WO2000031292A1

WO2000031292A1 - Method for counting living cells

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Publication number: WO2000031292A1
Application number: PCT/JP1999/006582
Authority: WO
Inventors: Noriaki Hattori; Yasuhiro Harada; Keiko Yajitate; Seiji Murakami
Original assignee: Kikkoman Corp
Current assignee: Kikkoman Corp
Priority date: 1998-11-25
Filing date: 1999-11-25
Publication date: 2000-06-02
Anticipated expiration: 2001-05-25
Also published as: EP1134291A1; JP2000157295A; AU1409700A

Description

生細胞数の測定方法技術分野

本発明は、試料中に含まれる生細胞数を迅速かつ高感度に測定する方法、測定試薬キットおよび生細胞数測定装置に関する。明

背景技術

各種工業分野、臨床医学、基礎研究等田の現場では、試料液中の生細胞数の測定が広く行なわれている。特に、食品工業、医薬品工業および化粧品工業などの分野では、使用する工業水、原料、中間体あるいは製品中の微生物を含めた生細胞数の管理が極めて重要である。この場合、生細胞数の測定においては、正確さが要求されることは言うまでもないが、この正確さはオーダーレベルで十分である場合が多く、それ以上の完全な細胞数を把握することよりも、むしろ測定の迅速性が要求されることが多い。

従来、試料中の生細胞数の測定には、試料をそのまま、あるいは簡易なフィル夕一上に生細胞を補足した後、試料中の生細胞を標準寒天培地で長時間培養し、コロニーを検出するいわゆる平板培養法が一般に行なわれている（「食品衛生検查指針一微生物編」厚生省生活衛生局監修（1990) p. 70〜77) 。また、試料中に含まれる生細胞数を測定する別の方法として最確数法（M P N法、菌数限度試験法とも言う）が知られており、現在、日本においては、医薬、化粧品等の品質検查の公定法として採用されている（第十三改正日本薬局方解説書、廣川書店刊 (1996) p. B-403〜421) 。最確数法とは、試料を順次段階希釈し、各希釈液の一定量を液体培地に接種した後、長時間培養し、濁度により生細胞の生育の有無を判定し、統計学的確立論に基づいて、試料中の生細胞数を最確数として求める方法である。最近では、ルシフェリン—ルシフェラーゼ反応を用いる発光反応を利用して生細胞数を測定する方法が用いられている（De Luca, M. & McEl roy, W. D. (1 978) Me thods Enzymol. 57, 3-15 ; St an l ey, P. E. (1986) Me thods Enzymol. 133, 14-22等）。

平板培養法は、寒天培地などの固形平板培地上に試料を塗布し、 2日〜 7日間ほど培養したのち、平板培地上に生育するコロニーを数え、生細胞数を測定する方法で、迅速に測定できないと言う欠点を有していた。また、最確数法は、生細胞の生育の有無を濁度測定により判定するため、長期の培養時間を必要とする欠点を有する。

ルシフェリンールシフェラーゼ発光反応を利用して生細胞数を測定する方法は、生細胞より ATPを抽出し、抽出した ATPをルシフェリン—ルシフェラーゼ発光反応を用いて発光させ、その発光量から AT P量を求め、得られた ATP量と生細胞当たりの AT P量から生細胞数を算出する方法である。

ルシフェリンールシフェラーゼ発光反応を利用した生物発光試薬による生細胞数測定の例として、ルシフェール 250プラス（キッコーマン（株）製）を用いて作成した、発光量から Escherichia col iの菌数を求める検量線を図 1に示した。図 1より明らかなように、 Escherichia col iの検出下限は 1 0³ C FU (生細胞数の単位） Zm lである。また、細菌の場合、細菌 1菌体当たりの AT P含量は、ほぼ一定であることが報告〔小高ら、日本食品微生物学会誌、 1 3、 29- 34、 ( 1996 ) ] されていることから、細菌一般についても、生物発光法を用いて測定するとき、前記検量線、図 1から、生細胞数を求めることができるが、この場合の検出下限も 1 0³ CFUZm lである。すなわち、上記方法を用いるとき、この検出下限以下の生細胞数を測定することは、原理的に不可能であるという問題があった。

更に、上記方法を用いて生細胞数を測定する場合、試料中に含まれる生細胞内 AT P以外の AT P (バックグラウンド AT Pという）力多量に存在すると、生細胞内の AT Pがバックグラウンド AT Pに埋もれてしまい、検出感度が低下するという問題があった。バックグラウンド AT Pを分解する方法として、 AT P分解酵素を有効成分どする試薬を用いる方法があるが、この方法では、 ATP の分解が不十分な場合が多く、問題を解決することはできない。

検出下限以下の試料ゃバックグラウンド ATPを多量に含む試料への対処法として、短時間培養して検出可能な生細胞数まで増殖させる方法がある。しかし、この方法では、生細胞の検出は可能であるが、試料中の生細胞数を測定することはできない。

本発明の目的は、試料中に含まれる生細胞数を正確に、且つ短時間で測定する方法、その測定方法に用いるための測定試薬キット、および上記測定方法を実施するための生細胞数測定装置を提供することである。発明の開示

本発明者らは、上記課題を解決すべく種々検討した結果、試料を生細胞増殖用培地で順次段階希釈した後、培養処理し、該培養処理希釈物中の生細胞の有無をルシフェリンールシフェラーゼ発光反応を用いて判定することにより、試料中に含まれる生細胞数を正確に且つ短時間で測定できることを見いだし、本発明を完成した。

即ち、本発明は、以下（ 1) 〜（7) を提供する。

(1) 以下の工程（i) 〜（iv) ：

(1) 試料を希釈溶液を用いて順次段階希釈する第 1工程、

(ii) 第 1工程で得られた各希釈物を培養処理する第 2工程、

(iii) 第 2工程で得られた培養処理した希釈物中の生細胞内 A T Pを測定する第 3工程、及び

(iv) 第 3工程で得られた生細胞内 ATPの測定結果に基づいて、試料中の生細胞数を算出する第 4工程、

を含むことを特徴とする、試料中の生細胞数の測定方法。

(2) 前記第 1工程で用いる希釈溶液が、生細胞増殖用培地であることを特徴とする上記（1) に記載の生細胞数の測定方法。

(3) 前記第 1工程で用いる希釈溶液が、 AT Pを分解した生細胞増殖用培地であることを特徴とする上記（ 1) に記載の生細胞数の測定方法。

(4) 前記第 2工程において、培養処理中又は培養処理後に、希釈物中の生細胞内 AT P以外の AT Pを分解することを特徴とする上記（ 1) に記載の生細胞数の測定方法。

(5) 前記第 3工程における生細胞内 AT Pの測定が、ルシフェリン—ルシフエラーゼ発光反応を利用するものである、上記（1) に記載の生細胞数の測定方法

(6) 上記（1) に記載の生細胞数の測定方法に用いる測定試薬キットであって、以下（a) 〜（c) ：

(a) 希釈溶液、

(b) ATP抽出試薬、及び

(c) AT P測定試薬、

を含む測定試薬キット。

(7) 上記（1) に記載の生細胞数の測定方法に用いる生細胞測定装置であって、試料希釈装置、増殖用培養装置および AT P測定装置を備える生細胞数測定装置。

(8) 上記 AT P測定装置が、ルシフェリンールシフェラーゼ発光反応による発光量の測定装置である、上記（7) に記載の生細胞数測定装置。尚、本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願平成 1 0年特許願第 333979号の明細書および Zまたは図面に記載される内容を包含する。図面の簡単な説明

図 1は、従来の技術に記載した検量線、および実施例 1、 2および 3の対照法 2において用いた検量線を示す図である。発明を実施するための形態

本明細書において、「生細胞」とは、増殖能を有する細胞を言い、特に限定されない。例えば、動物細胞、植物細胞、微生物（細菌、酵母糸状菌など）などが挙げられ、本発明に係る測定方法の使用される目的等に応じて選ばれ、 1種類の生細胞であっても、あるいは 2種以上の生細胞の混合物であっても良い。「試料」としては、上記の生細胞を含む可能性があると考えられるものであれば、いかなるものでもよく、例えば、飲食物、医薬品、化粧品、海水、河川水、工業用水、下水、土壌、尿、糞便、血液、喀痰、濃汁、生細胞の培養物等が挙げられ、液体の形態で測定に用いられる。試料が固形分を含む場合や、粘性を有する場合には、該試料を適当な溶媒に懸濁し、溶液状の試料とすることが望ましい。溶媒としては、例えば、蒸留水、生理的食塩水、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液等が挙げられる。

本発明の第 1工程では、得られた試料を希釈溶液を用いて、順次段階希釈を行なう。希釈溶液としては、例えば、上記生細胞の増殖用培地の他、蒸留水、生理的食塩水、リン酸緩衝液、卜リス緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液等が挙げられるが、特に前記測定対象となる生細胞増殖用培地が好適に用いられる。本発明で言う「生細胞増殖用培地」とは、生細胞の増殖、発育を可能とする溶液であって、生細胞の増殖、発育に必要な栄養成分を含む溶液のことである。本発明に用いる生細胞増殖用培地として、特に限定はされないが、対象となる生細胞にとって好適な増殖用培地を選ぶことができる。当業者であれば、対象となる生細胞が特定されれば、好適な増殖用培地を選ぶことは容易であるが、例えば、動物細胞の増殖用培地として、ダルベッコ M E M培地、細菌の増殖用培地として、普通ブイョン培地、酵母の増殖用培地として、ブドウ糖ペプトン培地等が挙げられる。順次段階希釈とは、希釈溶液を用いて試料を希釈し、第 1段階の希釈物を得、次に、同様に、希釈溶液を用いて、得られた第 1段階の希釈物を希釈し、第 2段階の希釈物を得、このようにして順次段階的に希釈を行なうことである。順次段階希釈により、希釈倍率を挙げてゆくことができ、更に、任意の希釈倍率を自由に選択することもできる。順次段階希釈の希釈倍率は限定されるものではないが、希釈倍率が高すぎる場合には正確さに劣るようになり、一方希釈倍率が低すぎる場合には、後の工程で処理すべき希釈物が多くなるため好ましくない。オーダ一レベルの正確さが要求される本発明に係る測定方法においては、生細胞数算出工程が煩雑にならないことも考慮すれば、 1 0倍単位の順次段階希釈が好ましい。この場合、例えば、試料 1部に対して、希釈溶液 9部を合わせ、 1 0倍希釈物を得る。以下、順次段階希釈により、 1 0 0倍、 1 0 0 0倍と、 1 0倍単位の希釈倍率の希釈物を得ることができる。

本発明の第 2工程では、第 1工程で得られた各希釈物を培養処理する。本発明で言う「培養処理」とは、生細胞増殖用培地を用いて、温度、酸素濃度、時間などの外部条件を制御しながら、生細胞を人工的に増殖させることを言う。培養処理に適した外部条件は、生細胞及び生細胞増殖用培地が特定されれば、当業者が容易に決定できるものであるが、例えば、細菌の場合、試験管に分注された生細胞増殖用培地で希釈された細菌を含む希釈物を、 3 0 °C、 6時間、 1 0 0 r p m で振盪培養するのが好ましい。対象となる生細胞により、培養温度は 5〜 8 O t: 、振盪条件は静置培養〜 5 0 0 r p mの振盪培養、培養時間は 1〜 1 2 0時間の範囲で培養処理条件を適宜選択することができる。

本発明では、生細胞内に含まれる A T P量に基づいて生細胞の有無を判定するため、希釈物中に含まれるバックグラウンド A T Pは、検出感度の低下を引き起こす。そのため、生細胞内 A T Pの抽出に先立ち、希釈溶液および希釈物中又は培養処理した希釈物中のバックグラウンド A T Pを分解することが望ましい。バックグラウンド A T Pを分解する方法としては、 A T P分解酵素を有効成分とする試薬（以下、 A T P消去剤という）を用いる方法が例示される。 A T P分解酵素としては、例えば、アデノシンリン酸デァミナ—ゼ、アビラーゼ、アルカリホスファ夕ーゼ、酸性ホスファターゼ、へキソキナーゼ、ホスホジエステラーゼ等が挙げられる。これらの酵素は、単独又は 2種類以上を組み合わせて使用できる。バックグラウンド A T Pを分解した後は、希釈物中の A T P消去剤を除去あるいは失活させることが望ましい。 A T P消去剤は、該消去剤の阻害剤、例えば、アデノシンリン酸デアミナ一ゼにはコホルマイシンを、アル力リホスファタ一ゼにはァクチノマイシン Dを、へキソキナーゼにはキシ口一スを、ホスホジエステラ一ゼにはキサンチン等を作用させることにより失活させることもできる。また、阻害剤以外に、適当な物理的条件（加熱、 p H、イオン強度）下で失活させることもできる。

本発明において、バックグラウンド A T Pを分解する方法としては、第 1工程に用いる希釈溶液として、前もって A T P消去剤により A T Pを分解した希釈溶液を用いる方法や第 2工程の培養処理中又は培養処理後に A T P消去剤を用いてバックグラウンド A T Pを分解する方法が用いられ、これらを併用しても良い。本発明において、更に検出感度を上げる方法として、フィルターを用いて集菌する方法を組み合わせても良い。例えば、第 1工程で得られた各希釈物をフィル夕一濾過して集菌した後、第 2工程の培養処理を行なう方法や第 2工程で得られた培養処理した各希釈物をフィルター濾過して集菌した後、第 3工程の生細胞内 A T Pの測定を行なう方法などがある。

本発明の第 3工程である、生細胞内 A T Pを測定するためには、先ず、培養処理した希釈物または適量に分取された該希釈物の一部に含まれる生細胞内の A T Pを抽出し、次いで、抽出された A T P量を測定する。次いで、対照サンプルにおいて測定された A T P量（ブランク値）との比較により、生細胞の存在について判定する。例えば、下記ルシフェリンールシフェラーゼ発光反応法を用いた A T P測定の場合には、ブランク値の 1 . 5倍以上の発光量が得られた場合に生細胞が存在すると判定できるが、この数値は、生細胞、希釈溶液、試料及び対照の調製法等に応じて適宜決定される。

生細胞内の A T Pの抽出方法としては、加熱抽出、または A T P抽出試薬を用いる方法が例示される。前者は該希釈物を 5 0〜 1 0 0 °Cにて 1〜 6 0分間加熱して生細胞内 A T Pを生細胞外に抽出する方法であり、後者は該希釈物に A T P 抽出試薬を添加して抽出する方法である。 A T P抽出試薬として、公知の試薬、即ち、リゾチーム、エタノールとアンモニアの混合液、メ夕ノ一ル、エタノール、界面活性剤（塩化べンゼトニゥム、塩化ベンザルコニゥム、トリトン X— 1 0 0など）、トリクロル酢酸、過塩素酸などを使用できる。例えば、市販のルシフエール 2 5 0プラス（キッコーマン（株）製）に付属の A T P抽出試薬を使用することができる。次に、抽出された A T Pを測定する方法としては、公知の種々の A T P測定方法を用いることができる。例えば、 A T P抽出後の希釈物に、 A T P測定試薬を添加する方法が挙げられる。用いられる A T P測定試薬としては、 A T P測定用試薬であれば、いかなる測定試薬でもよく、具体的には、ルシフエリンールシフェラーゼ発光反応法を用いた A T P測定試薬を採用し得る。本発明のルシフェリンおよびルシフェラーゼとしては、ゲンジボタル、ヘイケボタル、アメリカボタル、ツチボ夕ル等を由来とするものを用いることができる。ルシフェラーゼは上記生物の発光組織から精製した天然型ルシフェラーゼゃ遺伝子工学的手法により調製した天然型ルシフェラーゼ、さらには天然型ルシフエラーゼのアミノ酸配列中の 1または複数のアミノ酸に付加、欠失、置換等の変異を導入した変異型ルシフェラーゼを使用することができる。

ルシフェリンールシフェラ—ゼ発光反応法では、まず、ルシフェリン、ルシフエラーゼ、マグネシウム等を含む A T P測定試薬（以下、生物発光試薬と言う）を A T Pを抽出した希釈物に添加する。生物発光試薬と A T Pが反応して発光が生じるので、その発光量をルミノメ一夕一等の測定器を用いて測定する。生物発光試薬としては、市販の試薬、例えば、ルシフェール L U 2 5 0プラス（キッコ一マン（株）製）に付属の生物発光試薬を使用することができる。上記、ルシフェリンールシフェラーゼ発光反応法の変法として、ピルべ一トオルトホスフエ— トジキナーゼを含む生物発光法（以下 P P D K発光法という）を用いることにより測定感度を更に向上することができる（特開平 9一 2 3 4 0 9 9号公報）。第 4工程では、培養処理した各希釈物中の細胞内 A T Pの測定結果に基づいて、初発試料中の生細胞数を測定する。即ち、発光量、発光量から得られる A T P 量、そして希釈倍率等から試料中の生細胞数やオーダーレベルの生細胞数を算出できる。又、同時に最確数表を用いて試料中のより正確な生細胞数を算出することもできる。

生細胞数の測定試薬キットは、前述の希釈溶液、 A T P抽出試薬および A T P 測定試薬を含むものである。 A T P抽出試薬および A T P測定試薬としては、例えば、ルシフェリン—ルシフェラーゼ発光反応法に基づいた市販の菌体内 A T P 測定用試薬、ルシフェール 2 5 0プラス（キッコーマン（株）製）を挙げることができる。高感度での測定のため、バックグラウンド A T Pを分解する必要がある場合には、前述した方法で、例えば、市販のルシフェール A T P消去剤（キッコーマン（株）製）を用いて、 A T P抽出試薬を添加する前にバックグラウンド A T Pを分解する。キットは上記の希釈溶液、試薬以外の他の試薬を含んでいてもよい。他の試薬としては A T P消去剤等が挙げられる。

さらに、本発明に係る生細胞数測定装置は、前述の生細胞数測定方法を実施するための装置であり、試料希釈装置、増殖用培養装置および A T P測定装置を備えるものである。試料希釈装置は試料を試験管に順次段階希釈するための装置であり、市販の希釈装置、例えば、システムダイリュー夕一（販売元：グンゼ産業 (株））を用いることもできる。希釈装置のプログラム設定により、任意かつ望ましい希釈溶液の容量や段階希釈倍率を自動的に選択することができる。次に、増殖用培養装置は、希釈物中の生細胞の培養処理を行なうための装置であり、恒温かつ振盪機能を有することが望ましい。

A T P測定装置は、生細胞内の A T Pを抽出するための処理を行なう抽出処理装置と、抽出された A T P量を測定する測定装置からなる。抽出処理装置は培養処理した希釈物を含む試験管に、一定量の A T P抽出剤を添加し、室温にて、自動的に抽出処理を行なうことができる。測定装置は、例えばルシフェリンールシフェラーゼ発光反応法により発光させ、生じた生物発光を測定する発光測定装置 (ルミノメーター）を使用することができる。この場合、 A T P抽出処理を終えた試験管に一定量のルシフェリン—ルシフェラーゼ発光試薬を添加し、生じた発光量を測定する。本発明において好適に使用できる A T P測定装置として、例えば市販のルミテス夕— K 一 1 0 0 (販売元：（株）盛進）が挙げられる。

測定の結果、得られた A T P量から、初発試料中の生細胞数を算出する。本発明の生細胞数測定装置に、以下の算出プログラムを組み込んだ演算装置を装備しても良い。（1 ) A T P量と希釈条件に基づく算出プログラム。（2 ) A T P量と希釈条件から、統計学的確立論を用いた最確数法に基づく算出プログラム。なお、この装置においては、各種データーの記憶、保存、およびプリントアウト等の機能を装備することもできる。

本発明に係る、試料希釈装置、増殖用培養装置および A T P測定装置を個々に機能的に結合させて、生細胞数測定装置として使用することもできるが、上記 3 個の装置を一体化して、試料をセットすることにより、自動的に試料中の生細胞数が得られるような、生細胞数測定装置とすることが望ましレ^ 施例

以下、実施例により、本発明を更に具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲は、これら実施例により、何ら限定されるものではない。

〔実施例 1〕標準菌株を用いた生細胞数の測定

標準菌株として、ェシエリチアコリー（Escherichia coli) AT C C 259 22 (以下、 E株という）およびバチルスサチリス（Bacillus subtilis) A TC C 9372 (以下、 B株という）を用いた。この標準菌株 2株を普通ブイョン液体培地 3m 1に接種し、 35でで一晩培養した。この培養液をあらかじめ滅菌した生理的食塩水で適宜希釈し、それぞれ試料として以下の生細胞数の測定に供した。生細胞数の多い試料を試料 1、生細胞数の少ない試料を試料 2とした。

(1) 本発明法

オートクレープで滅菌したチォグリコール酸培地 I I (栄研化学（株）製） 9 0m lに、濾過滅菌した 1 0m 1の AT P消去剤（キッコ—マン（株）製）を添加して得た、 AT Pを分解した生細胞増殖用培地を、希釈溶液として用いた。試料 1 m 1を 9m 1の希釈溶液に添加し、良く撹拌し 10倍希釈物を得た。次に、 10倍希釈物 1 m 1を 9m 1の希釈溶液に添加し、撹拌し、 100倍希釈物を得た。同様な操作を繰り返し、 1 000倍、 10000倍と 1 0倍単位で順次段階希釈された希釈物を得た。得られた^:希釈物を 35 °C、 6時間培養処理した。培養処理後、その 0. 1 m 1をキュベットに取り、ルシフェール 250プラス（キッコ—マン（株）製）を用いて、生細胞中の AT Pの抽出と該 AT Pによる生物発光を行なった。生じた発光量をルミテスタ— K— 100 (キッコ—マン（株）製）を用いて測定した。希釈溶液 0. 1 m 1を用いたときの発光量をブランク値とし、ブランク値の 1. 5倍以上の発光量が得られた場合に、培養処理した希釈物中に生細胞が存在すると半定した。生細胞が存在すると判定された希釈物のうち、最大希釈倍率の希釈物の希釈倍率の値より、初発試料中の生細胞数を算出した。

(2) 対照法 1

滅菌した生理的食塩水を希釈溶液として用いた。試料を順次段階希釈し、 1 0 倍単位で希釈された希釈物を得た。希釈物の 1 0 0 1 を、シャーレに分注し、固めた標準寒天培地（栄研化学（株）製）上に塗布し、 3 5^DC、 2日間培養した。出現したコロニー数と希釈倍率より、初発試料中の生細胞数を算出した。

(3) 対照法 2

試料 1. 0 m 1をキュベットに取り 0. 1 m 1の AT P消去剤を添加し、室温にて 30分間反応させた。その 0. 1 m 1 をキュベットに取り、ルシフェール 2 50プラス（キッコ一マン（株）製）およびルミテス夕— K— 1 00 (キッコ一マン（株）製）を用いて生細胞内 AT Pによる発光量を測定した。得られた発光量から図 1の検量線により生細胞数を算出した。

(4) 結果

(a) E株を用いたとき：

①本発明法による測定結果を表 1に示す。

希釈率試料 1 試料 2

発光 i (RLU) 生有発光量（RLU) 生育

10 284404 有り 3095 有り

100 27898 有り 255 有り

1000 2467 有り 10 無し

10000 366 有り 11 無し

100000 10 無し 10 無し

1000000 9 無し 9 無し

ブランク値 10 無し 10 無し

試料 1の生細胞数（オーダー）： 10⁴ CFU/ml

試料 2の生細胞数（オーダー）： 10² CFU/ml ②対照法 1による測定結果を表 2に示す。

表 2

③対照法 2による測定結果を表 3に示す。

表 3

(b) B株を用いたとき：

①本発明法による測定結果を表 4に示す。

表 4 希釈率試料 1 拭料 2

発光量 ( LU) 生育発光量（RLU) 生育

10 77422 有り 306 有り

100 2249 有り 53 有り

1000 181 有り 12 無し

10000 22 有り 11 無し

100000 11 無し 9 無し

1000000 9 無し 10 無しブランク値 10 無し 10 無し試料 1 の生細胞数（オーダー）： 10⁴ CFU/ml 試料 2の生細胞数（オーダ一）： 10² CFU/ml

②対照法 1による測定結果を表 5に示す。

表 5 試料生細胞数

試料 1 4 . 4 1 0 ⁴ CFU/ml

試料 2 4 . 4 X 1 0 ² CFU/ml

③対照法 2による測定結果を表 6に示す。

表 6

表 1、表 2、表 4、及び表 5の結果から、本発明法で求めた生細胞数と対照法 1で得られた生細胞数は、 E株、 B株とも、試料 1及び試料 2のいずれについても、オーダ—レベルで一致していることが示された。一方、表 3及び表 6に示した通り、対照法 2においては、 E株、 B株とも、生細胞数を多く含む試料 1では、図 1の検量線より得られた生細胞数は、本発明法及び対照法 1により得られた結果とオーダーレベルで一致したが、試料 2については、いずれの標準菌株についても、試料中の生細胞数が 1 0 ³ C F U Zm 1以下であったため、発光量はブランク値と同等であり、実質的に測定不可能であつた。以上の結果は、本発明法が、対照法 2で測定できない生細胞数（ 1 0 ³ C F U /m 1以下）の試料も含めて、生細胞数の多少にかかわらず、短時間で生細胞数をオーダーレベルで測定することができることを示した。

〔実施例 2〕カット野菜中に含まれる汚染菌（生細胞）数の測定

市販されているカット野菜、 3種類を購入した。それぞれカット野菜 1 0 gに滅菌した生理的食塩水 1 0 0 m 1を添加して、ストマッカ一（販売元：オルガノ (株））を用いて、ストマッカ一処理をした。得られたストマツキング液を試料とした。

(1) 本発明法

上記試料を用い、〔実施例 1〕に記載の本発明法に準じて測定した。但し、培養温度は 30°C、培養時間は 8時間とした。

(2) 対照法 1

上記試料を用い、〔実施例 1〕に記載の対照法 1に準じて測定した。但し、培養温度は 30 °C、培養時間は 2日間とした。

(3) 対照法 2

上記試料を用い、〔実施例 1〕に記載の対照法 2に準じて測定した。但し、 0 • 22 / mのフィルターで除菌した試料を用い、同様な操作を行なって得られた発光量をブランク値とした。

(4) 結果

①本発明法による測定結果を表 7に示す。

表 7 希釈率試料 1 拭料 2 試料 3

発光量（RLU) 生育発光量（RLU) 生育発光量（RLU) 生育

10 14381 有 y

- 有り 92932 有り

100 1820 有リ 536332 有り 7791 有り

1000 180 有リ 57266 有り 634 有り

10000 80 有り 6782 有 y 66 有り

100000 10 無し 986 有り 45 有り

1000000 9 無し 101 有り 10 無し

10000000 11 無し 10 無し 11 無し

100000000 12 無し 12 無し 12 無しブランク值 10 無し 10 無し 9 無し試料 1の才-ーダー 10⁴ CFU/ml

試料 2の才-ーダー 10⁶ CFU/ml

試料 3のォ-ーダ一 10⁵ CFU/ml

②対照法 1による測定結果を表 8に示す。

表 8 試料生細胞数

試料 1 4 . 2 X 1 0 4 CFU/ml

試料 2 4 . 5 X 1 0 ⁶ CFU/ml

試料 3 1 . 3 x 1 0 ⁵ CFU/ml

③対照法 2による測定結果を表 9に示す。

表 9

本発明法により短時間で測定した生細胞数（表 7 ) と対照法 1により得た生細胞数（表 8 ) とは、 3種類のいずれの試料についても、オーダーレベルで同じ結果を示した。対照法 2を用いて測定したとき、表 9に示したように、試料のブランク値が 4 4 9 0 R L U (発光量の単位）と高い値を示し、試料 1及び試料 3では、その測定値がブランク値とほぼ同等であったため、生細胞数を測定することができなかった。しかし、汚染菌を多く含む試料 2では、その測定値がブランク値と比較して有意に大きいため、本発明法の生細胞数とオーダーレベルで一致した測定結果を得ることができた。

以上より、本発明法は、対照法 2で測定することができないような高いブランク値を含む、種々のブランク値を有する試料についても短時間で生細胞数を測定することができ、野菜等の食品中に含まれる汚染菌数の測定にも、何ら問題なく使用できた。

〔実施例 3〕食肉中に含まれる汚染菌（生細胞）数の測定

市販の食肉 3種類を購入した。それぞれ食肉 1 0 gに滅菌した生理的食塩水 1 00m lを添加して、ス卜マッカ一を用いて、ストマッカ一処理をした。得られたストマツキング液を試料とした。

(1) 本発明法

上記試料を用い、〔実施例 1〕に記載の本発明法に準じて測定した。但し、培養温度は 30°C、培養時間は 8時間とした。発光量の測定試薬はルシフェール H Sプラス（キッコーマン（株）製）を用いた。

(2) 対照法 1

上記試料を用い、〔実施例 1〕に記載の対照法 1に準じて測定した。但し、培養温度は 30で、培養時間は 2日間とした。

(3) 対照法 2

上記試料を用い、〔実施例 1〕に記載の対照法 2に準じて測定した。但し、 0 . 22 mのフィルターで除菌した試料を用い、同様な操作を行なって得られた発光量をブランク値とした。発光量の測定試薬は、ルシフェール HSプラス（キッコ一マン（株）製）を用いた。

(4) 結果

①本発明法による測定結果を表 10に示した。

表 1 0 希釈率拭料 1 拭料 2 試料 3

発光量（RLU) 生育発光量（RLU) 生育発光量 (RLU) 生育

10 483366 有り 32087 有りスケ-ルォ-ハ♦ - 有り 00 28682 有り 1893 有り 143785 有り

1000 723 有り 236 有り 16190 有り

10000 56 有り 68 有り 1458 有り

100000 25 無し 26 無し 208 有り

1000000 24 無し 23 無し 59 有り

10000000 25 無し 25 無し 25 無しブランク値 24 無し 10 無し 25 無し試料"!の生細胞数（ォー -ダー -) ： 10⁴ CFU/ml

試料 2の生細胞数（ォ一 -ダ一 -) ： 10⁴ CFU/ml

試料 3の生細胞数（ォー -ダー 0 ： 10⁶ CFU/ml ②対照法 1による測定結果を表 1 に示した ₍

表 1 1

③対照法 2による測定結果を表 1 2に示した。

表 1 2

対照法 2では、表 1 2に示した通り、ブランク値の発光量が 5 3 6 9 2 R L U と非常に高く、 3種類の試料いずれについても、試料の発光量とほぼ同等であり、生細胞数を測定できなかった。一方、本発明法と対照法 1の生細胞数の測定結果は、 3種類の試料いずれについても、オーダーレベルで一致した。よって、本発明法により、対照法 2では全く測定できない、ブランク値の非常に高い試料についても、短時間で、生細胞数を測定することができた。本発明法は、食肉等の食品中に含まれる汚染菌数の測定にも、有効に用いられる。産業上の利用性

本発明は、生細胞を含む試料を、生細胞増殖用培地を希釈溶液として、順次段階希釈し、得られた希釈物を短時間培養処理した後、生細胞内 A T Ρを測定することにより、試料中の生細胞数を測定する方法に関する。また、上記方法において使用される測定試薬キット、及び生細胞数測定装置に関する。

本発明を用いることにより、試料中の生細胞数を感度良く、かつ短時間に測定することができる。生鮮食品は言うに及ばず、食品においては、短時間に食品中に含まれる汚染菌数を測定することが強く望まれており、本発明は、好適に利用できる。本明細書で引用した全ての刊行物は、参考としてそのまま本明細書にとり入れるものとする。

Claims

請求の範囲

1. 以下の工程（i) 〜（iv) ：

(i) 試料を希釈溶液を用いて順次段階希釈する第 1工程、

(ii) 第 1工程で得られた各希釈物を培養処理する第 2工程、

を含むことを特徴とする、試料中の生細胞数の測定方法。

2. 前記第 1工程で用いる希釈溶液が生細胞増殖用培地であることを特徴とする、請求項 1記載の生細胞数の測定方法。

3. 前記第 1工程で用いる希釈溶液が、 AT Pを分解した生細胞増殖用培地であることを特徴とする、請求項 1記載の生細胞数の測定方法。

4. 前記第 2工程において、培養処理中又は培養処理後に、希釈物中の生細胞内 AT P以外の AT Pを分解することを特徴とする請求項 1に記載の生細胞数の測定方法。

5. 前記第 3工程における生細胞内 AT Pの測定が、ルシフェリンールシフエラーゼ発光反応を利用するものである、請求項 1に記載の生細胞数の測定方法。

6. 請求項 1に記載の生細胞数の測定方法に用いるための測定試薬キッ卜であつて、以下（a) 〜（c) ：

(a) 希釈溶液、

(b) ATP抽出試薬、及び (c) ATP測定試薬、

を含む測定試薬キッ卜。

7. 請求項 1に記載の生細胞数の測定方法に用いるための生細胞数測定装置であって、試料希釈装置、増殖用培養装置および A TP測定装置を備えることを特徴とする、生細胞数測定装置。

8. 上記 A TP測定装置が、ルシフェリンールシフェラーゼ発光反応による発光量の測定装置である、請求項 7に記載の生細胞数測定装置。