WO2000024267A1

WO2000024267A1 - Gelatins with low allergenicity

Info

Publication number: WO2000024267A1
Application number: PCT/JP1999/005890
Authority: WO
Inventors: Kenichi Ichie; Yasuki Taguchi; Yoshihisa Takahata; Fumiki Morimatsu; Tamotsu Shigehisa
Original assignee: Nippon Meat Packers Inc
Current assignee: NH Foods Ltd
Priority date: 1998-10-23
Filing date: 1999-10-25
Publication date: 2000-05-04
Anticipated expiration: 2001-04-23
Also published as: JP2000125775A

Description

明細書低アレルゲン性ゼラチン技術分野

本発明は低アレルゲン性ゼラチン及びペプチドに関する。より詳細には、食用、医療用（医薬用も含む)、化粧品用として利用され、アレルギー症状を引き起こすことのないゼラチン及びべプチドに関する。従来の技術

ゼラチンは、脊椎動物に最も多く含まれるタンパク質、コラーゲンを物理化学的処理により変性して可溶性状態にした後、精製 '乾燥したものである。従って、ゼラチンはコラーゲン含有組織より製造される。コラーゲン含有 m¾としては動物（例えば、牛、豚、兎、羊、鶏など）の皮、骨、軟骨、腱、胎盤などが例示されるが、ゼラチンを商業的に生産する場合は、大量且つ安価に入手可能な牛又は豚の骨と皮が使用されている。

従来よりゼラチンは原料をアル力リ又は酸で前処理した後、温水にて抽出する方法で製造されている。近年では効率化 ·高純度化という観点から酵素（プロテア一ゼ）による前処理なども検討されている。

アルカリによる前処理とは、原料を 1〜5 %石灰液などに 3 0〜 1 0 0日浸した後、中和水洗する方法である。この処理によって不純物が除去され、ゼラチンが温水で容易に抽出される状態になる。アルカリ処理中にアルギニン、グルタミン、ァスパラギン側鎖のアミド基がカルボキシル化されるため、アルカリ処理ゼラチンの等電点はコラーゲンよりも低い 4〜 5 . 5である。

酸による前処理とは、原料を硫酸、塩酸などの希薄な酸溶液に 1〜2日程度浸した後、水洗する方法である。酸処理ゼラチンの等電点は 7〜1 0、通常 7 . 5〜9 . 5であり、コラーゲンとほぼ同じである。酵素処理ゼラチンの等電点も酸処理ゼラチンとほぼ同じである。

ゼラチンには、起泡性、皮膜形成能、保水性、保護コロイド性、弾力性、熱可逆的ゾル 'ゲル変換特性（ゲル化特性）など多くの特性があり、また安価且つ大量に入手可能なため、食用、医療用、化粧品用、写真用、工業用など幅広い用途で利用されている。

食用としては、そのゲル化特性を活かしたゼリーの原料として利用される。ゼラチン以外にも寒天、カラギーナン、ぺクチンなどの植物性多糖類がゲル化特性を有するが、これらはすべて植物性であり消化吸収が悪く栄養価も低い。一方、ゼラチンは消化吸収の良い代表的な動物性タンパク質であり、ゼリー使用時の食感にも優れている。

さらに、起泡性を活かしてマシュマロの原料として利用されている。その他にも、グミキャンディー、ヨーグルト、ハム、ソ一セージ、スープ、ノくバロア、アイスクリームなどの主原料あるいは副原料として広く利用されている。

医療用としては、ハード及びソフ卜カプセルに応用されている。これらは、粘性、ゲル化特性、皮膜形成能などゼラチンの多様な特性に依存している。

また、皮膚に対する親和性や保水性、粘着性などに優れることからパップ剤にも利用されている。その他にも、錠剤の結合剤、 iLiiL材などに応用されている。

化粧品用としては、保湿成分として乳液、パック剤などに配合されている。

写真用としては感光物質であるハロゲン化銀の結合剤に使用されている。ゲル化特性と保護コロイド性の二点でゼラチンに代替できる物質は未だ開発されていない。工業用としては合板、家具などの木工用接着剤として利用されている。

ゼラチンを酸、アルカリ、酸素又は熱で加水分解したペプチドも食用、医療用、化粧品用として広く利用されている。食用としては、ゼラチンよりも溶けやすく消化吸収も良いため栄養剤などのアミノ酸供給源として添加されている。また、保護コロイド性を活かし、清酒などアルコール飲料のオリ下げ剤などにも利用される。医療用としては、代用血漿剤、ワクチン安定剤などに利用されている。化粧品用としてはヘアケア原料などに配合されてし、る。ゼラチンは、その分子構造が種の違いにかかわらず極めて類似しているため、異種のものであっても抗原性はない又は少ないとされてきた。食用ゼラチンは、 F A OZWH O合同食品添加物専門委員会によって「類制 A ( 1 )、 A D I特定せず」と評価され、また医薬品としては日本薬局方の 3局より収載されているなど、ゼラチンのヒトに対する安全性は広く認められている。

しかし、近年ゼラチンを含有するヮクチンゃ食品によつてァレルギ一反応を引き起こす乳幼児例が急増している。ワクチン被接種者の約 5 0 0人に 1例が即時型、約 1 1 0人に 1例が非即時型のゼラチンアレルギーを引き起こすという報告もある (日本国厚生省予防接種副反応研究班 ·予防接種リサーチセンタ一：予防接種の効果的実施と副反応に関する総合的研究、 1 5 1— 1 5 4、 1 9 9 8 )。この感作の主要因としては、三種混合ワクチンやゼラチン含有離乳食などが指摘されてし、る。ゼラチンは食用、医療用、化粧品用、写真用、工業用などに幅広い用途で利用されているが、ゼラチンァレルギ一患者がこれらゼラチン含有製品を投与されたり、又は摂取などした場合、ァレルギ一症状を引き起こす可能性がある。

特に重篤なゼラチンアレルギーは、生ワクチンの接種によって生じる。生ワクチンには力価の低下を防ぐためにタンパク質の安定剤、例えば、ゼラチンもしくはその加水分解物又はヒト血清アルブミンの添加が必要であった。し力、し、ヒ卜血清ァルブミンには未知の病原体の存在など、広く使用するには問題が多い。一方、乳糖、ソルビトール、ブドウ糖、精製白糖及びデキストランなどの糖類では十分な安定化効果は得られなかった。ここ数年間でゼラチン含有ヮクチンの危険性が広く認知され、ゼラチンフリーワクチンが開発されてはいるものの、低力価で安定した効果の要求される麻疹ワクチンには夕ンパク質の安定剤の添加が不可欠である。従って、代替の安定剤又はァレルギ一症状を引き起こすことなく、安定剤としての機能を果たすゼラチンの開発が強く望まれていた。

ワクチン接種によるゼラチンアレルギー力認知されつつあるものの、食品やその他の医薬品、化粧品の使用によるゼラチンァレルギ一には殆ど関心が払われて、ない。従って、これらのゼラチンを含有する製品の利用による重篤な事故の発生が危惧されている。故にこれを未然に回避することは社会的に重要である。

ゼラチン含有食品には、ゼリー、ノパ 'ロア、グミキャンディ—、ヨーグルト、ノヽム、ソーセージ、スープ、アイスクリームなど、日常摂取する多くの食品がある。また、ゼラチン加水分解ペプチドも食品に利用されており、特に近年ゼラチン加水分解べプチドを大量に含有した食品、例えば飲料などが市販されるようになった。これらの食品のゼラチン加水分解べプチドの含有量は、一回に 5 g摂取する場合もある。この摂取量はアナフィラキシーショックを起こすには十分な量である。更に、医薬用のソフトカプセル、ハードカプセルもゼラチンが主原料である。これらの食品、医薬品をゼラチンアレルギー患者が摂取すると、口の中や目に痒み、鼻汁、発熱、嘔吐、頭痛、下痢、皮膚炎、喘息などのアレルギー症状を生じ、場合によってはアナフィラキシーショックを起こすこともある。 —方、上述のようにゼラチンはこれらの食品や医薬品の形状、物性、呈味などを保持する上で必須成分であり、これに変わる安価な物質は開発されていなかった。

化粧品においてもゼラチンは保湿成分として乳液やローションに配合され、使用されている。また、ゼラチンはパップ剤に使用されている。これらの化粧品ゃパップ剤をゼラチンアレルギー患者が使用する場合には、痒み、紅班、丘疹、小水疱、表面剥離など、皮膚の炎症を伴う可能性がある。し力、し、皮膚に対する親和性や保水性、粘着性を兼ね備えた安価な代替物質はなかった。

上述のように、食品、医薬品、化粧品などへのゼラチンの利用はその多様な特性に依存する場合が多く、その殆どが代替のきかない利用法であるため、従来のゼラチンの特性を有し、且つァレルギ一を起こさな t、安全で安価な物質の開発が望まれていた。

このような点から、原料そのものの抗原性に着目し、低抗原性である I I型コラ —ゲンを主成分としたゼラチンが開発されている（日本特願平 9一 2 1 0 0了 5号参照)。しかし、軟骨など I I型コラーゲンを含む原料の大量入手は容易ではなく、牛又は豚の皮や骨と比較して高価な上、ゼラチンの収率も悪いため商業的に生産するには問題が多い。上記の発明以外にも、ゼラチンの抗原性を除去するために加水分解を利用した発明が種々提案されている（日本特公昭 6 2— 3 6 4 9 5号公報、日本特開平 7— 8 2 2 9 9号公報、日本特開平 8 - 1 9 3 9 5 8号公報、日本特開平 9— 1 7 6 1 9 6号公報など参照)。し力、し、加水分解を行うと、ゼラチン特有の性質（例えば、ゲル化特性、皮膜形成能など）が消失してしまうため、利用範囲が極めて限定されてしまう。さらに、後記の実施例で示すように、市販の牛又は豚の皮又は骨から抽出されたゼラチンはアレルゲン性を有する。さらに、アルカリ処理で調製されるゼラチンには原料の種類を問わずにアレルゲン性があり、上記公報で調製されたゼラチン加水分解べプチドにはァレルゲン性が残存している可能性が大き、。

以上のように、これまでの発明は、本発明の目的である従来のゼラチンの諸特性を有し且つ、アレルギー症状を起こさない、安全で安価なゼラチン及びその製造法とはいえない。

本発明者等は上記の問題を解決するために、従来のゼラチンと同様の加工適性、嗜好特性などを有し且つゼラチンァレルギ一患者の血清と抗原抗体反応を生じない又は抗原抗体反応が低値であり、安全なゼラチンを安価且つ大量に調製する方法を開発するべく鋭意検討を重ねてきた。その結果、家禽類の皮、骨及び/又は腱、好ましくは鶏の皮、骨及びノ又は足より、アルカリ処理することなく調製したゼラチンが所期の目的を達成し得ることを見出した。本発明はかかる知見に基づ、てなされたもので、食用、医療用、化粧品用等として利用する際に、ゼラチンアレルギー患者に対してァレルギ一症状を引き起こすことのないゼラチンを安価且つ大量に提供することを可能とする。発明の開示

本発明は、家禽類の皮、骨及び Z又は腱由来で、等電点が 7〜1 0であり、ゼラチンァレルギ一患者血清と抗原抗体反応を生じない又は抗原抗体反応が低値であることを特徴とする、食用、医療用又は化粧品用ゼラチンである。

また、本発明は、上記のゼラチンを含有する、ゼラチンアレルギー患者に対して低アレルゲン性の食品、医療品又は化粧品である。

更に、本発明は、家禽類の皮、骨及びノ又は腱を酸溶液に浸漬し、沈殿物を回収し、得られた沈澱物を酸溶液で加熱抽出し、抽出物を精製することからなる、上記ゼラチンの製法である。

また、本発明は、上記のゼラチン及びノ又はその前駆体であるコラーゲンを加水分解することで得られる、食用、医療用又は化粧品用ペプチドである。図面の簡単な説明

図 1は、本発明のゼラチン（鶏足ゼラチン及び鶏皮ゼラチン）及びゼラチン加水分解ペプチド（鶏足ゼラチン加水分解物）並びに巿販食用ゼラチン、医薬用ゼラチン、化粧品用ゼラチン及びゼラチン加水分解物（医薬用ゼラチン加水分解物）に対するゼラチンアレルギーと診断された患者血清 (黒塗り）と健常者血清 (白塗り）の抗原特異 I g E抗体値を示す図である。

図 2は、鶏足、牛皮又は豚皮より調製した酸処理ゼラチン (黒塗り)又はアルカリ処理ゼラチン（白塗り）に対するゼラチンアレルギーと診断された患者血清の抗原特異 I g E抗体値を示す図である。発明を実施するための最良の形態

前述のように、本発明のゼラチンは、家禽類の皮、骨及び/又は腱由来のゼラチンであって、等電点が 7〜 1 0であり、従来のゼラチンをアレルゲンとして認識する患者血清と抗原抗体反応をさせるとき抗原抗体反応を生じなヽ又は抗原抗体反応力、'低値であることを特徵とする。なお、上記の抗原抗体反応が低値であるとは、試験結果に基づき統計学上の有意差検定を行つたとき、健常者血清と比較して有意差が認められなし、状態を意味する。

本発明に係わる低アレルゲン性ゼラチンの出発原料としては、家禽類の皮、骨及び Z腱が用いられる。こられの原料は食肉産業の副生物などを利用できる。家禽類としては、鶏、ァヒル、ガチョウ、七面鳥などが例示できるが、鶏が原料的には有利である。従って、本発明の出発原料としては、鶏の皮、骨及び Z又は足が好適に用いられる。なお、本発明のゼラチンの由来は抗原抗体反応により確認することができる。

本発明のゼラチンは上記原料を用いて調製されるが、生産する上で重要な点としてはアルカリ処理を施さないことが挙げられる。市販ゼラチンの多くはアルカリによる前処理が施されている力、後記試験例でも示すようにアル力リ処理を施すと畜種、部位に係わらずゼラチンのアレルゲン性が上昇する。従って前処理には十分注意を払う必要がある。

アル力リ処理の有無はゼラチンの等電点を調べることにより確認できる。酸処理ゼラチンの等電点はコラーゲンとほぼ同じの 7〜1 0程度、通常 7 . 5〜9 . 5であるのに対し、アルカリ処理ゼラチンの等電点はアルギニン、グルタミン、ァスパラギン側鎖のァミド基がカルボキシル化されているためコラーゲンよりも低い 4〜 5 . 5である。

等電点以外にもァミノ酸分析によるオルニチンの検出によりアル力リ処理の有無を確認できる。アルカリ処理を施すとアルギニンの一部がオル二チンに変化する。これはアミノ酸 1 0 0 0残基中に数残基存在するためアミノ酸分析により確認が可能である。一方、未変性コラーゲン及び酸処理ゼラチンではオル二チンは検出されない。

より具体的に本発明のゼラチンの製造法の一例を示すと、前記の原料を酸溶液（塩酸溶液、硫酸溶液など、好ましくは 3 %程度の塩酸溶液）に 2日間程度浸潰する。その後、沈殿物を回収し水洗を行った後、 p H 4程度の酸溶液（塩酸溶液、硫酸溶液など、好ましくは塩酸溶液）を加えて加熱し抽出を行う。得られた抽出物を濾過、脱塩、乾燥することにより本発明のゼラチンが得られる。かくして得られたゼラチンは必要に応じて慣用のタンパク質精製法に準じて更に精製してもよい。

後記試験例でも示すように本発明のゼラチンは従来のゼラチンと同等のゼリ一強度を有する。更に、起泡性、皮膜形成能、保水性、保護コロイド性、弾力性などを有しており、従来のゼラチンが用いられている各種の用途に利用することができる。特に好適には食用、医療用、化粧品用に利用される。

食用としてはゼリー、グミキャンディ一、ヨーグルト、ハム、ソーセージ、スープ、ババロア、アイスクリームなどに利用される。本発明のゼラチンを用いることにより、嗜好性を変えることなくァレルゲン性の非常に低い食品を製造することが可能となる。

医療用としてはカプセル、ノ、。ップ剤、ワクチン安定剤などに利用される。本発明のゼラチンを用いることにより従来のゼラチンの基本的性質を変更することなく、これらの安全性を確保すること力、'可能となる。また、ワクチンの製造において毒素の無毒化の際に使用しても良、。

化粧品用としてはクリーム、軟膏、化粧水などに配合される。本発明のゼラチンはアレルゲン性がない、又は非常に低いため、これらの化粧品に含有されるゼラチンに起因した皮膚の炎症などを回避することができる。

なお、低アレルゲン性が確保される限りにおいて、本発明のゼラチンに他のゼラチン（例えば、アルカリ処理ゼラチン、家禽類以外の動物種由来のゼラチンなど）を混和して使用してもよく、これにより、加工適性及び Z又は嗜好特性の維持が図れ、より一層安価な製品の供給が可能となる。

本発明のぺプチドは、上記のゼラチンを常法に準じて加水分解した低分子物質である。そして、本発明のペプチドは、牛又は豚の骨と皮から製造された従来のゼラチンをァレルゲンとして認識する患者血清と抗原抗体反応をさせるとき抗原抗体反応を生じなヽ又は抗原抗体反応が低値であることを特徴とする。

本発明のぺプチドは、本発明のゼラチン及びノ又はその前駆体であるコラーゲンを、常法に準じて酵素、酸などで加水分解することにより得ることができる。分子量は用途によって適宜選択することができるが、 5 0 0から 5 0 0 0 0が適当である。

本発明のペプチドは、従来のゼラチン加水分解物又はコラーゲン加水分解物の基本的性質を変更することなく、さらに安全性を付与しているため、従来のゼラチン加水分解物又はコラーゲン加水分解物が用いられている各種用途にも利用できる。特に低分子べプチドは水に非常によく溶け、低温下においてもゲル化特性がないこと力、ら、飲料、菓子などの食品、ワクチン用安定剤、ノ、 °ップ剤、代用血漿剤などの医薬品及びシヤンブーなどの化粧品にも利用できる。産業上の利用可能性

本発明のゼラチン及びぺプチドは、従来のゼラチンやゼラチン分解べプチドの特性を損なうことなく、しかもアレルゲン性がない又は非常に低い。従って、従来のゼラチンやゼラチン分解べプチドの利用分野で特に安全性が求められる食品用、医薬品用、化粧品用などとして有用である。しかも、本発明のゼラチン及びペプチドの原料である家禽類の皮、骨及び Z又は腱は食肉産業の副生物であり、それを利用できるため資源の有効活用が図れ、更に収量もよいため大量且つ安価に製造することができる。実施例

以下、実施例及び試験例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。

実施例 1

低アレルゲン性ゼラチンの調製（1 )

鶏足を粉砕後、 5倍量の 3 %塩酸溶液に浸漬した。 4 8時間後沈殿物を回収し、水洗にて過剰の酸を除去した。 5倍量の塩酸溶液（p H 4 ) を加え、 6 0 4時間加熱抽出し、蒸留水で洗浄した混床ィォン交換樹脂（バイオラッドネ土製、 AG501-X8) カラムにかけ、パス画分を回収し、凍結乾燥を行って、本発明の低アレルゲン性ゼラチンを得た。実施例 2

グミキャンディ一の製造

水（配合成分混合物 1 0 0重量部当り 1 4部、以下同様）にヨーグルトパウダー ( 6部）を加え加熱溶解した溶液に、砂糖 ( 2 5部)、水あめ（3 0部）及び実施例 1で得た低アレルゲン性ゼラチン（2 5部）を加え 2 0分間煮詰めた。これを適当なケ一シングに充填、成形した後、冷却してグミキャンディ一を製造した。実施例 3

ゼリーの製造

熱水 ( 8 5部）に、実施例 1で得た低アレルゲン性ゼラチン（3部）及び砂糖（1 0部）を加え溶解し、更に輪切りのレモン汁（2部）を加えて 2 0分間煮た。これを型に流し、冷却してゼリーを製造した。実施例 4

ハードカプセルの製造

実施例 1で得た低ァレルゲン性ゼラチンの 5 %溶液を力プセル型のピンに付着させた後、冷却、乾燥を行った。水分含量 1 5 〜 1 8 %まで乾燥させた時点でピンを引き抜き、更に水分含量 1 2 〜 1 5 %まで乾燥させてハードカプセルを製造した。実施例 5

低アレルゲン性ゼラチンの製造（2 )

実施例 1の鶏足に代えて鶏皮を使用する以外は実施例 1と同様な方法で、本発明の低アレルゲン性ゼラチンを得た。実施例 6

低アレルゲン性ゼラチン加水分解物べプチドの調製

実施例 1で得た低ァレルゲン性ゼラチン 1 0 gを 3 %塩酸溶液 5 0 0 m lに溶解した後、 7 0 3時間加水分解を行った。中和後、これを、蒸留水で洗浄した混床イオン交換樹脂（バイオラッド社製、 AG501-X8) カラムにかけ、パス画分を回収し、スプレードライを行って本発明のぺプチドを得た。実施例 7

果汁飲料の製造

水（5 6 . 8部）にクェン酸（0 . 2部）、オレンジ果汁（3 5部)、砂糖（5部）及び実施例 6で得たゼラチン加水分解べプチド（ 3部）を加えて加熱溶解させ、冷却後、容器充填及び 8 5 °C 3 0分間の加熱殺菌を行って果汁飲料を製造した。実施例 8

低アレルゲン性ゼラチンの製造（3 )

実施例 1の鶏足に代えてァヒル皮を使用する以外は実施例 1と同様な方法で、本発明の低アレルゲン性ゼラチンを得た。試験例 1

低アレルゲン性の証明（1 )

実施例 1、 5及び 6記載の方法で調製した本発明のゼラチン及びゼラチン加水分解べプチド並びに巿販ゼラチンに対するゼラチンアレルギー患者血清中の抗原特異 I g E抗体との反応性について調べた。

①供試試料

上記の本発明のゼラチン及びゼラチン加水分解ぺプチドと、市販の食用ゼラチン、医薬用ゼラチン、化粧品用ゼラチン及び医薬用ゼラチン加水分解ぺプチドを供試試料とした。供試試料の性状を表 1に示す。なお、ゼリー強度の測定は、日本工業規格 JIS K 6503-1977に記載の方法に準じて行つた。供試試料原料ゼリ一強度 (bloom)

鶏足ゼラチン C例 1 ) 鶏足 4 1 4

鶏皮ゼラチン例 5 ) 鶏皮 3 7 5

¾足ゼラチン鶏足ゲル化せず

加水分解べプチド (実施例 6 )

市販食用ゼラチン牛皮 1 0 0〜3 0 0

市販医薬用ゼラチン牛骨 2 8 4

市販化粧品用ゼラチン牛骨 ·牛皮ゲル化せず

市販医薬用ゼラチン牛骨 ·牛皮ゲル化せず

加水分解物

②試料液の調製

本発明のゼラチン及びゼラチン加水分解ぺプチド並びに市販ゼラチンは、 0 . 1 % (W/V)溶液となるように P B S (リン酸緩衝生理食ヽ H 7 . 2 ) で希釈し、湯煎しながら十分に撹拌して溶解した。これらの溶液を試料液とした。

③ァレルギ一患者血清

ゼラチンアレルギーと診断され、 R A S T (radio allergosorbent test)陽性を示したアレルギー患者 1 5人（男 6人、女 9人）から医師が少量の血液を採取し、常法により血清を分離して保存したものを使用した。

④健常者血清

新生児 6人（男女同数）の臍帯血を採取し、常法により血清を分離して凍結保存したものを使用した。

⑤試験方法

上記の各試料液に対するゼラチンァレルギ一患者血清中の抗原特異 I E抗体との反応性（抗原特異 I g E抗体値）は ELISA(enzyme-linke{i immunosorbent assay) 法により調べた。因みに ELISAは「藤原大美ら編，免疫研究法ノヽンドブック, 199- 206, 1992, 中外医学社，東京」に記載された方法に準じて行った。

ELISA法の操作概要を以下に示す。

( 1 ) 上記の試料液を 96穴 ELISA用マイクロプレートに加え、抗原蛋白質をプレ一卜に固定化する。 ( 2 ) プレート洗浄後、検体や標識抗体の非特異的吸着を防ぐため、ヒト血清アルブミンを加えてブロッキングする。

( 3 ) プレート洗浄後、検体としてアレルギー患者血清と健常者血清をそれぞれ別個のゥエルに加えて抗原と反応させる。

( 4 ) プレート洗浄後、アルカリホスファタ一ゼ標識抗ヒト I g E e鎖ャギ抗体を加えて反応させる。

( 5 ) プレート洗浄後、基質（ルミホス 530 ; 4-Methoxy-4-(3-phosphate- phenyl)spiro[ 1 ,2-dioxeta e-3 ,2 '-adamantane] disodium salt, 相光薬ェ桌社製)を加え、アルカリホスファタ一ゼの脱リン酸化反応により生じた発光量を測定する。 ( 6 ) 測定は、プレートリーダー（LUMINOUS CT- 9000D、ダイアヤト口ン社）にて行う。段階的に希釈した標準抗体による ELISAを同時に行い、これにより作成した標準曲線より抗原特異 IgE抗体濃度を算出する。

⑥結果

上記の試験の結果は、図 1に示す（何れも平均値土標準誤差)。なお、黒塗りは各試料液に対するゼラチンアレルギー患者血清の特異 I g E抗体値、白抜きは健常者血清の特異 I g E抗体値を示す。

図 1に示されるように、ゼラチンアレルギー患者血清及び健常者血清を用いて、本発明のゼラチン及びゼラチン加水分解ぺプチド並びに巿販ゼラチンに対する抗原抗体反応について調べたところ、本発明のゼラチン及びゼラチン加水分解べプチドに対するゼラチンァレルギ一患者血清の特異 I g E抗体反応性は低値であり、それらに対する健常者血清の特異 I g E抗体値との間に有意な差は認められなかった。一方、市販の食用ゼラチン、医薬用ゼラチン、化粧品用ゼラチン及び医薬用ゼラチン加水分解べプチドでは、その何れに対してもゼラチンアレルギー患者血清の特異 I g E抗体値は高く、それらに対する健常者血清の特異 I g E抗体値との間に有意な差が認められた。試験例 2 低アレルゲン性の証明（2 )

畜種及び製法の違いによるアレルゲン性を検討するため、鶏足、牛皮又は豚皮より常法に準じて酸処理ゼラチン又はアル力リ処理ゼラチンを調製し、これらのゼラチンに対するゼラチンアレルギー患者血清中の抗原特異 I g E抗体との反応性について調べた。なお、鶏足由来酸処理ゼラチンとは実施例 1記載の方法で調製した本発明のゼラチンを指す。

①供試試料

鶏足、牛皮又は豚皮より常法に準じて調製した酸処理ゼラチン又はアル力リ処理ゼラチンを供試試料とした。得られたゼラチンのオル二チン数（ 1 0 0 0残基中）及び等電点を表 2に示す。

表 2

②試料液の調製

試験例 1と同様な方法で調製した。

③ァレルギ一患者血清

試験例 1と同じ血清を用いた。

④試験方法

試験例 1と同様な方法で試験を行った。

⑤結果

上記の試験の結果は、図 2に示す（平均値土標準誤差)。黒塗りは各原料より調製した酸処理ゼラチンに対するゼラチンアレルギー患者血清の特異 I g E抗体値、白抜きは各原料より調製したアル力リ処理ゼラチンに対するゼラチンァレルギ一患者血清の特異 I _g E抗体値を示す。図 2に示されるように、畜種別酸処理ゼラチンについて調べたところ、ゼラチンァレルギ一患者血清の本発明のゼラチンに対する特異 I E抗体値は低値であつた、豚皮及び牛皮由来酸処理ゼラチンに対する特異 I g E抗体値は有意に高値であつた。

また、前処理としてアルカリ処理を行うと、アレルギー患者血清の特異 I g E抗体値はどれも一様に上昇した。更に、別途行った試験において、ゼラチンアレルギ一患者血清の本発明のゼラチンに対する特異 I g E抗体値と、これらに対する健常者血清の特異 I g E抗体値との間に有意な差は認められなかった。

即ち、ゼラチンアレルギー患者血清中には、本発明のゼラチンを抗原（アレルゲン）として認識する特異 I g E抗体は殆ど認められなかった。しかし、本発明のゼラチンの原料である鶏足からァルカリ処理により調製したゼラチンは特異 I g E抗体が認められた。また、牛皮及び豚皮より調製したゼラチンは、前処理を問わずァレルゲン性を有していた。

アル力リ処理ゼラチンのアレルゲン性が酸処理ゼラチンと比較して高い理由としては、アルカリ処理によりゼラチン分子の一次構造が変化し、ヒトコラーゲン（ゼラチン）との配列の類似性が失われたためと推察される。

なお、図示はしていないが、市販のグミキャンディ一、ゼリー、ハードカプセルにつ、ても試料液を調製して試験したところ、市販ゼラチンとほぼ同様な結果であつた。これに対して、実施例 2、実施例 3、実施例 4及び実施例 7において、本発明のゼラチン又はペプチドを使用し作製したグミキャンディー、ゼリー、ハード力プセル及び果汁飲料では、ゼラチンアレルギー患者血清中の抗原特異的 I g E抗体との反応性は殆ど認められなかった。

これらの結果から、ゼラチンアレルギー患者にとって、市販の食用ゼラチン、医薬用ゼラチン、化粧品用ゼラチン及び医薬用ゼラチン加水分解べプチドは血中の抗原特異 I g E抗体との反応性が高く、利用を回避しなければならない場合が多いのに対し、本発明のゼラチンは抗原特異 I g E抗体との反応性が低く安全である。また、本発明のゼラチン又はペプチドを使用して作製されたグミキャンディ一、ゼリ —及び果汁飲料などはゼラチンアレルギー患者においても安全に利用できると考えられる。

なお、市販のゼラチン加水分解ペプチドでは、低分子化によるアレルゲン性の低下が期待されていたが、上記試験結果でも明らかなようにその効果は不十分であつた。一方、本発明のペプチドにおいては、元来低アレルゲン性である、本発明のゼラチンを加水分解し低分子化しているため、投与時のアレルギー反応の防止により有効である。試験例 3

安全性の証明（in vivoでの検討）

実施例 2の方法により作製したグミキヤンディ一の安全性について調べるために医療機関の協力のもと、軽症のゼラチンアレルギー患者を対象に負荷試験を行つた。ちなみに、負荷試験は「上野川修一ら編、食品アレルギー対策ハンドブック、 143- 150、 1996、サイエンスフォーラム、東京」に記載の方法に準じて行った。

①対象患者

ゼラチン含有食品摂取によりアレルギー症状を呈した 4名（男女同数、年齢 1〜5歳）とした。なお、試験前に本試験の目的及び内容を十分説明した後、患者の法定代理人及び、可能な場合には患者本人より同意を得た。また、以下のいずれかの項目に該当する患者は除外した。

·反応を修飾するステロイド剤、抗ヒスタミン剤、抗アレルギー剤などを投与された者。

•ゼラチンの除去により症状が軽快しないまたは除去を始めて 1ヶ月以内の者。 •ァナフイラキシーショックまたは急性喘息の恐れがある者。

•その他、担当医師が不適当と判断した者。

②試験食品

実施例 2の方法により 1粒当たり 2. 5gのサイズに作製したグミキヤンディ一を使用した。 ③投与方法

全ての患者は入院管理下において、必ずアナフィラキシ一ショックの対策のため静脈ルートを確保し、法定代理人立ち会いのもと空腹時に投与した。ゼラチンに対する特異 IgE抗体値の結果を参考に投与量を決定し、 single- blindで行った。投与は 1人当り 10粒とし、最初に少量（ 1粒）を与え、反応が出なければ 15分間隔で増量し 1時間で全ての投与を終了した。途中で症状が出現した場合は、その時点で負荷を中止し経過観察することとした。

④観察方法

観察は、皮膚症状、消化器症状、呼吸器症状及びアナフィラキシーに分けて、それぞれ投与前、投与時、投与終了 30分後、 1時間後、 2時間後、 3時間後、 5時間後、 24時間後、 48時間後までフォローアップした。

⑤評価項目

医師が次の 3点について評価した。

(1) その食品によって症状 ·所見が出現したか（陽性の診断)。

(2)身体のどこにどのような症状 ·所見が出現したか（病像の診断)。

(3)初回投与からの症状，所見が出現までの時間（出現時間の診断)。

⑥判定

医師が各観察時における評価項目について総合的に勘案し、試験食品の安全性を 3段階「問題なし、やや問題あり、問題あり」で判定した。

⑦結果

本負荷試験の観察結果を表 3に示す。総合評価結果は、 4人の対象患者のうち 3人が「問題なし」、 1人で「やや問題あり」であった。この患者は、市販のグミキャンディ一では一粒摂取で蓴麻疹が確認されたが、本発明のゼラチンを使用したグミキヤンディ一では一粒摂取では全く問題なく、 10粒摂取後 30分で背中に軽度の蓴麻疹が確認された。表 3

以上の結果から、本試験食品はゼラチンアレルギー患者にとっても、安全かつ、おいしく利用できる代替食品と言える。

Claims

請求の範囲

1 . 家禽類の皮、骨及び Z又は腱由来で、等電点が 7〜 1 0であり、ゼラチンァレルギ一患者血清と抗原抗体反応を生じなヽ又は抗原抗体反応が低値であることを特徵とする、食用、医療用又は化粧品用ゼラチン。

2 . 家禽類の皮、骨及び Z又は腱を酸処理して得られたゼラチンである請求の範囲 1記載の食用、医療用又は化粧品用ゼラチン。

3 . 請求の範囲 1記載のゼラチンを含有する、ゼラチンアレルギー患者に対して低アレルゲン性の食品。

4. 請求の範囲 1記載のゼラチンを含有する、ゼラチンアレルギー患者に対して低アレルゲン性のゼリー、グミキャンディ一、ヨーグルト、ノヽム、ソーセージ、ス一プ、ババロア又はアイスクリーム。

5 .請求の範囲 1記載のゼラチンを含有する、ゼラチンァレルギ一患者に対して低ァレルゲン性の化粧品。

6 . 請求の範囲 1記載のゼラチンを含有する、ゼラチンアレルギー患者に対して低アレルゲン性のクリーム、軟膏又は化 ffi7_K。

7 . 請求の範囲 1記載のゼラチンを含有する、ゼラチンアレルギー患者に対して低アレルゲン性の医療品。

8 . 請求の範囲 1記載のゼラチンを含有する、ゼラチンアレルギー患者に対して低アレルゲン性の医薬用カプセル、パップ剤又はワクチン剤。

9 . 家禽類の皮、骨及び/又は腱を酸溶液に浸漬し、沈澱物を回収し、得られた沈澱物を酸溶液で加熱抽出し、抽出物を精製することからなる請求の範囲 1記載のゼラチンの製法。

1 0 . 請求の範囲 1記載のゼラチン及び Z又はその前駆体であるコラーゲンを加水分解することで得られる、食用、医療用又は化粧品用ペプチド。