TWI246919B - Remedies or preventives containing cyclopentenone compounds as the active ingredient - Google Patents

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1246919 A7 ____ B7 Z發明説明（1 ) ^ 技術領域 本發明為有關以環戊晞酮類酯化物為有效成份之醫藥。 背景技術 過去臨床上療法所用之藥物有如烷化劑、代謝抑制劑、藥 物生物鹼等制癌劑、抗生物質、免疫促進劑、免疫調節劑等 形形色色，但這些藥物療法仍難謂完成。 其中天然物由來之前列腺素中，於5員環具有α，0 _不飽 和羰基之前列腺素Α和J類抑制DNA合成而可當作安全性高 之制癌劑之報告，並合成彼等之各種衍生物（參照特開： 62-96438 號公報）。 發明之目的 本發明之主要目的為開發具有種種生理作用之環戊晞酮衍 生物，並提供以該化合物為有效成份之醫藥。 以下參知、圖式說明本發明之上述目的和其他目的及本發 明之優點。 圖面之簡單說明 圖1為二異丁醯環戊晞酮之光譜。 圖2為二甲氧乙酿環戊婦酮之lj^NMR光譜。 圖3為二甲冨馬醯環戊晞酮之1h_nmr光譜。 圖4為二甲馬來醯基環戊烯酮之lH-NMR光譜。 圖5表不環戊晞酮衍生物投與量和足部浮腫增加率之關係 圖。 圖6表示環戊婦酮衍生物投與量和遲發性過敏症反應增加 率之關係圖。 圖7表示二丙醯環戊烯酮濃度和3H-胸苷收取量之關係

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圖。 圖8表不二丙醯環戊烯酮濃度和3h_胸菩收取量之關係 圖。 *、 發明之概要 •文本I明人為達成上述目的而致力檢討之結果，發現如下 式⑴環戊埽顯I衍生物： 〇

〇

II 〇-C-R1 "0 - C一R〇 II 1 ， 〇 〔I〕 、芳族基或 下簡稱環戊 (式中RAR2相同或相異，各為A、脂肪族基 芳脂肪族基） 係由如下式（Π)之4,5-二羥基環戊婦“ _酮（以 婦酮;） 〇

和幾酸及/或其反應性衍生物反應而生成，此環戊婦嗣衍生 物了有強力肩節免疫之作用、抗炎症作用、抑制腫瘤壞死因 子產生《作用、抗真菌之作用、抑制細胞接著之作用等生理 活性而完成本發明。 故本發明提供一種須調節免疫之疾病、須抑制炎症之疾

1246919 A7 ______ _B7_ 五、發明説明（3 ) 病、須抑制腫瘤壞死因子產生之疾病、須抑制真菌之疾病、 /員抑制細胞接著之疾病或須謗導熱休克蛋白之疾病之治療劑 或預防劑，其係含有選自如上式⑴環戊埽酮化合物或其光 學活性體或彼等之鹽之至少一種化合物為有效成份。 發明之詳細說明 本發明所用之環戊埽酮包括4和5位之羥基之立體組態為 順和反之異構物。本發明中可用順體、反體或順體和反體之 混合物。亦可使用彼等之光學活性體。 順體環戊晞g同可由化學合成法取得[Helvetica Chimiea Acta，第55卷、第2838〜2844頁（1972)]。反體環戊婦酮可由 化學合成法取得[Carbohydrate Res·，第247卷、第217-222頁 (1993)]。又可由如葡萄糖酸酸等糖磁酸，如半乳糖趁酸等 糖醛酸衍生物加熱處理而得（w〇 98/13328號）。本發明亦 可使用含有環戊晞酮之彼等加熱處理物、其部分純化物和 純化物。 例如糖醛酸採用D-葡萄糖醛酸，將此1%溶液於12itM 熱處理4小時，則生成環戊晞酮。將該加熱處理物中之環 戊缔酮用溶劑萃取，並濃縮該萃取物後，以矽膠管柱層析 分離該濃縮物，將溶出之環戊埽酮部分濃縮，使用氯仿自 該濃縮物萃取環戊婦酮，藉由進行萃取濃縮物之順相管柱 層析’單離加熱處理物中之環戊埽酮。 將此單離之環戊埽酮光學分割，則可得光學活性體之（_ )·4,5-二羥基-2-環戊晞-1·酮和（+)_4,5_二羥基-2•環戊缔 酮。當然，合成方法所得之環戊埽酮也可進行光學分割。 藉由使環戊晞酮及/或其光學活性體與具有氫、脂肪族 -6 - 1246919 A7

族，芳香脂肪族基之羧酸及/或其反應性衍生物同 学活性體 η 7ϋ

本發明所用之式⑴環戊缔酮忑生物之R#R〔j具有氫、 反應，可得本發明之下式⑴環戊缔酮衍生 脂肪族基、芳香族基或芳香脂肪族基之幾酸或其反應性衍 生物如下。 具有氫之羧酸可用甲酸。 具有脂肪族基之羧酸可用具有烷基之羧酸、具有烯基、 幾酸。 具有烷基之羧酸可用具有直或分枝鏈烷基之羧酸，烷基 鏈長可依所生成環戊晞酮衍生物之生物活性、溶解性等而 適當選擇’通常宜C1-C30。具有直鏈烷基之羧酸有如乙 酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、正辛酸、壬酸、正 癸酸、十一酸、十二酸、十三酸、十四酸、十五酸、十二 酸、十七酸、十八酸、十九酸、二十酸、二十二酸、-十 四酸、二十六酸、三十酸等。 具有分枝鏈烷基之羧酸有如異丁酸、異戊酸、2_甲美丁 酸、特戊酸、4 -甲基戊酸、1，2-二甲基戊酸等。 具有晞基之羧酸可用具有直鏈或分枝鏈晞基之羧酸，少希 基鏈長、不飽和度、不飽和鍵之位置可依所生成環戊稀_酉门 衍生物之生物活性、溶解性等而適當選擇，通常宜 1246919

30 ° 具有直鏈晞基之 酸、異巴豆酸、烯 辛晞酸、4 -癸埽酸 酸、半油酸、油酸、 酸、二十竣四晞酸、 I酸有如丙烯酸、乙埽基乙酸、巴豆 丙基乙酸、2 -己缔酸、3 -己婦酸、3- 、10-十一碳婦酸、軟脂烯酸、岩芹 亞油酸、α -亞麻酸、τ -亞麻酸、桐 花生四烯酸、二十碳五晞酸、巴西烯 I力子酸一十一故六烯酸、西門木酸、2卜三十碳烯 酸等。

具有分枝鏈烯基之羧酸有如甲基丙埽酸、剔各酸、當歸 酸、α -乙基巴豆酸等。 具有取代基<脂肪族基之羧酸可用具有以cl_4低烷基為 取代基之娱:基之幾酸，例如甲氧乙酸。又可用具有以c2_5 低烷氧羰基為取代之烯基之羧酸，例如甲基馬來酸。 具有芳香族基之羧酸可用例如苯甲酸、甲苯甲酸、氯苯 I酸、溴苯甲酸、硝苯甲酸、眩酸、異酞酸、對酞酸;柳 酸、乙柳故、乙酿柳醒柳酸、胺基柳酸、對經苯甲酸、 胺苯甲酸、甲氧苯甲酸、乙醯胺苯甲酸、香草酸、苔色 酸、莕甲酸、辛可部酸、奎寧酸、犬尿晞酸等，可依所生 成環戊婦酮衍生物之生物活性、溶解性等而適當選擇具有 所用芳香族基之羧酸。 ^ 具有芳香脂肪族基之羧酸可用例如苯乙酸、苯丙酸、苯 乳酸、苯丙酮酸、桂皮酸、α -苯丙婦酸、審乙酸等 了 所生成依環戊晞酮衍生物之生物活性、溶解性等而 & 备選 擇具有所用芳香脂肪族基之羧酸。 裝

k

1246919 A7 __ —_ B7 五、發明説明（6 ) 脂肪族基、芳香族基或芳香脂肪族基可有取代基，如胺 基、硝基、氧基、羥基、硫醇基、硫酸基等官能基或鹵素 (氟、氯、溴、琪）。 如此式（I)中心和化2相同或相異，各為氫、cl-3〇直鏈或 分枝鏈烷基、C2-30直鏈或分枝鏈婦基、C6_1〇芳基或ci_ 30烷基C6-10芳基，這些必要時可有選自Cl_3〇烷基、ci-4 烷氧基、C2-5烷氧羰基、胺基、硝基、氧基、羥基、硫醇 基、硫酸基等官能基或鹵素（氟、氯、溴、碘 少一 取代基。 &故之反應性衍生物有如醯基自、酸奸、酸酿、鹽等， 可依目的作成所用羧酸之反應性衍生物。 iI或其反應性衍生物和環戊婦_之反應可施行為使環 戊烯酮衍生物之心和!^相同或相異。即心和化相異之羧酸 同時或順序和環戊晞酮反應。此時藉由保護環戊婦酮之單 方輕基，則可有效作成心和心相異之環戊埽酮衍生物。 環戊晞酮或其光學活性體和羧酸反應所得環戊烯酮衍生 物或其光學活性體具有強力調節免疫之作用、抗炎症作 用、抑制腫瘤壞死因子產生之作用、抗真菌之作用、抑制 細胞接著等，以此活性為指標將環戊晞酮衍生物或其光學 活性體從反應液純化單離。此純化單離手段可用化學性方 法、物理性方法等周知之純化手段，可將凝膠過遽法、藉 由分子量區分摩之區分法、溶劑萃取法、分留法、離子交 換樹脂等各種層析法等周知之純化方法加以組合，以純化 單離反應生成物中環戊烯酮衍生物或其光學活性體。 -9 - 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 7 1246919 五、發明説明（ 例如藉由知％戊埽嗣或其光學活性體，4 _二甲胺基胺基 比疋和夢久酸/合於—氯甲烷，於冰冷下添加Ν，Ν·二環己碳化 一亞胺而反應，可生成本發明所用環戊婦酮衍生物。將此 生成物於石夕膠Υ柱層析純化，單離目的之環戊婦嗣衍生 物。 又可將環戊埽酮或其光學活性體和乙酸酐於無水吡啶中 反應，則可將二乙醯環戊埽酮衍生物或其光學活性體從反 應液純化單離。 本發明所用冑戊埽嗣衍生物纟光學活性體之分離可用消 旋混合物之機械分割、優先結晶法、成非對映體鹽或晶蘢 化合物之結晶化來分割、由酶、微生物之動力學分割、由 層析之分割等。 由層析之分剖可用氣體層析、液體層析、薄層層析等， 要使用各適用之對掌固定相即可。 依液體層析之光學分割可用對掌之固定相之方法、對掌 之溶離液之方法、作為非對映體之分離等。 手 "對手固定相可用醯胺系固定相、尿素系固定相、配基交 換型固定相、多醣-多醣衍生物固定相、蛋白質固定^ ^ 聚甲基丙婦酸酯固定相、聚甲基丙婦醯胺固定相等。目 溶離液可用己烷系、醇系、、水(緩衝液）系等，於上 固疋相之組合中適當使用。 一 本發明所用環環戊婦酮衍生物或其光學活性蛛騎 醫藥容許鹽，可用周知方法變換。 如 本發明所用環戊婦酮衍生物之代表例有 ― J 7 一乙醯核戊埽 -10- 本紙張尺度適用t S S家標準(CNS) 44規格㈣㈣7公羡） 1246919

AT ------ ...____B7 五、發明説明（。 ) '~ -- 8 ’ 酮一丙醯糸戊烯酮、二丁醯環戊晞酮、二異丁醯環戍烯 酮、一戊醯環戊烯酮、二己醯環戊烯酮、二辛醯環戊烯 酮、、一癸醯環戊烯酮、雙十四醯環戊烯酮、二甲氧乙醯環 戊烯酮一甲基冨馬醯環戊烯酮、二甲基馬來醯環戊婦 酮、二-2-己烯醯環戊烯酮、二辛晞醯環戊晞酮、二苯 甲醯環戊烯酮等。 本發明所用環戊烯酮衍生物或其光學活性體或彼等之鹽 具有凋節免疫之作用，例如抑制淋巴球幼化反應作用、抑 制混合淋巴球反應作用、天然殺手細胞活化作用、癌細胞 專性淋巴球活化作用等，抗炎症作用，例如抑制鹿角菜 膠浮腫作用、抑制遲發性過敏症反應作用等，抑制腫瘤壞 夕匕因子產生之作用，抑制拓樸異構酶作用，謗導熱休克蛋 白I作用，抑制細胞接著之作用，抗真菌作用等，而可當 作眉肩節免疫之疾病、須抑制炎症之疾病、須抑制腫瘤壞 夕匕因子產生之疾病、須抑制拓樸異構酶之疾病，須謗導熱 休克蛋白之疾病，須抑制細胞接著之疾病或須抑制真菌之 疾病等之治療劑或預防劑，可以選自環戊烯酮化合物或其 光學活性體或彼等之鹽之至少一種化合物為有效成份製造 調節免疫劑、抗炎症劑、腫瘤壞死因子產生抑制劑、拓樸 異構酶抑制劑，熱休克蛋白謗導劑，抗真菌劑，細胞接著 抑制劑。 腫瘤壞死因子雖然當作誘導腫瘤部位出血性壞死之因子 發現，但現在認為廣汎關係以炎症為基本之生體防禦免 疫、免疫機構之細胞激動素。此腫瘤壞死因子之產生調節 -11 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1246919 A7 B7 9 五、發明説明（ 機構之破錠對宿主帶來種種不適。腫瘤壞死因子之過度或 操调節之產生關連包括慢性關節風濕、風濕性脊髓炎、變 形性關節症、痛風性關節炎、敗血症、敗血性休克、内毒 素休克、革蘭陰性菌敗血症、毒性休克症候群、腦性癔 疾、慢性肺炎、移植片對宿主反應、同種移植片排斥反 應由如〃,u行性感冒等感染之發熱和肌肉痛、對感染或惡 性腫瘤足惡病質、對人類後天性免疫不全症候群（aids) < 一次性足惡病質、愛滋病、愛滋病關連症候群、傷痕形 成、潰瘍性大腸炎、多發性硬化症、自體免疫糖尿病和全 身、’’X斑f生狼瘡等自體免疫疾病（分子醫藥，第卷，第 1010〜1020、1182〜1189頁，1996)。本發明之腫瘤壞死因子 產生抑制劑可用於治療、預防由腫瘤壞死因子所媒介或惡 化之病狀，例如以腫瘤壞死因子為病因之胰島素非依存^ 糖尿病（自然，第389卷，第610_614頁，1997)。 〜本I月ί疋供以選自；衣戊婦g同化合物或其光學活性體或彼 等之二之土y種化合物為有效成份之腫瘤壞死因子產生 (凋即万去。本發明又提供含有選自環戊缔酮化合物或並 光學活性體或彼等之鹽之至少一種化合物而用於改善由腫 《壞叱因子媒介或惡化之疾病之病狀之食品或飲料，或疾 病預防用食品或飲料。 環y希酮化合物或其光學活性體或彼等之鹽具有如抑制 :巴：幼化反應作用、抑制混合淋巴球反應作用等調節免 選自這些之至少一種化合物為有效成份之免 又δ周即劑可為這些免“、免㈣子之異常引起之疾病和 本紙張 -12 尺度適用T _家標準(CNS) A4規格(21GX 297公董)__ 1246919 五、發明説明（ IU ' 須賦活免疫之疾病之治療劑或預防劑。 不即^林巴球幼化反應作用係使細胞分裂劑結合淋巴球 表面之受體，活化淋巴球而促進其分裂增殖之反應。混合 淋巴球反應係混合培養得自同種異系之動物之淋巴球，而 謗導由於王要組織適合抗原之不一致之淋巴球活化，促進 淋巴球之分裂增殖之反應。上述免疫調節劑抑制這些反 應，可用於治療或預防淋巴球異常亢進引起之自身免疫性 疾病，例如慢性腎炎、慢性大腸炎、〗型糖尿病、慢性關 節風濕等慢性疾病，又可用於抑制移植片排斥反應。 環戊缔酮化合物或其光學活性體或彼等之鹽具有鹿角草 膠足浮腫之抑制作用，以選自這些之至少_種化合物為有 效成份之抗炎症劑可為須抑制炎症之疾病之治療劑或預防 劑。 鹿角草膠足浮腫模式可將發炎劑鹿角草膠皮下注射於足 摭來謗導巨噬細胞、嗜中性球等之炎症細胞，由這些細胞 產生之炎症性因子而冗進血管透過性，引起浮腫之反應。 t述抗炎，之抑料腫作用可料治療或預防須抑；血 管透過性九進之疾病’例如慢性關節風濕。 環戊婦酮衍生物或其光學活性體或彼等之鹽具有抑制遲 發型過敏症之作用’以選自這些之至少一種化合物為有效 成份之抗炎症劑可為須抑制感染症引起之遲發型過敏症反 應之疾病之治療或預防劑。 遲發型過敏症反應為依存於由活化淋巴球、單核球、巨 噬細胞等之細胞性免疫之炎症反應。由浸潤於炎症部位之 -13- 太紙係尺淹福用Φ國菌家標準(CNS) A4規格y ocw &妓、 1246919 A7 B7

彼等細胞產生之細胞激素而引起血管透過性亢進、浮腫、 肉芽腫、纖維化、壞死、重篤之障害。由遲發型過敏症反 應之過敏性皮膚炎占接觸性皮膚炎之多數，且為以細菌、 病毒或藥物為抗原之過敏症之原因。以羊紅血球為抗原之 小白鼠之模式常用於遲發型過敏症反應之試驗，於本模式 具有效性之化合物則可用於治療或預防上述過敏性疾病。 環戊婦酮化合物或其光學活性體或彼等之鹽在正常細胞 中僅於分裂期暫時表現，但若癌化則全細胞周期皆呈高表 現，因而顯示對於拓樸異構酶贝專一地抑制活性，以選自 这些（至少一種化合物為有效成份之拓樸異構酶抑制劑可 當作制癌劑使用。又以選自這些之至少一種化合物為有效 成份使用之拓樸異構酶抑制方法可用於生化學研究和篩選 制癌劑。 環戊晞酮衍生物或其光學活性體或彼等之鹽具有抑制細 胞接著之活性，而可提供含有選自這些之至少一種化合物 為有效成份之細胞接著抑制劑。本發明之細胞接著抑制劑 可當作須抑制細胞接著之疾病之治療劑或預防劑。 例如癌轉移為於原病灶增殖之癌細胞往血管内游離，移 動至轉移部位，浸潤於組織内而成立。其中從血管内移動 至轉移部位時，須癌細胞和、血管内皮細胞之接著。參予癌 轉私之接著分子已知有如血管内皮細胞側之〗CAMq、 VCAM-1、ELAM-1等，分別對應之癌細胞側之配基已鑑定 為LFA-1、VLA-4、唾液醯路易士 χ。這些接著分子常表現 於白血病細胞中，一般認為其係參予白血病細胞之血管外 _____ ____ 14 · 本紙張尺度適JU t g g家料(CNS) A4^(21G X 297^^ 1246919 A7

= 抑制仲介這些接著分 由環戊晞酮、含有環戊缔酮和印基之化合 PCT7JP98/00815說明書記載之化合物生成 益；i K ， 刀別王抑制細胞接 …性，而提供以選自這些之至少—種化 份 < 細胞接著抑制劑。 又风 、本發明提供之細胞接著抑制劑可用於抑制劑細胞接著之 万法’該方法可用於有關細胞接著之生化學研究和筛選細 胞接著抑制劑和細胞接著活性劑。 環戊婦酮衍生物或其光學活性體或彼等之鹽具有天然殺 手（NK)細胞活化作用，而可提供以選自這些之至少一種 化合物為有效成份之NK細胞活化劑。本發明之Νκ細胞活 化劑可當作須活化N K細胞之疾病之治療劑或預防劑。 亦即’ NK細胞係可辨識細菌、病毒感染細胞和癌細 胞’藉由細胞膜傷害作用而將此排除之細胞。故活化Ν κ 細胞可提咼活體之免疫防禦機構，本發明Ν κ細胞活化劑 可當作細胞、病毒疾病和癌之治療劑或預防劑。 由環戊烯酮、含有環戊稀酮和s Η基之化合物生成之 PCT/JP98/00815說明書記載之化合物也分別呈ΝΚ細胞活化 作用，而提供以選自這些之至少一種化合物為有效成份之 Ν Κ細胞活化劑。 本發明提供之Ν Κ細胞活化劑可用於Ν Κ細胞活化之方 法，該方法可用於有關免疫防禦機構之生化學研究和篩選 免疫防禦劑。 -15- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210X297公釐) 1246919 A7 B7 五、發明説明（13 ) 環戊晞酮衍生物或其光學活性體或彼等之鹽具有抗真菌 作用，而以選自這些之至少一種化合物為有效成份，配合 周知醫藥用載體來製劑化，即可製造抗真菌劑。 過去真菌感染症之治療劑除如兩性黴素B (amphotericin B)、氟胞密淀（flucytosine)、米可那嗤、氟可那峻等外，尚 有多數種類，但於效力、毒性和耐性菌仍有問題。尤其對 近年漸增之全身感染有效而低毒性之藥劑很少。本發明之 抗真菌劑毒性低，可為新穎抗真菌劑。 環戊烯酮化合物或其光學活性體或彼等之鹽具有熱休克 蛋白謗導作用，而可製造以選自這些之至少一種化合物為 有效成份之熱休克蛋白謗導劑，可依須謗導熱休克蛋白之 疾病之方法投與。 亦即，環戊晞酮衍生物或其光學活性體或彼等之鹽具有 70kd(HSP70)等熱休克蛋白謗導活性，對肝炎病毒、愛滋 病病毒、流性性感冒病毒、水疱性口内炎病毒、疱疹病毒 等RNA病毒、DNA病毒之抗病毒作用。又熱休克蛋白謗導 劑參予癌免疫，這些化合物對癌免疫有效。又具有抗炎症 等活體防禦作用。攝取本發明之化合物或其光學活性體或 彼等之鹽可治療或預防由流行性感冒病毒等病毒性疾病。 此外，熱休克蛋白為細胞和個體急激受比平常溫度高 5〜1 0 °C之溫度變化時謗導合成之蛋白之總稱，從原核生 物至高等真核生物廣泛分布。真核生物之熱休克蛋白已知 有HSP90、HSP70、汎有素、HSP26等。其中HSP70為分子 導蛋白Charperon之一種，結合於未完成抱持或不完全抱持 -16- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1246919 A7 B7 五、發明説明（14 ) 之蛋白以協助其立體構造之形成。熱休克蛋白之胺基酸序 列於進化過程保存良好，HSP70和大腸桿菌之DnaK蛋白相 同。於人類有約1 0個HSP70基因存在，但其有些有構造表 現，有些由種種刺激謗導。熱休克蛋白之合成除了熱休克 之外，也由種種化學物質、氧化壓迫等細胞障礙而謗導。 C· Amici等於病毒學雜誌第6 8卷第6890〜6899頁（1994)報 告，若於具有α，/3 -不飽和羰基之前列腺素Ai之存在下培 養感染仙台病毒之動物細胞，則可謗導HSP70和HSP90之 合成，謗導合成HSP70期間，病毒蛋白之合成被抑制。又 C. Amici等於生物化學雜誌第271卷第32192〜32196頁（1996) 報告，2 -環戊婦-1-酮和前列腺素A 1同樣可謗導HSP70之 合成，並抑制水癌性口内炎病毒蛋白之合成。 由例如二異丁基環戊烯酮等環戊烯酮衍生物之HSP70誘 導能力見於1.25 //M，於2.5 /zM成最大，此和2 -環戊婦-1-酮謗導HSP70須數百//M相較，可謂極高之謗導能力。 因環戊烯酮衍生物或其光學活性體或彼等之鹽具有如此 高之熱休克蛋白謗導活性，故對DNA病毒、RNA病毒、反 轉錄病毒和類病毒具有抗病毒作用。這些病毒和類病毒有 如上述病毒和類病毒。 本發明之治療劑或預防劑、免疫調節劑之製造一般以選 自環戊烯酮衍生物或其光學活性體或彼等之鹽之化合物為 有效成份，配合醫藥容許之液狀或固體狀載體，必要時添 加溶劑、分散劑、乳化劑、緩衝劑、安定劑、賦形劑、結 合劑、崩壞劑、滑劑等而作成錠劑、顆粒劑、散劑、粉末 -17- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1246919 A7

胗襄劑寺固形劑 孔硬等液 如 ，队，队剛、懸〉手液劑、费 劑。又可作成使用前添加適當載體成液狀之乾燥f 醫藥用載體可依上述投與形態和劑故：為 劑時，可用澱粉、乳粹、 举右為口服 玉米澱粉、無機鹽等。調製口服劑時，可再配= 崩壞劑、界面活性劑、潤# _ 口、、。σ劑、 著色劑、香料等。性促進劑、墙味劑、 右局非口服劑，可依常法將本發明 t之選自環戊埽_衍生物或其光學活性體或彼等之 &物落解或懸浮於稀釋劑，如注射用蒸餾水、生 水、葡膽水溶液、注射用植物油、㈣油、花生油:: 且油、玉米油、丙二醇、爷r換 μ ·、 禾乙烯知寺，必要時添加殺菌 剑、安疋劑、等張劑、無痛劑等。 本發明之免疫調節劑可依劑型而以適當之投與路 與。投與方法無特定，可以内服、外用和注射。注射 投與靜脈、肌肖、皮下、皮内等，外用劑也包括座劑等。 免疫調節劑之投與量可依其劑型、投與方法、使用目的 和病人之年齡、fa重、症狀來設定，雖無特定投予量，但 一般製劑中含有之選自環戊婦酮衍生物或其光學活性體或 彼等之鹽之化合物量為成人每日〇丨#g〜2〇〇mg/kg。當然， 投與量隨種種條件而變，亦有比上述投與量少即足夠之情 形，也有須超過之情形。本發明之藥劑除了就此口服之 外，也可任意添加於飲食品而日常攝取。 本發明之腫瘤壞死因子產生抑制劑、抗炎症劑、拓樸異 •18- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1246919 A7 B7 五、發明説明（16 ) 構酶抑制劑、細胞接著抑制劑、熱白休克蛋白謗導劑、抗 真菌劑可仿上述免疫調節劑來製劑化，以因應各疾病之方 法投與。當然，各藥劑之投與量隨種種條件而變，亦有比 上述投與量少即足夠之情形，也有須超過之情形。本發明 之藥劑除了就此口服之外，也可任意添加於飲食品而日常 攝取。 本發明所用之環戊晞酮衍生物或其光學活性體或彼等之 鹽可由環戊缔酮和任意之羧酸或其反應性衍生物有效製 造。 由上述製法分別提供環戊烯酮和異丁酸酐之反應生成物 二異丁醯環戊晞酮、環戊婦酮和甲氧乙酸之反應生成物二 甲氧乙酿環戊晞酮、環戊晞酮和甲基馬來酸之反應生成物 一甲基虽馬酿環戊婦酮和二甲基馬來醯環戊婦酮。 這些化合物具有制癌活性、抑制拓樸異構酶活性等，以 这些化合物或其光學活性體或彼等之鹽為有效成份可當作 制癌劑等醫藥。 本發明所得之含有環戊烯酮衍生物或其光學活性體或彼 等之鹽為有效成份之食品或飲料之製法無特定，可依調理 加工和一般使用之食品或飲料之製法製造，於所得之食品 或飲料含有有效量具有生理作用之選自環戊烯酮衍生物或 其光學活性體或彼等之鹽即可，可當作免疫調節用食品或 飲料等機能性食品或飲料。 本發明所得之環戊缔g時生物或其光學活性體或彼等之 鹽即使投與生理活性有效量亦 ’ 置T禾見毒性。例如口服二丙醯：

1246919 A7 B7 五、發明説明（ %戊烯酮、二己醯環戊晞酮、二己烯醯環戊烯酮、二昱 丁基環戊缔酮、二苄醯環戊埽酮或其光學活性體或彼等之 鹽l〇〇mg/kg對小白體單次投與皆未見死亡例。 可見環戊婦_衍生物或其光學活性體或彼等之鹽可簡單 製造，由其種種生理機能，可於醫藥、食品等廣泛之領域 極為有用。 以下舉實施例說明本發明，但本發明之技術範圍不限於 此。貫施例中％為重量％。 實施例1 (1)將1 0克D _葡萄糖醛酸（細馬公司製造，G 5269)溶於i 公升水，於12 TC加熱4小時後，減壓濃縮成約10毫升而與 乙酸丁酯：乙酸：水=3 : 2 : 2混合液之上層液40毫升混 合，離心所得上清液減壓濃縮成約i 〇毫升。 將此於矽膠管柱（BW-300SP，2 X 28公分，富士矽化學公 司製造）層析，將乙酸丁酯：乙酸··水=3 ·· 2 ·· 2之上層液用 恩縮機加壓為0 · 2公斤/公分2以每分5毫升之流速分離。劃 分為1 0毫升，各劃分取出一部分予以薄層層析，得知第 61〜80劃分含高純度之環戊烯酮。收集這些劃分而減壓濃 縮後，用40毫升氯仿萃取，減壓濃縮，得100毫克環戊晞 將此劃分用palpack型S管柱之順相HPLC分離，用215nm 之U V檢測結果純度為98%。 將以相同方法所得之環戊晞酮113·9毫克溶於2.85亳升乙 醇，於該乙醇溶液中添加已烷/乙醇（94/6) 3.85毫升以調製 -20- 本紙張尺度適用·中國國家標竿(CNS) Α4規格(21〇 X 297公釐） 1246919 A7 ___________B7 _____ 五、發明説明（18 ) 17毫克/毫升之環戊缔酮溶液。將此用〇.5 濾紙過濾，作 成光學分割HPLC試料溶液。 將此試料溶液於以下條件施行光學分割HPLC，分別收集 前吸收峰之（-)體環戊晞酮和後吸收峰之體環戊烯酮之 劃分而減壓蒸乾，分別得㈠體環戊烯酮43.2毫克和（+)體環 戊晞酮43.0毫克。 光學分割HPLC條件 管柱：chiralpackAS(Daicel化學工業）2·0公分X25.0公分

管柱溫度·· 4 0 °C 移動相：己烷/乙醇（94/6) 流速· 14 · 0愛升/ m i η 檢出：UV 210 nm 試料注入量：150 el (2.55毫克） 由於所得㈠體環戊婦酮和（+)體環戊稀酮兩者共含有約 1 %之對映體，故再施行上述條件之光學分割，結果從前 吸收峰之㈠體環戊婦酮3〇 〇毫克得19·7毫克不含對映體之 ㈠體環戊晞g同，從後吸收峰之（+)體環戊晞酮37·4毫克得 27.7¾克不含對映體之（+)體環戊婦酮。（_)體環戊晞酮和 體ί衣戊晞酮之光學分割HPLC溶出時間分別為33分和々ο分。 (2)於以實施例1β(1)所載方法所得環戊婦酮29.6毫克中 添加無水"比呢（中瀨tecs公司製造295-26) 1毫升和乙酸酐 (中瀨tecs公司製造002_26) 〇1毫升，於室溫攪拌3小時 後’用氯仿萃取，得二乙醯環戊烯酮3 6毫克。 將所得4二乙酸環戊缔酮用dX302質量分析計（日本電子 ____ -21 -

本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4^(2ι〇χ跗7公釐)-—-----J 1246919 A7 B7 五、發明説明（19 ) 公司）施行質量分析，另外，溶於CDC13，用NMR解析構 造。NMR裝置用JNM-A 500(日本電子公司）。結果如下， iH-NMR之化學位移值以氯仿之化學位移值為7.24 ppm表 示。

MS m/z 199 (M+H) + lH-NMR 52·12(3Η，S，-OCOCH3)，2·16(3Η，S，-OCOCH3)，5·16(1Η， d，J=3.0Hz，H-5)，5·89(1Η，m，H-4)，6·40(1Η，d-d，J=1.5, 6·5Ηζ，H-2)，7.43(1H，d-d，J=2.5, 6.5Hz，H-3) (3) 使用以實施例1-(1)之方法所得（-)體環戊烯酮15.9毫克 進行與實施例1-(2)相同之反應，可得二乙醯基㈠體環戊婦 酮15.1毫克。依實施例1-(2)施行由質量解析和NMR解析構 造，可得與實施例1_(2)相同之結果。 (4) 使用以實施例1-(1)之方法所得（+)體環戊烯酮16.7毫克 進行與參考例1-(2)相同之反應，可得二乙醯基（+)體環戊婦 酮18.8毫克。與實施例1-(2)同樣施行由質量解析和NMR解 析構造，可得同實施例1-(2)之結果。 (5) 於環戊烯酮13.8毫克添加苯甲酸（中瀨tecs公司製造 〇4 1-20)44.3毫克，二甲胺基吡啶（DMAP :東京化成工業公 司製造D1450)7.5毫克，N，N’-二環己碳化二亞胺（DCC ··肽 研究所公司製造100 1)5 1.0毫克，次加氯仿5毫升，於冰冷 下攪酸拌4小時後，將過濾反應液所得濾液加於7 5毫升矽 膠管柱層析，用氯仿溶出，可得含有二爷S&環戊晞酮之劃 分。將此劃分減壓:去除溶劑，殘查溶於乙醇後，藉由以氯 -22- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1246919 A7 B7 五、發明説明（2〇 ) 仿：甲醇=99 : 1混合液作為展開溶液之矽膠薄層層析進行 分離。將Rf=0.45-0.55之部份之矽膠從薄層削取，用氯仿 萃取，可得二芊醯環戊婦酮3.2毫克。 所得二芊醯環戊婦酮與實施例1-(2)同樣施行由質量解析 和NMR解析構造，得結果如下。

MS m/z 323 (M+H) + iH-NMR 55.56(lH，d，J=3.0Hz，H-5),6.30(lH，m，H-4)，6.54(lH,d-d，J=1.5, 6·5Ηζ，H-2)，7·44(4Η，m，芳香環之H)，7,58(2H，m， 芳香環之H)，7·64(1Η，d-d，J=2.0, 6.5Hz，H-3)，8.06(4H，m,芳 香環之H) (6) 使用（-)體環戊烯酮22.1毫克、苯甲酸71·9毫克、 DMAP 12.1毫克、DCC 80.3毫克，與實施例1-(5)進行相同反 應，可得二芊醯基㈠體環戊晞酮19.2毫克。與上述實施例ΙΟ) 同 樣施行 由質量解析和 NMR 解析 構造， 可得與 實施例 ΙΟ)相同之結果。 (7) 使用（+)體環戊晞酮20.4毫克、苯甲酸65.6毫克、DMAP 11.0毫克、DCC 74.3毫克，進行與實施例1-(5)相同反應， 可得二芊醯基（+)體環戊晞酮21.4毫克。與實施例1-(5)同樣 施行由質量解析和NMR解析構造，可得同實施例1-(5)之結 果。 (8) 將（+)體環戊晞酮30毫克、DMAP 10毫克、己酸（中瀨 tecs公司製造070-26)153毫克溶於5.9毫升二氯甲烷，於冰 冷下添加DCC 108毫克。反應1小時後，藉由以氯仿作為展 -23- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1246919 A7 B7 五、發明説明（21 ) 開溶劑之矽膠薄層層析分離純化反應液。將Rf=0.3-0.4之 部分之矽膠從薄層削取，用氯仿萃取，可得二己醯環戊婦 酮11毫克。 將所得之二己醯環戊晞酮溶於CDC13，用NMR確認。 NMR裝置用JNM-EX270 FT NMR系統（日本電子公司）。4-NMR之化學位移值以四甲基矽烷之化學位移值為0 ppm表 示。結果如下。

^-NMR 5 7·44(1Η，dd，J2_3=6.27Hz，J3.4=1.98Hz，Η-3)，6·42(1Η，dd， J2_3=6.27Hz，J3_4=1.32Hz5 H-2)，5.91(1H，m，H-4), 5·16(1Η，d， J4_5=2.97Hz，H-5)，2.42(2H，t，卜7.26Hz)，2.38(2H，t，J=7.76Hz)， 1.65(4H，m)，1.26(8H，m)，0·88(6Η，t)。 (9)將環戊婦酮30毫克、DMAP 10毫克、十四酸（東京化 成工業公司製造1^1〇476)301毫克溶於5.9毫升二氯甲烷，於 冰冷下加DCC 108毫克。反應1小時後，藉由以氯仿作為展 開溶劑之矽膠薄層層析分離反應液。將Rf=0.45-0.55之部 分之矽膠從薄層削取，用氯仿萃取，可得雙十四醯環戊烯 酉同5 3毫克。 所得雙十四醯環戊晞酮之NMR解析構造係與實施例1-(8) 同樣施行，可得結果如下。

^-NMR 57·45(1Η, dd，J2_3 = 5.94Hz，J3-4=2.31Hz，Η-3)，6·42(1Η，dd， J2.3 = 5.31Hz，J3.4=1.32Hz，H-2)，5·92(1Η，m5 H-4)，5·16(1Η，d， J4_5=2.64Hz，H-5)，2.42(2H, t，J=7.26Hz)，2·38(2Η，t，J=7.91Hz)， -24- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐) 1246919

1·63(4Η? m)? l.26(32H? m)? 0.88(6H? t) 將環戊缔酮30毫克、DMAP 10毫克、辛酸（中瀨tecs 公司製造071-11)19〇毫克溶於59毫升二氯甲烷，於冰冷下 、j C 10 8耄克。反應1小時後，藉由以氯仿為展開溶劑之 夕膠薄層層析分離反應液。將Rf=0.25-0.35之部分之梦膠 «薄層削取，用氯仿萃取，可得二辛醯環戊烯酮2 7毫克。 所得二辛醯環戊烯酮與實施例丨_(8)同樣施行藉*NMRi 解析構造，可得結果如下。

W-NMR 57.44(1Η，dd，J2.3=6.1Hz，J3_4=2.16Hz，Η-3)，6·41(1Η，dd， J2-3 = 6.1Hz，J3-4=i.48Hz，H-2)，5·92(1Η，m，H-4)，5·16(1Η，d， J4-5=2.97HZ，H-5)，2.42(2H，t，J=7.59Hz)，2.38(2H，t，J=7.9iHz)， 1-65(4H? m)? 1.29(16H5 m)5 0.88(6H? t) (11)將環戊晞酮30毫克、DMAP 10毫克、3-辛晞酸（東京 化成工業公司製造00070)190毫克溶於5.9亳升二氯甲燒， 於冰冷下加DCC 108毫克。反應1小時後，劑由以氯仿作為 展開么劑之梦膠薄層層析分離反應液。將25-0 35之 部分之矽膠從薄層削取，用氯仿萃取，可得二辛缔酿環 戊烯酮2 5亳克。

所得二-3-辛晞醯環戊烯酮與實施例1-(8)同樣施行藉由 NMR之解析構造，可得結果如下。 iH-NMR

Μ·44(1Η，dd，J2.3=6.27Hz，J3.4=2.32Hz，Η-3)，6·42(1Η，dd J2-3=6.27Hz，J3-4=1.49Hz，H-2)，5·91(1Η，m，Η、），5 55(4H 25 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) !2469l9 A7 B7 五、發—) --— ^ 5.16(1H, d, J4.5=2.97Hz, H-5), 3.12(4H, dd, J=12.85Hz, 159Hz)，2·04(4Η5 m)5 1.33(8H，m)，〇·89(6Η，t) (U)將環戊烯酮30毫克、DMAP 1〇亳克、正丁酸（東京化 成工業公司製造B0754)l 15毫克溶於5.9毫升二氯甲烷，於 冰=下加DCC 108毫克。反應i小時後，藉由以氯仿作為展 開洛劑之矽膠薄層層析分離反應液。將Rf=〇 2〇_〇 3〇t部 分 < 矽膠從薄層削取，用氯仿萃取，可得二丁醯環戊埽酮 ^毫克。 所得二丁醯環戊烯酮與實施例1β(8)同樣施行藉由^“汉之 解析構造，可得結果如下。

A-NMR δ7·45(1Η，dd，J2-3=6.27Hz5 J3.4=2.13HZ，H-3)，6.42(1H，dd， Jm.27Hz，J3.4=1.65Hz，H-2)，5·91(1Η，m，H-4)，5·16(1Η，d， J4.5=2.64Hz, H-5) (13)將環戊烯酮3〇毫克、dMAP 10毫克、正癸酸（東京化 成工業公司製造D0017)226毫克溶於5·9毫升二氯甲燒，於 冰冷下加DCC 108毫克。反應1小時後，藉由以氯仿作為展 開溶劑之矽膠薄層層析分離反應液。將Rf=〇.35-0.45之部 分之矽膠從薄層削取，用氯仿萃取，可得二癸醯環戊婦酮 3 5毫克。 所得二癸醯環戊烯酮與實施例1-(8)同樣施行藉由NMRi 解析構造，可得結果如下。

^-NMR 6 7·44(1Η，dd，J2-3=6.27Hz，J3-4=1.97Hz，Η·3)，6.42(1H，dd， -26- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1246919 A7 _________— B7 五、發明說明（24 ) J2-3 = 6.27Hz，J3_4=1.3Hz，Η·2)，5.91(1H，m，H-4)，5.15(1H，d， J4-5=2.97Hz，H-5)，2·42(2Η，t，JN7.24Hz)，2.38(2H，t，J=7.91Hz)， L65(4H，m)，1.26(24H，m)，0·88(6Η，t) (14) 將環戊婦酮3 〇毫克、DMAP 16毫克、三乙胺（東京化 成工業公司製造T0424)66毫克和正戊酸酐（東京化成工業 公司製造VO〇〇6)122毫升溶於5.9亳升二氯甲烷，於冰冷下 反應1小時後，藉由以氯仿：甲醇=2〇〇 : i作為展開溶劑之 石夕膠薄層層析展開反應液。將之部分之矽膠從 薄層削取，用氯仿萃取，可得二戊醯環戊晞酮3 9毫克。 所得二戊醯環戊烯酮與實施例l_(8)同樣施行藉由NMR之 解析構造，可得結果如下。

W-NMR ^7·45(1Η，dd，J2-3 = 6.11Hz，】3·4=1·66Ηζ，H-3)、6·42(1Η， dd，J2-3=6.11Hz，J3-4=1.66Hz，Η-2)、5·91(1Η，m5 Η-4)、5.16(1Η， d，Μ-5=2·97Ηζ, Η-5)、2.43(2Η，dd，J=7.59, 7·59Ηζ)、2·39(2Η, dd，J=7.59, 7.59Ηζ)、1·65(4Η，m)、1.38(4Η，m)、〇·93(6Η，dd， J=7_26, 7.26Hz) (15) 將環戊烯酮3 0毫克、DMAP 16毫克、三乙胺66毫克 和丙酸酐（東京化成工業公司製造！>〇513)86亳克溶於5.9毫 升一氯甲 '丨元’於冰冷下反應1小時後，藉由以氯仿：〒醇 200 : 1為展開溶劑之矽膠薄層層析展開反應液。將Rf=〇 5_ 〇·6之部分之矽膠從薄層削取，用氯仿萃取，可得二丙醯 壤戊坪嗣31亳克。 所得二丙醯環戊晞酮與實施例1-(8)同樣施行藉*NMRi -27- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） 1246919 A7 B7

解析構造，可得結果如下。 iH-NMR 5 7.45(1H，dd，J2-3 = 6.27Hz，J3伞2·ΐ5Ηζ，H-3)、6·42(1Η dd，J2_3 = 6.27Hz，J3-4吐49Ηζ，Η_2)、5 91(ιη，队 η·4)、’ 5·16(1Η，d，Η-5=2·97Ηζ，Η-5)、2·46(2Η，dd，>15.01，7.59Ηζ)、 2·42(2Η，dd，J=15.01，7·59Ηζ)、1·18(6Η，dd，卜7·59, 7.59Ηζ)

(16) 將環戊缔酮2克、DMAP 733毫克、反_2_己婦酸（東京 化成工業公司ΗΜΜΗ」毫克和DCC 5 57克溶於2〇〇毫升二 氯甲燒’於室溫反應2小時後’於進行以己烷：乙酸乙酿 =8 : 1為溶劑之矽膠柱層析，於膠薄層析上可得呈單一斑^ 裝 之劃分。將此劃分減壓濃縮，可得油狀二己缔醯環戊烯 酮約900亳克。 所得二-2-己烯醯環戊晞酮與實施例1_(8)同樣施行藉由 NMR之解析構造，可得結果如下。

^-NMR

5〇.92(6H，m，11-Η+1Γ-Η)、1·48(4Η, m，1〇-Η+1〇，-Η)、 2.18(4H? m5 9-H5 9'-H) ' 5.22(1H, d5 J=3.0Hz5 5-H)? 5.85(2H5 m, 7_h+7’-H)、5.98(1H，m5 4-H)、6·41(1Η，dd，J=l.〇, 6.0Hz， 2-H)、7.04(2H，m，8-H+8，-H)、7.47(1H，dd，J=2.0, 6·0Ηζ，3_H) 此外，將結合於環戊晞酮5位之2 -己烯醯基之碳從羰基起 順序訂為6〜丨丨位，結合於環戊烯酮4位之2 -己婦醯基之碳 從羰基起順序訂為6’〜1Γ位。 (17) 將環戊晞酮1·2毫克溶於200毫升二氯甲烷，添加異丁 酸酐（中瀨tecs公司）1··7毫升、DMAP 427毫克、三乙胺（中 -28 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210X 297公釐） 1246919 A7

瀨tecs公司）1.46毫升，於室溫反應！小時後，減壓濃縮， 溶於乙酸乙酯，用1〇%檸檬酸和飽和重碳酸鈉水溶=洗 淨，減壓濃縮，以己烷：乙酸乙酯=8 :丨作為展開溶=之 矽膠管柱層析進行分離，再藉由以己烷··乙酸乙酯 為展開溶劑之矽膠薄層層析〇，可得Rf=〇 2呈斑點之劃分。 將此劃分減壓濃縮去除溶劑，可得含高純度二異丁醯環戊 晞酮之油狀物470毫克。 所得二異丁醯環戊烯酮溶於重氫氯仿，依實施例Η”施 行藉由NMR之解析構造，可得結果如下。 【h-nmr 5l.l8(12H5m，7-H，8-H，10-H，ll-H)、2.61(2H，m，6-H，9-H)、5·1〇(1Η，d，J=3.0Hz，5-H)，5·88(1Η，m，4-H)、6·39(1Η， dd，J=1.5, 6·0Ηζ，2-H)、7.41(1H，dd，J=2.5, 6.0Hz，3-H) 但重氫氯仿之殘留質子之化學位移值以7.24 ppm表示。 圖1為二異丁醯環戊缔酮之iH-NMR。圖1中橫軸為化學 位移值（ppm)，縱軸為信號之強度。 此外，iH-NMR中信號之歸屬編號如下式（III)。 〇

(18)將環戊婦酮1.5毫克溶於200毫升二氯甲烷，添加甲氧 -29- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1246919

乙酸（中瀨tecs公司）2·7克、DMAP 794毫克、二環己基碳 化二亞胺DCC(中瀨_公司）536克，於室溫反應2小時 f，減壓濃縮，溶於乙酸乙酯，用1〇%擰檬酸和飽和重碳 &鈉水溶液洗淨，減壓濃縮，進行矽膠管柱層析（己烷： 乙酸乙酉曰2·3)分離，藉由碎膠薄層析（己故··乙酸乙酯 -1 ·、1)，可得Rf=0.34呈斑點之劃分。將此劃分減壓濃縮去 除溶劑，可得含高純度二甲氧乙醯環戊烯酮之油狀物3⑽ 毫克。 所得一曱氧乙醯環戊埽酮溶於重氮氯仿，依實施例1_(2) 施行藉由NMR之解析構造，得結果如下。

W-NMR 53·45(6Η，s，7-H，9-H)、4·13(4Η，m，6-H，8-H)、5.30(1H， d，J=3_0Hz，5-H)、5·99(1Η，m，4-H)、6·44(1Η，dd，J=1.5, 6.5Hz，2-H)、7·46(1Η，dd，J=2.0, 6.5Hz，3-H) 但重氫氯仿之殘留質子之化學位移值以7.24 pprn表示。 圖2為二曱氧乙醯環戊烯酮之iH-NMR。圖2中橫軸為化 學位移值（ppm)，縱軸為信號之強度。 此外，iH-NMR中信號之歸屬編號如下式（IV)。

-30- I紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(21〇 X 297公藿） 1246919

(19)將環戊晞酮Li毫克溶於200毫升二氯甲烷，添加甲基 馬來酸3.4克、DMAP 610毫克、二環己基碳化二亞胺〇(^ 4.12克’於室溫反應2小時後，減壓濃縮，溶於乙酸乙 酉曰’用10%檸檬酸和飽和重碳酸鈉水溶液洗淨，減壓濃 縮’藉由矽膠管柱層析（己烷··乙酸乙酯=3 : 2)分離，在藉 由石夕膠薄層層析（己烷：乙酸乙酯=1 :丨），可得Rf=〇.6呈斑 點之劃分和Rf=〇.45呈斑點之劃分。 將此二劃分分別減壓濃縮去除溶劑。從Rf=〇.6劃分得含 南純度二甲基富馬醯環戊婦酮之固體物3〇〇亳克，和從

Rf-0.45劃分得含高純度二甲基馬來醯環戊晞酮之油狀物 300毫克。

將此分別溶於重氫氯仿，依實施例施行藉*NMRi 解析構造，可得結果如下。 b-NMR 二甲基冨馬醯環戊晞酮 5 3.80(6H，s，10-H，15-H)、5.31(H，d5 J=3.0Hz，5-H)、 6·03(1Η，m，4-H)、6·48(1Η，dd，J=l.〇，6·0Ηζ，2-H)、6·90(4Η， m，7-H，8-H，12-H，13-H)、7·50(1Η，dd，J=2.0, 6.0Hz，3-H) 二甲基馬來醯環戊晞酮 53·76(6Η，s，1〇·Η，15-H)、5·31(1Η，d，J=3.0Hz，5-H)、 6·07(1Η，m，4-H)、6·31(4Η, m，7_H，8-H，12-H，13-H)、 6_44(1H，dd，J=1.5, 6·0Ηζ，2-H)、7·58(1Η，dd，J=2.0, 6.0Hz， 3-H) 但重氫氯仿之殘留質子之化學位移值以7.24ppm表示。 -31 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1246919 A7 B7 五、發明説明（ 29 圖3為二甲基富馬醯環戊婦酮之ipj-NMR光譜。 圖4為二甲 基馬來酿％戊缔酉同之iH-NMR光譜。圖3、4中橫轴為 移值（ppm)，縱轴為信號之強度。 二甲基富馬醯環戊晞酮之iH_NMR中信號之歸屬編號 下式（V)。 ^ u

〇 〔V〕 二甲基馬來醯環戊埽酮之1η-nmr中信號之歸屬編號如 下式（VI)。

9 cno He 8 cno 3 Η 5 c 1 ' 1VCH 一 /

V

(20)混合環戊烯酮之1 Μ水溶液100 /zl和200 mM麩胱甞肽 (還原型；中瀨tecs公司：170-10)水溶液（pH 3.0)500 //1，於 60°C反應5小時後，濾經〇.5#m濾膜，用以下條件予以HPLC -32- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 化學位

1246919 A7 B7 五、發明説明（3〇 ) 分離。 管柱：TSKgelODS-80Ts(5 从 m)、20mm X 25cm 移動相：八0.1%丁卩八水溶液 B 0.1% TFA/50%乙腈水溶液 流速·· 7.5毫升/分 梯度··以1 0分移動相A -> 5 5分從移動相至A ·· B = 1 : 1 —以1 5分從移動相A : B = 1 : 1至移動相B 檢測：220 nm吸光度 取上述反應液200 /d進行HPLC，分取留存時間35.7、36.1 分之吸收峰，分別減壓濃縮，得乾燥物5.5毫克。 將此物之構造解析。NMR用JNM-A500(日本電子公司）， MS用DX302質量分析計（日本電子公司），UV用UV-2500分 光光度計（島津製作所），IR用FT1R-8000PC紅外分光光度 計（島津製作所）測定。結果如下。

^-NMR δ2·09(2Η，m，5，-Η)，2·28(1Η，dd，J=13.0，20·0Ηζ，5-H)， 2·44(2Η，m，4f-H)，2·78(1Η，dd，J=8.5，14.0，Γ-Η)，2·85 或 2·89(1Η，dd，J=3.0，6.0Hz，5-H)，2.92 或 2·95(1Η，dd，J=1.0, 5.5Hz，Γ-Η)，3.86(2H，S，9’·Η)，3.95(2H，m，4-H，6f-H)， 4·46(1Η，m，2、H)，6.47或 6.49(1H，d，J=3.0Hz，3-H)。 試料溶在0. IN DC1重水溶液，HOD之化學位移值以4.65 ppm表示°

13C-NMR 5 26.3(5，-C)， 31.7(4、C)， 31.9 或 32.1(r-C)， 39.3(4-C)， -33- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1246919 A7 B7 五、發明説明（31 ) 41.9(9’-C)，42.2 或42.3(5-C)，53.3(6，-C)，54.1(2f-C)，133.5(3-C)，154.4(2-C)，173 附近（3，-C，7，-C，8，-C，10f-C)，205.8(1-C) 試料溶在〇. IN DC1重水溶液，二哼烷之化學位移值以 67.4 ppm表示。 此外，iH-NMR、13C-NMR之吸收峰之歸屬之編號如下式 [VII] 6. 5' 4· 3· 2· 8' 9· 1〇’ \

H2N—CH~CH2一CH2一C_NH—CH—C 一 NH—CH2 一C〇〇H

丨7· II II C〇〇H Ο ν 〇 〇Η

S 5 evil]

FAB-MS m/z 404(M+H)+，426(M+Na)+ 以甘油為基質。 UV Amax 251 nm(水） IR uK^maxem·1 2949, 1710, 1660, 1539, 1404, 1203 依擴散反射法施行。 由以上之結果，得知乾燥物為2-羥基-4-麩胱甞肽-S-基-2-環戊烯-1·酮（以下稱GM)。 實施例2 將於含10%經56°C處理30分之牛胎兒血清（FCS ·· JRH公司） 之RPMI1640培養基（BIO WHITTAKER公司）中37°C培養之 HL-60(ATCC CCL-240)懸浮於 RPMI1640培養基成 2·5 X 105 -34- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1246919 A7 B7 五、發明説明（32 ) 細胞/ 5毫升。 對此懸浮液5亳升添加稀釋為種種濃度之二異丁酶環戊 婦酮、二甲氧乙醯環戊埽酮、二甲基富馬醯環戊烯酮、二 甲基馬來醯環戊烯酮之各70%乙醇水溶液1〇 ，於m， 5%二氧化碳之存在下培養2 4小時。又為確認將已知作為 謗發細胞凋亡之試藥放射黴素D ( S i g m a公司製造）之水溶 液（0.5毫克/毫升）10 μΐ代替上述試料用於同樣培養。 以培養細胞用光學顯微鏡觀察，分別確認於試料和放射 Μ素D添加培養細胞中核之凝縮、細胞之縮小、細胞调亡 小體之形成。對照之70%乙醇水溶液1〇川添加培養細胞則 無這些現象。 " 又從與上述相同方法培養之細胞進行部分取樣，用〇 錐藍染色後，用光學顯微鏡觀察，測定未染色之活細胞和 染色為藍色之死細胞之細胞數，求出存活率成5〇%之各樣 品之濃度（存活率⑼//Μ)，如下表1。 表1

k 二甲基富馬醯環戊晞酮

一甲氧乙醯環戊晞嗣 本^用中準(CNS) A4規格 1246919 A7 B7 五、發明説明（33 ) 實施例3 (1)混合拓樸異構酶II(TopoGEN公司製造、2單位///1)2// 1、10倍濃度緩衝液[0·5Μ Tiris-鹽酸（pH 8.0)、12M KC1、 0.1M MgCl2、2·5 mM腺甞三瞵酸、5 mM二硫蘇醇]2 //1、 0 . 1 %牛血清蛋白素（寶酒造公司）2 /zl、蒸餾水11 μΐ及對照 之用蒸餾水或水調製為種種濃度之二丙醯環戊烯酮、二異 丁醯環戊晞酮、二芊醯環戊晞酮、二己醯環戊晞酮、二-2-己晞醯環戊晞酮、二甲氧乙醯環戊烯酮、二甲基富馬醯環 戊晞酮、二甲基馬來醯環戊烯酮2以，並添加0.25 /zg/ # 1 pBR322 DNA(寶酒造公司）1 #1，於37°C反應3 0分後，添加 1 %十二基硫酸鋼、50%甘油、0.02%溴紛藍水溶液2//1使反 應停止。 將此反應液20/zl於用洋菜糖L03(寶酒造公司）和TAE緩衝 液[40 mM Tris、5 mM乙酸納、1 mM EDTA和乙酸調為pH 7.8]作成之1%洋菜糖凝膠上用TAE緩衝液進行電泳後，凝 膠浸漬於1 /zg/毫升乙基溴水溶液，照射紫外線，觀察DNA 電泳樣式。於添加水之對照中，其DN A由超螺旋型完全變 化為弛緩型，但當拓樸異構酶11之活性被抑制，則由螺旋 型至弛緩型之變化部分或完全被抑制。 結果於添加水之對照中，DNA由超螺旋型完全變化為弛 緩型，但因0.1 以上之二丙醯環戊晞酮、1/zM以上二異 丁醯環戊烯酮、1 //M以上之二苄醯環戊婦酮、10 //M以上 之二己醯環戊烯酮、10 以上之二-2-己晞醯環戊烯酮、 50//M以上之二甲氧乙醯環戊烯酮、10/zM以上之二甲基富 -36- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1246919

馬醞壞戍缔酮、域以上之二甲基馬來醯環戊烯酮，使超 螺旋型至弛緩型之變化部分或完全被抑制，因而確認各環 戍婦酮衍生物具有抑制拓樸異構酶II之活性。 (2)以與貫施例3_(1)同樣方法測定各環戊晞酮衍生物之拓 樸異構酶1抑制活性。但拓樸異構酶II代之以拓樸異構酶 !(t〇p〇GEN公司製造、〇 〇1單位/仲、1〇倍濃度緩衝液用 H)0 mM Tris-鹽酸（pH 79)，1〇 mM EDTA，丨福亞精胺和 50%甘油。 …果於添加水之對照中，DNA由超螺旋型完全變化為弛 緩型，但因1000 以上之二丙醯環戊埽酮、5〇〇#M以上 二異丁醯環戊晞酮、50 以上之二苄醯環戊婦酮、1〇〇〇“ Μ以上之二己醯環戊埽酮、5〇〇/zM以上之二_2•己晞醯環戊 烯酮、1000 //M以上之二甲氧乙醯環戊婦酮、1〇〇〇#m以上 之二甲基富馬醯環戊埽酮、1000 βΜα上之二甲基馬來醯環 戊烯酮，使DNA由超螺旋型至弛緩型之變化部分或完全被 抑制’確認各環戊婦酮衍生物具拓樸異構酶I抑制活性。 由上_示上述環戊晞酮衍生物和實施例1記載之其他環 戊婦g同衍生物對於正常細胞中僅分裂期暫時表現，但藉由 癌化而變成全細胞周期高表現之拓樸異構酶j〗會呈抑制活 性。又拓樸異構酶Π抑制活性與隨癌化而增大表現量和活性 之拓樸異構酶I抑制活性相較具有強力抑制活性。 .以上各化合物之光學活性體和彼等之鹽也有同樣之拓樸昱 構酶II專一抑制活性。 實施例4 -37_ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐）

裝 訂

1246919 A7 B7 五、發明説明（35 ) (1)將含2X 105細胞 / 毫升之HL-60(ATCC CCL-240)之 10% 牛胎兒血清之RPMI1640培養基5毫升注入6穴板之各穴，於 37°C，5%二氧化碳之存在下培養2 4小時後，添加二丙醯環 戊晞酮、二異丁醯環戊烯酮、二-2-己晞醯環戊晞酮至最終 濃度為 0、0.63、1.3、2.5、5、10、20/zM，再培養6 小時。 培養終了後，計測細胞數，離心回收細胞，用PBS洗 淨，調製各試料處理細胞。於45°C熱處理10分後，也調製 同樣培養之細胞。 用這些處理細胞，依分子選殖[冷泉港實驗室出版（1989)] 之方法進行SDS-PAGE。將處理細胞懸浮於SDS-PAGE樣品 緩衝液成2.5X106細胞/毫升而於100°C處理10分後，分5//1 電泳於2片8〇8-卩八〇£凝膠（5%堆積凝膠，10%分離凝膠）。 一方之凝膠予以苦馬西染色，他方之凝膠則墨潰於聚乙烯 化二氟轉膜[Immobilon TM ··微孔公司製造Cat. # IPVH000-10]。將此膜用Block Ace(大日本製藥公司Cat. # UK-B25)於 4 °C遮斷一夜。 此遮斷膜與熱謗導之70 kDa之熱休克蛋白專一反應之單 株抗體HSP72/73(Ab-l，Oncogene Research Products Cat. # HSP01)反應後，用含0.05% Tween 20之TBS洗淨，再用TBS 洗淨。其次和過氧化酶複合二次抗體HRP-兔抗小白鼠IgG (H+L)(ZYMED實驗公司Cat. # 61-6520)反應後，同上進行 相同洗淨。如此和一次抗體、二次抗體反應之膜，和克美 米醇試藥 RENAISSANCETM(杜邦 NEN公司 Cat. # NEL-100) 反應後，用X光軟片感光，確認謗導70 kDa之熱休克蛋 白0 -38- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1246919 A7 B7 五、發明説明（36 ) 結果確認謗導70 kDa之熱休克蛋白。此謗導之強弱如表 2。又表2中，+表示謗導強，+越多，謗導越強。-表示無 謗導，土表示謗導少。 表2 環戊晞酮衍生物 濃度UM) 0.63 1.3 2.5 5 10 20 二丙醯環戊烯酮 - 土 + +++ ++ ++ 二異丁醯環戊晞酮 土 + +++ +++ + + 二-2-己醯環戊烯酮 土 + +++ 土 - 未處理之對照為-，45°C熱處理5分為++。以上化合物於 低濃度呈現謗導熱休克蛋白之作用。其光學活性體和彼等 之鹽也有同樣之活性。又其他環戊烯酮衍生物或其光學活 性體和彼等之鹽也有同樣之活性。 實施例5 用二丙醯環戊烯酮、二異丁醯環戊烯酮和二-2-己烯醯環 戊婦酮調查對白色念珠菌ΤΙΜΜ0 136之抗真菌活性。 白色念珠菌於含有酵母氮基劑（Deflco公司）0.67%和葡萄 糖1.0%之YNBG培養基培養一夜（種培養）。其次用新鮮之 酵母氮基劑培養基稀釋至1X106細胞/毫升，分100^1分注 於96穴微板之各穴。 各穴添加二丙醯環戊婦酮、二異丁醯環戊晞酮和二-2-己 晞醯環戊烯酮之各100 #g/毫升、500 //g/毫升之70%乙醇溶 液或70%乙醇溶液10/zl，於30°C培養4 8小時（本培養）。 二丙醯環戊晞酮、二異丁醯環戊晞酮和二-2-己晞醯環戊 晞酮各以500 /zg/毫升抑制白色念珠菌之增殖，最低抑制濃 -39- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐)

裝 η

線 1246919 A7 _B7 五、發明説明（37 ) 度各為500 zzg/笔升，這些化合物可當作抗真菌劑之有效成 份。又這些環戊烯酮衍生物或其光學活性體和彼等之鹽也 有同樣之活性。 實施例6 將人類血管内皮細胞（二光純藥公司）懸浮於含1 〇 % F c s

(Hiclone公司）之RPMI-1640培養基（Gibco公司），調為1 X 105細胞/毫升而於96微穴板播種1〇〇#丨/穴。 於37°C，5%二氧化碳之保溫箱培養2日而成單層之血管 内皮細胞中添加100 U/毫升之人類重組TNF- α (普羅美加 公司），於37°C，5%二氧化碳之保溫箱培養6小時，作成以 TNF- α刺激之血管内皮細胞。 另將懸浮於含10% FCS之RPMI-1640培養基（Gibco公司） 而調為1 X 106細胞/毫升之HL-60細胞中添加各濃度之環戊 晞酮、G Μ或二丙醯環戊晞酮，於37°C，5 %二氧化碳之保 溫箱培養3小時後，添加螢光劑5 之5 (和6 )-羧基螢光 素二乙酸丁二醯亞胺酯（分子探針公司），於37°C反應1 0分 後，用RPMI· 1640培養基洗細胞2次，懸浮於含10% FCS之 RPMI· 1640培養基而調為1 X 1〇6細胞/毫升之標識螢光之 HL-60細胞液。 於以TNF-α刺激之血管内、皮細胞重疊標識螢光之HL-60 細胞100 #1/穴，添加各濃度之環戊烯酮、G Μ或二丙醯環 戊晞酮，於37 °C，5°/。二氧化碳之保溫箱培養20分，施行 血管内皮細胞和HL-60細胞之接著反應。 接著反應後，清洗平板除去非接著細胞，添加1 % Triton _ -40- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1246919

Χ(中瀨tecs公司）來破壞接著細胞，用485/22 nm(激發用） 和5 3 0 /2 5 n m (測定用）之各濾鏡測定螢光強度。 一以螢光標識之IX 105個細胞之螢光強度為1〇〇%，求出血 管内皮細胞所接著之接著率。 結果如表3，藉由TNF_a刺激可增加血管内皮細胞和hl· 60細胞之接著率。此接著率之增加藉由環戊婦嗣、⑽或 二丙酿環戊婦酮’於1〇-Μ〇·4Μ之濃度隨用量抑制，環戊 婦酮、GM或二丙醯環戊烯酮呈現抑制癌轉移所須之癌細 胞和血管内皮細胞之接著作用。這些化合物之 :髀 和彼等之鹽也有同樣之活性。 尤予活陳月丘 又其他環戊晞酮衍生物或其光學活性體和彼等之鹽也有 表3

-41 -

A7 B7

1246919 五、發明説明（ 100 16.3 二丙醯環戊烯酮 0.1 49.2 1 35.1 10 15.3 100 15.5 實施例7 由曰本SLC公司購入ddY小白鼠（雌，7週齡），飼養一週 後供實驗。 於小鼠腹腔内接種IX 1〇6細胞之Ehrlich癌細胞i日後，腹 腔内投與10亳克/公斤環戊婦酮、30毫克/公斤gm或1〇毫 克/公斤二丙醯環戊晞酮。對照則投與生理食鹽水。 接種癌細胞之1 0日後摘出脾臟而粉碎，懸浮於含1〇% FCS(Hicl〇ne公司）之RPMI-1640培養基（Gibco公司），可得 單細胞液。將細胞液中之接著細胞接著於塑膠板來除去， 將所得非接著細胞當作脾臟淋巴球用於以下實驗。 將脾臟淋巴球懸浮於含10% FCS之RPMI-1640培養基，調 為2 X 1〇6細胞/毫升而於96微穴板播種1〇〇 gl/穴。 刺激細胞之調製如下。懸浮於RPMI-1640培養基而調為2 X 106細胞/毫升之Ehdich癌細胞中添加絲裂黴素C(協和發 酵公司）50#g/毫升，於37°C處理30分，洗淨2次後，懸浮 於含10% FCS之RPMI-1640培養基，調為2 X 106細胞/亳升 之刺激細胞。 將所調製之刺激細胞100 //1重疊於添加脾臟淋巴球之平 板之各穴1〇〇 #1/穴，於37°C，5%二氧化碳之保溫箱培養5 -42 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210X 297公釐）

裝 η

1246919 A7 B7 五、發明説明（4〇 ) 曰。培養終了前1日，各穴添加3H-胸甞（第一化學藥品公 司）3 7 kB q，施行脈衝標識，培養終了後，各細胞收集於 玻璃濾器而測定放射活性。 結果如下表4。環戊婦酮、G Μ或二丙醯環戊晞酮投與小 白鼠所得各脾臟淋巴球因癌細胞刺激而顯著促進增殖，表 示謗導和癌細胞專一反應之淋巴球。這些化合物之光學活 性體和彼等之鹽也有同樣之活性。 又其他環戊烯酮衍生物或其光學活性體和彼等之鹽也有 同樣之活性。 表4 被檢物質 投與量 (毫克/公斤） 癌細胞刺激 3H-胸甞收取 量 (CPM) 對照 - 10492 + 8806 環戊晞酉同 10 - 9680 + 25756 GM 30 - 8700 + 36291 二丙醯環戊婦酮 10 . 9250 + 20748 實施例8 由日本SLC公司購入ddY小白鼠（雌，7週齡），飼養一週 -43- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） 1246919 A7 B7 五、發明説明（ 後供實驗。 於小鼠腹腔内接種1 X 1〇6個EhrUch癌細胞i日後，腹腔 内投與10毫克/公斤環戊烯酮、30毫克/公斤GM*1〇亳克/ 公斤二丙醯環戊婦酮。對照則投與生理食鹽水。 接種癌細胞之1 0日後自小鼠摘出脾臟粉碎，懸浮於含 10% FCS(Hiclone公司）之RPMI-1640培養基，可得單細胞 液。細胞液中之接著細胞接著於塑膠板來除去，所得非接 著細胞當作NK細胞。 NK細胞懸浮於含10% FCS之RPMM640培養基，調為6X 106細胞/毫升，以100 #1/穴撥種於微穴板。 標的細胞之調製如下。於1 X 1〇6個YAC-1細胞（大日本製 藥公司）添加3700 kBq之51Cr(亞馬西母公司），於37°C培養1 小時來標識。標識細胞洗2次後，懸浮於含10% fcs之 RPMI-1640培養基，調為2X105細胞/毫升。 將所調製之標的細胞100 重疊於添加N K細胞之板之各 穴，於3 7 C ’ 5 %二氧化碳之保溫箱培養5小時。培養後， 板予以1500 rpm離心5分，上澄液100 回收於r計管來測 定放射活性（實驗值）。 為測定從標的細胞自然放出之放射活性（對照值），於反 應系中添加1 〇〇 W培養液代替NK細胞，並測定放射活性。 此外，為測定反應系中所含之總放射活性（總放射活性 值），於反應系添加1% Triton X(中瀨tecs公司）以測定溶 解51Cr標識YAC-1細胞時放出於上澄液之放射活性。 因此，藉由NK細胞之專一性細胞傷害率（％ )之計算式 如下 -44 - ^紙張尺度適Θ中_家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1246919

細胞傷吾率(％)==[(實驗值-對照值)/(總放射活性值-對照值)]χ丨〇〇 結果如下表5。於投與環戊缔酮、GM或二丙醯環戊晞酮之 J白队中確涊N K細胞之活化，藉由這些化合物之投與提 高活體之免疫防禦機構，對癌細胞之傷害活性上昇。這些 化合物之光學活性體和彼等之鹽也有同樣之活性。 又其他環戊婦酮衍生物或其光學活性體和彼等之鹽也有 同樣之活性。

實施例9 由SEAC吉冨公司購入路易士大鼠（雄，9週齡，體重藥 250克）。 7庄 實驗開始前斷食1 8小時之大鼠每組4隻口服溶於橄欖油 (中瀨tecs公司）而調製成1或10毫克/10毫升/公斤之二丙酿 環戊烯酮、二己醯環戊晞酮、二-2-己烯醯環戊烯酮、二異 丁醯環戊晞酮或二芊醯環戊埽酮。 投與被檢物質0.5小時後，於大鼠右足疏注射懸浮於生理 食鹽水（大塚製藥公司）之1 % λ鹿角草膠（和光純藥公 司）100 /zl來謗導足部浮腫，鹿角草膠注射3小時後，用大 氣足容積測足裝置（夫各巴公司）測定大氣之右足容積。測 定值為從鹿角草膠投與前測定之各鼠之右足容積算定增加 率0 -45- 本纸浪尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(21〇χ297公釐） 1246919 A7

結果如圖5，圖5表禾所&也、四 & ^ 斤技與'^ %戊烯酮衍生物量和足部 為增加率（％)。 #為投與里（笔克/公斤），縱轴 以j 〇其皿酉同以1 =克/公斤之投與量抑制足部浮腫， 毛 A足投與里王現顯著抑制作用。二己醯環戊 旦Γ、二已埽醯環戊_分別以1或10毫克/公之投盘 ::現顯著抑制作用。二異丁醯環戊 埽 酮分別以1毫克/公斤之投與量抑制足部浮腫，以1〇毫戍克~ :斤 < 投與I主現顯著抑制作用。這些環戊埽酮衍生物之 光學活性體和彼等之鹽也有同樣之活性。 又其他裱戊烯酮衍生物或其光學活性體和彼之晻 同樣之活性。 意百 圖5中*為比對照組p<〇 〇5，"為p<〇 〇1差異顯著。 實施例1 0 由日本SLC公司購入C57BL/6小白鼠（雄，7週齡，體重約 25克），飼養一週後供實驗。 知起敏抗原羊紅血球（清水實驗材料）用生理食鹽水（大 塚製藥）洗3次後，用生理食鹽水調為丨χ 1〇9細胞/亳升， 而於腹腔内注射200 W來起敏。5日後，於右腳趾注射同樣 調製之抗原40⑷來誘發引起足部浮腫。 將二丙醯環戊婦酮溶於生理食鹽水調整為各濃度，於每 組5隻小鼠，從抗原起敏日起，每日1次腹腔内或經口投與 3日。抗原謗發之2日後，鼠右足容積用足部浮腫測定裝置 (吳各巴公司）測定而作為DTH之指標。測定值依下式由抗 原謗發前測定之各鼠之右足容積算定增加率。 -46-

1246919 五、發明説明（Μ ) A7 B7

增加率=(抗原謗發後右足容積-抗原謗發前 原謗發前右足容積 右足容積）/抗 結果如圖6，圖中縱軸表示藉由抗原誘發而増加之右足容 之增加率。二丙醯環戊婦酮以i毫克/公斤之腹腔投與顯示 抑制足邵浮腫之傾向’以10毫克/公斤進行腹腔内投與或以 30¾克/公斤之經口投與顯著抑制。這些環戊缔酮衍生物之 光學活性體和彼等之鹽也有同樣之活性。 又其他環戊埽酮衍生物或其光學活性體和彼等之鹽也有同 樣之活性。 " 圖6中*為比對照組ρ<〇·〇5，**為？<〇 〇1差異顯著 實施例1 1 (1)從日本SLC公司購入ddY小白鼠（雄，7週齡），摘出脾 臟而粉碎，懸浮於含10%FCS(Hicl〇ne公司）之ΚΡΜΙ·164〇培 養基，可得單細胞液。將細胞懸浮液播種於塑膠皿板，於 3 7 C培養2小時。接著性細胞接著於皿來除去，所得非接 著性細胞當作脾臟淋巴球使用。將細胞濃度調為2 X 1〇6細 胞/毫升，以200 //1/穴播種於9 6穴微板。於對照組以外之 各穴添加各濃度之二丙醯環戊烯酮，再於所有之穴添加5 //g之ConA(中瀨tecs公司），於37°C，二氧化碳保溫器培養 1日後，於各穴添加1 #Ci之3H-胸荅，再培養1日，細胞中 收取量用液體閃爍計測定。 結果如下圖7。圖7表示二丙酿環戊烯i同濃度和3h_胸：y： 收取量之關係。橫軸為二丙醯環戊晞酮濃度（VM),縱轴為 ^H-胸芬收取量（CPM)。白柱表示無刺激時，斜線柱表示用 ___ -47- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210X297公釐） 裝 訂

1246919 A7 B7 五、發明説明（μ ) 45 ’

ConA刺激時之3Η-胸苷收取量。由圖7得知，對促細胞分裂 劑刺激小藏淋巴球之增殖，二丙醯環戊烯酮隨用量而呈現 抑制作用，於丨〇 大至完全抑制，此環戊婦酮之光學活 性體和彼等之鹽也有同樣之活性。又其他環戊晞酮衍生物 或其光學活性體和彼等之鹽也有同樣之活性。 (2)從日本SLC公司購入β alb/c小白鼠（雄，6週齡）和 C57BL/6小白鼠（雄，6週齡），摘出脾臟，根據實施例 (1)之方法’取得脾臟淋巴球。將細胞懸浮液調為2 X 106細 胞/¾升，於96穴微板播種100 #丨/穴，於對照組以外之各穴 添加各濃度之二丙醯環戊缔酮，於37t，二氧化碳培養器 培養4日後，於各穴添加1/zCi之3H_胸甞，再培養1日，細 胞中收取量用液體閃爍計測定。 結果如下圖8。圖8表示二丙醯環戊烯酮濃度和3H-胸菩 收取量之關係。橫軸為二丙醯環戊婦酮濃度（#M)，縱軸 為3H-胸甞收取量（CPM)。白柱表示單獨用任一系統由來之 細胞時之311-胸菩收取量，斜線柱表示混合兩系統由來之 細胞時之3H-胸苷收取量。由圖8得知，對別抗原刺激而活 化之淋巴球，二丙醯環戊埽酮隨用量而呈現抑制作用，於 1 大至完全抑制。此環戊缔酮之光學活性體和彼等之鹽 也有同樣之活性。 又其他環戊缔酮衍生物或其光學活性體和彼等之鹽也有 同樣之活性。 實施例1 2 (1)從日本SLC公司購入CDF1小白鼠（雌，8週齡），製作 -48-

本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1246919 A7 B7 五、發明説明（46 ) 内毒素休克模式。每組4隻小鼠皮下投與蒸餾水（對照）或 1 0毫克/公斤二異丙醯環戊婦酮或二異丁醯環戊缔嗣，3 〇 分後，腹腔内投與20 // g/小鼠之LPS(脂多糖：s igma公 司）。其1.5小時後’由小鼠採血並分離血清，血中腫瘤壞 死因子（TNF)-a之量用市售ELISA套組（R&D公司）測定。 結果如表6。 表6 組 投與量 (毫升/公斤） TNF量(ng/毫升） 平均+ SE 對照 二異丙酸環戊婦酉同 二異丁醯環戊晞酮 10 10 7·53±〇·48 4.61 ±0.57** 3.39 + 0.33*** 相車父於投與蒸館水之對照組’ 1 〇毫克/公斤二異丙酸環戊 晞酮或二異丁醯環戊烯酮投與組顯著抑制TNF- α之產生。 表6中* *為比對照組ρ<〇·〇ι，***為p<〇 〇〇1差異顯著。這些 環戊婦酮衍生物之光學活性體和彼等之鹽也有同樣之活 性。 又其他環戊缔酮衍生物或其光學活性體和彼等之鹽也有 同樣之活性。 (2)母組用4隻CDF 1小白鼠（雌，8週齡），腹腔内投與LPS (20“g/小氣）來製作内毒素休克模式。投與LpSi3〇分前分 別以3 0毫克/公斤1〇〇毫克/公斤之用量口服二異丙醯環戊 少希銅或二異丁醯環戊婦酮，投與LPS之1.5小時後，採血而 分離血清’血中腫瘤壞死因子（TNF)-a之量用ELISA套組 測定。 I_— _ -49- 本紙張尺度適用巾國國豕標準(CNS) △鐵格⑵^^撕公釐） 1246919

結果如表7 ’相較於對照組’二異丙醯環戊晞酮或二里 =環=酮隨口服量抑制·之產生。這些環戊缔g同衍 生物之光子活性體和彼等之鹽也有同樣之活性。 又其他環戊埽酮彳汗& % + & , & _ 丁生物或其光學活性體和彼等之鹽也有 同樣之活性。 $ 表7

二丙醯 環戊婦酮 -異丁醯 環戊婦酮 30 100 30 100 TNF量(ng/毫升） 平均土SE 5.72土 1.02 2·95±0·14* 1·26±0.15** 3·92±0·13 2.48±0.43* * ’ * * : ρ<0·05 ’ 〇·01 vs對照 -- 實施例1 3 (1)將小白鼠白血病Ρ·388(1·1χ1〇6細胞/小白鼠）腹腔内注 射於DB A/2小白鼠（雌，7週齡）。隨即腹腔内注射二丙醯 環戊晞酮10亳克/公斤一次。對照組則用生理食鹽水同樣 腹腔内注射。就二組各8隻計算存活數、平均存活日數和 延命率。 結果，對照組平均存活日數為10.lg，二丙醯環戊烯酉同 投與組則為13.9日，其延命率為137·0% ,延命效果顯著。 同樣，用Meth Α腫瘤細胞：BALB/c小白鼠之系檢討之結 果’對照組平均存活日數為13.4日，二丙醯環戊晞_投與 -50- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1246919

組則為16·9日，其延命率為126.2% ,延命效果顯著。 此環戊埽酮衍生物之光學活性體和彼等之鹽也有同樣之 活性。 又其他環戊晞酮衍生物或其光學活性體和彼等之鹽也有 同樣之活性。 (2)小白鼠固形癌Meth a(2X 1〇6細胞/小白鼠）於BALB/c小 白(雌，8週齡）背部皮下注射。隨即於同部位皮下注射 一丙醯環戊埽酮連續五日。對照組則用生理食鹽水同樣皮 下注射。每組用8隻小鼠試驗。 二週後摘出形成於小鼠背部之癌組織，測定其重量。結 果如表8，對照組平均癌重量為〇61克，二丙醯環戊晞酮 投與組則為0.05克，其抑制率為92,3%。且8隻中5隻完全 典形成癌細胞。此環戊晞酮衍生物之光學活性體和彼等之 鹽也有同樣之活性。 又其他環戊烯酮衍生物或其光學活性體和彼等之鹽也有 同樣活性。 表8 組 癌重量（克） 平均土SE 抑制率 (%) 對照 〇.61±〇·20 二丙醯 0.05±0.08 92.3 環戊烯酮 (3)用 Ehrlich癌（EAC) 、Meth Α之二種， 將對各種腹水型 癌之二丙醯環戊晞酮和二異丁醯環戊烯酮之制癌作用，就 若干投與量腹腔内或經口投與來檢討。腹腔内移植細胞數 -51 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1246919 A7 B7 五、發明説明（49 ) 和宿主動物如表9。 表9 癌細胞 小白鼠 移植細胞數 EAC Meth A ddY(雌性、5週齡） BALA/c(雌性、7週齡） 1.2 X 106 2.0 X1〇6 二丙醯環戊婦酮或二異丁醯環戊缔酮分別於癌細胞移植 之次日起連續5日腹腔内或經口投與。對照組則將注射用蒸 餾水同樣投與。就每組8隻計算平均存活日數、延命率和3〇 曰存活數。 結果如表10〜13。表10為於EAC移植小白鼠腹腔内投與各 被檢物質時之延命效果，表U為對於Meth A移植小白鼠腹 腔内投與各被檢物質時之延命效果，表丨2為對於EAC移植 小白氣經口投與各被檢物質時之延命效果，表丨3為對於 Meth A移植小白鼠經口投與各被檢物質時之延命效果。 可見於EAC移植小白氣中’二丙醯環戊晞酮和二異丁醯 環戊晞酮有優越之延命效果，尤其腹腔内投與時，各組皆 呈現3 0日存活例。又於二丙醯環戊晞酮經口投與也有強力 效果。 又於Meth A移植小白鼠中，各治療組腹腔内投與時，皆 呈現強力延命效果。又於二丙醯環戊晞酮經口投與有3 〇日 存活例。 這些環戊婦酮衍生物之光學活性體和彼等之鹽也有同樣 之活性。 又其他環戊烯酮衍生物或其光學活性體和彼等之鹽也有 -52 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X297公董] ' -------- 1246919 A7 B7 五、 發明説明（50 ) 同樣之活性。 表1 0 組 投與量 平均生存曰數 延命率 30曰 (毫克/公斤） (曰） (%) 生存例數 對照 12.5 100 0 二丙酿 10 28.1 >225 6 環戊烯酮 二異丁醯 30 25.3 >202 3 環戊婦酮 10 17.0 136 0 表1 1 組 投與量 平均生存日數 延命率 30曰 (毫克/公斤） (曰） (%) 生存例數 對照 11.8 100 0 二丙酸 10 20.5 174 0 環戊晞酮 二異丁醯 10 15.5 132 0 環戊烯酮 表12 組 投與量 平均生存日數 延命率 30曰 (毫克/公斤） (曰） (%) 生存例數 對照 12.5 100 0 二丙酉S 30 24.1 >193 4 環戊婦酮 二異丁醯 100 20.9 167 0 環戊晞酮 30 15.1 121 0 表1 3 -53- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐) 1246919 A7 B7 2 五、發明説明（ 51 組 投與量 (毫克/公斤） W__ 11.8 100 二丙醯 環戊晞酮 30 17.3 >147 實施例1 4 注射劑 (1) 以1 %濃度於生理食鹽水中添加二異丁醯環戊缔酮、 二丙醯環戊烯酮或一甲氧環戊埽酮，作為注射劑。 (2) 分別以0.5%和0.1%濃度於生理食鹽水添^二甲基富 馬醯環戊晞酮或二甲基馬來醯環戊缔酮和甘草酸，作為& 射劑。 實施例1 5 錠劑 (1) 凋製含有100毫克一兴丁酿環戊缔嗣或二丙醯環戊晞 酮和適量微晶纖維素之錠劑，予以糖衣，作成各錠劑。 (2) 調製含有0.1毫克二甲基富馬醯環戊諦酮、1〇毫克甘 草酸二鉀和適量微晶纖維素之錠劑，予以糖衣，作成錠 劑。 如上所述，本發明提供具有強力調節免疫之作用、抗炎 症作用、抑制腫瘤壞死因子產生之作用、抗真菌之作用等 生理活性之環戊晞酮衍生物或其光學活性體或彼等之鹽。 以這些化合物為有效成份之醫藥可當作須調節免疫之疾 病、須抑制炎症之疾病、須抑制腫瘤壞死因子產生之疾 病、須抑制病原微生物之疾病等之治療劑或預防劑而為維 持生體恒常性有用之醫藥。 -54- 裝 訂 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) 規格(2ι〇 χ 297公釐）

Claims (1)

1. 1246919 、 A8 B8 ' C8 _ D8 六、申請專利範圍 1 · 一種用於須調節免疫之疾病、須抑制炎症之疾病、須抑 制腫瘤壞死因子產生之疾病、須抑制細胞接著之疾病或 須謗導熱休克蛋白之疾病之治療劑或預防劑，其特徵為 以選自二乙醯環戊婦酮、二丙醯環戊烯酮、二丁醯環戊 晞酮、二異丁醯環戊烯酮、二戊醯環戊晞酮、二己醯 環戊婦酮、二辛醯環戊烯酮、二癸醯環戊缔酮、雙十 四醯環戊婦酮、二甲氧乙醯環戊烯酮、二甲基富馬醯 環戊婦艱I、二甲基馬來酸環戊錦Γ g同、二己晞酸環戊 ~酮、一 -3-辛~醯5哀戊晞酮、二爷醯環戊晞酮或其光 學活性體或彼等之鹽之至少一種化合物為有效成份。 2 ·如申請專利範圍第1項之治療劑或預防劑，其係免疫調 節劑、抗炎症劑、腫瘤壞死因子產生抑制劑、細胞接 著抑制劑或熱休克蛋白誘導劑。