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WO2000010560A1 - Moyens de traitement ou de prevention contenant des composes de cyclopentenone comme principe actif - Google Patents

Moyens de traitement ou de prevention contenant des composes de cyclopentenone comme principe actif Download PDF

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Publication number
WO2000010560A1
WO2000010560A1 PCT/JP1999/004323 JP9904323W WO0010560A1 WO 2000010560 A1 WO2000010560 A1 WO 2000010560A1 JP 9904323 W JP9904323 W JP 9904323W WO 0010560 A1 WO0010560 A1 WO 0010560A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cyclopentenone
acid
group
pentenone
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP1999/004323
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Eiji Kobayashi
Hiromu Ohnogi
Hiroaki Sagawa
Takanari Tominaga
Eiji Nishiyama
Nobuto Koyama
Katsushige Ikai
Ikunoshin Kato
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Takara Shuzo Co Ltd
Original Assignee
Takara Shuzo Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Takara Shuzo Co Ltd filed Critical Takara Shuzo Co Ltd
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Priority to EP99937010A priority patent/EP1112742B1/en
Priority to US09/763,244 priority patent/US6548543B1/en
Priority to KR1020017001696A priority patent/KR20010072356A/ko
Priority to AU51957/99A priority patent/AU5195799A/en
Priority to DE69921670T priority patent/DE69921670T2/de
Publication of WO2000010560A1 publication Critical patent/WO2000010560A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • C07C69/013—Esters of alcohols having the esterified hydroxy group bound to a carbon atom of a ring other than a six-membered aromatic ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C2601/00—Systems containing only non-condensed rings
    • C07C2601/06—Systems containing only non-condensed rings with a five-membered ring
    • C07C2601/10—Systems containing only non-condensed rings with a five-membered ring the ring being unsaturated
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    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to a medicament containing a pentenone ester as an active ingredient.
  • Conventional technology a pentenone ester as an active ingredient.
  • drugs used in clinical therapy are diverse, including alkylating agents, metabolic inhibitors, anticancer agents such as plant alkyloids, antibiotics, immunostimulants, and immunomodulators. These drug therapies are not yet complete.
  • prostaglandins ⁇ and J which have ⁇ , ⁇ monounsaturated carbonyls on the 5-membered ring, among natural prostaglandins, inhibit DNA synthesis, thereby providing highly safe control. Its potential as a cancer drug has been reported, and various derivatives thereof have been synthesized (see JP-A-62-96438). Purpose of the invention
  • the main object of the present invention is to develop a pentenone derivative having various physiological actions and provide a drug containing the compound as an active ingredient.
  • FIG. 1 is a diagram showing a 1 H-NMR spectrum of diisobutyrylcyclopentenone.
  • FIG. 2 is a diagram showing a 1 H-NMR spectrum of dimethoxyacetylcyclopentenone.
  • FIG. 3 is a diagram showing a 1 H-NMR spectrum of dimethyl fumaryl cyclopentenone.
  • FIG. 4 is a diagram showing the 1 H—NMR spectrum of dimethyl maleyl cyclopentenone.
  • FIG. 5 is a graph showing the relationship between the amount of pentenone derivative administered and the rate of increase in paw edema.
  • FIG. 6 is a graph showing the relationship between the amount of pentenone derivative administered and the rate of delayed hypersensitivity reaction.
  • FIG. 7 is a graph showing the relationship between the concentration of pentenone in dipropionyl cyc mouth and the uptake of 3 H-thymidine.
  • FIG. 8 is a graph showing the relationship between dipropionylcyclopentenone concentration and 3 H-thymidine incorporation.
  • R and F may be the same or different and represent hydrogen, an aliphatic group, an aromatic group or an araliphatic group.
  • cyclopentenone Formed by the reaction of 4,5-dihydroxy-2-cyclopentene-11-one (hereinafter simply referred to as cyclopentenone) represented by the formula: carboxylic acid and Z or a reactive derivative thereof.
  • Derivatives have physiological activities such as strong immunomodulatory action, anti-inflammatory action, inhibitory action on sever necrosis factor production, antifungal action, and cell adhesion inhibitory action This led to the completion of the present invention.
  • the present invention provides an immunomodulator characterized by comprising as an active ingredient at least one compound selected from the cyclopentenone derivative represented by the above formula [I] or an optically active substance or a salt thereof.
  • the cyclopentenone used in the present invention includes both a cis isomer and a trans isomer in the configuration of the hydroxyl group at the 4-position and the 5-position.
  • cis-cyclopentenone may be used
  • trans-pentopentenone may be used
  • a mixture of cis-cyclopentenone and trans-cyclopentenone may be used.
  • these optically active substances may be used.
  • the cis-cyclopentenone is obtained by a chemical synthesis method (Helvetica Chimica Acta, Vol. 55, pp. 2838-2844 (1972)).
  • Trans-cyclopentenone can also be obtained by a chemical synthesis method (Carbohydrate Res., Vol. 247, pp. 217-222 (1993)). It can also be obtained by heat-treating glucuronic acid or a peronic acid derivative, for example, glucuronolactone (see W098Z13328).
  • these heat-treated products containing cyclopentenone, partially purified products and purified products thereof can also be used.
  • cyclopentenone is generated in the heat-treated product.
  • the cyclopentenone in this heat-treated product is extracted with a solvent, and the extract is concentrated.
  • the concentrate is separated by silica gel column chromatography, the eluting fraction of pentenone which is eluted is concentrated, and pentenone is extracted from the concentrate using form-form, and the extract concentrate is subjected to normal phase column chromatography.
  • the cyclopentenone in is isolated.
  • the (1) -4,5-dihydroxy-12-cyclopentene-1-one and (+)-4,5-dihydroxy-12-cyclopentene were obtained as optically active substances. One can get one on. Naturally, pentenone obtained by the synthesis method can also be optically resolved.
  • the reaction solution is obtained by simultaneously or sequentially reacting cyclopentenone and Z or an optically active substance thereof with hydrogen, an aliphatic group, an aromatic group or a carboxylic acid having an aromatic or aliphatic group and / or a reactive derivative thereof.
  • formula [I] of the present invention :
  • the pentenone derivative represented by the formula or an optically active substance thereof is produced.
  • Carbonic acid having a hydrogen, an aliphatic group, an aromatic group, or an araliphatic group, or a reactive derivative thereof, corresponding to R 1, is as follows.
  • Formic acid can be used as the carboxylic acid having hydrogen.
  • carboxylic acid having an aliphatic group a carboxylic acid having an alkyl group and a carboxylic acid having an alkenyl group can be used.
  • carboxylic acid having an alkyl group a carboxylic acid having a linear or branched alkyl group can be used, and the chain length of the alkyl chain can be appropriately selected based on the biological activity, solubility, and the like of the cyclopentenone derivative. Usually, C1-30 groups are preferred.
  • Examples of the carboxylic acid having a linear alkyl group include acetic acid, propionic acid, butyric acid, valeric acid, hexanoic acid, heptanoic acid, n-octanoic acid, pelargonic acid, n-decanoic acid, pendecanoic acid, and lauric acid , Tridecanoic acid, myristic acid, pentadecanoic acid, palmitic acid, heptadecanoic acid, stearic acid, nonadecanoic acid, icosanoic acid, behenic acid, lignoceric acid, serotinic acid, and melisic acid.
  • Examples of the carboxylic acid having a branched alkyl group include isobutyric acid, isovaleric acid, 2-methylbutyric acid, pivalic acid, 4-methylvaleric acid, 1,2-dimethylvaleric acid, etc. can be used.
  • carboxylic acid having an alkenyl group a carboxylic acid having a linear or branched alkenyl group can be used, and the chain length, the degree of unsaturation, and the position of the unsaturated bond of the alkenyl group are determined based on the biological activity of the pentenone derivative of Cycopene, Force that can be appropriately selected based on solubility and the like Usually, a C 2 to 30 group is preferred.
  • Examples of the carboxylic acid having a linear alkenyl group include acrylic acid, vinyl acetic acid, crotonic acid, isocrotonic acid, allylic acetic acid, 2-hexenoic acid, 3-hexenoic acid, 3-octenoic acid, and obsuccinic acid. , 10-pentadecenoic acid, palmitoleic acid, petroselinic acid, elaidic acid, oleic acid, linolenic acid, monolinolenic acid, y
  • -Linolenic acid eleostearic acid, icosatrienoic acid, arachidonic acid, eicosapentaenoic acid, brassic acid, enolecaic acid, docosahexanoic acid, ximenic acid, 21-triacontenic acid and the like can be used.
  • carboxylic acid having a branched alkenyl group for example, methacrylic acid, tiglic acid, angelic acid, polyethylcrotonic acid and the like can be used.
  • carboxylic acid having an aliphatic group having a substituent a carboxylic acid having an alkyl group having a C 1-4 lower alkoxy group as a substituent, for example, methoxyacetic acid can be used.
  • a carboxylic acid having an alkenyl group having a C 2-5 lower alkoxycarbonyl group as a substituent for example, methylmaleic acid can be used.
  • carboxylic acid having an aromatic group examples include benzoic acid, toluic acid, black benzoic acid, bromobenzoic acid, nitrobenzoic acid, phthalic acid, isophthalic acid, terephthalic acid, salicylic acid, acetylsalicylic acid, and acetylsalicyl.
  • a carboxylic acid having an aromatic group to be used may be selected based on the biological activity, solubility, and the like of the resulting cyclopentenone derivative.
  • carboxylic acid having an araliphatic group examples include, for example, phenylacetic acid, feninole O 00/10560
  • Propionic acid phenyl lactic acid, phenyl rubic acid, cinnamic acid, atropic acid, naphthyl acetic acid, etc. can be used.However, depending on the biological activity and solubility of the resulting cyclopentenone derivative, the araliphatic group to be used can be used. What is necessary is just to select the carboxylic acid which has.
  • An aliphatic group, an aromatic group, or an araliphatic group is a substituent such as a functional group such as an amino group, a nitro group, an oxo group, a hydroxyl group, a thiol group, or a sulfate group, or a halogen (eg, fluorine, chlorine). , Bromine, iodine).
  • a functional group such as an amino group, a nitro group, an oxo group, a hydroxyl group, a thiol group, or a sulfate group, or a halogen (eg, fluorine, chlorine). , Bromine, iodine).
  • halogen eg, fluorine, chlorine, bromine, iodine
  • Examples of the reactive derivative of a carboxylic acid include an acid halide, an acid anhydride, an acid ester, a salt, and the like. It is sufficient that the reactive derivative of the carboxylic acid to be used is prepared according to the purpose.
  • the reaction between the carboxylic acid or a reactive derivative thereof and the pen-opentenone may be performed so that R 1 and R 2 of the pen-opentenone derivative may be the same, or R 2 and R 2 may be different. That is, carboxylic acids having different R 1, R 2 may be simultaneously reacted with cyclopentenone, or carboxylic acids having different R 1, R 2 may be sequentially reacted. At this time, by protecting one of the hydroxyl groups of cyclopentenone, it is possible to efficiently produce a pentenone derivative having different R, and.
  • Pentenone or optically active form thereof reacts with carboxylic acid to produce pentenone derivative or optically active form thereof, and the resulting immunomodulatory action, anti-inflammatory action, tumor necrosis factor production inhibitory action, antifungal action, cell adhesion inhibition
  • the cyclopentenone derivative or its optically active substance can be purified and isolated from the reaction solution by using this activity as an index.
  • known methods such as chemical method and physical method may be used, and gel filtration method, fractionation method using molecular weight fractionation membrane, solvent extraction method, fractionation method, ion exchange Conventionally known purification methods such as various mouth chromatography methods using resins, etc. By combining the methods, the pentenone derivative or optically active form thereof in the reaction product can be purified and isolated.
  • pentenone or its optically active form, 4-dimethylaminopyridine, and carboxylic acid are dissolved in dichloromethane, and N, N-dicyclohexylcarbodiimide is added thereto under ice-cooling to cause a reaction.
  • the cyclopentenone derivative used is formed.
  • the desired cyclopentenone derivative can be isolated by purifying the product by silica gel thin-layer chromatography.
  • cyclopentenone or its optically active 1 "living body can be reacted with acetic anhydride in pyridine anhydride, and diacetylcyclopentenone can be purified and isolated from the reaction product.
  • Separation of the optically active form of the cyclopentenone derivative used in the present invention can be performed by mechanical resolution of a racemic mixture, preferential crystallization, resolution by crystallization as a diastereomer salt or clathrate, enzyme kinetics by microorganisms
  • the separation can be carried out by separation, chromatography, or the like.
  • optical resolution by liquid chromatography a method using a chiral stationary phase, a method using a chiral eluent, separation as a diastereomer, and the like can be used.
  • chiral stationary phases examples include amide-based stationary phases, urea-based stationary phases, ligand-exchange-type stationary phases, polysaccharide / polysaccharide derivative stationary phases, protein stationary phases, polymethacrylic acid ester stationary phases, and polymethacrylamide stationary phases. Can be used.
  • Hexanes, alcohols, water (buffer) systems and the like can be used as the eluent, and can be used as appropriate depending on the combination with the stationary phase described above.
  • Examples of the salt of a pen-mouth pentenone derivative or an optically active substance thereof used in the present invention include pharmaceutically acceptable salts, which can be converted by a known method.
  • cyclopentenone derivative used in the present invention include: diacetinolecyclopentenone, dipropionylcyclopentenone, dibutyrylcyclopene O 00/10560
  • the pentenone derivative or optically active form thereof or a salt thereof used in the present invention has an immunomodulatory effect, for example, an inhibitory effect on lymphocyte blastogenesis, an inhibitory effect on mixed lymphocyte reaction, and an effect on natural killer cell activation.
  • Cancer cell-specific lymphocyte activation, anti-inflammatory such as inhibitory effect on dysgematous edema, suppression of delayed-type hypersensitivity reaction, suppression of lupus necrosis factor production, inhibition of topoisomerase, heat shock
  • It has protein-inducing, cell-adhesion-inhibiting, and antifungal effects, and requires diseases that require immunomodulation, diseases that require suppression of inflammation, diseases that require suppression of lupus ulcer necrosis factor production, diseases that require inhibition of topoisomerase, Useful as a therapeutic or prophylactic agent for diseases requiring induction of heat shock protein, diseases requiring suppression of fungal growth, diseases requiring suppression of cell adhesion, etc.
  • the agent for inhibiting the production of tumor necrosis factor of the present invention is useful for treating or preventing a condition mediated or worsened by tumor necrosis factor, for example, non-insulin-dependent diabetes caused by severe ulcer necrosis factor.
  • the present invention provides a method for regulating the production of tumor necrosis factor using at least one compound selected from a cyclopentenone derivative or an optically active form thereof or a salt thereof as an active ingredient.
  • a food for ameliorating the condition of a disease mediated by or worsened by tumor necrosis factor comprising at least one compound selected from a cyclopentenone derivative or an optically active form thereof or a salt thereof.
  • a beverage or a food or beverage for disease prevention is provided.
  • the cyclopentenone derivative, its optically active form, or a salt thereof has an immunoregulatory action such as an inhibitory action on lymphocyte blastogenesis and an inhibitory action on a mixed lymphocyte reaction, and at least one compound selected from these compounds is used.
  • An immunomodulator as an active ingredient is useful as a therapeutic or prophylactic agent for diseases caused by abnormalities of these immune systems and immune factors and diseases requiring immunostimulation.
  • the lymphocyte blastogenesis reaction is a reaction in which mitogen binds to a receptor on the surface of a lymphocyte, activates the lymphocyte, and promotes its division and proliferation.
  • the mixed lymphocyte reaction is defined as the mixed culture of lymphocytes obtained from allogeneic animals, which induces lymphocyte activation due to a mismatch between major histocompatibility antigens and promotes the division and proliferation of lymphocytes. Reaction.
  • the immunomodulator suppresses these reactions, and treats or prevents autoimmune diseases caused by abnormally elevated lymphocytes, for example, chronic diseases such as chronic nephritis, chronic colitis, type I diabetes, and rheumatoid arthritis. In particular, it is also useful for suppressing transplant rejection.
  • the pen-mouthed pentenone derivative, its optically active form, or a salt thereof exhibits an inhibitory effect on foot edema, and an anti-inflammatory agent containing at least one compound selected from these compounds as an active ingredient requires suppression of inflammation.
  • an anti-inflammatory agent containing at least one compound selected from these compounds as an active ingredient requires suppression of inflammation.
  • inflammatory cells such as macrophages and neutrophils are induced by subcutaneously injecting force-lagenan, which is an inflammatory agent, into the foot, and inflammatory factors produced from these cells This is a reaction that increases vascular permeability and causes edema.
  • force-lagenan which is an inflammatory agent
  • the edema-suppressing action of the above-mentioned anti-inflammatory agent is useful for the treatment or prevention of diseases requiring control of enhanced vascular permeability, for example, rheumatoid arthritis.
  • the pen-mouthed pentenone derivative, its optically active form, or a salt thereof exhibits a delayed-type hypersensitivity reaction inhibitory action
  • an anti-inflammatory agent containing as an active ingredient at least one compound selected from these compounds includes: It is useful as a therapeutic or prophylactic agent for diseases requiring delayed hypersensitivity reaction caused by infectious diseases and the like.
  • Late-onset hypersensitivity reactions are inflammatory reactions that rely on cellular immunity, such as by activated lymphocytes, monocytes, and macrophages. Cytoin produced by these cells that infiltrate the site of inflammation enhances vascular permeability, causing edema, granulomas, fibrosis, necrosis, and severe injury.
  • Allergic dermatitis due to late-onset hypersensitivity reactions accounts for the majority of contact dermatitis, and also causes allergies in which bacteria, viruses, or drugs serve as antigens.
  • a mouse model using hedge erythrocytes as an antigen is often used as a test for delayed-type hypersensitivity reaction, and a compound showing efficacy in this model can be used for the treatment of allergic diseases described above. It is considered useful for prevention.
  • the cyclopentenone derivative, its optically active form, or a salt thereof is transiently expressed in normal cells only during the mitotic phase, but becomes highly expressed throughout the entire cell cycle due to canceration.
  • a topoisomerase inhibitor which specifically exhibits an inhibitory activity and contains at least one compound selected from these compounds as an active ingredient can also be used as an anticancer agent.
  • a method for inhibiting topoisomerase using at least one compound selected from these compounds as an active ingredient is useful for biochemical research, screening for cancer drugs and the like.
  • a pentenone derivative or an optically active form thereof or a salt thereof has a cell adhesion inhibitory activity, and it is possible to provide a cell adhesion inhibitor containing at least one compound selected from these compounds as an active ingredient. it can.
  • Cell adhesion inhibition of the present invention O 00/10560
  • the agent is useful as a therapeutic or prophylactic agent for diseases requiring cell adhesion suppression.
  • cancer metastasis is established when cancer cells proliferating at the primary focus are released into blood vessels, migrate to the metastatic site, and invade tissues.
  • adhesion between cancer cells and vascular endothelial cells is required for migration from the blood vessel to the metastatic site.
  • ICAM-1, VCAM-1, ELAM on vascular endothelial cells as adhesion molecules involved in cancer metastasis
  • the corresponding ligands on the cancer cell side are LFA-1, VLA-4, and Cyaryl Lewis X, respectively. These adhesion molecules are frequently expressed in leukemia cells and are thought to be involved in extravasation of leukemia cells. Therefore, the cell adhesion inhibitor of the present invention is expected to suppress cancer metastasis by suppressing the adhesion of cancer cells via these adhesion molecules.
  • the compounds described in PCTZJ P98 / 00815 which are produced from cyclopentenone, cyclopentenone and SH group-containing compounds, also exhibit cell adhesion inhibitory activity, and at least one compound selected from these compounds is effective.
  • a cell adhesion inhibitor contained as a component can be provided.
  • the cell adhesion inhibitor provided by the present invention can be used in a method for suppressing cell adhesion, and the method is useful for biochemical studies on cell adhesion and for screening cell adhesion inhibitors and cell adhesion active agents. It is.
  • the pen-opentenone derivative or optically active form thereof or a salt thereof has a natural killer (NK) cell activating action, and contains at least one compound selected from these compounds as an active ingredient.
  • NK natural killer
  • An arsenical can be provided.
  • the NK cell activator of the present invention is useful as a therapeutic or preventive agent for diseases requiring NK cell activation.
  • NK cells are cells that recognize bacteria, virus-infected cells, and cancer cells and eliminate them by damaging cell membranes. Therefore, activating NK cells means enhancing the immune defense mechanism of the living body, and the NK cell activator of the present invention is useful for treating or preventing bacterial or viral diseases or cancer.
  • NK cell activator can be provided.
  • the NK cell activator provided by the present invention can be used in an NK cell activation method, and the method is useful for biochemical studies on the immune defense mechanism and for screening of immunoprotective agents.
  • the pen-mouthed pentenone derivative, its optically active form, or a salt thereof has an antifungal effect, and when at least one compound selected from these compounds is used as an active ingredient and formulated in combination with a known pharmaceutical carrier, Antifungal agents can be manufactured.
  • Antifungal agents can be manufactured.
  • few low-toxic drugs are effective for systemic infections, which have been increasing in recent years.
  • the antifungal agent of the present invention has low toxicity and is useful as a new type of antifungal agent.
  • the pen-mouthed pentenone derivative, its optically active form, or a salt thereof has a heat shock protein-inducing effect, and it is possible to produce a heat shock protein inducer containing at least one compound selected from these compounds as an active ingredient. It can be administered in a manner appropriate for the disease requiring heat shock protein induction.
  • pentenone derivative or optically active form thereof or a salt thereof has a heat shock protein inducing activity such as 70 kDalton (HSP 70), and hepatitis ⁇ inores, AIDS virus, influenza virus, vesicular stomatitis virus It has an antiviral action against RNA viruses such as virus of virus and DNA virus. Heat shock proteins are also involved in cancer immunity, and these compounds are also effective in cancer immunity. Furthermore, it also has a biological defense effect such as anti-inflammatory. By ingesting the compound of the present invention, its optically active substance or a salt thereof, viral diseases such as a cold disease caused by influenza virus can be prevented and treated.
  • HSP 70 heat shock protein inducing activity
  • Heat shock protein is a general term for proteins whose synthesis is induced when cells or individuals undergo a sudden temperature change of about 5 to 10 ° C higher than normal temperature. It is widely distributed to living things.
  • HSP90, HSP70, ubiquitin, HSP26 and the like are known.
  • HSP70 is a type of molecular chaperone, which binds to unfolded or incompletely folded proteins to form a three-dimensional structure.
  • HSP70 The amino acid sequence of the heat shock protein is well conserved during evolution, and HSP70 is homologous to the DnaK protein of E. coli. There are about 10 HSP70 genes in humans, some of which are constitutively expressed and some are induced by various stimuli. Heat shock protein synthesis is induced not only by heat shock but also by various chemicals and cell damage such as oxidative stress.
  • cyclopentenone derivatives such as diisobutylcyclopentenone
  • HSP70 The ability of cyclopentenone derivatives, such as diisobutylcyclopentenone, to induce HSP70 is seen at 1.25 and is maximal at 2.5, with 2-cyclopentene-11one increasing HS HS70. It can be said that the induction ability is extremely high as compared with the case where several hundreds of concentrations are required for induction.
  • the production of the therapeutic or prophylactic agent of the present invention is generally a cyclopentenone derivative, and the production of an immunoregulator is generally selected from a cyclopentenone derivative or an optically active form thereof or a salt thereof.
  • the compound is used as an active ingredient, and is mixed with a pharmaceutically acceptable liquid or solid carrier, and a solvent, a dispersant, an emulsifier, a buffer, a stabilizer, an excipient, a binder, a disintegrant, a lubricant, if necessary.
  • a pharmaceutically acceptable liquid or solid carrier e.g., a pharmaceutically acceptable ethanol, aqueous ethanol, alumiol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol,
  • Pharmaceutical carriers can be selected according to the above administration forms and dosage forms.
  • oral preparations for example, starch, lactose, sucrose, mannitol, carboxymethyl cellulose, corn starch, inorganic salts, etc. are used.
  • a binder, a disintegrant, a surfactant, a lubricant, a fluidity promoter, a flavoring agent, a coloring agent, a fragrance, and the like can be further added.
  • a compound selected from the cyclopentenone derivative or an optically active form thereof or a salt thereof, which is an active ingredient of the present invention is used as a diluent in distilled water for injection, physiological saline, Dissolve or suspend in aqueous glucose solution, vegetable oil for injection, sesame oil, laccase oil, soybean oil, corn oil, propylene glycol, polyethylene glycol, etc., and if necessary, disinfectant, stabilizer, isotonic agent, soothing agent And the like.
  • the immunomodulator of the present invention is administered by an appropriate administration route depending on the formulation.
  • the method of administration is not particularly limited, and can be internal, external, or by injection.
  • injections can be administered intravenously, intramuscularly, subcutaneously, intradermally, etc., and external preparations include suppositories and the like.
  • the dose of the immunomodulator is appropriately determined depending on the form, administration method, purpose of use and the age, weight, and symptoms of the patient to which the immunomodulator is applied.
  • the amount of the compound selected from the oral pentenone derivative or an optically active form thereof or a salt thereof is 0.1 g to 20 mg / kg per day for an adult.
  • the drug of the present invention can be orally administered as it is, or can be added to any food or drink and taken daily.
  • the tumor necrosis factor production inhibitor, anti-inflammatory agent, topoisomerase inhibitor, cell adhesion inhibitor, heat shock protein inducer, and antifungal agent of the present invention can be formulated according to the above immunomodulators. Can be administered according to the method. Of course, the dose of each drug varies depending on various conditions, so the dose may be smaller than the above dose. In some cases it may be sufficient, or in other cases it may be necessary. Each drug of the present invention can be orally administered as it is, or can be added to any food or drink and taken daily.
  • the pen mouth pentenone derivative or optically active form thereof or a salt thereof used in the present invention can be produced efficiently from pen mouth pentenone and any carboxylic acid or a reactive derivative thereof.
  • disobutyrylcyclopentenone which is a reaction product of cyclopentenone with isobutyric anhydride
  • dimethoxyacetylcyclopentenone which is a reaction product of cyclopentenone and methoxyacetic acid
  • cyclopentene Dimethyl fumaryl cyclopentenone which is a reaction product of tenone and methyl maleic acid
  • pentyl pentenone are provided.
  • These compounds have an anticancer activity, a topoisomerase inhibitory activity, and the like, and can be used as an anticancer drug or the like using these compounds or their optically active substances or salts thereof as active ingredients.
  • the method for producing a food or beverage containing the pen-opentenone derivative obtained in the present invention or its optically active substance or a salt thereof as an active ingredient is not particularly limited, but is prepared, processed, and generally used food. Or a beverage production method, wherein the produced food or beverage contains a compound selected from an effective amount of a cyclopentenone derivative having a physiological effect, an optically active form thereof, or a salt thereof. And a functional food or beverage such as an immunoregulatory food or beverage.
  • the toxicity of the pentenone derivative or optically active isomer thereof or the salt thereof obtained in the present invention is not recognized even when an effective amount of the physiological activity is administered.
  • dipropionylcyclopentenone, dihexanolcyclopentenone, di-2-hexenoylcyclopentenone, diisobutylcyclopentenone, dibenzoylcyclopentenone, or an optically active form thereof A single dose of any of these salts at 10 O mg Z kg was administered to mice without death.
  • a cyclopentenone derivative, an optically active form thereof, or a salt thereof can be easily produced, and its various physiological functions allow it to be used in a wide range of fields such as medicine and food. O 00/10560
  • This fraction was separated by normal phase HP LC using a Palpack type S column, and its purity was 98% as detected by ultraviolet absorption at 215 nm.
  • the sample solution was subjected to optical resolution HP LC under the following conditions, and fractions of the (1) cyclopentenone in the front peak and the (+) cyclopentenone in the rear peak were collected, and dried under reduced pressure. 43.2 mg of the cyclopentenone form and 43.Omg of the pentenone form (+) form were obtained.
  • Both the obtained (1) -cyclopentenone and (+)-cyclopentenone contained about 1% of enantiomer, so that they were optically resolved again under the above conditions.
  • the (1) -cyclopentenone that does not contain 19.7 mg of the enantiomer from 30.Omg of the (1) -cyclopentenone in the former peak and the (+)-cyclopentenone in the later peak of 37.41118 to 27 .7 mg of (+)-cyclopentenone containing no enantiomer was obtained.
  • the elution times of (1) optical cyclopentenone and (+) cyclopentenone by optical resolution HP LC were 33 minutes and 40 minutes, respectively.
  • Example 11 In 29.6 mg of cyclopentenone obtained by the method described in (1), anhydrous pyridine (295-26, manufactured by Nacalai Tester) lm1, acetic anhydride (002-26, manufactured by Nacalai Tesque) 0 1 ml was added and stirred at room temperature for 3 hours. The reaction solution was extracted with chloroform to obtain 36 mg of diacetylcyclopentene. Mass spectrometry of the obtained diacetylcyclopentenone was performed using a DX 302 mass spectrometer (manufactured by Nihon Denshi). It was dissolved in CDC 1 : 1 and its structure was analyzed by NMR. The nuclear magnetic resonance apparatus used was J NM-A500 (manufactured by JEOL Ltd.). The results are shown below. However, the chemical shift value of l H- NMR represented the chemical shift value of the black hole Holm 7. As 24 p pm.
  • Example 1 Using 15.9 mg of the (-)-cyclopentenone obtained by the method of (1), a reaction similar to that of Example 1-1 (2) was carried out to obtain a diacetyl (1-) cyclopentenone. 15. lmg was obtained. Structural analysis by mass spectrometry and nuclear magnetic resonance was performed in the same manner as in Example 11 (2), and the same results as in Example 11 (2) were obtained.
  • Example 1 Using 16.7 mg of the (+)-cyclopentenone obtained by the method of (1), a reaction similar to that of Reference Example 1-1 (2) was carried out to give a diacetyl (+)-cyclopentenone. 18.8 mg was obtained. Structural analysis by mass spectrometry and nuclear magnetic resonance was performed in the same manner as in Example 1- (2), and the same results as in Example 1- (2) were obtained.
  • Example 6-(6) (1) body cyclopentenone 22. lmg, benzoic acid 71. 9 mg N DM
  • the same reaction as in Example 1- (5) was carried out using 12.1 mg of AP and 80.3 mg of DCC to obtain 19.2 mg of dibenzoyl (mono) cyclopentenone.
  • Structural analysis by mass spectrometry and nuclear magnetic resonance was performed in the same manner as in Example 11- (5) above, and the same results as in Example 1- (5) were obtained.
  • Example 11- (5) The same reaction as in Example 11- (5) was carried out using 1.01 mg of AP and 74.3 mg of DCC to obtain 21.4 mg of a dibenzoyl (+) cyclopentenone. Structural analysis was performed by mass spectrometry and nuclear magnetic resonance in the same manner as in Example 1- (5) above, and the same results as in Example 11- (5) were obtained.
  • the obtained dihexanoylcyclopentenone was dissolved in CDC 1 and confirmed by nuclear magnetic resonance (NMR).
  • the nuclear magnetic resonance apparatus used was a JNM-EX270 FT NMR system (manufactured by JEOL Ltd.).
  • the chemical shift value of 'H-NMR was expressed assuming that the chemical shift value of tetramethylsilane was 0 ppm.
  • the carbon of the 2-hexenoyl group bonded to the 5-position of cyclopentenone is changed from the carbonyl group to the 6- to 11-position, and the 2-hexenoyl group bonded to the 4-position of cyclopentenone.
  • the carbons were assigned from the carbonyl group to the 6th to 11'-positions.
  • Figure 1 shows the 1 H-NMR spectrum of diisobutyrylcyclopentenone.
  • the horizontal axis represents the chemical shift value (ppm), and the vertical axis represents the signal intensity.
  • the obtained dimethoxyacetylcyclopentenone was dissolved in double-mouthed form and subjected to structural analysis by nuclear magnetic resonance according to Example 11- (2). The results are shown below.
  • Figure 2 shows the 1 H-NMR spectrum of dimethoxyacetylcyclopentenone.
  • the horizontal axis indicates the chemical shift value (ppm), and the vertical axis indicates the signal intensity.
  • the number of the signal assignment in 'H-NMR is as shown in the following formula [IV].
  • Example 11- (2) Each was dissolved in deuterated chlorophonolem, and the structure was analyzed by nuclear magnetic resonance according to Example 11- (2). The results are shown below.
  • FIG. 3 shows the 1 H-NMR spectrum of pentamone.
  • FIG. 4 shows the 1 H-NMR spectrum of pentenone in dimethylmaleyl sulphate.
  • the horizontal axis indicates the chemical shift value (ppm), and the vertical axis indicates the signal intensity.
  • the structure of the dried product was analyzed.
  • the nuclear magnetic resonance (NMR) spectrum is J NM—A
  • the sample was dissolved in a 0.1 IN DC single aqueous solution, and the chemical shift value of HOD was expressed as 4.65 ppm.
  • the sample was dissolved in a 0.1 IN DC single aqueous solution, and the chemical shift value of dioxane was expressed as 674 ppm.
  • Glycerol was used for the matrix.
  • GM Cyclopenten-1-one (2-hydroxy-4-glutathion-S-yl-2-cyclopenten-1-one: hereinafter simply referred to as GM).
  • HL-60 cultured at 37 ° C in RPMI 1640 medium BIO WHI TTAKER
  • FCS: JRH 10% fetal calf serum
  • the cells were cultured at 37 ° C in the presence of 5% carbon dioxide for 24 hours.
  • a similar culture was carried out using an aqueous solution (0.5 mg / ml) 101 of actinomycin D (manufactured by Sigma), which is known as a reagent for inducing apoptosis, instead of the above sample.
  • the cultured cells were observed under an optical microscope, and nuclei were condensed, the cells were reduced, and apoptotic bodies were formed in the sample and the cultured cells containing actinomycin D. These phenomena were not observed in the cultured cells containing 10 ⁇ l of a 70% aqueous ethanol solution as a control.
  • each compound exhibited a cancer cell growth inhibitory activity and an apoptosis-inducing activity.
  • the optically active forms of each compound and their salts also exhibited similar activities.
  • Topoisomerase II [Topo GEN, 2 units /// 1] 2 ⁇ l, 10-fold concentration buffer [0.5 ⁇ Tris-HC1 (pH 8.0), 1. 2M KC and 0. 1M Mg C l 2, 2. 5 mM adenosine triphosphate,
  • 1% agarose gel prepared using Agarose L03 (Takara Shuzo) and TAE buffer [40 mM Tris, 5 mM sodium acetate, 1 mM disodium ethylenediaminetetraacetate (EDTA), adjusted to pH 7.8 with acetic acid] Then, 20 ⁇ l of the above reaction solution was applied thereto, and electrophoresis was performed in a ⁇ buffer. After the electrophoresis, the gel was immersed in an aqueous solution of 1 ⁇ g Zm1 ethidium bromide, and irradiated with ultraviolet light to observe the DNA electrophoresis pattern. In the control with water, the DNA completely changed from the supercoiled form to the relaxed form, but when the topoisomerase II activity was inhibited, the change from the supercoiled form to the relaxed form was partially or completely inhibited. .
  • the DNA completely changed from the supercoiled form to the relaxed form, but dipropionylcyclopentenone of 0.1 / M or more, 1 / diisobutylinolecyclopentenone of 1 / M or more, 1 M or more dibenzoylcyclopentenone, ⁇ ⁇ or more dihexanoyl cylic pentenone, ⁇ 10 ⁇ or more di2-hexenoylcyclopentenone, 50 ⁇ or more dimethoxyacetyl cyclopentenone, 10
  • Example 3 The topoisomerase I inhibitory activity of each cyclopentenone derivative was measured in the same manner as in (1). However, instead of topoisomerase II, topoisomerase I [manufactured by Topogen, 0.0 imt / 1], 10 OmM Tris-HC I (pH 7.9), 10 mM EDTA, 1 mM Permidine, 50% glycerol was used. O 00/10560
  • the DNA completely changed from the supercoiled to the relaxed form.
  • the force was 100 ⁇ or more of dipropionylcyclopentenone, 500 or more of diisobutyrylcyclopentenone, and 50 ⁇ or more of dibenzoyl.
  • topoisomerase II which is transiently expressed only in the mitotic phase in normal cells but becomes highly expressed throughout the entire cell cycle due to canceration, includes the above-mentioned cyclopentenone derivative and those described in Example 1.
  • the pen-mouthed pentenone derivative showed inhibitory activity.
  • the topoisomerase II inhibitory activity exhibited a stronger inhibitory activity than the inhibitory activity on topoisomerase I whose expression level and activity increased due to canceration.
  • optically active forms of the above compounds and salts thereof also exhibited similar topoisomerase-specific inhibitory activities.
  • Dipropionylcyclopentenone, diisobutyrylcyclopentenone, and di-2-hexenylcyclopententenone were added to 3, 2.5, 5, 10, and 20 ⁇ 10, and the culture was continued for another 6 hours.
  • the treated cells were suspended in SDS-PAGE Sample buffer so that the cells became 2.5 x 10 6 cells, and the cell suspension was treated at 100 ° C for 10 minutes, and then 5/1 cells were removed.
  • Two SDS-PAGE gels (5% stacking gel, 10% separation gel) were applied and electrophoresed. One gel was stained with Coomassie, the other gel was Polyvmylidene difluoride transfer membrane [ImmobilonTM: Millipore
  • Monoclonal antibody HSP72-73 (Ab-1), which specifically reacts with the heat shock protein of 70 kDa thermally induced on the blocked membrane [Oncogene Research Products, Inc.] was reacted with TBS containing 0.05% Twee ⁇ 20, and further washed with TBS. Then, a peroxidase-conjugated secondary antibody HRP-Rabbit Anti Mouse IgG (H + L) Cat. # 61-65203 manufactured by CZYED Laboratories, Inc. (ZYMED Laboratolies, Inc.) was reacted and washed in the same manner as described above.
  • the membrane After reacting the membrane reacted with the primary antibody and the secondary antibody with the chemiluminol reagent RENAISSANCETM (Dupont NEN Cat. ⁇ NEL-100), the membrane is exposed to X-Ray film. The induction of a heat shock protein of 70 kDa was confirmed.
  • the untreated control was ⁇ , and the heat treatment at 45 ° C. for 5 minutes was ++.
  • the above compounds exhibited heat shock protein inducing activity at low concentrations.
  • the optically active substances and their salts also exhibited similar activities. Still other pentenone derivatives or their optically active compounds or salts thereof also exhibited similar activities.
  • the antifungal activity against Candida albicans TIMM0136 was examined using dipropionylcyclopentenone, diisobutyrylcyclopentenone, and G21-hexenoylcyclopentene.
  • Candida albicans was cultured for 1 ⁇ in a YNBG medium containing 0.67% of Distco-Nutrogen Base (manufactured by Difco) and 1.0% of Dulcose (seed culture). Then diluted with fresh Isu preparative Nitrogen Base medium at 1 X 1 0 6 O urchin culture the cells Zm I, 9 6-well microtiter one pre Ichito 1 0 0 ⁇ 1 each dispensed into each Ueru of did.
  • Dipropionylcyclopentenone, diisobutyrylcyclopentenone, and di-1-2-hexenylcycline pentenone each suppress the growth of Candida albiforce at 500 ⁇ g / m1, with a minimum growth inhibitory concentration of 500 g each.
  • These compounds are useful as an active ingredient of an antifungal agent.
  • the optically active forms of these cyclopentenone derivatives and their salts also showed similar activities.
  • Fluorescently labeled HL-60 cells were added to 100 ⁇ l of vascular endothelial cells stimulated with TNF- ⁇ .
  • the fluorescence intensity of 1 ⁇ 10 5 fluorescently labeled cells was taken as 100%, and the adhesion rate of cells adhered to vascular endothelial cells was determined.
  • Table 3 shows the results. Endothelial cells increased their adhesion to HL-60 upon stimulation with TNF. This increase in adhesion rate is cyclopentenone, GM, by Jipuropionirushi Kuropentenon, a dose dependent manner at a concentration of 10- 7 to 10-4 M, cyclopentenone, GM, dipropionate El cyclopentenone is It exhibited the action of suppressing adhesion between cancer cells and vascular endothelial cells, which is necessary for suppressing cancer metastasis. The optically active forms of these compounds and their salts also exhibited similar activities.
  • mice female, 7 weeks old mice were purchased from Japan SLC, Inc. and used for experiments after one week of preliminary rearing.
  • mice Ten days after inoculation of the cancer cells, spleens were removed from the mice.
  • the spleen is ground finely and RPMI-1640 medium (Gibco Inc.) containing 10% FCS (Hyclone) O 00/10560
  • the adherent cells in the cell solution were removed by adhering to a plastic plate L / piece, and the obtained non-adherent cells were used as spleen lymphocytes below.
  • Spleen lymphocytes were adjusted to R PM I- 1 6 4 0 were suspended in the medium 2 X 1 0 6 cells Zm 1 containing 1 0% FCS, and plated into microtiter plates at 1 0 0 ⁇ 1 Noueru.
  • Stimulator cells were prepared as follows. R PM I- 1 6 4 0 were suspended in the medium 2 X 1 0 6 MY to Erich cancer cells adjusted to a cell / m 1 Tomaishin C (manufactured by Kyowa Hakko Co., Ltd.) was added at a concentration of 5 0 g 1, The cells were treated at 37 ° C. for 30 minutes, washed twice, and suspended in a RPM 1-164 medium containing 10% FCS to prepare 2 ⁇ 10 ⁇ cells / 1 stimulated cells.
  • the prepared stimulator cells (100 ⁇ l) were layered on each well of the plate containing spleen lymphocytes in 100 /// 1 wells, and 37 for 5 days. They were cultured with C 5% C 0 2 incubator scratch. One day before the end of the culture, 3 H-thymidine (manufactured by Daiichi Pure Chemicals) 37 kBq was added to each well, and pulse labeling was performed. After the end of the culture, each cell was collected on a glass filter and radioactivity was measured. It was measured.
  • Table 4 shows the results. Spleen lymphocytes obtained from cyclopentenone, GM, dipropionylcyclopentenone, and treated mice were significantly stimulated to proliferate by stimulating cancer cells, and induced lymphocytes that respond specifically to cancer cells It was suggested that it was done. The optically active forms of these compounds and their salts also exhibited similar activities.
  • mice female, 7 weeks old mice were purchased from Japan S.L.C. and used for experiments after one week of preliminary rearing.
  • the spleen was removed from the mouse.
  • the spleen was ground finely and suspended in RPMI-1640 medium containing 10% FCS (Hyclone) to obtain a single cell solution.
  • Adherent cells were removed from the cell solution by attaching them to a plastic plate, and non-adherent cells were used as NK cells.
  • the NK cells were suspended in RPM1-1640 medium containing 10% FCS, adjusted to 6 ⁇ 10 8 cells Zml, and seeded on a microtiter plate at 100 ⁇ IZ well.
  • the prepared target cells (100 ⁇ l) were overlaid on each well of the plate containing the ⁇ cells, and cultured in a 5% C ⁇ incubator at 37 ° C. for 5 hours. After the culturing, the plate was centrifuged at 1500 rpm for 5 minutes, the supernatant 100 ⁇ 1 was collected in a gamma-counter tube, and the radioactivity (experimental value) was measured with an auto-gamma-counter.
  • control value 100 ⁇ l of the culture solution was added to the reaction system instead of the NK cells, and the radioactivity was measured.
  • Triton X radioactivity released into the supernatant when dissolved 5 'C r-labeled YAC-1 cells in addition to the reaction system was measured.
  • cytotoxicity (%) by NK cells can be calculated by the following formula.
  • Cytotoxicity (%) [(Experimental value-Control value) Z (Total radioactivity value-Control value)] X 100
  • Table 5 shows the results. Activation of NK cells was observed in mice to which cyclopentenone, GM, and dipropionylcyclopentenone were administered, and administration of these compounds enhanced the immune defense mechanism of the living body and increased the cytotoxicity against cancer cells.
  • the optically active forms of these compounds and their salts also exhibited similar activities.
  • Lewis rats male, 9 weeks old, weighing about 250 g were purchased from SEATS Yoshitomi.
  • Dipropionylcyclopentenone and dihexanoylcyclopen were dissolved in olive oil (manufactured by Nacalai Tesque) in rats fasted 18 hours before the start of the experiment to prepare 1 or 1 OmgZl Om 1 Zkg.
  • Tenone, di-12-hexenylcyclopentenone, diisobutyrylcyclopentenone or dibenzoylcyclopentenone were orally administered to rats of 4 rats in each group.
  • the cells were suspended at 1% concentration in physiological saline (manufactured by Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.); Caused foot edema.
  • physiological saline manufactured by Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.
  • the right paw volume of the rat was measured with a rat paw volume measuring device ( ⁇ Gobazil3 ⁇ 4). The measured values were calculated and calculated from the right paw volume of each rat measured before the administration of ligamentan.
  • FIG. 5 shows the results. That is, FIG. 5 is a graph showing the relationship between the amount of the cyclopentenone derivative administered and the rate of increase in the weight of the paw floating weight.
  • the horizontal axis indicates the dose (mg / kg), and the vertical axis indicates the rate of increase (%).
  • Dipropionylsic pentenone showed a tendency to suppress paw edema at a dose of 1 mg Z kg, and administration of 1 O mg Zkg showed a significant inhibitory effect.
  • Dihexano Pyrtenok and G2-hexenolsk pentenone showed significant inhibitory effects at doses of 1 or 10 mg kg, respectively.
  • Diisobutyrylcyclopentenone and dibenzoylcyclopentenone each showed a suppressive tendency at a dose of lmgZkg, and showed a significant suppressive effect at a dose of lOmgZkg.
  • the optically active isomers of these pentotenone derivatives and salts thereof also exhibited similar activities. Further, other than the above, pentenone derivatives or optically active organisms thereof or salts thereof also showed similar activities.
  • mice Male, 7 weeks old, weighing about 25 g were purchased from Japan SLC and used for experiments after one week of preliminary rearing.
  • Hijji erythrocytes is induced antigen (Shimizu Laboratory) in saline (Otsuka Pharmaceutical), and adjusted to 1 X 10 9 cells Roh m 1 with saline, 200 mu 1 intraperitoneally in mice To sensitize to antigen. Five days after the sensitization, 40 ⁇ l of the antigen prepared in the same manner was injected into the right foot pad to induce antigen, thereby inducing foot edema.
  • the dipropionyl pentopentenone was dissolved in physiological saline to adjust to each concentration, and administered intraperitoneally or orally once a day for three days to 5 mice per group once from the day of antigen sensitization.
  • the right paw volume of the mouse was measured with a paw edema measuring device ( ⁇ Gobasil) and used as an index of DTH. The measured value was calculated and calculated from the right paw volume of the mouse measured before the antigen induction according to the following formula.
  • Increase rate (right foot volume after antigen induction-right foot volume before antigen induction) ⁇ right foot volume before antigen induction
  • the results are shown in FIG.
  • the vertical axis of the figure shows the increase rate of the paw volume increased by antigen induction.
  • Dipropyronylcyclopentenone showed a tendency to suppress paw edema by intraperitoneal administration of 1 mgZkg, and significant inhibition was observed by intraperitoneal administration of 1 OmgZkg or oral administration of 3 Omg / kg.
  • the optically active forms of these cyclopentenone derivatives and their salts also showed similar activities.
  • Spleen was removed from d dY mouse (male, 7 weeks old; purchased from SLC, Inc.), finely crushed, and RPMI-1640 containing 10% FCS (high clone ne: t). The cells were suspended in a medium to obtain a single cell solution. The cell suspension was seeded on a plastic petri dish and cultured in a carbon dioxide incubator at 37 ° C for 2 hours. The adherent cells were adhered to the petri dish and removed, and non-adherent cells were used as spleen lymphocytes.
  • Figure 7 shows the results. That is, Fig. 7 shows the relationship between dipropionylcyclopentenone concentration and : 'H-thymidine incorporation, where the horizontal axis represents dipropionylcyclopentenone concentration (M) and the vertical axis represents : iH-thymidine incorporation. (C PM). Open bar Darafu the case of no stimulation, the hatched bar graph cases stimulated by C on A: 'H- denotes thymidine uptake. As is clear from FIG. 7, dipropionylcyclopentenone exhibited a dose-dependent inhibitory effect on the proliferation of mitogen-stimulated mouse lymphocytes, and was almost completely suppressed at 10 // M. The optically active isomers of this cyclopentenone derivative and their salts also exhibited similar activities.
  • Spleen lymphocytes were obtained by the method (1).
  • the concentration of each cell suspension was adjusted to 2 ⁇ 10 fi cells 1, 100 ⁇ l of each was mixed and seeded on a 96-well microtiter plate.
  • the pentenone propionirus was added, and the cells were cultured in a carbon dioxide incubator at 37 ° C for 4 days. After the culture, 1 ⁇ Ci of 3 H-thymidine was added to each well, and the cells were further cultured for 1 day, and the amount of uptake into the cells was measured using a liquid scintillation counter.
  • FIG. 8 is a diagram showing the relationship between dipropionyl cyclopentenone concentration and 3 H- thymidine uptake, the horizontal axis Jipuropionirushi Kuropentenon Concentration (M), the vertical axis 3 H- thymidine uptake (CPM ).
  • M Jipuropionirushi Kuropentenon Concentration
  • CPM vertical axis 3 H- thymidine uptake
  • the 3 H- thymidine down uptake when white bars used alone cells from any of the strains the hatched bar shows the 3 H- thymidine uptake when mixed cells from both strains.
  • dipropionyl pentopentenone showed a dose-dependent inhibitory effect on lymphocytes activated by seroantigen stimulation, and was almost completely suppressed by 1 ⁇ M.
  • the optically active isomers of the cyclopentenone derivative and their salts also exhibited similar activities.
  • An endotoxin shock model was prepared using 8-week-old female CDF1 mice (purchased from S.L.C.). Distilled water (control) or 10 mg / kg of disopropionyl cyclic pentenone or disobutyryl cyclic pentenone was administered subcutaneously to mice, and LPS (lipopolysaccharide: Sigma) was intraperitoneally administered 30 minutes later. ) did. S? 3 1.5 hours after administration, blood was collected from the mouse, the serum was separated, and the amount of tumor necrosis factor (TNF) - ⁇ in the serum was measured using a commercially available ELISA kit (manufactured by R & D). In addition, 4 mice were used in each group.
  • TNF tumor necrosis factor
  • LPS was intraperitoneally administered (20 ⁇ gZ mouse) to prepare an endotoxin shock model.
  • Dipropionylcyclopentenone or diisobutyrylcyclopentenone was administered orally at a dose of 30,10 Omg / kg, respectively, 30 minutes before LPS administration. Otsu? 3. 1.5 hours after administration, blood was collected from the mice, serum was separated, and TNF- ⁇ in the serum was measured using an ELISA kit. In addition, 4 mice were used per group.
  • Table 7 shows the results. That is, dipropionyl cyclic pentenone or diisobutyrylcyclopentenone inhibited TNF production in a dose-dependent manner by oral administration to the control group. Optically active isomers of these pentenone derivatives and salts thereof also showed similar activities.
  • Mouse leukemia P-388 (1.1 ⁇ 10 B cells / mouse) was injected intraperitoneally into 7-week-old female DBAZ 2 mice. Immediately thereafter, a single intraperitoneal injection of dipropionylcyclopentenone at a dose of lOmg / kg. On the other hand, the control group was similarly intraperitoneally injected with physiological saline. The number of surviving mice, the average number of surviving days, and the survival rate were calculated in two groups of eight animals each.
  • control group had an average survival time of 10.1 days, whereas the dipropionylcyclopentenone-administered group had 13.9 days, showing a 137.0% survival rate. A prolonged life effect was observed.
  • the study was performed using a Meth A tumor cell: BALBZc mouse system.
  • the average survival time in the control group was 13.4 days, and that in the dipropionylcyclopentenone group was 16.9 days.
  • the survival rate was 126.2%, showing a remarkable life extension effect.
  • optically active isomers of the pentenone derivative and their salts also exhibited similar activities.
  • mice Female B A LBZc mice were injected subcutaneously on the back. Thereafter, pentenone dipropionylsuccinum was injected subcutaneously into the same site for 5 consecutive days. In the control group, physiological saline was similarly injected subcutaneously. In addition, eight mice were used in each group.
  • Pentenone dipropionirusic or pentenone disobutyryl was administered intraperitoneally or orally for 5 consecutive days from the day after cancer cell transplantation.
  • the control group was similarly administered with distilled water for injection.
  • the average survival time, the survival rate, and the 30-day survival number were calculated using 8 animals in each group.
  • Table 10 shows the life-prolonging effect when each test substance was intraperitoneally administered to EAC-transplanted mice
  • Table 11 shows the life-prolonging effect when each test substance was intraperitoneally administered to Meth A-transplanted mice.
  • Table 12 shows the life-prolonging effect of each test substance administered orally to EAC-transplanted mice
  • Table 13 shows the life-prolonging effect of test substance administered orally to Meth A-transplanted mice.
  • dipropionylcyclopentenone and diisobutyrylcyclopentenone exhibited excellent life-prolonging effects in EAC-transplanted mice.
  • all groups showed survival for 30 days.
  • dipropionirusic pentenone also showed a strong effect in oral administration.
  • each treatment group showed a life-prolonging effect by intraperitoneal administration, and the dipropionylcyclopentenone-administered group survived for 30 days by oral administration.
  • optically active isomers of these pen-mouthed pentenone derivatives and their salts also showed the same activity.
  • Pen mouth Pentenone diisobutyl 30 25 .3> 20 23
  • Pentenone or dimethoxycyclopentenone was added at a concentration of 1% to prepare an injection.
  • a derivative or optically active substance thereof which has a physiological activity such as an immunoregulatory effect, an anti-inflammatory effect, an inhibitory effect on ⁇ -severe necrosis factor production, an antifungal effect, etc. Salt is provided.
  • Pharmaceuticals containing these compounds as active ingredients are useful as therapeutic or prophylactic agents for diseases requiring immunomodulation, diseases requiring suppression of inflammation, diseases requiring suppression of tumor necrosis factor production, diseases requiring suppression of growth of pathogenic microorganisms, etc. Is a drug useful for maintaining homeostasis.

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Description

明 細 書 シク口ペンテノン化合物を有効成分とする治療剤又は予防剤 発明の分野
本発明はシク口ペンテノン類エステルを有効成分とする医薬に関する。 従来の技術
従来、 臨床上の療法に用いられている薬物はアルキル化剤、 代謝阻害剤、 植物 アル力ロイド等の制がん剤、 抗生物質、 免疫促進剤、 免疫調節剤など多岐にわた つているが、 これらの薬物療法はいまだ完成したとはいいがたい。
これらのうち、 天然物由来であるプロスタグランジンの中で、 5員環に α， β 一不飽和カルボニルを有するプロスタグランジン Α及び J類が D N A合成を抑制 することにより、 安全性の高い制がん剤としての可能性が報告され、 それらの各 種誘導体が合成されている （特開昭 6 2 - 9 6 4 3 8号公報参照） 。 発明の目的
本発明の主な目的は、 種々の生理作用を有するシク口ペンテノン誘導体を開発 し、 該化合物を有効成分とする医薬を提供することにある。
本発明のこの目的及びその他の目的並びに本発明の利点を、 添付の図面を参照 して以下の説明より明らかにする。 図面の簡単な説明
図 1は、 ジイソプチリルシクロペンテノンの1 H— NMRスぺク トルを示す図 である。
図 2は、 ジメ トキシァセチルシクロペンテノンの1 H— NMRスぺク トルを示 す図である。
図 3は、 ジメチルフマリルシクロペンテノンの ' H— NMRスぺク トルを示す 図である。 2
図 4は、 ジメチルマレィルシクロペンテノンの1 H— NM Rスぺク トルを示す 図である。
図 5は、 投与したシク口ペンテノン誘導体量と足浮腫増加率の関係を示す図で める。
図 6は、 投与したシク口ペンテノン誘導体量と遅発型過敏症反応増加率の関係 を示す図である。
図 7は、 ジプロピオ二ルシク口ペンテノン濃度と3 H—チミジン取り込み量の 関係を示す図である。
図 8は、 ジプロピオニルシクロペンテノン濃度と3 H—チミジン取り込み量の 関係を示す図である。 発明の概要
本発明者らはかかる目的を達成するために鋭意検討した結果、 式 〔I〕
Figure imgf000004_0001
〔 I〕
(式中、 R ,及び F は、 同一または異なってもよく、 水素、 脂肪族基、 芳香族基 又は芳香脂肪族基を意味する。 ）
で表わされるシクロペンテノン誘導体が、 式 〔I I〕 ：
Figure imgf000004_0002
で表わされる 4， 5—ジヒドロキシー 2—シクロペンテン一 1一オン （以下、 単 にシクロペンテノンと称す） と、 カルボン酸及び Z又はその反応性誘導体との反 応により生成し、 このシクロペンテノン誘導体が強い免疫調節作用、 抗炎症作用、 重瘍壊死因子産生抑制作用、 抗真菌作用、 細胞接着抑制作用等の生理活性を有す ることを見出し、 本発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明は、 上記式 〔I〕 で表されるシクロペンテノン誘導体若しく は光学活性体又はそれらの塩から選択される少なくとも 1つの化合物を有効成分 として含有することを特徴とする免疫調節を必要とする疾患、 炎症抑制を必要と する疾患、 月重瘍壊死因子産生抑制を必要とする疾患、 真菌の抑制を要する疾患、 細胞接着抑制を要する疾患、 又は熱ショックタンパクの誘導を要する疾患の治療 剤又は予防剤を提供するものである。 発明の詳細な説明
本発明において使用するシクロペンテノンは、 4位と 5位のヒ ドロキシル基の 立体配置がシスの異性体とトランスの異性体の双方を包含する。 本発明において はシス体シクロペンテノンを用いてもよいし、 トランス体シク口ペンテノンを用 いてもよいし、 シス体シクロペンテノンと トランス体シクロペンテノンの混合物 を用いてもよい。 また、 これらの光学活性体を用いてもよレ、。
シス体シクロペンテノンは化学合成法によって得られる 〔ヘルべチカ キミ力 ァクタ （He l v e t i c a Ch i mi c a Ac t a) 、 第 55卷、 第 28 38〜 2844頁 （1972) 〕 。 トランス体シクロペンテノンは化学合成法に よっても得られるし 〔カーボハイ ドレート リサーチ （Ca r b o h y d r a t e Re s. ) 、 第 247卷、 第 217〜 222頁 （1993) 〕 、 また、 ゥロ ン酸、 例えば、 グルクロン酸、 ゥロン酸誘導体、 例えば、 グルクロノラクトン等 を加熱処理することによつても得られる （W098Z13328号公報参照） 。 本発明では、 シクロペンテノンを含有するこれらの加熱処理物、 その部分精製物 及び精製物も使用できる。
例えば、 ゥロン酸として D—ダルク口ン酸を使用し、 その 1 %溶液を 121 °C で 4時間加熱処理することにより、 加熱処理物中にシクロペンテノンが生成され る。 この加熱処理物中のシクロペンテノンを溶媒で抽出し、 抽出物を濃縮する。 次にこの濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離し、 溶出するシク 口ペンテノン画分を濃縮し、 濃縮物からシク口ペンテノンをクロ口ホルムで抽出 し、 抽出濃縮物の順相カラムクロマトグラフィーを行うことにより、 加熱処理物 O 00/10560
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中のシクロペンテノンが単離される。
単離されたシク口ペンテノンを光学分割することにより、 光学活性体として (一） ー4， 5—ジヒドロキシ一 2—シクロペンテン一 1一オン及び （+ ) —4， 5—ジヒドロキシ一 2—シクロペンテン一 1一オンを得ることができる。 当然、 合成方法により得られたシク口ペンテノンも光学分割することができる。
シクロペンテノン及び Z又はその光学活性体と、 水素、 脂肪族基、 芳香族基又 は芳香脂肪族基を有するカルボン酸及び 又はその反応性誘導体とを、 同時又は 順次反応させることにより、 反応液中に本発明の式 〔I〕 ：
Figure imgf000006_0001
U〕
で表わされるシク口ペンテノン誘導体又はその光学活性体が生成する。
本発明において使用する、 上記式 〔I〕 で表されるシクロペンテノン誘導体の
R ,、 に相当する、 水素、 脂肪族基、 芳香族基又は芳香脂肪族基を有するカル ボン酸又はその反応性誘導体は次の通りである。
水素を有するカルボン酸としては、 ギ酸を使用できる。
脂肪族基を有するカルボン酸としては、 アルキル基を有するカルボン酸、 アル ケニル基を有するカルボン酸を使用することができる。
アルキル基を有するカルボン酸としては、 直鎖又は分枝のアルキル基を有する カルボン酸が使用でき、 アルキル鎖の鎖長はシク口ペンテノン誘導体の生物活性、 溶解性等より適宜選択することができるが、 通常、 C 1〜3 0の基が好ましい。 直鎖アルキル基を有するカルボン酸としては、 例えば、 酢酸、 プロピオン酸、 酪 酸、 吉草酸、 へキサン酸、 ヘプタン酸、 n—オクタン酸、 ペラルゴン酸、 n—デ カン酸、 ゥンデカン酸、 ラウリン酸、 トリデカン酸、 ミリスチン酸、 ペンタデカ ン酸、 パルミチン酸、 ヘプタデカン酸、 ステアリン酸、 ノナデカン酸、 ィコサン 酸、 ベヘン酸、 リグノセリン酸、 セロチン酸、 メリシン酸等が使用できる。
分枝アルキル基を有するカルボン酸としては、 例えば、 イソ酪酸、 イソ吉草酸、 2—メチル酪酸、 ピバル酸、 4ーメチル吉草酸、 1， 2—ジメチル吉草酸等が使 用できる。
アルケニル基を有するカルボン酸としては、 直鎖又は分枝のアルケニル基を有 するカルボン酸が使用でき、 アルケニル基の鎖長、 不飽和度、 不飽和結合の位置 はシク口ペンテノン誘導体の生物活性、 溶解性等より適宜選択することができる 力 通常、 C 2〜 3 0の基が好ましい。
直鎖アルケニル基を有するカルボン酸としては、 例えば、 アクリル酸、 ビニル 酢酸、 クロ トン酸、 イソクロ トン酸、 ァリル酢酸、 2—へキセン酸、 3—へキセ ン酸、 3—ォクテン酸、 ォブッシル酸、 1 0—ゥンデセン酸、 パルミ トレイン酸、 ペトロセリン酸、 エライジン酸、 ォレイン酸、 リノ一ノレ酸、 ひ一リノレン酸、 y
—リノレン酸、 エレォステアリン酸、 ィコサトリェン酸、 ァラキドン酸、 エイコ サペンタエン酸、 ブラシジン酸、 エノレカ酸、 ドコサへキサェン酸、 キシメン酸、 2 1一トリアコンテン酸等が使用できる。
分枝アルケニル基を有するカルボン酸としては、 例えば、 メタクリル酸、 チグ リン酸、 アンゲリカ酸、 ひ—ェチルクロトン酸等が使用できる。
置換基を有する脂肪族基を有するカルボン酸としては、 C 1〜 4の低級アルコ キシ基を置換基として有するアルキル基を有するカルボン酸、 例えば、 メ トキシ 酢酸を使用することができる。 また、 C 2〜 5の低級アルコキシカルボ二ルを置 換基として有するアルケニル基を有するカルボン酸、 例えば、 メチルマレイン酸 を使用することができる。
芳香族基を有するカルボン酸としては、 例えば、 安息香酸、 トルィル酸、 クロ 口安息香酸、 プロモ安息香酸、 ニトロ安息香酸、 フタル酸、 イソフタル酸、 テレ フタル酸、 サリチル酸、 ァセチルサリチル酸、 ァセチルサリチルサリチル酸、 ァ ミノサリチル酸、 p—ヒ ドロキシ安息香酸、 ァミノ安息香酸、 メ トキシ安息香酸、 ァセトアミ ド安息香酸、 バニリン酸、 ォルセリン酸、 ナフトェ酸、 シンコメロン 酸、 キサッレン酸、 キニン酸、 キヌレン酸等が使用できるが、 生成するシクロべ ンテノン誘導体の生物活性、 溶解性等より使用する芳香族基を有するカルボン酸 を選択すればよい。
芳香脂肪族基を有するカルボン酸としては、 例えば、 フエニル酢酸、 フエ二ノレ O 00/10560
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プロピオン酸、 フエニル乳酸、 フエ二ルビルビン酸、 ケィ皮酸、 アトロパ酸、 ナ フチル酢酸等が使用できるが、 生成するシクロペンテノン誘導体の生物活性、 溶 解性等より、 使用する芳香脂肪族基を有するカルボン酸を選択すればよい。
脂肪族基、 芳香族基、 又は芳香脂肪族基は、 置換基、 例えば、 アミノ基、 ニト 口基、 ォキソ基、 水酸基、 チオール基、 硫酸基等の官能性基やハロゲン （例えば、 フッ素、 塩素、 臭素、 ヨウ素） を有していても良い。
かくして、 式 〔I〕 における 及び R 2の例としては、 同一又は異なって、 水素、 C 1〜 3 0の直鎖又は分枝アルキル基、 C 2〜 3 0の直鎖又は分枝ァルケ ニル基、 C 6〜 1 0のァリ一ル基又は C：！〜 3 0アルキル C 6〜 1 0ァリ一ル基 が挙げられ、 これらは所望により、 C l〜3 0アルキル基、 C l〜4アルコキシ 基、 C 2〜5アルコキシカルボニル基、 アミノ基、 ニトロ基、 ォキソ基、 水酸基、 チオール基、 硫酸基、 ハロゲン （例えば、 フッ素、 塩素、 臭素、 ヨウ素） から選 択される 1つ以上の置換基で置換されていてもよい。
カルボン酸の反応性誘導体としては、 酸ハライド、 酸無水物、 酸エステル、 塩 等が例示され、 目的に応じ、 使用するカルボン酸の反応性誘導体を作製すれば良 レ、
カルボン酸又はその反応性誘導体とシク口ペンテノンとの反応はシク口ペンテ ノン誘導体の R ,、 R が同一になるように行っても良く、 R ,、 R 2が異なるよう に行っても良い。 すなわち、 R ,、 R 2が異なるカルボン酸を同時にシクロペンテ ノンと反応させても良く、 順次 R ,、 R 2が異なるカルボン酸を反応させても良レ、。 このとき、 シクロペンテノンの水酸基の片方を保護することにより、 効率よく、 R ,、 が異なるシク口ペンテノン誘導体を作製することができる。
シク口ペンテノン又はその光学活性体とカルボン酸とが反応し、 生成したシク 口ペンテノン誘導体又はその光学活性体は免疫調節作用、 抗炎症作用、 腫瘍壊死 因子産生抑制作用、 抗真菌作用、 細胞接着抑制作用等を有し、 この活性を指標に シクロペンテノン誘導体又はその光学活性体を反応液中から精製、 単離すること ができる。 精製、 単離手段としては、 化学的方法、 物理的方法等の公知の精製手 段を用いれば良く、 ゲルろ過法、 分子量分画膜による分画法、 溶媒抽出法、 分留 法、 イオン交換樹脂等を用いた各種ク口マトグラフィ一法等の従来公知の精製方 法を組合せ、 反応生成物中のシク口ペンテノン誘導体又はその光学活性体を精製、 単離することができる。
例えば、 シク口ペンテノン又はその光学活 ½t体、 4―ジメチルァミノピリジン、 及びカルボン酸をジクロロメタンに溶解し、 氷冷下 N， N—ジシクロへキシルカ ルボジイミ ドを加え反応させることにより、 本発明に使用するシクロペンテノン 誘導体が生成する。 生成物をシリカゲル薄層クロマトグラフィーにより精製する ことにより、 目的のシクロペンテノン誘導体を単離することができる。
また、 シクロペンテノン又はその光学活 1"生体と無水酢酸とを無水ピリジン中で 反応させ、 反応物中からジァセチルシクロペンテノンを精製、 単離することがで きる。
本発明により使用されるシクロペンテノン誘導体の光学活性体の分離はラセミ 混合物の機械的分割、 優先晶出法、 ジァステレオマー塩あるいは包接化合物とし ての結晶化による分割、 酵素 '微生物による動力学的分割、 クロマトグラフィー による分割等により行うことができる。
クロマトグラフィーによる分割としては、 ガスクロマトグラフィー、 液体クロ マトグラフィー、 薄層クロマトグラフィー等を用いることができ、 それぞれに適 したキラル固定相を使用すればよレ、。
液体ク口マトグラフィ一による光学分割としては、 キラルな固定相を用いる方 法、 キラルな溶離液を用いる方法、 ジァステレオマ一としての分離等を用いるこ とができる。
キラル固定相としては、 アミ ド系固定相、 尿素系固定相、 配位子交換型固定相、 多糖 '多糖誘導体固定相、 タンパク質固定相、 ポリメタクリル酸エステル固定相、 ポリメタクリルアミ ド固定相等が使用できる。
溶離液としてはへキサン系、 アルコール系、 水 （緩衝液） 系等が使用でき、 上 記固定相との組合せにぉレ、て適宜使用することができる。
本発明で使用されるシク口ペンテノン誘導体又はその光学活性体の塩としては、 医薬として許容される塩があり、 公知の方法にて変換することができる。
本発明で使用されるシクロペンテノン誘導体の代表的な例としては、 ジァセチ ノレシクロペンテノン、 ジプロピオニルシクロペンテノン、 ジブチリルシクロペン O 00/10560
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テノン、 ジイソプチリルシクロペンテノン、 ジバレリルシクロペンテノン、 ジへ キサノィルシクロペンテノン、 ジォクタノィルシクロペンテノン、 ジデカノィル シクロペンテノン、 ジミリストイルシクロペンテノン、 ジメ トキシァセチルシク 口ペンテノン、 ジメチルフマリルシクロペンテノン、 ジメチルマレィルシクロぺ ンテノン、 ジ一 2—へキセノィルシクロペンテノン、 ジー 3—ォクテノィルシク 口ペンテノン、 ジベンゾィルシク口ペンテノンなどが挙げられる。
本発明で使用されるシク口ペンテノン誘導体若しくはその光学活性体又はそれ らの塩は、 免疫調節作用、 例えば、 リンパ球幼若化反応抑制作用、 混合リンパ球 反応抑制作用、 ナチュラルキラー細胞活性化作用、 がん細胞特異的リンパ球活'性 化作用、 抗炎症作用、 例えば、 力ラゲナン浮腫抑制作用、 遅発型過敏症反応抑制 作用、 月重瘍壊死因子産生抑制作用、 トポイソメラーゼ阻害作用、 熱ショックタン パク誘導作用、 細胞接着抑制作用、 抗真菌作用等を有し、 免疫調節が必要な疾病、 炎症抑制が必要な疾病、 月重瘍壊死因子産生抑制が必要な疾病、 トポイソメラーゼ 阻害を要する疾病、 熱ショックタンパク誘導を要する疾病、 真菌の増殖抑制を要 する疾病、 細胞接着の抑制を要する疾病等の治療剤又は予防剤として有用であり、 シク口ペンテノン誘導体若しくはその光学活性体又はそれらの塩から選択される 少なくとも 1つの化合物を有効成分として免疫調節剤、 抗炎症剤、 腫瘍壊死因子 産生抑制剤、 トポイソメラーゼ阻害剤、 熱ショックタンパク誘導剤、 抗真菌剤、 細胞接着抑制剤を製造することができる。
月重瘍壊死因子は、 腫瘍部位に出血性壊死を誘導する因子として発見されたが、 現在では炎症を基本とした生体防御 ·免疫機構に広くかかわるサイトカインとし て認識されている。 この腫瘍壊死因子の産生調節機構の破綻は様々な不都合を宿 主にもたらし、 腫瘍壊死因子の過度又は未調節の産生は、 慢性関節性リウマチ、 リウマチ性脊髄炎、 変形性関節症、 痛風性関節炎、 敗血症、 敗血性ショック、 内 毒素ショック、 グラム陰性菌敗血症、 毒性ショック症候群、 脳性マラリア、 慢性 肺炎、 移植片対宿主反応、 同種移植片拒絶反応、 インフルエンザのような感染症 による発熱及び筋肉痛、 感染又は悪性腫瘍に対して二次的な悪液質、 ヒト後天性 免疫不全症候群 (A I D S ) に対して二次的な悪液質、 A I D S、 A I D S関連 症候群、 ケロイド形成、 潰瘍性大腸炎、 多発性硬化症、 自己免疫糖尿病及び全身 O 00/10560
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エリテマト一デス等の自己免疫疾患を含む、 これらの多くの疾患に関連している 〔モレキュラー メデイシン （Molecular Medicine) 、 第 33卷、 第 1010〜
1020頁、 第 1 182〜 1 189頁 （1996) 〕 。 本発明の腫瘍壊死因子産 生抑制剤は、 腫瘍壊死因子により媒介されるか又は悪化する病状の治療、 予防、 例えば重瘍壊死因子が原因となるインスリン非依存型糖尿病 [ネ一チヤ一
(Nature) 、 第 389卷、 第 610〜 614頁 （1997) ] の治療、 予防に有 用である。
また、 本発明により、 シクロペンテノン誘導体若しくはその光学活性体又はそ れらの塩から選択される少なくとも 1つの化合物を有効成分として使用する腫瘍 壊死因子の産生の調節方法が提供される。 また本発明により、 シクロペンテノン 誘導体若しくはその光学活性体又はそれらの塩から選択される少なくとも 1つの 化合物を含有し、 腫瘍壊死因子により媒介されるか又は悪化する疾病の病状の改 善用食品又は飲料、 又は疾病予防用食品又は飲料が提供される。
シクロペンテノン誘導体若しくはその光学活性体又はそれらの塩はリンパ球幼 若化反応抑制作用、 混合リンパ球反応抑制作用等の免疫調節作用を有し、 これら の化合物から選択される少なくとも 1つの化合物を有効成分とする免疫調節剤は これらの免疫系、 免疫因子の異常が起因となる疾病、 免疫賦活を要する疾病の治 療剤又は予防剤として有用である。
すなわち、 リンパ球幼若化反応とは、 マイトジェンがリンパ球表面の受容体に 結合し、 リンパ球を活性化させ、 その分裂、 増殖を促す反応である。 混合リンパ 球反応とは、 同種異系の動物より得られたリンパ球を混合培養することにより、 主要組織適合抗原の不一致によるリンパ球の活性化が誘導され、 リンパ球の分裂、 増殖が促進される反応である。 上記免疫調節剤はこれらの反応を抑制し、 リンパ 球の異常亢進が起因となる自己免疫性疾患、 例えば慢性腎炎、 慢性大腸炎、 I型 糖尿病、 慢性関節リウマチ等の慢性の疾患の治療又は予防に特に有用であり、 ま た移植片拒絶反応の抑制にぉレ、ても有用である。
シク口ペンテノン誘導体若しくはその光学活性体又はそれらの塩は力ラゲナン 足浮腫抑制作用を示し、 これらの化合物から選択される少なくとも 1つの化合物 を有効成分として含有する抗炎症剤は、 炎症抑制を必要とする疾病の治療剤又は ΛΛ ,, ΛΓ Λ PCT/JP99/04323 O 00/10560
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予防剤として有用である。
力ラゲナン足浮腫モデルは、 起炎剤である力ラゲナンを足躕部に皮下注射する ことにより、 マクロファージ、 好中球等の炎症細胞が誘導され、 これらの細胞か ら産生された炎症性の因子により血管透過性が亢進し、 浮腫が惹起される反応で ある。 上記抗炎症剤の浮腫抑制作用は、 血管透過性の亢進の制御を必要とする疾 患、 例えば慢性関節リゥマチの治療又は予防に有用である。
シク口ペンテノン誘導体若しくはその光学活性体又はそれらの塩は、 遅発型過 敏症反応抑制作用を示し、 これらの化合物から選択される少なくとも 1つの化合 物を有効成分として含有する抗炎症剤は、 感染症などによって引き起こされる遅 発型過敏症反応抑制を必要とする疾病の治療剤又は予防剤として有用である。 遅発型過敏症反応は、 活性化されたリンパ球、 単球、 マクロファージなどによ る細胞性免疫に依存した炎症反応である。 炎症部位に浸潤したこれらの細胞から 産生されたサイト力インにより血管透過性が充進し、 浮腫、 肉芽種、 線維化、 壊 死が起こり、 重篤な障害が引き起こされる。 遅発型過敏症反応によるアレルギー 性皮膚炎は接触性皮膚炎の多数を占め、 更に細菌、 ウィルス又は薬物が抗原とな るアレルギーにおいても、 その発症の原因となっている。 ヒッジ赤血球を抗原と して用いたマウスのモデルは遅発型過敏症反応の試験としてよく用いられており、 本モデルにぉレ、て有効性を示す化合物は上記のァレルギ一性疾患の治療又は予防 に有用であると考えられる。
シクロペンテノン誘導体若しくはその光学活性体又はそれらの塩は、 正常細胞 では分裂期のみに一過的に発現しているが、 がん化により全細胞周期を通じて高 発現するようになるトポイソメラ一ゼ IIに特異的に阻害活性を示し、 これらの化 合物から選択される少なくとも 1以上の化合物を有効成分として含有するトポィ ソメラーゼ阻害剤は制がん剤として使用することもできる。 また、 これらの化合 物から選択される少なくとも 1つの化合物を有効成分として使用するトポイソメ ラーゼ阻害方法は生化学研究や制がん剤のスクリ一ユング等に有用である。
シク口ペンテノン誘導体若しくはその光学活性体又はそれらの塩は細胞接着抑 制活性を有し、 これらの化合物から選択される少なくとも 1つの化合物を有効成 分として含有する細胞接着抑制剤を提供することができる。 本発明の細胞接着抑 O 00/10560
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制剤は細胞接着の抑制を要する疾病の治療剤又は予防剤として有用である。
例えば、 がん転移は原発巣で増殖したがん細胞が血管内へ遊離し、 転移部位ま で移動して組織内浸潤することにより成立する。 このうち血管内から転移部位へ の移動においてがん細胞と血管内皮細胞との接着が必要となる。 がん転移に関与 する接着分子として血管内皮細胞側の I CAM— 1、 VCAM— 1、 EL AM—
1等が知られており、 それぞれに対応するがん細胞側のリガンドは L F A— 1、 VLA— 4、 シァリルルイス Xであることが同定されている。 白血病細胞にはこ れらの接着分子がしばしば発現されており、 白血病細胞の血管外浸潤に関与して いると考えられている。 したがって、 本発明の細胞接着抑制剤は、 これら接着分 子を介したがん細胞の接着を抑制することによりがん転移の抑制が期待される。 また、 シクロペンテノン、 シクロペンテノンと SH基含有化合物より生成され る PCTZJ P98/00815号明細書記載の化合物もそれぞれ細胞接着抑制 活性を示し、 これらの化合物から選択される少なくとも 1つの化合物を有効成分 として含有する細胞接着抑制剤を提供することができる。
本発明により提供される細胞接着抑制剤は、 細胞接着抑制方法に使用すること ができ、 該方法は細胞接着に関する生化学的研究や、 細胞接着阻害剤や細胞接着 活个生剤のスクリーニングに有用である。
シク口ペンテノン誘導体若しくはその光学活性体又はそれらの塩はナチュラル キラー （NK) 細胞活性化作用を有し、 これらの化合物から選択される少なくと も 1つの化合物を有効成分として含有する N K細胞活性ィヒ剤を提供することがで きる。 本発明の N K細胞活性化剤は N K細胞の活性化を要する疾病の治療剤又は 予防剤として有用である。
すなわち、 NK細胞は細菌、 ウィルス感染細胞やがん細胞を認識し、 細胞膜傷 害作用によりこれらを排除する細胞である。 従って、 NK細胞を活性化させるこ とは生体の免疫防御機構を高めることであり、 本発明の NK細胞活性化剤は細菌、 ウィルス疾患やがん治療または予防に有用である。
また、 シクロペンテノン、 シクロペンテノンと SH基含有化合物より生成され る PCT/J P98Z00815号明細書記載の化合物もそれぞれ NK細胞活性 化作用を有し、 これらの化合物から選択される少なくとも 1つの化合物を有効成 O 00/10560
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分として含有する N K細胞活性化剤を提供することができる。
本発明により提供される N K細胞活性化剤は、 N K細胞活性化方法に使用する ことができ、 該方法は免疫防御機構に関する生化学的研究や、 免疫防御剤のスク リーニングに有用である。
シク口ペンテノン誘導体若しくはその光学活性体又はそれらの塩は抗真菌作用 を有し、 これらの化合物から選択される少なくとも 1つの化合物を有効成分とし、 これを公知の医薬用担体と組合せ製剤化すれば抗真菌剤を製造することができる。 従来、 真菌感染症の治療剤としては、 アンホテリシン B、 フルシトシン、 ミコ ナゾール、 フルコナゾ一ルのほか多数あるが、 効力及び毒性若しくは耐性菌の点 で問題がある。 特に近年増加傾向にある全身感染に有効な低毒性の薬剤は少なレ、。 本発明の抗真菌剤は毒性も少なく、 新しいタイプの抗真菌剤として有用である。 シク口ペンテノン誘導体若しくはその光学活性体又はそれらの塩は熱ショック タンパク誘導作用を有し、 これらの化合物から選択される少なくとも 1つの化合 物を有効成分とする熱ショックタンパク誘導剤を製造することができ、 熱ショッ クタンパク誘導を必要とする疾患に応じた方法で投与することができる。
すなわち、 シク口ペンテノン誘導体若しくはその光学活性体又はそれらの塩は 7 0 kダルトン （H S P 7 0 ) 等の熱ショックタンパク誘導活性を有し、 肝炎ゥ イノレス、 エイズウイルス、 インフルエンザウイルス、 水疱性口内炎ウィルス、 へ ルぺスウィルス等の R N Aウィルス、 D NAウィルスに対する抗ウィルス作用を 有する。 また、 熱ショックタンパクはがん免疫に関与しており、 これらの化合物 はがん免疫にも有効である。 更に抗炎症等生体防御作用をも有する。 本発明の化 合物若しくはその光学活性体又はそれらの塩を摂取することにより、 ィンフルェ ンザウィルスによる風邪疾患等のウィルス性疾患が予防、 治療できる。
なお、 熱ショックタンパクは細胞や個体が平常の温度よりも 5〜 1 0 °C程度高 い温度変化を急激に受けたときに合成が誘導されるタンパクの総称であり、 原核 生物から高等真核生物まで幅広く分布している。 真核生物の熱ショックタンパク としては H S P 9 0、 H S P 7 0、 ュビキチン、 H S P 2 6等が知られている。 その中で H S P 7 0は分子シャペロンの一種であり、 フォールディングが完了し ていない、 または不完全にフオールデイングしたタンパクに結合して立体構造の O 00/10560
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形成を助ける。 熱ショックタンパクのアミノ酸配列は進化の過程でよく保存され ており、 HS P 70は大腸菌の Dn a Kタンパクと相同である。 ヒトには約 10 個の HS P 70遺伝子が存在しているが、 これらのあるものは構成的に発現して おり、 あるものは様々な刺激によって誘導される。 熱ショックタンパクの合成は 熱ショックのほかに様々な化学物質、 酸化ストレス等の細胞障害によっても誘導 される。
C. ァミチ （C. Amici) ら 〔ジャーナル ォプ ビロロジー （Journal of Virology)、 第 68巻、 第 6890〜 6899頁 （1994) 〕 は、 β—不 飽和カルボニルを持つプロスタグランジン A ,の存在下でセンダイウィルスを感 染させた動物細胞を培養すると HS P 70と HS P 90の合成が誘導され、 HS P 70の合成が誘導されている間はウィルスタンパクの合成が抑制されることを 報告している。 また、 A. ロッシ （A. Rossi) ら 〔ザ ジャーナル ォブ バイ ォロジカノレ ケミストリ一 （The Journal of Biological Chemistry) 、 第 27 1卷、 第 32192〜 32196頁 （1996) 〕 は、 2—シクロペンテン一 1 —オンがプロスタグランジン A,と同様に HS P 70の合成を誘導し、 水疱性口 内炎ウイルスタンパクの合成を抑制することを報告している。
シクロペンテノン誘導体、 例えば、 ジイソプチルシクロペンテノンによる HS P 70誘導能は 1. 25 でみられ、 2. 5 で最大となるが、 これは 2— シクロペンテン一 1一オンが HS Ρ 70を誘導するには数百 の濃度を要する ことと比較すると極めて高い誘導能であるといえる。
シクロペンテノン誘導体若しくはその光学活性体又はそれらの塩はこのように 高い熱ショックタンパク誘導作用を持つことから、 DNAウィルス、 RNAウイ ルス、 レトロゥイノレス、 及びウイロイドに対して抗ウィルス活性を示す。 これら のウィルス、 ウイロイドには上記の各ウィルス、 ウイロイドが例示される。 本発明の治療剤又は予防剤の製造は、 一般的にはシクロペンテノン誘導体、 免 疫調節剤の製造は、 一般的にはシク口ペンテノン誘導体若しくはその光学活性体 又はそれらの塩から選択される化合物を有効成分とし、 薬学的に許容できる液状 又は固体状の担体と配合し、 力 必要に応じて溶剤、 分散剤、 乳化剤、 緩衝剤、 安定剤、 賦形剤、 結合剤、 崩壊剤、 滑沢剤等を加えて、 錠剤、 顆粒剤、 散剤、 粉 O 00/10560
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末剤、 カプセル剤等の固形剤、 通常液剤、 懸濁剤、 乳剤等の液剤とすることがで きる。 またこれを使用前に適当な担体の添加によつて液状となし得る乾燥品とす ることができる。
医薬用担体は、 上記投与形態及び剤型に応じて選択することができ、 経口剤の 場合は、 例えばデンプン、 乳糖、 白糖、 マンニット、 カルボキシメチルセルロー ス、 コーンスターチ、 無機塩等が利用される。 また経口剤の調製に当っては、 更 に結合剤、 崩壊剤、 界面活性剤、 潤沢剤、 流動性促進剤、 矯味剤、 着色剤、 香料 等を配合することもできる。
一方、 非経口剤の場合は、 常法に従い本発明の有効成分であるシクロペンテノ ン誘導体若しくはその光学活性体又はそれらの塩から選択される化合物を希釈剤 としての注射用蒸留水、 生理食塩水、 ブドウ糖水溶液、 注射用植物油、 ゴマ油、 ラッカセィ油、 ダイズ油、 トウモロコシ油、 プロピレングリコール、 ポリエチレ ングリコール等に溶解ないし懸濁させ、 必要に応じ、 殺菌剤、 安定剤、 等張化剤、 無痛化剤等を加えることにより調製される。
本発明の免疫調節剤は、 製剤形態に応じた適当な投与経路で投与される。 投与 方法も特に限定はなく、 内用、 外用及び注射によることができる。 注射剤は、 例 えば静脈内、 筋肉内、 皮下、 皮内等に投与し得、 外用剤には座剤等も包含される。 免疫調節剤としての投与量は、 その製剤形態、 投与方法、 使用目的及びこれに 適用される患者の年齢、 体重、 症状によって適宜設定され、 一定ではないが一般 には製剤中に含有されるシク口ペンテノン誘導体若しくはその光学活性体又はそ れらの塩から選択される化合物の量が成人 1日当り 0 . 1 g〜2 0 O m g / k gである。 もちろん投与量は、 種々の条件によって変動するので、 上記投与量よ り少ない量で十分な場合もあるし、 あるいは範囲を超えて必要な場合もある。 本 発明の薬剤はそのまま経口投与するほか、 任意の飲食品に添加して日常的に摂取 させることもできる。
本発明の腫瘍壊死因子産生抑制剤、 抗炎症剤、 トポイソメラーゼ阻害剤、 細胞 接着抑制剤、 熱ショックタンパク誘導剤、 抗真菌剤は上記免疫調節剤に準じ、 製 剤化することができ、 各疾病に応じた方法で投与することができる。 もちろん各 薬剤の投与量は、 種々の条件によって変動するので、 上記投与量より少ない量で 十分な場合もあるし、 あるいは範囲を超えて必要な場合もある。 本発明の各薬剤 はそのまま経口投与するほか、 任意の飲食品に添加して日常的に摂取させること もできる。
本発明で使用するシク口ペンテノン誘導体若しくはその光学活性体又はそれら の塩はシク口ペンテノン及び任意のカルボン酸若しくはその反応性誘導体より、 効率よく製造することができる。
上記製造法により、 シク口ペンテノンと無水ィソ酪酸の反応生成物であるジィ ソブチリルシクロペンテノン、 シクロペンテノンとメ トキシ酢酸の反応生成物で あるジメ トキシァセチルシクロペンテノン、 シクロペンテノンとメチルマレイン 酸との反応生成物であるジメチルフマリルシクロペンテノン、 及びジメチルマレ ィルシク口ペンテノンがそれぞれ提供される。
これらの化合物は制がん活性、 トポイソメラーゼ阻害活性等を有し、 これらの 化合物若しくはそれらの光学活性体又はそれらの塩を有効成分として制がん剤等 の医薬とすることができる。
本発明で得られたシク口ペンテノン誘導体若しくはその光学活性体又はそれら の塩を有効成分として含有する食品又は飲料の製造法は、 特に限定はないが、 調 理、 加工及び一般に用いられている食品又は飲料の製造法による製造を挙げるこ とができ、 製造された食品又は飲料に有効量の生理作用を有するシクロペンテノ ン誘導体若しくはその光学活性体又はそれらの塩から選択される化合物が含有さ れていれば良く、 免疫調節用食品又は飲料等の機能性食品又は飲料とすることが できる。
本発明で得られるシク口ペンテノン誘導体若しくはその光学活性体又はそれら の塩はその生理活性の有効量の投与を行っても毒性は認められない。 例えば、 経 口投与の場合、 ジプロピオニルシクロペンテノン、 ジへキサノルシクロペンテノ ン、 ジー 2—へキセノィルシクロペンテノン、 ジイソブチルシクロペンテノン、 ジベンゾィルシク口ペンテノン若しくはこれらの光学活性体又はそれらの塩のい ずれかを 1 0 O m g Z k gでマウスに単回投与しても死亡例は認められない。 以上、 シクロペンテノン誘導体若しくはその光学活性体又はそれらの塩は、 簡 便に製造でき、 その種々の生理的機能により、 医薬、 食品等の広い分野において O 00/10560
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極めて有用な化合物である。
以下、 実施例を挙げて、 本発明を更に具体的に説明するが、 本発明はこれらの 実施例に何ら限定されるものではない。 なお、 実施例における％は重量％を意味 する。
実施例 1
(1) 10 gの D—グルクロン酸 （シグマネ： G 5269) を 1リッ トル の水に溶解し、 121。 で 4時間加熱した後約 10 m 1になるまで減圧下濃縮し た。 これに酢酸ブチル：酢酸：水 = 3 ·· 2 ： 2混合液の上層 4 Om 1を加えて混 合後、 遠心によって得た上清を減圧下約 1 Omlまで濃縮した。
上記抽出液をカラムクロマトグラフィー用シリカゲル BW— 300 S P (2
X 28 cm, 富士シリシァ化学社製） にアプライし、 酢酸ブチル：酢酸：水 = 3 : 2 : 2の上層を溶離液としてコンプレッサーで 0. 2 k gZcm2に加圧し、 毎分 5 m 1の流速で分離を行った。 1画分当り 1 Om〖になるようにフラクショ ネーシヨンを行い、 各面分の一部をとつて薄層クロマトグラフィ一で分析したと ころ 61番から 80番までの画分に高純度のシクロペンテノンが含まれていた。 これらの画分を集めて減圧下濃縮した後 4 Om 1のクロロホルムで抽出し、 抽出 液を减圧下濃縮することによって 1 0 Omgのシクロペンテノンを得た。
この画分をパルパックタイプ Sカラムを用いた順相 HP LCで分離し、 215 n mの紫外部吸収で検出したところ、 純度は 98 %であった。
上記と同様の方法で得たシクロペンテノン 1 13. 9mgをエタノール 2. 8
5mlに溶かした。 このエタノール溶液にへキサンノエタノール （94/6) 3. 85m lを更に加え、 1 Tr gZm 1のシクロペンテノン溶液を調製した。 この 液を 0. 5 /zmのフィルターでろ過し、 光学分割 HP LC試料溶液とした。
この試料溶液を以下の条件で光学分割 HP LCを行い、 前ピークの （一） 体シ クロペンテノン及び後ピークの （+) 体シクロペンテノンのフラクションをそれ ぞれ集め、 減圧乾固し、 （一） 体シクロペンテノン 43. 2mg、 （ + ) 体シク 口ペンテノン 43. Omgをそれぞれ得た。
光学分割 H PLC条件
カラム：キラールパック AS (ダイセル化学工業） 2. 0 cmX 25. 0 c O 00/10560
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m
カラム温度： 40°C
移動相：へキサン エタノール （94Z6)
流速： 14. 0 m 1 /m i n
検出： UV 210 nm
試料注入量： 150μ 1 (2. 55 m g )
得られた （一） 体シクロペンテノン及び （+ ) 体シクロペンテノンは両者共に 約 1 %のェナンチォマーを含有していたため再度上記の条件で光学分割した。 そ の結果、 前ピークの （一） 体シクロペンテノン 30. Omgから 19. 7mgの ェナンチォマーを含有しない （一） 体シクロペンテノンを、 後ピークの （+ ) 体 シクロペンテノン 37. 41118から27. 7 m gのェナンチォマーを含有しない (+ ) 体シクロペンテノンをそれぞれ得た。 なお （一） 体シクロペンテノン及び (+) 体シクロペンテノンの光学分割 HP LCの溶出時間はそれぞれ 33分、 4 0分であった。
(2) 実施例 1一 （1) 記載の方法で得たシクロペンテノン 29. 6mgに無 水ピリジン （ナカライテスタ社製 295— 26) lm 1、 無水酢酸 （ナカライ テスク社製 002-26) 0. 1 m 1を加えて室温で 3時間かくはんした。 反 応液をクロロホルムで抽出してジァセチルシク口ペンテノン 36 mgを得た。 得られたジァセチルシクロペンテノンの質量分析を DX 302質量分析計 （日 本電子社製） を用いて行った。 また、 CDC 1 :1に溶解し、 NMRによってその 構造を解析した。 核磁気共鳴装置は J NM— A500 (日本電子社製） を用いた。 その結果を以下に示す。 但し、 lH— NMRの化学シフト値はクロ口ホルムの化 学シフト値を 7. 24 p pmとして表した。
MS m/z 199 (M + H) +
Ή-NMR
δ 2. 12 (3 H, S， -OCOCH3) , 2. 16 (3H, S， -OCOC H3) , 5. 16 (1H， d, J = 3. OH z, H-5) ， 5. 89 ( 1 H, m， H-4) ， 6. 40 (1H， d-d, J = l. 5， 6. 5Hz， H— 2) ， 7. 43 (1 H, d-d, ] = 2. 5, 6. 5Hz， H- 3) O 00/10560
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(3) 実施例 1一 （1) の方法で得た （―） 体シクロペンテノン 15. 9mg を用いて上記実施例 1一 （2) と同様の反応を行い、 ジァセチル （一） 体シクロ ペンテノン 15. lmgを得た。 上記実施例 1一 （2) と同様に質量分析と核磁 気共鳴による構造解析を行い、 上記実施例 1一 （2) と同様の結果が得られた。
(4) 実施例 1一 （1) の方法で得た （+ ) 体シクロペンテノン 16. 7mg を用いて上記参考例 1一 （2) と同様の反応を行い、 ジァセチル （+ ) 体シクロ ペンテノン 18. 8mgを得た。 上記実施例 1— (2) と同様に質量分析と核磁 気共鳴による構造解析を行い、 上記実施例 1— (2) と同様の結果が得られた。
(5) シクロペンテノン 13. 8mgに安息香酸 （ナカライテスク 04 1一 20) 44. 3mg、 ジメチルァミノピリジン （DMA P ：東京化成工業社 製 D 1450) 7. 5mg、 N， N' —ジシクロへキシルカルボジイミ ド （D CC :ペプチド研究所社製 1001) 51. Omgを加えてクロ口ホルム 5m 1を添カ卩し、 氷冷中 4時間かくはんした。 反応液をろ過して得られたろ液をシリ 力ゲルカラム （75m l) にアプライし、 クロ口ホルムで溶出してジベンゾィル シクロペンテノンを含む画分を得た。 この画分の溶媒を減圧下除去し、 残渣をェ タノ一ルに溶解した後、 クロ口ホルムとメタノ一ルの 99 : 1混合液を展開溶媒 としたシリカゲル薄層クロマトグラフィーにより分離した。 R f =0. 45〜0. 55の部分のシリカゲルを薄層から搔き取り、 クロ口ホルムで抽出することによ りジベンゾィルシクロペンテノン 3. 2m gを得た。
得られたジベンゾィルシク口ペンテノンの質量分析と核磁気共鳴による構造解 析を上記実施例 1— (2) と同様に行った。 その結果を以下に示す。
MS m/z 323 (M + H) +
Ή-NMR
δ 5. 56 (1 Η, d, J = 3. OH z, H- 5) ， 6. 30 ( 1 H, m， H 一 4) ， 6. 54 (1 H, d-d, J = 1. 5， 6. 5Hz， H— 2) ， 7. 4
4 (4H， m, 芳香環の H) ， 7. 58 (2H， m, 芳香環の H) , 7. 64
(1H， d-d, J = 2. 0， 6. 5Hz, H— 3) ， 8. 06 (4H, m, 芳 香環の H)
(6) (一） 体シクロペンテノン 22. lmg、 安息香酸 71. 9 m g N DM AP 12. lmg、 DCC 80. 3 m gを用いて上記実施例 1— (5) と同 様の反応を行い、 ジベンゾィル （一） 体シクロペンテノン 19. 2mgを得た。 上記実施例 1一 （5) と同様に質量分析と核磁気共鳴による構造解析を行い、 上 記実施例 1— (5) と同様の結果が得られた。
(7) ( + ) 体シクロペンテノン 20. 4mg、 安息香酸 65. 6mg、 DM
AP 1 1. 0mg、 DCC 74. 3 m gを用いて上記実施例 1一 （5) と同 様の反応を行い、 ジベンゾィル （+ ) 体シクロペンテノン 21. 4mgを得た。 上記実施例 1— (5) と同様に質量分析と核磁気共鳴による構造解析を行い、 上 記実施例 1一 （5) と同様の結果が得られた。
(8) シクロペンテノン 30mg、 DMAP 10 m g、 へキサン酸 （ナカラ ィテスク社製 070- 26) 153mgを 5. 9 m 1のジクロロメタンに溶解 し、 氷冷下 DC C 108mgをカロえた。 1時間反応後、 クロ口ホルムを展開溶 媒としたシリカゲル薄層クロマトグラフィーによつて反応液を分離精製した。 R f = 0. 3〜0. 4の部分のシリカゲルを薄層から搔き取ってクロ口ホルムで抽 出することにより 1 1 mgのジへキサノィルシクロペンテノンを得た。
得られたジへキサノィルシクロペンテノンを CDC 1 に溶解して核磁気共鳴 法 （NMR) によって確認した。 核磁気共鳴装置は J NM— EX270 FT NMR システム （日本電子社製） を用いた。 また、 'H— NMRの化学シフト 値はテトラメチルシランの化学シフト値を 0 p pmとして表した。
その結果を以下に示す。
Ή-NMR
57. 44 (1 H, d d, J2一 3=6. 27Hz, J 3-4= 1. 98Hz, H- 3) ， 6. 42 (1 H, d d, J =6. 27H z, J3一 4= 1. 32Hz， H —2) ， 5. 91 (1 H, m， H-4) , 5. 16 ( 1 H， d， J 4-5= 2. 9 7Hz, H— 5) ， 2. 42 (2H, t, J = 7. 26H z) ， 2. 38 (2H, t, J = 7. 76H z) , 1. 65 (4H, m) , 1. 26 (8H， m) ， 0. 88 (6H， t)
(9) シクロペンテノン 30mg、 DMAP 10mg、 ミリスチン酸 （東京 化成工業社製 M0476) 301mgを 5. 9 m 1のジクロロメタンに溶解し、 O 00/10560 r^
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氷冷下 D CC 108mgを加えた。 1時間反応後、 クロ口ホルムを展開溶媒と したシリカゲル薄層クロマトグラフィーによつて反応液を分離した。 R f == 0. 45〜0. 55の部分のシリカゲルを薄層から搔き取ってクロ口ホルムで抽出す ることにより 53mgのジミリストイルシクロペンテノンを得た。
得られたジミリストイルシク口ペンテノンの核磁気共鳴による構造解析を実施 例 1一 （8) と同様に行った。 その結果を以下に示す。
•H-NMR
δ 7. 45 (1H， d d, J
Figure imgf000022_0001
2. 31 H z, H- 3) ， 6. 42 (1 H, d d， J 2-3=5. 31 H z, J 3-4= 1. 32H z, H 一 2) ， 5. 92 (1 H, m, H-4) , 5. 1 6 (1 H, d， J 4-5= 2. 6
4H z, H— 5) ， 2. 42 (2H， t， J = 7. 26H z) ， 2. 38 (2H， t , J = 7. 91 H z) ， 1. 63 (4H, m) ， 1. 26 (32H， m) ， 0. 88 (6H, t)
(10) シクロペンテノン 3 Omg、 DMAP 10mg、 オクタン酸 （ナカ ライテスタ社製 071 - 1 1) 190mgを 5. 9 m 1のジクロロメタンに溶 解し、 氷冷下 DC C 108mgを加えた。 1時間反応後、 クロ口ホルムを展開 溶媒としたシリカゲル薄層クロマトグラフィーによって反応液を分離した。 R f = 0. 25〜0. 35の部分のシリカゲルを薄層から搔き取ってクロ口ホルムで 抽出することにより 27 mgのジォクタノィルシクロペンテノンを得た。
得られたジォクタノィルシク口ペンテノンの核磁気共鳴による構造解析を実施 例 1一 （8) と同様に ί亍つた。 その結果を以下に示す。
Ή-NMR
δ 7. 44 (1 Η, d d, J 2-3= 6. 1 H z, J 3-4= 2. 16H z, H- 3) ， 6. 41 ( 1 H, d d， J 2-3= 6. lHz， J 3一 4= 1. 48H z, H— 2) ， 5. 92 (1 H, m, H-4) , 5. 16 (l H, d, J 4-5= 2. 97
Hz, H— 5) ， 2. 42 (2H， t, J = 7. 59H z) ， 2. 38 ( 2 H, t, J = 7. 91 H z) , 1. 65 (4H， m) ， 1. 29 ( 16 H, m) ， 0. 88 (6 H, t)
(1 1) シクロペンテノン 3 Omg、 DMAP 10mg、 3—ォクテン酸 (東京化成工業社製 00070) 190mgを 5. 9mlのジクロロメタンに 溶解し、 氷冷下 DC C 108mgを加えた。 1時間反応後、 クロ口ホルムを展 開溶媒としたシリカゲル薄層クロマトグラフィーによって反応液を分離した。 R f =0. 25〜0. 35の部分のシリカゲルを薄層から搔き取ってクロ口ホルム で抽出することにより 25 mgのジー 3—ォクテノィルシクロペンテノンを得た。 得られたジ一 3—ォクテノィルシク口ペンテノンの核磁気共鳴による構造解析 を実施例 1一 （8) と同様に行った。 その結果を以下に示す。
Ή-NMR
δ 7. 44 (1 Η, d d, J =6. 27H z, J :,-4= 2. 32Hz， H- 3) ， 6. 42 (1 H, d d, J -3=6. 27H z, J a-4= 1. 49H z, H
—2) , 5. 91 (1H， m, H-4) ， 5. 55 (4H, m) ， 5. 16 (1 H， d， J -5=2. 97Hz, H- 5) ， 3. 12 (4H， d d， J = 12. 85H z, J = 6. 59Hz) , 2. 04 (4H， m) ， 1. 33 (8H, m) , 0. 89 (6H, t)
(12) シクロペンテノン 30mg、 DMAP 10 m g、 n—酪酸 （東京化 成工業社製 B 0754) 1 15mgを 5. 9 m 1のジクロロメタンに溶解し、 氷冷下 D CC 108 m gを加えた。 1時間反応後、 クロ口ホルムを展開溶媒と したシリカゲル薄層クロマトグラフィ一によって反応液を分離した。 R f = 0. 20〜0. 30の部分のシリカゲルを薄層から搔き取ってクロ口ホルムで抽出す ることにより 16 mgのジブチリルシクロペンテノンを得た。
得られたジブチリルシク口ペンテノンの核磁気共鳴による構造解析を実施例 1 - (8) と同様に行った。 その結果を以下に示す。
Ή-NMR
δ 7. 45 (1 Η, d d, J 2-3=6. 27H z, J3-4=2. 13H z, H- 3) ， 6. 42 (1 H, d d， J2— 3=6. 27Hz， J3-4= 1. 65Hz, H
—2) , 5. 91 (1 H， m， H-4) ， 5. 16 ( 1 H, d， J4— 5=2. 6 4H z, H- 5)
(13) シクロペンテノン 30mg、 DMAP 10mg、 n—デカン酸 （東 京化成工業 ttM D 0017) 226mgを 5. 9 m 1のジクロロメタンに溶解 O 00/10560
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し、 氷冷下 DC C 108mgをカロえた。 1時間反応後、 クロ口ホルムを展開溶 媒としたシリカゲル薄層クロマトグラフィーによって反応液を分離した。 R f = 0. 35〜0. 45の部分のシリカゲルを薄層から搔き取ってクロ口ホルムで抽 出することにより 35 mgのジデカノィルシクロペンテノンを得た。
得られたジデカノィルシク口ペンテノンの核磁気共鳴による構造解析を実施例
1一 (8) と同様に行った。 その結果を以下に示す。
Ή-NMR
δ 7. 44 (1 Η, d d， J =6. 27Hz， J 3-4= 1. 97Hz， H— 3) ， 6. 42 (1 H, d d， J =6. 27Hz， J 3-4= 1. 3Hz, H - 2) ， 5. 91 (1 H, m, H-4) , 5. 1 5 ( 1 H， d, J 4-s= 2. 97
Hz, H- 5) , 2. 42 (2H, t, J = 7. 24H z) ， 2. 38 (2H, t , J = 7. 91 H z) , 1. 65 (4H, m) , 1. 26 (24H， m) ， 0. 88 (6H, t)
(14) シクロペンテノン 30mg、 DMAP 16mg、 トリェチルァミン (東京化成工業社製 TO 424) 66mg及び無水 n—吉草酸 （東京化成工業 社製 V0006) 122mgを 5. 9 m 1のジクロロメタンに溶解し、 氷冷下 1時間反応させた。 この反応液をクロロホルム：メタノール = 200 : 1を展開 溶媒としたシリカゲル薄層クロマトグラフィーによって展開し、 R f = 0. 7〜 0. 8の部分のシリカゲルを薄層から搔き取り、 クロ口ホルムで抽出することに よって 39 mgのジバレリルシクロペンテノンを得た。
得られたジバレリルシクロペンテノンの核磁気共鳴による構造解析を実施例 1 一 （8) と同様に行った。 その結果を以下に示す。
Ή-NMR
δ 7. 45 (1 Η, d d， J 2-3 = 6. 1 1 Hz, J 3-4= 1. 66 H z , H— 3) 、 6. 42 ( 1 H, d d， J 2-3 = 6. 1 1 H z, J 3-4=1. 6
6Hz, H- 2) 、 5. 91 ( 1 H, m, H-4) 、 5. 16 ( 1 H， d， J 4 一 5 = 2. 97H z, H- 5) 、 2. 43 (2H, d d, J = 7. 59， 7. 5 9Hz) 、 2. 39 (2H， d d, J = 7. 59， 7. 59Hz) 、 1. 65 (4H, m) 、 1. 38 (4H， m) 、 0. 93 (6 H, d d， J = 7. 26， 7. 26H z)
(15) シクロペンテノン 3 Omg、 DMAP 16mg、 トリェチルァミン 66mg及び無水プロピオン酸 （東京化成工業社製 P0513) 86mgを 5, 9m 1のジクロロメタンに溶解し、 氷冷下 1時間反応させた。 この反応液をクロ 口ホルム：メタノール =200 ： 1を展開溶媒としたシリカゲル薄層クロマトグ ラフィ一によって展開し、 R f = 0. 5〜0. 6の部分のシリカゲルを薄層から 搔き取り、 クロ口ホルムで抽出することによって 31 mgのジプロピオ二ルシク 口ペンテノンを得た。
得られたジプロピオ二ルシク口ペンテノンの核磁気共鳴による構造解析を実施 例 1一 （8) と同様に行った。 その結果を以下に示す。
Ή-NMR
δ 7. 45 ( 1 Η, d d, J 2-3 = 6. 27 H z , J 3-4 = 2. 15Hz， H— 3) 、 6. 42 ( 1 H, d d , J 2-3 = 6. 27Hz， J 3-4= 1. 4 9Hz， H- 2) 、 5. 91 ( 1 H， m， H— 4) 、 5. 16 ( 1 H, d, J 4 —5 = 2. 97H z, H— 5) 、 2. 46 (2H， d d， J = 15. 01， 7.
59H z) 、 2. 42 (2H, d d, J = 15. 01， 7. 59H z) 、 1. 1 8 (6 H, d d， J = 7. 59， 7. 59H z)
(16) シクロペンテノン 2 g、 DMAP 733mg、 t r a n s— 2—へ キセン酸 （東京化成工業社製、 HO 383) 4. 1：!11及び0〇〇 5. 57 g を 20 Om 1のジクロロメタンに溶解し、 室温で 2時間反応させた。 この反応液 をへキサン：酢酸ェチル = 8 ： 1を溶媒としたシリカゲルカラムクロマトグラフ ィ一を行い、 シリカゲル薄層クロマトグラフィ一上で単一のスポットを示す画分 を得た。 この画分を减圧下濃縮し、 油状のジ一 2—へキセノィルシクロペンテノ ン約 900 m gを得た。
得られたジー 2—へキセノィルシク口ペンテノンの核磁気共鳴による構造解析 を実施例 1— (8) と同様に行った。 その結果を以下に示す。
Ή-NMR
δ 0. 92 (6Η, m, 1 1 -H+ 1 1 ' —H) 、 1. 48 (4H， m, 10 -H+ 10 ' — H) 、 2. 18 (4H， m， 9一 H, 9 ' 一 H) 、 5. 22 (1 O 00/10560
24
H， d, J =3. OH z, 5 -H) 、 5. 85 (2H， m, 7-H+7' -H) 、 5. 98 (1H， m, 4-H) 、 6. 41 (1H， d d, J = 1. 0， 6. OH z， 2—H) 、 7. 04 (2H， m， 8 -H+ 8 ' 一 H) 、 7. 47 (1 H, d d, J = 2. 0， 6. OH z , 3 -H)
なお、 シクロペンテノンの 5位に結合している 2—へキセノィル基の炭素を力 ルボニル基から順に 6位〜 1 1位、 シクロペンテノンの 4位に結合している 2— へキセノィル基の炭素をカルボニル基から順に 6， 位〜 1 1 ' 位とした。
(1 7) シクロペンテノン 1. 2 gを 200m 1のジクロロメタンに溶解し、 無水イソ酪酸 （ナカライテスク社製） 1. 7ml、 DMAP 427mg、 トリ ェチルァミン （ナカライテスク社製） 1. 46m 1を加えた。 室温で 1時間反応 後減圧下濃縮して酢酸ェチルに溶解し、 10 %クェン酸及び飽和重曹水溶液で洗 浄した。 これを減圧下濃縮し、 へキサン：酢酸ェチル =8 ： 1を展開溶媒とした シリカゲノレカラムクロマトグラフィーで分離し、 へキサン：酢酸ェチル =6 ： 1 を展開溶媒としたシリカゲル薄層クロマトグラフィーで R f = 0. 2のスポット を与える画分を得た。 本画分の溶媒を減圧下留去し、 高純度のジイソプチリルシ ク口ペンテノンを含む 470 m gの油状物を得た。
得られたジィソブチリルシク口ペンテノンを重クロロホルムに溶解し、 核磁気 共鳴による構造解析を実施例 1一 （2) に従い行った。 その結果を以下に示す。
Ή-N R
δ 1. 18 (12Η, m, 7— H， 8-H, 10-H, 1 1一 H) 、 2. 61
(2H， m, 6 -H, 9-H) 、 5. 10 ( 1 H, d， J = 3. OHz， 5— H) 、 5. 88 (1 H, m, 4-H) 、 6. 39 (1H， d d, J = 1. 5， 6. OH z, 2—H) 、 7. 41 (1 H, d d， J = 2. 5， 6. 0Hz， 3— H) 但し、 重クロ口ホルムの残留プロ トンの化学シフト値を 7. 24 p pmとして 表した。
図 1にジイソブチリルシクロペンテノンの1 H— NMRスぺクトルを示す。 図 1において横軸は化学シフト値 （p pm) 、 縦軸はシグナルの強度を示す。
なお、 'H— NMRにおけるシグナルの帰属の番号は下記式 〔I I I〕 の通り である。 O 00/10560
25
Figure imgf000027_0001
(i I n
(18) シクロペンテノン 1. 5 gを 200m 1のジクロロメタンに溶解し、 メ トキシ酢酸 （ナカライテスタ社製） 2. 7 g、 DMAP 794mg、 ジシクロ へキシルカルボジィミ ド （DCC：ナカライテスク社製） 5. 36 gを加えた。 室温で 2時間反応後减圧下濃縮して酢酸ェチルに溶解し、 10%クェン酸及び飽 和重曹水溶液で洗浄した。 これを減圧下濃縮し、 へキサン：酢酸ェチル =2 ： 3 を展開溶媒としたシリカゲルカラムクロマトグラフィ一で分離し、 へキサン：酢 酸ェチル = 1 ： 1を展開溶媒としたシリカゲル薄層クロマトグラフィーで R f = 0. 34のスポットを与える画分を得た。 本画分の溶媒を減圧下留去し、 高純度 のジメ トキシァセチルシクロペンテノンを含む 30 Omgの油状物を得た。
得られたジメ トキシァセチルシクロペンテノンを重クロ口ホルムに溶解し、 核 磁気共鳴による構造解析を実施例 1一 （2) に従い行った。 その結果を以下に示 す。
Ή-NMR
63. 45 (6Η, s， 7-H, 9-H) , 4. 13 (4H， m, 6 -H, 8
-H) 、 5. 30 (1H, d， J = 3. 0Hz， 5— H) 、 5. 99 ( 1 H， m， 4-H) 、 6. 44 (1H， d d， J = 1. 5， 6. 5H z, 2 -H) 、 7. 4 6 (1 H, d d, J = 2. 0， 6. 5Hz， 3— H)
但し、 重クロ口ホルムの残留プロトンの化学シフト値を 7. 24 p pmとして 表した。
図 2にジメ トキシァセチルシクロペンテノンの1 H— NMRスぺクトルを示す。 図 2において横軸は化学シフト値 （p pm) 、 縦軸はシグナルの強度を示す。 なお、 'H— NMRにおけるシグナルの帰属の番号は下記式 〔I V〕 の通りで ある。 O 00/10560
26
Figure imgf000028_0001
〔I V〕
(19) シクロペンテノン 1. 1 gを 20 Om 1のジクロロメタンに溶解し、 メチルマレイン酸 3. 4 g、 DMAP610mg、 ジシクロへキシルカルボジィ ミ ド 4· 1 2 g、 を加えた。 室温で 2時間反応後減圧下濃縮して酢酸ェチルに溶 解し、 10%クェン酸及び飽和重曹水溶液で洗浄した。 これを減圧下濃縮し、 へ キサン：酢酸ェチル =3 ： 2を展開溶媒としたシリカゲルカラムクロマトグラフ ィ一で分離し、 へキサン：酢酸ェチル = 1 ： 1を展開溶媒としたシリカゲル薄層 クロマトグラフィーで R f = 0. 6のスポットを与える画分および R f =0. 4 5のスポットを与える画分を得た。
両画分の溶媒をそれぞれ減圧下留去し、 R f = 0. 6の画分より高純度のジメ チルフマリルシクロペンテノンを含む 30 Omgの固体物、 及び R f = 0. 45 の画分より高純度のジメチルマレィルシクロペンテノンを含む 30 Omgの油状 物を得た。
それぞれを重クロロホノレムに溶解し、 核磁気共鳴による構造解析を実施例 1一 (2) に従い行った。 その結果を以下に示す。
Ή-NMR
ジメチルフマリルシク口ペンテノン
δ 3. 80 (6 Η, s , 10-Η, 15— Η) 、 5. 31 (1H， d , J = 3. ΟΗ.ζ, 5 -Η) 、 6. 03 (1Η， m， 4一 Η) 、 6. 48 ( 1 Η， d d， J =1. 0， 6. OH ζ, 2 -Η) 、 6. 90 (4Η, m, 7-Η, 8-Η, 12
— Η， 13— Η) 、 7. 50 (1Η， d d， J = 2. 0， 6. OH ζ, 3— Η) ジメチルマレイノレシク口ペンテノン
S 3. 76 (6Η, s , 10-Η, 15— Η) 、 5. 31 ( 1 Η, d， J = 3. OH z, 5 -H) 、 6. 07 (1 H, m, 4 -H) 、 6. 31 (4H， m, 7— H, 8 -H, 12-H, 1 3 -H) 、 6. 44 (1 H, d d， J = 1. 5， 6. O 00/10560
27
0Hz， 2— H) 、 7. 58 ( 1 H， d d， J = 2. 0， 6. 0Hz, 3— H) 但し、 重クロ口ホルムの残留プロ トンの化学シフト値を 7. 24 p pmとして 表した。
図 3にジメチルフマリルシク口ペンテノンの1 H— NMRスぺク トルを示す。 また図 4にジメチルマレイルシク口ペンテノンの1 H— NMRスぺク トルを示す。 図 3、 図 4において横軸は化学シフト値 （p pm) 、 縦軸はシグナルの強度を示 す。
なお、 ジメチルフマリルシク口ペンテノンの 'H— NMRにおけるシグナルの 帰属の番号は下記式 〔V〕 の通りである。
Figure imgf000029_0001
〔v〕 また、 ジメチルマレイルシク口ペンテノンの1 H— NMRにおけるシグナルの 帰属の番号は下記式 〔V I〕 の通りである。
Figure imgf000029_0002
〔V I〕
(20) シクロペンテノンの 1M水溶液 100 μ 1 と 20 OmMグルタチオン (還元型：ナカライテスク社販売： 1 70— 10) 水溶液 （pH3. 0) 500 μ ΐを混合し、 60°Cで 5時間反応させた。 この反応液を 0. 5 μιηコスモナイ スフィルターでろ過し、 以下の条件で HP LCで分離した。 O 00/10560
28
カラム： TSKg e l ODS-8 OT s (5 zm) 、 2 OmmX 25 cm 移動相： A 0. 1 %TF A水溶液
B 0. 1 %TF AZ50%ァセトニトリル水溶液
流速： 7. 5 m 1 Z分
グラジェント ： 1 0分間移動相 A— 55分かけて移動相 Aから A： B= 1 ： 1
→1 5分かけて移動相 A： B= 1 ： 1から移動相 B 検出： 220 nmにおける吸光度
上記反応液 20 Ο μ 1を H PLCにかけ、 保持時間 35. 7、 36. 1分のピ 一クを分取し、 それぞれ減圧下濃縮乾固し、 乾固物 5. 5mgを得た。
この乾固物の構造を解析した。 核磁気共鳴 （NMR) スペク トルは J NM— A
500 (日本電子社製） 、 質量スぺク トル （MS) は DX 302質量分析計 （日 本電子社製） 、 紫外 （UV) 吸収スペク トルは UV— 2500分光光度計 （島津 製作所製） 、 赤外吸収 （ I R) スぺク トルは FT I R— 8000 PC赤外分光光 度計 （島津製作所製） を用いて測定した。 その結果を以下に示す。
Ή-NMR
δ 2. 09 (2Η, m, 5 ' -H) ， 2. 28 ( 1 H， d d， J = 1 3. 0, 20. OH z, 5—H) ， 2. 44 (2H, m， 4 ' 一 H) ， 2. 78 ( 1 H， d d， J = 8. 5， 1 4. 0， 1 ' 一 H) ， 2. 85又は 2. 89 ( 1 H, d d， J =3. 0, 6. OH z, 5-H) ， 2. 92又は 2. 95 ( 1 H, d d, J = 1. 0， 5. 5H z， 1 ' -H) ， 3. 86 (2H, S， 9 ' -H) ， 3. 95 (2H， m, 4-H, 6' -H) ， 4. 46 ( 1 H, m， 2 ' 一 H) ， 6. 47 又は 6. 49 (1 H， d， J = 3. 0Hz， 3-H)
試料は 0. I N DC 1重水溶液に溶解し、 HODの化学シフト値を 4. 65 p pmとして表した。
,3C-NMR
6 26. 3 (5' — C) ， 3 1. 7 (4' — C) ， 3 1. 9又は 32. 1 (1 ' -C) ， 39. 3 (4-C) ， 41. 9 (9' — C) ， 42. 2又は 42. 3 (5 -C) ， 53. 3 (6 ' 一 C) , 54. 1 (2 ' 一 C) ， 1 33. 5 (3 一 C) ， 1 54. 4 (2-C) , 1 73付近 （3' — C， 7， 一 C, 8， 一 C， O 00/10560
29
10' — C) ， 205. 8 (1— C)
試料は 0. I N DC 1重水溶液に溶解し、 ジォキサンの化学シフト値を 67 4 p pmとして表した。
なお、 'H— NMR、 1:iC一 NMRのピークの帰属の番号は下記式 〔V I I〕 のとおりである。
Figure imgf000031_0001
〔V I I〕 FAB-MS
m/z 404 (M + H) +， 426 (M+N a) +
グリセロールをマトリックスに用いた。
UV lmax 251 nm (水）
I R vKBr max cm—1 2949， 1 710， 1660, 1539， 140 4， 1203
拡散反射法によって行った。
以上の結果から、 乾固物は 2—ヒドロキシ一 4一ダルタチオン一 S—^ Tル— 2
—シクロペンテン一 1一オン （2- hydroxy- 4 - glutathion - S- yl - 2 - cyclopenten-1- one ：以下、 単に GMと称する） であった。
実施例 2
56°C、 30分間処理したゥシ胎児血清 （FCS ： J RH社製） を 10%含む RPM I 1 640培地 （B I O WH I TTAKER社製） にて 37°Cで培養し た HL— 60 (ATCC CCL-240) を RPMI 1640培地にて 2. 5 X 105細胞/ 5 m 1となるように懸濁した。
この懸濁液 5mlに対し、 様々な濃度に希釈したジイソプチリルシクロペンテ ノン、 ジメ トキシァセチルシクロペンテノン、 ジメチルフマリルシクロペンテノ ン、 ジメチルマレィルシクロペンテノンのそれぞれ 70%エタノール水溶液を 1 O 00/10560
30.
0 1添加し、 3 7°C、 5%二酸化炭素存在下で、 24時間培養した。 また確認 のためアポトーシスを誘発する試薬として知られているァクチノマイシン D (シ グマ社製） の水溶液 （0. 5mg/m l ) 1 0 1を上記の試料の代わりに用い て同様の培養を行った。
培養細胞を光学顕微鏡下で観察し、 試料、 及びァクチノマイシン D添加培養細 胞に核の凝縮、 細胞の縮小、 アポトーシス小体の形成をそれぞれ確認した。 なお 対照の 7 0%エタノール水溶液 1 0 μ 1添加培養細胞においてはこれらの現象は 認められなかった。
さらに、 上記と同様の方法で培養した細胞を一部サンプリングし、 0. 4% トリパンブルーで染色後、 光学顕微鏡で観察し、 染色されていない生細胞と青く 染色された死細胞の細胞数の測定を行い、 生残率が 50%になる各サンプルの濃 度 （生残率 5(,/ζΜ) をもとめ、 表 1に示した
サンプル名 生残率 5。 (μΜ) ジィソブチリル、: /ゥ口ペンテノン 8. 8
ジメ トキシアセラ F レシク口ペンテノン 1 4
ジメチノレフマリノレシク口ペンテノン 2. 9
ジメチノレマレイノレシク口ペンテノン 3. 4
以上、 各化合物はがん細胞増殖抑制活性、 アポト一シス誘発活性を示した。 ま た各化合物の光学活性体及びそれらの塩も同様の活性を示した。
実施例 3
( 1 ) トポイソメラーゼ II [トポジェン （T o p o GEN) 社製、 2単位/// 1 ] 2 μ 1、 1 0倍濃度緩衝液 [0. 5Μ T r i s -HC 1 (pH 8. 0) 、 1. 2M KCし 0. 1M Mg C l 2、 2. 5 mM アデノシン三リン酸、
5mM ジチオスレィトール] 2 μ し 0. 1 %ゥシ血清アルブミン （宝酒造社 製） 2 μ し 蒸留水 1 1 μ 1及び対照の蒸留水又は水で様々な濃度に調製したジ プロピオニノレシクロペンテノン、 ジイソプチリルシクロペンテノン、 ジベンゾィ ノレシクロペンテノン、 ジへキサノィルシクロペンテノン、 ジ一 2—へキセノィル シクロペンテノン、 ジメ トキシァセチルシクロペンテノン、 ジメチルフマリルシ クロペンテノン、 ジメチルマレィルシクロペンテノン 2 / 1を混合したものに、 0. 25 μ g/μ 1 pBR322 DNA (宝酒造ネ： h ) 1 // 1を添加して 3 7 °Cで反応させた。 30分間反応後、 1 %ドデシル硫酸ナトリウム、 50%グリ セロール、 0. 02%プロモフエノールブル一水溶液 2 jti 1を添加して反応を停 止した。
ァガロース L 03 (宝酒造社製） と TAE緩衝液 [40mM Tr i s、 5 m M酢酸ナトリウム、 1 mMエチレンジァミン四酢酸ニナトリウム （EDTA) 、 酢酸で pH7. 8に調整] を用いて作製した 1 %ァガロースゲルに上記反応液 2 0 μ 1をアプライし、 ΤΑΕ緩衝液中で電気泳動を行った。 泳動後、 ゲルを 1 μ gZm 1ェチジゥムブロミ ド水溶液に浸漬し、 紫外線を照射して DN A電気泳動 パターンを観察した。 なお、 水添加の対照では DN Aが超螺旋型から弛緩型に完 全に変化するが、 トポイソメラーゼ II活性が阻害されると超螺旋型から弛緩型へ の変化が一部又は完全に阻害される。
その結果、 水添加の対照では DN Aが超螺旋型から弛緩型に完全に変化したが、 0. 1 / M以上のジプロピオニルシクロペンテノン、 1 //M以上のジイソブチリ ノレシクロペンテノン、 1 M以上のジベンゾィルシクロペンテノン、 Ι ΟμΜ以 上のジへキサノィルシク口ペンテノン、 10 μΜ以上のジー 2—へキセノィルシ クロペンテノン、 50 μΜ以上のジメ トキシァセチルシクロペンテノン、 10
Μ以上のジメチルフマリルシクロペンテノン、 5 以上のジメチルマレィルシ ク口ペンテノンによって DNAの超螺旋型から弛緩型への変化が一部又は完全に 阻害され、 各シク口ペンテノン誘導体のトポイソメラーゼ II阻害活性が確認され た。
(2) 実施例 3— (1) と同様の方法で各シクロペンテノン誘導体のトポイソ メラーゼ I阻害活性を測定した。 但し、 トポイソメラーゼ IIの代わりにトポイソ メラーゼ I [トポジェン社製、 0. 0 imt/ 1] , 10倍濃度緩衝液として 10 OmM Tr i s— HC I (pH 7. 9) 、 10 mM EDTA, 1 mMス ペルミジン、 50%グリセロールを用いた。 O 00/10560
32
その結果、 水添加の対照では DN Aが超螺旋型から弛緩型に完全に変化した力 100 ΟμΜ以上のジプロピオニルシクロペンテノン、 500 以上のジイソ プチリルシクロペンテノン、 50 μΜ以上のジベンゾィルシクロペンテノン、 1 000 μΜ以上のジへキサノィルシクロペンテノン、 500 以上のジ一 2— へキセノィルシクロペンテノン、 1000 juM以上のジメ トキシァセチルシクロ ペンテノン、 1000 以上のジメチルフマリルシクロペンテノン、 1000 juM以上のジメチルマレィルシクロペンテノンによって DNAの超螺旋型力 ら弛 緩型への変化が一部又は完全に阻害され、 各シク口ペンテノン誘導体のトポイソ メラーゼ I阻害活性が確認された。
以上、 正常細胞では分裂期のみに一過的に発現しているが、 がん化により全細 胞周期を通じて高発現するようになるトポイソメラーゼ IIに、 上記シクロペンテ ノン誘導体及び実施例 1に記載の他のシク口ペンテノン誘導体は阻害活性を示し た。 また、 トポイソメラーゼ II阻害活性は、 がん化により発現量や活性が増大す るトポイソメラ一ゼ Iへの阻害活性に比べ、 強い阻害活性を示した。
また、 上記化合物の光学活性体及びそれらの塩も同様のトポイソメラーゼ Π特 異的阻害活性を示した。
実施例 4
( 1 ) 2X 105細胞 1の H L— 60 (ATCC CCL-240) を含む 10 %牛胎 児血清含有 RPM 1 1 640培地 5 m 1を 6ゥエルプレー卜の各ゥエルに入れ、 37°C5%C〇2 存在下で 24時間培養した後、 最終濃度が、 0、 0. 63、 1.
3、 2. 5、 5、 10、 20 μΜになるようにジプロピオニルシクロペンテノン、 ジィソブチリルシクロペンテノン、 ジー 2—へキセノィルシク口ペンテノンを添 加し、 更に 6時間培養を続けた。
培養終了後、 細胞数を計測した後、 細胞を遠心分離で回収し、 PBSで洗浄し て、 各試料処理細胞を調製した。 また、 45 °C10分間熱処理を行った後、 同様 に培養した細胞も調製した。
これらの処理細胞を用レ、、 モレキュラー クローニング （Molecular Cloning) 〔コールド スプリング ハーバー ラボラ トリ一 プレス （Cold Spring Harbor Laboratory Press) (1989) 〕 記載の方法に従って SDS- PAGEを行った。 O 00/10560
33
処理細胞は、 2 . 5 X 1 0 6細胞 1になるように SDS- PAGE Sample bufferに 懸濁し、 この細胞懸濁液を 1 0 0 °Cで 1 0分間処理した後、 5 / 1ずつを 2枚の SDS- PAGEゲル （ 5 %スタッキングゲル、 1 0 %セパレーションゲル） にアプライ し、 電気泳動を行った。 一方のゲルは、 クマシ一染色し、 他方のゲルは、 Polyvmylidene difluoride transfer membrane [ImmobilonTM ： ミリポア
(MILLIP0RE) 社製 Cat. # IPVH000- 10〕 にブロッテイングした。 このメンブレン を Block Ace (大日本製薬株式会社 Cat. # UK-B25) で 4。C—晚ブロッキングし た。
このブロッキングしたメンブレンに熱誘導される 7 0 k D aの熱ショックタン パクと特異的に反応するモノクローナル抗体 H S P 7 2ノ 7 3 (A b— 1 ) 〔ォ ンコジーン リサーチ プロダクツ （Oncogene Research Products) 社製 Cat. HSP01) を反応させた後、 0 . 0 5 %T w e e η 2 0を含む T B Sで洗浄し、 更 に、 T B Sで洗浄した。 次いで、 Peroxidase複合二次抗体 HRP-RabbitAnti Mouse IgG(H+L) CZY ED ラボラトリース社 （ZYMED Laboratolies, Inc. ) 製 Cat. # 61- 65203 を反応させ、 先の操作と同様に洗浄した。 このように一次抗体、 二次抗体 と反応させたメンブレンに、 ケミルミノール試薬 RENAISSANCETM 〔デュポン NEN (Dupont NEN ) 社製 Cat. ίί NEL- 100〕 を反応させた後、 X- Ray フィルムを感光し て 7 0 k D aの熱ショックタンパクの誘導を確認、した。
その結果、 7 0 k D aの熱ショックタンパクの誘導が確認された。 その誘導の 強弱は表 2に示した。 なお表 2中、 +は誘導の強さを表し、 十が多いほど誘導が 強いことを意味する。 また一は誘導が認められなかったこと、 土は誘導がわず かであることを意味する。 O 00/10560
34
表 2
Figure imgf000036_0001
なお、 未処理のコントロールは—、 4 5 °C 5分間熱処理は + +であった。 以上 上記化合物は低濃度で熱ショックタンパクの誘導活性を示した。 またその光学活 性体及びそれらの塩も同様の活性を示した。 更に他のシク口ペンテノン誘導体若 しくはその光学活性体又はそれらの塩も同様の活性を示した。
実施例 5
ジプロピオニルシクロペンテノン、 ジイソプチリルシクロペンテノン、 ジー 2 一へキセノィルシク口ペンテノンを用いてカンジダ ·アルビカンス T I MM 0 1 3 6に対する抗真菌活性を調べた。
カンジダ 'アルビカンスはィ一ストナイ トロジェンベース （ディフコ社製） 0 . 6 7 %、 ダルコース 1 . 0 %を含有する Y N B G培地で 1晚培養した （種培養） 。 次に新鮮なィース トナイトロジェンベース培地で 1 X 1 0 6細胞 Zm Iとなるよ うに培養液を希釈し、 9 6ウェルマイクロタイタ一プレ一トの各ゥエルに 1 0 0 μ 1ずつ分注した。
ジプロピオニルシクロペンテノン、 ジイソプチリルシクロペンテノン、 ジー 2 O 00/10560
35
—へキセノィルシク口ペンテノンの各々 1 00 μ g/m 1、 500 g/m 1の 70 %エタノール溶液又は 70 %ェタノール溶液を各ゥエルに 1 0 μ 1ずつ加え、 30°Cで 48時間生地培養した （本培養） 。
ジプロピオニルシクロペンテノン、 ジイソプチリルシクロペンテノン、 ジ一 2 —へキセノィルシク口ペンテノンは各々 500 μ g/m 1でカンジダ♦アルビ力 ンスの増殖を抑制し、 最小生育阻害濃度は各々 500 gノ m 1であり、 これら の化合物は抗真菌剤の有効成分として有用である。 またこれらのシクロペンテノ ン誘導体の光学活性体及びそれらの塩も同様の活性を示した。
実施例 6
ヒ ト血管内皮細胞 （三光純薬社販売） を 1 0%FCS (ハイクローン社製） を 含む R PM I— 1 640培地 （ギブコネ： t ) に懸濁して 1 X 1 05細胞/ m 1に 調整し、 96ウェルマイク口タイタープレートに 1 00 μ 1ノウエルで播種した。
37°C 5 %C02インキュベーターで 2日間培養して単層になった血管内皮 細胞に 1 0 OUZm 1のヒ ト リコンビナント TNF—ひ （プロメガ社製） を加え、 37°C 5%C02インキュベーターで 6時間培養し、 TNF-αで刺激した血管 内皮細胞を調製した。
—方、 1 0%?〇3を含む1^??^ 1 - 1 640培地に懸濁して 1 X 1 Οβ細胞 /m 1に調整した HL— 60細胞に各濃度のシクロペンテノン、 GMまたはジプ 口ピオ二ルシク口ペンテノンを添加して 37°C 5%C02ィンキュベータ一で 3時間培養した。 培養終了後、 蛍光剤として 5 μ Mの 5 (- and- 6) - carboxyfluorescein diacete, succmimidyle ester (モレキュフ一プロ—フ社 製） を加え 3 7 °Cで 1 0分間反応させた後、 R PM I— 1 640培地で細胞を 2 回洗浄し、 1 0%FC Sを含む RPM 1 - 1 640培地に懸濁して 1 X 1 0β細 胞 1の蛍光標識した HL— 60細胞液を調整した。
TNF-αで刺激した血管内皮細胞に蛍光標識した H L— 60細胞を 1 00 μ
1ノウエルで重層し、 各濃度のシクロペンテノン、 GMまたはジプロピオニルシ クロペンテノンを添加して 37°C 5 %C02インキュベーターで 20分間イン キュベ一トし、 血管内皮細胞と HL— 60細胞の接着反応を行った。
接着反応後、 プレートを洗浄して非接着細胞を除去し、 1 %トリ トン X (ナカ O 00/10560
36
ライテスクネ； h ) を加えて接着細胞を壊し、 485 22nm (励起用） 、 53 0/25 nm (測定用） の各フィルターを用いて蛍光強度を測定した。
蛍光標識した 1 X 105個の細胞の蛍光強度を 100%とし、 血管内皮細胞に 接着した細胞の接着率を求めた。
結果を表 3に示す。 血管内皮細胞は T N F—ひ刺激により HL— 60との接着 率が増加した。 この接着率の増加はシクロペンテノン、 GM、 ジプロピオニルシ クロペンテノンにより、 10— 7〜10— 4Mの濃度において用量依存的に抑制され、 シクロペンテノン、 GM、 ジプロピオエルシクロペンテノンはがん転移抑制に必 要な、 がん細胞と血管内皮細胞の接着抑制作用を示した。 またこれらの化合物の 光学活性体及びそれらの塩も同様の活性を示した。
更に、 上記以外のシク口ペンテノン誘導体若しくはその光学活性体又はそれら の塩も同様の活性を示した。
O 00/10560
37
表 3 被検物質 濃度 （μΜ) 接着率 (%) 対照
非刺激 3. 6
TNF- c刺激 50. 9 シク口ペンテノン 0. 1 51. 7
1 46. 0
10 22. 2
100 1 7. 9
GM 0. 1 53. 9
1 48. 3
10 23， 9
100 1 6. 3 ジプロピオニル 0. 1 49. 2
シク口ペンテノン 1 35. 1
10 15. 3
100 15. 5
実施例 Ί
d dYマウス （雌性、 7週齢） は日本エスエルシー社より購入し、 1週間の予 備飼育の後、 実験に用いた。
マウスの腹腔内に 1 X 106細胞のエーリッヒがん細胞を接種し、 接種 1日後 に 1 OmgZk gのシクロペンテノン、 3 OmgZk gの GMまたは 1 OmgZ k gのジプロピオ二ルシク口ペンテノンを腹腔内投与した。 また対照には生理食 塩水を投与した。
がん細胞接種から 10日後にマウスより脾臓を摘出した。 脾臓は細かく粉砕し て 10%FCS (ハイクローン社製） を含む RPM I— 1640培地 （ギブコ社 O 00/10560
38
製） に懸濁して単細胞液を得た。 細胞液中の接着細胞をプラスチックプ L /一トに 接着させて除き、 得られた非接着細胞を脾臓リンパ球として以下用いた。
脾臓リンパ球は 1 0 % F C Sを含む R PM I— 1 6 4 0培地に懸濁して 2 X 1 0 6細胞 Zm 1に調整し、 1 0 0 μ 1ノウエルでマイクロタイタープレートに 播種した。
刺激細胞は次のように調製した。 R PM I— 1 6 4 0培地に懸濁して 2 X 1 0 6細胞/ m 1に調整したエーリッヒがん細胞にマイ トマイシン C (協和発酵社 製） を 5 0 g 1の濃度で添加し、 3 7 °Cで 3 0分間処理し、 2回洗浄後、 1 0 % F C Sを含む R PM 1 - 1 6 4 0培地に懸濁し、 2 X 1 0 θ細胞/ 1の 刺激細胞を調整した。
調製した刺激細胞 1 0 0 μ 1を、 1 0 0 // 1 ウエルで脾臓リンパ球を加えた プレートの各ゥエルに重層し、 5日間 3 7。C 5 % C 02インキュベータ一で培 養した。 培養終了 1日前に3 H—チミジン （第一化学薬品社製） 3 7 k B qを各 ゥエルに添加し、 パルスラベルを行い、 培養終了後、 各細胞をガラスフィルター に回収して放射活性を測定した。
結果を表 4に示す。 シクロペンテノン、 GM及びジプロピオニルシクロペンテ ノンおよび投与マウスより得られた各脾臓リンパ球は、 がん細胞刺激により増殖 が著明に促進され、 がん細胞に特異的に反応するリンパ球が誘導されていること が示唆された。 またこれらの化合物の光学活性体及びそれらの塩も同様の活性を 示した。
更に、 上記以外のシク口ペンテノン誘導体若しくはその光学活性体又はそれら の塩も同様の活性を示した。 O 00/10560
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表 4
Figure imgf000041_0001
実施例 8
d dYマウス （雌性、 7週齢） は日本エスエルシ一社より購入し、 1週間の予 備飼育の後、 実験に用いた。
マウスの腹腔內に 1 X 106個のエーリツヒがん細胞を接種し、 接種 1日後に 1 Omg/k gのシクロペンテノン、 3 OmgZk gの GMまたは 1 OmgZk gのジプロピオ二ルシク口ペンテノンを腹腔内投与した。 また対照は生理食塩水 を投与した。
がん細胞接種から 10日後にマウスから脾臓を摘出した。 脾臓は細かく粉碎し て 10%FCS (ハイクローン社） を含む RPM I— 1640培地に懸濁して単 細胞液を得た。 細胞液から接着細胞をプラスチックプレートに接着ざせて除き、 非接着細胞を NK細胞として用いた。
NK細胞は 10%FC Sを含む RPM 1 - 1640培地に懸濁して 6 X 108 細胞 Zmlに調整し、 100 μ I Zゥエルでマイクロタイタ一プレートに播種し た。
標的細胞の調製は次のように行った。 1 X 10β細胞の YAC— 1細胞 （大日 Λ ΛΛ„Λ«Λ PCT/JP99/04323 O 00/10560
40
本製薬社販売） に 3 7 0 0 k B qの5 1 C r (アマシャム社製） を加え 3 7 °Cで 1 時間培養して標識した。 標識した細胞は 2回洗浄後、 1 0 % F C Sを含む R PM 1— 1 6 4 0培地に懸濁して 2 X 1 0 5細胞 Zm 1に調整した。
調製した標的細胞 1 0 0 μ 1を、 Ν Κ細胞を加えたプレートの各ゥエルに重層 し、 5時間 3 7 °C 5 % C〇 インキュベーターで培養した。 培養後、 プレート を 1 5 0 0 r p m、 5分間遠心し、 上清 1 0 0 ^ 1をガンマ一カウンターチュー ブに回収して放射活个生 （実験値） をオートガンマ一カウンターで測定した。
標的細胞から自然放出される放射活性 （対照値） を測定するためには、 N K細 胞の代わりに反応系に培養液 1 0 0 μ 1を加え放射活性を測定した。
また、 反応系に含まれる総放射活性 （総放射活性値） を測定するためには、
1 %トリ トン X (ナカライテスク社製） を反応系に加えて5 ' C r標識 Y A C— 1 細胞を溶解させたときに上清に放出される放射活性を測定した。
したがって、 N K細胞による特異的な細胞傷害率 （％) は次の計算式によって 求めることができる
細胞傷害率 （％) = [ (実験値一対照値） Z (総放射活性値一対照値） ] X 1 0 0
結果を表 5に示す。 シクロペンテノン、 GM及びジプロピオニルシクロペンテ ノン投与マウスにおいて N K細胞の活性化が認められ、 これらの化合物の投与に より、 生体の免疫防御機構が高まり、 がん細胞に対する傷害活性が上昇した。 ま たこれらの化合物の光学活性体及びそれらの塩も同様の活性を示した。
更に、 上記以外のシク口ペンテノン誘導体若しくはその光学活性体又はそれら の塩も同様の活性を示した。 O 00/10560
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表 5
Figure imgf000043_0001
実施例 9
ルイスラット （雄性、 9週齢、 体重約 250 g) はセアツク吉富社 （株） より 購入した。
実験開始 18時間前から絶食したラットにォリーブ油 （ナカライテスク社製） に溶解して、 1又は 1 OmgZl Om 1 Zk gとなるように調製したジプロピオ ニルシクロペンテノン、 ジへキサノィルシクロペンテノン、 ジ一 2—へキセノィ ルシクロペンテノン、 ジイソプチリルシクロペンテノン又はジベンゾィルシクロ ペンテノンを各群 4匹のラッ卜に経口投与した。
被験物質投与 0. 5時間後に生理食塩水 （大塚製薬社製） に 1%の濃度で懸濁 した; I一力ラゲナン （和光純薬社製） 1 ΟΟμ 1をラットの右足足躕に注射し、 足浮腫を惹起した。 力ラゲナン注射 3時間後にラットの右足容積をラット足容積 測定装置 （ゥゴバジール ¾ ) で測定した。 なお測定値は力ラゲナン投与前に測 定した各ラットの右足容積から増加率を算定して表示した。
結果を図 5に示す。 すなわち図 5は投与したシクロペンテノン誘導体量と足浮 月重増加率の関係を示す図であり、 横軸は投与量 （mg/kg) 、 縦軸は増加率 (%) を示す。
ジプロピオ二ルシク口ペンテノンは 1 m g Z k gの投与量で足浮腫の抑制傾向 が認められ、 1 OmgZk gの投与により有意な抑制作用を示した。 ジへキサノ ィルシク口ペンテノン、 ジー 2—へキセノィルシク口ペンテノンはそれぞれ 1又 は 10 m gノ k gの投与量で有意な抑制作用を示した。 ジイソプチリルシクロべ ンテノン、 ジベンゾィルシクロペンテノンはそれぞれ lmgZk gの投与量で抑 制傾向を示し、 l OmgZkgの投与量で有意な抑制作用を示した。 またこれら のシク口ペンテノン誘導体の光学活性体及びそれらの塩も同様の活性を示した。 更に、 上記以外のシク口ペンテノン誘導体若しくはその光学活"生体又はそれら の塩も同様の活性を示した。
図 5において *は対照群に比べて p<0. 05、 **は p<0. 01の有意差が あることを示す。
実施例 10
C57BL/6マウス （雄、 7週齢、 体重約 25 g) は日本 SLCより購入し、 1週間の予備飼育後、 実験に用いた。
惹起抗原であるヒッジ赤血球 （清水実験材料） を生理食塩水 （大塚製薬） で 3 回洗った後、 生理食塩水で 1 X 109細胞ノ m 1に調整し、 200 μ 1をマウス の腹腔内に注射して抗原感作した。 感作から 5日後に同様に調整した抗原 40 μ 1を右足肉趾に注射して抗原誘発し、 足浮腫を惹起した。
ジプロピオ二ルシク口ペンテノンは生理食塩水に溶解して各濃度に調整し、 1 群 5匹のマウスに抗原感作日から 1日 1回、 3日間腹腔内または経口投与した。 抗原誘発から 2日後にマウスの右足容積を足浮腫測定装置 （ゥゴバジル社） で測 定して DTHの指標とした。 測定値は下記の式により抗原誘発前に測定したマウ スの右足容積から増加率を算定して表示した。
増加率 = (抗原誘発後右足容積一抗原誘発前右足容積） Ζ抗原誘発前右足容積 結果を図 6に示す。 図の縦軸は抗原誘発により増加した足容積の増加率を示す。 ジプロピロニルシクロペンテノンは 1 mgZk gの腹腔内投与により、 足浮腫の 抑制傾向を示し、 1 OmgZk gの腹腔内投与、 または 3 Omg/k gの経口投 与で有意な抑制を認めた。 また、 これらのシクロペンテノン誘導体の光学活性体 及びそれらの塩も同様の活性を示した。
更に、 上記以外のシク口ペンテノン誘導体若しくはその光学活性体又はそれら の塩も同様の活性を示した。 図 6において、 *は対照群に比べて p < 0. 05、 **は p < 0. 0 1の有意 差があることを示す。
実施例 1 1
( 1 ) d dYマウス （雄性、 7週齢： 日本エスエルシー社より購入） より脾臓 を摘出し、 細かく粉砕して 1 0%FC S (ハイクローンネ: t ) を含んだ RPM I - 1 640培地に懸濁して単細胞液を得た。 細胞浮遊液をプラスチックシャーレ に播種して炭酸ガス培養器で 3 7 °C、 2時間培養し、 接着性細胞をシャーレに接 着させて除き、 非接着性細胞を脾臓リンパ球として用いた。 細胞濃度を 2 X 1 0R細胞/ 1に調整し、 9 6ウェルマィクロタイタープレートに 2 00 μ 1 / ゥエルで播種し、 対照群以外の各ゥエルに、 各濃度のジプロピオニルシクロペン テノンを添加し、 さらにすベてのゥエルに 5 μ gの C ο η Α (ナカライテスク社 製） を添加し、 炭酸ガス培養器で 3 7°C、 1日間培養した。 培養後 1 μ C iの3 H—チミジンを各ゥエルに加えさらに 1日間培養して細胞への取り込み量を液体 シンチレーシヨンカウンターで測定した。
その結果を図 7に示す。 すなわち、 図 7はジプロピオニルシクロペンテノン濃 度と :'H—チミジン取り込み量の関係を示す図であり、 横軸はジプロピオニルシ クロペンテノン濃度 （ M) 、 縦軸は :iH—チミジン取り込み量 （C PM) を示 す。 白棒ダラフは刺激なしの場合の、 斜線棒グラフは C o n Aにより刺激した場 合の :'H—チミジン取り込み量を示す。 図 7から明かなように、 マイ トジェン刺 激マウスリンパ球の増殖に対しジプロピオニルシクロペンテノンは用量依存的な 抑制作用を示し、 1 0 //Mでほぼ完全に抑えた。 またこのシクロペンテノン誘導 体の光学活性体及びそれらの塩も同様の活性を示した。
更に、 上記以外のシク口ペンテノン誘導体若しくはその光学活性体又はそれら の塩も同様の活性を示した。
(2) BALBZcマウス （雄性、 6週齢： 日本エスエルシー社より購入） お よび C 5 7 B LZ6マウス （雄性、 6週齢： 日本エスエルシー社より購入） より 脾臓を摘出し、 実施例 1 1一 （ 1 ) の方法により脾臓リンパ球を得た。 各細胞浮 遊液の濃度を 2 X 1 0 fi細胞 1に調整し、 1 00 μ 1ずつを混合して 9 6ゥ エルマイクロタイタープレー卜に播種した。 対照群以外の各ゥエルに各濃度のジ プロピオ二ルシク口ペンテノンを添加し、 炭酸ガス培養器で 37°C、 4日間培養 した。 培養後 1 μ C iの3 H—チミジンを各ゥエルに加え、 さらに 1日間培養し て細胞への取り込み量を液体シンチレーシヨンカウンターで測定した。
その結果を図 8に示す。 すなわち、 図 8はジプロピオニルシクロペンテノン濃 度と3 H—チミジン取り込み量の関係を示す図であり、 横軸はジプロピオニルシ クロペンテノン濃度 （ M) 、 縦軸は3 H—チミジン取り込み量 （CPM) を示 す。 白棒グラフはいずれかの系統由来の細胞を単独で用いた場合の3 H—チミジ ン取り込み量を、 斜線棒グラフは両系統由来の細胞を混合した場合の3 H—チミ ジン取り込み量を示す。 図 8から明かなように、 ァロ抗原刺激により活性化され たリンパ球に対してジプロピオ二ルシク口ペンテノンは用量依存的な抑制作用を 示し、 1 μΜでほぼ完全に抑えた。 またこのシクロペンテノン誘導体の光学活性 体及びそれらの塩も同様の活性を示した。
更に、 上記以外のシク口ペンテノン誘導体若しくはその光学活性体又はそれら の塩も同様の活性を示した。
実施例 1 2
(1) 8週齢の雌性 CD F 1系マウス （日本エスエルシ一社より購入） を用い てエンドトキシンショックモデルを作製した。 マウスに蒸留水 （対照） 又は 10 mg/k gのジィソプロピオ二ルシク口ペンテノン若しくはジィソブチリルシク 口ペンテノンを皮下投与し、 その 30分後に LPS (リポポリサッカライド：シ グマ社） を腹腔内投与 マウス） した。 し？3投与1. 5時間後にマ ウスより採血し、 血清を分離し、 血清中腫瘍壊死因子 （TNF) — α量を市販の EL I SAキット （R&D社製） にて測定した。 なお各群 4匹のマウスを使用し た。
結果を表 6に示す。 O 00/10560
45
表 6
群 投与量 TNF量 （n g/m 1)
νπι g / g 平均 士 SE 対照 7. 5 3 0. 4 8 ジイソプロピオニル 10 4. 6 1 土 0. 5
シク口ペンテノン ジィソブチリル 10 3. 3 9 0. 3 2 *** シク口ペンテノン
蒸留水を投与した対照群に対し、 1 OmgZk gのジイソプロピオニルシクロ ペンテノン又はジィソブチリルシク口ペンテノンを投与した群で有意に TNF— ひ産生が抑制された。 表 6において、 **は対照群に比べて p<0. 01、 ***は p < 0. 001の有意差があることを示す。 またこれらのシクロペンテノン誘導 体の光学活性体及びそれらの塩も同様の活性を示した。
更に、 上記以外のシク口ペンテノン誘導体若しくはその光学活性体又はそれら の塩も同様の活性を示した。
(2) 8週齢の雌性 CDF 1系マウスを用い L PSを腹腔内投与 （20 μ gZ マウス） し、 エンドトキシンショックモデルを作製した。 ジプロピオニルシクロ ペンテノンあるいはジイソプチリルシクロペンテノンは、 LPS投与の 30分前 にそれぞれ 30， 10 Omg/k gの用量で経口投与した。 乙？3投与1. 5時 間後にマウスから採血、 血清を分離し、 血清中 TNF— αを EL I SAキットに て測定した。 なお 1群 4匹のマウスを用いた。
結果を表 7に示す。 すなわち、 コントロール群に対して、 ジプロピオ二ルシク 口ペンテノンあるいはジィソブチリルシクロペンテノンは、 TNF産生を経口投 与で用量依存性に抑制した。 またこれらのシク口ペンテノン誘導体の光学活性体 及びそれらの塩も同様の活性を示した。
更に、 上記以外のシクロペンテノン誘導体若しくはその光学活性体又はそれら の塩も同様の活性を示した。 46
表 7
群 投与量 TNF (n g/m 1 )
g X k g ) 平均 S E コント口一ル 5. 72 土 1. 02 ジプロピオ二ノレ 30 2. 95 土 0. 14 * シク口ペンテノン 100 1， 26 土 0. 15 ** ジィソブチリル 30 3. 92 0. 13
シク口ペンテノン 100 2. 48 0. 43 *
*, ** : p<0. 05, 0. 01 v s コントローノレ
実施例 1 3
(1) マウス白血病 P— 388 (1. 1 X 10B細胞/マウス） を 7週齢の雌 性 DBAZ 2マウスに腹腔内注射した。 その直後、 ジプロピオニルシクロペンテ ノンを l Omg/k gの用量で一回腹腔内注射した。 一方対照群には生理的食塩 水を同様に腹腔内注射した。 それぞれ 8匹ずつの 2群において、 マウスの生存数、 平均生存日数、 延命率を算定した。
その結果、 対照群では平均生存日数が 10. 1日であったのに対し、 ジプロピ ォニルシクロペンテノン投与群では 1 3. 9日で、 その延命率は 137. 0%を 示し、 有意な延命効果が認められた。
同様に、 Me t h A腫瘍細胞： BALBZcマウスの系を用いて検討した。 そ の結果、 対照群の平均生存日数は 1 3. 4日、 ジプロピオニルシクロペンテノン 投与群では 16. 9日であった。 延命率は 126. 2%で、 顕著な延命効果を示 した。
また、 このシク口ペンテノン誘導体の光学活性体及びそれらの塩も同様の活性 示した。
更に、 上記以外のシク口ペンテノン誘導体若しくはその光学活性体又はそれら の塩も同様の活性を示した。
(2) マウス固形がん Me t h A (2 X 106 c e 1 1 s/マウス） を 8週齢 O 00/10560
47
の雌性 B A LBZcマウスの背部皮下に注射した。 その後、 引続いて同じ箇所に 5日間連続してジプロピオ二ルシク口ペンテノンを皮下注射した。 また対照群に は生理的食塩水を同様に皮下注射した。 なお各群 8匹のマウスを使用した。
2週間後にマウス背部に形成されたがん組織を摘出して、 その重量を測定した。 その結果を表 8に示す。 すなわち対照群では平均がん重量は 0. 61 gであつ たのに対し、 ジプロピオ二ルシク口ペンテノン投与群では 0. 05 gで抑制率は 92. 3%であった。 また 8匹中 5匹はがん組織の形成を全く示さなかった。 ま たこのシク口ペンテノン誘導体の光学活性体及びそれらの塩も同様の活性を示し た。
更に、 上記以外のシク口ペンテノン誘導体若しくはその光学活性体又はそれら の塩も同様の活性を示した。
表 8
Figure imgf000049_0001
(3) エーリツヒがん （EAC) 、 Me t h Aの 2種を用い、 各種腹水型が んに対するジプロピオ二ルシク口ペンテノンおよびジィソプチリルシク口ペンテ ノンの制がん作用を、 レ、くつかの投与量で腹腔内投与あるいは経口投与において 検討した。 腹腔内移植細胞数および宿主動物を表 9に示した。
表 9
がん細胞 マウス 移植細胞数
EAC d d Y (雌性、 5週齢） 1. 2 X 106
Me t h A BALA/c (雌性、 7週齢） 2. 0 X 10β O 00/10560
48
ジプロピオ二ルシク口ペンテノンあるいはジィソブチリルシク口ペンテノンは それぞれ、 がん細胞移植の翌日より 5日間連続して腹腔内あるいは経口投与した。 コントロール群には同様に注射用蒸留水を投与した。 各群 8匹を用い平均生存日 数、 延命率および 3 0日間生存数を算定した。
結果を表 1 0〜1 3に示した。 表 1 0は E A C移植マウスに各被検物質を腹腔 内投与したときの延命効果を示し、 表 1 1は M e t h A移植マウスに各被検物 質を腹腔内投与したときの延命効果を示し、 表 1 2は E A C移植マウスに各被検 物質を経口投与したときの延命効果を示し、 表 1 3は M e t h A移植マウスに 被検物を経口投与したときの延命効果を示す。
すなわち、 E A C移植マウスにおいてジプロピオニルシクロペンテノンおよび ジィソブチリルシクロペンテノンは優れた延命効果を示し、 特に腹腔內投与にお いて、 いずれの群も 3 0日間生存例を出現させた。 さらにジプロピオ二ルシク口 ペンテノンは経口投与においても強い効果を示した。
又、 M e t h A移植マウスにおいては各治療群は腹腔内投与で延命効果を示 し、 更にジプロピオニルシクロペンテノン投与群では経口投与において 3 0日間 生存例を示した。
またこれらのシク口ペンテノン誘導体の光学活性体及びそれらの塩も同様の活 性を示した。
更に、 上記以外のシク口ペンテノン誘導体若しくはその光学活性体又はそれら の塩も同様の活性を示した。
表 1 0
群 投与量 平均生存日数 延命率 3 0曰
(m g / k g ) (曰） (%) 生存例数 コン卜口ール 1 2 . 5 1 0 0 0 ジプロピオニル 1 0 2 8 . 1 > 2 2 5 6
シク口ペンテノン ジィソブチル 3 0 2 5 . 3 > 2 0 2 3
シク口ペンテノン 1 0 1 7 . 0 1 3 6 0 O 00/10560
49
表 1 1
Figure imgf000051_0001
実施例 14
注射剤
(1) 生理食塩液 ジィソブチリルシク口ペンテノン、 ジプロプォニルシク口 O 00/10560
50
ペンテノン又はジメ トキシシクロペンテノンを 1%濃度で加え、 注射剤を作製し た。
(2) 生理食塩水にジメチルフマリルシクロペンテノン、 又はジメチルマレイ ルシクロペンテノン及びグリシルリチン酸をそれぞれ 0. 5%及び 0. 1%濃度 で加え、 注射剤を作製した。
実施例 1 5
錠剤
( 1 ) ジィソプチリルシク口ペンテノン又はジプロプォニルシク口ペンテノン の 10 Omgと微結晶性セルロースの適量とを含有する錠剤を調製し、 糖衣を施 し、 各錠剤を作製した。
(2) ジメチルフマリルシクロペンテノンの 0. lmg、 グリシルリチン酸ジ カリウム 1 Omg及び微結晶セルロースの適量を含有する錠剤を調製し、 糖衣を 施し、 錠剤を作製した。
以上記載したごとく、 本発明により免疫調節作用、 抗炎症作用、 β重瘍壊死因子 産生抑制作用、 抗真菌作用等の生理活性を有するシク口ペンテノンの誘導体若し くはその光学活性体又はそれらの塩が提供される。 これらの化合物を有効成分と する医薬は、 免疫調節を要する疾患、 炎症抑制を要する疾患、 腫瘍壊死因子産生 抑制を要する疾患、 病原微生物の増殖抑制を要する疾患等の治療剤、 予防剤とし て生体の恒常性の維持に有用な医薬品である。

Claims

O 00/10560 51 請 求 の 範 囲
1 . 式 〔I〕
Figure imgf000053_0001
〔I〕
(式中、 R ,及び！^は同一又は異なってもよく、 水素、 脂肪族基、 芳香族基又は 芳香脂肪族基を意味する。 ） で表わされるシクロペンテノン誘導体若しくは光学 活性体又はそれらの塩から選択される少なくとも 1つの化合物を有効成分として 含有することを特徴とする免疫調節を必要とする疾患、 炎症抑制を必要とする疾 患、 S重瘍壊死因子産生抑制を必要とする疾患、 真菌の抑制を要する疾患、 細胞接 着抑制を要する疾患、 又は熱ショックタンパクの誘導を要する疾患の治療剤又は 予防剤。
2 . 及び R 2が同一又は異なって、 水素、 C 1〜3 0の直鎖又は分枝アル キル基、 C 2〜 3 0の直鎖又は分枝アルケニル基、 C 6〜l 0のァリール基又は
C 1〜3 0アルキル C 6〜1 0ァリ一ル基であり、 これらは所望により、 C l〜 3 0アルキル基、 C l〜4アルコキシ基、 C 2〜5アルコキシカルボニル基、 ァ ミノ基、 ニトロ基、 ォキソ基、 水酸基、 チオール基、 硫酸基及びハロゲンから選 択される 1つ以上の置換基で置換されていてもよい請求項 1記載の治療剤又は予 防剤。
3 . 式 〔 I〕 のシクロペンテノン誘導体が、 ジァセチルシクロペンテノン、 ジ プロピオニルシクロペンテノン、 ジブチリルシクロペンテノン、 ジイソブチリノレ シクロペンテノン、 ジバレリルシクロペンテノン、 ジへキサノィルシクロペンテ ノン、 ジォクタノィルシクロペンテノン、 ジデカノィルシクロペンテノン、 ジミ リストィルシクロペンテノン、 ジメ トキシァセチルシクロペンテノン、 ジメチル O 00/10560
52
フマリノレシクロペンテノン、 ジメチ マレイ^^シクロペンテノン、 ジ— 2—へキ セノイ^^シク口ペンテノン、 ジー 3—ォクテノイ^/シク口ペンテノン又はジベン ゾィルシク口ペンテノンである請求項 1記載の治療剤又は予防剤。
4 . 免疫調節剤、 抗炎症剤、 腫瘍壊死因子産生抑制剤、 抗真菌剤、 細胞接着抑 制剤、 又は熱ショックタンパク誘導剤である請求項 1記載の治療剤又は予防剤。
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