WO2000014543A1

WO2000014543A1 - Method for detecting kidney diseases and pathological control

Info

Publication number: WO2000014543A1
Application number: PCT/JP1999/004804
Authority: WO
Inventors: Hiroshi Oda; Kosuke Seiki; Hiroshi Nakajima; Nobuyuki Sato; Yoshihiro Urade; Nobuhito Hirawa; Yoshio Uehara
Original assignee: Maruha Corp; Osaka Bioscience Institute; Japan Science and Technology Corp
Current assignee: Osaka Bioscience Institute; Japan Science and Technology Agency; Maruha Nichiro Corp
Priority date: 1998-09-04
Filing date: 1999-09-03
Publication date: 2000-03-16
Anticipated expiration: 2001-03-04
Also published as: AU750574B2; US7109044B1; EP1111387A4; CA2342897A1; JP3961152B2; JP2000146980A; AU5449199A; KR100705732B1; ATE408145T1; EP1111387B1; DE69939544D1; KR20010078380A; EP1111387A1

Description

明細書

腎疾患の検出および病態管理方法技術分野

本発明は、腎疾患の検出方法、詳しくは、既存の診断法では検出できない早期の腎疾患を検出することのできる腎疾患の早期検出方法、および糸球体濾過能を簡便に評価することによる腎疾患の病態管理方法である。背景技術

近年、糖尿病性腎症のために透析療法に入る患者の数が年々増加している。平成 8年の統計では、 1年間に新たに透析導入された糖尿病性腎症患者数は 9， 351 名で、第一位の慢性腎炎の 10， 995名に極めて近い数字に増加してきている（関川暁ら，第 41回日本糖尿病学会学術集会）。しかし、残念なことに、糖尿病患者の透析療法は、心不全、血圧の動揺、感染症、シャントトラブルなど多くの問題があり、透析導入後の平均余命は 3年程度と短いのが現状である（例えば、日本透析療法学会統計調査委員会，透析会誌， 25， 1095- 1103, 1992参照）。従って、糖尿病性腎症では早期診断による早期治療が重要であると考えられている。

糖尿病性腎症ゃ糸球体腎炎をはじめとした腎糸球体に病変を起こす腎疾患の診断、病態管理において、ィヌリン、クレアチニンなどを対象としたクリアランス試験は、糸球体濾過能を評価する上で有用であるとされている。しかし、クリアランス試験では蓄尿が必要となり、またィヌリン等の外因性物質の投与によるクリァランス試験では外因性物質の静脈注射が必要となるため、試験に要する時間や煩雑さの面からその適用は明らかな腎疾患患者に限られていた。従って、腎疾患が疑われる、あるいは可能性のある患者の日常的な診断法としてクリアランス試験が用いられることは少なく、持続性蛋白尿の検出や血中クレアチニン濃度の測定によって診断が行われるケースが多かった。ところが、持続性蛋白尿の出現する時期や血中クレアチニン濃度の上昇する時期には、既に非可逆性の糸球体病変が進行していることも知られている（例えば、「腎臓学」，黒川清編， 249-25 1頁，（1995)参照）。従って、持続性タンパク尿の検出や血中クレアチニン濃度の測定は、病変の初期段階を有効に検出できる手段とはなり得ない。近年、尿中に排泄される種々の蛋白質の測定が可能となり、例えば糖尿病性腎症においては尿中へのアルブミンの増加、即ち、微量アルブミン尿が持続性蛋白尿に先行することが明らかとなった。そこで現時点では、微量アルブミン尿などの出現をもって腎疾患を診断することが一般化している。

糖尿病性腎症およびそれ以外の腎症の病期分類としては、一般的には、第 1期 (腎症前期）、第 2期（早期腎症期）、第 3期（顕性腎症期）、第 4期（腎不全期）、第 5期（透析療法期）に分類される（繁田幸男ら，平成 3年度糖尿病調査研究報告書，厚生省， 317-320， 1992) 。微量アルブミン尿を呈する時期は、上記のうち第 2期（早期腎症期）に該当し、病理学的にはこの時期には既に軽度から中等度のびまん性病変が存在し、結節性病変の存在も知られている。例えば糖尿病性腎症においては、腎糸球体基底膜の肥厚およびメサンギゥム領域の拡大が特徴とされている力く、臨床的に微量アルブミン尿の認められない時期より、これらの変化が既に存在することも知られている（猪股茂樹ら，糖尿病， 30， 429-43 5, 1987、 Bangstad, H. , J. et al.， Diabetologia, 36， 523-529, 1993) 。従つて、第 2期（早期腎症期）は必ずしも初期腎症とは限らず、あくまでも現在の臨床検査で診断可能な時期と解されている。これに対し、微量アルブミン尿を呈する以前の第 1期（腎症前期）に生ずる異常については事実上腎生検でしか検出できないと考えられる。しかしながら、腎生検は侵襲的であるが故、苦痛や危険性を伴い、また検査開始から結果が出るまでに多大な手間や時間がかかる。よつて、このような微量アルブミン尿を呈する以前の異常を、非侵襲的に検出できる簡便な検査法の開発が望まれるところである。

このような状況下、尿中 IV型コラーゲンが腎症前期においても増加することが報告され、糖尿病性腎症のより早期の指標となり得る可能性が示された（Hayash i, Y. et al. , Diabet i c Medi cine, 9， 366-370, 1992、 Yagame, M. e t al. , J . Cl in. Lab. Anal. , 11, 110-116, 1997) 。このような尿中 IV型コラーゲンの増加は、腎糸球体基底膜の肥厚およびメサンギゥム基質の増生、拡大などの組織的変化を反映して、糸球体基底膜、糸球体上皮細胞、或いは尿細管上皮細胞においてその産生が亢進することが原因であると考えられている（磯野元秀ら，糖尿病， 39， 599-604, 1996) 。しかしながら、このような腎糸球体における組織的変化が生じてしまう以前にも、腎糸球体組織内の細胞レベルでは、糖尿病に特徴的な高血糖に対応して、代謝や形態など様々な変化が生じているものと考えられる。例えば、糖尿病ラッ卜糸球体、高糖濃度条件下で培養した糸球体、メサンギゥム細胞などでプロティンキナーゼ C活性の亢進が報告されており、糖尿病性腎症をはじめとした糖尿病合併症における組織的変化との関連が注目されている（ Craven, P. , A. and DeRubertis, F. R.， J. Clin. Invest. , 83， 1667-1675, 1 989 、 Williams, B. and Sc rier, R. W. , Diabetes, 41， 1464-1472, 1992 ) 。従って、このような細胞レベルの質的な変化をより早期に検出できれば、組織的変化が生じてしまう以前により効果的な対処が取れるものと考えられるが、これまでのところ臨床的にそのような有用性を検討した報告はない。

一方、ヒトリポカリン型プロスタグランジン D合成酵素（以下い PGDS) は、各種プロスタグランジン類の共通の前駆体である PGH₂から、睡眠誘発作用をはじめとした各種生理作用を示す PGD₂への異性化を触媒する酵素である（Urade, Y.， F ujimoto, N.， and Hayaishi, 0. , J. Biol. Chem. , 260, 12410-12415, 1985、 U rade, Y.， Watanabe, K. , and Hayaishi, 0.， J. Lipid Mediator Cell Signali ng, 12, 257-273, 1995) 。近年、この L- PGDSが、ヒ卜脳脊髄液（CSF)中に多量に存在することが知られていた -トレースと同一であることが明らかにされた（H of fmann, A.， Conradt, H. S. , Gross, G.， Nimi tz, M. , Lottspeich, F.， and Wurster, U.， J. Neurochem. , 61, 451-456, 1993 、 Zahn, M. , Mader, M. , Sch midt, B.， Bol lensen, E. , and Felgenhauer, K. , Neurosci. Let. , 154, 93-95 ， 1993、 Watanabe, K. , Urade, Y. , Mader, . , Murphy, C.， and Hayaishi, 0. , Biochem. Biophys. Res. Commun. , 203, 1110-1116, 1994) 。

い PGDSがまだ^ -トレースと呼ばれていた 1969年に、 Ericssonらは腎疾患と 3- トレース（L- PGDS) の関連性を示唆する論文を発表している（Ericsson, J., Li nk, H.， and Zettervall, 0., Neurology, 19, 606-610, 1969) 。即ち、当時の測定法は技術的に未熟であったため、健常者の血中および尿中ではい PGDSが検出できなかったが、血中クレアチニン澳度およびクレアチニンクリアランスに異常が認められる慢性腎炎をはじめとする腎疾患患者の血中および尿中ではい PGDSが検出され、これら患者でその濃度が上昇することが示唆された。また、 Fe l genha uerらも、健常者では検出されない血中い PGDSが、 1例のみであるが腎不全患者において検出されたと報告している（Fe l genhauer, K.， Schad l i ch, H. J. , and Neki c, M. , Kl i n. Wochenschr. , 65, 764-768, 1987 ) 。これに対して、 Wh i ts edらは、より高感度の測定法を開発し、健常者とタンパク尿を呈する腎疾患患者の尿中い PGDS濃度（24時間当たりの排泄量）を比較したが、腎疾患患者が必ずしも高濃度のい PGDSを示すとは限らないとの報告を行っている（Whi t sed, H. , and Penny, R.， Cl i n. Chim. Acta, 50, 111-118, 1974 ) 。このように、研究者によって腎疾患とい PGDSの相関性について意見が分かれているのは、これらの報告で用いている測定法がポリクローナル抗体を用いた古典的な免疫学的方法に基づく半定量的なものであるためであると考えられる。最近、ドイツの Hof fmannらは、より定量性の高い測定系を用いて、末期腎不全である透析療法期の患者の血中い PGDS濃度が、健常者と比べ著しく上昇していること確認した（Hof fmann, A.， Nimtz, M.， and Conradt, H. S.， Gl ycob i o l ogy, 7， 499-506， 1997 ：) 。しかしながら、彼らの測定法では特異性を明らかにしたモノクロ一ナル抗体を用いているものの、血液試料からレ PGDSを精製した後、ウェスタンブロッテイングを行い、バンドの濃さを比較するという煩雑な方法であるため、小さな濃度差を正確に比較することはやはり困難であると考えられる。

このように、これまでに行われてきた腎疾患とい PGDS ( -トレース）の相関性に関する検討は、何れも、クレアチニンの動態に異常を示す、タンパク尿を呈する、透析療法期である、といったように、既存の検査手段で腎疾患が明らかに進展していることを確認した患者を対象にして、 L- PGDSの著しい濃度上昇を検出したに過ぎない。これに対し、腎疾患が進展する以前のい PGDS濃度に関する検討はこれまで全くなされていなかった。発明の開示

本発明の課題は、これまでの肾疾患に対する種々の検査手段では検出することのできなかった早期腎症期以前に生ずる腎異常を、正確に且つ被験者の負担が少なく検出することのできる方法を提供することにある。更に、これまで時間や手間のかかるクリアランス試験によって評価していた糸球体濾過能を、簡便且つ短時間に評価することのできる方法を提供することにある。

本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、血液、尿等の体液中い PGDS濃度を測定し、その測定値を指標とすることより、疾患がある程度進展した早期腎症期以前の腎疾患を発見することができることを見い出し、更に、その測定値を指標にすることにより、腎疾患患者の病態管理を行えることを見い出し、本研究を完成させるに至った。

即ち、本発明は、被験者より採取した体液試料中のい PGDSを測定し、その測定値を健常者より採取した体液試料中のい PGDS濃度の測定値から設定した基準値と比較することを特徴とする、腎疾患の早期検出方法である。

本発明はまた、被験者より採取した体液試料中のい PGDS濃度を測定し、その測定値から糸球体濾過能を評価することを特徴とする、腎疾患の病態管理方法であ。以下本発明を詳細に説明する。

本発明において、レ PGDSを測定する試料は、被験者から採取した体液であり、具体的には、血液、尿（随時尿、蓄尿等）、羊水等が挙げられる。

上記試料中のい PGDS濃度を測定する方法としては、 L-PGDS濃度を正確に反映する測定法であれば特に限定はされず、例えば免疫学的測定法、酵素活性測定法が挙げられる。しかしながら、実際の臨床現場において、簡便に且つ多量の試料を同時に測定する必要性の観点から、 L-PGDSに特異的なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を用いた E 1A、 ELISA、 RIA、 F IA等の免疫学的測定法によるのが好適である。

上記の免疫学的測定法のうち、特に、い PGDS特異的モノクローナル抗体を使用したサンドイッチ ELISA法が好ましく、該モノクローナル抗体としては、具体的には、ハイプリドーマ細胞株 1B7 (FERM BP- 5709) 、 7F5 (FERM BP-5711) 、 6F5 (FERM BP-5710) 、 9A6 (FERM BP- 5712) 、 10A3 (FERM BP- 5713) より産生される抗体が挙げられる。

サンドィツチ EL ISA 法による測定に際しては、既に本発明者らにより確立されている、上記モノクローナル抗体を含むい PGDS検出キッ卜を利用すればよい（W0 97/16461) 。

本発明においては、上記手段で測定されたい PGDS濃度測定値を指標として腎疾患を早期に検出し、また当該測定値から糸球体濾過能を評価することによって、腎疾患の病態を管理することができる。

本発明の方法では、上記手段で測定した被験者の体液試料中のい PGDS濃度測定値を健常者の体液試料中のレ PGDS濃度より設定した基準値と比較することにより、腎疾患を検出する。

ここで「基準値」とは、陽性 ·陰性を判定するための値をいい、臨床現場ではカツトオフ値とも呼ばれる。この基準値は、例えば「健常者の平均値」 + ( X 標準偏差）により設定することができる。ここで、は 0 . 5 , 1， 2 , 5などであり、正規分布をとる集団では 2が用いられるケースが多い。

腎疾患の検出は、具体的には、まず健常者からなる集団を対象としてその体液試料中の L-PGDS濃度を測定して上記式より基準値を設定し、次に、被験者の体液試料中の L- PGDS濃度の測定値が、基準値以上の値を示した（異常値を示した）場合に陽性と判定することによって行う。

また、腎疾患の病態を管理するには、上記手段で測定した被験者の体液試料中のレ PGDS濃度測定値から糸球体濾過能を評価することによって行う。

本発明において、病態の管理とは、病状（重篤度の程度）の把握、予後の観察をいう。

本発明の方法により検出され、または病態の管理が行える腎疾患としては、例えば、糸球体病変を伴うもの、高血圧性腎障害、脂質代謝異常性障害などが挙げられ、具体的には腎症など、さらに具体的には、糸球体腎炎、ネフローゼ症候群、糖尿病性腎症、多発性囊胞腎、または腎不全などが挙げられる。ここで、糖尿病性腎症には、例えば微量アルブミン尿を呈する時期以前や尿中 IV型コラーゲンの増加が見られる以前の極めて初期の糖尿病性腎症も含まれる。図面の簡単な説明

図 1は、血中い PGDS濃度と血中クレアチニン濃度の相関性を示す。図 2は、尿中い PGDS指数と尿中アルブミン指数の相関性を示す。

図 3は、尿中い PGDS指数と尿中 IV型コラーゲン指数の相関性を示す。

図 4は、各種腎疾患患者における血中い PGDS濃度と血中クレアチニン濃度（A

) 、および尿中い PGDS指数と尿中アルブミン指数（B) を示す。

図 5は、血中い PGDS濃度 ·血中クレアチニン濃度と糖尿病歴の相関性（A) 、および尿中い PGDS指数 ·尿中アルブミン指数と糖尿病歴の相関性（B) を示す。図 6は、血中い PGDS濃度とクレアチニンクリアランスの相関性（A) 、および尿中い PGDS指数とクレアチニンクリアランスの相関性（B) を示す。

図 7は、尿中アルブミン指数を基に分類した各アルブミン尿期における、尿中い PGDS指数と尿中 IV型コラーゲン指数の変化を示す。

図 8は、尿中アルブミン指数を基に分類した各アルブミン尿期における、尿中い PGDS指数と尿中 IV型コラーゲン指数の陽性率を示す。

図 9は、尿中 IV型コラーゲン指数陽性 *陰性の糖尿病患者における、尿中い PG DS指数の陽性率を示す。発明を実施するための最良の形態

以下に、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に何ら限定されるものではない。

〔参考例〕（健常者の血中および尿中い PGDS濃度の測定と基準値の設定）健常者から採取した血液（血清）および随時尿について、これら体液試料におけるい PGDS濃度を 2抗体サンドィツチ EL ISA法により測定し、基準値の設定を行つ丁：o

( 1 ) 標準曲線の作成

まず、 L- PGDSと結合可能な抗ぃ PGDSモノクローナル抗体（クローン： 7F5) を 5 OmM炭酸緩衝液（pH 9. 6) に 4. 4 /z g/mlになるように希釈し、 96ウェルマイクロタイタ一プレートに 300 ^ 1/ゥエルずつ加えて、 4°Cで一晩放置し固相化した。このプレートをリン酸緩衝生理食塩水（pH 7. 4、以下 PBS) で 3回洗浄した後、 0. 2¾！力ゼインを含む PBS (pH 7. 4、以下ブロッキング液）を 300 1/ゥエル加えて 30°Cで 90分インキュベートし、ブロッキングを行った。

次いで、ブロッキング後のプレートを 0. 05¾!Tween20を含む PBS (T-PBS) で 3回洗浄した後、 100 ^ 1の標準し -PGDS溶液（CSFより純化したい PGDSをブロッキング液で段階希釈することにより調製）を各ゥエルに加え、 30°Cで 90分間インキュべ一卜した。反応後、 T-PBSで 3回洗浄し、ブロッキング液で 0. 5 g/mlになるように希釈した西洋ヮサビペルォキシダーゼ標識化抗 PGDSモノクローナル抗体（ク口ーン： 1B7) 100 1を各ゥエルに加え、 30°Cで 90分間インキュベー卜した。 T- PBS で 3回洗浄した後、発色液（ABTS solut i on：ベーリンガ一マンハイム社製） 100 1を各ゥエルに加え、 30°Cで 30分間インキュベートした後、停止液（ 1. 5%シュゥ酸）を 100 1ずつゥエルに加え、プレートミキサーで撹拌して反応を停止させた。市販のプレートリーダー（型番 SK601 、生化学工業社製）により 405nmと 490 nmにおける吸光度の差（A405nni- A490nni) を測定し、標準曲線を作成した。

上記サンドイッチ ELISA法に用いたモノクローナル抗体（クローン： 1B7、 7F5 ) は、マウス腹腔内にプリスタン 1. 0mlを注射し、その後 2週間目にそれぞれの抗体産生細胞株を 1 X 10⁸個マウスの腹腔内に移植し、 2週間後に腹水を採取し、得られた腹水をプロティン Aァフィ二ティーカラムクロマトグラフィ一操作にかけることにより得た（3〜10mg/ml) 。

尚、上記モノクロ一ナル抗体を産生する細胞株はそれぞれ上記モノクロ一ナル抗体名に一致し、それぞれの細胞株は、工業技術院生命工学工業技術研究所（曰本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号）に、 1B7については FERM BP- 5709 (原寄託日平成 7年 9月 21日）、 7F5については FERM BP-5711 (原寄託日平成 8年 6月 6日）として寄託されている。

( 2 ) 試料中のい PGDS濃度の測定

血液は 192例、随時尿は 56例を用い、それぞれブロッキング液で適宜希釈して、上記のサンドイッチ ELISA法に従ってい PGDS濃度を測定した。測定の結果、健常者によって得られた平均値土標準偏差は、血中では 0. 848±0. 186 g/mlであつた。随時尿を用いた検討では、採尿時の尿の濃さの違いによる影響を考慮して、尿中クレアチニン濃度による換算を行い、尿中い PGDS指数（い PGDS/g- creat i ni ne) として表すこととした。その結果、健常者によって得られた尿中い PGDS指数の平均値土標準偏差は、 2.44±1.86mg/g- creatinineであった。このようにして得られた平均値士標準偏差から前記式に従い、平均値 + (2 X標準偏差）で基準値を設定したところ、血中で 1.22 g/ml、尿中で 6.16mg/g-creatinineという値が得られた。

以下の各実施例において、体液試料（血液、尿）中のい PGDSの測定は参考例の方法に従い、クレアチニンの測定はアル力リピクリン酸法、尿中アルブミンの測定はラテックス凝集法、尿中 IV型コラーゲンの測定はサンドィツチ ELISA法によつて行った。また、尿試料は随時尿を用いたため、濃度差を考慮して、尿中クレァチニンによる換算を行った（尿中い PGDS指数：い PGDS/g- creatinine 尿中ァルブミン指数：アルブミン/ g-creatinine、尿中 IV型コラーゲン指数： IV型コラ一ゲン g - creatinine) ₀

〔実施例 1〕（L— PGD Sと血中クレアチニン、尿中アルブミン、および尿中 IV型コラーゲンとの相関性）

内科外来患者 118名を対象として、血中い PGDS濃度、血中クレアチニン濃度、尿中い PGDS指数、尿中アルブミン指数をそれぞれ測定した。また、内科外来患者 284名を対象として、尿中い PGDS指数と尿中 I V型コラーゲン指数を測定した。図 1〜 3にそれぞれ示されるように、血中い PGDS濃度と血中クレアチニン濃度、尿中い PGDS指数と尿中アルブミン指数、および尿中い PGDS指数と尿中 IV型コラ一ゲン指数は、いずれも高い相関性を示した。従って、い PGDSは、これまでの血中クレアチン、尿中アルブミン、尿中 IV型コラーゲンに匹敵する腎疾患診断の指標となり得ることが明らかとなった。

〔実施例 2〕（各種腎疾患患者におけるレ PGDS濃度の変化）

腎疾患患者 42名（慢性腎不全： 11名、糸球体腎炎： 23名、多発性囊胞腎： 8名 ) を対象として、血中い PGDS濃度および尿中い PGDS指数の測定を行った。同時に血液試料に関しては血中クレアチニン濃度を、尿試料に関しては尿中アルブミン指数を測定した。結果を図 4に示す。

図 4に示されるように、全ての腎疾患において血中い PGDS濃度および尿中い PG DS指数が健常者に対し有意に増加することが明らかとなった。また、血中クレアチニン濃度、尿中アルブミン指数も上昇したが、 p値（危険率）を比較すると、い PGDSの方がより小さい値を示した。従って、い PGDSは血中クレアチニン、尿中アルブミンよりも優れた腎疾患診断の指標となり得るといえる。

〔実施例 3〕（糖尿病患者におけるし -PGDS濃度の変化）

糖尿病患者 55名を対象として、血中い PGDS濃度および尿中 L- PGDS指数の測定を行った。同時に血液試料に関しては血中クレアチニン濃度を、尿試料に関しては尿中アルブミン指数を測定した。患者を糖尿病歴によって分類した（5年未満： 22名、 5年以上 10年未満： 19名、 10年以上： 14名）結果を図 5に示す。

図 5に示されるように、血中い PGDS濃度および尿中い PGDS指数はともに病歴が長くなるに従って上昇することが判明した。また、血中クレアチニン濃度、尿中アルブミン指数も病歴が長くなるほどに上昇したが、 p値（危険率）を比較すると、 L- PGDSの方がより小さい値を示した。糖尿病では腎症を合併しやすいことから、い PGDSは血中クレアチニン、尿中アルブミンよりも優れた腎症移行の指標となり得るといえる。

〔実施例 4〕（糖尿病患者における追跡調査）

実施例 3において、血中クレアチニン濃度、尿中アルブミン指数とも正常値を示したが、血中い PGDS濃度およびノまたは尿中い PGDS指数に異常値を示した患者 6名に関して、 2年間の追跡調査を行った。尚、い PGDSの異常値は、健常者の平均値 + ( 2 X標準偏差）（血中： 1. 22 g/ml、尿中： 6. 16mg/g- creat i ni ne) 以上、血中クレアチニン濃度の異常値は 1. lmg/d l以上、尿中アルブミン指数の異常値は 30mg/g- creat i ni ne以上とした。結果を表 1に示す。表 1 糖 ^患者における披赌 1 被麟 2 被 ¾¾3 彼験者 4 被 5 被 ¾¾6 血中クレアチン ig¾(mg/dl) 0.9 1.0 0.8 0.7 0.9 0.7

尿中アルブミン f¾¾(mg/g-creatinine) 15.9 28.8 15.2 19.4 8.8 10.1

血中い PCDS離 (/ g/ml) 1.86 * し 69 * 1.25 * 1.06 0.70 0.94

^L-PGDSiH¾(mg/g-creatinine) 13.6G" 12.21' 5.79 14.94* 9.80 '

〔2糊

血中クレ 7チン ¾¾(mg/dl) 1.3 - 5.5 * 3.4 * 0.6 1.1 * 0.7

尿中了ルフ |¾0ng creatinine) 64.9 * 373.8 ' 269.0 * 29.1 8.8

血中い PGDS雌 (tfg/ml) 2.03 ' 6.91 ' 1.73 * 1.14 1.37 ' し 12

尿中し- PGDS†i¾(mg/g-crea t i n i ne) 14.60* 17.57* 19.59* 5.10 7.75 * 6.72 * 異常値表 1に示されるように、試験開始時には 6名全員が血中クレアチニン濃度、尿中アルブミン指数とも正常値を示したが、 2年後には 6名中 4名で血中クレアチニン濃度、尿中アルブミン指数ともに異常値を示し、腎症を併 ο 発していることが明らかとなった。このことは、現在の臨床診断で検出不可能な極めて初期の腎症を、い PGDS濃度測定によって検出することが可能であることを示しており、その濃度測定値が健常者の平均値 + (2 X標準偏差）以上を示す者を陽性と判断することが適していることが明らかとなった。

〔実施例 5〕（内科外来患者における追跡調査）

実施例 1において、血中クレアチニン濃度、尿中アルブミン指数はともに正常値を示したが、血中い PGDS濃度および Zまたは尿中 L- PGDS指数が異常値を示した患者 8名に関して、 2年間の追跡調査を行った。尚、 L- PGDS濃度の異常値は健常者の平均値 + (2 X標準偏差）（血中： 1.22 g/mし尿中： 6.16mg/g- creatinin e) 以上、血中クレアチニン濃度の異常値は 1. lmg/cH以上、尿中アルブミン指数の異常値は 30mg/g-creatinine以上とした。結果を表 2に示す。表 2

内者における^ s¾

被 1 2 被験者 3 彼鮮 4 腦者 5 被！ ¾#6 彼 7 被血中クレアチン麒 (mg/dl) 0.7 0.9 1.0 0.7 0.7 0.8 0.6 0.6 尿中 7ルプミン il¾(mg/g-creatinine) 9.5 10.0 22.1 12.3 5.8 20.5 15.9 8.8 血中い rasas (yg/mi) 2.03 ' 1.68 * 1.88 * 1.39 ' 0.89 0.79 1.20 1.03 尿中い PGDS¾¾(ing/g-crea tinine) 16.51* 8.87 * 5.44 11.94 * 14.58 7.62

〔2糊

血中，レアチン離 (mg/dl) 1.2 * 0.8 3.2 * 2.7 * 1.2 * 1.3 * 0.9 0.7 尿中 7ルブミン itii(mg/ g-crea t i n i ne) 47.2 * 9.5 523.3 * 633.7 * 349.0 * 98.5 ' 14.0 7.0 血中 PCDS離 (us/ml) 1.38 ' 1.16 2.08 * 3.21 * 1.61 * 1.23 * 1.07 0.93 尿中い PGDSig¾(mg/g-crea tinine) 7.93 * 9.27 ' 16.52 * 22.74 * 9.60 * 17.77 * 13.41 5.72 異常値

表 2に示されるように、試験開始時には 8名全員が血中クレアチニン濃度、尿中アルブミン指数ともに正常値を示していたが、 2年後には 8名中 5名で血中クレアチニン濃度、尿中アルブミン指数ともに異常値を示し、腎疾患を発症していることが明らかとなった。このことは、現在の臨床診断で検出不可能な極めて初期の腎疾患を、 L-PGDS濃度測定によって検出することが可能であることを示しており、その濃度測定値が健常者の平均値 + (2 X標準偏差）以上を示す者を陽性と判断することが適していることが明らかとなつた。

〔実施例 6〕（糸球体病変の病態管理）

糸球体腎炎患者および慢性腎不全患者 11名を対象として、 24時間クレアチニンクリアランスと血中 L-PGDS濃度および尿中い PGDS指数の測定を行った。尚、尿中し- PGDS指数の測定には随時尿を用いた。結果を図 6に示す。

図 6に示されるように、血中い PGDS濃度および尿中い PGDS指数は、共にクレアチニンクリアランスと高い相関性を示し、い PGDS濃度測定は糸球体濾過能の評価に有用であることが明らかとなった。い PGDSの測定には蓄尿ゃ外因性クリアランス物質の投与が必要でないため、本法により糸球体病変の病態管理を簡便に行うことが可能となった。

〔実施例 7〕（糖尿病性腎症の進行と L-PGDS濃度）

糖尿病患者 101名を対象として、尿中い PGDS指数の測定を行った。同時に尿中アルブミン指数および尿中 IV型コラーゲン指数も測定した。尿中アルブミン指数より糖尿病性腎症の進行程度を、正常アルブミン尿期（尿中アルブミン指数： 30 mg/g- creatinine未満、 57名）、微量アルブミン尿期（同： 30mg/g- creatinine以上 300mg/g- creatinine未満、 27名）、顕性タンパク尿期（同： 300mg/g- creatini ne以上、 17名）に分類した結果を図 7に示す。

図 7に示されるように、尿中い PGDS指数および尿中 IV型コラーゲン指数は共に糖尿病性腎症の進行に伴って増加してくることが明らかとなった。従って、尿中い PGDSは、尿中アルブミンまたは尿中 IV型コラーゲンに匹敵する早期糖尿病性腎症の指標となり得るといえる。

更に、正常アルブミン尿期の糖尿病患者の尿中い PGDS指数は健常者より有意に高かったが、尿中 IV型コラーゲン指数ではこのような有意差が認められないことが判明した。このことは、尿中アルブミンや尿中 IV型コラーゲンの測定では検出できない極めて初期の糖尿病性腎症が、尿中 L-PGDSの測定では検出可能であることを示している。

〔実施例 8〕（糖尿病性腎症の進行と陽性率）

実施例 7で分類した各アルブミン尿期の患者における、尿中い PGDS指数および尿中 IV型コラーゲン指数の陽性率を調べた。尿中い PGDS指数の異常値は、実施例 5に従い、 6.16mg/g-creaUnine 以上とした。また、尿中 IV型コラーゲン指数の異常値は、磯野らの基準に従い、 3.7 zg/g- creatinine以上とした（磯野元秀ら，糖尿病， 39， 599-604, 1996) 。各々、異常値を示した場合を陽性と判定した結果を図 8に示す。

図 8に示されるように、顕性タンパク尿期の患者では、尿中い PGDS指数と尿中 IV型コラーゲン指数は共に 100!¾陽性を示した。しかし微量アルブミン尿期の患者では、尿中い PGDS指数の陽性率が尿中 IV型コラーゲン指数の陽性率を僅かに上回つていた（74. 1¾ vs 70. 4¾) 。更に正常アルブミン尿期の患者では、尿中い PGDS 指数の陽性率は尿中 IV型コラーゲン指数の陽性率を大きく上回っていた（57. 9% vs 36. 8¾) o

更に、これら糖尿病患者 101名を尿中 IV型コラーゲン指数の基準値で 2群に分類し、陽性群 ·陰性群における尿中い PGDS指数の陽性率を検討した結果を図 9に示す。

図 9に示されるように、尿中 IV型コラーゲン指数陽性症例では尿中い PGDS指数も 90%以上が陽性と判定され、両者の結果はほぼ一致した。一方、尿中 IV型コラ一ゲン指数が陰性でも、尿中 L- PGDS指数が陽性と判定された症例が 40¾存在していた。

以上の結果は、尿中アルブミンまたは尿中 IV型コラーゲンの測定では検出できない極めて初期の糖尿病性腎症が、尿中 L- PGDSの測定では検出可能であることを示している。

〔実施例 9〕（糖尿病患者における後ろ向き調査）

実施例 7の被験者の内、尿を 2〜 3年前に採取し、 - 20°Cにて保存していた 63 名を対象として、保存尿中のい PGDS、アルブミン、 IV型コラーゲン指数を測定した。尿中アルブミン指数の異常値は、日本糖尿病学会 · 日本腎臓学会の合同委員会の診断基準に従い、 30mg/g- creat inine以上とした。また、尿中 L- PGDSおよび I V型コラーゲン指数の異常値は、実施例 8と同様とした。

その結果、保存検体における尿中アルブミン指数および尿中 IV型コラーゲン指数とも正常値を示したが、尿中い PGDS指数のみ陽性と判定される患者が 8名存在することが明らかとなった。これら 8名について、以前（2〜3年前）および現在の尿中い PGDS、アルブミン、 IV型コラーゲン指数をまとめたものを表 3に示す表 3

糖尿病患者における後ろ向き i¾g 彼披鮮 3 彼儲 4 彼赌 5 被鮮 8 謹〕

アルブミン ¾St(mg g-creatinine) 9.6 10.9 2.3 18.9 6.7 0.6 8.8 5.7

IVSコラ-ゲン iaii k^g/g-creatinine) 2.6 1.5 1.2 2.2 1.1 2.7 3.0 3.5

L-PCDSig¾(mg/g-creat inine) 6.60 * 9.68 ' 10.34 * 9.08 ' 6.43 ' 7.89 * 7.09 ' 6.79 ' 画 - アルブミン ¾¾¾(mg/g-creat inine) 55.3 * 234.4 . 51.1 * 12.3 39.5 ' 31.0 * 9.9 31.8 *

1V コラーゲン ¾ί¾ (yg/g-creat inine) 9.1 ' 22.8 * 7.3 * 11.6 · 2.6 10.0 * 3.7 * 3.8 ·

L-PGDSi¾i(mg/g-creat inine) 9.41 ' 16.12 * 8.12 * 6.28 * 16.29 * 4.93 10.21 * 異常値

以前〜現在の尿中い PGDS指数を見ると、正常値になった者は 1名のみであり（被験者 7) 、残りの 7名は依然として異常値を示していた。これら 7名の内、 2 〜 3年間で更に尿中アルブミン指数のみが異常値を示すようになつた者が 1名（被験者 5 ) 、尿中 IV型コラーゲン指数のみが異常値を示すようになった者が 2名 (被験者 4、 7) 存在した。加えて、尿中アルブミン指数および尿中 IV型コラーゲン指数が共に異常値を示すようになった者は 5名存在した（被験者 1、 2、 3 、 6、 8) o

これらのことは、尿中い PGDSの測定によって、尿中アルブミンや尿中 IV型コラ一ゲンの測定では検出できない極めて初期の糖尿病性腎症を検出することが可能であることを示している。産業上の利用可能性

本発明によれば、糸球体腎炎、糖尿病性腎症などの腎糸球体に病変を有する腎疾患の指標として現在用いられている血中クレアチニンや尿中アルブミンよりも顕著に腎異常を検出することのできる方法が提供される。しかも、本発明方法は

、血中クレアチニン、尿中アルブミン、尿中 IV型コラーゲンで異常を示さない、現在の臨床診断で検出不可能な早期腎症期以前の腎疾患をも、極めて正確に且つ被験者の負担を少なく検出できる。更に、本発明方法により、蓄尿ゃ外因性クリァランス物質の投与を必要とせず、糸球体濾過能の評価を簡便に行うことができる。従って、本発明方法は、腎疾患の早期発見と、患者の病態管理に極めて有用あ^。

Claims

請求の範囲

1 . 被験者より採取した体液試料中のヒトリボカリン型プロスタグランジン D合成酵素濃度を測定し、その測定値を健常者より採取した体液試料中のヒトリボカリン型プロスタグランジン D合成酵素濃度の測定値から設定した基準値と比較することを特徴とする、腎疾患の早期検出方法。

2 . 被験者より採取した体液試料中のヒトリボカリン型プロスタグランジン D合成酵素濃度を測定し、その測定値から糸球体濾過能を評価することを特徴とする、腎疾患の病態管理方法。

3 . 体液試料中のヒトリポカリン型プロスタグランジン D合成酵素濃度の測定を、免疫学的測定法により行うことを特徴とする、請求項 1〜2のいずれかに記載の方法。

4 . 腎疾患が糸球体病変を伴うものである、請求項 1〜 3のいずれかに記載の方

5 . 腎疾患が高血圧性腎障害、または脂質代謝異常性腎障害である、請求項 1〜 3のいずれかに記載の方法。

6 . 腎疾患が肾症である、請求項 1〜3のいずれかに記載の方法。

7 . 腎疾患が糸球体腎炎、ネフローゼ症候群、糖尿病性腎症、腎硬化症、多発性囊胞腎、または腎不全である、請求項 1〜3のいずれかに記載の方法。