JP4022045B2 - 細菌検出のための遺伝子及びそれを用いた検出法 - Google Patents

Description

技術分野
本発明は、ビール混濁菌ペクチネータス属菌のペクチネータス・フリシンゲンシスまたはペクチネータス・セルビシフィラスを検出するための遺伝子及びこれを用いた該菌の検出方法に関する。
背景技術
ビールを混濁させる微生物（細菌）として、ペクチネータス（Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ）属菌が知られている。この属には、ペクチネータス・フリシンゲンシス（Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ ｆｒｉｓｉｎｇｅｎｎｓｉｓ）とペクチネータス・セルビシフィラス（Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉｉｐｈｉｌｕｓ）の２種が知られている。ペクチネータス属菌の検出には、増殖培養、分離培養をへて菌を単離しなければならず、少なくとも７日は要する。その後、単離した菌を増殖させ、形態観察、グラム染色性、カタラーゼ試験、糖資化性など多くの性状試験を行うことにより同定を行っている。
これらの多岐にわたる検査は煩雑であり、時間も費用もかかる。また、これら一般に行われている同定試験のほかに、単離した菌からＤＮＡを抽出し、それを膜上あるいは他の支持体上に固定し、標準菌のＤＮＡをプローブとしてハイブリダイゼーション試験を行うことにより菌種を同定する方法がある。しかし、この方法も数日を必要とし、さらに十分な検出感度及び選択性を得るのが難しい。
そこで、最近では、ペクチネータス属菌に関する検出法として、ペクチネータス・セルビシフィラスに特異的に反応するモノクローナル抗体を使用した検出法（ＡＳＢＣ Ｊｏｕｒｎａｌ：５１（４）１５８−１６３，１９９３）がある。しかし、本法は検出感度が不十分であるばかりでなく、ペクチネータス・フリシンゲンシスは検出できないという問題があった。
また、別の検出法として、リボソームＲＮＡ遺伝子の多型性を検出するリボタイピング（Ｒｉｂｏｔｙｐｉｎｇ）法によりペクチネータス・フリシンゲンシスとペクチネータス・セルビシフィラスを検出する方法が報告されている
（Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｃｈｅｍ．：５６（１）１９−２３，１９９８）。しかし、本法の適用にあたっては菌の単離操作が必要であることから、検出感度、迅速性に問題があった。
そこで、さらに迅速な検出法が検討され、最近では、国際公開番号ＷＯ９７／２００７１の開示があり、検体となる微生物のＤＮＡを抽出し、このＤＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドをプライマーとして機能させたＰＣＲ法を用いたペクチネータスを検出する方法の報告がある。しかしながら、これらの技術に用いられている１６ＳｒＲＮＡの塩基配列は微生物の属を越えて類似している場合があり、検出したい特定の微生物以外の微生物も誤って検出してしまうという問題があった。
一方、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子と２３ＳｒＲＮＡ遺伝子の間に構成されているスペーサー領域の遺伝子は微生物種に特異的な遺伝子配列を有することが知られており、それを利用した微生物検出法として、醸造論文集５０、２２−３１（１９９５）、ＡＰＰＬ．ＥＮＶＩＲＯＮ．ＭＩＣＲＯＢＩＯＬ．ＶＯＬ．６２，ＮＯ．５，１６８３−１６８８（１９９６）、ＦＥＭＳ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬ ＬＥＴＴ．ＶＯＬ．８４，ＮＯ．３，３０７−３１２（１９９１）、特開平６−９８８００等があるが、ペクチネータス属菌のスペーサー領域の遺伝子配列は明らかにされていない。
発明の開示
そこで、本発明では、ビール混濁に関係するペクチネータス属菌に特異的な１６ＳｒＲＮＡ遺伝子と２３ＳｒＲＮＡ遺伝子の間に構成されているスペーサー領域の遺伝子配列を提供し、その配列を用いて迅速に感度よく検出できる方法を提供することを目的とする。
（１）第１の発明は、配列番号１に示される塩基配列の一部または全部を含むペクチネータス・フリシンゲンシス（Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ ｆｒｉｓｉｎｇｅｎｓｉｓ）の１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子と２３ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子との間のスペーサー領域の遺伝子配列である。
（２）第２の発明は、配列番号２に示される塩基配列の一部または全部を含むペクチネータス・フリシンゲンシス（Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ ｆｒｉｓｉｎｇｅｎｓｉｓ）の１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子と２３ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子との間のスペーサー領域の遺伝子配列である。
（３）第３の発明は、配列番号３に示される塩基配列の一部または全部を含むペクチネータス・セルビシフィラス（Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉｉｐｈｉｌｕｓ）の１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子と２３ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子との間のスペーサー領域の遺伝子配列である。
（４）第４の発明は、配列番号４に示される塩基配列の一部または全部を含むペクチネータス・セルビシフィラス（Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉｉｐｈｉｌｕｓ）の１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子と２３ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子との間のスペーサー領域の遺伝子配列である。
（５）第５の発明は、ペクチネータス・フリシンゲンシス（Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ ｆｒｉｓｉｎｇｅｎｓｉｓ）の１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子と２３ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子との間のスペーサー領域の遺伝子配列が以下の配列群、
５’−ＣＣＡＴＣＣＴＣＴＴＧＡＡＡＡＴＣＴＣ−３’ ▲１▼
５’−ＴＣＴＣＲＴＣＴＣＡＣＡＡＧＴＴＴＧＧＣ−３’▲２▼
の少なくとも一つを有するか、または対応する相補的配列を有することを特徴とするオリゴヌクレオチドである。
（６）第６の発明は、ペクチネータス・セルビシフィラス（Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉｉｐｈｉｌｕｓ）の１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子と２３ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子との間のスペーサー領域の遺伝子配列が以下の配列群、
５’−ＣＡＣＴＣＴＴＡＣＡＡＧＴＡＴＣＴＡＣ−３’ ▲３▼
５’−ＣＣＡＣＡＡＴＡＴＴＴＣＣＧＡＣＣＡＧＣ−３’ ▲４▼
５’−ＡＧＴＣＴＴＣＴＣＴＡＣＴＧＣＣＡＴＧＣ−３’ ▲５▼
の少なくとも一つを有するか、または対応する相補的配列を有することを特徴とするオリゴヌクレオチドである。
（７）第７の発明は、（１）または（２）に記載された遺伝子配列より作製したオリゴヌクレオチド配列を核酸合成のプライマーとして機能させ、遺伝子増幅処理することによってペクチネータス・フリシンゲンシスを検出する方法である。
（８）第８の発明は、（３）または（４）に記載された遺伝子配列より作製したオリゴヌクレオチド配列を核酸合成のプライマーとして機能させ、遺伝子増幅処理することによってペクチネータス・セルビシフィラスを検出する方法である。
（９）第９の発明は、（１）または（２）に記載された遺伝子配列より作製したオリゴヌクレオチドあるいは（５）に記載されたオリゴヌクレオチドと、ペクチネータス・フリシンゲンシスの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子をコードするヌクレオチド配列を核酸合成のプライマーとして機能させ、遺伝子増幅処理することによってペクチネータス・フリシンゲンシスを検出する方法である。
（１０）第１０の発明は、（３）または（４）に記載された遺伝子配列より作製したオリゴヌクレオチドあるいは（６）に記載されたオリゴヌクレオチドと、ペクチネータス・セルビシフィラスの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子をコードするヌクレオチド配列を核酸合成のプライマーとして機能させ、遺伝子増幅処理することによってペクチネータス・セルビシフィラスを検出する方法である。
（１１）第１１の発明は、ペクチネータス・フリシンゲンシスの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子をコードするヌクレオチド配列が、以下の配列、
５’−ＣＧＴＡＴＣＣＡＧＡＧＡＴＧＧＡＴＡＴＴ−３’ ▲６▼
を有することを特徴とするオリゴヌクレオチドである（９）の方法である。
（１２）第１２の発明は、ペクチネータス・セルビシフィラスの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子をコードするヌクレオチド配列が、以下の配列、
５’−ＣＧＴＡＴＧＣＡＧＡＧＡＴＧＣＡＴＡＴＴ−３’ ▲７▼
を有することを特徴とするオリゴヌクレオチドである（１０）の方法である。
発明を実施するための最良の形態
遺伝子増幅に関する技術は既に公知であり、Ｓａｉｋｉらが開発したＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ法（以下、ＰＣＲ法と略す；Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０，１３５０，１９８５）を基に行うことができる。
この方法は、特定の遺伝子配列を増幅させる反応で、迅速・高感度で高い特異性を持ち、かつ簡便であることから、遺伝学的分野のみならず、近年は医療分野における病原菌の迅速判定や、食品分野における有害菌の迅速検出にも応用が試みられている。ＰＣＲ法を行うことにより、検体中に僅かな量しか存在していなくても、２つのプライマーが挟む標的ヌクレオチド配列は何百倍にも増幅され、検出が可能までに大量にそのコピーが産生される。また、ＰＣＲ法を行うには、検体中に存在する菌から核酸成分を遊離させる必要があるが、ＰＣＲ法は標的配列が数分子以上存在すれば増幅反応が進むので、溶菌酵素や界面活性剤を用いた簡便な前処理をするだけで十分に試験に供することができる。そのため、従来の細菌検出法に比べ、利用価値が非常に高い。
これらのことを利用すべく、本発明では、ペクチネータス・フリシンゲンシス、ペクチネータス・セルビシフィラス各々の１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子と２３ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子の間のスペーサー領域の遺伝子配列を提供し、これらから選択したオリゴヌクレオチドもしくは１６ＳｒＲＮＡ遺伝子をコードするヌクレオチド配列をＰＣＲ法の核酸合成のプライマーとして機能させ、遺伝子増幅処理することによって検体中にペクチネータス・フリシンゲンシスあるいはペクチネータス・セルビシフィラスが存在するか否かを迅速、高感度に判定する方法を開発した。
検体は、ビール及びビール製造途中の半製品、または下水などの環境から採取されたサンプルでもよい。また、プライマーに用いるオリゴヌクレオチドは化学合成されたものでも天然のものでも、いずれの使用でも可能である。
発明を実施するための最良の形態
以下に、ＰＣＲ法を用いて、ペクチネイタス・フリシンゲンシスあるいはペクチネイタス・セルビシフィラスを検出する方法を示す。ＰＣＲ法に用いた塩基配列は、さきの（５）、（６）、（１１）、（１２）に示したものは一例であり、これに限定されるものではない。また、ＰＣＲ法に用いるプライマー長は、（５）、（６）、（１１）、（１２）に記述したものは１９〜２０塩基長であったが、これに限定されるものではない。好ましくは、１０〜５０塩基長のものを用いる。
ＰＣＲ法を用いてペクチネータス・フリシンゲンシスを検出する場合、プライマーとして▲１▼と▲６▼を組み合わせた場合の増幅されるＤＮＡ断片はおよそ７００塩基対およびおよそ９００塩基対、▲２▼と▲６▼を組み合わせ場合の増幅されるＤＮＡ断片はおよそ７００塩基対およびおよそ９００塩基対であり、これらのバンドがゲル電気泳動により検出されときはペクチネータス・フリシンゲンシスが存在していたと判定できる。これらのプライマーの組み合わせは、いずれでもペクチネータス・フリシンゲンシス菌に特異的であるため、この菌種の検出に利用できるが、２組を平行して使用することにより、より確実な同定が行える。ＰＣＲ法に用いるプライマーの塩基配列を変更させることで、増幅されるヌクレオチド配列の長さは変化する。
一方、ＰＣＲ法を用いてペクチネータス・セルビシフィラスを検出する場合、プライマーとして▲３▼と▲７▼を組み合わせた場合の増幅されるＤＮＡ断片はおよそ６００塩基対、▲４▼と▲７▼を組み合わせ場合の増幅されるＤＮＡ断片はおよそ６５０塩基対、▲５▼と▲７▼を組み合わせた場合の増幅されるＤＮＡ断片はおよそ７００塩基対であり、これらのバンドがゲル電気泳動により検出されときはペクチネータス・セルビシフィラスが存在していたと判定できる。これらのプライマーの組み合わせは、いずれでもペクチネータス・セルビシフィラス菌に特異的であるため、この菌種の検出に利用できるが、２組以上を平行して使用することにより、より確実な同定が行える。ＰＣＲ法に用いるプライマーの塩基配列を変更させることで、増幅されるヌクレオチド配列の長さは変化する。
ＰＣＲ反応における温度条件は、２本鎖ＤＮＡを１本鎖にする熱変性反応で９０〜９８℃、プライマー鋳型ＤＮＡにハイブリダイズさせるアニーリング反応で３７〜６５℃、ＤＮＡポリメラーゼを作用させる鎖長反応で５０〜７５℃で行い、これを１サイクルとしたものを数十サイクル行わせることにより、標的配列を増幅させることができる。ＰＣＲ反応後、反応物を電気泳動により分離し、エチジウムブロマイド等で核酸染色を行い、増幅されたヌクレオチド配列の塩基長が、上述の標的配列の塩基長と等しければ検体中に検出対象の菌が存在すると判定できる。増幅されたヌクレオチド配列の検出には、クロマトグラフィーも有効である。
本発明の配列表について説明する。
配列番号１は、配列の長さが６２４、配列の型が核酸、鎖の数が二本鎖、トポロジーが直鎖状、配列の種類がｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ。起源がペクチネータス・フリシンゲンシス ＤＳＭ６３０６の配列である。
配列番号２は、配列の長さが４４２、配列の型が核酸、鎖の数が二本鎖、トポロジーが直鎖状、配列の種類がｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ。起源がペクチネータス・フリシンゲンシス ＤＳＭ６３０６の配列である。
配列番号３は、配列の長さが７２４、配列の型が核酸、鎖の数が二本鎖、トポロジーが直鎖状、配列の種類がｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ。起源がペクチネータス・セルビシフィラス ＤＳＭ２０４６７の配列である。
配列番号４は、配列の長さが３９９、配列の型が核酸、鎖の数が二本鎖、トポロジーが直鎖状、配列の種類がｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ。起源がペクチネータス・セルビシフィラス ＤＳＭ２０４６７の配列である。
配列番号５は、配列の長さが１９、配列の型が核酸、鎖の数が一本鎖、トポロジーが直鎖状、配列の種類がｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ。起源がペクチネータス・フリシンゲンシス ＤＳＭ６３０６の配列である。
配列番号６は、配列の長さが２０、配列の型が核酸、鎖の数が一本鎖、トポロジーが直鎖状、配列の種類がｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ。起源がペクチネータス・フリシンゲンシス ＤＳＭ６３０６の配列である。
配列番号７は、配列の長さが１９、配列の型が核酸、鎖の数が一本鎖、トポロジーが直鎖状、配列の種類がｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ。起源がペクチネータス・セルビシフィラス ＤＳＭ２０４６７の配列である。
配列番号８は、配列の長さが２０、配列の型が核酸、鎖の数が一本鎖、トポロジーが直鎖状、配列の種類がｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ。起源がペクチネータス・セルビシフィラス ＤＳＭ２０４６７の配列である。
配列番号９は、配列の長さが２０、配列の型が核酸、鎖の数が一本鎖、トポロジーが直鎖状、配列の種類がｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ。起源がペクチネータス・セルビシフィラス ＤＳＭ２０４６７の配列である。
配列番号１０は、配列の長さが２０、配列の型が核酸、鎖の数が一本鎖、トポロジーが直鎖状、配列の種類がｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ。起源がペクチネータス・フリシンゲンシス ＤＳＭ６３０６の配列である。
配列番号１１は、配列の長さが２０、配列の型が核酸、鎖の数が一本鎖、トポロジーが直鎖状、配列の種類がｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ。起源がペクチネータス・セルビシフィラス ＤＳＭ２０４６７の配列である。
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１
検体の調製
Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ属に属する菌としては、Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ ｆｒｉｓｉｎｇｅｎｓｉｓ（ＤＳＭ６３０６）、Ｐｅｃｔｉｎａｔｕｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉｉｐｈｉｌｕｓ（ＤＳＭ２０４６７）を使用した。また、本発明の配列番号５、６、７、８、９、１０、１１に示したペクチネイタス・フリシンゲンシスおよびペクチネイタス・セルビシフィラスプライマーの特異性を確かめるために、表１に示す他の細菌を使用した。これらを適当な増殖用培地にて培養を行った後、菌体を遠心操作により回収した。その後、菌体からのＤＮＡ抽出は、新生化学実験講座２核酸Ｉ分離精製ｐ２０〜２１（日本生化学会編、東京化学同人）に従って行い、ＤＮＡ溶液を得た。

実施例２
ペクチネータス・フリシンゲンシスの１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子と２３ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子との間のスペーサー領域のクローニング及び塩基配列の決定
（１）ＰＣＲ法による１６Ｓ／２３ＳｒＲＮＡスペーサー領域の増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーの選定および合成
ペクチネータス・フリシンゲンシスの１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子は塩基配列が明らかにされており〔インターナショナル ジャーナル オブ システマティック バクテリオロジー（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）、第４０巻、第１９〜２７頁（１９９０）〕、５５７番目〜５７６番目の塩基配列をもとにプライマーを選定した。
ペクチネータス・フリシンゲンシスの２３ＳリボソームＲＮＡ遺伝子は塩基配列が明らかにされており〔システマティック アプライド マイクロバイオロジー（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、第１５巻、第４８７〜５０１頁（１９９２）、ＥＭＢＬ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｘ４８４２３〕、１番目〜２０番目の塩基配列をもとに対応する相補的配列になるようにプライマーを選定した。合成はサワディーテクノロジー（株）に委託した。
（２）ＰＣＲ法による１６Ｓ／２３ＳｒＲＮＡスペーサー領域の増幅
実施例１で調製したペクチネータス・フリシンゲンシスのＤＮＡ溶液０．１μｇを０．２ｍｌ用チューブ（パーキンエルマー社）に取り、ｒＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｋｉｔ（東洋紡社）中の１０×バッファーを５μｌ、３μｌの２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５μｌの２ｍＭｄＮＴＰ混合液（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）、０．５μｌの５ユニット／μｌのタック−ポリメラーゼ、実施例２−（１）で調製した濃度１００ｍＭプライマーを各々０．５μｌを加え、これに滅菌蒸留水を加えて５０μｌの溶液にした。このチューブを自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラー（パーキンエルマー社）にセットし増幅反応を行った。反応条件は、９４℃、２．５分間の変性後、９４℃、３０秒間の変性→５５℃、３０秒間のプライマーのアニーリング→７２℃、３０秒間の合成反応のサイクルを３０サイクル行った。反応後５μｌの反応液を取り、アガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイドでＤＮＡを染色して、増幅されたＤＮＡを確認した。その結果、約１６００ｂｐ（以下「ロング」と称す）と約１４００ｂｐ（以下「ショート」と称す）のＤＮＡが増幅された。
（３）スペーサー領域ロングのクローニング及びシークエンシング
ＰＣＲ終了後の反応液を、ハイ ピュア ＰＣＲ プロダクト ピュリフィケイション キット（ベーリンガーマンハイム社）を用い、未反応のｄＮＴＰｓを除去した。このように調製した増幅ＤＮＡ１００ｎｇにＴＡ クローニング キット（ＴＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社）に含まれるプラスミドｐＣＲ２．１を２μｌ、リガーゼを１μｌ、バッファーを１μｌ、滅菌水を全量１０μｌになるように加え、１４℃、４時間反応させた後、その２μｌと０．５Ｍ β−メルカプトエタノール２μｌをともに大腸菌ＩＮＶα‘Ｆコンピテントセルに加え、氷中、３０分間放置した後、４２℃、３０秒間熱処理し、大腸菌へのプラスミドの形質転換を行った。形質転換した大腸菌にＳＯＣ培地（２．０％ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ，０．５％ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ，１０．０ｍＭ ＮａＣｌ，２．５ｍＭ ＫＣｌ，１０．０ｍＭ ＭｇＣｌ_２−６Ｈ_２Ｏ，２０．０ｍＭ ｇｌｕｃｏｓｅ）２５０μｌを加え、３７℃、６０分間振とうした後、５０μｇ／ｍｌアンピシリンおよび４０μｇ／ｍｌＸ−Ｇａｌを含むＬＢ平板培地に植菌し、３７℃、一晩培養した。現れた白色のコロニーを５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む３ｍｌのＬＢ液体培地に接種し、３７℃、一晩培養した。
培養後、大腸菌よりプラスミド ミニ キット（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、プラスミドを抽出した。得られたプラスミドの一部を取り、制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社）により３７℃、６０分間反応させた後アガロース電気泳動、エチジウムプロマイドによるＤＮＡの染色により、ロングが挿入されていることを確認した。残りのプラスミドのうち５００ｎｇを制限酵素ＳｍａＩ（東洋紡社）により、３０℃、６０分間反応させた後、３Ｍ 酢酸ナトリウム２μｌ、１００％エタノールを５００μｌを加え、氷中に１５分間保持した後、１５０００ｒｐｍ、１５分間遠心し、上清を除いた。沈殿に７０％エタノールを５００μｌを加え、１５０００ｒｐｍ、１５分間遠心し、上清を除き、１０分間減圧乾燥を行った。この沈殿に滅菌水を加えて溶解し、制限酵素ＸｂａＩ（ベーリンガーマンハイム社）により、３７℃、６０分間反応させた。この反応液に等量のフェノール／クロロホルム（等量混合液）を加え穏やかに混合し、１５０００ｒｐｍ、１５分間遠心し水層（上層）を回収した。
この回収液に等量の水飽和エーテルを加え穏やかに混合し、１５０００ｒｐｍ、１５分間遠心しエーテル層（上層）を除去した。残りの水層に３Ｍ 酢酸ナトリウム２μｌ、１００％エタノールを５００μｌを加え、氷中に１５分間保持した後、１５０００ｒｐｍ、１５分間遠心し、上清を除いた。沈殿に７０％エタノールを５００μｌ加え、１５０００ｒｐｍ、１５分間遠心し、上清を除き、１０分間減圧乾燥を行った後、滅菌蒸留水２０μｌを加えた。この溶液５μｌにブランティングキッド（宝酒造社）に含まれる１０×バッファーを１μｌ、滅菌蒸留水を３μｌを加え、７０℃で５分間保温した後、Ｔ４ ＤＮＡ ポリメラーゼ１μｌを加え、３７℃、５分間保温することにより、末端平滑化を行った。撹拌によりＴ４ ＤＮＡ ポリメラーゼを失活させた後、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ａを４０μｌ、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｂを１０μｌ加え、１６℃で３０分間保温することにより分子内ライゲーションを行った。
この反応液２μｌと０．５Ｍ β−メルカプトエタノール２μｌをともに大腸菌ＩＮＶα‘Ｆコンピテントセルに加え、氷中、３０分間放置した後、４２℃、３０秒間熱処理し、大腸菌へのプラスミドの形質転換を行った。形質転換した大腸菌にＳＯＣ培地（２．０％ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ，０．５％ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ，１０．０ｍＭ ＮａＣｌ，２．５ｍＭ ＫＣｌ，１０．０ｍＭ ＭｇＣｌ_２−６Ｈ_２Ｏ，２０．０ｍＭ ｇｌｕｃｏｓｅ）２５０μｌを加え、３７℃、６０分間振とうした後、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ平板培地に植菌し、３７℃、一晩培養した。現れた白色のコロニーを５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む３ｍｌのＬＢ液体培地に接種し、３７℃、一晩培養した。培養後、大腸菌よりプラスミド ミニ キット（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、プラスミドを抽出した。
このようにして得られたプラスミドを鋳型とし、シーケンス反応を行った。シーケンシングプライマーはＩＲＤ４１ Ｉｎｆａｒｅｄ Ｄｙｅ Ｌａｂｅｌｅｄ Ｍ１３ Ｆｏｒｗａｒｄ プライマーおよびＩＲＤ４１ Ｉｎｆａｒｅｄ Ｄｙｅ Ｌａｂｅｌｅｄ Ｍ１３ Ｒｅｖｅｒｓｅ プライマー（日清紡製造、アロカ（株）販売）を、反応液はＳｅｑｕｉＴｈｅｒｍ（登録商標）Ｌｏｎｇ−Ｒｅａｄ（登録商標）Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ−ＬＣ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）を使用した。塩基配列決定は、４０００Ｌ Ｌｏｎｇ ＲｅａｄＩＲ（登録商標） ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＬＩ−ＣＯＲ社製）を用いた。
得られたＰｅｃｔｉｎａｔｕｓ ｆｒｉｓｉｎｇｅｎｓｉｓ ＤＳＭ６３０６菌の１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子と２３ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子との間のスペーサー領域（ロング）の遺伝子配列を配列番号１に示す。
（４）スペーサー領域ショートのクローニング及びシークエンシング
実施例２−（２）のＰＣＲ終了後の反応液を、ハイ ピュア ＰＣＲ プロダクト ピュリフィケイション キット（ベーリンガーマンハイム社）を用い、未反応のｄＮＴＰｓを除去した。このように調製した増幅ＤＮＡ１００ｎｇにＴＡクローニング キット（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社）に含まれるプラスミドｐＣＲ２．１を２μｌ、リガーゼを１μｌ、バッファーを１μｌ、滅菌水を全量１０μｌになるように加え、１４℃、４時間反応させた後、その２μｌと０．５Ｍ β−メルカプトエタノール２μｌをともに大腸菌ＩＮＶα‘Ｆコンピテントセルに加え、氷中、３０分間放置した後、４２℃、３０秒間熱処理し、大腸菌へのプラスミドの形質転換を行った。形質転換した大腸菌にＳＯＣ培地（２．０％ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ，０．５％ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ，１０．０ｍＭ ＮａＣｌ，２．５ｍＭ ＫＣｌ，１０．０ｍＭ ＭｇＣｌ_２−６Ｈ_２Ｏ，２０．０ｍＭ ｇｌｕｃｏｓｅ）２５０μｌを加え、３７℃、６０分間振とうした後、５０μｇ／ｍｌアンピシリンおよび４０μｇ／ｍｌＸ−Ｇａｌを含むＬＢ平板培地に植菌し、３７℃、一晩培養した。現れた白色のコロニーを５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む３ｍｌのＬＢ液体培地に接種し、３７℃、一晩培養した。培養後、大腸菌よりプラスミド ミニ キット（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、プラスミドを抽出した。
得られたプラスミドの一部を取り、制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社）により３７℃、６０分間反応させた後アガロース電気泳動、エチジウムプロマイドによるＤＮＡの染色により、ショートが挿入されていることを確認した。残りのプラスミドのうち５００ｎｇを制限酵素ＳｍａＩ（東洋紡社）により、３０℃、６０分間反応させた後、３Ｍ 酢酸ナトリウム２μｌ、１００％エタノールを５００μｌを加え、氷中に１５分間保持した後、１５０００ｒｐｍ、１５分間遠心し、上清を除いた。沈殿に７０％エタノールを５００μｌを加え、１５０００ｒｐｍ、１５分間遠心し、上清を除き、１０分間減圧乾燥を行った。この沈殿に滅菌水を加えて溶解し、制限酵素ＸｂａＩ（ベーリンガーマンハイム社）により、３７℃、６０分間反応させた。この反応液に等量のフェノール／クロロホルム（等量混合液）を加え穏やかに混合し、１５０００ｒｐｍ、１５分間遠心し水層（上層）を回収した。この回収液に等量の水飽和エーテルを加え穏やかに混合し、１５０００ｒｐｍ、１５分間遠心しエーテル層（上層）を除去した。
残りの水層に３Ｍ 酢酸ナトリウム２μｌ、１００％エタノールを５００μｌを加え、氷中に１５分間保持した後、１５０００ｒｐｍ、１５分間遠心し、上清を除いた。沈殿に７０％エタノールを５００μｌ加え、１５０００ｒｐｍ、１５分間遠心し、上清を除き、１０分間減圧乾燥を行った後、滅菌蒸留水２０μｌを加えた。この溶液５μｌにブランティングキット（宝酒造社）に含まれる１０×バッファーを１μｌ、滅菌蒸留水を全量３μｌを加え、７０℃で５分間保温した後、Ｔ４ ＤＮＡ ポリメラーゼ１μｌを加え、３７℃、５分間保温することにより、末端平滑化を行った。撹拌によりＴ４ ＤＮＡ ポリメラーゼを失活させた後、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ａを４０μｌ、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｂを１０μｌ加え、１６℃で３０分間保温することにより分子内ライゲーションを行った。この反応液２μｌと０．５Ｍ β−メルカプトエタノール２μｌをともに大腸菌ＩＮＶα‘Ｆコンピテントセルに加え、氷中、３０分間放置した後、４２℃、３０秒間熱処理し、大腸菌へのプラスミドの形質転換を行った。
形質転換した大腸菌にＳＯＣ培地（２．０％ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ，０．５％ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ，１０．０ｍＭ ＮａＣｌ，２．５ｍＭ ＫＣｌ，１０．０ｍＭ ＭｇＣｌ_２−６Ｈ_２Ｏ，２０．０ｍＭ ｇｌｕｃｏｓｅ）２５０μｌを加え、３７℃、６０分間振とうした後、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ平板培地に植菌し、３７℃、一晩培養した。現れた白色のコロニーを５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む３ｍｌのＬＢ液体培地に接種し、３７℃、一晩培養した。培養後、大腸菌よりプラスミド ミニ キット（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、プラスミドを抽出した。
このようにして得られたプラスミドを鋳型とし、シーケンス反応を行った。シーケンシングプライマーはＩＲＤ４１ Ｉｎｆａｒｅｄ Ｄｙｅ Ｌａｂｅｌｅｄ Ｍ１３ Ｆｏｒｗａｒｄ プライマーおよびＩＲＤ４１ Ｉｎｆａｒｅｄ Ｄｙｅ Ｌａｂｅｌｅｄ Ｍ１３ Ｒｅｖｅｒｓｅ プライマー（日清紡製造、アロカ（株）販売）を、反応液はＳｅｑｕｉＴｈｅｒｍ（登録商標）Ｌｏｎｇ−Ｒｅａｄ（登録商標）Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ−ＬＣ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）を使用した。塩基配列決定は、４０００Ｌ Ｌｏｎｇ ＲｅａｄＩＲ（登録商標） ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＬＩ−ＣＯＲ社製）を用いた。
得られたペクリネータス・フリシンゲンシスの１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子と２３ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子の間のスペーサー領域（ショート）の遺伝子配列を配列番号２に示す。
実施例３
ＰＣＲ法によるペクチネータス・フリシンゲンシスの検出
（１）ペクチネータス・フリシンゲンシスのためのプライマーの選定と合成
配列番号１、２を基にＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトウエアエンジニアリング（株））を用いてペクチネータス・フリシンゲンシスに特異的な配列を解析した。その結果、配列番号１のペクチネータス・フリシンゲンシスの１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子と２３ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子の間のスペーサー領域の遺伝子配列上の３７７番目から３９５番目までの配列、および配列番号２のペクチネータス・フリシンゲンシスの１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子と２３ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子の間のスペーサー領域の遺伝子配列上の１９５番目から２１３番目までの配列を選定した。（配列番号５）
また、同様の解析により、配列番号１のペクチネータス・フリシンゲンシスの１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子と２３ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子の間のスペーサー領域の遺伝子配列上の３６１番目から３８０番目までの配列、および配列番号２のペクチネータス・フリシンゲンシスの１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子と２３ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子の間のスペーサー領域の遺伝子配列上の１７９番目から１９８番目までの配列を選定した。（配列番号６）
さらにペクチネータス・フリシンゲンシスの１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子配列より、配列番号１０に示す特異的プライマーを選定した。
これらのオリゴヌクレオチドを実施例２−（１）と同様の方法で化学合成した。
（２）配列番号６および配列番号１０の配列をもつプライマーを用いたペクチネータス・フリシンゲンシスの検出及び同定。
実施例１で調製した各菌のＤＮＡ溶液を、実施例３で合成したプライマー（配列番号６および配列番号１０）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは以下の温度条件：
熱変性；９４℃ ３０秒
アニーリング；５５℃ ３０秒
鎖長反応；７２℃ ３０秒
を１サイクルとし、これを３５サイクル繰り返して行った。ＰＣＲ終了後、反応液をアガロースゲルにて、１００Ｖ定電圧で３０分間電気泳動に供した。反応液の他に、分子量マーカーとしてｐＨＹマーカーも同時に泳動した。泳動終了後、約０．５μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイド溶液中で２０分間染色した後、紫外線照射下でゲルを観察し、写真撮影を行った。ゲルの観察または撮影した写真より、増幅産物の塩基長を分子量マーカーとの相対移動度から求めた。
その結果、図１に示されるように、ペクチネータス・フリシンゲンシスにのみおよそ７００ｂｐｓとおよそ９００ｂｐｓのバンドが検出された。
この結果より、本発明の配列番号６及び配列番号１０のオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして用いた場合、ペクチネータス・フリシンゲンシスにのみ目的長のバンドが検出された。このことより、本発明の各オリゴヌクレオチドが、ペクチネータス・フリシンゲンシスの１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子と２３ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子の間のスペーサー領域の遺伝子配列および１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子上の標的とする塩基配列を正しく認識していることが示された。かつ、同属のペクチネータス・セルビシフィラスを始め、近縁な偏性嫌気性菌やグラム陽性菌にも目的長のバンドは一切検出されなかったことから、本発明は、ペクチネータス・フリシンゲンシスを種特異的に検出できることを示し、ペクチネータス・フリシンゲンシスを検出できると同時に同定も行うことが出来るものであることが示された。
実施例４
ペクチネータス・セルビシフィラスの１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子と２３ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子の間のスペーサー領域のクローニング及び塩基配列の決定
（１）ＰＣＲ法による１６Ｓ／２３ＳｒＲＮＡスペーサー領域の増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーの選定および合成
ペクチネータス・セルビシフィラスの１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子は塩基配列が明らかにされており〔インターナショナル ジャーナル オブ システマティック バクテリオロジー（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）、第４０巻、第１９〜２７頁（１９９０）〕、５５７番目〜５７６番目の塩基配列をもとにプライマーを選定した。
ペクチネータス・セルビシフィラスの２３リボソームＲＮＡ遺伝子は塩基配列が明らかにされていないが、ペクチネータス・フリシンゲンシスの２３リボソームＲＮＡ遺伝子は塩基配列が明らかにされていることから〔システマティック アプライド マイクロバイオロジー（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、第１５巻、第４８７〜５０１頁（１９９２）、ＥＭＢＬ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｘ４８４２３〕、ペクチネータス・フリシンゲンシスの２３リボソームＲＮＡ遺伝子の１番目〜２０番目の塩基配列をもとに対応する相補的配列になるようにプライマーを選定した。合成はサワディーテクノロジー（株）に委託した。
（２）ＰＣＲ法による１６Ｓ／２３ＳｒＲＮＡスペーサー領域の増幅
実施例１で調製したペクチネータス・セルビシフィラスのＤＮＡ溶液０．１μｇを０．２ｍｌ用チューブ（パーキンエルマー社）に取り、ｒＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｋｉｔ（東洋紡社）中の１０×バッファーを５μｌ、３μｌの２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５μｌの２ｍＭｄＮＴＰ混合液（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）、０．５μｌの５ユニット／μｌのタック−ポリメラーゼ、実施例２−（１）で調製した濃度１００ｍＭプライマーを各々０．５μｌを加え、これに滅菌蒸留水を加えて５０μｌの溶液にした。このチューブを自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラー（パーキンエルマー社）にセットし増幅反応を行った。反応条件は、９４℃、２．５分間の変性後、９４℃、３０秒間の変性→５５℃、３０秒間のプライマーのアニーリング→７２℃、３０秒間の合成反応のサイクルを３０サイクル行った。反応後５μｌの反応液を取り、アガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイドでＤＮＡを染色して、増幅されたＤＮＡを確認した。その結果、約１７００ｂｐ（以下「ロング」と称す）と約１４００ｂｐ（以下「ショート」と称す）のＤＮＡが増幅された。
（３）スペーサー領域ロングのクローニング及びシークエンシング
ＰＣＲ終了後の反応液を、ハイ ピュア ＰＣＲ プロダクト ピュリフィケイション キット（ベーリンガーマンハイム社）を用い、未反応のｄＮＴＰｓを除去した。このように調製した増幅ＤＮＡ１００ｎｇにＴＡ クローニング キット（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社）に含まれるプラスミドｐＣＲ２．１を２μｌ、リガーゼを１μｌ、バッファーを１μｌ、滅菌水を全量１０μｌになるように加え、１４℃、４時間反応させた後、その２μｌと０．５Ｍ β−メルカプトエタノール２μｌをともに大腸菌ＩＮＶα‘Ｆコンピテントセルに加え、氷中、３０分間放置した後、４２℃、３０秒間熱処理し、大腸菌へのプラスミドの形質転換を行った。形質転換した大腸菌にＳＯＣ培地（２．０％ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ，０．５％ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ，１０．０ｍＭ ＮａＣｌ，２．５ｍＭ ＫＣｌ，１０．０ｍＭ ＭｇＣｌ_２−６Ｈ_２Ｏ，２０．０ｍＭ ｇｌｕｃｏｓｅ）２５０μｌを加え、３７℃、６０分間振とうした後、５０μｇ／ｍｌアンピシリンおよび４０μｇ／ｍｌＸ−Ｇａｌを含むＬＢ平板培地に植菌し、３７℃、一晩培養した。現れた白色のコロニーを５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む３ｍｌのＬＢ液体培地に接種し、３７℃、一晩培養した。
培養後、大腸菌よりプラスミド ミニ キット（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、プラスミドを抽出した。得られたプラスミドの一部を取り、制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社）により３７℃、６０分間反応させた後アガロース電気泳動、エチジウムプロマイドによるＤＮＡの染色により、ロングが挿入されていることを確認した。残りのプラスミドのうち５００ｎｇを制限酵素ＳｍａＩ（東洋紡社）により、３０℃、６０分間反応させた後、３Ｍ 酢酸ナトリウム２μｌ、１００％エタノールを５００μｌを加え、氷中に１５分間保持した後、１５０００ｒｐｍ、１５分間遠心し、上清を除いた。沈殿に７０％エタノールを５００μｌを加え、１５０００ｒｐｍ、１５分間遠心し、上清を除き、１０分間減圧乾燥を行った。この沈殿に滅菌水を加えて溶解し、制限酵素ＸｂａＩ（ベーリンガーマンハイム社）により、３７℃、６０分間反応させた。この反応液に等量のフェノール／クロロホルム（等量混合液）を加え穏やかに混合し、１５０００ｒｐｍ、１５分間遠心し水層（上層）を回収した。この回収液に等量の水飽和エーテルを加え穏やかに混合し、１５０００ｒｐｍ、１５分間遠心しエーテル層（上層）を除去した。残りの水層に３Ｍ 酢酸ナトリウム２μｌ、１００％エタノールを５００μｌを加え、氷中に１５分間保持した後、１５０００ｒｐｍ、１５分間遠心し、上清を除いた。
沈殿に７０％エタノールを５００μｌ加え、１５０００ｒｐｍ、１５分間遠心し、上清を除き、１０分間減圧乾燥を行った後、滅菌蒸留水２０μｌを加えた。この溶液５μｌにブランティングキット（宝酒造社）に含まれる１０×バッファーを１μｌ、滅菌蒸留水を３μｌを加え、７０℃で５分間保温した後、Ｔ４ ＤＮＡ ポリメラーゼ１μｌを加え、３７℃、５分間保温することにより、末端平滑化を行った。撹拌によりＴ４ ＤＮＡ ポリメラーゼを失活させた後、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ａを４０μｌ、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｂを１０μｌ加え、１６℃で３０分間保温することにより分子内ライゲーションを行った。この反応液２μｌと０．５Ｍ β−メルカプトエタノール２μｌをともに大腸菌ＩＮＶα‘Ｆコンピテントセルに加え、氷中、３０分間放置した後、４２℃、３０秒間熱処理し、大腸菌へのプラスミドの形質転換を行った。
形質転換した大腸菌にＳＯＣ培地（２．０％ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ，０．５％ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ，１０．０ｍＭ ＮａＣｌ，２．５ｍＭ ＫＣｌ，１０．０ｍＭ ＭｇＣｌ_２−６Ｈ_２Ｏ，２０．０ｍＭ ｇｌｕｃｏｓｅ）２５０μｌを加え、３７℃、６０分間振とうした後、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ平板培地に植菌し、３７℃、一晩培養した。現れた白色のコロニーを５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む３ｍｌのＬＢ液体培地に接種し、３７℃、一晩培養した。培養後、大腸菌よりプラスミド ミニ キット（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、プラスミドを抽出した。
このようにして得られたプラスミドを鋳型とし、シーケンス反応を行った。シーケンシングプライマーはＩＲＤ４１ Ｉｎｆａｒｅｄ Ｄｙｅ Ｌａｂｅｌｅｄ Ｍ１３ Ｆｏｒｗａｒｄ プライマーおよびＩＲＤ４１ Ｉｎｆａｒｅｄ Ｄｙｅ Ｌａｂｅｌｅｄ Ｍ１３ Ｒｅｖｅｒｓｅ プライマー（日清紡製造、アロカ（株）販売）を、反応液はＳｅｑｕｉ Ｔｈｅｒｍ（登録商標）Ｌｏｎｇ−Ｒｅａｄ（登録商標）Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ−ＬＣ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）を使用した。塩基配列決定は、４０００Ｌ Ｌｏｎｇ ＲｅａｄＩＲ（登録商標） ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＬＩ−ＣＯＲ社製）を用いた。
得られたペクチネータス・セルビシフィラスの１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子と２３ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子の間のスペーサー領域（ロング）の遺伝子配列を配列番号３に示す。
（４）スペーサー領域ショートのクローニング及びシークエンシング
実施例４−（２）のＰＣＲ終了後の反応液を、ハイ ピュア ＰＣＲ プロダクト ピュリフィケイション キット（ベーリンガーマンハイム社）を用い、未反応のｄＮＴＰｓを除去した。このように調製した増幅ＤＮＡ１００ｎｇにＴＡ クローニング キット（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社）に含まれるプラスミドｐＣＲ２．１を２μｌ、リガーゼを１μｌ、バッファーを１μｌ、滅菌水を全量１０μｌになるように加え、１４℃、４時間反応させた後、その２μｌと０．５Ｍ β−メルカプトエタノール２μｌをともに大腸菌ＩＮＶα‘Ｆコンピテントセルに加え、氷中、３０分間放置した後、４２℃、３０秒間熱処理し、大腸菌へのプラスミドの形質転換を行った。形質転換した大腸菌にＳＯＣ培地（２．０％ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ，０．５％ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ，１０．０ｍＭ ＮａＣｌ，２．５ｍＭ ＫＣｌ，１０．０ｍＭ ＭｇＣｌ_２−６Ｈ_２Ｏ，２０．０ｍＭ ｇｌｕｃｏｓｅ）２５０μｌを加え、３７℃、６０分間振とうした後、５０μｇ／ｍｌアンピシリンおよび４０μｇ／ｍｌＸ−Ｇａｌを含むＬＢ平板培地に植菌し、３７℃、一晩培養した。現れた白色のコロニーを５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む３ｍｌのＬＢ液体培地に接種し、３７℃、一晩培養した。培養後、大腸菌よりプラスミド キット（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、プラスミドを抽出した。
得られたプラスミドの一部を取り、制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社）により３７℃、６０分間反応させた後アガロース電気泳動、エチジウムプロマイドによるＤＮＡの染色により、ショートが挿入されていることを確認した。残りのプラスミドのうち５００ｎｇを制限酵素ＳｍａＩ（東洋紡社）により、３０℃、６０分間反応させた後、３Ｍ 酢酸ナトリウム２μｌ、１００％エタノールを５００μｌを加え、氷中に１５分間保持した後、１５０００ｒｐｍ、１５分間遠心し、上清を除いた。沈殿に７０％エタノールを５００μｌを加え、１５０００ｒｐｍ、１５分間遠心し、上清を除き、１０分間減圧乾燥を行った。この沈殿に滅菌水を加えて溶解し、制限酵素ＢａｍＨＩ（宝酒造社）により、３７℃、６０分間反応させた。この反応液に等量のフェノール／クロロホルム（等量混合液）を加え穏やかに混合し、１５０００ｒｐｍ、１５分間遠心し水層（上層）を回収した。この回収液に等量の水飽和エーテルを加え穏やかに混合し、１５０００ｒｐｍ、１５分間遠心しエーテル層（上層）を除去した。残りの水層に３Ｍ 酢酸ナトリウム２μｌ、１００％エタノールを５００μｌを加え、氷中に１５分間保持した後、１５０００ｒｐｍ、１５分間遠心し、上清を除いた。
沈殿に７０％エタノールを５００μｌ加え、１５０００ｒｐｍ、１５分間遠心し、上清を除き、１０分間減圧乾燥を行った後、滅菌蒸留水２０μｌを加えた。この溶液５μｌにブランティングキット（宝酒造社）に含まれる１０×バッファーを１μｌ、滅菌蒸留水を全量３μｌを加え、７０℃で５分間保温した後、Ｔ４ ＤＮＡ ポリメラーゼ１μｌを加え、３７℃、５分間保温することにより、末端平滑化を行った。撹拌によりＴ４ ＤＮＡ ポリメラーゼを失活させた後、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ａを４０μｌ、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｂを１０μｌ加え、１６℃で３０分間保温することにより分子内ライゲーションを行った。この反応液２μｌと０．５Ｍ β−メルカプトエタノール２μｌをともに大腸菌ＩＮＶα‘Ｆコンピテントセルに加え、氷中、３０分間放置した後、４２℃、３０秒間熱処理し、大腸菌へのプラスミドの形質転換を行った。形質転換した大腸菌にＳＯＣ培地（２．０％ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ，０．５％ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ，１０．０ｍＭ ＮａＣｌ，２．５ｍＭ ＫＣｌ，１０．０ｍＭ ＭｇＣｌ_２−６Ｈ_２Ｏ，２０．０ｍＭ ｇｌｕｃｏｓｅ）２５０μｌを加え、３７℃、６０分間振とうした後、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ平板培地に植菌し、３７℃、一晩培養した。現れた白色のコロニーを５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む３ｍｌのＬＢ液体培地に接種し、３７℃、一晩培養した。培養後、大腸菌よりプラスミド キット（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、プラスミドを抽出した。
このようにして得られたプラスミドを鋳型とし、シーケンス反応を行った。シーケンシングプライマーはＩＲＤ４１ Ｉｎｆａｒｅｄ Ｄｙｅ Ｌａｂｅｌｅｄ Ｍ１３ Ｆｏｒｗａｒｄ プライマーおよびＩＲＤ４１ Ｉｎｆａｒｅｄ Ｄｙｅ Ｌａｂｅｌｅｄ Ｍ１３ Ｒｅｖｅｒｓｅ プライマー（日清紡製造、アロカ（株）販売）を、反応液はＳｅｑｕｉＴｈｅｒｍ（登録商標）Ｌｏｎｇ−Ｒｅａｄ（登録商標）Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ−ＬＣ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）を使用した。塩基配列決定は、４０００Ｌ Ｌｏｎｇ ＲｅａｄＩＲ（登録商標）ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＬＩ−ＣＯＲ社製）を用いた。
得られたペクリネータス・セルビシフィラスの１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子と２３ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子の間のスペーサー領域（ショート）の遺伝子配列を配列番号４に示す。
実施例５
ＰＣＲ法によるペクチネータス・セルビシフィラスの検出
（１）ペクチネータス・セルビシフィラスのためのプライマーの選定と合成
配列番号３を基にＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトウエアエンジニアリング（株））を用いてペクチネータス・セルビシフィラスに特異的な配列を解析した。その結果、配列番号３のペクチネータス・セルビシフィラスの１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子と２３ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子の間のスペーサー領域の遺伝子配列上の１３５番目から１５３番目までの配列を選定した。（配列番号７）
また、同様の解析により、配列番号３のペクチネータス・セルビシフィラスの１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子と２３ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子の間のスペーサー領域の遺伝子配列上の１７２番目から１９１番目までの配列を選定した。（配列番号８）
また、同様の解析により、配列番号３のペクチネータス・セルビシフィラスの１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子と２３ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子の間のスペーサー領域の遺伝子配列上の２０３番目から２２２番目までの配列を選定した。（配列番号９）
さらにペクチネータス・セルビシフィラスの１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子配列より、配列番号１１に示す特異的プライマーを選定した。これらのオリゴヌクレオチドを実施例２−（１）と同様の方法で化学合成した。
（２）配列番号７および配列番号１１の配列をもつプライマーを用いたペクチネータス・セルビシフィラスの検出及び同定。
実施例１で調製した各菌のＤＮＡ溶液を、実施例５−（１）で合成したプライマー（配列番号７および配列番号１１）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは以下の温度条件：
熱変性；９４℃ ３０秒
アニーリング；５５℃ ３０秒
鎖長反応；７２℃ ３０秒
を１サイクルとし、これを３５サイクル繰り返して行った。ＰＣＲ終了後、反応液をアガロースゲルにて、１００Ｖ定電圧で３０分間電気泳動に供した。反応液の他に、分子量マーカーとしてｐＨＹマーカーも同時に泳動した。泳動終了後、約０．５μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイド溶液中で２０分間染色した後、紫外線照射下でゲルを観察し、写真撮影を行った。ゲルの観察または撮影した写真より、増幅産物の塩基長を分子量マーカーとの相対移動度から求めた。
その結果、図２に示されるように、ペクチネータス・セルビシフィラスにのみ約６００ｂｐｓのバンドが検出された。
この結果より、本発明の配列番号７及び配列番号１１のオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして用いた場合、ペクチネータス・セルビシフィラスにのみ目的長のバンドが検出された。このことより、本発明の各オリゴヌクレオチドが、ペクチネータス・セルビシフィラスの１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子と２３ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子の間のスペーサー領域の遺伝子配列および１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子上の標的とする塩基配列を正しく認識していることが示された。かつ、同属のペクチネータス・フリシンゲンシスを始め、近縁な偏性嫌気性菌やグラム陽性菌にも目的長のバンドは一切検出されなかったことから、本発明は、ペクチネータス・セルビシフィラスを種特異的に検出できることを示し、ペクチネータス・セルビシフィラスを検出できると同時に同定も行うことが出来るものであることが示された。
産業上の利用の可能性
本発明により、ペクチネータス・フリシンゲンシスおよびペクチネータス・セルビシフィラスの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子と２３ＳｒＲＮＡ遺伝子の間に構成されているスペーサー領域の遺伝子が明らかになり、この遺伝子配列の全部または一部を用いたペクチネータス・フリシンゲンシスおよびペクチネータス・セルビシフィラス菌を迅速かつ確実に検出する方法が提供された。
【図面の簡単な説明】
図１は実施例３における電気泳動図。
図２は実施例５における電気泳動図。

Claims (4)

1. ペクチネータス・フリシンゲンシス（Pectinatus frisingensis）の１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子と２３ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子との間のスペーサー領域の遺伝子配列を一方のプライマーとして選択し、１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子配列をもう一方のプライマーとするプライマー対であって、１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子と２３ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子との間のスペーサー領域の遺伝子配列が、
   ５’−ＣＣＡＴＣＣＴＣＴＴＧＡＡＡＡＴＣＴＣ−３’ または
   ５’−ＴＣＴＣＹＴＣＴＣＡＣＡＡＧＴＴＴＧＧＣ−３’または
   対応する相補的配列からなり、１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子配列が、
   ５’−ＣＧＴＡＴＣＣＡＧＡＧＡＴＧＧＡＴＡＴＴ−３’ または
   対応する相補的配列からなるオリゴヌクレオチド。
2. ペクチネータス・セルビシフィラス（Pectinatus cerevisiiphilus）の１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子と２３ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子との間のスペーサー領域の遺伝子配列を一方のプライマーとして選択し、１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子配列をもう一方のプライマーとするプライマー対であって、１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子と２３ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子との間のスペーサー領域の遺伝子配列が、
   ５’−ＣＡＣＴＣＴＴＡＣＡＡＧＴＡＴＣＴＡＣ−３’ または
   ５’−ＣＣＡＣＡＡＴＡＴＴＴＣＣＧＡＣＣＡＧＣ−３’ または
   ５’−ＡＧＴＣＴＴＣＴＣＴＡＣＴＧＣＣＡＴＧＣ−３’ からなるオリゴヌクレオチド、または対応する相補的配列からなり、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子をコードする遺伝子配列が、
   ５’−ＣＧＴＡＴＧＣＡＧＡＧＡＴＧＣＡＴＡＴＴ−３’ または
   対応する相補的配列からなるオリゴヌクレオチド。
3. ペクチネータス・フリシンゲンシス（Pectinatus frisingensis）の１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子と２３ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子との間のスペーサー領域の遺伝子配列として、
   ５’−ＣＣＡＴＣＣＴＣＴＴＧＡＡＡＡＴＣＴＣ−３’ または
   ５’−ＴＣＴＣＹＴＣＴＣＡＣＡＡＧＴＴＴＧＧＣ−３’からなるオリゴヌクレオチド、または、対応する相補的配列からなるオリゴヌクレオチドを一方のプライマーとして選択し、１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子配列として、
   ５’−ＣＧＴＡＴＣＣＡＧＡＧＡＴＧＧＡＴＡＴＴ−３’ からなるオリゴヌクレオチド、または、対応する相補的配列からなるオリゴヌクレオチドをもう一方のプライマーとすることで、遺伝子増幅処理することによってペクチネータス・フリシンゲンシスを検出する方法。
4. ペクチネータス・セルビシフィラス（Pectinatus cerevisiiphilus）の１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子と２３ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子との間のスペーサー領域の遺伝子配列として、
   ５’−ＣＡＣＴＣＴＴＡＣＡＡＧＴＡＴＣＴＡＣ−３’ または
   ５’−ＣＣＡＣＡＡＴＡＴＴＴＣＣＧＡＣＣＡＧＣ−３’ または
   ５’−ＡＧＴＣＴＴＣＴＣＴＡＣＴＧＣＣＡＴＧＣ−３’ からなるオリゴヌクレオチド、または対応する相補的配列からなるオリゴヌクレオチドを一方のプライマーとして選択し、１６ＳｒＲＮＡをコードする遺伝子配列として
   ５’−ＣＧＴＡＴＧＣＡＧＡＧＡＴＧＣＡＴＡＴＴ−３’ からなるオリゴヌクレオチド、または、対応する相補的配列からなるオリゴヌクレオチドをもう一方のプライマーとすることで、遺伝子増幅処理することによってペクチネータス・セルビシフィラスを検出する方法。

Images