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WO2001051656A1 - Utilisation de l'exonuclease iii dans des reactions d'amplification par polymerase de fragments d'adn - Google Patents

Utilisation de l'exonuclease iii dans des reactions d'amplification par polymerase de fragments d'adn Download PDF

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WO2001051656A1
WO2001051656A1 PCT/FR2001/000057 FR0100057W WO0151656A1 WO 2001051656 A1 WO2001051656 A1 WO 2001051656A1 FR 0100057 W FR0100057 W FR 0100057W WO 0151656 A1 WO0151656 A1 WO 0151656A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
dna
exonuclease iii
pcr
amplification
polymerase
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/FR2001/000057
Other languages
English (en)
Inventor
Bernard Fromenty
Christine Demeillers
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Original Assignee
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM filed Critical Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Publication of WO2001051656A1 publication Critical patent/WO2001051656A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6846—Common amplification features

Definitions

  • the present invention relates to an improvement of the polymerase amplification methods of DNA fragments.
  • PCR reaction polymerase chain reaction
  • Escherichia coli exonuclease III is best known for catalyzing the progressive elimination of mononucleotides from the 3'OH end of a
  • Double stranded DNA (3 ' ⁇ 5' exonuclease activity) (Richardson et al, 1964).
  • This enzyme also has RNase H, 3'-phosphatase, and AP-endonuclease (AP, for Apurinic and Apyrimidinic) activities, described. in particular in the articles by Kow, 1989 and Shida et al, 1996.
  • any exonuclease III purified from Escherichia coli, (such as for example that supplied by New England Biolabs) can be used ) or a counterpart thereof.
  • Exonuclease III homologues of E. coli are enzymes that have a certain identity (some amino acids are the same) or a similarity in structure (some amino acids are the same or have physicochemical analogies. conserved amino acids).
  • a modified form of exonuclease III for example a modified form no longer exhibiting 3'- 5 'exonuclease activity.
  • Such a modification, targeting one or more bases can in particular be obtained by site-directed mutagenesis.
  • the homologs which can be used have a percentage of identity of at least 20%, and / or a percentage of similarity of at least 50%.
  • homologs of interest mention may in particular be made of the homologs of exonuclease III in other organisms, such as bacteria, insects, plant, or mammals for example.
  • homologous enzymes Exo A of Streptococcus pneumoniae, Rrp1 of Drosophiia melanogaster, Arp of Arabidopsis thaliana. Mention may also be made of the homologous enzymes of the mouse (murine APEX), of the rat, of the ox (bovine BAP1 or APEX), or of the human (human HAP1 or APEX). These homologous enzymes are listed in Barzilay and Hickson, 1995 and Reardon et al, 1998. The present invention therefore relates to the use of exonuclease III in the implementation of an amplification reaction by polymerase of DNA fragments, preferably at least 1 thousand bases approximately.
  • exonuclease III has been found to be particularly effective for amplification reactions on fragments larger than 5 kb (kilobases).
  • the polymerase amplification reactions targeted are preferably PCR, RT-PCR, or sequencing reactions.
  • Exonuclease III can be used in amplification reactions of DNA fragments in addition to the usual polymerases. It can thus be used for example in combination with a single DNA polymerase, such as rTth DNA polymerase (Perkin-Elmer), or with different combinations of DNA polymerases, such as a combination of rTth and Vent polymerases (Perkin-Elmer ), or a combination of Taq and Pwo (Roche Molecular Biochemicals) polymerases.
  • rTth DNA polymerase Perkin-Elmer
  • DNA polymerases such as a combination of rTth and Vent polymerases (Perkin-Elmer )
  • Taq and Pwo Roche Molecular Biochemicals
  • the invention therefore also relates to a method of amplifying a DNA template using at least one polymerase, in which said DNA template is brought into contact with an exonuclease III.
  • exonuclease III From 1 to 75 units of exonuclease III can for example be used, preferably at least 5 units, more preferably from 20 to 50 units.
  • exonuclease III One unit of exonuclease III is defined as the quantity of enzyme necessary to produce, in 30 minutes and at 37 ° C., 1 nmole of mononucleotides from sonicated DNA. This definition is taken up by the various suppliers of exonuclease III.
  • oligonucleotide primers for the amplification, to counterbalance the possible destruction of these primers by the exonuclease 3'-5 'activity of the exonuclease. If the primer concentration cannot be increased, it is then advantageous to heat the enzyme beforehand, for example for a period of 10 to 30 minutes at a temperature of at least 70 ° C., for example up to approximately 99 ° C, and / or decrease the amount of enzyme used (up to 1 to 5 units).
  • exonuclease III The effect of exonuclease III on the amplification of long DNA fragments can also be exploited in a method for determining the presence of DNA lesions, by comparison of the amplification products with or without exonuclease III .
  • the invention therefore also relates to a method for detecting lesions on a DNA fragment, preferably more than a thousand bases, comprising the steps consisting i) amplifying said DNA fragment by means of a polymerase chain reaction (PCR) without exonuclease III; ii) amplifying said DNA fragment by means of a polymerase chain reaction (PCR) in the presence of exonuclease III; iii) compare, by quantification, the amplification products obtained in step (i) and in step (ii), any difference being indicative of lesions in the DNA fragment.
  • This comparison can be implemented by measuring with a scanner the intensity of the amplification products obtained in step (i) and in step (ii).
  • the number of lesions on the DNA fragment studied can then be evaluated using, for example, the Poisson equation into which the values of the intensities of the PCR products obtained in the presence and absence of exonuclease III will be introduced.
  • This equation is conventionally used to assess the number of lesions on damaged DNA fragments (Kalinowski et al, 1992; Mansouri et al, 1999).
  • the DNA can be contacted beforehand with a DNA glycosylase, before subjecting it to the abovementioned amplification steps.
  • This DNA glycosylase which specifically recognizes one or more kinds of modified bases (Lindahl and Wood, 1999), creates in these places abasic sites which can then be detected by amplification in the presence of exonuclease III.
  • E DNA glycosylase can be used.
  • coli such as Puracil-DNA glycosylase, sold by Boehringer Mannheim. This specifically recognizes at the DNA level uracil from the desamination of cytosine.
  • Such a method (with or without the intervention of a DNA glycosylase) can be particularly useful for evaluating the mutagenic effect of various agents in vivo, i or in vitro.
  • E. coli exonuclease III Origin and conditions of use of E. coli exonuclease III: In most of the experiments, exonuclease III from New England Biolabs was used, but certain experiments were carried out with exonuclease III from Life Technologies. Exonuclease III (for example between 25 and 50 units) was added directly to the PCR mixture with DNA polymerases. In some experiments, exonuclease III was heated for 10 or 30 minutes at 99 ° C, or treated with 1 or 25 mM CoCI 2 for 30 minutes at 99 ° C, before its addition to the PCR reaction.
  • the total DNA was isolated with Qiagen-Genomic-tip 100 / G columns (Qiagen, Hilden Germany) as described previously (Mansouri et al, 1999) or by phenol / chloroform extraction.
  • the exchange resin Qiagen anions usually provide longer DNA fragments (50-100 kb) than phenol / chloroform extraction (Cheng et al, 1995).
  • DNA samples extracted by Qiagen genomic-tip 100 / G columns are therefore particularly suitable for long PCRs (Cheng et al, 1995; Mansouri et al, 1999).
  • Qiagen columns are used to isolate total DNA from mouse liver or mitochondrial DNA from mitochondria isolated from rat liver.
  • Murine or human DNA samples isolated by the phenol / chloroform method are prepared from mouse liver or human blood (Fromenty et al, 1996b), and stored at -20 ° C or -80 ° C for several years.
  • the rat DNA samples extracted by the phenol / chloroform method were recently prepared for the experiments presented here. DNA concentrations are evaluated by absorption at 260 nm.
  • DNA samples isolated with Qiagen columns were subjected to treatments aimed at altering the DNA.
  • AP sites Ide et al, 1993
  • the DNA samples were treated with a depurination buffer (100 mM NaCl; 10 mM sodium citrate, pH 5.0) at 70 ° C for 0, 20, 40 or 60 minutes (preparation of DNA AP0, AP20, AP 40 and AP60 respectively).
  • the number of AP sites created increases linearly over time (Ide et al, 1993).
  • Other DNA samples were subjected to an elevated temperature (99 ° C) for 30, 60, 90, 120 or 150 seconds, which induces AP sites, DNA strand breaks and possibly others. DNA damage (Barnes, 1994; Friedberg et al, 1995).
  • DNA samples were denatured at 99 ° C for 10, 15, 20 and 30 minutes. Finally, some DNA samples were subjected to UV radiation (365 nm) for 4.5 or 6 hours, radiation generated by a "Rad-Free” UV lamp (6W, Schleicher and Schuell). To avoid evaporation, the DNA samples were kept on ice. Of. radiation " in, near UV (300 to 400 nm) produces breaks in the DNA strands, DNA-protein crosslinks and possibly AP sites (Rosenstein and Ducore, 1983; Sammartano and Tuveson, 1983; Tyrrell, 1991). - Long PCR experiments:
  • PCR reactions were carried out in a volume of 50 ⁇ l loaded with mineral oil, using MicroAmp PCR reaction tubes (Perkin-Elmer) and a RoboCycler Gradient 96 PCR device (Stratagene). This device makes it possible to obtain optimal cycle conditions for amplification by long PCR (Barnes, 1994).
  • Protocol 1a aims to co-amplify a short DNA fragment and a long DNA fragment from the mitochondrial genome of mice during the same PCR reaction, as previously described (Mansouri et al, 1999).
  • Protocol 1B differs from Protocol 1a by the omission of primers A and B from the PCR reaction.
  • concentration of Mg 2+ is 1.75 mM and the profile of the thermal cycler is an initial denaturation at 95 ° C for 2 minutes, 26 cycles at 95 ° C for 45 seconds, 57 ° C for 45 seconds and 68 ° C for 7.5 minutes and a final extension at 68 ° C for 7 minutes.
  • the extension step was 12 minutes instead of 7.5 minutes.
  • protocol 1c PCR reactions were carried out with primers A and B only, to exclusively amplify the short fragment of 316 base pairs of mitochondrial DNA (mtDNA) with either rTth DNA polymerase alone or the combination of rTth and Vent DNA polymerases .
  • mtDNA mitochondrial DNA
  • Protocol 2 was established to amplify the entire rat mitochondrial genome.
  • 5'- sense primer CACGATAGCTAAGACCCAAACTGG-3 '(nucleotides 469-492 of the rat mtDNA sequence (SEQ ID No. 5)) (Gadaleta et al, 1989) and the antisense primer 5'- CACCACAGTTATGTTGGTCATGGG-3' (nucleotides 15879- 15856 (SEQ ID No. 6)) were used to amplify a mtDNA fragment of 15411 5 base pairs (i.e. 15.4 kb).
  • the quantity of primers was 20 pmol and the concentration of Mg 2+ was 1.5 mM.
  • the thermocycler profile for protocol 2 includes an initial denaturation at 95 ° C for 2 minutes, 26 cycles at 95 ° C for 45 seconds, 58 ° C for 45 seconds and 68 ° C for 20 minutes, and a final extension to
  • Protocol 3 was intended to amplify a 5 kb fragment from the human nuclear gene CYP2D6 as described previously (Johansson et al, 1996).
  • the sense primer was 5'-
  • the protocol 3 thermocycler profile includes an initial denaturation. at 95 ° C for 2 minutes, 35 cycles at 95 ° C for 45 seconds, 63 ° C for 45
  • mouse total DNA samples were heated at 99 ° C for 30 seconds to 5 minutes and Southern blot hybridization was performed as previously described.
  • the membranes were dehybridized and rehybridized with a Cot-1 mouse nuclear DNA probe (Life Technologies).
  • the high molecular weight DNA detected with this probe was quantified by densitometry of the autoradiographies as described previously (Mansouri
  • the DNA sequencing of the PCR products was carried out by the Big Dye Terminators system (Applied Biosystems), as described previously (Mansouri et al, 1997).
  • the mtDNA fragment of 8636 base pair amplified with the protocol 1b was subjected to sequencing of the DNA with primers C and D, or forward and reverse primers (7241-7261 nucleotides or nucleotides 13179-13159 respectively, mouse mtDNA sequence).
  • the PCR products obtained with protocol 1a were digested with restriction enzymes EcoRV and BspMI, and the products were visualized on a 3% agarose gel MetaPhore® (FMC BioProducts).
  • the enzymes EcoRV and BspMI which have restriction sites at nucleotide positions 5376 and 12936 on the mouse mtDNA sequence, respectively (Bibb et al, 1981) cut the long mtDNA PCR product of 8636 base pairs nearby from each end, thus generating short fragments of 404 base pairs and 664 base pairs, respectively, with the larger fragments associated.
  • EXAMPLE 1 Exonuclease III promotes the amplification by long PCR of DNA samples denatured by heat:
  • Heat denatured DNA samples were therefore used to assess the effect of exonuclease III on long PCR amplification of increasing DNA matrix.
  • Mouse liver DNA samples were heated to 99 ° C for 30 to 120 seconds and subjected to long PCR protocol 1a to co-amplify a mitochondrial DNA fragment of 8636 base pairs and a mitochondrial DNA fragment of 316 base pairs.
  • the amplification of the product from 8636 base pairs gradually decreased with the DNA templates heated to 30, 60, 90 or 120 seconds.
  • exonuclease III 25 units
  • exonuclease III restored significant amplification of the PCR product of 8636 base pairs, while this DNA sample was not detectably amplified in the absence of exonuclease III.
  • yield of long PCR fragment was increased by exonuclease III, the authors of the invention noted the disappearance of the short DNA fragment (316 base pairs) in the PCR products when 25 units of exonuclease III were used.
  • exonuclease III is capable to eliminate the mononucleotides from the 3 ′ end (exonuclease activity 3 ′ - 5 ′), it was hypothesized that this enzyme could destroy a significant quantity of primers A and B, thus explaining the disappearance of the short fragment.
  • primers A and B are used in quantities approximately three times less than primers C and D in this co-amplification protocol (cf. Materials and methods and article by Mansouri et al, 1999).
  • Exonuclease III In order to quantitatively assess the beneficial effect of the exonuclease III effect on the amplification of long PCR in relation to the intensity of the mtDNA alteration, aliquots of liver DNA samples from mice were heated at 99 ° C for 0, 30, 60 and 90 seconds and used to quantify residual mitochondrial DNA by Southern Blot hybridization and to amplify the 8636 base pair mtDNA fragment using the 1 b protocol with or without 25 exonuclease III units. Exonuclease III increased the yield of the PCR product by 8636 base pairs by 2.4; 4.2; and 5.5 times, when the percentage of mitochondrial DNA loss was 11, 32 and 64% respectively. Exonuclease III also allowed a 1.4-fold increase in the yield of the long PCR product from unheated mouse liver DNA sample, reflecting the inevitable presence of some DNA damage itself. in the most carefully prepared DNA samples.
  • Exonuclease III significantly increased the amplification of the 15.4 kb fragment for the mtDNA sample heated at 99 ° C for 30 seconds and even more strikingly allowed an amplification of this fragment for DNA samples heated for 60 seconds or 90 seconds.
  • mammalian mtDNA is a particular DNA since it is a small circular DNA (approximately 16 kb in mammals).
  • the authors of the invention therefore investigated whether the beneficial effect of exonuclease III could also be observed for a long PCR amplification on altered targets located on the nuclear genome.
  • exonuclease III 50 units
  • EXAMPLE 2 Exonuclease III of £. coli promotes long PCR amplification of purified DNA arrays
  • E. coli exonuclease III is an AP endonuclease (Weiss, 1981; Shida et al, 1996), the authors of the invention evaluated its ability to increase the amplification of long PCR with DNA samples from depurinated mouse liver.
  • the AP sites were created as described in the "Materials and Methods" section above, and the long PCR protocol 1b was used to amplify the 8636 base pair mtDNA fragment. While in the absence of exonuclease III, the amplification gradually decreased according to the increasingly purified DNA samples, exonuclease III (25 units) restored normal or satisfactory amplification, even with the most purified DNA sample (AP 60).
  • exonuclease III increased by 25, 30, 66 and 88% the product yield of 8636 base pairs with the depurinated preparations APO, AP20, AP40 and AP60, respectively.
  • the authors of the invention also carried out an RFLP analysis on the mtDNA products of 8636 base pairs after amplification of the samples of depurinated DNA (AP40) with or without exonuclease III.
  • Two restriction enzymes namely EcoRV and BspMI, cut the 8636 base pair PCR product near each end, generating small DNA fragments of 404 base pairs and 664 base pairs respectively. These fragments were not detectably shortened by exonuclease III indicating that its 3V5 'exonuclease activity does not detectably cut the ends of the long PCR product.
  • Exonuclease III increased dramatically, amplification of the 8636 base pair mtDNA fragment, mouse DNA samples, amplification of the rat mitochondrial genome almost entirely (15.4 kb ) and the product of nuclear CYP2D6 5 kb of human DNA. It should be noted that an improvement in the amplification by PCR. long of the latter product was also observed when the concentration of Mg 2+ was decreased by 1.5 mM to 1 mM, indicating that the beneficial effect of exonuclease III appears over a wide range of Mg 2+ concentrations.
  • exonuclease III can repair DNA damage induced by close UV (Samma . Rtano and Tuveson, 1983)
  • the authors of the invention evaluated the effect of exonuclease III on PCR amplification long 8636 base pair mtDNA fragments with DNA samples from mouse liver subjected to near UV radiation (365 nm). Again, exonuclease III increased the product yield by 8636 base pairs when there was little or no amplification in its absence.
  • EXAMPLE 5 The improvement in amplification by long PCR exerted by exonuclease III is largely resistant to denaturation of the enzyme induced by heat but is destroyed by 25 mM of CoCI 2 :
  • the authors of the invention sought to inhibit the beneficial effect of exonuclease III on the amplification of long PCR of depurinated DNA arrays (AP40). Preheat the enzyme at 99 ° C for 30 minutes before its addition to the failed PCR reaction, indicating that the activity involved is thermostable.
  • the DNA polymerase Vent has a 3'-5 "exonuclease (proofreading) activity, which appears essential for an effective amplification of long DNA targets.
  • the authors of the present invention have investigated whether the exonuclease III could improve PCR performed with rTth DNA polymerase alone, without Vent DNA polymerase.
  • An increasing improvement in the amplification efficiency of the 8,636 base pair fragment of mouse mtDNA was observed when uses (1) rTth polymerase, (2) rTth polymerase and exonuclease III, (3) rTth polymerase and Wind polymerase and finally (4) these two DNA polymerases and exonuclease III.
  • EXAMPLE 7 The beneficial effect of exonuclease III on long PCR was observed with another combination of DNA polymerase and this effect is similar when the exonuclease III comes from two different suppliers;
  • exonuclease III also allowed the amplification of a 5 kb PCR fragment obtained from the human CYP2D6 nuclear gene when it was used, ie blood DNA samples heat denatured, i.e. DNA samples extracted with phenol and kept for several years.
  • EXAMPLE 8 Another AP-endonuclease of E. coli, endonuclease IV has little effect on the amplification by long PCR of altered DNA templates
  • endonuclease IV another major AP-endonuclease of E. coli
  • endonuclease IV was either preincubated with DNA samples for 30 minutes at 37 ° C in an appropriate buffer, or directly added to the PCR reaction. Contrary to the results obtained with exonuclease III, no reproducible beneficial effect of endonuclease IV on long PCR could be observed for a given sample of DNA.
  • exonuclease III of E. coli surprisingly improves the amplification by PCR of long fragments of more or less damaged DNA. This beneficial effect seems to increase in proportion to the DNA damage. This effect can be observed either with DNA samples subjected to different treatments known to induce AP sites and / or breaks in DNA strands (low pH, heat, radiation in the near UV) or with samples of DNA stored over a long period. Exonuclease III increases PCR amplification of DNA sequences of variable lengths (5 to 15.4 kb) located in the mitochondrial genome or the nuclear genome of different animal species. In addition, exonuclease III is effective either in combination with a single DNA polymerase (i.e.
  • exonuclease III is effective in a wide range of Mg 2+ concentrations (i.e. from 1.0 to 1.75 mM with the PCR GeneAmp XL system and 2.25 mM with the PCR Expand TM Long Template system). All of these data show that exonuclease III can be used under various PCR amplification conditions for long DNA fragments.

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Abstract

Cette invention concerne l'utilisation de l'exonucléase III (de<i>E. coli</i>) dans la mise en oeuvre d'une réaction par polymérase visant à amplifier des fragments d'ADN, de préférence d'au moins 1 millier de bases environ, ainsi que l'application de cette nouvelle utilisation pour détecter des lésions, de type lésions oxydatives dans l'ADN.

Description

Utilisation de l'exonucléase III dans des réactions d'amplification par polymerase de fragments d'ADN
La présente invention a trait à un perfectionnement des méthodes d'amplification par polymerase de fragments d'ADN.
L'utilisation de la réaction de PCR (réaction en chaîne par polymerase), pour amplifier des séquences d'ADN est maintenant très répandue dans le domaine de la génétique moléculaire. Les réactions de PCR visant à amplifier des fragments d'ADN de plusieurs milliers de paires de bases, désignées « PCR longues », posent néanmoins des problèmes, l'intégrité de la matrice d'ADN se révélant critique (Cheng et al, 1994a et 1995). En effet cette matrice d'ADN peut être de mauvaise qualité, et présenter en particulier des cassures de brins ou des lésions (dépurination...) qui bloquent la progression des ADN polymérases (Fromenty et al, 1997). Ces altérations peuvent notamment avoir lieu lors des procédures d'extraction de l'ADN, ou lors de la congélation et décongélation des échantillons d'ADN.
Grâce à Barnes (1994), le problème de l'amplification des longs fragments d'ADN a été partiellement résolu par l'utilisation d'une combinaison d'une grande quantité d'un mutant de Taq polymerase dénuée d'activité exonuclease (Klentaql), avec une très faible quantité d'une ADN polymerase thermostable présentant une activité exonucléasique 3'- 5', ou activité de relecture (« proofreading »), polymerase choisie parmi les enzymes Pfu, Vent, ou Deep Vent.
Cheng et al (1994b) ont aussi testé la combinaison des polymérases Vent, Deep Vent, Pfu et rTma avec la rTth polymerase, et se sont aperçus que la combinaison rTth et Vent était la meilleure.
Malgré ces améliorations, les réactions d'amplification par polymerase de longs fragments d'ADN ne donnent pas toujours- de bons- résultats,- en particulier avec des échantillons d'ADN endommagés. Les auteurs de la présente invention ont maintenant trouvé de manière surprenante que Pexonucléase III avait un effet bénéfique sur ce type d'amplifications.
L'exonucléase III d'Escherichia coli est surtout connue pour catalyser l'élimination progressive de mononucléotides à partir de l'extrémité 3'OH d'un
ADN double brin (activité 3'→5' exonuclease) (Richardson et al, 1964). Cette enzyme possède également des activités de RNase H, 3'-phosphatase, et d'AP-endonucléase (AP, pour Apurinique et Apyrimidinique), décrite . notamment dans les articles de Kow, 1989 et Shida et al, 1996. Conformément à l'invention, on peut utiliser n'importe quelle exonuclease III, purifiée à partir d'Escherichia coli, (telle que par exemple celle fournie par New England Biolabs) ou un homologue de celle-ci. Les homologues de l'exonucléase III de E. coli sont des enzymes qui présentent une certaine identité (certains acides aminés sont les mêmes) ou une similarité de structure (certains acides aminés sont les mêmes ou présentent des analogies physico-chimiques. On parle alors d'acides aminés conservés).
Parmi ces homologues,, on peut notamment utiliser une forme modifiée de l'exonucléase III, par exemple une forme modifiée ne présentant plus l'activité exonucléasique 3'- 5'. Une telle modification, visant une ou plusieurs bases, peut en particulier être obtenue par mutagénèse dirigée.
De préférence, les homologues utilisables présentent un pourcentage d'identité d'au moins 20 %, et/ou un pourcentage de similarité d'au moins 50 %.
Parmi les homologues d'intérêt, on peut notamment citer les homologues de l'exonucléase III chez d'autres organismes, tels que bactéries, insectes, plante, ou mammifères par exemple.
Sont entre autres connues comme enzymes homologues l'Exo A de Streptococcus pneumoniae, la Rrp1 de Drosophiia melanogaster, l'Arp d'Arabidopsis thaliana. On peut encore citer les enzymes homologues de la souris (APEX murine), du rat, du bœuf (BAP1 ou APEX bovine), ou de l'homme (HAP1 ou APEX humaine). Ces enzymes homologues sont répertoriées- dans Barzilay et Hickson, 1995 et Reardon et al, 1998. La présente invention a donc pour objet l'utilisation de l'exonucléase III dans la mise en œuvre d'une réaction d'amplification par polymerase de fragments d'ADN, de préférence d'au moins 1 millier de bases environ.
L'utilisation de l'exonucléase III s'est avérée particulièrement efficace pour des réactions d'amplification sur des fragments de plus de 5 kb (kilobases).
Les réactions d'amplification par polymerase visées sont de préférence les réactions de PCR, RT-PCR, ou de séquençage.
L'exonucléase III peut être utilisée dans les réactions d'amplification des fragments d'ADN en supplément des polymérases habituelles. Elle peut ainsi être utilisée par exemple en association avec une seule ADN polymerase, telle que la rTth ADN polymerase (Perkin-Elmer), ou avec différentes combinaisons d'ADN polymérases, telles qu'une combinaison des polymérases rTth et Vent (Perkin-Elmer), ou une combinaison des polymérases Taq et Pwo (Roche Molecular Bîochemicals).
L'invention a donc également pour objet une méthode d'amplification d'une matrice d'ADN à l'aide d'au moins une polymerase, dans laquelle ladite matrice d'ADN est mise en contact avec une exonuclease III. De 1 à 75 unités d'exonucléase III peuvent par exemple être utilisées, de préférence au moins 5 unités, de préférence encore de 20 à 50 unités.
Une unité d'exonucléase III est définie comme la quantité d'enzyme nécessaire pour produire, en 30 minutes et à 37°C, 1 nmole de mononucléotides à partir d'ADN soniqué. Cette définition est reprise par les différents fournisseurs d'exonucléase III.
Il convient de veiller à utiliser pour l'amplification une quantité suffisamment élevée d'amorces oligonucléotidiques, pour contrebalancer la destruction éventuelle de ces amorces par l'activité exonucléasique 3'-5' de l'exonucléase. Si la concentration en amorces ne peut être augmentée, il est alors avantageux de chauffer préalablement l'enzyme, par exemple pendant - une durée de 10 à 30 minutes à une température d'au moins 70°C, par exemple jusqu'à environ 99°C, et/ou de diminuer la quantité d'enzyme utilisée Gusqu'à 1 à 5 unités). L'effet de l'exonucléase III sur l'amplification des longs fragments d'ADN peut également être mis à profit dans un procédé pour déterminer la présence de lésions de l'ADN, par comparaison des produits d'amplification avec ou sans exonuclease III. Il s'agit de détecter et éventuellement de quantifier diverses modifications de structure de l'ADN, telles que des pertes de bases (sites abasiques) des oxydations de bases (hydroxylation par exemple), des pertes -de fonction aminé (désamination), des alkylations (méthylations), comme décrit dans Lindahl, 1993. L'invention a donc également pour objet une méthode de détection, de lésions sur un fragment d'ADN, de préférence de plus d'un millier de bases,, comprenant les étapes consistant à : i) amplifier ledit fragment d'ADN au moyen d'une réaction en chaîne par polymerase (PCR) sans exonuclease III ; ii) amplifier ledit fragment d'ADN au moyen d'une réaction en chaîne par polymerase (PCR) en présence d'exonucléase III ; iii) comparer par quantification les produits d'amplification obtenus à l'étape (i) et à l'étape (ii), toute différence étant indicatrice de lésions dans le fragment d'ADN. Cette comparaison peut être mise en œuvre en mesurant grâce à un scanner l'intensité des produits d'amplification obtenus à l'étape (i) et à l'étape (ii). Le nombre de lésions sur le fragment d'ADN étudié peut être évalué alors grâce par exemple à l'équation de Poisson dans laquelle seront introduites les valeurs des intensités des produits PCR obtenus en présence et en absence d'exonucléase III. Cette équation est classiquement utilisée pour évaluer le nombre de lésions sur des fragments d'ADN endommagé (Kalinowski et al, 1992 ; Mansouri et al, 1999).
Selon un mode particulier de réalisation de ce procédé, on peut préalablement mettre en contact l'ADN avec une ADN glycosylase, avant de le soumettre aux étapes d'amplification précitées.
Cette ADN glycosylase, qui reconnaît spécifiquement une ou plusieurs sortes de bases modifiées (Lindahl et Wood, 1999), crée à ces endroits des sites abasiques qui peuvent être ensuite détectés par l'amplification en présence d'exonucléase III.
On peut utiliser une ADN glycosylase d'E. coli telle que Puracil-ADN glycosylase, commercialisée par Boehringer Mannheim. Celle-ci reconnaît spécifiquement au niveau de l'ADN l'uracil provenant de la desamination de la cytosine.
Un tel procédé (avec ou sans intervention d'une ADN glycosylase) peut être particulièrement utile pour évaluer l'effet mutagène de divers agents in vivo, i ou in vitro.
Les exemples suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée.
EXEMPLES : Les exemples décrits plus loin mettent en œuvre les matériels et méthodes suivants :
Matériels et méthodes
- Origine et conditions d'utilisation de l'exonucléase III de E. coli : Dans la plupart des expériences, on a utilisé l'exonucléase III de New England Biolabs, mais certaines expériences étaient menées avec l'exonucléase III de Life Technologies. L'exonucléase III (par exemple entre 25 et 50 unités) a été ajoutée directement au mélange de PCR avec les ADN polymérases. Dans certaines expériences, l'exonucléase III a été chauffée pendant 10 ou 30 minutes à 99°C, ou traitée avec 1 ou 25 mM de CoCI2 pendant 30 minutes à 99°C, avant son addition à la réaction de PCR.
- Isolement de l'ADN total ou de l'ADN mitochondriaf (ADNmt) ;i
L'ADN total a été isolé avec des colonnes Qiagen -Genomic-tip 100/G (Qiagen, Hilden Germany) comme décrit précédemment (Mansouri et al, 1999) ou par une extraction phénol/chloroforme. La résine échangeuse d'anions de Qiagen permet habituellement d'obtenir de plus longs fragments d'ADN (50-100 kb) qu'une extraction phénol/chloroforme (Cheng et al, 1995). Les échantillons d'ADN extraits par des colonnes Qiagen genomic-tip 100/G sont donc particulièrement appropriés pour des PCR longues (Cheng et al, 1995 ; Mansouri et al, 1999). Les colonnes Qiagen sont utilisées pour isoler l'ADN total à partir de foie de souris ou l'ADN mitochondrial à partir de mitochondries isolées de foie de rat. Des échantillons d'ADN murin ou humain, isolé par le procédé de phénol/chloroforme sont préparés à partir de foie de souris ou de sang humain (Fromenty et al, 1996b), et stockés à -20°C ou - 80°C pendant plusieurs années. Les échantillons d'ADN de rat extraits par le procédé de phénol/chloroforme ont été récemment préparés pour les expériences présentées ici. Les concentrations d'ADN sont évaluées par une absorption à 260 nm.
- Préparation des échantillons d'ADN abîmés :
Des échantillons d'ADN isolé avec des colonnes Qiagen ont été soumis à des traitements visant à altérer l'ADN. Pour créer des sites AP (Ide et al, 1993), les échantillons d'ADN ont été traités par un tampon de dépurination (100 mM NaCI ; 10 mM sodium citrate, pH 5,0) à 70°C pendant 0, 20, 40 ou 60 minutes (préparation d'ADN AP0, AP20, AP 40 et AP60 respectivement). Le nombre des sites AP créés augmente linéairement avec le temps (Ide et al, 1993). D'autres échantillons d'ADN ont été soumis à une température élevée (99°C) pendant 30, 60, 90, 120 ou 150 secondes, ce qui induit des sites AP, des cassures des brins d'ADN et éventuellement d'autres lésions de l'ADN (Barnes, 1994 ; Friedberg et al, 1995). Dans d'autres expériences, des échantillons d'ADN ont été dénaturés à 99°C pendant 10, 15, 20 et 30 minutes. Finalement, certains échantillons d'ADN ont été soumis à des radiations UV (365 nm) pendant 4,5 ou 6 heures, radiations générées par une lampe UV "Rad-Free" (6W, Schleicher et Schuell). Pour éviter l'évaporation, les échantillons d'ADN ont été maintenus dans de la glace. Des. radiations "en, proche UV (300 à 400 nm) produisent des cassures des brins d'ADN, des réticulations ADN-protéine et éventuellement des sites AP (Rosenstein et Ducore, 1983 ; Sammartano et Tuveson, 1983 ; Tyrrell, 1991). - Expériences de PCR longue :
Les PCR longues sont réalisées avec le système GeneAmp XL PCR (Perkin-Elmer) qui utilisent les ADN polymérases rTth et Vent. Sauf indications contraires, ces expériences ont été menées comme précédemment décrit dans Mansouri et al, 1999. D'autres expériences ont été réalisées avec le système Expand™ Long Template PCR (Roche Molecular Biochemicals) qui utilise les ADN polymérases Taq et Pwo. Ces expériences ont été menées comme précédemment décrits dans Fromenty et al, 1996a et Fromenty et al, 1997, à l'exception de l'albumine de sérum bovin purifiée qui a été omis dans les réactions de PCR. Le tampon 3 contenant des détergents et 2,25 mM de MgCI2 a toujours été utilisé dans les expériences réalisées avec le système Expand™ Long Template. Certaines expériences de PCR longue ont également été réalisées avec l'ADN polymerase rTth (Perkin Elmer) seule, en utilisant le même mélange de réaction de PCR que pour l'association des ADN polymérases rTth plus Vent.
Toutes les. réactions de PCR ont été réalisées dans un volume de 50 μl chargé avec de l'huile minérale, en utilisant des tubes de réaction PCR MicroAmp (Perkin-Elmer) et un appareil RoboCycler Gradient 96 PCR (Stratagene). Cet appareil permet d'obtenir des conditions de cycles optimales pour l'amplification par PCR longue (Barnes, 1994).
Quatre protocoles de PCR longue différents ont été mis en œuvre. Le protocole 1a vise à coamplifier un fragment d'ADN court et un fragment d'ADN long à partir du génome mitochondrial de souris pendant la même réaction de PCR, comme précédemment décrit (Mansouri et al, 1999). Une amorce sens A 5'-CGACAGCTAAGACCCAAACTGGG-3' (nucleotides 470-492 de la séquence d'ADN mitonchondrial de souris (SEQ ID n° 1)) (Bibb et al, 1981) et une amorce anti-sens B 5'-CCCATTTCTTCCCATTTCATTGGC- 3' (nucleotides 785-762 (SEQ ID n° 2)) ont permis d'amplifier un fragment , — , d'ADN mitochondrial de 316 paires de bases, tandis que l'amorce sens C'5'- TACTAGTCCGCGAGCCTTCAAAGC-3' (nucleotides 4964-4987 (SEQ ID n° 3)) et l'amorce anti-sens D 5'-GGGTGATCTTTGTTTGCGGGT-3' (nucleotides 13599-13579 (SEQ ID n° 4)) ont permis d'amplifier un fragment d'ADN mitochondrial de 8636 paires de bases. Ce protocole de PCR longue à quatre amorces était à l'origine destiné à évaluer le nombre de lésions capables de bloquer la progression des ADN polymerase sur une séquence cible d'ADN de mitochondrie de 8636 paires de bases (Mansouri et al ,1999). En effet, des lésions aléatoires dans l'ADN sont bien plus susceptibles d'empêcher la progression des ADN polymérases et de décroître l'amplification de la PCR pour des longs fragments d'ADN que pour des courts fragments d'ADN (Mansouri et al, 1999). Dans cette technique, la coamplification des longs fragments et des courts fragments d'ADN mitochondrial est réalisée grâce au déséquilibre dans les quantités d'amorces (c'est-à-dire 14 pmoles pour les amorces A et B, amplifiant le court fragment contre 40 pmoles pour les amorces C et D, amplifiant le long fragment PCR).
Le protocole 1 b diffère du protocole 1a par l'omission des amorces A et B de la réaction de PCR. Dans les deux protocoles (1a et 1b) la concentration en Mg2+ est de 1 ,75 mM et le profil du thermocycleur est une dénaturation initiale à 95°C pendant 2 minutes, 26 cycles à 95°C pendant 45 secondes, 57°C pendant 45 secondes et 68°C pendant 7,5 minutes et une extension finale à 68°C pendant 7 minutes. Lorsque le système Expand™ Long Template PCR a été utilisé pour amplifier le fragment d'ADN mitochondrial de 8636 paires de bases, l'étape d'extension était de 12 minutes au lieu de 7,5 minutes.
Dans le protocole 1c. des réactions de PCR ont été réalisées avec les amorces A et B seulement, pour amplifier exclusivement le fragment court de 316 paires de bases d'ADN mitochondrial (ADNmt) avec soit l'ADN polymerase rTth seule soit la combinaison des ADN polymérases rTth et Vent.
Les conditions générales des réactions de PCR étaient les mêmes que pour le protocole 1a à l'exception de la quantité des amorces A et B (30-40 pmoles au lieu de 14 pmoles) et la durée de l'étape d'extension à 68°C était en outre de 1
, minute au lieu de 7,5 minutes. Toutes les expériences de courte PCR. ont été ,, - effectuées avec l'exonucléase III préchauffée 10 minutes à 99°C-. avant son addition dans la réaction de PCR.
Le protocole 2 a été établi pour amplifier le génome mitochondrial de rat pratiquement dans son entier. L'amorce sens 5'- CACGATAGCTAAGACCCAAACTGG-3' (nucleotides 469-492 de la séquence d'ADNmt de rat (SEQ ID n° 5)) (Gadaleta et al, 1989) et l'amorce anti-sens 5'- CACCACAGTTATGTTGGTCATGGG-3' (nucleotides 15879-15856 (SEQ ID n° 6)) ont été utilisées pour amplifier un fragment d'ADNmt de 15411 paires de 5 bases (c'est-à-dire 15,4 kb). Sauf indications contraires, la quantité des amorces était de 20 pmoles et la concentration en Mg2+ était de 1 ,5 mM. Le profil du thermocycleur pour le protocole 2 inclut une dénaturation initiale à 95°C pendant 2 minutes, 26 cycles à 95°C pendant 45 secondes, 58°C pendant 45 secondes et 68°C pendant 20 minutes, et une extension finale à
10 68°C pendant 7 minutes.
Le protocole 3 était destiné à amplifier un fragment de 5 kb à partir du gène nucléaire humain CYP2D6 comme décrit précédemment (Johansson et al, 1996). L'amorce sens était 5'-
CCAGAAGGCTTTGCAGGCTTCA-3' (SEQ ID n° 7) et l'amorce antisens était
15 5'-ACTGAGCCCTGGGAGGTAGGTA-3 (SEQ ID n° 8). La quantité d'amorces était de 40 pmoles et la concentration en M.g2+ était de 1,5 mM, sauf pour certaines expériences réalisées avec une concentration de 1 ,0 mM de Mg2+. Le profil de thermocycleur du protocole 3 inclut une dénaturation initiale. à 95°C pendant 2 minutes, 35 cycles à 95°C pendant 45 secondes, 63°C pendant 45
20 secondes et 68°C pendant 7,5 minutes, et une extension finale à 68°C pendant 7 minutes. Ces conditions de cycles thermiques ont été maintenues lorsque un système Expand™ Long Template PCR a été utilisé à la place du système GeneAmp XL PCR.
Les produits PCR (22 μl) ont été soumis à une électrophorèse sur
25 gel d'agarose (0,7-1 ,2 %) coloré avec du bromure d'éthidium. La quantité de produits PCR a été déterminée comme décrit précédemment (Mansouri et al, 1999).
- Hybridation Southern Blot :
' 30 Pour évaluer la dégradation de l'ADN, des échantillons-d'ADN total de souris ont été chauffés à 99°C pendant 30 secondes à 5 minutes et l'hybridation Southern Blot a été réalisée comme décrit précédemment
(Mansouri et al, 1999). Brièvement, des échantillons d'ADN chauffés et non chauffés (2 à 5 μg) ont été déposés sur des gels d'agarose à 0,7 % sans bromure d'éthidium. L'ADN a été soumis à une électrophorèse toute une nuit à un voltage de 2,5 V/cm, transféré sur une membrane de nylon Hybond-N+, et hybride avec une sonde d'ADNmt de. souris de 8,6 kb synthétisée par PCR longue. Les différentes formes du génome mitochondrial de souris (superenroulé, circulaire ou linéaire de pleine longueur) ont été quantifiées par une densitométrie des autoradiographies comme décrit précédemment (Mansouri et al, 1999). Les membranes ont été déshybridées et réhybridées avec une sonde d'ADN nucléaire de souris Cot-1 (Life Technologies). L'ADN de haut poids moléculaire détecté avec cette sonde a été quantifié par densitométrie des autoradiographies comme décrit précédemment (Mansouri
Figure imgf000011_0001
- Séquençage de l'ADN et analyse RFLP des produits de PCR : Le séquençage de l'ADN des produits de PCR a été effectué par le système Big Dye Terminators (Applied Biosystems), comme décrit précédemment (Mansouri et al, 1997). Le fragment d'ADNmt de 8636 paires de bases amplifié avec le protocole 1b a été soumis à un séquençage dlADN avec les amorces C ou D, ou des amorces sens et antisens (nucleotides 7241-7261 ou nucleotides 13179-13159 respectivement, sur la séquence ADNmt de souris).
Pour une analyse RFLP, les produits de PCR obtenus avec le protocole 1a ont été digérés avec des enzymes de restriction EcoRV et BspMI, et les produits ont été visualisés sur un gel d'agarose à 3 % MetaPhore® (FMC BioProducts). Les enzymes EcoRV et BspMI qui ont des sites de restriction en positions nucléotidiques 5376 et 12936 sur la séquence d'ADNmt de souris, respectivement (Bibb et al, 1981) coupent le produit de PCR longue d'ADNmt de 8636 paires de bases à proximité de chaque extrémité, générant ainsi de courts fragments de 404 paires de bases et de 664 paires de bases, respectivement, avec les fragments plus larges associés. EXEMPLE 1 : L'exonucléase III favorise l'amplification par PCR longue d'échantillons d'ADN dénaturés à la chaleur :
• La chaleur induit de sites AP et des cassures dans les brins d'ADN (Barnes, 1994 ; Friedberg et al, 1995). Pour évaluer l'effet de la chaleur sur l'ADN, de l'ADN total de foie de souris a été chauffé à 99°C pendant des durées variées, et des expériences de Southern Blot ont été réalisées d'abord avec une sonde d'ADNmt puis avec une sonde d'ADN nucléaire (ADN de souris Cot-1). La quantification des formes non altérées du génome mitochondrial et de l'ADN nucléaire à haut poids moléculaire a permis aux auteurs de la présente invention d'évaluer la perte d'ADN mitochondrial ou d'ADN nucléaire. Après 30 secondes, 60 secondes, 90 secondes et 150 secondes d'altération de l'ADN induite par le chauffage, 11 , 32, 64 et 96 % de l'ADN mitochondrial était perdu, tandis que la perte de l'ADN nucléaire à haut poids moléculaire était de 23, 82, 95 et 99 % respectivement. Des échantillons d'ADN dénaturés à la chaleur ont donc été utilisés pour évaluer l'effet de l'exonucléase III sur l'amplification par PCR longue de matrice d'ADN altérée de manière croissante. Des échantillons d'ADN de foie de souris ont été chauffés à 99°C pendant 30 à 120 secondes et soumis au protocole 1a de PCR longue pour coamplifier un fragment d'ADN mitochondrial de 8636 paires de bases et un fragment d'ADN mitochondrial de 316 paires de bases. En l'absence d'exonucléase III, l'amplification du produit de 8636 paires de bases a progressivement décru avec les matrices d'ADN chauffées à 30, 60, 90 ou 120 secondes. En revanche, lorsque l'exonucléase III (25 unités) a été ajoutée au mélange de PCR, on a observé une augmentation frappante du rendement des produits de PCR longue. A noter qu'avec l'échantillon d'ADN chauffé à 99°C pendant 120 secondes, l'exonucléase III a restauré une amplification significative du produit de PCR de 8636 paires de bases, tandis que cet échantillon d'ADN n'était pas amplifié de manière détectable en l'absence d'exonucléase III. Toutefois, tandis que le rendement de fragment long de PCR a été augmenté par l'exonucléase III, les auteurs de l'invention ont noté la disparition du fragment d'ADN court (316 paires de bases) dans les produits de PCR lorsque 25 unités d'exonucléase III ont été utilisées. Puisque l'exonucléase III est capable d'éliminer les mononucléotides à partir de l'extrémité 3' (activité exonuclease 3'- 5'), l'hypothèse a été émise que cette enzyme pouvait détruire une quantité significative des amorces A et B expliquant ainsi la disparition du fragment court. En effet, les amorces A et B sont utilisées en quantités environ trois fois moindres que les amorces C et D dans ce protocole de coamplification (cf Matériels et méthodes et article de Mansouri et al, 1999).
Les auteurs de la présente invention ont donc tenté de diminuer ou d'inhiber l'activité exonucléasique 3' -5' de l'exonucléase III, en diminuant la concentration d'exonucléase (Henner et al, 1983 ; Shida et al, 1996) ou en préchauffant l'enzyme (Richardson et al, 1964 ; Weiss, 1981) avant l'expérience de longue PCR. La diminution de la concentration en exonuclease III jusqu'à 5 unités a restauré l'amplification du fragment d'ADN de 316 paires de bases tout en maintenant l'effet d'augmentation du rendement du produit de PCR de 8636 paires de bases. Toutefois, le rendement en fragment d'ADNmt de 8636 paires de bases était légèrement moindre avec seulement une unité d'exonucléase III ou avec l'exonucléase III préchauffé (99°C pendant 10 minutes) par rapport aux résultats obtenus avec 5 ou 25 unités d'exonucléase III.
Des expériences complémentaires avec les protocoles 1b. 2 et 3 de PCR longue ont confirmé que la quantité d'amorces oligonucléotîdîques doit être suffisamment élevée pour contrebalancer la destruction éventuelle des amorces par l'activité exonucléasique 3"-5' de l'exonucléase III. Dans le cas présent, un minimum de 20 pmoles d'amorces dans la réaction de PCR longue a été nécessaire pour bénéficier de l'effet de l'exonucléase III sur l'amplification en PCR longue des matrices altérées, et cette concentration en amorces pourra être modifiée pour d'autres protocoles. A noter que pour des protocoles de PCR pour lesquels la concentration en amorces ne pourra être augmentée (par exemple amorces A et B dans le protocole 1 a) une solution satisfaisante est de préchauffer l'exonucléase III avant son addition dans la réaction de PCR longue.
Afin d'évaluer quantitativement l'effet bénéfique de l'effet exonuclease III sur l'amplification de longue PCR en relation avec l'intensité de l'altération de l'ADNmt, des fractions aliquotes d'échantillons d'ADN de foie de souris ont été chauffées à 99°C pendant 0, 30, 60 et 90 secondes et utilisées pour quantifier l'ADN mitochondrial résiduel par hybridation de Southern Blot et pour amplifier le fragment d'ADNmt de 8636 paires de bases en utilisant le protocole 1 b avec ou sans 25 unités d'exonucléase III. L'exonucléase III a augmenté le rendement du produit de PCR de 8636 paires de bases de 2,4 ; 4,2 ; et 5,5 fois, lorsque le pourcentage de perte d'ADN mitochondrial était de 11 , 32 et 64 % respectivement. L'exonucléase III a également permis une augmentation de 1 ,4 fois du rendement du produit de PCR longue à partir d'échantillon d'ADN de foie de souris non chauffé, reflétant la présence inévitable d'une certaine altération de l'ADN même dans les échantillons d'ADN les plus soigneusement préparés.
• Afin d'étendre ces observations à d'autres amorces oligonucleotidiques, ou à de l'ADN mitochondrial d'autres espèces animales et à de l'ADN nucléaire, des expériences complémentaires ont été réalisées. Les auteurs de la présente invention ont d'abord évalué l'effet de l'exonucléase III sur l'amplification d'un fragment d'ADNmt de 15,4 kb en utilisant le protocole 2 et des échantillons d'ADNmt de foie de rat dénaturés à la chaleur, comme matrices altérées.
L'exonucléase III (25 unités) augmente significativement l'amplification du fragment de 15,4 kb pour l'échantillon d'ADNmt chauffé à 99°C pendant 30 secondes et de manière encore plus frappante a permis une amplification de ce fragment pour les échantillons d'ADN chauffés pendant 60 secondes ou pendant 90 secondes.
Structurellement, l'ADNmt de mammifère est un ADN particulier puisqu'il s'agit d'un petit ADN circulaire (environ 16 kb chez les mammifères). Les auteurs de l'invention se sont donc demandés si l'effet bénéfique de l'exonucléase III pouvait également être observé pour une amplification par PCR longue sur des cibles altérées localisées sur le génome nucléaire. Avec des échantillons d'ADN de sang humain dénaturés à la chaleur pendant 30 secondes ou 60 secondes, l'exonucléase III (50 unités) a augmenté le rendement en produit de PCR (5kb) obtenu à partir du gène nucléaire humain CYP2D6. EXEMPLE 2 : L'exonucléase III de £. coli favorise l'amplification par PCR longue de matrices d'ADN dépurinées
Puisque l'exonucléase III de E. coli est une AP endonucléase (Weiss, 1981 ; Shida et al, 1996), les auteurs de l'invention ont évalué sa capacité à augmenter l'amplification de PCR longue avec des échantillons d'ADN de foie de souris dépuriné. Les sites AP ont été créés comme décrit dans la partie "Matériels et méthodes" ci-dessus, et le protocole 1b de PCR longue a été utilisé pour amplifier le fragment d'ADNmt de 8636 paires de bases. Tandis qu'en l'absence de l'exonucléase III, l'amplification a progressivement décru en fonction des échantillons d'ADN de plus en plus dépurinés, l'exonucléase III (25 unités) a restauré une amplification normale ou satisfaisante, même avec l'échantillon d'ADN le plus dépuriné (AP 60). Cet effet bénéfique a été reproduit dans sept séries d'expérience, et en moyenne, l'exonucléase III a augmenté de 25, 30, 66 et 88 % le rendement du produit de 8636 paires de bases avec les préparations dépurinées APO, AP20, AP40 et AP60, respectivement.
Pour vérifier la nature des produits de PCR de 8636 paires de bases amplifiés en présence d'exonucléase III, certains produits de PCR obtenus à partir de l'amplification d'échantillons d'ADN dépurinés (à savoir AP 40) ont été séquences. Les résultats indiquent que les séquences de quatre régions différentes de ces produits de PCR (représentant un total de 2053 paires de bases séquencées) s'apparient avec la séquence d'ADNmt de souris rapportée par Bibb et al, 1981 , à l'exception de quelques bases. Cependant, le nombre de bases ne correspondant pas à la séquence de référence n'est pas plus élevé que le nombre d'erreurs trouvées dans les séquences obtenues à partir des échantillons d'ADN dépuriné (AP40) amplifié sans exonuclease III (représentant un total de 1449 paires de bases séquencées). En effet, lorsque les amplifications de PCR longue ont été effectuées avec ou sans exonuclease -; ' IH, les fréquences d'erreurs étaient d'une erreur pour 205 bases et d'une erreur . pour 145 bases respectivement. Finalement, la fréquence d'erreur est de 1 erreur pour 134 bases lorsque l'amplification de PCR longue est réalisée sans exonuclease III et avec un échantillon d'ADN non altéré. Les différences entre les séquences d'ADNmt obtenues entre cette expérience et la référence de cette séquence d'ADNmt de souris (Bibb et al, 1981) sont vraisemblablement dues à des erreurs introduites lors du séquençage de l'ADN.
Les auteurs de l'invention ont également réalisé une analyse RFLP sur les produits de l'ADNmt de 8636 paires de bases après amplification des échantillons d'ADN dépuriné (AP40) avec ou sans exonuclease III. Deux enzymes de restriction, à savoir EcoRV et BspMI, coupaient le produit de PCR de 8636 paires de bases à proximité de chaque extrémité, générant de petits fragments d'ADN de 404 paires de bases et 664 paires de bases respectivement. Ces fragments n'étaient pas raccourcis de manière détectable par l'exonucléase III indiquant que son activité exonucléasique 3V5' ne coupe pas de façon détectable les extrémités du produit de PCR longue.
EXEMPLE 3 : L'exonucléase III augmente l'amplification par
PCR longue d'échantillons d'ADN extraits au phénol
Les auteurs de l'invention ont également évalué si l'exonucléase III pouvait augmenter l'amplification de PCR longue avec des matrices d'ADN qui ont été involontairement endommagées lors de l'isolement ët/ou du stockage. II a été utilisé des échantillons d'ADN humain, de rat ou de souris extraits au phénol/chloroforme et, soit conservés à -20°C ou -80°C pendant plusieurs années (ADN humain ou murin), soit récemment préparés (ADN de rat). L'ADN de foie de souris, l'ADN de foie de rat ou l'ADN de sang humain ont été soumis aux protocoles 1a. 2 ou 3 respectivement sans exonuclease III et les échantillons d'ADN qui donnaient peu ou pas de produits de PCR longue ont été sélectionnés (échantillons d'ADN présupposés altérés). L'exonucléase III a augmenté de manière frappante, l'amplification du fragment de l'ADNmt de 8636 paires de bases, des échantillons d'ADN de souris, l'amplification du génome mitochondrial de rat pratiquement dans son entier (15,4 kb) et le produit' CYP2D6 nucléaire de 5 kb d'ADN humain. Il est à noter qu'une amélioration de l'amplification par PCR . longue de ce dernier produit a également été observée lorsque la concentration en Mg2+ a été diminuée de 1 ,5 mM à 1 mM, indiquant que l'effet bénéfique de l'exonucléase III apparaît sur une large gamme de concentrations en Mg2+.
EXEMPLE 4 : L'exonucléase III améliore l'amplification par
PCR longue d'échantillons d'ADN irradiés aux rayonnements UV
Puisque l'exonucléase III peut réparer les lésions de l'ADN induites par les proches UV (Samma.rtano et Tuveson, 1983), les auteurs de l'invention ont évalué l'effet de l'exonucléase III sur l'amplification de PCR longue des fragments d'ADNmt de 8636 paire de bases avec des échantillons d'ADN de foie de souris soumis à des radiations de proche UV (365 nm). Là encore, l'exonucléase III a augmenté le rendement en produit de 8636 paires de bases alors qu'il n'y avait peu ou pas d'amplification en son absence.
EXEMPLE 5 : L'amélioration de l'amplification par PCR longue exercée par l'exonucléase III est largement résistante à une dénaturation de l'enzyme induite par la chaleur mais est détruite par 25 mM de CoCI2 : Dans une série d'expériences, les auteurs de l'invention ont cherché à inhiber l'effet bénéfique de l'exonucléase III sur l'amplification de la PCR longue des matrices d'ADN dépurinées (AP40). Préchauffer l'enzyme à 99°C pendant 30 minutes avant son addition à la réaction de PCR a échoué, indiquant que l'activité impliquée est thermostable. Une étude précédente indiquait que l'activité de réparation thermostable de l'exonucléase III était spécifiquement inhibée par une incubation prolongée de l'enzyme avec du C0CI2 (Bemelot-Moens et Demple, 1989). Les auteurs de l'invention ont donc préchauffé l'enzyme à 99°C pendant 30 minutes en présence de 1 ou 25 mM de CoCI2. Tandis que 1 mM de C0CI2 ont diminué légèrement l'amélioration de -PCR- longue exercée par l'exonucléase III, 25 mM de CoCI2 ont supprimé totalement celle-ci et l'amplification devenait alors similaire à celle observée sans exonuclease III. EXEMPLE 6 : L'exonucléase III améliore également l'amplification par PCR longue avec la polymerase rTth comme ADN polymerase unique Le système PCR GeneAmp XL (Perkin-Elmer) qui a été utilisé dans les expériences décrites précédemment est basé sur la combinaison de deux ADN polymérases, à savoir les ADN polymérases rTth et Vent. L'ADN polymerase Vent a une activité exonuclease 3'-5" (de relecture ou "proofreading"), qui apparaît essentielle pour une amplification efficace des cibles d'ADN longue. Les auteurs de la présente invention se sont demandés si l'exonucléase III pouvait améliorer la PCR effectuée avec l'ADN polymerase rTth seule, sans l'ADN polymerase Vent. Une amélioration croissante du rendement d'amplification du fragment de 8 636 paires de bases de l'ADNmt de souris a été observée lorsque l'on utilise (1) la rTth polymerase, (2) la rTth polymerase et l'exonucléase III, (3) la rTth polymerase et la Vent polymerase et enfin (4) ces deux ADN polymerase et l'exonucléase III.
EXEMPLE 7 : L'effet bénéfique de l'exonucléase III sur la PCR longue a été observé avec une autre combinaison d'ADN polymerase et cet effet est similaire lorsque l'exonucléase III provient de deux fournisseurs différents ;
Des systèmes de PCR longue autres que le système PCR GeneAmp XL (Perkin-Elmer) sont disponibles. L'effet de l'exonucléase III sur l'amplification de la PCR longue réalisée par le système Expand™ Long Template PCR (Roche Molecular Biochemicals), qui combine les polymérases Taq et Pwo a été évalué. Le protocole 1 b a été mis en œuvre avec différents types de matrices d'ADN de foie de souris altéré. L'exonucléase III (25 unités) a augmenté l'amplification à la fois des matrices d'ADN dépurinées (AP40) et des échantillons d'ADN extraits au phénol et conservés depuis plusieurs années. Les résultats obtenus sont similaires avec l'exonucléase III de New England Biolabs et de Life Technologies. Finalement, avec le système Expand Long Template PCR et le protocole 3 de PCR longue, l'exonucléase III a également permis l'amplification d'un fragment de PCR de 5 kb obtenu à partir du gène nucléaire CYP2D6 humain lorsqu'il était utilisé soit des échantillons d'ADN sanguin dénaturé à la chaleur, soit des échantillons d'ADN extraits au phénol et conservés depuis plusieurs années.
EXEMPLE 8 : Une autre AP-endonucléase de E. coli, l'endonucléase IV a peu d'effet sur l'amplification par PCR longue de matrices d'ADN altérées
Enfin, les auteurs de la présente invention ont également évalué l'effet de l'endonucléase IV, une autre AP-endonucléase majeure de E. coli, sur amplification par PCR longue de matrices d'ADN altérées. Dans ces expériences, l'endonucléase IV a été soit préincubée avec des échantillons d'ADN pendant 30 minutes à 37°C dans un tampon approprié, soit directement ajoutée à la réaction de PCR. Contrairement aux résultats obtenus avec l'exonucléase III, aucun effet bénéfique reproductible de l'endonucléase IV sur la PCR longue n'a pu être observé pour un échantillon donné d'ADN. (
CONCLUSION :
Les expériences ci-dessus montrent que l'exonucléase III de E. coli améliorent de manière surprenante l'amplification par PCR de longs fragments d'ADN plus ou moins endommagés. Cet effet bénéfique semble augmenter de manière proportionnelle à l'altération de l'ADN. Cet effet peut être observé soit avec des échantillons d'ADN soumis à différents traitements connus pour induire des sites AP et/ou des cassures des brins d'ADN (pH bas, chaleur, radiation dans le proche UV) soit avec des échantillons d'ADN conservés sur une longue durée. L'exonucléase III augmente l'amplification par PCR de séquences d'ADN de longueurs variables (5 à 15,4 kb) localisées dans le génome mitochondrial ou le génome nucléaire de différentes espèces animales. En outre, l'exonucléase III est efficace soit en association avec une ADN polymerase unique (à savoir l'ADN polymerase rTth) soit avec différentes combinaisons d'ADN polymérases (à savoir rTth + Vent ou Taq + Pwo). Il est aussi intéressant de noter que l'exonucléase III est efficace dans une large gamme de concentrations de Mg2+ (c'est-à-dire de 1 ,0 à 1 ,75 mM avec le système PCR GeneAmp XL et 2,25 mM avec le système PCR Expand™ Long Template). L'ensemble de ces données montre que l'exonucléase III peut être utilisée dans diverses conditions d'amplification par PCR de longs fragments d'ADN.
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Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d'une exonuclease III dans la mise en œuvre d'une réaction d'amplification par polymerase de fragments d'ADN, d'au moins
1 millier de bases environ.
2. Méthode d'amplification d'une matrice d'ADN d'au moins un millier de bases environ à l'aide d'au moins une polymerase, dans laquelle ladite matrice d'ADN est mise en contact avec une exonuclease III.
3. Méthode selon la revendication 2, dans laquelle l'amplification est une réaction en chaîne par polymerase (PCR).
4. Méthode selon l'une des revendications 2 ou 3, dans laquelle l'exonucléase III est préchauffée à au moins 70°C avant d'être mise en contact avec la matrice d'ADN.
5. Méthode selon l'une des revendications 2 à 4, dans laquelle l'exonucléase III est associée avec une seule ADN polymerase, telle que la rTth ADN polymerase.
6. Méthode selon l'une des revendications 2 à 4, dans laquelle l'exonucléase III est associée avec une combinaison de différentes ADN polymérases, telles qu'une combinaison des polymérases rTth et Vent, ou une combinaison des polymérases Taq et Pwo.
7. Méthode selon l'une des revendications 2 à 6, dans laquelle de 1 à 75 unités d'exonucléase III sont utilisées.
8. Méthode de détection de lésions sur un fragment d'ADN, comprenant les étapes consistant à : i) amplifier ledit fragment d'ADN au moyen d'une réaction en chaîne par polymerase (PCR) sans exonuclease III ; ii) amplifier ledit fragment d'ADN au moyen d'une réaction en chaîne par polymerase (PCR) en présence d'exonucléase III ; iii) comparer par quantification les produits d'amplification obtenus à l'étape (i) et à l'étape (ii), toute différence étant indicatrice de lésions dans le fragment d'ADN.
9. Méthode selon la revendication 8, dans laquelle ledit fragment d'ADN amplifié comprend au moins un millier de bases environ.
10. Méthode selon l'une des revendications 8 ou 9, comprenant préalablement aux étapes (i) à (iii), la mise en contact du fragment d'ADN avec une ADN glycosylase.
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