WO2024176823A1

WO2024176823A1 - 樹状細胞活性化剤

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Publication number: WO2024176823A1
Application number: PCT/JP2024/004033
Authority: WO
Inventors: 宏文立花; 裕子田中; 玲乃冨岡
Original assignee: Mitsui Norin Co Ltd; Kyushu University NUC
Current assignee: Mitsui Norin Co Ltd; Kyushu University NUC
Priority date: 2023-02-24
Filing date: 2024-02-07
Publication date: 2024-08-29
Anticipated expiration: 2025-08-24
Also published as: CN120659604A; JPWO2024176823A1

Abstract

長年食されて安全性が経験的に確認されている天然物由来の成分を有効成分とし、がん又は感染症に対する効果的な獲得免疫応答を生じさせるか又は促進させるための樹状細胞活性化剤を提供する。　式（Ｉ）で表される５－（３，５－ジヒドロキシフェニル）－γ－バレロラクトンを有効成分とする樹状細胞活性化剤、及び式（Ｉ）で表される化合物を有効成分として含有する医薬品、サプリメント又は飲食品。［波線の立体配置はＲ配置、Ｓ配置のどちらであってもよい。］

Description

樹状細胞活性化剤

　本発明は、式（Ｉ）で表される５－（３，５－ジヒドロキシフェニル）－γ－バレロラクトン（以下、ＥＧＣ－Ｍ５とも表現する）を有効成分とする、樹状細胞活性化剤に関する。また、免疫機能を向上させ、がんやウイルス性疾患を含む疾病の予防／または治療を目指すことを目的とし、前記樹状細胞活性化剤を用いた医薬品、サプリメント又は飲食品に関するものである。

　自然免疫や獲得免疫の免疫調整機能は、複合的に体内で発揮されて日常の健康維持に重要な役割を果たしている。このため、免疫機能の賦活化は、疾病の治療および予防ならびに健康増進に特に重要と認識されている。体内の免疫賦活化を促進する物質については、これまで様々な免疫賦活物質が見出されている。しかし、副作用についてすでに多くのものが知られており、発現頻度の高いものや重篤なものもあることから、治療を行う際の課題となっている。このため、健常者が疾病予防を目的に摂取する場合には、副作用のリスクが低く、日常的に摂取可能な天然物由来の免疫賦活物質が好ましく、食品成分での免疫賦活の探求が行われている。
　これまで植物ポリフェノールの一種であるカテキンについて幅広い健康機能が報告されている。また、カテキン類の腸内細菌代謝産物である数種類の化合物に関して機能性の評価が行われ、報告されている。

　生体防御機構である免疫機能は、外部から侵入する細菌やウイルス等の病原体や生体内で発生した腫瘍細胞を抗原として認識し、排除する役割を担っている。自然免疫系は先天的に備わっている免疫系であるのに対し、獲得免疫系は後天的に外来抗原の刺激に応じて形成される。
　体内に抗原（病原体や腫瘍）が侵入・発生すると、先ず自然免疫系を担うマクロファージ、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞が抗原排除に向けて作動する。続いて、樹状細胞は捕捉した抗原情報をＴ細胞やＢ細胞に提示することで、抗原を特異的に攻撃するキラーＴ細胞（ＣＤ８^＋Ｔ細胞）や抗体産生を誘導して獲得免疫系が活性化する。

　樹状細胞（ＤＣ）は、自然免疫系と獲得免疫系の橋渡しを行う重要な役割を担っており、骨髄の造血幹細胞からＤＣ前駆細胞（Ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ－ｄｅｒｉｖｅｄ　ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ　ｃｅｌｌ：ＢＭＤＣ）を経たのち、形質細胞様ＤＣ（ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ　ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ　ｃｅｌｌ：ｐＤＣ）への分化（図６の矢印Ｂ）、または標準型ＤＣ（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ　ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ　ｃｅｌｌ：　ｃＤＣ）への分化（図６の矢印Ａ）によりＤＣは発現する。

　形質細胞様ＤＣ（ｐＤＣ）は抗原提示能力が弱いものの、ウイルス感染に応答して大量のＩ型インターフェロン－αおよびβ（ＩＦＮ－α、β）を分泌する作用を有する。また、ナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞（以下ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞と表記）からのＩＬ－１０産生型Ｔ細胞や制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）への分化を誘導することにより、過剰な免疫応答を抑制する役割を担い、自己免疫疾患や炎症性疾患、アレルギー反応などの惹起を抑制する。このため、ｐＤＣの増殖誘導によるウイルス感染予防または治療剤としてラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）に属する乳酸菌又は培養物（特許文献１）や、ＤＣの免疫調節性サイトカインの産生能を高めるラクトバチルス　ケフィリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｋｅｆｉｒｉ）の乳発酵物又はその処理物（特許文献２）は安全性が高く、有用であることが報告されている。しかしながら、ｐＤＣを介した獲得免疫機能の強化は、ｐＤＣによる制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の誘導や免疫調節性サイトカインＩＬ－１０の産生促進によって過剰な免疫応答（炎症）を抑制し副次的な組織傷害を防ぐことができる一方で、抗原に対する細胞傷害活性を低下させる原因となる。また、ｐＤＣは多発性骨髄腫患者の骨髄に集積して、免疫抑制および腫瘍促進を誘導すること（非特許文献１）、Ｔｒｅｇ細胞を増殖・活性化することで免疫抑制を亢進させるため、一部の癌種において予後不良との関連が報告されていること（非特許文献２）から、ｐＤＣのみを対象とした獲得免疫系の強化は腫瘍の排除効率を低下させ、腫瘍の増殖促進に寄与してしまう弊害を伴う可能性がある。

　一方、標準型ＤＣ（ｃＤＣ）は活性化した後、リンパ系組織（脾臓、リンパ節、骨髄など）や非リンパ系組織（肺、皮膚）に分布し、ｃＤＣ１はＭＨＣクラスＩ受容体を介した交差提示経路によるＣＤ８^＋Ｔ細胞（図７ではＣＤ８Ｔと表記する）に対する細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）への誘導作用（図７の矢印ａ）、ＩＬ－１２分泌によるＴｈ１細胞への分化促進（図７の矢印ｂ）、ならびにナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）やナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）を活性化する作用を有する。ｃＤＣ２はＭＨＣクラスＩＩ受容体を介した抗原提示によるＣＤ４^＋Ｔ細胞（ヘルパーＴ細胞；図７ではＣＤ４Ｔと表記する。）の活性化作用を有しており（図７の矢印ｃ）、抗原提示する場のサイトカイン環境に応じてＴｈ１細胞やＴｈ２細胞等への分化を促進する。ＩＬ－１２存在下においてＣＤ４^＋Ｔ細胞が抗原提示を受けた場合は、Ｔｈ１細胞への分化が促進される。また、Ｔｈ１細胞はＩＦＮ－γを分泌し、ＩＦＮ－γは細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の細胞傷害活性を増強する（図７の矢印ｄ）。したがって、造血幹細胞から標準型ＤＣ（ｃＤＣ）への、ｃＤＣの活性化を伴う分化促進（図６の矢印Ａ）による獲得免疫系の強化は、腫瘍細胞だけでなく外部から侵入する宿主細胞寄生性微生物（細菌、真菌、原虫）やウイルス等の抗原に対する効果的な抗原排除、すなわち抗原特異的な細胞傷害活性の獲得に寄与し、疾病リスクの低減および免疫応答機能の増強が期待できる。

特開２０１７－０３１１０９号公報特開２０１７－００７９８３号公報

Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｅｌｌ，２００９，Ｖｏｌ．１６，ｐ．３０９－３２３．Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，２０１２，Ｖｏｌ．７２，ｐ．５２４０－５２４９

　本発明の課題は、長年食されて安全性が経験的に確認されている天然物由来の成分を有効成分とし、がん又は感染症に対する効果的な免疫応答を発動させるか又は促進させるための樹状細胞活性化剤、若しくは樹状細胞を活性化するための医薬品、サプリメント又は飲食品を提供することにある。

　本発明者らはｃＤＣ活性化を伴う、ｃＤＣへの分化を介した獲得免疫系の強化に着目し、喫食実績が豊富で安全性が経験的に確認されている天然物由来の成分についてｃＤＣへの分化およびｃＤＣの活性化作用について鋭意探索を行い、カテキン類の腸内細菌分解物（式（Ｉ））がｃＤＣ１およびｃＤＣ２の両者を活性化する優れた作用を示すことを見出した。また、同成分によるｃＤＣ活性化は、Ｔ細胞への抗原提示の際に細胞性免疫を抑制する反応（Ｔｈ２細胞誘導）を伴わないことから、効率的に獲得免疫系による抗原排除能力（細胞傷害活性）を増強する作用を示すことを見出し、本発明の完成に至った。

　すなわち、本発明は以下を包含するものである。
　［１］　式（Ｉ）で表される５－（３，５－ジヒドロキシフェニル）－γ－バレロラクトンを有効成分として含有することを特徴とする樹状細胞活性化剤。
（式（Ｉ）中、波線の立体配置はＲ配置及びＳ配置のどちらであってもよい）。
［２］　標準型樹状細胞（ｃＤＣ）への分化を促進するために用いられる、［１］に記載の樹状細胞活性化剤。
［３］　標準型樹状細胞（ｃＤＣ）への分化促進が、標準型樹状細胞（ｃＤＣ）の活性化を伴うものである［２］に記載の樹状細胞活性化剤。
［４］　ＣＤ４^＋Ｔ細胞のＴｈ１細胞への分化を促進し、Ｔｈ２細胞への分化を抑制する、［２］に記載の樹状細胞活性化剤。
［５］　ＣＤ８^＋Ｔ細胞の細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）への分化を促進し、細胞傷害活性を増強する、［２］に記載の樹状細胞活性化剤。
［６］　獲得免疫系の増強剤である、［１］乃至［５］に記載の樹状細胞活性化剤。
［７］　獲得免疫系が細胞性免疫である、［６］に記載の樹状細胞活性化剤。
［８］　抗がん剤である、［６］に記載の樹状細胞活性化剤。

　５－（３，５－ジヒドロキシフェニル）－γ－バレロラクトンを有効成分とする樹状細胞活性化剤は、造血幹細胞から標準型ＤＣ（ｃＤＣ）への、ｃＤＣの活性化を伴う分化促進により獲得免疫系を増強することが出来る。また、５－（３，５－ジヒドロキシフェニル）－γ－バレロラクトンを有効成分とする樹状細胞活性化剤は、腫瘍細胞だけでなく外部から侵入する宿主細胞寄生性微生物（細菌、真菌、原虫）やウイルス等の抗原に対する効果的な細胞性免疫による抗原排除、すなわち抗原特異的な細胞傷害活性の獲得に寄与し、疾病リスクの低減および免疫応答機能の増強が期待できる。

図１は、ＥＧＣ－Ｍ５を腹腔内投与したマウスの骨髄細胞における各樹状細胞サブセットの割合を示すグラフである。図２は、マウス骨髄細胞の樹状細胞への分化誘導時にＥＧＣ－Ｍ５を添加した場合の各樹状細胞サブセットの割合を示すグラフ（図２Ａ）、各樹状細胞のマーカー遺伝子発現（図２Ｂ）、ＩＬ－１２遺伝子発現および産生量（図２Ｃ）を示したグラフである。図３は、マウス脾細胞にＥＧＣ－Ｍ５を添加した時のＴｈ１細胞活性化関連遺伝子の発現を示したグラフ（図３Ａ）、Ｔｈ１細胞が分泌するサイトカインであるＩＦＮ－γの産生量を示したグラフである（図３Ｂ）。図４はＥＧＣ－Ｍ５を腹腔内投与した結腸がんモデルマウスの脾細胞におけるＴｈ１細胞活性化関連遺伝子（図４Ａ）、Ｔｈ２細胞活性化関連遺伝子（図４Ｂ）の発現を示したグラフである。図５ＡはＥＧＣ－Ｍ５を腹腔内投与した結腸がんモデルマウスの脾細胞におけるＣＴＬ活性化関連遺伝子の発現を示したグラフである。図５Ｂは腫瘍組織一領域あたりのＣＤ８^＋Ｔ細胞（ＣＴＬ）の数を示したグラフである。図６はＥＧＣ－Ｍ５による骨髄由来前駆樹状細胞（ＢＭＤＣ）に対するｃＤＣへの分化促進作用の予想経路模式図である。図７はｃＤＣによる抗腫瘍作用の予想経路模式図である。

　本発明の樹状細胞活性化剤は、下記式（Ｉ）で表される５－（３，５－ジヒドロキシフェニル）－γ－バレロラクトンを有効成分として含む。５－（３，５－ジヒドロキシフェニル）－γ－バレロラクトンを有効成分として含むことにより、造血幹細胞から標準型ＤＣ（ｃＤＣ）への、ｃＤＣ活性化を伴う分化促進することができる。
（式（Ｉ）中、波線の立体配置はＲ配置及びＳ配置のどちらであってもよい。）

　本発明の樹状細胞活性化剤によるｃＤＣへの分化促進を介した獲得免疫系の強化について、図６，７を用いて説明する。
　図６はＥＧＣ－Ｍ５による骨髄由来前駆樹状細胞（ＢＭＤＣ）に対するｃＤＣへの分化促進作用の予想経路模式図である。骨髄由来前駆樹状細胞（ＢＭＤＣ）は標準型ＤＣ（ｃＤＣ）に分化（図６の矢印Ａ）、又は形質細胞様ＤＣ（ｐＤＣ）に分化（図６の矢印Ｂ）する。本発明の樹状細胞活性化剤の有効成分であるＥＧＣ－Ｍ５は、骨髄由来前駆樹状細胞（ＢＭＤＣ）に作用し、分化したＤＣに占める標準型ＤＣ（ｃＤＣ）の割合を増加させる、すなわちｃＤＣへの分化を促進する。
　図７はｃＤＣによる抗腫瘍作用の予想経路模式図である。分化形成された直後のｃＤＣは外来異物と遭遇したことがなく、抗原提示分子のＭＨＣクラスＩＩ分子や補助シグナル分子の発現レベルが低いが、抗原を取り込むことによりナイーブＴ細胞（図７のＣＤ８Ｔ及びＣＤ４Ｔ）に抗原提示する成熟ｃＤＣに変化する、すなわち活性化する。本発明の樹状細胞活性化剤の有効成分であるＥＧＣ－Ｍ５はｃＤＣの抗原の取り込み、プロセシング、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩを介した抗原提示を亢進する、すなわちｃＤＣを活性化する。活性化されたｃＤＣはナイーブＴ細胞（まだ一度も抗原に出会ったことのないＴ細胞；図７ではＣＤ８Ｔ、ＣＤ４Ｔに相当）にＭＨＣクラスＩおよびＩＩを介して抗原提示をし、活性化する。ｃＤＣはＭＨＣクラスＩを介して抗原提示をするｃＤＣ１とＭＨＣクラスＩＩを介して抗原提示をするｃＤＣ２の２種類に分類される。ｃＤＣ１はナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞（図７のＣＤ８Ｔ）を活性化し、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）への分化を促進し（図７の矢印ａ）、ＩＬ－１２分泌によりナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞（図７のＣＤ４Ｔ）からＴｈ１細胞への分化を促進（図７の矢印ｂ）する。ｃＤＣ２はナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞（図７のＣＤ４Ｔ）を活性化し（図７の矢印ｃ）、ＩＬ－１２存在下ではＴｈ１細胞への分化を促進する。ｃＤＣ１のＩＬ－１２分泌とｃＤＣ２のＭＨＣクラスＩＩを介した抗原提示により、ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞（図７のＣＤ４Ｔ）から分化したＴｈ１細胞はＩＦＮ－γを分泌する。ＩＦＮ－γはナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞からＴｈ１細胞への分化をさらに促進し、細胞性免疫を抑制する働きのあるＴｈ２細胞への分化を抑える（図７の矢印ｅ）。また、Ｔｈ１細胞によって分泌されたＩＦＮ－γは、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の細胞傷害活性を増強する（図７の矢印ｄ）。したがって、本発明の樹状細胞活性化剤は、ｃＤＣへの分化促進を介して、獲得免疫系を強化する。
　本明細書では、細胞の分化とは、他の細胞との接触や分化誘導因子などの刺激により、異なる細胞へ変化することを指す。
　骨髄内で形成された造血幹細胞は、骨髄系幹細胞とリンパ球幹細胞のいずれかに分化する。骨髄系幹細胞は赤血球、白血球、血小板、顆粒球（好中球、好酸球、好塩基球）、単球マクロファージ、樹状細胞のいずれかに分化し、リンパ系幹細胞は白血球の一種であるリンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）のいずれかに分化する。
　本明細書では、造血幹細胞から標準型樹状細胞（ｃＤＣ）への分化誘導（図６の矢印Ａ）の促進とは、造血幹細胞から骨髄系幹細胞を経て分化した樹状細胞に占める標準型樹状細胞（ｃＤＣ）の割合を増加させることを指す。本発明における「分化の促進」とは、「分化促進」および「分化誘導」と同義である。
　本明細書では、標準型ＤＣ（ｃＤＣ）の活性化とは、分化形成された直後の未熟ｃＤＣ（外来異物と遭遇したことがなく、ＭＨＣクラスＩＩ分子などの補助シグナル分子の発現レベルが低い状態）が、成熟ｃＤＣに変化することを指す。成熟ｃＤＣに変化することで、ｃＤＣはウイルスや腫瘍由来の抗原ペプチドを提示したＭＨＣクラスＩＩを大量に発現するようになるとともに、補助シグナル分子の発現上昇、リンパ節へのＴ細胞領域への移動し、ナイーブＴ細胞への抗原を提示できる機能を発現する。
　本明細書では、細胞性免疫とはＴ細胞性免疫と同義であり、Ｔ細胞が直接的に働くことによって機能するものであり、抗体の働きによって誘導される免疫（体液性免疫）とは異なる。細胞性免疫は宿主細胞内に寄生した微生物（細菌、真菌、原虫）、ウイルス感染細胞、がん細胞などの異常細胞を直接攻撃する免疫反応を指す。

　樹状細胞活性化剤は、５－（３，５－ジヒドロキシフェニル）－γ－バレロラクトンを有効成分として含む樹状細胞活性化剤（以下、単に「樹状細胞活性化剤」ともいう）であれば特に制限されず、かかる樹状細胞活性化剤はどのような形態であってもよく、例えば、水溶液や混濁物や乳化物などの液状形態、ゲル状やペースト状の半固形状形態、粉末や顆粒やカプセル、タブレットなどの固形状形態であってもよい。

　樹状細胞活性化剤は、製剤化のために通常使用され薬学的に許容される賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、防腐剤、等張化剤、安定化剤、分散剤、酸化防止剤、着色剤、香味剤、緩衝剤などの添加物を含んでいてもよい。

　樹状細胞活性化剤の摂取量は、年齢、体重、症状、治療効果、投与方法、処理時間等により異なるが、通常成人一人あたり、１回に有効成分である本件化合物の含量として０．１ｍｇ～１０００ｍｇ、好ましくは１ｍｇ～５００ｍｇの範囲で、１日１回から数回経口又は非経口摂取することができる。

　樹状細胞活性化剤は、医薬品とすることもできる。当該医薬品としては、式（Ｉ）の化合物を有効成分として含有し、標準型ＤＣの活性化を伴って標準型ＤＣ（ｃＤＣ）への分化を促進するための医薬品（以下、単に「医薬品」ともいう）であれば特に制限されず、かかる医薬品としては日本薬局方に収められている医薬品であって、胃がん、大腸がん、肺がん、前立腺がん、乳がん、子宮がん、食道がん、肝臓がん、悪性リンパ腫などのがんや、アトピー性皮膚炎、花粉症などのアレルギーや、関節リウマチ、乾癬性関節炎などの自己免疫疾患や、白血病などの血液疾患や、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎などのウイルス性肝炎などの免疫機能の障害に起因する疾患を治療又は予防するための医薬品を挙げることができるが、がんを治療又は予防するための医薬品、すなわち抗がん剤であることが好ましい。その他、外部から侵入する宿主細胞寄生性微生物（細菌、真菌、原虫）やウイルス等の抗原に対しても細胞性免疫が有効に働くため、これらに対しての治療薬や予防薬も好ましい。例えば、インフルエンザやヘルペスなどの全てのウイルス、細胞内寄生細菌（結核菌、チフス菌、梅毒トレポネーマ、サルモネラやマイクコプラズマ、クラミジア、レジオネラ菌など）、細胞内寄生真菌（カンジダ、クリプトコッカス、アスペルギルス等）、寄生原虫（トキソプラズマ、糞線虫など）による疾病を治療又は予防するための医薬品も好ましい。

　医薬品の製剤形態としては、錠剤、顆粒剤、細粒剤、丸剤、散剤、カプセル剤、トローチ剤、チュアブル剤、液剤（ドリンク剤）、輸液剤などが挙げられる。外用剤の場合は、皮膚表面や粘膜などから体内へ吸収されるものであればどのような形態でもよく、例えばローション剤、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、テープ剤、パッチ剤、エアゾール剤、吸引剤などが挙げられる。

　また、医薬品は、製剤化のために通常使用され薬学的に許容される賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、防腐剤、等張化剤、安定化剤、分散剤、酸化防止剤、着色剤、香味剤、緩衝剤などの添加物を含んでいてもよい。

　医薬品の投与量は、年齢、体重、症状、治療効果、投与方法、処理時間等により異なるが、通常成人一人あたり、１回に有効成分である式（Ｉ）の化合物の含量として０．１ｍｇ～１０００ｍｇ、好ましくは１ｍｇ～５００ｍｇの範囲で、１日１回から数回経口又は非経口投与することができる。

　樹状細胞活性化剤を医薬部外品として用いてもよい。当該医薬部外品としては、厚生労働大臣が指定した医薬部外品であって、吐き気その他の不快感又は口臭若しくは体臭の防止や、あせも、ただれなどの防止や、脱毛の防止、育毛又は除毛を行うための医薬部外品であれば特に限定されず、医薬部外品の製剤形態としては、例えば内服液剤、健康飲料、ビタミン含有保健剤、錠剤、顆粒剤、液剤、ローション剤、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、テープ剤、パッチ剤、エアゾール剤などが挙げられる。

　サプリメントとしては、式（Ｉ）の化合物を有効成分として含有する標準型ＤＣの活性化を伴って標準型ＤＣ（ｃＤＣ）への分化を促進するためのサプリメント（以下、単に「サプリメント」ともいう）であれば特に制限されず、かかるサプリメントはどのような形態であってもよく、例えば、水溶液や混濁物や乳化物などの液状形態、ゲル状やペースト状の半固形状形態、粉末や顆粒やカプセル、タブレットなどの固形状形態であってもよい。

　また、サプリメントは、ロイシン、バリンなどのアミノ酸、亜鉛、カルシウムなどのミネラル、ビタミンＡ、ビタミンＢ１、Ｂ２、Ｂ６、Ｂ１２、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、βカロテン、コエンザイムＱ１０などのビタミンや、通常サプリメントの製剤に使用される賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、防腐剤、等張化剤、安定化剤、分散剤、酸化防止剤、着色剤、香味剤、緩衝剤などの添加物を含んでいてもよい。

　サプリメントの摂取量は、年齢、体重、症状、治療効果、投与方法、処理時間等により異なるが、通常成人一人あたり、１回に有効成分である式（Ｉ）の化合物の含量として０．１ｍｇ～１０００ｍｇ、好ましくは１ｍｇ～５００ｍｇの範囲で、１日１回から数回経口又は非経口摂取することができる。

　本発明の飲食品としては、式（Ｉ）の化合物を有効成分として含有する標準型ＤＣの活性化を伴って標準型ＤＣ（ｃＤＣ）への分化を促進するための飲食品（以下、「本件飲食品」ともいう）であれば特に制限されず、かかる飲食品はどのような形態であってもよく、例えば、水溶液や混濁物や乳化物などの液状形態、ゲル状やペースト状の半固形状形態、粉末や顆粒やカプセル、タブレットなどの固形状形態であってもよい。

　飲食品としては、例えば、即席食品類（即席めん、カップめん、レトルト・調理食品、調理缶詰め、電子レンジ食品、即席味噌汁・吸い物、スープ缶詰め、フリーズドライ食品など）、炭酸飲料、柑橘類（グレープフルーツ、オレンジ、レモンなど）の果汁や果汁飲料や果汁入り清涼飲料、柑橘類の果肉飲料や果粒入り果実飲料、トマト、ピーマン、セロリ、ウリ、ニンジン、ジャガイモ、アスパラガスなどの野菜を含む野菜系飲料、豆乳・豆乳飲料、コーヒー飲料、お茶飲料、粉末飲料、濃縮飲料、スポーツ飲料、栄養飲料、アルコール飲料やタバコなどの嗜好飲料・嗜好品類、マカロニ・スパゲッティ、麺類、ケーキミックス、唐揚げ粉、パン粉、ギョーザの皮などの小麦粉製品、キャラメル・キャンディー、チューイングガム、チョコレート、クッキー・ビスケット、ケーキ・パイ、スナック・クラッカー、和菓子・米菓子・豆菓子、デザート菓子などの菓子類、しょうゆ、みそ、ソース類、トマト加工調味料、みりん類、食酢類、甘味料などの基礎調味料、風味調味料、調理ミックス、カレーの素類、たれ類、ドレッシング類、めんつゆ類、スパイス類などの複合調味料・食品類、バター、マーガリン類、マヨネーズ類、植物油などの油脂類、牛乳・加工乳、乳飲料、ヨーグルト類、乳酸菌飲料、チーズ、アイスクリーム類、調製粉乳類、クリームなどの乳・乳製品、素材冷凍食品、半調理冷凍食品、調理済み冷凍食品などの冷凍食品、水産缶詰め、果実缶詰め・ペースト類、魚肉ハム・ソーセージ、水産練り製品、水産珍味類、水産乾物類、佃煮類などの水産加工品、畜産缶詰め・ペースト類、畜肉缶詰め、果実缶詰め、ジャム・マーマレード類、漬物・煮豆類、農産乾物類、シリアル（穀物加工品）などの農産加工品、ベビーフード、ふりかけ・お茶漬けのりなどの市販食品などが挙げられる。

　なお、上記の樹状細胞活性化剤の特性をいかして、（ａ）５－（３，５－ジヒドロキシフェニル）－γ－バレロラクトンを対象に投与することを特徴とする樹状細胞活性化方法や、（ｂ）５－（３，５－ジヒドロキシフェニル）－γ－バレロラクトンを対象に投与することを特徴とする免疫賦活方法や、（ｃ）樹状細胞活性化剤、医薬品、サプリメント又は飲食品としての５－（３，５－ジヒドロキシフェニル）－γ－バレロラクトンの使用や、（ｄ）樹状細胞活性化剤、医薬品、サプリメント又は飲食品の調製における５－（３，５－ジヒドロキシフェニル）－γ－バレロラクトンの使用を挙げることができる。

　樹状細胞活性化剤、医薬品、サプリメント又は飲食品の有効成分である５－（３，５－ジヒドロキシフェニル）－γ－バレロラクトンは、カテキン代謝物、すなわちヒト、ラット、マウス、ブタなどの哺乳動物の生体内に生息する微生物の作用などにより、カテキン類から生成しうる化合物であることから、当該化合物を用いることにより、安全性に優れた樹状細胞活性化剤、医薬品、サプリメント又は飲食品とすることが可能である。

　式（Ｉ）の化合物を樹状細胞活性化剤、医薬品、サプリメント又は飲食品に含有させるには、精製された式（Ｉ）の化合物を含有させてもよいし、あるいは、粗精製された式（Ｉ）の化合物を含有する組成物を含有させてもよい。

　式（Ｉ）の化合物は、次の文献に示す公知の有機化学合成法（ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ，９，１５１２－１５２０，２０１０）などにより得ることができ、例えば、３，５－（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシロキシ）ブロモベンゼン（３，５－（ｔｅｒｔ－Ｂｕｔｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘｙ）ｂｒｏｍｏｂｅｎｚｅｎｅ）を基質としてスワーン酸化、ウィッティヒ反応を含む７つの反応を用いることで調製することが可能である。

　また、式（Ｉ）の化合物は、腸内微生物を用いた微生物変法により製造することも可能である。微生物変換法によりカテキン代謝物である式（Ｉ）の化合物を製造する場合、ラットやヒトの腸内微生物を含む糞や盲腸内容物を培養して腸内微生物を増殖させた後、培養菌体を緩衝液、生理食塩水、水などに懸濁させ、懸濁液に基質となるカテキン類を加えてインキュベーション処理する方法を挙げることができる。

　基質として加えるカテキン類としては、非ガレート型カテキン類である（＋）－エピガロカテキン、（－）－エピガロカテキン、（－）－ガロカテキンや、ガレート型カテキン類である（－）－ガロカテキンガレート、（－）－エピガロカテキンガレートを挙げることができ、（－）－エピガロカテキンであることが好ましい。

　式（Ｉ）の化合物を得るには、まず微生物変換により、基質となるカテキン類を下記の式（ＩＩ）で表される化合物に変換する必要がある。カテキン類を下記式（ＩＩ）で表される化合物に変換する能力を持つ微生物の好ましい例としては、エガーテラ・レンタ：Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ　ｌｅｎｔａ　ＪＣＭ９９７９株や、アドラークルーツィア・エクオーリファシエンス：Ａｄｌｅｒｃｒｅｕｔｚｉａ　ｅｑｕｏｌｉｆａｃｉｅｎｓ　ＭＴ４ｓ－５株（受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ－２１７３８）及びＪＣＭ１４７９３株、アサッカロバクター・セラツス：Ａｓａｃｃｈａｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｅｌａｔｕｓ　ＪＣＭ１４８１１株、スラッキア・エクオーリファシエンス：Ｓｌａｃｋｉａ　ｅｑｕｏｌｉｆａｃｉｅｎｓ　ＪＣＭ１６０５９株を挙げることができる（Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，３８，３２５－３３０，２０１５参照）。

（式（ＩＩ）のＲ_１及びＲ_２はそれぞれ独立に水酸基（ＯＨ）または水素原子（Ｈ）を表し、波線の立体配置はＲ配置、Ｓ配置のどちらであってもよい。）

　なお、式（Ｉ）で表される化合物を得るには、式（ＩＩ）記載の化合物のうちＲ_１がＨであり、Ｒ_２がＯＨである化合物を得る必要がある。その場合、培地中に水素及び／又は蟻酸を添加する必要がある。また、水素や蟻酸を培地中に添加しない場合は、水素及び／又は蟻酸生成能を有する微生物を共存させることも可能である。このような微生物の例として、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、ブチリシモナス属菌を挙げることができ、大腸菌Ｋ１２株（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｋ１２）、ブチリシモナス・ビローサ（Ｂｕｔｙｒｉｃｉｍｏｎａｓ　ｖｉｒｏｓａ）ＪＣＭ１５１４９、ブチリシモナス・シネルジスティカ（Ｂｕｔｙｒｉｃｉｍｏｎａｓ　ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃａ）ＪＣＭ１５１８４、ブチリシモナス・パラビローサ（Ｂｕｔｙｒｉｃｉｍｏｎａｓ　ｐａｒａｖｉｒｏｓａ）ＪＣＭ１８６７７などであることが好ましい。

　式（ＩＩ）で表される化合物を、式（Ｉ）で表される化合物に変換する能力を有する微生物の好ましい例としては、フラボニフラクター属細菌（旧学名；ユウバクテリウム属細菌及びクロスリジウム属細菌）を挙げることができ、フラボニフラクター・プラウティ：Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ　ｐｌａｕｔｉｉ（旧学名；ユウバクテリウム・プラウティ：Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｌａｕｔｉｉ）ＡＴＣＣ２９８６３株、フラボニフラクター・プラウティ：Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ　ｐｌａｕｔｉｉ（旧学名；ユウバクテリウム・プラウティ：Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｌａｕｔｉｉ）ＭＴ４２株（受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ－２１７６５）及びフラボニフラクター・プラウティ：Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ　ｐｌａｕｔｉｉ（旧学名；クロストリジウム・オルビシンデンス：Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｏｒｂｉｓｃｉｎｄｅｎｓ）ＡＴＣＣ４９５３１株であることが好ましい。

　上記のカテキン類を式（ＩＩ）で表される化合物に変換する能力を持つ微生物と、上記式（ＩＩ）で表される化合物を式（Ｉ）で表される化合物に変換する能力を有する微生物を共存させた培養菌体懸濁液又は培養液に、カテキン類及び／又はカテキン含有物を基質として添加し、嫌気条件下でインキュベーション処理することで上記の本件化合物含有物を容易に得ることができる。インキュベーション処理方法については、上記微生物を培養後、集菌したものを緩衝液や生理食塩水、水などに懸濁させ基質を添加する方法、若しくは上記微生物の培養時あるいは培養開始後一定期間経過後に基質を添加する方法がある。さらに、上記微生物の生育する培養液中に基質を添加し、嫌気条件下でインキュベーション処理することで式（Ｉ）の化合物を容易に得ることもできる。

　上記に示した微生物を培養する場合には、該当微生物が生育できる栄養源含有培地に接種し、嫌気的条件下で培養する。培養菌体を得るための微生物培養及び基質存在下での微生物培養は、一般的な嫌気性微生物の培養方法を採用することができる。また、培養菌体を集菌した後、上記基質の存在下でインキュベーション処理する場合にも、嫌気条件下で行うことが望ましい。培養に用いられる培地としては、上記微生物が生育できる培地であれば特に限定されないが、例えばＧＡＭブイヨン（日水製薬（株）製）などが利用可能である。

　培養条件は、上記微生物が生育しうる範囲内で適宜選択することができる。通常、ｐＨ６．０～７．５、３５～４０℃であり、好ましくはｐＨ６．５～７．３、３７～３９℃である。培養時間は通常２４～１２０時間、好ましくは４８～７２時間である。上述した各種の培養条件は、使用する微生物の種類や特性、外部条件などに応じて適宜変更でき、最適条件を選択することができる。

　微生物変換法によりカテキン代謝物を製造する場合、調製時には数種類のカテキン代謝物を含む抽出物が得られるが、精製を重ねることで高純度のカテキン代謝物を得ることが出来る。有機合成方法と同様に種々の既知精製手段を選択し、組み合わせて行うことで所望する純度が得られる。例えば、酢酸エチル、ジエチルエーテル、ブタノールなどを用いた溶媒抽出、合成樹脂吸着剤の脱吸着を利用する方法、シリカゲルなどのカラムクロマトグラフィーや高速液体クロマトグラフィーを単独あるいは適宜組み合わせて分離・精製し、抽出物中のカテキン代謝物の含有率を調節することが出来る。

　以下に、式（Ｉ）の化合物の製造例、実施例に基づき本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

＜式（Ｉ）の化合物の製造＞
（製造例１：エガーテラ・レンタＪＣＭ９９７９株とフラボニフラクター・プラウティＡＴＣＣ４９５３１株及び大腸菌Ｋ１２株の共存下での（Ｒ）－５－（３，５－ジヒドロキシフェニル）－γ－バレロラクトンの製造）

　エガーテラ・レンタＪＣＭ９９７９株を３０ｍＬのＧＡＭブイヨン（日水製薬（株）製）に植菌し、ｐＨ７．２、３７℃で４８時間嫌気培養し、前培養液１とした。また、大腸菌Ｋ１２株及びユウバクテリウム・プラウティＡＴＣＣ４９５３１株は１０ｍＬのＧＡＭブイヨンを用いてｐＨ７．２、３７℃で２４時間嫌気培養し、前培養液２とした。（－）－エピガロカテキン２９０ｍｇを含む１００ｍＬのＧＡＭブイヨンにＪＣＭ９９７９株の前培養液１を３０ｍＬ、大腸菌Ｋ１２株及びＡＴＣＣ４９５３１株の前培養液２を１０ｍＬ加え、ｐＨ７．２、３７℃で７２時間嫌気培養した。得られた培養液１ｍＬをサンプリングして高速遠心分離（１５０００×ｇ、１０分、４℃）により菌体を除去し、上清液を下記ＬＣ／ＭＳ分析条件で分析することで５－（３，５－ジヒドロキシフェニル）－γ－バレロラクトンと５－（３，５－ジヒドロキシフェニル）－４－ヒドロキシ吉草酸の生成を確認した。ＬＣ／ＭＳ分析条件は下記の通りである。

（ＬＣ／ＭＳ条件）
　・カラム：Ｃａｐｃｅｌｌｐａｋ　Ｃ１８　ＭＧ（２．０ｉ．ｄ．×１００．０ｍｍ、５μｍ、（資生堂社製）
　・流速：０．２ｍＬ／分　　
　・カラム温度：４０℃
　・溶媒
　　溶媒Ａ：水：アセトニトリル：酢酸（１００：２．５：０．１　容量比（ｖ／ｖ／ｖ））
　　溶媒Ｂ：水：アセトニトリル：メタノール：酢酸（３５：２．５：６５：０．１　容量比（ｖ／ｖ／ｖ／ｖ））
　・グラジエント条件：０分　Ａ；１００％　Ｂ；０％、３分　Ａ；１００％　Ｂ；０％、２５分　Ａ；０％　Ｂ；１００％、２５．１分　Ａ；１００％　Ｂ；０％、３３分　Ａ；１００％　Ｂ；０％
　・検出器：ＰＤＡ及び質量分析計
　・インターフェース：ＥＳＩ
　・ポラリティ：ネガティブ

　培養液を高速遠心分離（１００００×ｇ、２０分間、２０℃）し、菌体を除去した。得られた上清に５Ｍ塩酸水を加えてｐＨ２．０に調整し、８０℃で約２時間保持して上清中に含まれる５－（３，５－ジヒドロキシフェニル）－４－ヒドロキシ吉草酸を脱水縮合させ、５－（３，５－ジヒドロキシフェニル）－γ－バレロラクトンに変換した。この反応液を２００ｍＬの酢酸エチルで３回抽出し、酢酸エチル相を合一してエバポレーターで濃縮した。得られた濃縮液を分取ＨＰＬＣに供した。分取ＨＰＬＣ条件は下記のとおりである。

（分取ＨＰＬＣ条件）
　・カラム：Ｃａｐｃｅｌｌｐａｋ　ＭＧ（２０ｉ．ｄ．×１５０ｍｍ、５μｍ、（資生堂社製））
　・流速１５ｍＬ／分
　・溶媒：
　　溶媒Ａ：アセトニトリル：メタノール：水：酢酸（５：５：９０：０．３　容量比（ｖ／ｖ／ｖ））
　　溶媒Ｂ：アセトニトリル：メタノール：水：酢酸（５：６５：３０：０．５　容量比（ｖ／ｖ／ｖ））
　・グラジエント条件：０分　Ａ；８０％　Ｂ；２０％、５分　Ａ；８０％　Ｂ；２０％、２０分　Ａ；１０％　Ｂ；９０％、２５分　Ａ；１％　Ｂ；９０％、２６分　Ａ；８０％　Ｂ；２０％、３５分　Ａ；８０％　Ｂ；２０％、
　・検出器：ＵＶ２７０ｎｍ

　分取後、上記ＬＣ／ＭＳ分析条件で分析を行い、目的とする代謝物の含まれる画分を確認した。その後、分取液をエバポレーターで濃縮乾固し、乾固物に５ｍＬの純水を加えて再度濃縮乾固する操作を３回繰り返して画分中の酢酸を完全除去した。最後に、少量の純水を加えて溶解させた乾固物を凍結乾燥させることで５－（３，５－ジヒドロキシフェニル）－γ－バレロラクトンを４５ｍｇ得た。

＜実施例１　ＥＧＣ－Ｍ５の腹腔内投与が骨髄において形成される樹状細胞の組成に与える影響＞

　（ａ）飼育方法および投与方法
　６週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを予備飼育後、ＥＧＣ－Ｍ５投与群およびＣｏｎｔｒｏｌ群の２群（各群１０匹）に割付けた。ＥＧＣ－Ｍ５投与群は、ＥＧＣ－Ｍ５を１０％ＤＭＳＯ含有ＰＢＳ緩衝液で溶解した試液を、ＥＧＣ－Ｍ５　１０ｍｇ／ｋｇ　ｂ．ｗ．の投与量で毎日腹腔内投与した。Ｃｏｎｔｒｏｌ群は１０％ＤＭＳＯ含有ＰＢＳ緩衝液を毎日腹腔内投与した。１２日間投与を行った後、イソフルラン麻酔下での採血により屠殺し、大腿骨を採取した。

　（ｂ）骨髄細胞の調製
　採取した大腿骨はＲＰＭＩ－１６４０培地（富士フイルム和光純薬）の入った５ｍＬディッシュに入れ、２．５ｍＬシリンジおよび２６Ｇ針を用いて髄液を回収した。メッシュによる濾過で組織片を除去し、５分間遠心後、血球計算盤を用いて細胞数を計測した。

　（ｃ）各樹状細胞の組成分析
　骨髄細胞をフェノールレッド不含ＲＰＭＩ－１６４０培地（富士フイルム和光純薬）にて１．０×１０^７　ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるよう調整し、２％ＰＦＡ（４％パラホルムアルデヒド・りん酸緩衝液（富士フイルム和光純薬）を注射用水で希釈）と等量混合した後、４℃で２０分静置した。５分間遠心後、上清を除去し、５％ＦＢＳ－ＴＰＢＳ（０．２％Ｔｗｅｅｎ－ＰＢＳ（富士フイルム和光純薬））にて再懸濁した。９６ｗｅｌｌＶ底プレートに５０μＬ／ｗｅｌｌで分注し、室温で３０分静置した。表１に示す各抗体を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加し、室温で１時間静置して細胞を蛍光標識した。その後、細胞懸濁液５０μＬおよびＰＢＳ２５０μＬを混合し、フローサイトメトリーにより樹状細胞に占めるｃＤＣ１、ｃＤＣ２およびｐＤＣの割合（％）を測定した。このとき、蛍光強度を基準にＣＤ３陰性かつＣＤ１１ｃ陽性を呈した細胞を「樹状細胞」として選別し、「樹状細胞」のうち、ＣＤ１０３陽性かつＩ－Ａ／Ｉ－Ｅ（ＭＨＣ－ＩＩ）強陽性の細胞を「ｃＤＣ１」、ＣＤ１１ｂ陽性かつＩ－Ａ／Ｉ－Ｅ（＝ＭＨＣ－ＩＩ）強陽性の細胞を「ｃＤＣ２」、Ｂ２２０陽性かつＩ－Ａ／Ｉ－Ｅ（ＭＨＣ－ＩＩ）弱陽性の細胞を「ｐＤＣ」と定義した。

　表１にフローサイトメトリーによる各樹状細胞の測定に用いた抗体（ｃＤＣ１、ｃＤＣ２およびｐＤＣ）を示す。

　（ｄ）統計処理
　得られた測定結果を平均値（Ｍｅａｎ）および標準誤差（Ｓ．Ｅ．）で示し、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ－ｔｅｓｔによりＣｏｎｔｒｏｌ群とＥＧＣ－Ｍ５投与群の有意差を調べた。有意水準は、＊Ｐ　＜　０．０５とした。

　（ｅ）　試験結果
　図１に示すように、マウス骨髄にて形成される樹状細胞は、Ｃｏｎｔｒｏｌ群に比べてＥＧＣ－Ｍ５投与群において標準型樹状細胞（ｃＤＣ１およびｃＤＣ２）の割合が有意に増加し、形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）の割合は変化しないことが示された。
本結果より、ＥＧＣ－Ｍ５の投与は、生体における骨髄内での造血幹細胞から樹状細胞への分化の過程において、標準型樹状細胞（ｃＤＣ１およびｃＤＣ２）への分化を促進させる作用があることが示された。

＜実施例２　ＥＧＣ－Ｍ５による骨髄由来前駆樹状細胞（ＢＭＤＣ）の分化および活性化に与える影響＞

　（ａ）　使用マウスおよび飼育方法
　６週齢雄性のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを予備飼育後、イソフルラン麻酔下での採血により屠殺し、大腿骨を採取した。

　（ｂ）　骨髄細胞の調製
　実施例１の（ｂ）と同様の方法で、大腿骨から骨髄細胞を分離した。

　（ｃ）ＥＧＣ－Ｍ５存在下での　骨髄由来前駆樹状細胞（ＢＭＤＣ）の分化
　前駆樹状細胞（ＢＭＤＣ）を含有する骨髄細胞を、０，１，１０μＭ　ＥＧＣ－Ｍ５含有Ｒ１０（１０％非働化ＦＢＳ，２０ｎｇ／ｍＬ　ＧＭ－ＣＳＦ，５０μＭ　２－メルカプトエタノール含有ＲＰＭＩ）培地にて２．０×１０^５　ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整し、浮遊細胞用１０ｍＬディッシュに播種した。３７℃、５％ＣＯ_２下で７２時間培養後、０，１，１０μＭ　ＥＧＣ－Ｍ５含有Ｒ１０培地を１０ｍＬ添加した。４８時間培養後、培養上清１０ｍＬを回収・遠心し、ペレットを０，１，１０μＭ　ＥＧＣ－Ｍ５含有Ｒ１０培地１０ｍＬで懸濁して元のディッシュに戻した。４８時間培養後、直前と同様の処理を行い、前駆樹状細胞（ＢＭＤＣ）を未熟樹状細胞に分化させた。さらに４８時間培養後、細胞を回収し、０，１，１０μＭ　ＥＧＣ－Ｍ５含有成熟誘導培地（１０％非働化ＦＢＳ，１０ｎｇ／ｍＬ　ＧＭ－ＣＳＦ，５０μＭ　２－メルカプトエタノール，１μｇ／ｍＬ　ＬＰＳ）に再懸濁して接着細胞用１０ｍＬディッシュに播種し、未熟樹状細胞を成熟樹状細胞（活性化ｃＤＣ）に変化させた。２４時間培養後、細胞および培養上清を回収した。

　（ｄ）　各樹状細胞の組成分析
　（ｃ）の操作で得られた細胞を回収し、実施例１の（ｃ）と同様に、フローサイトメトリーにより「樹状細胞」に占める「ｃＤＣ１」、「ｃＤＣ２」、「ｐＤＣ」および「活性化ＤＣ」の割合（％）を測定した。「活性化ＤＣ」は、「樹状細胞」のうちＩ－Ａ／Ｉ－Ｅ（ＭＨＣ－ＩＩ）陽性を呈した細胞とした。「活性化ＤＣ」の測定に使用した抗体は表２の通りである。

　表２にフローサイトメトリーによる活性化ＤＣの測定に用いた抗体（ＭＨＣ－ＩＩ^＋ＤＣ）を示す。

　（ｅ）　ＩＬ－１２産生量、ｃＤＣおよびｐＤＣ遺伝子発現量の分析
　（ｃ）の操作で得られた培養上清におけるＩＬ－１２濃度をＥＬＩＳＡ法にて測定した。測定にはＭｏｕｓｅ　ＩＬ－１２　ｐ７０　ＤｕｏＳｅｔ　ＥＬＩＳＡ　（ＤＹ４１９－０５，Ｒ＆Ｄシステムズ）およびＤｕｏＳｅｔ　Ａｎｃｉｌｌａｒｙ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｋｉｔ　２，５　Ｐｌａｔｅ（ＤＹ００８，Ｒ＆Ｄシステムズ）を使用した。また、（ｃ）の操作で得られた細胞のＲＮＡを抽出し、Ｐｒｉｍｅ　Ｓｃｒｉｐｔ^ＴＭ　ＲＴ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｋｉｔ（タカラバイオ）によりｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡ、各遺伝子検出用ＰＣＲプライマーおよびＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を混合し、リアルタイムＰＣＲ法により各遺伝子発現量を測定した。内部標準としてＡｃｔｂを用いた。各遺伝子のプライマー配列は以下の通りである。

（ｃＤＣ１マーカー）
Ｘｃｒ１：　Ｆｏｒｗａｒｄ　５’－　ＡＣＡＴＧＡＴＡＣＣＣＡＴＧＧＧＧＡＡＧＴ　－３’
　　　　　　Ｒｅｖｅｒｓｅ　５’－　ＧＴＧＣＡＣＧＡＡＧＴＧＴＴＧＣＴＴＴＧ　－３’
Ｃｄ１０３：　Ｆｏｒｗａｒｄ　５’－　ＧＣＣＧＴＧＡＴＣＣＡＧＡＣＴＧＡＧＴＴＴＧＡＴ　－３’
　　　　　　　Ｒｅｖｅｒｓｅ　５’－　ＡＴＧＧＣＴＧＡＧＧＣＧＧＴＣＴＴＡＧＴＧＡＣＴ　－３’
（ｃＤＣ２マーカー）
Ｃｄ１１ｂ：　Ｆｏｒｗａｒｄ　５’－　ＣＣＡＣＴＣＡＴＴＧＴＧＧＧＣＡＧＣＴＣ　－３’
　　　　　　　Ｒｅｖｅｒｓｅ　５’－　ＧＧＧＣＡＧＣＴＴＣＡＴＴＣＡＴＣＡＴＧＴＣ　－３’
（ｐＤＣマーカー）
Ｂｓｔ２：　Ｆｏｒｗａｒｄ　５’－　ＡＣＡＴＧＧＣＧＣＣＣＴＣＴＴＴＣＴＡＴＣＡＣＴ　－３’
　　　　　　Ｒｅｖｅｒｓｅ　５’－　ＴＧＡＣＧＧＣＧＡＡＧＴＡＧＡＴＴＧＴＣＡＧＧＡ　－３’
（サイトカインＩＬ－１２遺伝子）
Ｉｌ－１２ａ：　Ｆｏｒｗａｒｄ　５’－　ＴＣＴＧＧＴＡＣＡＴＣＴＴＣＡＡＧＴＣＣＴＣＡＴＡＧＡ　－３’
　　　　　　　　Ｒｅｖｅｒｓｅ　５’－　ＴＡＣＴＡＧＡＧＡＧＡＣＴＴＣＴＴＣＣＡＣＡＡＣＡＡＧＡＧ　－３’
（内在性コントロール遺伝子）
Ａｃｔｂ：　Ｆｏｒｗａｒｄ　５’－　ＣＡＴＣＣＧＴＡＡＡＧＡＣＣＴＣＴＡＴＧＣＣＡＡ－３’
　　　　　　Ｒｅｖｅｒｓｅ　５’－　ＡＴＧＧＡＧＣＣＡＣＣＧＡＴＣＣＡＣＡ　－３’

　（ｆ）　統計処理
　結果は平均値（Ｍｅａｎ）および標準誤差（Ｓ．Ｅ．）で示し、Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ　ｔｅｓｔにより有意差を調べた。有意水準は＊Ｐ　＜　０．０５、＊＊Ｐ　＜　０．０１とした。

　（ｇ）　試験結果
　（ｄ）による各樹状細胞の組成分析の結果、前駆樹状細胞（ＢＭＤＣ）に対して１０μＭ　ＥＧＣ－Ｍ５処理した群では、Ｃｏｎｔｒｏｌ群と比較して、樹状細胞に占めるｃＤＣ１およびｃＤＣ２の割合が有意に増加したが、ｐＤＣの割合は変化しなかった。一方で、活性化ＤＣ（ＭＨＣ－ＩＩ^＋ＤＣ）の割合は有意に増加した（図２（Ａ））。
　続いて、（ｅ）によるｃＤＣ１、ｃＤＣ２およびｐＤＣマーカーの遺伝子発現量の分析の結果、１０μＭ　ＥＧＣ－Ｍ５処理した群では、Ｃｏｎｔｒｏｌ群と比較してｃＤＣ１マーカー（ＸＣＲ１、ＣＤ１０３）、ｃＤＣ２マーカー（ＣＤ１１ｂ）の遺伝子発現が有意に上昇した。ｐＤＣマーカー（ＢＳＴ２）の遺伝子発現に有意な変動は認められなかった（図２（Ｂ））。
　さらに、（ｅ）によるサイトカインＩＬ－１２遺伝子発現量および産生量分析の結果、１μＭ　ＥＧＣ－Ｍ５処理群において、ＩＬ－１２ａ遺伝子の発現量が増加する傾向が見られ、１０μＭ　ＥＧＣ－Ｍ５処理群ではＩＬ－１２産生量が増加する傾向が認められた（図２（Ｃ））。ＩＬ－１２は活性化ｃＤＣ１が主に分泌するサイトカインであることから、ＩＬ－１２遺伝子発現量および産生量の増加は活性化ｃＤＣ１の増加に因るものであると考えられた。
　以上の結果より、ＥＧＣ－Ｍ５は前駆樹状細胞（ＢＭＤＣ）に直接的に作用することで、標準型樹状細胞（ｃＤＣ１およびｃＤＣ２）への分化を促進するとともに、未熟ｃＤＣを活性化して成熟ｃＤＣに変化させることが示された。

　実施例１および２よりＥＧＣ－Ｍ５の腹腔内投与および骨髄由来前駆樹状細胞への添加は、前駆樹状細胞のｃＤＣ１およびｃＤＣ２分化を促進し、活性化させる可能性が示された。そこで、以降の試験ではｃＤＣ１、ｃＤＣ２によって分化促進および活性化されるＴｈ１細胞および細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）に対して、ＥＧＣ－Ｍ５が与える影響を評価した。

＜実施例３　：ＥＧＣ－Ｍ５によるマウス脾細胞におけるＴｈ１細胞の活性化に与える影響＞

　（ａ）　飼育方法
　６週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを予備飼育後、イソフルラン麻酔下での採血により屠殺し、脾臓を採取した。

　（ｂ）　ＥＧＣ－Ｍ５存在下での脾細胞中のＴ細胞活性化関連遺伝子発現量の分析
　採取した脾臓はＲＰＭＩ－１６４０培地を入れた５ｍＬディッシュに入れ、スライドガラスを用いて組織をすりつぶし、細胞を分散させた。メッシュによる濾過で組織片を除去し、５分間遠心した。上清を除去後、ＢＤ　Ｐｈａｒｍ　Ｌｙｓｅ^ＴＭＬｙｓｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ　（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ）による溶血処理を行った。なお、Ｌｙｓｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒは注射用水（大塚製薬）にて１０倍希釈して使用した。細胞をＲＰＭＩ－１６４０培地で２回洗浄後、血球計算盤を用いて細胞数を計測した。１０％ＦＢＳ－ＲＰＭＩ１６４０培地にて１．０×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、２４ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに播種した。その後、ＥＧＣ－Ｍ５を終濃度０、１、１０μＭとなるよう添加した。３７℃、５％ＣＯ_２下で７２時間培養後、ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてＲＮＡ抽出し、Ｐｒｉｍｅ　Ｓｃｒｉｐｔ^ＴＭ　ＲＴ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｋｉｔ（タカラバイオ）によりｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡを各種プライマーとＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）と混合し、リアルタイムＰＣＲ法によりＴｈ１細胞活性化関連遺伝子の発現を評価した。内部標準としてＡｃｔｂを用いた。
　Ｉｌ－１２ａは主に活性化ｃＤＣ１が産生するサイトカインの遺伝子であり、ＩＬ－１２はナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞に作用してＴｈ１細胞へ分化させる働きがある。Ｔ－ｂｅｔはＩＬ－１２等のサイトカインがナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞上の受容体に結合した際に、シグナル伝達経路が活性化することで発現する転写因子である。Ｔ－ｂｅｔはＩＦＮ－γ遺伝子の発現を増強し、ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞からＴｈ１細胞への分化を促進する。また、ＴＮＦ－αおよびＩＦＮ－γはＴｈ１細胞が分泌するサイトカインであり、ＣＴＬ活性化を誘導することが知られている。
　各遺伝子のプライマー配列は以下の通りである。

（サイトカインＩＬ－１２遺伝子）
Ｉｌ－１２ａ：　Ｆｏｒｗａｒｄ　５’－　ＴＣＴＧＧＴＡＣＡＴＣＴＴＣＡＡＧＴＣＣＴＣＡＴＡＧＡ　－３’
　　　　　　　　Ｒｅｖｅｒｓｅ　５’－　ＴＡＣＴＡＧＡＧＡＧＡＣＴＴＣＴＴＣＣＡＣＡＡＣＡＡＧＡＧ　－３’
（Ｔｈ１細胞分化関連遺伝子）
Ｔ－ｂｅｔ：　Ｆｏｒｗａｒｄ　５’－　ＡＡＣＣＡＧＴＡＴＣＣＴＧＴＴＣＣＣＡＧＣ　－３’
　　　　　　　Ｒｅｖｅｒｓｅ　５’－　ＴＧＴＣＧＣＣＡＣＴＧＧＡＡＧＧＡＴＡＧ　－３’
（サイトカインＴＮＦ－α遺伝子）
Ｔｎｆ－α：　Ｆｏｒｗａｒｄ　５’－　ＧＡＧＧＣＡＣＴＣＣＣＣＣＡＡＡＡＧＡＴ　－３’
　　　　　　　Ｒｅｖｅｒｓｅ　５’－　ＣＧＡＴＣＡＣＣＣＣＧＡＡＧＴＴＣＡＧＴ　－３’
（サイトカインＩＦＮ－γ遺伝子）
Ｉｆｎ－γ：　Ｆｏｒｗａｒｄ　５’－ＧＣＴＴＣＣＴＧＡＧＧＣＴＧＧＡＴＴＣ－３’
　　　　　　　Ｒｅｖｅｒｓｅ　５’－ＧＧＡＴＧＣＡＴＴＣＡＴＧＡＧＴＡＴＴＧＧ－３’
（内在性コントロール遺伝子）
Ａｃｔｂ：　Ｆｏｒｗａｒｄ　５’－　ＣＡＴＣＣＧＴＡＡＡＧＡＣＣＴＣＴＡＴＧＣＣＡＡ－３’
　　　　　　Ｒｅｖｅｒｓｅ　５’－　ＡＴＧＧＡＧＣＣＡＣＣＧＡＴＣＣＡＣＡ　－３’

　（ｃ）　ＩＦＮ－γ産生量の評価
　（ｂ）と同様にして脾臓から脾細胞を分離後、ＰＨＡ　４μｇ／ｍＬ含有１０％ＦＢＳ－ＲＰＭＩ１６４０培地（富士フィルム和光純薬）にて１．０×１０^７　ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整し、９６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに播種した。その後、ＥＧＣ－Ｍ５を終濃度０，１，１０μＭとなるように添加した。３７℃、５％ＣＯ_２下で７２時間培養後、培養上清を回収し、ＩＦＮ－γ産生量をＥＬＩＳＡ法にて測定した。測定には抗体セットのＭｏｕｓｅ　ＩＦＮ－ｇａｍｍａ　ＤｕｏＳｅｔ　ＥＬＩＳＡ（ＤＹ４８５－０５，　Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）および別売りキットのＤｕｏＳｅｔ　Ａｎｃｉｌｌａｒｙ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｋｉｔ　２，５　Ｐｌａｔｅ（ＤＹ００８，Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。

　（ｄ）　統計処理
　結果は平均値（Ｍｅａｎ）および標準誤差（Ｓ．Ｅ．）で示し、Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ　ｔｅｓｔにより有意差を調べた。有意水準は＊Ｐ　＜　０．０５、＊＊Ｐ　＜　０．０１とした。

　（ｅ）　試験結果
　図３に示したように、１０μＭ　ＥＧＣ－Ｍ５処理群はＣｏｎｔｒｏｌ群と比較して、脾細胞におけるＩＬ－１２ａ、Ｔ－ｂｅｔ、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ遺伝子の発現量（図３（Ａ））およびＩＦＮ－γ産生量（図３（Ｂ））が有意に増加した。ＩＬ－１２ａ遺伝子およびＴ－ｂｅｔ遺伝子発現量の増加により、ＥＧＣ－Ｍ５はナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞からＴｈ１細胞への分化を促進することが示された。また、ＴＮＦ－αおよびＩＦＮ－γ遺伝子の発現量の増加により、ＥＧＣ－Ｍ５はＴｈ１細胞が分泌するサイトカインの産生能力を増強したことが示された。さらに、ＩＦＮ－γ産生量の増加により、ＥＧＣ－Ｍ５は細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の細胞傷害活性を増強する作用があることが示された。
　本結果より、ＥＧＣ－Ｍ５は脾細胞におけるナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞からＴｈ１細胞への分化を促進し、Ｔｈ１細胞が分泌するサイトカインの産生能力を増強することで、産生されたＩＦＮ－γが作用する細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の細胞傷害活性を増強させ、細胞性免疫を強化する作用があることが示された。

＜実施例４：結腸がんモデルマウスにおけるＥＧＣ－Ｍ５の腹腔内投与が脾臓中のＴｈ１細胞活性化に与える影響＞

　（ａ）　飼育方法および投与方法
　６週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを予備飼育後、マウス結腸癌細胞株ＭＣ３８細胞１．０×１０^６　ｃｅｌｌｓ／ｍｏｕｓｅとなるように皮下移植した。移植４日後、ＥＧＣ－Ｍ５投与群およびＣｏｎｔｒｏｌ群の２群（各群１０匹）に割付けた。ＥＧＣ－Ｍ５投与群は、ＥＧＣ－Ｍ５　１０　ｍｇ／ｋｇ　ｂ．ｗ．の投与量になるように調製したＥＧＣ－Ｍ５含有１０％ＤＭＳＯ含有ＰＢＳ緩衝液を、毎日２００μＬずつ腹腔内投与した。Ｃｏｎｔｒｏｌ群は１０％ＤＭＳＯ含有ＰＢＳ緩衝液を毎日腹腔内投与した。移植１６日後にイソフルラン麻酔下での採血により屠殺し、脾臓および腫瘍組織を採取した。

　（ｂ）　Ｔ細胞分化に関連するサイトカイン遺伝子発現量の分析
　採取した脾臓を５ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地を入れた５ｍＬディッシュに浸した。次に、脾臓をフロスト付きスライドガラスですりつぶし、７０μｍセルストレーナー（ＦＡＬＣＯＮ）にてろ過した。２，５００ｒｐｍ、５分間の遠心分離後、上清を除去し、１ｍＬのＬｙｓｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ社製）にて懸濁した後、氷上で１分間静置した。ＰＢＳ２ｍＬを加えて反応を停止させ、２，５００ｒｐｍで５分間遠心分離後、上清を除去し、１０ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地で懸濁した。再度２，５００ｒｐｍで５分間遠心分離をし、上清を除去後、ＲＰＭＩ１６４０培地にて懸濁し、細胞数を測定した。また、ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて細胞のＲＮＡを抽出し、Ｐｒｉｍｅ　Ｓｃｒｉｐｔ^ＴＭ　ＲＴ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｋｉｔ（タカラバイオ）によりｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡを各種プライマーとＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）と混合し、リアルタイムＰＣＲ法によりＴｈ１細胞、Ｔｈ２細胞活性化関連遺伝子の発現を評価した。内部標準としてＡｃｔｂを用いた。プライマー配列は以下の通りである。

（サイトカイン遺伝子）
Ｉｌ－１２ａ：　Ｆｏｒｗａｒｄ　５’－　ＴＣＴＧＧＴＡＣＡＴＣＴＴＣＡＡＧＴＣＣＴＣＡＴＡＧＡ　－３’
　　　　　　　　Ｒｅｖｅｒｓｅ　５’－　ＴＡＣＴＡＧＡＧＡＧＡＣＴＴＣＴＴＣＣＡＣＡＡＣＡＡＧＡＧ　－３’
Ｉｌ－１２ｂ：　Ｆｏｒｗａｒｄ　５’－　ＡＡＣＴＴＧＡＧＧＧＡＧＡＡＧＴＡＧＧＡＡＴＧＧ　－３’
　　　　　　　　Ｒｅｖｅｒｓｅ　５’－　ＧＧＡＡＧＣＡＣＧＧＣＡＧＣＡＧＡＡＴＡ　－３’
Ｉｌ－２：　Ｆｏｒｗａｒｄ　５’－　ＣＴＴＣＡＡＧＣＴＣＣＡＣＴＴＣＡＡＧＣＴ　－３’
　　　　　　　　Ｒｅｖｅｒｓｅ　５’－　ＣＣＡＴＣＴＣＣＴＣＡＧＡＡＡＧＴＣＣＡＣＣ　－３’
Ｉｆｎ－γ：　Ｆｏｒｗａｒｄ　５’－ＧＣＴＴＣＣＴＧＡＧＧＣＴＧＧＡＴＴＣ－３’
　　　　　　　　Ｒｅｖｅｒｓｅ　５’－ＧＧＡＴＧＣＡＴＴＣＡＴＧＡＧＴＡＴＴＧＧ－３’
Ｉｌ－４：　Ｆｏｒｗａｒｄ　５’－　ＴＣＣＴＣＡＣＡＧＣＡＡＣＧＡＡＧＡＡＣ　－３’
　　　　　　Ｒｅｖｅｒｓｅ　５’－　ＣＡＡＧＣＡＴＧＧＡＧＴＴＴＴＣＣＣＡＴＧ　－３’
Ｉｌ－５：　Ｆｏｒｗａｒｄ　５’－　ＴＣＡＧＣＴＧＴＧＴＣＴＧＧＧＣＣＡＣＴ　－３’
　　　　　　Ｒｅｖｅｒｓｅ　５’－　ＴＴＡＴＧＡＧＴＡＧＧＧＡＣＡＧＧＡＡＧＣＣＴＣＡ　－３’
Ｉｌ－６：　Ｆｏｒｗａｒｄ　５’－　ＧＧＣＣＴＴＣＣＣＴＡＣＴＴＣＡＣＡＡＧ　－３’
　　　　　　Ｒｅｖｅｒｓｅ　５’－　ＡＴＴＴＣＣＡＣＧＡＴＴＴＣＣＣＡＧＡＧ　－３’
Ｉｌ－１０：　Ｆｏｒｗａｒｄ　５’－　ＧＡＣＣＡＧＡＴＧＧＡＣＡＡＣＡＴＡＣＴＧＡＴＡＡ　－３’
　　　　　　　Ｒｅｖｅｒｓｅ　５’－　ＧＡＣＣＡＧＣＴＧＧＡＣＡＡＣＡＴＡＣＴＧＣＴＡＡ　－３
（内在性コントロール遺伝子）
Ａｃｔｂ：　Ｆｏｒｗａｒｄ　５’－　ＣＡＴＣＣＧＴＡＡＡＧＡＣＣＴＣＴＡＴＧＣＣＡＡ－３’
　　　　　　Ｒｅｖｅｒｓｅ　５’－　ＡＴＧＧＡＧＣＣＡＣＣＧＡＴＣＣＡＣＡ　－３’

　（ｃ）　統計処理
　結果は平均値（Ｍｅａｎ）および標準誤差（Ｓ．Ｅ．）で示し、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ－ｔｅｓｔにより有意差を調べた。有意水準は＊Ｐ　＜　０．０５、＊＊Ｐ　＜　０．０１とした。

　（ｄ）　試験結果
　図４に示したとおり、結腸がんモデルマウスの脾臓において、ＥＧＣ－Ｍ５投与群ではナイーブＣＤ４^＋Ｔ胞からＴｈ１細胞への分化を誘導するＩＬ－１２ａおよびＩＬ－１２ｂ遺伝子の発現量が増加した。また、Ｔｈ１細胞が分泌するサイトカインＩＬ－２およびＩＦＮ－γ遺伝子の発現量も増加した（図４（Ａ））。一方、Ｔｈ１細胞とは相反的な作用をもつＴｈ２細胞が産生するサイトカインＩｌ－４，Ｉｌ－６，およびＩｌ－１０遺伝子の発現量は、ＥＧＣ－Ｍ５投与群で減少した（図４（Ｂ））。
　本結果より、結腸がんモデルマウスにおいてＥＧＣ－Ｍ５の投与は、脾臓におけるナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞からＴｈ１細胞への分化を促進し、Ｔｈ１細胞とは相反的な作用をもつＴｈ２細胞への分化を抑制すること（図７ｅ）が示された。

＜実施例５：結腸がんモデルマウスにおけるＥＧＣ－Ｍ５の腹腔内投与が細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の活性化および腫瘍浸潤に与える影響＞

　（ａ）　ＥＧＣ－Ｍ５がＣＴＬ活性化に与える影響の評価
　実施例４にて採取した脾臓を５　ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地を入れた５ｍＬディッシュに浸した。次に、脾臓をフロスト付きスライドガラスですりつぶし、７０μｍセルストレーナー（ＦＡＬＣＯＮ）にてろ過した。２，５００ｒｐｍ、５分間の遠心分離後、上清を除去し、１ｍＬのＬｙｓｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ　（ＢＤ社製）にて懸濁した後、氷上で１分間静置した。ＰＢＳ２ｍＬを加えて反応を停止させ、２，５００ｒｐｍで５分間遠心分離後、上清を除去し、１０ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地で懸濁した。再度２，５００ｒｐｍで５分間遠心分離をし、上清を除去後、ＲＰＭＩ１６４０培地にて懸濁し、細胞数を測定した。また、ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて細胞のＲＮＡを抽出し、Ｐｒｉｍｅ　Ｓｃｒｉｐｔ^ＴＭ　ＲＴ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｋｉｔ（タカラバイオ）によりｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡを各種プライマーとＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）と混合し、リアルタイムＰＣＲ法によりＣＴＬ活性化関連遺伝子の発現を評価した。内部標準としてＡｃｔｂを用いた。プライマー配列は以下の通りである。

Ｐｅｒｆｏｒｉｎ：　Ｆｏｒｗａｒｄ　５’－　ＧＡＧＡＡＧＡＣＣＴＡＴＣＡＧＧＡＣＣＡ　－３’
　　　　　　　　　　Ｒｅｖｅｒｓｅ　５’－　ＡＧＣＣＴＧＴＧＧＴＡＡＧＣＡＴＧ　－３’
Ｇｒｚｂ：　Ｆｏｒｗａｒｄ　５’－　ＣＣＴＣＣＴＧＣＴＡＣＴＧＣＴＧＡＣ　－３’
　　　　　　Ｒｅｖｅｒｓｅ　５’－　ＧＴＣＡＧＣＡＣＡＡＡＧＴＣＣＴＣＴＣ　－３’
Ａｃｔｂ：　Ｆｏｒｗａｒｄ　５’－　ＣＡＴＣＣＧＴＡＡＡＧＡＣＣＴＣＴＡＴＧＣＣＡＡ－３’
　　　　　　Ｒｅｖｅｒｓｅ　５’－　ＡＴＧＧＡＧＣＣＡＣＣＧＡＴＣＣＡＣＡ　－３’

　（ｂ）　腫瘍組織におけるＣＤ８^＋Ｔ細胞の浸潤の評価
　実施例４にて採取した腫瘍組織を、４％パラホルムアルデヒドにて１週間浸漬した。その後、（株）協同病理にパラフィンブロックおよび組織切片の作製を委託した。レモゾール（富士フイルム和光純薬）を用いて脱パラフィン処理を行った後、イムノセイバー（日新ＥＭ）にて熱処理を行うことで抗原を賦活化した。５％　ＦＢＳ－Ｓｏｄｉｕｍ　ａｚｉｄｅ（０．０１％アジ化ナトリウム－ＰＢＳ　（富士フィルム和光純薬））を用いて室温で１時間処理し、ブロッキングを行った後、ａｎｔｉ－ＣＤ８ａｌｐｈａ抗体（ａｂｃａｍ，×２００）を用いて４℃で一晩処理した。その後、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｏｕｒ４８８　Ｆ（ａｂ’）２　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｏｆ　ｇｏａｔ　ａｎｔｉ－ＩｇＧ（ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ，×５００），Ｈｏｅｃｈｓｔ　３３３４２，ｔｒｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ，ｔｒｉｈｙｄｒａｔｅ（Ｈ３５７０，ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ，×１００００）を用いて４℃で１時間処理することで染色を行った。ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ（ＶＥＣＴＯＲ　ＬＡＢＰＲＡＴＯＲＩＥＳ）およびカバーガラスを用いて組織を封入後、オールインワン蛍光顕微鏡　ＢＺ－Ｘ７００（ＫＥＹＥＮＣＥ）にて観察し、一領域あたりの緑色の蛍光を示した細胞（ＣＤ８^＋Ｔ細胞）の数を目視でカウントした。

　（ｃ）　統計処理
　結果は平均値（Ｍｅａｎ）および標準誤差（Ｓ．Ｅ．）で示し、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ－ｔｅｓｔにより有意差を調べた。有意水準は＊＊Ｐ　＜　０．０１とした。

　（ｅ）　試験結果
　図５（Ａ）に示したとおり、結腸がんモデルマウスへのＥＧＣ－Ｍ５腹腔内投与により、脾細胞において細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）が産生する細胞傷害物質の遺伝子ＰｅｒｆｏｒｉｎおよびＧｒｚｂが発現上昇した。さらに、ＥＧＣ－Ｍ５の投与により、腫瘍におけるＣＤ８^＋Ｔ細胞（ＣＴＬ）の顕著な集積が確認され、一領域あたりのＣＤ８^＋Ｔ細胞の数はＥＧＣ－Ｍ５投与により有意に増加した（図５（Ｂ））。この結果から、ＥＧＣ－Ｍ５はＣＴＬの活性化および腫瘍組織への細胞浸潤促進作用を発揮し、がん細胞に対するＣＴＬの攻撃力を増加（細胞性免疫を強化）させる可能性が示された。

　本件樹状細胞活性剤、本件医薬品、本件サプリメント又は本件飲食品は、獲得免疫応答を発動または促進させる標準型樹状細胞への分化を促進し、標準型樹状細胞を活性化させることから、がんや感染症の予防又は治療分野で有用である。

Claims

　式（Ｉ）で表される５－（３，５－ジヒドロキシフェニル）－γ－バレロラクトンを有効成分として含有することを特徴とする樹状細胞活性化剤。
（式（Ｉ）中、波線の立体配置はＲ配置及びＳ配置のどちらであってもよい。）
　標準型樹状細胞（ｃＤＣ）への分化を促進するために用いられる、請求項１に記載の樹状細胞活性化剤。
　標準型樹状細胞（ｃＤＣ）への分化促進が、標準型樹状細胞（ｃＤＣ）の活性化を伴うものである請求項２に記載の樹状細胞活性化剤。
　ＣＤ４^＋Ｔ細胞のＴｈ１細胞への分化を促進し、Ｔｈ２細胞への分化を抑制する、請求項２に記載の樹状細胞活性化剤。
　ＣＤ８^＋Ｔ細胞の細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）への分化を促進し、細胞傷害活性を増強する、請求項２に記載の樹状細胞活性化剤。
　獲得免疫系の増強剤である、請求項１乃至５に記載の樹状細胞活性化剤。
　獲得免疫系が細胞性免疫である、請求項６に記載の樹状細胞活性化剤。
　抗がん剤である、請求項６に記載の樹状細胞活性化剤。