害活性が増強されており、フコイダン添加群では低いェフクタ一細胞とターゲット細胞との比にも拘らず、高い細胞傷害活性を示し、細胞傷害性免疫がフコィダンにより増強された。

また参考例に記載の他の各フコィダン、その分解物、 I画分、 I I画分、 I I I画分、及び 7— 1 2 SF d— Fも同様の活性を示した。実施例 4

( 1 ) 非刺激リンパ球からの I FN— 7産生誘導作用

C57BL/6 マウス（雌、 6週齢、体重約 2 0 g) は日本 SLCより購入し、 1週間の予備飼育の後、実験に用いた。前記の方法により調製した脾臓リンパ球を播種したプレートの各ゥエルに 1 0〜5 0 0 ug/ 1 となるよう参考例 3— （2 ) で調製した G—フコィダンを添加し、 3 7°C、 5%炭酸ガス培養器で 4日間培養した。培養後、培養上清を回収し、 I FN - 7量をキットを用いて測定した。

その結果、検討した用量において G—フコィダンによる I FN—ァ産生誘導作用は認められなかった。

(2) 感作リンパ球の抗原刺激下における I FN— 7産生誘導作用

C57BL/6 マウス（雌、 6週齢、体重約 2 Og ) は日本 SLCより購入し、 1週間の予備飼育の後、実験に用いた。試料として参考例 3— (2) で調製した G— フコィダンは蒸留水に溶解して 1 0 OmgZm 1に調製し、表示量の 1 0倍濃度に培地で希釈した。前記の方法により調製した脾臓リンパ球、及び Meth- Aマウス肉腫細胞を播種したプレー卜の各ゥエルに最終濃度が 1 0〜5 0 0 ng/m 1となるよう調製した G—フコィダンを添加して 3 7°C、 5 %炭酸ガス培養器で 4日間培養した。なお、対照は試料と同量の培地を添加し、培養した。培養後、培養上清を回収し、 I FN - 7量、及び I L一 1 2量を ELISA キットを用いて測定した。

その結果を第 1 0図、第 1 1図に示す。すなわち第 1 0図は G—フコィダンの I FN - 7産生誘導作用を示す図であり、図中縦軸は I FN - 7産生量（ P gZ m l ) 、横軸は試料、及び添加量（zz gZm l ) を示す。また、第 1 1図は G— フコィダンの I L一 1 2産生誘導作用を示す図であり、図中縦軸は I L一 1 2産生量（ P g/m 1 ) 、横軸は試料、及び添加量（ g/m 1 ) を示す。第 1 0図、第 1 1図に示すように、感作リンパ球の抗原刺激下において、 G—フコィダンは 1 0〜5 0 0 g/m 1の用量において用量依存的な I FN— < 産生の増強作用が認められた。 I L一 1 2についても 5 0 0 β g/m 1の用量において顕著な産生増強作用が認められた。実施例 5

ガゴメ昆布由来フコィダンの I FN— 7産生誘導作用に対する抗 I L一 1 2抗体及び抗副刺激レセプター（CD 2 8、 CD 4 0) 抗体の作用

前記の方法により調製した C57BL/6 マウス由来脾臓リンパ球及び Meth- Aマウス肉腫細胞を混合して 9 6穴マイクロ夕イタ一プレートに播種し、全てのゥエルに終濃度 100 t gZmlの参考例 1一（ 1 ) で調製したガゴメ昆布由来フコィダンを添加した。さらに対照以外のゥエルに終濃度 1 gZm 1の抗 I L一 1 2抗体 (R &D社）、又は終濃度 10 gZm 1の抗 CD 2 8抗体、若しくは抗 CD 4 0 抗体を添加して 3 7°C、 5 %炭酸ガス培養器で 4日間培養した。培養後、培養上清を回収し、 I FN— 7量、及び I L一 1 2量を ELISA により測定した。その結果を第 1 2図に示す。すなわち第 1 2図はフコィダンの I FN— 7又は I L— 1 2産生誘導作用に対する各種抗体の作用を示す図であり、図中左縦軸は I FN - 7産生量（ P g/m 1 ) 、右縦軸は I L— 1 2產生量（ p g/m 1 ) 、横軸は用いた各抗体を示す。

第 1 2図に示すように、抗原提示反応時のガゴメ昆布由来フコィダンによる I L— 1 2の産生誘導は抗 I L一 1 2抗体、抗 CD 2 8抗体、又は抗 CD 4 0抗体により完全に抑制された。一方、感作リンパ球からの I FN—ァ産生誘導は抗 I L- 1 2抗体により約 5 0%が抑制され、抗 CD 2 8抗体、又は抗 CD 4 0抗体により完全に抑制された。実施例 6

各種フコィダンの I FN— 7産生誘導作用の比較

C57BL/6 マウスに Meth-Aマウス肉腫細胞を接種して免疫し、接種から 24日後に脾臓を摘出した。前記の方法により調製した C57BL/6 マウス由来脾臓リンパ球、及び Meth-Aマゥス肉腫細胞を混合して 9 6穴マイクロタイタープレートに播種した。試料として、参考例 1で調製したガゴメ昆布由来フコィダン、参考例 8で調製したォキナヮモズク由来フコィダン、参考例 5で調製したヒバマ夕由来フコィダン、及び参考例 4で調製したワカメメカブ由来フコィダンを用い、各フコィダンの最終濃度が 1 0〜5 0 0 s 1 となるように実施例 2— ( 1 ) と同様に調製し、添加して 3 7°C、 5 %炭酸ガス培養器で 4日間培養した。なお、対照は試料と同量の培地を添加し、培養した。培養後、培養上清を回収し、 I FN— 7量を ELISA キットを用いて測定した。

その結果を第 1 3図に示す。すなわち第 1 3図は各フコィダンの I FN— 7産生誘導作用を示す図であり、図中縦軸は I FN— 7産生量（ p gZm l ) 、横軸は各試料、及び添加量（ gZm 1 ) を示す。

第 1 3図に示すように、感作リンパ球の抗原刺激下における I FN— γ産生誘導能に関して、カゴメ昆布とヒバマ夕由来フコィダンは同等、ォキナヮモズク、ワカメメカブはそれに比べ弱い I FN— γ産生誘導作用が認められた。実施例 7

1群 4または 5匹の 5週令のウィスター系雄性ラット（日本 SLC社）に、卵白アルブミン（シグマ社）の 0. 0 1 %生理食塩水溶液 1 0 及びァラム（商品名ィムジヱクトァラム（Imject Alum ) ；ピアス社製） 1 00 1 を腹腔内投与して感作し、その 1 4日後に腹大静脈より血液を採取した。

採取した血液は遠心分離（2000rpm, 5分）後、血漿を分離し、ラットを用いた受身皮膚アナフィラキシー（PCA)反応で抗原特異的 I gE量を測定した。すなわち血漿の倍々希釈系列を 2倍から 64倍まで、生理食塩水を用いて作製し、毛刈りした 7週令のウイス夕一系雄性ラットの背部の皮内に 0. 1mlずつ注射した。皮内注射の 48時間後、 0. 05 %卵白アルブミン及び 0. 5%エバンスブルー（ナカライテスク社製）の混液 lmlを尾静脈より注射した。尾静脈注射 30分後、ラットを断頭、放血死させ、背部に現れた青色スポットを観察し、直径 5mm以上のスポットを陽性とし、最高希釈倍数を I gE力価として表した。参考例 1— (1) で調製したガゴメ昆布由来フコィダンの投与群は抗原感作日 7日前から採血日まで 0. 1 %または 1 %のガゴメ昆布由来フコィダンを給水瓶に入れ、自由摂取させた。また対照群では水道水を同様に与えた。その結果、卵白アルブミン感作による抗原特異的 I gE量の上昇は 1 %ガゴメ昆布由来フコィダンの飲水摂取により著明に抑制された。その結果を表 1に示す。表 1 動物 N o, I gE抗体力価対照 1 8

2 64

3 1 6

4 1 6

5 32 ガゴメ昆布由来 1 8

フコィダン 0. 1 % 2 32

3 32

4 32 ガゴメ昆布由来 1 < 2

フコィダン 1 % 2 < 2

3 < 2

4 4

5 8

実施例 8

実施例 7と同様の方法により感作したラットに、初回感作から 1 9日後に同条件で追加免疫し、最終免疫から 1 4日後に腹大静脈より血液を採取した。採取した血液は前記同様 PC A反応で抗原特異的 I gE量を測定した。

参考例 1一（ 1 ) で調製したガゴメ昆布由来フコィダンの投与群は追加免疫日から採血日まで 0. 1 %または 1 %のガゴメ昆布由来フコィダンを給水瓶に入れ、自由摂取させた。また対照群では水道水を同様に与えた。その結果、卵白アルブミンによる抗原特異的 I g E量の上昇は 1 %ガゴメ昆布由来フコィダンの飲水摂取により著明に抑制された。このことより、フコィダンは予防的投与に加え、抗原感作時からの治療的投与においても有効であることが示された。その結果を表 2に示す。表 2 動物 N 0 I g E抗体力価対照 1 8

2 3 2

3 3 2

4 3 2

5 3 2 ガゴメ昆布由来 1 1 6

フコィダン 0 . 1 % 2 1 6

3 3 2

4 3 2 ガゴメ昆布由来 1 2

フコィダン 1 % 2 2

3 2

4 4

5 2 実施例 9

( 1 ) 1. 5 g中に、フコィダンとしてガゴメ昆布由来フコィダン 2 Omg、ポリフエノールとして市販のリンゴ抽出物（商品名：アップルフヱノン、ニツカゥヰスキー（株）製）、ブドウ種子抽出物（商品名：グラヴイノール、キッコ一マン（株）製）、甜茶抽出物（商品名：サンテンチヤ S、サントリー（株）製）の合計 82mg. 残余がビーフエキス（大日本製薬（株）製）、ビール酵母（キリンビール（株）製）、乳糖、コーンスターチ（加藤化学（株）製）、還元麦芽糖

(東和化成工業（株）製）となるように原料を配合し、本発明の飼料添加物（ 1 mm径）を押し出し造粒機を用い製造し、一包 1. 5 gとした。

(2) 大型犬（体重：約 3 O kg) の場合は 1 日 3包、中型犬（体重：約 1 O k g) の場合は 1日 2包、小型犬（体重： 5 kg) には 1日 1包各々の飼料に上記飼料添加剤を栄養補助食として添加した。

本発明の飼料添加剤の摂取により、大型犬、中型犬、小型犬共に活動が活発となり、食欲も増進した。また体調の改善効果により、毛並みが改善され、体臭、糞尿の臭いは軽減した。これらの効果は特に老犬において顕著に見られ、老犬の体調改善、健康回復、若返りに本発明の飼料は極めて有用であった。寄託された生物材料

( 1) 寄託機関の名称

通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所

日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号（郵便番号 305 - 8 5 6 6 )

(2) 寄託された微生物

( i ) アルテロモナス（Alteromonas) s p. SN- 1 0 0 9

原寄託日：平成 8年 2月 1 3曰

国際寄託への移管請求日：平成 8年 1 1月 1 5曰受託番号： FERM BP - 5747

(ii) フラボパクテリゥム（Flavobacterium) s p. S A- 0082 原寄託日：平成 7年 3月 29日

国際寄託への移管請求日：平成 8年 2月 1 5日

受託番号： FERM BP - 5402 産業上の利用可能性

本発明によりサイト力イン類産生調節作用、一酸化窒素産生誘導作用、及び抗アレルギー作用を示すフコィダン及び Z又はその分解物を有効成分として含有するサイトカイン類産生調節を要する疾患、一酸化窒素産生を要する疾患及びァレルギー性疾患に有効な医薬が提供される。該医薬は、生体内におけるインター口ィキン類、インターフロン類等の産生調節活性を有し、癌、免疫性疾患等のサィトカイン類の産生調節を必要とする疾患の治療剤又は予防剤として有用であるまた特に I FN - 7産生調節剤、 I L一 2産生調節剤、 NO産生誘導剤としてこれらの薬剤の適用を要する疾患の治療剤として有用である。

不必要な状態での免疫系の活性化あるいは増強は、アレルギー、自己免疫疾患等の疾病を惹起する場合があるが、本発明の製剤によるサイト力イン類増強、免疫増強は選択的なものであり、ウィルス感染、あるいは癌等、体内に排除すべき抗原が存在し、細胞性免疫の増強が必要なときのみに起こることにより、本発明の製剤は生体防御に極めて有用である。

また本発明の製剤により過剰な体液性免疫の活性化が抑制され、本発明の製剤はアレルギーの抑制にも極めて有用である。

更に、サイト力イン類産生調節作用、一酸化窒素産生誘導作用及び抗アレルギ —作用を有するフコィダン及び/ "又はその分解物を用いて飲食品又は飼料を製造することが可能になり、日常の飲食品として摂取することにより、サイト力イン類の産生調節を要する疾患、一酸化窒素産生を要する疾患、例えば動脈硬化症、ァレルギー性疾患等の症伏改善等が可能となる。

従って、フコィダン及び又はその分解物を有効成分とする機能性飲食品又は飼料は、これらの生理作用により、生体の恒常性の維持に有用な機能性飲食品又は飼料である。

またサイトカイン類の産生調節剤も提供され、当該調節剤はサイトカイン類の機能研究、サイトカイン類が関連する疾病用医薬のスクリーニングに有用である

4 Θ

Claims

請求の範囲

1 . フコィダン及び Z又はその分解物を有効成分として含有することを特徴とするサイトカイン類産生調節を要する疾患、一酸化窒素産生を要する疾患、又はアレルギー性疾患の治療剤又は予防剤。

2 . フコィダンが藻類由来又は棘皮動物由来である請求項 1記載の治療剤又は予防剤。

3 . サイトカイン類がインターロイキン類又はィンターフェロン類である請求項 1又は 2記載の治療剤又は予防剤。

4 . インターフヱロン類がィンターフヱロン— 7である請求項 3記載の治療剤又は予防剤。

5 . インターロイキン類がインターロイキン— 1 2である請求項 3記載の治療剤又は予防剤。

6 . アレルギー性疾患が I g E産生抑制を要する疾患である請求項 1又は 2記載の治療剤又は予防剤。

7 . 経口用治療剤又は経口用予防剤である請求項 1〜 6いずれか記載の治療剤又は予防剤。

8 . フコィダン及び Z又はその分解物を含有してなるサイトカイン類産生調節用、一酸化窒素産生誘導用、又は抗アレルギー用の食品、飲料又は飼料である、サイトカイン類産生調節用食品、飲料又は飼料、一酸化窒素産生誘導用食品、飲料又は飼料、或いは抗アレルギー用食品、飲料又は飼料。

9 . フコィダンが藻類由来又は棘皮動物由来である請求項 8記載の食品、飲料又は飼料。

1 0 . サイトカイン類がインタ一ロイキン類又はインターフェロン類である請求項 8又は 9記載の食品、飲料又は飼料。

1 1 . イン夕一フヱロン類がインターフヱロン一ァである請求項 1 0記載の食品、飲料又は飼料。

1 2 . インタ一ロイキン類がインターロイキン一 1 2である請求項 1 0記載の食品、飲料又は飼料。

1 3 . 抗アレルギー用食品、飲料又は飼料が I g E産生抑制用食品、飲料又は飼料である請求項 8又は 9記載の食品、飲料又は飼料。

1 4 . サイトカイン類産生調節を要する疾患、一酸化窒素産生を要する疾患、又はアレルギー性疾患を治療又は予防するためのフコィダン及びノ又はその分解物の使用。

1 5 . サイトカイン類産生調節を要する疾患、一酸化窒素産生を要する疾患、又はァレルギー性疾患の治療剤又は予防剤の製造のためのフコィダン及び Z又はその分解物の使用。

1 6. フコィダン及び Z又はその分解物を用いるサイトカイン類産生調節を要する疾患、一酸化窒素産生を要する疾患、又はアレルギー性疾患の治療又は予防力法。

1 7. フコィダン及び又はその分解物を有効成分として含有するサイトカイン類産生調節剤、一酸化窒素産生誘導剤、抗アレルギー剤、又は I gE産生抑制剤。

1 8. サイトカイン類産生調節剤、一酸化窒素産生誘導剤、抗アレルギー剤、又は I gE産生抑制剤の製造のためのフコィダン及び Z又はその分解物の使用。

1 9. サイトカイン類産生調節用食品、飲料又は飼料、一酸化窒素産生誘導用食品、飲料又は飼料、或いは抗アレルギー用食品、飲料又は飼料の製造のためのフコィダン及び Z又はその分解物の使用。

20. フコィダン及び Z又はその分解物を有効成分として使用するサイトカイン類産生調節方法、一酸化窒素産生誘導方法、アレルギー抑制方法、又は I gE 産生抑制方法。

21. サイトカイン類産生調節、一酸化窒素産生誘導、アレルギー抑制又は I gE産生抑制のためのフコィダン及び Z又はその分解物の使用。