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WO2000009683A1 - Genes for detecting bacteria and detection method by using the same - Google Patents

Genes for detecting bacteria and detection method by using the same Download PDF

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Publication number
WO2000009683A1
WO2000009683A1 PCT/JP1999/004341 JP9904341W WO0009683A1 WO 2000009683 A1 WO2000009683 A1 WO 2000009683A1 JP 9904341 W JP9904341 W JP 9904341W WO 0009683 A1 WO0009683 A1 WO 0009683A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
gene
sequence
rrna
encoding
minutes
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP1999/004341
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Yasuo Motoyama
Tomoo Ogata
Kazuhisa Sakai
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Asahi Breweries Ltd
Original Assignee
Asahi Breweries Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Asahi Breweries Ltd filed Critical Asahi Breweries Ltd
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Priority to JP2000565120A priority patent/JP4022045B2/ja
Priority to CA002338015A priority patent/CA2338015A1/en
Priority to AU51961/99A priority patent/AU5196199A/en
Priority to EP99937021A priority patent/EP1106688A4/en
Publication of WO2000009683A1 publication Critical patent/WO2000009683A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Priority to US10/600,642 priority patent/US7160701B2/en
Priority to AU2003220730A priority patent/AU2003220730B2/en
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria

Definitions

  • the present invention relates to a gene for detecting the bacterium belonging to the genus Vectinatus, a bacterium belonging to the genus Vectinatus, to detect flissingen cis or Vectinatus cerevisiae, and a method for detecting the bacterium using the gene.
  • Pectimtus As a microorganism (bacteria) that makes beer turbid, a genus Pectimtus is known. This genus includes Pectinatus 'Flisingensis (Pectinatus frisingennsis) and Pectinatus' Senolevisiphilus (Pectina tus
  • DNA is extracted from the isolated bacteria, immobilized on a membrane or other support, and the hybridization test is performed using the DNA of the standard bacteria as a probe. Is performed to identify the bacterial species. However, this method also requires several days, and it is difficult to obtain sufficient detection sensitivity and selectivity.
  • the gene of the spacer region composed between the 16S rRNA gene and the 23S rRNA gene has a gene sequence specific to the microorganism species.
  • MICROBIOL. VOL.62, N0.5, 1683-1688 (1996), FEMS MICROBIOL LETT. VOL.84, N0.3 , 307-312 (1991), and JP-A-6-98800 but the gene sequence of the spacer region of the bacteria belonging to the genus Pectinatus has not been clarified.
  • the present invention provides a gene sequence of the spacer region composed between the 16 S rRNA gene and the 23 S rRNA gene, which is specific to the genus Pectinia ssp.
  • An object of the present invention is to provide a method that can quickly and sensitively detect the use of the DNA.
  • the first invention relates to a gene encoding 16 S rRNA of Pectinatus frisingensis containing a part or all of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and 23 S rRNA. This is the gene sequence of the spacer region between the gene to be coded.
  • the second invention relates to a gene encoding 16 S rRNA of Pectinimus frisingensis containing part or all of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 and encoding a 23 S rRNA of This is the gene sequence of the spacer region between the gene and the target gene.
  • the third invention relates to a gene encoding 16 S rRNA and a gene encoding 23 S rRNA of (Pectinatus cerevisiiphilus) containing a part or all of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3. The gene sequence of the region between the two.
  • the fourth invention relates to 16 S r of Pectinus cerevisiiphilus (ectinatus cerevisiiphilus) containing part or all of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4.
  • the fifth invention is Pectinatus
  • the sixth invention relates to Pectinatus (Pectinatus).
  • the gene sequence of the donor region between the gene to be loaded is the following sequence group,
  • the seventh invention provides a method for producing a nucleic acid sequence, comprising: making an oligonucleotide sequence prepared from the gene sequence described in (1) or (2) function as a primer for nucleic acid synthesis; This is a method for detecting flissingensis.
  • the eighth invention provides a method for producing Vectinus tass celli philus by making an oligonucleotide sequence prepared from the gene sequence described in (3) or (4) function as a primer for nucleic acid synthesis and subjecting it to gene amplification treatment. It is a method of detecting.
  • a ninth invention is directed to an oligonucleotide prepared from the gene sequence described in (1) or (2) or the oligonucleotide described in (5), and 16 S rRNA of Pectinus flisingensis.
  • vector nucleotides encoding genes are used as primers for nucleic acid synthesis, and gene amplification treatment is performed to detect vectorinus furissingensis.
  • the tenth invention relates to an oligonucleotide prepared from the gene sequence described in (3) or (4) or the oligonucleotide described in (6), and 16 S of P. cerevisiae.
  • a nucleotide sequence encoding the rRNA gene is caused to function as a primer for nucleic acid synthesis, and a gene amplification treatment is performed to detect V. cellus saccharophilus.
  • the eleventh invention is characterized in that the nucleotide sequence encoding the 16 S rRNA gene of P. tass flisingensis has the following sequence:
  • the twelfth invention is a nucleotide sequence encoding the 16 S rRNA gene of Pectinus tass cerevisiae, comprising the following sequence:
  • FIG. 1 is an electrophoretogram in Example 3.
  • FIG. 2 is an electrophoretogram in Example 5.
  • PCR Polymerase Chain Reaction method
  • This method is a reaction for amplifying a specific gene sequence, is rapid, has high sensitivity, high specificity, and is simple.It is not only in the genetic field but also in the medical field in recent years. It is also being applied to rapid determination and rapid detection of harmful bacteria in the food field.
  • the target nucleotide sequence between the two primers is amplified hundreds of times even if only a small amount is present in the sample, and a large number of copies are produced before detection is possible. Is done.
  • the PCR method To perform the PCR method, it is necessary to release nucleic acid components from the bacteria present in the sample.However, in the PCR method, if the target sequence is present in several or more molecules, the amplification reaction proceeds. A simple pretreatment with an agent is sufficient for the test. Therefore, the utility value is very high compared to the conventional bacteria detection method.
  • the present invention provides a method for encoding a gene encoding 16 S r RN of each of Actinata's flisingensis and a gene of 16 S r RN and a gene encoding 23 S r RNA.
  • the specimen may be beer and semi-finished products during beer production, or a sample taken from the environment such as sewage.
  • Oligonucleotides used as primers may be chemically synthesized or natural, and any of them may be used.
  • the following describes a method for detecting Pectinitas' flisingensis or Vectinitas, Cervisophilus using the PCR method.
  • the nucleotide sequences used in the PCR method are those shown in (5), (6), (11) and (12) above, and are by way of example, but not limited thereto.
  • the primer length used in the PCR method was 19 to 20 bases as described in (5), (6), (11) and (12), but is not limited to this. .
  • Preferably, one having a length of 10 to 50 bases is used.
  • the DNA fragment to be amplified in the case of the combination is approximately 700 base pairs and base pairs, and when these bands are detected by gel electrophoresis, vectorinus furissingensis is present. Can be determined. Any combination of these primers is specific for P. fusinagensis and can be used to detect this species. However, by using two sets in parallel, more reliable identification can be performed. By changing the nucleotide sequence of the primer used in the PCR method, the length of the nucleotide sequence to be amplified changes.
  • the DNA fragment amplified when primers (3) and (4) are combined is approximately 600 base pairs, and the DN amplified when (4) and (5) are combined.
  • the A fragment is approximately 650 base pairs
  • the amplified DNA fragment when 5 and ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ are combined is approximately 700 bp, and when these bands are detected by gel electrophoresis, Vectinatus. You can judge that you did. Any combination of these primers can be used for the detection of this species because they are specific to B. cerevisiae S. cerevisiae.However, the use of two or more sets in parallel makes it more reliable. Identification can be performed. By changing the nucleotide sequence of the primer used in the PCR method, the length of the nucleotide sequence to be amplified changes.
  • the temperature conditions for the PCR reaction are 90-98 ° C for the heat denaturation reaction that converts double-stranded DNA to single-stranded DNA (: 37-65 ° C for the annealing reaction that hybridizes to primer type I DNA), and DNA polymerase.
  • the target sequence can be amplified by performing a chain length reaction at 50 to 75 ° C, which is performed in a single cycle, and then performing several tens of cycles.After the PCR reaction, the reaction product is subjected to electrophoresis.
  • the nucleic acid is separated, stained with a nucleic acid, etc., and the nucleotide length of the amplified nucleotide sequence is equal to the nucleotide length of the target sequence described above, and it can be determined that the sample to be detected is present in the sample. Chromatography is also effective for detecting sequences.
  • SEQ ID NO: 1 has a sequence length of 624, a sequence type of nucleic acid, a double-stranded chain, a linear topology, and a genomic DNA sequence.
  • the origin is the sequence of Pectinatus flisingensis D SM6306.
  • SEQ ID NO: 2 has a sequence length of 442, a sequence type of nucleic acid, a double-stranded chain, a linear topology, and a genomic DNA sequence. Origin is the sequence of Pectinus flissingensis DSM6306.
  • ⁇ SEQ ID NO: 3 has a sequence length of 724, the sequence type is nucleic acid, the number of chains is double-stranded, the topology is linear, and the sequence type is genomic DNA.
  • the origin is the sequence of Vectinatus' Cervisophilus D SM20467.
  • SEQ ID NO: 4 has a sequence length of 399, a sequence type of nucleic acid, a double-stranded chain, a linear topology, and a genomic DNA sequence. Origin is the sequence of Pectinatus' S. cerevisiae DSM20467.
  • SEQ ID NO: 5 has a sequence length of 19, a sequence type of nucleic acid, a single strand number, a The lodge is linear chain, and the type of rooster is genomic DNA. Origin is the sequence of Pectinatus flissingensis DSM 6306.
  • SEQ ID NO: 6 has a sequence length of 20, a sequence type of nucleic acid, a single-stranded chain, a linear topology, and a genomic DNA sequence type.
  • the origin is the sequence of Pectinatus flissingensis D SM6306.
  • SEQ ID NO: 7 has a sequence length of 19, a sequence type of nucleic acid, a single-stranded chain, a linear topology, and a genomic DNA sequence. Origin is the sequence of Pectinatus' Cell Visophilus DSM20467.
  • SEQ ID NO: 8 has a sequence length of 20, a sequence type of nucleic acid, a single-stranded chain, a linear topology, and a genomic DNA sequence type.
  • the origin is the sequence of Pectinatus' Cell Visophilus D SM20467.
  • SEQ ID NO: 9 has a sequence length of 20, a sequence type of nucleic acid, a single-stranded chain, a linear topology, and a genomic DNA sequence type.
  • the origin is the sequence of Pectinatus' Cell Visophilus D SM20467.
  • SEQ ID NO: 10 has a sequence length of 20, a sequence type of nucleic acid, a single-stranded chain, a topology of linear, and a sequence type of genomic DNA.
  • the origin is the sequence of Pectinatus flisingensis DSM 6306.
  • SEQ ID NO: 11 has a sequence length of 20, a sequence type of nucleic acid, a single-stranded chain, a topology of linear, and a sequence type of genomic DNA. Origin is the sequence of Pectinus tas Cervisophilus D SM20467.
  • the bacteria belonging to the genus tos include ecl / 3ai (DSM6306) and Pectinatus cerevisiiphilus (DSM20467) were used.
  • Table 1 was used to confirm the specificity of the Pectinitas flisingensis and Vectinitas servicifilas primers shown in SEQ ID NOs: 5, 6, 7, 8, 9, 10, and 11 of the present invention.
  • Other bacteria shown in Table 1 were used. After culturing them in an appropriate growth medium, the cells were collected by centrifugation. After that, DNA extraction from the cells was performed according to the Neonatal Chemistry Experiment Course 2 Nucleic Acid I Separation and Purification p20 21 (edited by The Biochemical Society of Japan, Tokyo Kagaku Dojin) to obtain a DNA solution.
  • the nucleotide sequence of the 16 S ribosome RNA gene of Pectinatus flisingensis [International Journal of Systematic Bacteriology, Vol. 40, pp. 19-27 (1990)], and the nucleotide sequence at positions 557-576 The primer was selected based on that.
  • the nucleotide sequence of the 23 S ribosomal RNA gene of Pectinus flisingensis has been identified [Systematic Applied Microbiology, Vol. 15, pp. 487-501 (1992).
  • EMBL Accession number X48423X Primers were selected based on the first to twentieth base sequences to obtain the corresponding complementary sequences. The synthesis was outsourced to Sade Technology Co., Ltd.
  • This tube was set in an automatic gene amplifying device, Thermal Cycler (Perkin Elmer), and an amplification reaction was performed.
  • the reaction conditions were: denaturation at 94 ° for 2.5 minutes, followed by denaturation at 94 ° C for 30 seconds-annealing of primers at 55 ° C for 30 seconds ⁇ 72. C.
  • a 30-second synthesis reaction cycle was performed for 30 cycles.
  • the reaction solution of 5-1 was removed, agarose gel electrophoresis was performed, and DNA was stained with ethidium microbud mold to confirm the amplified DNA.
  • long bp
  • short about 140 Obp
  • the unreacted dNTPs were removed from the reaction solution after the completion of PCR using a high-purity PCR product bilifi- cation kit (Boehringer Mannheim).
  • plasmids were extracted from E. coli using a plasmid mini kit (QIAGEN). A portion of the resulting plasmid was removed and reacted with the restriction enzyme ⁇ coR I (Takara Shuzo) at 37 ° C for 60 minutes, followed by agarose gel electrophoresis and DNA staining with ethidium dipromide to insert the long. Was confirmed.
  • E. coli SO C medium (2. 0% Trypt one, 0. 5% Yeas t Ex tr ac t, 10. OmM NaC l, 2. 5 mM KC 1, 10.
  • the thus obtained plasmid was designated as type III, and subjected to a sequencing reaction.
  • the sequencing primer used was IRD41 Infared Dye Labeled M13 Forward primer and the IRD41 Infared Dye Labeled M13 Reverse primer (manufactured by Nisshinbo Co., Ltd., sold by Aroka Co., Ltd.), and the reaction solution was SequiTherm (registered trademark) Long-Read (registered trademark). Cycle Sequencing Kit-LC (manufactured by EPICENTRE TECHNOLOGIES) was used. The base sequence was determined using 4000L Long ReadIR (registered trademark) DNA Sequencing System (manufactured by LI-COR).
  • coli was added to S0C medium (2.0% Tryptone, 0.5% Yeast Extract, 10%). 0 mM NaC 1,2.5 mM KC 1 3 10.OmM MgC 1 2 -6H 2 0, 20.OmM g luc ose) 250; l, shake at 37 ° C for 60 minutes, then add 50 g / The cells were inoculated on an LB plate medium containing ml ampicillin and 4O ⁇ g / mlX-Ga1 and cultured at 37 ° C, and the resulting white colonies were cultured in 3 ml containing 50 ⁇ g / ml ambicillin; Inoculate liquid medium After culturing overnight, the plasmid was extracted from E.
  • the precipitate was added with 500% of 70% ethanol, centrifuged at 15,000 rpm for 15 minutes, the supernatant was removed, and the mixture was dried under reduced pressure for 10 minutes.
  • Sterile water was added to the precipitate to dissolve it, and reacted with a restriction enzyme XwaaI (Boehringer Mannheim) at 37 ° C for 60 minutes.
  • XwaaI Boehringer Mannheim
  • An equal volume of water-saturated ether was added to the recovered solution, mixed gently, and centrifuged at 15000 rpm for 15 minutes to remove the ether layer (upper layer).
  • the plasmid thus obtained was used as type I, and a sequence reaction was performed.
  • the sequencing primer is IRD41 Infared Dye Labeled M13 Forward Primer and IRD41 Infared Dye Labeled M13 Reverse Primer (Nisshinbo Manufacturing, sold by AROKA), and the reaction solution is SequiTherm (registered trademark) Long-Read (registered trademark). ) Cycle Sequencing Kit-LC (EPICENTRE TECHNOLOGIES) was used.
  • the base sequence was determined using 4000L Long ReadIR (registered trademark) DNA Sequencing System (manufactured by LI-COR).
  • SEQ ID NO: 2 shows the obtained gene sequence of the spacer region (short) between the gene encoding 16 S rRNA and the gene encoding 23 S rRNA of ⁇ Clinatas flisingensis.
  • the sequence specific for Pectinus flisingensis was identified using the following method. As a result, 377 to 395 in the gene sequence of the gene region of the spanner region between the gene encoding 16 S rRNA and the gene encoding 23 S rRNA of Vectinus tass flisingensis of SEQ ID NO: 1 And 195 to 213 on the gene sequence of the spacer gene between the gene encoding 16 S rRNA and the gene encoding 23 S rRNA of Actinus furissingensis of SEQ ID NO: 2. The first two sequences were selected. (SEQ ID NO: 5)
  • a specific primer shown in SEQ ID NO: 10 was selected from the gene sequence encoding 16 S rRNA of Vectinus tass flisingensis.
  • Example 1 The DNA solution of each bacterium prepared in Example 1 was subjected to PCR using the primers synthesized in Example 3 (SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 10). PCR is performed under the following temperature conditions:
  • reaction solution was subjected to electrophoresis on an agarose gel at a constant voltage of 100 V for 30 minutes.
  • pHY marker was also electrophoresed simultaneously as a molecular weight marker.
  • the gel was stained for 20 minutes in an ethidium bromide solution of about 0.5 ⁇ g / m 1, and the gel was observed under ultraviolet irradiation and photographed. From the observation or photograph of the gel, the base length of the amplification product was determined from the relative mobility to the molecular weight marker.
  • bands of about 700 bps and about 900 bps were detected only in Pectinatus' flissingensis.
  • each of the oligonucleotides of the present invention has a gene in the promoter region between the gene encoding 16 S rRNA and the gene encoding 23 S rRNA of P. fusidagensis. It was shown that the sequence and the target nucleotide sequence on the gene encoding 16 S rRNA were correctly recognized.
  • the present invention provides This indicates that it can be specifically detected, and that it can detect P. sinus flissingensis as well as identify it.
  • the nucleotide sequence of the 16 S ribosomal RNA gene of P. cerevisiae has been clarified [International Journal of Systematic Bacteriology] ⁇ Vol. 40, pp. 19-27 (1990)], and a primer was selected based on the nucleotide sequence at positions 557 to 576.
  • nucleotide sequence of the 23 ribosomal RNA gene of P. cinetus is not known, the nucleotide sequence of the 23 liposomal RNA gene of P. fusigengensis is not clear.
  • Systematic Applied Microbiology, Vol. 15, pp. 487-501 (1992), EMBL Accession number X48423] the first of the 23 ribosome RNA genes of Pectinetus flisingensis A primer was selected based on the 20th to 20th base sequences so as to obtain a corresponding complementary sequence. Synthesis was outsourced to Saddy Technology Co., Ltd. (2) PCR amplification of 16 S / 23 S r RNA spacer region
  • TP dCTP, dTTP 0.5 unit of 5 units / d tack-polymerase
  • HiS Example 2- add 0.5 / 1 each of 10 OmM primers prepared in (1) and sterile distilled Water was added to give a solution of 5. This tube was set in an automatic gene amplifying device, Thermo Cycler (Perkin Elmer), and an amplification reaction was performed.
  • the reaction conditions were as follows: 94 ° (: 2.5 min denaturation, 94 ° C, 30 sec denaturation ⁇ 55 ° C N 30 sec primer annealing-72.C, 30 sec synthesis reaction cycle After the reaction, 30 cycles were performed, 51 reaction solutions were taken, agarose gel electrophoresis was performed, and DNA was stained with ethidium gel, and amplified DNA was confirmed. bp (hereinafter “long”) and about 140 Obp (hereinafter “short”) DNA were amplified.
  • the unreacted dNTPs were removed from the reaction mixture after completion of the PCR using a high-purity PCR product Pyurifi-Caution Kit (Boehringer Mannheim).
  • a high-purity PCR product Pyurifi-Caution Kit Boehringer Mannheim.
  • 21 of plasmid pCR2.1, 1 of ligase, 1 1 of ligase, and 1 I of sterile water contained in TA cloning kit (INVITROGEN) was added to bring the total volume to 1 and allowed to react at 1 ° C for 4 hours.Then, add both 21 and 0.5M?
  • OmM MgC l 2 - 6H 2 ⁇ , 20 OmM glucose) Add 250 ⁇ 1, shake at 37 ° C for 60 minutes, inoculate on LB plate medium containing 50 g / ml ampicillin and 40 / g / mlX-Ga1, 37 ° C, Cultured overnight. The white colonies that appeared were inoculated into 3 ml of LB containing 5 O ⁇ g / ml ampicillin. C, cultured overnight.
  • plasmids were extracted from E. coli using a plasmid mini kit (QIAGEN). A portion of the resulting plasmid was removed, reacted with the restriction enzyme coRI (Takara Shuzo Co., Ltd.) at 37 ° (60 minutes), followed by agarose gel electrophoresis and DNA staining with ethidium bromide. 50 ng of the remaining plasmid was ligated to the restriction enzyme Sal (Toyobo). After reacting at 30 ° C for 60 minutes, add 3M sodium acetate 2 ⁇ 1, 100% ethanol, add 5 OJLI, keep on ice for 15 minutes, centrifuge at 15000 rpm for 15 minutes, and remove the supernatant. Removed.
  • the plasmid thus obtained was designated as type I, and a sequence reaction was performed.
  • the sequencing primer is IRD41 Infared Dye Labeled M13 Forward primer and the IRD41 Infared Dye Labeled Ml 3 Reverse primer (Nisshinbo Manufacturing, sold by AROKA), and the reaction solution is SequiTherm (registered trademark) Long-Read (registered). Trademark) Cycle Sequencing it-LC (manufactured by EPICENTER TECHNOLOGIES) was used. Base arrangement The sequence was determined using a 4000L Long ReadIR (registered trademark) DNA Sequencing System (manufactured by LI-C0R).
  • SEQ ID NO: 3 shows the obtained gene sequence of the spacer region (long) between the gene encoding 16 S rRNA and the gene encoding 23 S rRNA of Actinus cerevisiae.
  • Example 4 Unreacted dNTPs were removed from the reaction solution obtained after completion of the PCR in (2), using a high-purity PCR product visualization kit (Behringermanheim). Add 21 parts of plasmid pCR 2.1, 1 part of ligase, 11 parts of buffer, and 11 parts of sterile water to TA10 Cloning Kit (INVITROGEN) to amplified DNA10 Ong prepared in this way. Add to 10 ⁇ 1 and 14. After reacting for 4 hours, add both 21 and 0.5M ⁇ -mercaptoethanol 21 to E. coli INVaT competent cells, leave them on ice for 30 minutes, and treat them at 42 ° C for 30 seconds. Was transformed into plasmid. SO C media E. coli transformed (2.
  • Tr yp t one 0. 5% Yeast Extract, 10. OmM NaC 1, 2. 5mM KC1, 10. OmM MgC 1 2 - 6 H 2 0, 20.
  • OmM glucose (250 ⁇ 1) was added, and the mixture was shaken at 37 ° C for 60 minutes, inoculated on an LB plate medium containing 5 ml ambicilin and 40 ig / ml X-Ga1, and cultured at 37 ° C overnight. The white colonies that appeared were inoculated into 3 ml of LB liquid medium containing 5 ambicilin and cultured overnight at 37 ° C. After the culture, the plasmid was extracted from the E. coli using a plasmid kit (QIAGEN).
  • the precipitate was added with 50% 70% ethanol, centrifuged at 1500 Orpm for 15 minutes, the supernatant was removed, and the mixture was dried under reduced pressure for 10 minutes.
  • Bacterial water is added to the precipitate to dissolve it, and the enzyme is digested with the restriction enzyme BaHI (Takara Shuzo). (: 60 minutes)
  • the reaction solution was mixed with an equal volume of phenol / chloroform (equivalent mixture), mixed gently, and centrifuged at 15,000 rpm for 15 minutes to collect the aqueous layer (upper layer).
  • An equal volume of water-saturated ether was added to the recovered solution, mixed gently, and centrifuged at 15,000 rpm for 15 minutes to remove the ether layer (upper layer). 500% sodium 2-1 and 100% ethanol were added thereto, and the mixture was kept on ice for 15 minutes, and then centrifuged at 15000 rpm for 15 minutes to remove the supernatant.
  • OmM lucose 250 ⁇ 1 was added, shaken at 37 ° C for 60 minutes, inoculated on an LB plate medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin, and cultured at 37 ° C at ⁇ ° C.
  • the white colonies that appeared were inoculated into 3 ml of LB liquid medium containing 50 / g / ml ampicillin and cultured overnight at 37 ° C.
  • the plasmid was extracted from the E. coli using a plasmid kit (QIAGEN).
  • the plasmid thus obtained was designated as type I, and a sequence reaction was performed.
  • the sequencing primer was IRD41 Infared Dye Labeled M13 Forward Primer — and IRD41 Infared Dye Labeled Ml 3 Reverse Primer (manufactured by Nisshinbo Industries, Inc., sold by AROKA), and the reaction solution was SequiTherm® Long-Read® ) Cycle Sequencing it-LC (EPICENTER TECHNOLOGIES) was used.
  • the base sequence was determined using 4000L Long ReadIR (registered trademark) DNA Sequencing System (manufactured by LI-COR).
  • the resulting gene sequence of the spacer region (short) between the gene encoding 16 S rRNA and the gene encoding 23 S rRNA of P. cerevisiae is shown in SEQ ID NO: 4.
  • DNAS IS Haitachi Software Engineering Co., Ltd.
  • a specific primer shown in SEQ ID NO: 11 was selected from a gene sequence encoding 16 S rRNA of Vectinus tas cerevisiae. These oligonucleotides were chemically synthesized in the same manner as in Example 2- (1).
  • the reaction solution was subjected to electrophoresis on an agarose gel at a constant voltage of 100 V for 30 minutes.
  • pHY as well as molecular weight were also electrophoresed.
  • the gel was stained for 20 minutes in a solution of ethidium bromide (about 0), and the gel was observed under ultraviolet irradiation and photographed. From the observation or photograph of the gel, the base length of the amplification product was determined from the relative mobility with the molecular weight.
  • each oligonucleotide of the present invention encodes a gene sequence of a spacer region between a gene encoding 16 S rRNA of Actinus cerevisiae and a gene encoding 23 S rRNA, and encodes 16 S rRNA. Correct recognition of the target nucleotide sequence on the gene It has been shown.
  • the present invention provides It was shown that P. aureus could be detected in a species-specific manner, and that it was possible to detect Pectinatas s.
  • a gene in the splicer region constituted between the 16S rRNA gene and the 23S rRNA gene of Pectinatus 'Flisingensis and Vectinatas' cerevisiae is clarified.
  • a method for quickly and surely detecting P. fussgenus and P. cerevisiae using the whole or a part of the gene sequence was provided.

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Description

明細書
細菌検出のための遺伝子及びそれを用いた検出法
技術分野
本発明は、 ビール混濁菌ぺクチネータス属菌のべクチネ一タス 'フリシンゲン シスまたはべクチネータス 'セルビシフィラスを検出するための遺伝子及びこれ を用いた該菌の検出方法に関する。
背景技術
ビールを混濁させる微生物 （細菌） として、 ぺクチネータス Pectimtus)属 菌が知られている。 この属には、 ぺクチネータス 'フリシンゲンシス（ Pectinatus frisingennsis)とぺクチネータス 'セノレビシフィラス ( Pectina tus
cerevisiiphilus)の 2種が知られている。 ぺクチネー夕ス属菌の検出には、 増殖 培養、 分離培養をへて菌を単離しなければならず、 少なくとも 7日は要する。 そ の後、 単離した菌を増殖させ、 形態観察、 グラム染色性、 力タラ一ゼ試験、 糖資 化性など多くの性状試験を行うことにより同定を行っている。
これらの多岐にわたる検査は煩雑であり、 時間も費用もかかる。 また、 これら 一般に行われている同定試験のほかに、 単離した菌から DNAを抽出し、 それを膜 上あるいは他の支持体上に固定し、 標準菌の DNAをプローブとしてハイブリダィ ゼ一シヨン試験を行うことにより菌種を同定する方法がある。 しかし、 この方法 も数日を必要とし、 さらに十分な検出感度及び選択性を得るのが難しい。
そこで、 最近では、 ぺクチネータス属菌に関する検出法として、 ぺクチネ一夕 ス ·セルビシフィラスに特異的に反応するモノクローナル抗体を使用した検出法 (ASBC Journal : 51 (4)158-163, 1993) がある。 しかし、 本法は検出感度が不十分 であるばかりでなく、 ぺクチネ一タス ·フリシンゲンシスは検出できないという 問題があった。
また、 別の検出法として、 リボソーム R N A遺伝子の多型性を検出するリボ夕 ィビング (Ribotyping)法によりべクチネータス ·フリシンゲンシスとぺクチネ一 タス ·セルビシフィラスを検出する方法が報告されている
(J.Am. Soc. Chem. : 56( 1 )19-23, 1998)。 しかし、 本法の適用にあたっては菌の単 離操作が必要であることから、 検出感度、 迅速性に問題があった。
そこで、 さらに迅速な検出法が検討され、 最近では、 国際公開番号 W0 9 7 / 2 0 0 7 1の開示があり、 検体となる微生物の D N Aを抽出し、 この D N Aに相 補的なオリゴヌクレオチドをプライマ一として機能させた P C R法を用いたぺク チネ一ダスを検出する方法の報告がある。 しかしながら、 これらの技術に用いら れている 1 6 S r H N Aの塩基配列は微生物の属を越えて類似している場合があ り、 検出したい特定の微生物以外の 物も誤って検出してしまうという問題が あった。 —方、 1 6 S rRNA遺伝子と 23 S r RN A遺伝子の間に構成されているス ぺーサ一領域の遺伝子は微生物種に特異的な遺伝子配列を有することが知られて おり、 それを利用した微生物検出法として、 醸造論文集 50、 22-31 (1995)、 APPL.ENVIRON. MICROBIOL. VOL.62，N0.5, 1683-1688(1996)、 FEMS MICROBIOL LETT. VOL.84, N0.3，307-312(1991)、 特開平 6-98800等があるが、 ぺクチネータス属菌 のスぺーサ一領域の遺伝子配列は明らかにされていない。
発明の開示
そこで、 本発明では、 ビール混濁に関係するぺクチネ一夕ス属菌に特異的な 1 6 SrRNA遺伝子と 23 S rRNA遺伝子の間に構成されているスベーサー領 域の遺伝子配列を提供し、 その配列を用いて迅速に感度よく検出できる方法を提 供することを目的とする。
(1) 第 1の発明は、 配列番号 1に示される塩基配列の一部または全部を含むぺ クチネータス ·フリシンゲンシス (Pectinatus frisingensis) の 16 S rRN Aをコ一ドする遺伝子と 23 S rRNAをコ一ドする遺伝子との間のスぺ一サ一 領域の遺伝子配列である。
(2) 第 2の発明は、 配列番号 2に示される塩基配列の一部または全部を含むぺ クチネータス ·フリシンゲンシス (Pectiimtus frisingensis) の 16 S rRN Aをコードする遺伝子と 23 S rRN Aをコードする遺伝子との間のスぺ一サ一 領域の遺伝子配列である。
(3) 第 3の発明は、 配列番号 3に示される塩基配列の一部または全部を含むぺ クチネ一タス ·セルビシフィラス Pectinatus cerevisiiphilus) の 16 S rR NAをコードする遺伝子と 23 S rRNAをコードする遺伝子との間のスぺ一サ —領域の遺伝子配列である。
(4) 第 4の発明は、 配列番号 4に示される塩基配列の一部または全部を含むぺ クチネータス ·セリレビシフィラス ectinatus cerevisiiphilus) の 16 S r
RNAをコ一ドする遺伝子と 23 S rRNAをコ一ドする遺伝子との間のスぺー サ一領域の遺伝子配列である。
(5) 第 5の発明は、 ぺクチネ一タス 'フリシ、ノゲンシス Pectinatus
frisingensis) の 1 6 S rRNAをコ一卜 Tる遺伝子と 23 S rRN Aをコ一ド する遺伝子との間のスぺ一サ一領域の遺伝子配列が以下の配列群、
5' -CCATCCTCTTGAAAATCTC-35 ①
5' -TCTCRTCTCACAAGTTTGGC-35 ②
の少なくとも一つを有するか、 または対応する相補的配列を有することを特徴と するオリゴヌクレオチドである。
(6) 第 6の発明は、 ぺクチネ一タス 'セルビシフィラス (Pectinatus
cerevisiiphilus) の 1 6 S rRN Aをコ一ドする遺伝子と 23 S rRN Aをコ ードする遺伝子との間のスぺ一サ一領域の遺伝子配列が以下の配列群、
5， -CACTCTTACAAGTATCTAC-35 ③
55 -CCACAATATTTCCGACCAGC-3' @
55 -AGTCTTCTCTACTGCCATGC-3' ⑤
の少なくとも一つを有するか、 または対応する相補的配列を有することを特徴と するオリゴヌクレオチドである。
(7) 第 7の発明は、 （1)または (2)に記載された遺伝子配列より作製したオリゴヌ クレオチド配列を核酸合成のプライマ一として機能させ、 遺伝子増幅処理するこ とによってべクチネ一タス ·フリシンゲンシスを検出する方法である。
(8) 第 8の発明は、 （3)または (4)に記載された遺伝子配列より作製したオリゴ ヌクレオチド配列を核酸合成のプライマーとして機能させ、 遺伝子増幅処理する ことによってべクチネ一タス ·セルビシフィラスを検出する方法である。
(9) 第 9の発明は、 （1)または (2)に記載された遺伝子配列より作製したオリゴ ヌクレオチドあるいは（5)に記載されたオリゴヌクレオチドと、ぺクチネータス · フリシンゲンシスの 16 S rRN A遺伝子をコードするヌクレオチド配列を核酸 合成のプライマーとして機能させ、 遺伝子増幅処理することによってべクチネ一 タス ·フリシンゲンシスを検出する方法である。
(10) 第 10の発明は、 （3)または (4)に記載された遺伝子配列より作製したオリ ゴヌクレオチドあるいは (6)に記載されたオリゴヌクレオチドと、 ぺクチネ一夕 ス ·セルビシフィラスの 16 S rRN A遺伝子をコードするヌクレオチド配列を 核酸合成のプライマ一として機能させ、 遺伝子増幅処理することによってべクチ ネ一タス■セルビシフィラスを検出する方法である。
(11) 第 11の発明は、 ぺクチネ一タス ·フリシンゲンシスの 16 S rRNA遺 伝子をコ一ドするヌクレオチド配列が、 以下の配列、
B ' -CGTATCCAGAGATGGATATT-3' ⑥
を有することを特徴とするオリゴヌクレオチドである（9)の方法である。
(12) 第 12の発明は、 ぺクチネ一タス 'セルビシフィラスの 16 S rRN A遺 伝子をコ一ドするヌクレオチド配列が、 以下の配列、
55 -CGTATGCAGAGATGCATATT-3' ⑦
を有することを特徴とするオリゴヌクレオチドである（10)の方法である。
図面の簡単な説明
図 1は実施例 3における電気泳動図。
図 2は実施例 5における電気泳動図。
発明を実施するための最良の形態
遺伝子増幅に関する技術は既に公知であり、 Saikiらが開発した Polymerase Chain Reaction法 (以下、 PCR法と略す； Science 230,1350,1985) を基に行 うことができる。 一 この方法は、 特定の遺伝子配列を増幅させる反応で、 迅速'高感度で高い特異 性を持ち、 かつ簡便であることから、 遺伝学的分野のみならず、 近年は医療分野 におけ 、病原菌の迅速判定や、 食品分野における有害菌の迅速検出にも応用が試 みられている。 P C R法を行うことにより、 検体中に僅かな量しか存在していな くても、 2つのプライマ一が挟む標的ヌクレオチド配列は何百倍にも増幅され、 検出が可能までに大量にそのコピーが産生される。 また、 P C R法を行うには、 検体中に存在する菌から核酸成分を遊離させる必要があるが、 P C R法は標的配 列が数分子以上存在すれば増幅反応が進むので、 溶菌酵素や界面活性剤を用いた 簡便な前処理をするだけで十分に試験に供することができる。 そのため、 従来の 細菌検出法に比べ、 利用価値が非常に高 、。
これらのことを利用すべく、 本発明では、 ぺクチネータス 'フリシンゲンシス、 ぺクチネ一タス ·セルビシフィラス各々の 1 6 S r R N Αをコードする遺伝子と 2 3 S r R N Aをコ一ドする遺伝子の間のスぺ一サー領域の遺伝子配列を提供し、 これらから選択したオリゴヌクレオチドもしくは 1 6 S r R N A遺伝子をコード するヌクレオチド配列を P C R法の核酸合成のプライマ一として機能させ、 遺伝 子増幅処理することによって検体中にぺクチネータス · フリシンゲンシスあるい はべクチネータス ·セルビシフィラスが存在するか否かを迅速、 高感度に判定す る方法を開発した。
検体は、 ビール及びビール製造途中の半製品、 または下水などの環境から採取 されたサンプルでもよい。 また、 プライマーに用いるオリゴヌクレオチドは化学 合成されたものでも天然のものでも、 いずれの使用でも可能である。
発明を するための最良の形態
以下に、 P C R法を用いて、 ぺクチネィタス ' フリシンゲンシスあるいはべ クチネィタス ，セルビシフィラスを検出する方法を示す。 P C R法に用いた塩基 配列は、 さきの（5 )、 （6 )、 （11 )、 （12)に示したものは一例であり、 これに限定さ れるものではない。 また、 P C R法に用いるプライマー長は、 （5 )、 （6)、 （11 )、 ( 12)に記述したものは 1 9〜2 0塩基長であつたが、 これに限定されるものでは ない。 好ましくは、 1 0〜5 0塩基長のものを用いる。
P C R法を用いてぺクチネ一タス ' フリシンゲンシスを検出する場合、 ブラ イマ一として①と⑥を組み合わせた場合の増幅される D N A断片はおよそ 7 0 0塩基対およびおよそ 9 0 0塩基対、 レ. を組み合わせ場合の増幅される D N A断片はおよそ 7 0 0塩基対およびお ： 基対であり、 これらのバン ドがゲル電気泳動により検出されときはべクチネータス ·フリシンゲンシスが存 在していたと判定できる。 これらのプライマ一の組み合わせは、 いずれでもぺク チネータス ·フリシンゲンシス菌に特異的であるため、 この菌種の検出に利用で きるが、 2組を平行して使用することにより、 より確実な同定が行える。 PCR 法に用いるプライマーの塩基配列を変更させることで、 増幅されるヌクレオチド 配列の長さは変化する。
一方、 P CR法を用いてぺクチネータス 'セルビシフィラスを検出する場合、 プライマ一として③と⑦を組み合わせた場合の増幅される DNA断片はおよそ 600塩基対、 ④と⑦を組み合わせ場合の増幅される DN A断片はおよそ 65 0塩基対、 ⑤と⑦を組み合わせた場合の増幅される DN A断片はおよそ 700 塩基対であり、 これらのバンドがゲル電気泳動により検出されときはべクチネー タス .セルビシフィラスが存在していたと判定できる。 これらのプライマーの組 み合わせは、 いずれでもべクチネ一タス 'セルビシフイラス菌に特異的であるた め、 この菌種の検出に利用できるが、 2組以上を平行して使用することにより、 より確実な同定が行える。 P CR法に用いるプライマーの塩基配列を変更させる ことで、 増幅されるヌクレオチド配列の長さは変化する。
P C R反応における温度条件は、 2本鎖 D N Aを 1本鎖にする熱変性反応で 90〜98° (：、 プライマ一錶型 DNAにハイブリダィズさせるアニーリング反 応で 37〜65°C、 DNAポリメラ一ゼを作用させる鎖長反応で 50〜75°C で行い、 これを 1サイクルとしたものを数十サイクル行わせることにより、 標的 配列を増幅させることができる。 PCR反応後、反応物を電気泳動により分離し、 ェチジゥムブ口マイド等で核酸染色を い、 増幅されたヌクレオチド配列の塩基 長が、 上述の標的配列の塩基長と等しければ検体中に検出対象の菌が存在すると 判定できる。 増幅されたヌクレオチド配列の検出には、 クロマトグラフィーも有 効である。
本発明の配列表について説明する。
配列番号 1は、 配列の長さが 624、 配列の型が核酸、 鎖の数が二本鎖、 ト ポロジ一が直鎖状、 配列の種類が genomic DNA。 起源がぺクチネータス ·フ リシンゲンシス D SM6306の配列である。
配列番号 2は、 配列の長さが 442、 配列の型が核酸、 鎖の数が二本鎖、 ト ポロジ一が直鎖状、 配列の種類が genomic DNA。 起源がぺクチネー夕ス ·フ リシンゲンシス DSM6306の配列である。
· 配列番号 3は、 配列の長さが 724、 配列の型が核酸、 鎖の数が二本鎖、 ト ポロジ一が直鎖状、 配列の種類が genomic DNA。 起源がベクチネータス 'セ ルビシフィラス D SM20467の配列である。
配列番号 4は、 配列の長さが 399、 配列の型が核酸、 鎖の数が二本鎖、 ト ポロジ一が直鎖状、 配列の種類が genomic DNA。 起源がぺクチネータス 'セ ソレビシフィラス DSM20467の配列である。
配列番号 5は、 配列の長さが 19、 配列の型が核酸、 鎖の数が一本鎖、 トポ ロジ一が直鎖牧、 酉己列の種類が genomic DNA。 起源がぺクチネータス ·フリ シンゲンシス D S M 6306の配列である。
配列番号 6は、 配列の長さが 20、 配列の型が核酸、 鎖の数が一本鎖、 トポ ロジ一が直鎖状、 配列の種類が genomic DNA。 起源がぺクチネータス ·フリ シンゲンシス D SM6306の配列である。
配列番号 7は、 配列の長さが 19、 配列の型が核酸、 鎖の数が一本鎖、 トポ ロジ一が直鎖状、 配列の種類が genomic DNA。 起源がぺクチネータス 'セル ビシフィラス DSM20467の配列である。
配列番号 8は、 配列の長さが 20、 配列の型が核酸、 鎖の数が一本鎖、 トポ ロジ一が直鎖状、 配列の種類が genomic DNA。 起源がぺクチネータス 'セル ビシフィラス D SM20467の配列である。
配列番号 9は、 配列の長さが 20、 配列の型が核酸、 鎖の数が一本鎖、 トポ ロジ一が直鎖状、 配列の種類が genomic DNA。 起源がぺクチネータス 'セル ビシフィラス D SM20467の配列である。
配列番号 10は、 配列の長さが 20、 配列の型が核酸、 鎖の数が一本鎖、 ト ポロジ一が直鎖状、 配列の種類が genomic DNA。 起源がぺクチネータス ·フ リシンゲンシス D SM 6306の配列である。
配列番号 1 1は、 配列の長さが 20、 配列の型が核酸、 鎖の数が一本鎖、 ト ポロジ一が直鎖状、 配列の種類が genomic DNA。 起源がぺクチネ一タス 'セ ルビシフィラス D SM20467の配列である。
以下、 本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、 本発明はこれら実施 例に限定されるものではない。
魏例 1
検体の調製
tos属に属する菌としては、 尸 ecl/3ai
Figure imgf000008_0001
(DSM6306)、 Pectinatus cerevisiiphilus (DSM20467)を使用した。 また、 本発明の配列番号 5、 6、 7、 8、 9、 10、 1 1に示したぺクチネィタス ·フリシンゲンシスお よびべクチネィタス ·セルビシフィラスプライマーの特異性を確かめるために、 表 1に示す他の細菌を使用した。これらを適当な増殖用培地にて培養を行った後、 菌体を遠心操作により回収した。 その後、 菌体からの DNA抽出は、 新生化学実 験講座 2 核酸 I 分離精製 p20 21 (日本生化学会編、 東京化学同人） に従って 行い、 DN A溶液を得た。
表 1
Figure imgf000009_0001
実施例 2
ベクチネータス ·フリシンゲンシスの 16 S r RNAをコードする遺伝子と 23 S rRNAをコードする遺伝子との間のスぺ一サ一領域のクロ一ニング及び 塩基配列の決定 - (1) PCR法による 16 S/23 S rRNAスぺーサ一領域の増幅のためのォ リゴヌクレオチドプライマ一の選定および合成
ぺクチネータス ·フリシンゲンシスの 16 Sリボソーム RN A遺伝子は塩基配列 が明らかにされており 〔インターナショナル ジャーナル ォブ システマティ ック ノ、'クテリオロジー (International Journal of Systematic Bacteriology)ヽ 第 40巻、 第 19〜27頁 （ 1990)〕、 557番目〜 576番目の塩基配列を もとにプライマ一を選定した。
ぺクチネータス ·フリシンゲンシスの 23 Sリボソーム RN A遺伝子は塩基配 列が明らかにされており 〔システマティック アプライ ド マイクロバイオロジ -(Systematic Applied Microbiology), 第 15卷、 第 487〜 501頁 （19 92)、 EMBL Accession number X48423X 1番目〜 20番目の塩基配列をもとに 対応する相補的配列になるようにプライマーを選定した。 合成はサヮディーテク ノロジ一 （株） に委託した。
(2) PCR法による 16 S/23 S r RN Aスぺ一サー領域の増幅
実施! ¾1で調製したぺクチネ一タス ·フリシンゲンシスの DNA溶液 0. 1 〃gを 0. 2ml用チューブ （パーキンエルマ一社） に取り、 rTaq DN A Po lymerase K i t (東洋紡社） 中の 10 xバッファーを 5〃し 3 1の 25mM MgC 12、 5 1の 2 mM d N T P混合液 （ d A T P、 dG TPs dCTP、 dTTP)、 0. 5 1の 5ユニット/ 1のタック一ポリメ ラーゼ、 実施例 2— （1) で調製した濃度 10 OmMプライマ一を各々 0. 5 ^1を加え、 これに滅菌蒸留水を加えて 50 1の溶液にした。 このチューブを 自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラ一 （パーキンエルマ一社） にセットし増幅 反応を行った。 反応条件は、 94° 2. 5分間の変性後、 94°C、 30秒間 の変性— 55°C、 30秒間のプライマーのァニ一リング→72。C、 30秒間の 合成反応のサイクルを 30サイクル行った。 反応後 5〃1の反応液を取り、 ァガ ロースゲル電気泳動を行い、 ェチジゥムブ口マイ ドで DN Aを染色して、 増幅さ れた DN Aを確認した。 その結果、 約 1600 bp (以下 「ロング」 と称す） と 約 140 Obp (以下 「ショート」 と称す） の DNAが増幅された。
( 3 ) スぺ一サ一領域口ングのクロ一ニング及びシークェンシング
PCR終了後の反応液を、 ハイ ピュア PCR プロダクト ビユリフィケ イシヨン キット （ベーリンガーマンハイム社） を用い、 未反応の dNTPsを除去 した。 このように調製した増幅 DNA10 Ongに TA クローニング キット (INVI TROGEN社） に含まれるプラスミ ド pCR2. 1を 2 1、 リガ —ゼを 1 1、 バッファ一を 1 ^1、 滅菌水を全量 10 1になるように加え、 1 4°C、 4時間反応させた後、 その と 0. 5M —メルカプトエタノール 2 1をともに大腸菌 INVひ' Fコンビテントセルに加え、 氷中、 30分間放置し た後、 42°C；、 30秒間熱処理し、 大腸菌へのプラスミ ドの形質転換を行った。 形質転換した大腸菌に SO C培地 （2. 0% Tryp t one, 0. 5% Y east Ext ract, 10. OmM NaCl, 2. 5 mM KC 1, 1 0. OmM MgC 12- 6 H20, 20. 0 mM glucos e) 250 ^1 を加え、 37° (：、 60分間振とうした後、 50〃g/mlアンピシリンおよび 40 g/m IX-Ga 1を含む L B平板培地に植菌し、 37 °C、 一晚培養し た。 現れた白色のコロニーを 50〃 g/m 1アンピシリンを含む 3mlの LB 液 咅地に接種し、 37°C、 一晚培養した。
培養後、 大腸菌よりプラスミ ド ミニ キット （Q I AGEN社） を用いて、 プラスミドを抽出した。 得られたプラスミ ドの一部を取り、 制限酵素 ^coR I (宝酒造社） により 37°C、 60分間反応させた後ァガロース電気泳動、 ェチ ジゥムプロマイドによる DNAの染色により、 ロングが挿入されていることを確 認した。 残りのプラスミ ドのうち 50 Ongを制限酵素 Sfflal (東洋紡社） に より、 30°C、 60分間反応させた後、 3M 酢酸ナトリウム 2〃し 100% エタノールを 500 zlを加え、 氷中に 15分間保持した後、 15000 rpm、 15分間遠心し、 上清を除いた。 に 70%エタノールを 500 /1を加え、 1 5000 rpm、 15分間遠心し、 上清を除き、 10分間減圧乾燥を行った。 この沈殿に滅菌水を加えて溶解し、 制限酵素 ゎ aェ （ベ一リンガーマンハイム 社） により、 37°C、 60分間反応させた。 この反応液に等量のフエノール/ クロ口ホルム （等量混合液） を加え穏やかに混合し、 15000 rpm、 15分 間遠心し水層 （上層） を回収した。
この回収液に等量の水飽和エーテルを加え穏やかに混合し、 15000 rp m、 15分間遠心しエーテル層 （上層） を除去した。 残りの水層に 3 M 酢酸ナ トリウム 100%エタノールを 500^1を加え、 氷中に 15分間保持 した後、 15000 rpm、 15分間遠心し、 上清を除いた。 «に 70%エタ ノールを 500/21加え、 1 5000 rpm、 1 5分間遠心し、 上清を除き、 1 0分間減圧乾燥を行った後、 滅菌蒸留水 20〃1を加えた。 この溶液 5 1にブ ランティングキット （宝酒造社） に含まれる 10 Xバッファ一を 1 1、 滅菌蒸 留水を を加え、 70°Cで 5分間保温した後、 T4 DNA ポリメラ一ゼ を加え、 37°C、 5分間保温することにより、 末端平滑ィ匕を行った。 撹拌 により T4 DNA ポリメラ一ゼを失活させた後、 L i gat i on So l ut i on Aを 40 ^1、 L i gat i on S o lut i on Bを
1加え、 16°Cで 30分間保温することにより分子内ライゲ一シヨンを行った。 この反応液 2^1と 0. 5M 5—メルカプトエタノール をともに大腸 菌 INVひ Tコンビテントセルに加え、 氷中、 30分間放置した後、 42°C、 30 秒間熱処理し、 大腸菌へのプラスミ ドの形質転換を行った。形質転換した大腸菌 に SO C培地 （2. 0% Trypt one, 0. 5% Yeas t Ex t r ac t, 10. OmM NaC l, 2. 5 mM KC 1, 10. OmM MgC 12-6H20, 20. OmM glu c o s e) 250 1を加え、 37°C、 6 0分間振とうした後、 5 O ig/mlアンピシリンを含む LB平板培地に植菌 し、 37 、 一晩培養した。 現れた白色のコロニーを 50 g/mlアンピシ リンを含む 3 mlの LB液体培地に接種し、 37°C、 一晩培養した。 培謝き、 大腸菌よりプラスミ ド ミニ キット （QI AGEN社） を用いて、 プラスミド を抽出した。
このようにして得られたプラスミドを錡型とし、 シーケンス反応を行った。 シ ーケンシングプライマーは IRD41 Infared Dye Labeled M13 Forward プライマ --および IRD41 Infared Dye Labeled M13 Reverse プライマー （日清紡製造、 ァロカ （株） 販売） を、 反応液は SequiTherm (登録商標） Long-Read (登録商標） Cycle Sequencing Kit-LC (EPICENTRE TECHNOLOGIES社製） を使用した。 塩基配 列決定は、 4000L Long ReadIR (登録商標） DNA Sequencing System (LI- COR社 製） を用いた。
得られた Pectinatus frisingensis DSM6306菌の 16 S rRNAをコードする 遺伝子と 23 SrRN Aをコードする遺伝子との間のスぺ一サー領域 （ロング） の遺伝子配列を配列番号 1に示す。
(4) スぺ一サー領域ショートのクローニング及びシークェンシング
実施例 2— (2) の PC R終了後の反応液を、 ハイ ピュア PCR プロ ダクト ピユリフィケイシヨン キット （ベ一リンガーマンハイム社） を用い、 未反応の dNTPsを除去した。 このように調製した増幅 DNA10 Ongに TA クローニング キット （INVI TROGEN社） に含まれるプラスミ ド pCR 2. 1を 2〃1、 リガーゼを 1〃1、 バッファ一を 1 1、 滅菌水を全量 10〃1 になるように加え、 14° (、 4時間反応させた後、 その と 0. 5M β— メルカプトエタノール 2 /1をともに大腸菌 INVa'Fコンビテントセルに加え、 氷中、 30分間放置した後、 42°C、 30秒間»理し、 大腸菌へのプラスミ ドの形質転換を行った。 形質転換した大腸菌に S0C培地 （2. 0% Tryp t one, 0. 5 % Ye as t Ext ra c t, 10. 0 mM NaC 1, 2. 5mM KC 13 10. OmM MgC 12-6H20, 20. OmM g luc o s e) 250 ; lを加え、 37°C、 60分間振とうした後、 50 g/ mlアンピシリンおよび 4 O ^g/mlX— Ga 1を含む LB平板培地に植菌 し、 37°C、 ー晚培養した。 現れた白色のコロニーを 50〃g/mlアンビシ リンを含む 3mlの； LB液体培地に接種し、 37°C、 一晩培養した。 培養後、 大腸菌よりプラスミ ド ミニ キット （QI AGEN社） を用いて、 プラスミ ド を抽出した。 - 得られたプラスミ ドの一部を取り、 制限酵素 £"coRI (宝酒造社） により 37°C、 60分間反応させた後ァガロース電気泳動、 ェチジゥムプロマイドに よる DNAの染色により、 ショートが挿入されていることを確認した。 残りのプ ラスミドのうち 50 Ongを制限酵素 S al (東洋紡社） により、 30°C、 60分間反応させた後、 3 M 酢酸ナトリウム 2 1、 100%エタノールを 5 00 1を加え、 氷中に 1 5分間保持した後、 15000 rpm、 15分間遠心 し、 上清を除いた。 沈殿に 70%エタノールを 500〃1を加え、 15000 r pm、 15分間遠心し、 上清を除き、 10分間減圧乾燥を行った。 この沈殿に滅 菌水を加えて溶解し、 制限酵素 Xわ a I (ベーリンガーマンハイム社） により、 37°C、 60分間反応させた。 この反応液に等量のフエノール/クロ口ホルム (等量混合液） を加え穏やかに混合し、 15000 rpm、 15分間遠心し水層 (上層）を回収した。この回収液に等量の水飽和エーテルを加え穏やかに混合し、 1 5000 r pm、 15分間遠心しエーテル層 （上層） を除去した。
残りの水層に 3 M 酢酸ナトリウム 2 l、 100%エタノールを 500 1を 加え、 氷中に 15分間保持した後、 1 5000 rpm、 15分間遠心し、 上清を 除いた。 沈殿に 70%エタノールを 500〃1加え、 15000 rpm、 1 5分 間遠心し、 上清を除き、 1 0分間減圧乾燥を行った後、 滅菌蒸留水 20^1を加 えた。 この溶液 5〃1にブランティングキット （宝酒造社） に含まれる 10 Xバ ッファーを 1 1、 滅菌蒸留水を全量 3〃1を加え、 70°Cで 5分間保温した後、 T4 DNA ポリメラ一ゼ 1 zlを加え、 37° 5分間保温することにより、 末端平滑ィヒを行った。 撹拌により T4 DNA ポリメラ一ゼを失活させた後、 L i gat i on S o lut i on Aを 40/il、 L i gat i on S o lut i on Bを 10 l加え、 1 6 °Cで 30分間保温することにより分子内 ライゲ一シヨンを行った。 この反応液 2〃1と 0. 5M ?—メルカプトェ夕ノ —ル 2〃1をともに大腸菌 INVo:Tコンビテントセルに加え、 氷中、 30分間放 置した後、 42°C、 30秒間熱処理し、 大腸菌へのプラスミ ドの形質転換を行 つた。
形質転換した大腸菌に SO C培地（2. 0% Tr yp t one, 0. 5% Y e as t Ext ra c t , 10. OmM NaC l， 2. 5 mM KC 1} 1 0. OmM MgC 12- 6 H203 20. OmM gluc o s e) 250 / 1 を加え、 37°C、 60分間振とうした後、 50 /g/mlアンピシリンを含む LB平板培地に植菌し、 37°C、 一晩培養した。 現れた白色のコロニーを 50 g/mlアンピシリンを含む 3mlの LB液体培地に接種し、 37°C、 一晩 培養した。 培養後、 大腸菌よりプラスミ ド ミニ キット （QI AGEN社） を 用いて、 プラスミ ドを抽出した。
このようにして得られたプラスミ ド—を錶型とし、 シーケンス反応を行った。 シ —ケンシングプライマ一は IRD41 Infared Dye Labeled M13 Forward プライマ 一および IRD41 Infared Dye Labeled M13 Reverse プライマ一 （日清紡製造、 ァロカ （株） 販売） を、 反応液は SequiTherm (登録商標） Long-Read (登録商標） Cycle Sequencing Kit-LC (EPICENTRE TECHNOLOGIES社製) を使用した。 塩基配 列決定は、 4000L Long ReadIR (登録商標） DNA Sequencing System (LI- COR社 製） を用いた。
得られたぺクリネータス ·フリシンゲンシスの 16 S rRNAをコードする遺 伝子と 23 S rRNAをコードする遺伝子の間のスぺーサー領域 （ショート） の 遺伝子配列を配列番号 2に示す。
実施例 3
P CR法によるべクチネ—タス ·フリシンゲンシスの検出
( 1) ぺクチネ一タス ·フリシンゲンシスのためのプライマーの選定と合成 配列番号 1、 2を基に DNAS I S (日立ソフトウェアエンジニアリング
(株））を用いてぺクチネータス ·フリシンゲンシスに特異的な配列を^ ΐした。 その結果、 配列番号 1のべクチネ一タス ·フリシンゲンシスの 16 S rRNAを コードする遺伝子と 23 S rRNAをコードする遺伝子の間のスぺ一サ一領域の 遺伝子配列上の 377番目から 395番目までの配列、 および配列番号 2のぺク チネータス ·フリシンゲンシスの 16 S rRNAをコードする遺伝子と 23 S r RN Aをコードする遺伝子の間のスベーサー領域の遺伝子配列上の 195番目か ら 2 13番目までの配列を選定した。 （配列番号 5)
また、 同様の解析により、 配列番号 1のぺクチネ一タス 'フリシンゲンシス の 16 S rRNAをコードする遺伝子と 23 S r R N Aをコードする遺伝子の間 のスぺーサー領域の遺伝子配列上の 36 1番目から 380番目までの配列、 およ び配列番号 2のぺクチネ一タス ·フリシンゲンシスの 16 S rRNAをコ一ドす る遺伝子と 23 S rRNAをコードする遺伝子の間のスベーサ一領域の遺伝子配 列上の 179番目から 198番目までの配列を選定した。 （配列番号 6)
さらにべクチネ一タス ·フリシンゲンシスの 16 S rRNAをコードする遺伝 子配列より、 配列番号 10に示す特異的プライマ一を選定した。
これらのオリゴヌクレオチドを 例 2— ( 1 )と同様の方法で化学合成した。
(2) 配列番号 6および配列番号 10の配列をもつプライマ一を用いたぺクチネ 一タス 'フリシンゲンシスの検出及び同定。
実施例 1で調製した各菌の DN A溶液を、 実施例 3で合成したプライマー （配 列番号 6および配列番号 10) を用いて PCRを行った。 PCRは以下の温度条 件：
熱変性； 94°C 30秒
ァニーリング； 55°C 30秒
鎖長反応； 72°C 30秒
を 1サイクルとし、 これを 35サイクル繰り返して行った。 PCR終了後、 反応 液をァガロースゲルにて、 100 V定電圧で 30分間電気泳動に供した。 反応液 の他に、 分子量マーカ一として pHYマーカ一も同時に泳動した。 泳動終了後、 約 0. 5〃 g/m 1のェチジゥムブロマイド溶液中で 20分間染色した後、 紫 外線照射下でゲルを観察し、 写真撮影を行った。 ゲルの観察または撮影した写真 より、 増幅産物の塩基長を分子量マーカ一との相対移動度から求めた。
その結果、 図 1に示されるように、 ぺクチネータス 'フリシンゲンシスにのみ およそ 700 bpsとおよそ 900 bp sのバンドが検出された。
この結果より、 本発明の配列番号 6及び配列番号 10のオリゴヌクレオチドを PCRプライマーとして用いた場合、 ぺクチネータス ·フリシンゲンシスにのみ 目的長のバンドが検出された。このことより、本発明の各オリゴヌクレオチドが、 ぺクチネ一タス ·フリシンゲンシスの 16 S rRNAをコードする遺伝子と 23 S r RNAをコ一ドする遺伝子の間のスぺ一サ一領域の遺伝子配列および 16 S rRNAをコードする遺伝子上の標的とする塩基配列を正しく認識していること が示された。 かつ、 同属のぺクチネータス 'セルビシフィラスを始め、 近縁な偏 性嫌気性菌ゃグラム陽性菌にも目的長のバンドは一切検出されなかったことから、 本発明は、 ぺクチネータス 'フリシンゲンシスを種特異的に検出できることを示 し、 ぺクチネー夕ス ·フリシンゲンシスを検出できると同時に同定も行うことが 出来るものであることが示された。
実施例 4
ぺクチネ一タス ·セルビシフィラスの 16 S rRNAをコードする遺伝子と 23 S rRNAをコードする遺伝子の間のスぺ一サ一領域のクローニング及び塩基配 列の決定
(1) P C I法による 16 S/23 S rRNAスぺ一サ一領域の増幅のための ォリゴヌクレオチドプライマ一の選定および合成
ぺクチネ一タス ·セルビシフィラスの 16 Sリボソーム RN A遺伝子は塩基配 列が明らかにされており 〔インターナショナル ジャーナル ォブ システマテ イツク ノ クテリオロジ一 ( International Journal of Systematic Bacteriology)^ 第 40巻、 第 19〜 27頁 （1990)〕、 557番目〜 576番目の塩基配列を もとにプライマ一を選定した。
ぺクチネ一タス 'セルビシフィラスの 23リボソーム RN A遺伝子は塩基配列 が明らかにされていないが、 ぺクチネ一タス ·フリシンゲンシスの 23リポソ一 ム RNA遺伝子は塩基配列が明らかにされていることから 〔システマティック アプライド マイクロバイオロジー（Systematic Applied Microbiology), 第 1 5巻、 第 487〜 501頁 （1992)、 EMBL Access ion num b e r X48423〕、 ぺクチネ一タス · フリシンゲンシスの 23リボソーム R NA遺伝子の 1番目〜 20番目の塩基配列をもとに対応する相補的配列になるよ うにプライマ一を選定した。 合成はサヮディーテクノロジー （株） に委託した。 (2) P CR法による 16 S/23 S r RNAスベーサー領域の増幅
実施例 1で調製したぺクチネ一タス ·セルビシフィラスの DN A溶液 0. 1 〃gを 0. 2 ml用チューブ （パーキンエルマ一社） に取り、 rTaq DN A P o l yme ras e K i t (東洋紡社） 中の 10 xバッファーを 5 ^1、 の 25mM MgC 12、 5 / 1の 2 mMd N T P混合液 （ d AT P、 dG
TP dCTP、 dTTP)、 0. 5 1の 5ユニット/ dのタック一ポリメ ラーゼ、 HiS例 2— (1) で調製した濃度 10 OmMプライマ一を各々 0. 5 /1を加え、 これに滅菌蒸留水を加えて 5 の溶液にした。 このチューブを 自動遺伝子増幅装置サ一マルサイクラ一 （パーキンエルマ一社） にセットし増幅 反応を行った。 反応条件は、 94° (：、 2. 5分間の変性後、 94°C、 30秒間 の変性→55°CN 30秒間のプライマ一のアニーリング— 72。C、 30秒間の 合成反応のサイクルを 30サイクル行った。 反応後 5 1の反応液を取り、 ァガ ロースゲル電気泳動を行い、 ェチジゥムブ口マイ ドで DN Aを染色して、 増幅さ れた DN Aを確認した。 その結果、 約 1700 bp (以下 「ロング」 と称す） と 約 140 Obp (以下 「ショート」 と称す） の DNAが増幅された。
( 3 ) スぺ一サ一領域ロングのクローニング及びシ一クェンシング
PCR終了後の反応液を、 ハイ ピュア PCR プロダクト ピユリフィ ケイシヨン キット （ベーリンガーマンハイム社） を用い、 未反応の dNTPsを除 去した。 このように調製した増幅 DNA 100 ngに TA クローニング キッ ト （INVI TROGEN社） に含まれるプラスミ ド p CR 2. 1を 2 1、 リ ガーゼを 1〃1、 ノ、 'ッファーを 1 I、 滅菌水を全量 1 になるように加え、 1 °Cs 4時間反応させた後、 その 2 1と 0. 5M ?—メルカプトェタノ一 ル 2 1をともに大腸菌 INVひ Tコンビテントセルに加え、 氷中、 30分間放置 した後、 42°C、 30秒間熱処理し、 大腸菌へのプラスミ ドの形質転換を行つ た。形質転換した大腸菌に SO C培地（2.0% Tr ypt one, 0.5% Y eas t Ext rac t, 10. OmM NaC l, 2. 5 mM KC 1, 1 0. OmM MgC l2 - 6H2〇， 20. OmM gluc o s e) 250 ^1 を加え、 37°C、 60分間振とうした後、 50 g/mlアンピシリンおよび 40 /g/mlX— Ga 1を含む LB平板培地に植菌し、 37°C、 一晩培養し た。 現れた白色のコロニーを 5 O^g/mlアンピシリンを含む 3mlの LB 液 地に接種し、 37。C、 一晩培養した。
培養後、 大腸菌よりプラスミド ミニ キット （QI AGEN社） を用いて、 プラスミ ドを抽出した。 得られたプラスミ ドの一部を取り、 制限酵素 coRI (宝酒造社） により 37° (、 60分間反応させた後ァガロース電気泳動、 ェチ ジゥムブロマイ ドによる DNAの染色により、 ロングが挿入されていることを確 認した。 残りのプラスミドのうち 50 Ongを制限酵素 S al (東洋紡社） に より、 30°C、 60分間反応させた後、 3M酢酸ナトリウム 2〃1、 100% エタノールを 5 O OJLIを加え、 氷中に 15分間保持した後、 15000 rpm、 15分間遠心し、 上清を除いた。 «に 70%エタノールを 500〃1を加え、 15000 rpm、 15分間遠心し、 上清を除き、 10分間減圧乾燥を行った。 この沈殿に滅菌水を加えて溶解し、 制限酵素 ゎ a I (ベ一リンガーマンハイム 社） により、 37°C、 60分間反応させた。 この反応液に等量のフエノール/ クロ口ホルム （等量混合液） を加え穏やかに混合し、 15000 rpm、 15分 間遠心し水層 （上層） を回収した。 この回収液に等量の水飽和エーテルを加え穏 やかに混合し、 15000 r pm、 15分間遠心しエーテル層 （上層） を除去し た。 残りの水層に 3 M酢酸ナトリウム 2〃1、 100%エタノールを 500 1 を加え、 氷中に 15分間保持した後、 15000 rpm、 15分間遠心し、 上清 を除いた。
沈殿に 70%エタノールを 500 1加え、 15000 rpm、 15分間遠心 し、 上清を除き、 10分間減圧乾燥を行った後、 滅菌蒸留水 20^1を加えた。 この溶液 5 にブランティングキット （宝酒造社） に含まれる 1 Oxバッファ —を 1 1、 滅菌蒸留水を 3〃1を加え、 70°Cで 5分間保温した後、 T4 D NA ボリメラ一ゼ 1〃1を加え、 37°C、 5分間保温することにより、 末端平 滑化を行った。 撹拌により T4 DNA ポリメラ一ゼを失活させた後、 L i g at ion Solut ion Aを 40 l、 Ligat ion So lut ion Bを 10 zl加え、 16 °Cで 30分間保温することにより分子内ライゲ —シヨンを行った。 この反応液 2〃1と 0. 5M 5—メルカプトエタノール 2 1をともに大腸菌 INVひ Tコンビテントセルに加え、 氷中、 30分間放置した 後、 42°C、 30秒間熱処理し、 大腸菌へのプラスミドの形質転換を行った。 形質転換した大腸菌に SO C培地（2. 0% Tr yp t one, 0. 5% Y east Ext ract, 10. OmM NaCl， 2. 5 mM KC 1, 1 0. OmM MgCl2-6H203 20. OmM lucose) 25 を加え、 37°C、 60分間振とうした後、 5 O^g/mlアンピシリンを含む LB平板培地に植菌し、 37°C、 ー晚培養した。 現れた白色のコロニーを 50 ^gZmlアンピシリンを含む 3mlの LB液 咅地に接種し、 37°C、 一晩 培養した。 培養後、 大腸菌よりプラスミ ド ミニ キット （Q I AGEN社） を 用いて、 プラスミ ドを抽出した。
このようにして得られたプラスミ ドを錶型とし、 シーケンス反応を行った。 シ —ケンシングプライマ一は IRD41 Infared Dye Labeled M13 Forwardプライマ —および IRD41 Infared Dye Labeled Ml 3 Reverseブライマ一 （日清紡製造、 ァロカ （株） 販売） を、 反応液は SequiTherm (登録商標） Long-Read (登録商標） Cycle Sequencing it-LC (EPICENTRE TECHNOLOGIES社製） を使用した。 塩基配 列決定は、 4000L Long ReadIR (登録商標） DNA Sequencing System (LI-C0R社 製） を用いた。
得られたぺクチネ一タス ·セルビシフィラスの 16 S rRNAをコードする遺 伝子と 23 S rRNAをコードする遺伝子の間のスぺ一サー領域 （ロング） の遺 伝子配列を配列番号 3に示す。
(4) スぺ一サ一領域ショートのクローニング及びシークェンシング
実施例 4一 (2)の PCR終了後の反応液を、 ハイ ピュア PCR プロ ダクト ビユリフィケイシヨン キット （ベ一リンガーマンハイム社） を用い、 未反応の dNTPsを除去した。 このように調製した増幅 DNA10 Ongに TA クロ一ニング キット （INVI TROGEN社） に含まれるプラスミ ド pCR 2. 1を 2 1、 リガ一ゼを 1〃1、 バッファ一を 1 1、 滅菌水を全量 10〃1 になるように加え、 14。 4時間反応させた後、 その 2 1と 0. 5M β— メルカプトエタノール 2 1をともに大腸菌 INVaTコンビテントセルに加え、 氷中、 30分間放置した後、 42°C、 30秒間^理し、 大腸菌へのプラスミ ドの形質転換を行った。 形質転換した大腸菌に SO C培地 （2. 0% Tr yp t one, 0. 5 % Yeast Extract, 10. OmM NaC 1, 2. 5mM KC1， 10. OmM MgC 12- 6 H20, 20. OmM g luc o s e) 250^1を加え、 37°C、 60分間振とうした後、 5 mlアンビシリンおよび 40 ig/mlX— Ga 1を含む LB平板培地に植菌 し、 37° 一晩培養した。 現れた白色のコロニーを 5 アンビシ リンを含む 3mlの LB液体培地に接種し、 37°C、 一晩培養した。 培養後、 大腸菌よりプラスミ ド キット （QIAGEN社） を用いて、 プラスミ ドを抽出 した。
得られたプラスミ ドの一部を取り、 制限酵素 icoRI (宝酒造社） により 37°C、 60分間反応させた後ァガロース電気泳動、 ェチジゥムプロマイドに よる DNAの染色により、 ショートが挿入されていることを確認した。 残りのプ ラスミ ドのうち 50 Ongを制限酵素 Smal (東洋紡社） により、 30° 60分間反応させた後、 3 M酢酸ナトリウム 2^1、 100%エタノールを 5 00^1を加え、 氷中に 15分間保持した後、 15000 r pm、 15分間遠心 し、 上清を除いた。 沈殿に 70%エタノールを 50 を加え、 1500 Or pm、 15分間遠心し、 上清を除き、 10分間減圧乾燥を行った。 この沈殿に滅 菌水を加えて溶解し、 制限酵素 Ba HI (宝酒造社） により、 37。 (：、 60 分間反応させた。 この反応液に等量のフエノール/クロ口ホルム （等量混合液） を加え穏やかに混合し、 15000 rpm、 15分間遠心し水層 （上層） を回収 した。 この回収液に等量の水飽和エーテルを加え穏やかに混合し、 15000 Γ pm、 15分間遠心しエーテル層 （上層） を除去した。 残りの水層に 3 M酢酸 ナトリウム 2〃1、 100%エタノールを 500 1を加え、 氷中に 15分間保 持した後、 15000 r pm、 15分間遠心し、 上清を除いた。
沈殿に 70%エタノールを 500 1加え、 15000 rpm、 15分間遠心 し、 上清を除き、 10分間減圧乾燥を行った後、 滅菌蒸留水 20 1を加えた。 この溶液 5 1にブランティングキット （宝酒造社） に含まれる 10 Xバッファ 一を 1〃1、滅菌蒸留水を全量 3 1を加え、 70°Cで 5分間保温した後、 T4 D NA ポリメラ一ゼ 1〃1を加え、 37°C、 5分間保温することにより、 末端平 滑化を行った。 撹拌により T4 DNA ポリメラ一ゼを失活させた後、 Lig at ion Solut ion Aを 40 1、 Ligat ion Solut ion Bを 10 1加え、 16°Cで 30分間保温することにより分子内ライゲ ーシヨンを行った。 この反応液 2〃1と 0. 5M 5—メルカプトエタノール 2 〃1をともに大腸菌 INVひ Tコンビテントセルに加え、 氷中、 30分間放置した 後、 42°C、 30秒間熱処理し、 大腸菌へのプラスミ ドの形質転換を行った。 形質転換した大腸菌に SO C培地 （2. 0% Tr yp t one, 0. 5% Y east Extract, 10. OmM NaC 1, 2. 5 mM KC 1, 1 0. OmM MgCl2 - 6H20, 20. OmM lucose) 250^1 を加え、 37°C、 60分間振とうした後、 50〃g/mlアンピシリンを含む LB平板培地に植菌し、 37°C、 ー晚培養した。 現れた白色のコロニーを 50 /g/mlアンピシリンを含む 3mlの LB液体培地に接種し、 37°C、 一晩 培養した。培養後、 大腸菌よりプラスミ ド キット （QI AGEN社） を用いて、 プラスミ ドを抽出した。
このようにして得られたプラスミ ドを鎵型とし、 シーケンス反応を行った。 シ ーケンシングプライマーは IRD41 Infared Dye Labeled M13 Forwardプライマ —および IRD41 Infared Dye Labeled Ml 3 Reverse プライマ一 （日清紡製造、 ァロカ （株） 販売） を、 反応液は SequiTherm (登録商標） Long-Read (登録商標） Cycle Sequencing it-LC (EPICENTRE TECHNOLOGIES社製） を使用した。 塩基配 列決定は、 4000L Long ReadIR (登録商標） DNA Sequencing System (LI-COR社 製） を用いた。
得られたぺクリネ一タス ·セルビシフィラスの 16 S rRNAをコードする遺 伝子と 23 S rRNAをコードする遺伝子の間のスぺーサー領域 （ショート） の 遺伝子配列を配列番号 4に示す。
実施例 5
P CR法によるべクチネータス ·セルビシフィラスの検出
( 1) ぺクチネ一タス ·セルビシフィラスのためのプライマ一の選定と合成 配列番号 3を基に DNAS I S (日立ソフトウェアエンジニアリング （株）） を用いてぺクチネ一タス 'セルビシフィラスに特異的な配列を した。 その結 果、 配列番号 3のぺクチネ一タス ·セルビシフィラスの 16 S rRNAをコ一ド する遺伝子と 23 S rRNAをコードする遺伝子の間のスぺ一サー領域の遺伝子 配列上の 135番目から 1 53番目までの配列を選定した。 （配列番号 7) また、 同様の解析により、 配列番号 3のべクチネ一タス 'セルビシフィラス の 16 S rRNAをコードする遺伝子と 23 S rRNAをコードする遺伝子の間 のスぺ一サー領域の遺伝子配列上の 172番目から 19 1番目までの配列を選定 した。 （配列番号 8)
また、 同様の解折により、 配列番号 3のべクチネ一タス 'セルビシフィラス の 16 S rRNAをコードする遺伝子と 23 S r RN Aをコードする遺伝子の間 のスぺ一サ一領域の遺伝子配列上の 203番目から 222番目までの配列を選定 した。 （配列番号 9)
さらにべクチネ一タス ·セルビシフィラスの 16 S rRNAをコ一ドする遺伝 子配列より、 配列番号 1 1に示す特異的プライマ一を選定した。 これらのオリ ゴヌクレオチドを 例 2— （ 1) と同様の方法で化学合成した。
(2) 配列番号 7および配列番号 1 1の配列をもつプライマーを用いたぺクチネ —タス ·セルビシフィラスの検出及び同定。
^例 1で調製した各菌の DNA溶液を、 実施例 5— ( 1) で合成したプライ マ一 （配列番号 7および配列番号 1 1) を用いて PCRを行った。 PCRは以下 の温度条件：
熱変性； 94 °C 30秒
ァニ一リング； 55°C 30秒
鎖長反応； 72°C 30秒
を 1サイクルとし、 これを 35サイクル繰り返して行った。 PCR終了後、 反応 液をァガロースゲルにて、 100V定電圧で 30分間電気泳動に供した。 反応液 の他に、 分子量マ一力一として pHYマ一力一も同時に泳動した。 泳動終了後、 約 0. のェチジゥムブロマイ ド溶液中で 20分間染色した後、 紫 外線照射下でゲルを観察し、 写真撮影を行った。 ゲルの観察または撮影した写真 より、 増幅産物の塩基長を分子量マ一力一との相対移動度から求めた。
その結果、 図 2に示されるように、 ぺクチネ一タス ·セルビシフィラスにのみ 約 600 bp sのバンドが検出された。
この結果より、 本発明の配列番号 7及び配列番号 1 1のオリゴヌクレオチドを PCRプライマーとして用いた場合、 ぺクチネータス 'セルビシフィラスにのみ 目的長のバンドが検出された。このことより、本発明の各オリゴヌクレオチドが、 ぺクチネータス ·セルビシフィラスの 16 S rRNAをコードする遺伝子と 23 S rRNAをコードする遺伝子の間のスぺ一サー領域の遺伝子配列および 16 S rRNAをコードする遺伝子上の標的とする塩基配列を正しく認識していること が示された。 かつ、 同属のぺクチネータス ' フリシンゲンシスを始め、 近縁な偏 性嫌気性菌ゃグラム陽性菌にも目的長のバンドは一切検出されなかったことから、 本発明は、 ぺクチネ一タス 'セルビシフイラスを種特異的に検出できることを示 し、 ぺクチネータス 'セルビシフィラスを検出できると同時に同定も行うことが 出来るものであることが示された。
産業上の利用の可能性
本発明により、 ぺクチネータス 'フリシンゲンシスおよびべクチネ一タス 'セ ルビシフィラスの 1 6 S r R NA遺伝子と 2 3 S r R N A遺伝子の間に構成され ているスぺ一サ一領域の遺伝子が明らかになり、 この遺伝子配列の全部または一 部を用いたぺクチネ一タス ·フリシンゲンシスおよびぺクチネ一タス ·セルビシ フィラス菌を迅速かつ確実に検出する方法が提供された。

Claims

¾$^ ¾
1. 酉己列番号 1に示される塩基配列の一部または全部を含むぺクチネー夕 ス ' フリシンゲンシス （ Pectim tus frisingensis) の 16 S rRNAをコード する遺伝子と 23 S r UNAをコードする遺伝子との間のスぺーサー領域の遺伝 子配列。
2. 配列番号 2に示される塩基配列の一部または全部を含むぺクチネー夕 ス ' フリシンゲンシス ( ec tina tus frisingensis) の 1 6 S rRNAをコード する遺伝子と 23 S rRN Aをコードする遺伝子との間のスぺ一サ一領域の遺伝 子配列。
3. 配列番号 3に示される塩基配列の一部または全部を含むベクチネー夕 ス ·セルビシフィラス (Pectinatus cerevisiiphilus) の 1 6 S rRNAをコ 一ドする遺伝子と 23 S rRNAをコードする遺伝子との間のスぺ一サ一領域の 遺伝子配列。
4. 配列番号 4に示される塩基配列の一部または全部を含むぺクチネー夕 ス 'セルビシフィラス ( ectinatus cerevisiiphilus) の 1 6 S rRNAをコ 一ドする遺伝子と 23 S rRNAをコードする遺伝子との間のスぺ一サ一領域の 遺伝子配列。
5. ベクチネータス ' フ シンゲンシス Pectinatus frisingensis、 の 16 S rRNAをコードする遺伝子と 23 S r UNAをコードする遺伝子との間 のスぺーサー領域の遺伝子配列が以下の配列群、
53 -CCATCCTCTTGAAAATCTC-3' ①
5 ' -TCTCRTCTCACAAGTTTGGC-3' ②
の少なくとも一つを有するか、 または対応する相補的配列を有することを特徴と するオリゴヌクレオチド。
6. ぺクチネ一タス 'セ レビシフィラス Pecti tus cerevisiiphilus) の 16 S rRNAをコードする遺伝子と 23 S r RN Aをコードする遺伝子との 間のスぺーサ一領域の遺伝子配列が以下の配列群、
55 -CACTCTTACAAGTATCTAC-35 ③
55 -CCACAATATTTCCGACCAGC-35 ④
5 ' -AGTCTTCTCTACTGCCATGC-3' ⑤
の少なくとも一つを有するか、 または対応する相補的配列を有することを特徴と するオリゴヌクレオチド。
7. 請求項 1または 2に記載さ-れた遺伝子配列より作製したオリゴヌクレ ォチドを核酸合成のブライマ一として機能させ、 遺伝子増幅処理することによつ てぺクチネータス ·フリシンゲンシスを検出する方法。
8. 請求項 3または 4に記載された遺伝子配列より作製したォリゴヌクレ ォチドを核酸合成のブライマ一として機能させ、 遺伝子増幅処理することによつ てぺクチネータス .セルビシフィラスを検出する方法。
9. 請求項 1または 2に記載された遺伝子配列より作製したォリゴヌクレ ォチドあるいは請求項 5に記載されたオリゴヌクレオチドと、 ぺクチネ一タス · フリシンゲンシスの 16 S rRNA遺伝子をコードするヌクレオチド配列を核酸 合成のプライマ一として機能させ、 遺伝子増幅処理することによってべクチネー タス ·フリシンゲンシスを検出する方法。
10. 請求項 3または 4に記載された遺伝子配列より作製したオリゴヌクレ ォチドあるいは請求項 6に記載されたオリゴヌクレオチドと、 ぺクチネータス · セルビシフィラスの 16 S rRNA遺伝子をコードするヌクレオチド配列を核酸 合成のプライマ一として機能させ、 遺伝子増幅処理することによってべクチネー タス ·セルビシフィラスを検出する方法。
1 1. ぺクチネータス ·フリシンゲンシスの 16 S rRNA遺伝子をコ一ド するヌクレオチド配列が、 以下の酉己列、
5' -CGTATCCAGAGATGGATATT-3' ©
を有することを特徴とするオリゴヌクレオチドである請求項 9記載の方法。
12. ぺクチネータス ·セルビシフィラスの 16 S rRNA遺伝子をコ一ド するヌクレオチド配列が、 以下の配列、
5 ' -CGTATGCAGAGATGCATATT-3' ⑦
を有することを特徴とするオリゴヌクレオチドである請求項 10記載の方法。
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