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WO2008059180A1 - Methodes de detection de microorganismes par pcr - Google Patents

Methodes de detection de microorganismes par pcr Download PDF

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Publication number
WO2008059180A1
WO2008059180A1 PCT/FR2007/052350 FR2007052350W WO2008059180A1 WO 2008059180 A1 WO2008059180 A1 WO 2008059180A1 FR 2007052350 W FR2007052350 W FR 2007052350W WO 2008059180 A1 WO2008059180 A1 WO 2008059180A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
sequence
oligonucleotide
pcr
seq
taken
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/FR2007/052350
Other languages
English (en)
Inventor
Valérie SCHREIBER
Nathalie Lemaitre
Frédéric Bois
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Air Liquide SA
Air Liquide Sante International SA
LAir Liquide SA pour lEtude et lExploitation des Procedes Georges Claude
Original Assignee
Air Liquide SA
Air Liquide Sante International SA
LAir Liquide SA pour lEtude et lExploitation des Procedes Georges Claude
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Air Liquide SA, Air Liquide Sante International SA, LAir Liquide SA pour lEtude et lExploitation des Procedes Georges Claude filed Critical Air Liquide SA
Publication of WO2008059180A1 publication Critical patent/WO2008059180A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae

Definitions

  • the invention relates to methods for detecting microorganisms (bacteria, yeasts and molds) by PCR.
  • the microbiological quality of the environment including food, pharmaceuticals, gases, and air in particular, is becoming a concern.
  • Many commercial devices that make it possible to control the microbiological quality of the ambient air according to various principles such as impaction on an agar medium, filtration, bubbling, etc. All these methods comprise an isolation step, a step of culture on a suitable medium and a step of counting microorganisms. Because of this culture step, the analysis time is long.
  • the sensitivity of the method depends on the culture medium used, the culture medium is not necessarily appropriate for all the microorganisms present in the sample taken.
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • All current PCR methods are very specific and only allow the detection of certain microorganisms present in a sample.
  • FR 2 811 321 which describes a method for detecting eubacterial species present in the blood by means of a method for amplifying a polymorphic zone. of 16S ribosomal PARN.
  • EP 1672081 describes a method for detecting the presence of 'Alicyclobacillus spp. in a sample that implements specific primers to amplify a region of the 16S ribosomal RNA coding gene characteristic of Alicyclobacillus spp.
  • One of the objectives of the present invention is to provide a method for detection of microorganisms that is rapid, sensitive and universal, that is to say capable of detecting and quantifying the total microbial flora present in a very small amount.
  • the inventors have developed two types of PCR primer pairs.
  • the first type of primer pairs amplifies in a virtually all prokaryotes a region of the 16S ribosomal PARN gene.
  • the second type of primer pairs amplifies in almost all yeasts and molds a region of the gene encoding 18S ribosomal PARN.
  • Using these two types of primer pairs it is possible to amplify a region of the ribosomal RNA coding gene of virtually all microorganisms.
  • Probes of the first type are able to hybridize with a region of the 16S ribosomal RNA gene from virtually all prokaryotes.
  • Probes of the second type are able to hybridize with a region of the 18S ribosomal RNA gene of virtually all yeasts and molds.
  • microorganisms we mean bacteria, yeasts and molds.
  • nucleotide is meant deoxyribonucleic acid and / or ribonucleic acid, but also non-natural nucleotides composed of 3 parts: a phosphate group or an equivalent, a sugar or equivalent and a nitrogenous base.
  • non-natural nucleotides mention may be made of the monomers
  • a first embodiment of the present invention is a primer for PCR comprising an oligonucleotide of at least 10 successive nucleotides taken from the sequence of SEQ ID No. 1 or the sequence complementary to the sequence of SEQ ID No. 1 or taken in a variant sequence of one of these two sequences comprising at most 3 mutations, wherein said oligonucleotide has a melting temperature (Tm) of between 50 ° C. and 70 ° C.
  • Tm melting temperature
  • a second embodiment of the present invention is a PCR primer comprising an oligonucleotide of at least 10 consecutive nucleotides selected from the sequence of SEQ ID N 2 0 or in the sequence complementary to the sequence of SEQ ID N 2 0 or taken in a variant sequence of one of these two sequences comprising at most 3 mutations, wherein said oligonucleotide has a melting temperature (Tm) of between 50 ° C. and 70 ° C.
  • Tm melting temperature
  • a third embodiment is a primer for PCR comprising an oligonucleotide of at least 10 successive nucleotides taken from the sequence of SEQ
  • a fourth embodiment is a PCR primer comprising an oligonucleotide of at least 10 consecutive nucleotides selected from the sequence complementary to the sequence SEQ ID N 0 3 or caught in a variant sequence of this having at most 3 mutations, wherein said oligonucleotide has a melting temperature (Tm) of between 50 ° C. and 70 ° C.
  • Tm melting temperature
  • a fifth embodiment is a primer for PCR comprising an oligonucleotide of at least 10 successive nucleotides taken from the sequence of SEQ ID No. 4 or the sequence complementary to the sequence of SEQ ID No. 4 or taken in a variant sequence one of these two sequences comprising at most 3 mutations, wherein said oligonucleotide has a melting temperature (Tm) of between 50 ° C. and 70 ° C.
  • Tm melting temperature
  • a sixth embodiment is a PCR primer comprising an oligonucleotide of at least 10 consecutive nucleotides selected from the sequence of SEQ ID NO: 5 or the sequence complementary to the sequence SEQ ID N 0 5 or caught in a variant sequence one of these two sequences comprising at most 3 mutations, wherein said oligonucleotide has a melting temperature (Tm) of between 50 ° C. and 70 ° C.
  • Tm melting temperature
  • a seventh embodiment is a PCR primer comprising an oligonucleotide at least 10 consecutive nucleotides selected from the sequence SEQ ID N 0 6 or caught in a variant thereof sequence having not more than 3 mutations, wherein said oligonucleotide has a melting temperature (Tm) of between 50 ° C. and 70 ° C.
  • Tm melting temperature
  • An eighth embodiment is a primer for PCR comprising an oligonucleotide of at least 10 successive nucleotides taken from the sequence complementary to the sequence of SEQ ID No. 6 or taken in a variant sequence thereof comprising at most 3 mutations, in which said oligonucleotide has a melting temperature (Tm) of between 50 ° C. and 70 ° C.
  • Tm melting temperature
  • said oligonucleotides of the first eight embodiments have a melting point of between 55 ° C. and 65 ° C., preferably between 57 ° C. and 62 ° C.
  • a ninth embodiment is a probe comprising an oligonucleotide of at least 10 successive nucleotides taken from the sequence of SEQ ID No. 3 or the sequence complementary to the sequence of SEQ ID No. 3 or taken from a variant sequence of one of these two sequences comprising at most 3 mutations, wherein said oligonucleotide has a melting temperature (Tm) of between 55 ° C. and 85 ° C.
  • Tm melting temperature
  • a tenth embodiment is a probe comprising an oligonucleotide of at least 10 successive nucleotides taken from the sequence of SEQ ID No. 6 or taken in a variant sequence thereof having at most 3 mutations, wherein said oligonucleotide has a Melting temperature (Tm) of between 55 ° C. and 85 ° C.
  • Tm Melting temperature
  • the probes according to the ninth embodiment are capable of hybridizing with a region of the 16S ribosomal RNA gene from virtually all prokaryotes.
  • the probes according to the tenth embodiment are capable of hybridizing with a region of the 18S ribosomal RNA gene from virtually all yeasts and molds.
  • said oligonucleotides of the ninth and tenth embodiments have a melting point of between 63 ° C. and 75 ° C., preferably between 66 ° C. and 72 ° C.
  • the oligonucleotides of the first ten embodiments will comprise at least 15 successive nucleotides taken respectively in one of the sequences of SEQ ID NO : 1 to 6 or in a sequence complementary to one of the sequences of SEQ ID Nos. 1 to 6, preferably at least 17 successive nucleotides and most particularly the oligonucleotides will respectively comprise all of one of the sequences of SEQ ID No. 1 to 6 or of a sequence complementary to one of the sequences of SEQ ID N 0 1 to 6.
  • a variant sequence of one of the sequences of SEQ ID N 0 1 to 6 or of a sequence complementary to one of the sequences of SEQ ID N 0 1 to 6, will comprise one or two mutations.
  • the melting temperature of an oligonucleotide those skilled in the art will use one of the following techniques:
  • the melting temperature can be determined using the calculation software: Primer Express Software 2.0 from Applied Biosystems according to the nearest neighbor calculation method (see Santa Lucia, J. (1998) Proc Nat Acad.
  • the melting temperature can be determined using the calculation software: Beacon Designer 6.0 (c) (Biosoft International Premier, 3786 Corina Way, PaIo Alto, CA 94303- 4504, USA). This latest software is based on the algorithm developed by IDT (Integrated DNA Technologies).
  • the melting temperature of the oligonucleotides may be determined according to the traditional physical method as described by Wickstrom et al. Biopolymers 1974, 13, 2367.
  • the method comprises the following steps, equimolar mixture of the oligonucleotide with its complementary sequence in a solution comprising a salt concentration of 50 mM.
  • the solution is heated up to 90 ° C. for 15 minutes and then cooled slowly to room temperature.
  • the temperature of the solution is then gradually increased (by 0.5 ° C. by measurement), the UV absorption at 260 nm is determined after each equilibration of the temperature.
  • the melting temperature of the oligonucleotide will be determined from the melting curve obtained (absorption at 260 nm as a function of temperature).
  • the melting temperature corresponds to the temperature at which the increase in absorbance corresponds to half of the maximum increase in absorbance.
  • the oligonucleotide will be considered to have a Tm included in a temperature range as defined in the different embodiments of the invention, provided that at least one of the results obtained falls within said temperature range.
  • oligonucleotides having the desired melting temperatures those skilled in the art may use one or more nucleotides other than deoxyribonucleic and ribonucleic acids.
  • the oligonucleotides may comprise one or more LNA monomers (see Singh et al., J Org Chem, 1998 Sep 4, 63 (18): 6078-6079 and Yong You et al., Nucleic Acids Research. , 2006, vol.34, No. 8 "Design of LNA probes that improve mismatch discrimination").
  • the LNA monomers are modified at the level of ribose by establishing a 2'-O, 4'-C-methylene ring bond.
  • a probe according to the invention may be adapted to real-time PCR, Taqman technology in particular.
  • Real-time PCR and Taqman technology are commonly used techniques, for review Poitras and Houde, Reviews in Biology and Biotechnology, Dec. 2002, 2 (2): 2-
  • a probe according to the invention will have a transmitter fluorochrome attached at its 5 'end and a suppressor fluorochrome attached at its end.
  • Examples of emitting and suppressing fluorochromes are: FAM, HEX,
  • TET TAMRA
  • JOE JOE
  • YAKIMA YELLOW CY3, CY5, ROX, QSY-7, Dabcyl, BHQ-1, BHQ-2, Eclipse® Dark Quencher.
  • the emitting fluorochrome is FAM or YAKIMA YELLOW and the acceptor fluorochrome is Eclipse® Dark Quencher.
  • the primers and / or the probes according to the invention may comprise at most 60, 50, 40 or 30 nucleotides.
  • a pair of primers comprising a primer according to the first embodiment and a primer according to the second embodiment makes it possible to amplify in a virtually all prokaryotes a region of the gene coding for 16S ribosomal RNA. It is the same for a pair of primers comprising a primer according to the first embodiment and a primer according to the fourth embodiment and for a pair of primers comprising a primer according to the third embodiment and a primer according to the second embodiment.
  • a pair of primers comprising a primer according to the fifth embodiment and a primer according to the sixth embodiment makes it possible to amplify in almost all the yeasts and molds a region of the gene encoding 18S ribosomal RNA. It is the same for a pair of primers comprising a primer according to the fifth embodiment and a primer according to the eighth embodiment and for a pair of primer comprising a primer according to the seventh embodiment and a primer according to the sixth embodiment. Using these two types of primer pairs, it is possible to amplify a region of the gene encoding the ribosomal RNA of virtually all microorganisms.
  • One embodiment of the invention is a method of detecting bacteria in a sample in which PCR is performed using a pair of primers described above for detecting bacteria.
  • Another embodiment of the invention is a method for detecting yeasts and / or molds in a sample in which a PCR is performed using a pair of primers described above for detecting yeasts and / or mold.
  • a person skilled in the art can use conventional PCR techniques. The revelation may be carried out on agarose or acrylamide gel or else by a capillary electrophoresis system.
  • Those skilled in the art may also use real-time PCR techniques.
  • the skilled person may use a probe.
  • the probe will have a higher melting temperature of 5 to 12 ° C, preferably 8 to 10 0 C at the lowest primer melting temperatures.
  • one skilled in the art will be able to use real-time PCR techniques that do not involve a probe. For example, it may use technology based on SYBR Green I.
  • Real-time PCR allows quantification of microorganisms present in a sample.
  • Yet another embodiment of the invention is a method for detecting bacteria, yeast and / or mold in a sample comprising two steps: a) the detection of bacteria according to the method as described above; and b) the detection of yeasts and / or molds according to the method as described above.
  • the two detection steps can be simultaneous or successive.
  • the sample taken can be divided into two fractions, a fraction for the detection of bacteria and the second fraction for the detection of yeasts and molds.
  • the same sample may be used for the detection of bacteria and yeasts and molds, in this case the skilled person will take care to choose for the probes fluorochromes compatible with each other, that is to say, not interfering between them.
  • the sample in which a detection method according to the invention is carried out may be obtained from samples taken in air, in a gas, in liquids (for example in water, on surfaces).
  • a detection method according to the invention can find an application in the following fields: hygiene, food, pharmacy, cosmetics, painting, control of disinfection processes, quality control, monitoring of industrial processes and production.
  • the sample in which a detection method according to the invention is carried out can be obtained by sampling from a gas or a gas mixture, in particular from air.
  • a process of impaction separation advantageously the process described in the international application published under the number WO 03 099418.
  • kits for this purpose To implement the above methods, the inventors have developed kits for this purpose.
  • Another embodiment of the invention is a PCR kit comprising a primer according to the first embodiment and a primer according to the second embodiment.
  • the kit will further include a probe according to the ninth embodiment.
  • the probe will have a higher melting temperature of 5 to 12 ° C, preferably 8 to 10 0 C at the lowest primer melting temperatures.
  • Another embodiment of the invention is a PCR kit comprising a primer according to the fifth embodiment and a primer according to the sixth embodiment.
  • the kit will further include a probe according to the tenth embodiment.
  • the probe will have a higher melting temperature of 5 to 12 ° C, preferably 8 to 10 0 C at the lowest primer melting temperatures.
  • Yet another embodiment of the invention is a PCR kit comprising four primers, i.e., a primer according to each of Embodiment 1, 2, 5 and 6.
  • the kit will further include two probes, namely one according to each of the ninth and tenth embodiments.
  • the probe according to the ninth embodiment will have a higher melting temperature of 5 to 12 ° C., preferably 8 to 10 ° C., at the lowest of the melting temperatures of the primers according to the first and second modes of fusion.
  • embodiment and the probe according to the tenth embodiment will have a higher melting temperature of 5 to 12 0 C, preferably 8 to 10 0 C at the lowest primer melting temperatures according to the fifth and sixth embodiments.
  • the following examples illustrate the present invention.
  • Primers and Probes Used The following primers were synthesized by chemical synthesis and used for the bacterial detection method: Bact-Forw: 5'-CTGGTAGTCCACGCCGTAAA-3 '(SEQ ID NO : 1) Bact-Rev: 5'-CGTTGCTTCGAATTAAACCACA -S '(SEQ ID NO: 2)
  • Bact-Probe 5'-GAATTGACGGGGRCCCGCACAA-S '(SEQ ID NO: 3)
  • This probe carries 5 'fluorochrome 6-FAM and 3' fluorochrome BHQ-I.
  • the following primers were used for the method of detection of yeasts and molds:
  • YM-Forw 5'-AAACTATGCCGACTAGRGAT-S '(SEQ ID NO: 7)
  • YM-Rev 5'-GTGGTGCCCTTCCGTCAATT-3' (SEQ ID NO: 5)
  • the following probe was used for the detection of yeast and mold bacteria: YM-Probe: 5'-CGCAAGGCTGAAACTTAAAG-3 '(SEQ ID NO: 8) This probe carries 5' fluorochrome 6-FAM and 3 ' In the above sequences, when the base is underlined (eg A), this indicates that it is an LNA monomer.
  • the oligonucleotides comprising the base R correspond to a mixture of two populations of oligonucleotides: for about 50% of the oligonucleotides, R corresponds to A and for the rest of the nucleotides, R corresponds to G.
  • UNG treatment 50.0 0 C for 2 minutes
  • DNA polymerase activation 95.0 ° C. for 10 minutes cycles: PCR (45 ⁇ ) step 1: 95.0 ° C. for 10 seconds step 2: 60.0 ° C. for 30 seconds
  • UNG treatment 50.0 0 C for 2 minutes
  • DNA polymerase activation 95.0 ° C. for 10 minutes cycles: PCR (45 ⁇ ) step 1: 95.0 ° C. for 10 seconds step 2: 60.0 ° C. for 30 seconds
  • Bertil Technologies' DNAzol® reagent SIGMA
  • Bertin Technologies Precellys® tube-homogenizer 24 were used.
  • the specificity of the primers and probes was tested using the following bacterial strains: Bacillus cereus, Bacillus cereus spores, Staphylococcus aureus subsp. Anaerobius, Sphingomonas sanguinis, Listeria monocytogenes, Clostridium perfringens, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Bacillus weihenstephanensis, Arthrobacter sp., Sphingomonas phyllosphaerae,
  • Staphylococcus aureus Micrococcus luteus, Bacillus subtilis, Bacillus macroides, as well as the following yeasts and molds: Aspergillus niger, Cladosporium herbarum, Candida albicans, Cryptococcus adeliensis, Penicillium sp., Cladosporium sp.
  • the detection limit of the bacterial detection method is 1 CFU (Unit

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Abstract

L'invention porte sur des méthodes de détection de la flore microbienne totale par PCR.

Description

METHODES DE DETECTION DE MICROORGANISMES PAR PCR
L'invention porte sur des méthodes de détection de microorganismes (bactéries, levures et moisissures) par PCR. La qualité microbiologique de l'environnement, celle des aliments, des produits pharmaceutiques, des gaz, et de l'air en particulier, devient un sujet de préoccupation. Il existe par exemple de nombreux appareils commerciaux qui permettent de contrôler la qualité microbiologique de l'air ambiant selon différents principes tels l'impaction sur milieu gélose, la filtration, le bullage... Toutes ces méthodes comprennent une étape d'isolement, une étape de culture sur un milieu approprié puis une étape de comptage des microorganismes. A cause de cette étape de culture, le temps d'analyse est long. De plus, la sensibilité de la méthode dépend du milieu de culture utilisé, le milieu de culture n'étant pas nécessairement approprié pour tous les microorganismes présents dans l'échantillon prélevé.
De nombreuses méthodes de détection de microorganismes existent. La PCR (la réaction de polymérisation en chaîne ou en anglais Polymerase Chain Reaction) est une technique qui est couramment utilisée pour détecter la présence de certains microorganismes dans un échantillon. Toutes les méthodes de PCR actuelles sont très spécifiques et permettent seulement la détection de certains microorganismes présents dans un échantillon. On peut citer à titre d'exemple la demande de brevet d'invention publiée sous le numéro FR 2 811 321 qui décrit une méthode de détection d'espèces eubactériennes présentes dans le sang à l'aide d'un procédé pour amplifier une zone polymorphique de PARN ribosomal 16S. La demande de brevet publiée sous le numéro EP 1 672 081 décrit une méthode pour détecter la présence d' 'Alicyclobacillus spp. dans un échantillon qui met en œuvre des amorces spécifiques pour amplifier une région du gène codant pour ARN ribosomal 16S caractéristique d'Alicyclobacillus spp.
Un des objectifs de la présente invention est de fournir une méthode de détection des microorganismes qui soit rapide, sensible et universelle, c'est-à-dire capable de détecter et de quantifier la flore microbienne totale présente en très faible quantité.
Pour ce faire, les inventeurs ont mis au point deux types de couples d'amorces pour PCR. Le premier type de couples d'amorces permet d'amplifier chez quasiment tous les procaryotes une région du gène codant PARN ribosomal 16S. Le deuxième type de couples d'amorces permet d'amplifier chez quasiment toutes les levures et moisissures une région du gène codant PARN ribosomal 18S. A l'aide de ces deux types de couples d'amorces, il est possible d'amplifier une région du gène codant TARN ribosomal de quasiment tous les microorganismes.
Les inventeurs ont également mis au point deux types de sondes. Les sondes du premier type sont capables de s'hybrider avec une région du gène codant l'ARN ribosomal 16S de quasiment tous les procary otes. Les sondes du deuxième type sont capables de s'hybrider avec une région du gène codant l'ARN ribosomal 18S de quasiment toutes les levures et moisissures.
Par microorganismes, on entend les bactéries, les levures et les moisissures.
Par nucléotide, on entend l'acide désoxyribonucléique et/ou l'acide ribonucléique, mais également des nucléotides non naturels composés de 3 parties: un groupement phosphate ou un équivalent, un sucre ou un équivalent et une base azotée. A titre d'exemple de nucléotides non naturels, on peut citer les monomères
LNA ou PNA (Peptide Nucleic Acids) (cf. Singh et al. J Org Chem. 1998 Sep
4;63(18):6078-6079; Yong You et al. Nucleic Acids Research, 2006, vol.34, n°8 « Design of LNA probes that improve mismatch discrimination » et A-Z of quantitative PCR - Stephen A. Bustin -IUL, California).
Un premier mode de réalisation de la présente invention est une amorce pour PCR comprenant un oligonucléotide d'au moins 10 nucléotides successifs pris dans la séquence de SEQ ID N° 1 ou dans la séquence complémentaire de la séquence de SEQ ID N° 1 ou pris dans une séquence variante d'une de ces deux séquences comportant au plus 3 mutations, dans laquelle ledit oligonucléotide présente une Température de fusion (Tm) comprise entre 500C et 7O0C.
Un deuxième mode de réalisation de la présente invention est une amorce pour PCR comprenant un oligonucléotide d'au moins 10 nucléotides successifs pris dans la séquence de SEQ ID N0 2 ou dans la séquence complémentaire de la séquence de SEQ ID N0 2 ou pris dans une séquence variante d'une de ces deux séquences comportant au plus 3 mutations, dans laquelle ledit oligonucléotide présente une Température de fusion (Tm) comprise entre 500C et 7O0C.
Un troisième mode de réalisation est une amorce pour PCR comprenant un oligonucléotide d'au moins 10 nucléotides successifs pris dans la séquence de SEQ
ID N° 3 ou pris dans une séquence variante de celle-ci comportant au plus 3 mutations, dans laquelle ledit oligonucléotide présente une Température de fusion
(Tm) comprise entre 500C et 700C.
Un quatrième mode de réalisation est une amorce pour PCR comprenant un oligonucléotide d'au moins 10 nucléotides successifs pris dans la séquence complémentaire de la séquence de SEQ ID N0 3 ou pris dans une séquence variante de celle-ci comportant au plus 3 mutations, dans laquelle ledit oligonucléotide présente une Température de fusion (Tm) comprise entre 5O0C et 7O0C.
Un cinquième mode de réalisation est une amorce pour PCR comprenant un oligonucléotide d'au moins 10 nucléotides successifs pris dans la séquence de SEQ ID N° 4 ou dans la séquence complémentaire de la séquence de SEQ ID N° 4 ou pris dans une séquence variante d'une de ces deux séquences comportant au plus 3 mutations, dans laquelle ledit oligonucléotide présente une Température de fusion (Tm) comprise entre 500C et 700C.
Un sixième mode de réalisation est une amorce pour PCR comprenant un oligonucléotide d'au moins 10 nucléotides successifs pris dans la séquence de SEQ ID N° 5 ou dans la séquence complémentaire de la séquence de SEQ ID N0 5 ou pris dans une séquence variante d'une de ces deux séquences comportant au plus 3 mutations, dans laquelle ledit oligonucléotide présente une Température de fusion (Tm) comprise entre 5O0C et 7O0C.
Un septième mode de réalisation est une amorce pour PCR comprenant un oligonucléotide d'au moins 10 nucléotides successifs pris dans la séquence de SEQ ID N0 6 ou pris dans une séquence variante de celle-ci comportant au plus 3 mutations, dans laquelle ledit oligonucléotide présente une Température de fusion (Tm) comprise entre 500C et 700C.
Un huitième mode de réalisation est une amorce pour PCR comprenant un oligonucléotide d'au moins 10 nucléotides successifs pris dans la séquence complémentaire de la séquence de SEQ ID N° 6 ou pris dans une séquence variante de celle-ci comportant au plus 3 mutations, dans laquelle ledit oligonucléotide présente une Température de fusion (Tm) comprise entre 5O0C et 700C.
Le tableau suivant présente les séquences 1 à 6 (R est A ou G):
Figure imgf000004_0001
Typiquement lesdits oligonuclétides des huit premiers modes de réalisation présentent une température de fusion comprise entre 55°C et 650C, préférentiellement comprise entre 57°C et 62°C. Un neuvième mode de réalisation est une sonde comprenant un oligonucléotide d'au moins 10 nucléotides successifs pris dans la séquence de SEQ ID N° 3 ou dans la séquence complémentaire de la séquence de SEQ ID N° 3 ou pris dans une séquence variante d'une de ces deux séquences comportant au plus 3 mutations, dans laquelle ledit oligonucléotide présente une Température de fusion (Tm) comprise entre 55°C et 85°C.
Un dixième mode de réalisation est une sonde comprenant un oligonucléotide d'au moins 10 nucléotides successifs pris dans la séquence de SEQ ID N° 6 ou pris dans une séquence variante de celle-ci comportant au plus 3 mutations, dans laquelle ledit oligonucléotide présente une Température de fusion (Tm) comprise entre 550C et 85°C.
Les sondes selon le neuvième mode de réalisation sont capables de s'hybrider avec une région du gène codant l'ARN ribosomal 16S de quasiment tous les procaryotes. Les sondes selon le dixième mode de réalisation sont capables de s'hybrider avec une région du gène codant l'ARN ribosomal 18S de quasiment toutes les levures et moisissures.
Typiquement lesdits oligonucléotides des neuvième et dixième modes de réalisation présentent une température de fusion comprise entre 63°C et 750C, préférentiellement comprise entre 66°C et 72°C. Typiquement les oligonucléotides des dix premiers modes de réalisation comprendront au moins 15 nucléotides successifs pris respectivement dans une des séquences de SEQ ID N0 1 à 6 ou dans une séquence complémentaire d'une des séquences de SEQ ID N° 1 à 6, de préférence au moins 17 nucléotides successifs et tout particulièrement les oligonucléotides comprendront respectivement la totalité d'une des séquences de SEQ ID N° 1 à 6 ou d'une séquence complémentaire d'une des séquences de SEQ ID N0 1 à 6.
Typiquement une séquence variante d'une des séquences de SEQ ID N0 1 à 6 ou d'une séquence complémentaire d'une des séquences de SEQ ID N0 1 à 6, comprendra une ou deux mutations. Pour déterminer la température de fusion d'un oligonucléotide, l'homme du métier utilisera l'une des techniques suivantes :
Si les oligonucléotides ne contiennent que des acides désoxyribonucléiques et/ou ribonucléiques, la température de fusion pourra être déterminée en utilisant le logiciel de calcul: Primer Express Software 2.0 de Applied Biosystems selon la méthode de calcul du plus proche voisin (cf. Santa Lucia, J. (1998) Proc. Nat. Acad.
ScL USA 95, 1460-1465). Si les oligonueléotides ne contiennent pas que des acides désoxyribonucléiques et/ou ribonucléiques, la température de fusion pourra être déterminée en utilisant le logiciel de calcul: Beacon Designer 6.0 (c) (Premier Biosoft International, 3786 Corina Way, PaIo Alto, CA 94303-4504, USA). Ce dernier logiciel est basé sur l'algorithme développé par IDT (Integrated DNA Technologies).
Pour toutes les méthodes de calcul, les calculs sont effectués pour une concentration en sel de 50 mM.
Alternativement, et quelle que soit la nature de l'oligonucléotide, la température de fusion des oligonueléotides pourra être déterminée selon la méthode physique traditionnelle telle que décrite par Wickstrom et al. Biopolymers 1974, 13, 2367. En résumé, la méthode comprend les étapes suivantes, mélange équimolaire de l'oligonucléotide avec sa séquence complémentaire dans une solution comprenant une concentration en sel de 50 mM. La solution est chauffée jusqu'à 900C pendant 15 minutes, puis refroidie lentement jusqu'à température ambiante. La température de la solution est ensuite augmentée graduellement (de 0,50C par mesure), l'absorption UV à 260 nm est déterminée après chaque équilibration de la température. La température de fusion de l'oligonucléotide sera déterminée à partir de la courbe de fusion obtenue (absorption à 260 nm en fonction de la température). La température de fusion correspond à la température pour laquelle l'augmentation de l'absorbance correspond à la moitié de l'augmentation maximale de l'absorbance.
Si ces différentes méthodes de détermination de la température de fusion conduisent à des résultats sensiblement différents, l'oligonucléotide sera considéré comme présentant un Tm compris dans une gamme de températures telle que définie dans les différents modes de réalisation de l'invention, dès lors qu'au moins l'un des résultats obtenus tombe dans ladite gamme de températures.
Afin d'obtenir des oligonueléotides présentant les températures de fusion souhaitées, l'homme du métier pourra utiliser un ou plusieurs nucléotides autres que les acides désoxyribonucléiques et ribonucléiques. En particulier il pourra utiliser la technologie LNA et les oligonueléotides pourront comprendre un ou plusieurs monomères LNA (cf. Singh et al. J Org Chem. 1998 Sep 4;63(18):6078-6079 et Yong You et al. Nucleic Acids Research, 2006, vol.34, n°8 « Design of LNA probes that improve mismatch discrimination »). Les monomères LNA sont modifiées au niveau du ribose par l'établissement d'une liaison cyclique 2'-O, 4'-C-methylène. Il existe également d'autres techniques pour modifier la température de fusion d'un oligonucléotide. On peut citer comme exemple : L'utilisation des PNA (Peptide Nucleic Acids) qui permettent d'augmenter le Tm de 0.5 à 2°C par nucléotide modifié ajouté (cf. A-Z of quantitative PCR - Stephen A. Bustin -IUL, California). Citons également les sondes Minor Groove Binding (MGB) sur lesquelles est fixée en 3' une macro molécule qui s'intègre dans le petit sillon de l'ADN et stabilise ainsi la structure (réf. Bio futur N°219 février 2002 « La PCR en temps réel »). Pour ce type de sondes l'augmentation maximale de Tm possible est d'environ 100C (cf. A-Z of quantitative PCR - Stephen A. Bustin -IUL, California).
Typiquement une sonde selon l'invention pourra être adaptée à la PCR en temps réel, à la technologie Taqman en particulier. La PCR en temps réel et la technologie Taqman sont des techniques couramment utilisées, on peut citer pour revue Poitras et Houde, Reviews in Biology and Biotechnology, Dec. 2002, 2(2) : 2-
11. Avantageusement, une sonde selon l'invention présentera un fluorochrome émetteur fixé à son extrémité 5 ' et un fluorochrome suppresseur fixé à son extrémité
3'. Des exemples de fluorochromes émetteurs et suppresseurs sont : FAM, HEX,
TET, TAMRA, JOE, YAKIMA YELLOW, CY3, CY5, ROX, QSY-7, Dabcyl, BHQ- 1 , BHQ-2, Eclipse® Dark Quencher.
Préférentiellement le fluorochrome émetteur est FAM ou YAKIMA YELLOW et le fluorochrome accepteur est Eclipse® Dark Quencher.
Typiquement les amorces et/ou les sondes selon l'invention pourront comprendre au plus 60, 50, 40 ou 30 nucléotides.
Couples d'amorces permettant de détecter les bactéries ;
Un couple d'amorces comprenant une amorce selon le premier mode de réalisation et une amorce selon le deuxième mode de réalisation permet d'amplifier chez quasiment tous les procaryotes une région du gène codant l'ARN ribosomal 16S. Il en est de même pour un couple d'amorces comprenant une amorce selon le premier mode de réalisation et une amorce selon le quatrième mode de réalisation et pour un couple d'amorces comprenant une amorce selon le troisième mode de réalisation et une amorce selon le deuxième mode de réalisation.
Couples d'amorces permettant de détecter les levures et/ou les moisissures : Un couple d'amorces comprenant une amorce selon le cinquième mode de réalisation et une amorce selon le sixième mode de réalisation permet d'amplifier chez quasiment toutes les levures et moisissures une région du gène codant l'ARN ribosomal 18S. Il en est de même pour un couple d'amorces comprenant une amorce selon le cinquième mode de réalisation et une amorce selon le huitième mode de réalisation et pour un couple d'amorces comprenant une amorce selon le septième mode de réalisation et une amorce selon le sixième mode de réalisation. A l'aide de ces deux types de couples d'amorces, il est possible d'amplifier une région du gène codant l'ARN ribosomal de quasiment tous les microorganismes.
Un mode de réalisation de l'invention est une méthode de détection de bactéries dans un échantillon dans laquelle on effectue une PCR en utilisant un couple d'amorces décrit ci-dessus permettant de détecter les bactéries.
Un autre mode de réalisation de l'invention est une méthode de détection de levures et/ou de moisissures dans un échantillon dans laquelle on effectue une PCR en utilisant un couple d'amorces décrit ci-dessus permettant de détecter les levures et/ou les moisissures. Pour mettre en œuvre les méthodes de détection selon l'invention, l'homme du métier pourra utiliser les techniques classiques de la PCR. La révélation pourra être effectuée sur gel agarose ou d'acrylamide ou encore par un système d'électrophorèse capillaire.
L'homme du métier pourra également utiliser les techniques de PCR en temps réel. L'homme du métier pourra utiliser une sonde. Avantageusement la sonde présentera une température de fusion supérieure de 5 à 12°C, préférentiellement de 8 à 100C à la plus basse des températures de fusion des amorces. Alternativement, l'homme du métier pourra utiliser les techniques de PCR en temps réel ne faisant pas intervenir de sonde. Il pourra par exemple utiliser la technologie basée sur le SYBR Green I.
La PCR en temps réel permet une quantification des microorganismes présents dans un échantillon.
Encore un mode de réalisation de l'invention est une méthode de détection de bactéries, de levures et/ou de moisissures dans un échantillon comprenant deux étapes : a) la détection de bactéries selon la méthode telle que décrite précédemment; et b) la détection de levures et/ou de moisissures selon la méthode telle que décrite précédemment. Les deux étapes de détection peuvent être simultanées ou successives.
Typiquement l'échantillon prélevé pourra être divisé en deux fractions, une fraction servant à la détection des bactéries et la seconde fraction à la détection des levures et moisissures. Alternativement le même échantillon pourra servir à la détection des bactéries et des levures et moisissures, dans ce cas l'homme du métier prendra soin de choisir pour les sondes des fluorochromes compatibles entre eux, c'est-à-dire n'interférant pas entre eux. Typiquement l'échantillon dans lequel est effectuée une méthode de détection selon l'invention pourra être obtenu à partir de prélèvements effectués dans l'air, dans un gaz, dans les liquides (par exemple dans l'eau, sur des surfaces).
Typiquement, une méthode de détection selon l'invention peut trouver une application dans les domaines suivants : l'hygiène, l'alimentaire, la pharmacie, la cosmétique, la peinture, le contrôle des procédés de désinfection, le contrôle qualité, le monitoring de procédés industriels et de production.
A titre d'exemple, l'échantillon dans lequel est effectuée une méthode de détection selon l'invention pourra être obtenu par prélèvement dans un gaz ou un mélange de gaz, en particulier dans l'air. Pour prélever les microorganismes présents dans le gaz ou le mélange de gaz, on pourra, par exemple, utiliser un procédé de séparation par impaction, avantageusement le procédé décrit dans la demande internationale publiée sous le numéro WO 03 099418.
Pour mettre en œuvre les méthodes ci-dessus, les inventeurs ont mis au point des trousses (kits) à cette fin.
C'est pourquoi un autre mode de réalisation de l'invention est une trousse pour PCR comprenant une amorce selon le premier mode de réalisation et une amorce selon le deuxième mode de réalisation.
Typiquement la trousse comprendra en outre une sonde selon le neuvième mode de réalisation. Avantageusement la sonde présentera une température de fusion supérieure de 5 à 12°C, préférentiellement de 8 à 100C à la plus basse des températures de fusion des amorces.
Un autre mode de réalisation de l'invention est une trousse pour PCR comprenant une amorce selon le cinquième mode de réalisation et une amorce selon le sixième mode de réalisation.
Typiquement la trousse comprendra en outre une sonde selon le dixième mode de réalisation. Avantageusement la sonde présentera une température de fusion supérieure de 5 à 12°C, préférentiellement de 8 à 100C à la plus basse des températures de fusion des amorces. Encore un autre mode de réalisation de l'invention est une trousse pour PCR comprenant quatre amorces, à savoir une amorce selon chacun des modes de réalisation 1, 2, 5 et 6.
Typiquement la trousse comprendra en outre deux sondes, à savoir une selon chacun des neuvième et dixième modes de réalisation. Avantageusement la sonde selon le neuvième mode de réalisation présentera une température de fusion supérieure de 5 à 120C, préférentiellement de 8 à 100C à la plus basse des températures de fusion des amorces selon le premier et le deuxième modes de réalisation et la sonde selon le dixième mode de réalisation présentera une température de fusion supérieure de 5 à 120C, préférentiellement de 8 à 1O0C à la plus basse des températures de fusion des amorces selon le cinquième et le sixième modes de réalisation. Les exemples qui suivent illustrent la présente invention.
Sauf si cela est indiqué autrement, pour réaliser les expériences de microbiologie et de biologie moléculaire, les techniques classiques ont été utilisées. Les références suivantes donnent une description de ces techniques :
• « La PCR en temps réel : principes et applications » (E. Poitras et A. Houde, Reviews in Biology and Biotechnology, Vol.2, N°2, Déc.2002, pp.2-11)
• « Quantification des acides nucléiques par PCR quantitative en temps réel » (C, Tse et J. Capeau, Ann. Biol. Clin., Vol.61, N°3, mai-juin 2003, pp.279- 293)
• Bio futur N°219 février 2002 « La PCR en temps réel » • « Molecular Biology Techniques Manual : PCR Primer Design and reaction optimisation» (Third Edition, 2001, Vernon E. Coyne et al, University of Cape Town, South Africa)
Amorces et sondes utilisées: Les amorces suivantes ont été synthétisées par synthèse chimique et utilisées pour la méthode de détection des bactéries : Bact-Forw : 5'-CTGGTAGTCCACGCCGTAAA-3' (SEQ ID N0I) Bact-Rev : 5'-CGTTGCTTCGAATTAAACCACA-S' (SEQ ID N°2)
La sonde suivante a été utilisée pour la détection des bactéries : Bact-Probe : 5'-GAATTGACGGGGRCCCGCACAA-S ' (SEQ ID N°3)
Cette sonde porte en 5' le fluorochrome 6-FAM et en 3' le fluorochrome BHQ-I. Les amorces suivantes ont été utilisées pour la méthode de détection des levures et des moisissures :
YM-Forw: 5'-AAACTATGCCGACTAGRGAT-S' (SEQ ID N°7) YM-Rev: 5'-GTGGTGCCCTTCCGTCAATT-3' (SEQ ID N°5)
La sonde suivante a été utilisée pour la détection des bactéries des levures et des moisissures : YM-Probe : 5'-CGCAAGGCTGAAACTTAAAG-3' (SEQ ID N°8) Cette sonde porte en 5' le fluorochrome 6-FAM et en 3' le fluorochrome BHQ- 1. Dans les séquences ci-dessus, lorsque la base est soulignée (par exemple A), cela indique qu'il s'agit d'un monomère LNA. Les oligonucléotides comprenant la base R correspondent à un mélange de deux populations d'oligonucléotides : pour environ 50% des oligonucléotides, R correspond à A et pour le reste des nucléotides, R correspond à G.
PCR en temps réel
Les conditions suivantes ont été utilisées pour effectuer les PCR en temps réel :
*** Pour Ia détection des bactéries :
> Composition du PCR mix
Figure imgf000011_0001
> Le profil en température de la PCR :
Traitement UNG (étape optionnelle) 50,00C pendant 2 minutes
Activation ADN polymérase: 95,00C pendant 10 minutes cycles: PCR (45X) étape 1: 95,00C pendant 10 secondes étape 2: 60,00C pendant 30 secondes
*> Pour Ia détection des levures et des moisissures :
>• Composition du PCR mix
Figure imgf000011_0002
> Le profil en température de la PCR :
Traitement UNG (étape optionnelle) 50,00C pendant 2 minutes
Activation ADN polymérase: 95,00C pendant 10 minutes cycles: PCR (45X) étape 1 : 95,00C pendant 10 secondes étape 2: 60,00C pendant 30 secondes
Les expériences ont été réalisées sur un appareil IQ cycler de BioRad en suivant les recommandations du constructeur. Une attention toute particulière a été portée aux réactifs utilisés afin de réduire le plus possible toute contamination par de l'ADN de microorganismes (bactéries, levures et moisissures). Extraction de l'ADN
Pour extraire l'ADN des microorganismes, le réactif DNAzol® (SIGMA) ainsi que broyeur-homogénéiseur 24 tube Precellys® de Bertin Technologies ont été utilisés.
Spécificités des amorces et des sondes
La spécificité des amorces et des sondes a été testée en utilisant les souches de bactéries suivantes : Bacillus cereus, spores de Bacillus cereus, Staphylococcus aureus subsp. anaerobius, Sphingomonas sanguinis, Listeria monocytogenes, Clostridium perfringens, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Bacillus weihenstephanensis, Arthrobacter sp., Sphingomonas phyllosphaerae,
Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus, Bacillus subtïlis, Bacillus macroides, ainsi que les levures et moisissures suivantes : Aspergillus niger, Cladosporium herbarum, Candida albicans, Cryptococcus adeliensis, Pénicillium sp., Cladosporium sp..
Les deux méthodes de détection sont complémentaires. Toutes les bactéries testées ont été détectées par la méthode de détection des bactéries, aucune des levures/moisissures testées n'a été détectée. Toutes les levures/moisissures testées ont été détectées par la méthode de détection des levures/moisissures, aucune des bactéries testées n'a été détectée.
Sensibilité des méthodes de détection
Pour déterminer la limite de détection de la méthode de détection des bactéries, les souches suivantes ont été testées : Bacillus weihenstephanensis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa et spores de Bacillus cereus. Pour toutes les bactéries testées, la limite de détection est 1 UFC (Unité
Formant Colonie). Pour déterminer la limite de détection de la méthode de détection des levures et/ou moisissures, les souches suivantes ont été testées : Aspergillus niger, Candida albicans. Pour toutes les levures/moisissures testées, la limite de détection est 1 UFC (Unité Formant Colonie).

Claims

REVENDICATIONS
1. Trousse pour PCR comprenant :
-une amorce pour PCR comprenant un oligonucléotide d'au moins 10 nucléotides successifs pris dans la séquence de SEQ ID N0 1 ou pris dans une séquence variante de celle-ci comportant au plus 3 mutations, dans laquelle ledit oligonucléotide présente une Température de fusion (Tm) comprise entre 5O0C et 700C ; et
-une amorce pour PCR comprenant un oligonucléotide d'au moins 10 nucléotides successifs pris dans la séquence de SEQ ID N0 2 ou pris dans une séquence variante de celle-ci comportant au plus 3 mutations, dans laquelle ledit oligonucléotide présente une Température de fusion (Tm) comprise entre 5O0C et 7O0C.
2. Trousse pour PCR comprenant : a) -une amorce pour PCR comprenant un oligonucléotide d'au moins 10 nucléotides successifs pris dans la séquence de SEQ ID N0 1 ou pris dans une séquence variante de celle-ci comportant au plus 3 mutations, dans laquelle ledit oligonucléotide présente une Température de fusion (Tm) comprise entre 5O0C et 7O0C ; et
-une amorce pour PCR comprenant un oligonucléotide d'au moins 10 nucléotides successifs pris dans la séquence complémentaire de la séquence de SEQ ID N° 3 ou pris dans une séquence variante de celle-ci comportant au plus 3 mutations, dans laquelle ledit oligonucléotide présente une Température de fusion (Tm) comprise entre 5O0C et 700C; ou bien b) -une amorce pour PCR comprenant un oligonucléotide d'au moins 10 nucléotides successifs pris dans la séquence de SEQ ID N° 3 ou pris dans une séquence variante de celle-ci comportant au plus 3 mutations, dans laquelle ledit oligonucléotide présente une Température de fusion (Tm) comprise entre 500C et 700C ; et
-une amorce pour PCR comprenant un oligonucléotide d'au moins 10 nucléotides successifs pris dans la séquence de SEQ ID N° 2 ou pris dans une séquence variante de celle-ci comportant au plus 3 mutations, dans laquelle ledit oligonucléotide présente une Température de fusion (Tm) comprise entre 500C et 7O0C.
3. Trousse pour PCR selon la revendication 1 comprenant en outre une sonde comprenant un oligonucléotide d'au moins 10 nucléotides successifs pris dans la séquence de SEQ ID N° 3 ou dans la séquence complémentaire de la séquence de SEQ ID N° 3 ou pris dans une séquence variante d'une de ces deux séquences comportant au plus 3 mutations, dans laquelle ledit oligonucléotide présente une Température de fusion (Tm) comprise entre 55°C et 85°C.
4. Trousse pour PCR comprenant :
-une amorce pour PCR comprenant un oligonucléotide d'au moins 10 nucléotides successifs pris dans la séquence de SEQ ID N0 4 ou pris dans une séquence variante de celle-ci comportant au plus 3 mutations, dans laquelle ledit oligonucléotide présente une Température de fusion (Tm) comprise entre 500C et 7O0C ; et
-une amorce pour PCR comprenant un oligonucléotide d'au moins 10 nucléotides successifs pris dans la séquence de SEQ ID N° 5 ou pris dans une séquence variante de celle-ci comportant au plus 3 mutations, dans laquelle ledit oligonucléotide présente une Température de fusion (Tm) comprise entre 500C et 7O0C.
5. Trousse pour PCR comprenant : a) -une amorce pour PCR comprenant un oligonucléotide d'au moins 10 nucléotides successifs pris dans la séquence de SEQ ID N° 4 ou pris dans une séquence variante de celle-ci comportant au plus 3 mutations, dans laquelle ledit oligonucléotide présente une Température de fusion (Tm) comprise entre 500C et 700C ; et
-une amorce pour PCR comprenant un oligonucléotide d'au moins 10 nucléotides successifs pris dans la séquence complémentaire de la séquence de SEQ ID N° 6 ou pris dans une séquence variante de celle-ci comportant au plus 3 mutations, dans laquelle ledit oligonucléotide présente une Température de fusion (Tm) comprise entre 5O0C et 700C ; ou bien b) -une amorce pour PCR comprenant un oligonucléotide d'au moins 10 nucléotides successifs pris dans la séquence de SEQ ID N0 6 ou pris dans une séquence variante de celle-ci comportant au plus 3 mutations, dans laquelle ledit oligonucléotide présente une Température de fusion (Tm) comprise entre 500C et 700C ; et
-une amorce pour PCR comprenant un oligonucléotide d'au moins 10 nucléotides successifs pris dans la séquence de SEQ ID N° 5 ou pris dans une séquence variante de celle-ci comportant au plus 3 mutations, dans laquelle ledit oligonucléotide présente une Température de fusion (Tm) comprise entre 5O0C et 700C.
6. Trousse pour PCR selon la revendication 4 comprenant en outre une sonde comprenant un oligonucléotide d'au moins 10 nucléotides successifs pris dans la séquence de SEQ ID N° 6 ou dans la séquence complémentaire de la séquence de SEQ ID N0 6 ou pris dans une séquence variante d'une de ces deux séquences comportant au plus 3 mutations, dans laquelle ledit oligonucléotide présente une Température de fusion (Tm) comprise entre 55°C et 85°C.
7. Trousse pour PCR comprenant un couple d'amorces tel que défini à la revendication 1 et un couple d'amorces tel que défini à la revendication 4.
8. Trousse pour PCR selon la revendication 7 comprenant en outre une sonde telle que définie à la revendication 3 et une sonde telle que définie à la revendication 6.
9. Trousse pour PCR comprenant une trousse selon la revendication 2 et une trousse selon la revendication 5.
10. Trousse selon l'une quelconque des revendications 3, 6 ou 8 comprenant une sonde présentant un fluorochrome émetteur fixé à son extrémité 5' et un fluorochrome suppresseur fixé à son extrémité 3'.
11. Trousse selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, comprenant une ou plusieurs amorces ou sondes présentant un ou plusieurs nucléotides rigidifiés par une liaison cyclique 2'-O, 4'-C-méthylène.
12. Méthode de détection de bactéries dans un échantillon dans laquelle on effectue une PCR en utilisant une trousse selon la revendication 1.
13. Méthode de détection de bactéries dans un échantillon dans laquelle on effectue une PCR en utilisant une trousse selon la revendication 2.
14. Méthode de détection de bactéries selon la revendication 12 dans laquelle il s'agit d'une PCR en temps réel utilisant une sonde comprenant un oligonucléotide d'au moins 10 nucléotides successifs pris dans la séquence de SEQ ID N° 3 ou dans la séquence complémentaire de la séquence de SEQ ID N0 3 ou pris dans une séquence variante d'une de ces deux séquences comportant au plus 3 mutations, dans laquelle ledit oligonucléotide présente une Température de fusion (Tm) comprise entre 550C et 85°C.
15. Méthode de détection de levures et/ou de moisissures dans un échantillon dans laquelle on effectue une PCR en utilisant une trousse selon la revendication 4.
16. Méthode de détection de levures et/ou de moisissures dans un échantillon dans laquelle on effectue une PCR en utilisant une trousse selon la revendication 5.
17. Méthode de détection de levures et/ou de moisissures selon la revendication 15 dans laquelle il s'agit d'une PCR en temps réel utilisant une sonde comprenant un oligonucléotide d'au moins 10 nucléotides successifs pris dans la séquence de SEQ ID N0 6 ou dans la séquence complémentaire de la séquence de SEQ ID N° 6 ou pris dans une séquence variante d'une de ces deux séquences comportant au plus 3 mutations, dans laquelle ledit oligonucléotide présente une Température de fusion (Tm) comprise entre 550C et 85°C.
18. Méthode de détection de bactéries, de levures et/ou de moisissure dans un échantillon comprenant deux étapes : a) la détection de bactéries selon la méthode de l'une quelconque des revendications 12 à 14 ; et b) la détection de levures et/ou de moisissures selon la méthode de l'une quelconque des revendications 15 à 17.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2723903A4 (fr) * 2011-06-27 2015-02-18 Gen Mills Inc Détection et quantification des bactéries produisant de l'acide lactique dans les produits alimentaires

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001048237A2 (fr) * 1999-12-23 2001-07-05 Andreas Hoeft Procede de determination rapide de dns/rns microbiens, kit y relatif et utilisation du procede
WO2001057055A2 (fr) * 2000-01-31 2001-08-09 GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit GmbH Oligonucleotides permettant l'amplification specifique et la detection specifique de genes d'arnr 16s de bacteries
US20030082535A1 (en) * 1996-05-01 2003-05-01 James Leushner Method, compositions and kit for detection of microorganisms and bi-directional sequencing of nucleic acid polymers

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030082535A1 (en) * 1996-05-01 2003-05-01 James Leushner Method, compositions and kit for detection of microorganisms and bi-directional sequencing of nucleic acid polymers
WO2001048237A2 (fr) * 1999-12-23 2001-07-05 Andreas Hoeft Procede de determination rapide de dns/rns microbiens, kit y relatif et utilisation du procede
WO2001057055A2 (fr) * 2000-01-31 2001-08-09 GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit GmbH Oligonucleotides permettant l'amplification specifique et la detection specifique de genes d'arnr 16s de bacteries

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE EMBL [online] 26 May 1999 (1999-05-26), "Artificial oligonucleotide primer sequence (18SDOWN) for Cymbidium 18S rDNA PCR analysis", XP002437962, retrieved from EBI accession no. EMBL:AJ242598 Database accession no. AJ242598 *
DATABASE Geneseq [online] 13 September 2001 (2001-09-13), "Bacterial and fungal 16S rRNA detecting PCR primer AR4.", XP002437958, retrieved from EBI accession no. GSN:AAH21206 Database accession no. AAH21206 *
DATABASE Geneseq [online] 13 September 2001 (2001-09-13), "Fungal 16S rRNA reverse primer PFU2.", XP002437960, retrieved from EBI accession no. GSN:AAH21196 Database accession no. AAH21196 *
DATABASE Geneseq [online] 19 October 2001 (2001-10-19), "E. coli 16S rRNA probe.", XP002437959, retrieved from EBI accession no. GSN:AAH48697 Database accession no. AAH48697 *
DATABASE Geneseq [online] 30 August 2002 (2002-08-30), "Candida 18S rRNA gene PCR primer SEQ ID NO: 9.", XP002437961, retrieved from EBI accession no. GSN:AAL47004 Database accession no. AAL47004 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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