WO2000008161A1

WO2000008161A1 - Expression de glycinine de soja dans des plantes transgeniques

Info

Publication number: WO2000008161A1
Application number: PCT/JP1999/001057
Authority: WO
Inventors: Fumio Takaiwa; Shigeru Utsumi; Tomoyuki Katsube
Original assignee: JAPAN AS REPRESENTED BY DIRECTOR GENERAL OF MINISTRY OF AGRICULTURE FORESTRY AND FISHERIES NATIONAL INSTITUTE OF AGROBIOLOGICAL RESOURCES; Bio Oriented Technology Research Advancement Institution
Current assignee: JAPAN AS REPRESENTED BY DIRECTOR GENERAL OF MINISTRY OF AGRICULTURE FORESTRY AND FISHERIES NATIONAL INSTITUTE OF AGROBIOLOGICAL RESOURCES; Bio Oriented Technology Research Advancement Institution
Priority date: 1998-08-07
Filing date: 1999-03-04
Publication date: 2000-02-17
Anticipated expiration: 2001-02-07
Also published as: CA2362013A1; JP2000050871A; US6576820B1; JP3030339B2

Description

ダイズグリシニンを発現するトランスジエニック植物技術分野

本発明は、食物成分として有用なダイズグリシニンを発現させた植物およびその繁殖媒体に関し、農業や食品などの分野に属する。背景技術

ダイズからタンパク質を抽出し、酸沈殿（pH4.5)させたダイズ分離タンパク質 (ダイズグロブリンを主要成分としている）は、ヒトの血清コレステロール値を低下させ、動脈硬化や冠状動脈性心疾患などの予防や治療に有効である。特に、高コレステロール血症患者の総コレステロール値、 LDL -コレステロール値及びトリグリセリド値の低下に顕著な効果がある（Mercer, N.J.H., Carroll, K.K., G iovannetti, P.M., Steinke, F.H. and Wolfe, B.M., Nutr. Rep. Int., 35, 27 9-287 (1987)、井村隆、田中真実、渡辺毅、ェ藤重光、打田俤治、金沢武動 Ther. Res., 17, 2451-2456 (1996)、菅野道廣食品工業， 39 (18), 59 - 68 (19 96))。また、コレステロール値が正常範囲の健常者においても総コレステロール値に有意の低下が見られる（Kito， M.， Moriyama, T.， Kimura, Υ. and Kambara, H. Biosci. Biotech. Biochem., 57, 354-355 (1993)、神原啓文、野原隆司、鬼頭誠 Ther. Res., 14, 3197-3204 (1993)) 。

ダイズのコレステロ一ル値低下機能に対して、ダイズタンパク質によるコレステロールや胆汁酸の吸収阻害が第一義的な役割を果たしている（菅野道廣食品工業， 39 (18)， 59-68 (1996))。すなわち、コレステロールの吸収が阻害された結果、肝臓でのコレステロール合成が上昇する。しかし、同時に胆汁酸の再吸収も阻害されるので肝臓のコレステロールは胆汁酸へと酸化される。この結果、肝臓のコレステロール濃度が低くなり、血清中のコレステロールの肝臓への取り込みが促進され、血清コレステロール値が低下することになる（管野道廣食品ェ業, 39 (18)， 59-68 (1996)) 。

ダイズタンパク質をプロテア一ゼで強く消化したときの不消化画分が強い血清コレステロール値低下作用を示すことが知られている（菅野道廣食品工業， 39 (18), 59-68 (1996))。不消化画分に存在するペプチドの一次構造は決定されていない（菅野道廣食品工業， 39 (18), 59-68 (1996))。一方、ダイズグロプリンの主要成分であるグリシニンの AlaBlbサブュニッ卜に由来するぺプチドが胆汁酸結合能を持つことが示されており（牧野志雄食品工業， 39 (24)， 77-87 (19 96))、上記不消化画分は、 AlaBlbサブュニットに由来する胆汁酸結合性べプチドに由来していると考えられている（菅野道廣食品工業， 39 (18), 59-68 (199 6)) 。また、ダイズタンパク質に由来する疎水性ペプチドが胆汁酸結合能を有することが知られている（Iwajni, K.， Sakakibara, K. and Ibuki, F. Agric. Bio 1. Chem.， 50, 1217-1222 (1986)) 。ダイズグロブリンの中で、グリシニンが最も疎水性に富み、 AlaBlbサブュニッ卜に由来する胆汁酸結合性ペプチド中にも疎水性領域が 2ケ所存在する（内海成食品工業， 40 (10)， 68-79 (1997))。したがって、ダイズタンパク質の血清コレステロール値低下機能は、主にグリシ二ンに存在しており、特に AlaBlbサブュニッ卜への依存度が高いと考えられる。ダイズ分離タンパク質の産業上の応用としては、食品分野において、不二製油のダイズからあげ、プロテインがんも、かねさ株式会社の G- 9、 G-9 100、日本ハムのてりやきミートボール、ハンバーグ、ポ一ルフランクなどが販売されている。しかしながら、グリシニン自体を添加した機能性食品に関しては、これまでに報告されていない。

一方、農業分野においても、ダイズグリシニンの特性を他の植物に付与するなどの試みは報告されていない。発明の開示

本発明者らは、上記のようなダイズグリシニンの性質に着目し、ダイズグリシニンをダイズ以外の植物種において発現させることにより、コレステロ一ル値低下機能などのダイズにみられる特性を他の植物種において実現することが可能であると考えた。また、本発明者らは、ダイズグリシニンタンパク質が、上記コレステロール値低下機能以外にも、水溶性で豆腐のように幅広い加工用途があること、およびコメなどには少ない必須アミノ酸「リジン」を多く含むため栄養性の観点からも優れていることにも着目し、他の農作物においてダイズグリシニン夕ンパク質を発現させることにより新しい加工食品の生産や、栄養価の高い新たな農作物の生産を行うことが可能であると考えた。従って、本発明は、ダイズグリシニンを発現させた植物、特に食糧として有用な農作物を提供することを課題とする。

イネは、その種子であるコメが我々の食生活において不可欠であり、最も重要な農作物の一つである。コメには、そのタンパク質の 80%を占める、主要貯蔵夕ンパク質グルテリンが存在する。グルテリンは、ダイズグリシニンとアミノ酸配列レベルで 32〜37%の相同性があり、基本構造が類似している。即ちグリシニン · グルテリンどちらも、シグナルペプチド、 A鎖、 B鎖から成るプレブ口型として生合成され、プロ型を経て、配列がよく保存された特異的部位でプロセッシングを受けて成熟型になる。グリシニンは 3量体を経て 6量体に分子集合し、塩溶液可溶性であり、グルテリンはジスルフィド結合や疎水的結合により巨大分子化していると考えられ塩溶液不溶性であるという相違も存在するが、基本構造の類似性などから、両タンパク質は共通の祖先遺伝子に出来していると考えられている（図 1 ) 。そこで、このグルテリン遺伝子のプロモー夕を用いて、栄養性や加工特性が優れ、ヒトの血清中コレステロール値を低下させる健康維持増進性を備えたダィズグリシニンを、グルテリンと同様にコメ種子で発現、蓄積させることができれば、コメの野生型に近い形を維持したまま、コメの付加価値を高めうると考えられる。また、グリシニンとグルテリンのハイブリッドタンパク質の蓄積も期待できる。そこで、本発明者らは、ダイズグリシニンを発現させる植物として、特にイネを選択し、その種子であり有用農作物であるコメにおいてダイズグリシ二ンの発現および蓄積を行った。

具体的には、イネ種子の胚乳に特異的に遺伝子を発現させるグルテリン遺伝子のプロモーター領域を単離して、該プロモー夕一の下流に天然型あるいは改造型のダイズグリシ二ン遺伝子が連結されたベクターを構築し、これらキメラ遺伝子をイネ培養細胞に導入して、トランスジヱニックイネ植物体を得た。次いで、作出したトランスジエニックィネ植物体において発現させたダイズグリシニンの組織特異性および形態につき検討を行った。その結果、本発明者らは、イネにおいて発現させたダイズグリシニンがイネ種子に蓄積しており、また蓄積したダイズグリシニンがプロセシング過程を経た成熟型として存在することを見出した。即ち、本発明者らは、イネ種子においてダイズグリシニンを発現させ、機能的な形態で蓄積させることに成功し、本発明を完成した。

本発明は、ダイズグリシニン遺伝子が導入された植物細胞および植物体、好ましくはイネ植物体、並びにその繁殖媒体に関し、より具体的には、

( 1 ) ダイズグリシニンタンパク質をコードする遺伝子を発現可能に保持するトランスジヱニック植物細胞、

( 2 ) ダイズグリシニンタンパク質が AlaBlbサブユニットである、（ 1 ) に言己載のトランスジ: nニック植物細胞、

( 3 ) ダイズグリシニンタンパク質をコードする遺伝子がィネグルテリン遺伝子のプロモーターの下流に結合している、（ 1 ) または（2 ) に記載のトランスジエニック植物細胞、

( 4 ) ( 1 ) から（3 ) のいずれかに記載のトランスジヱニック植物細胞を含むトランスジエニック植物体、

( 5 ) イネ科植物である、（4 ) に記載のトランスジヱニック植物体、 (6) イネである、（4) に記載のトランスジエニック植物体、

(7) 少なくともその一部にダイズグリシニンタンパク質が蓄積している、（4) から（6) のいずれかに記載のトランスジヱニック植物体、

(8) (4) から（6) のいずれかに記載の植物体の繁殖媒体、

(9) コメである、（8) に記載の繁殖媒体、

( 10) ダイズグリシニンタンパク質が蓄積している、（8) または（9) に記載の繁殖媒体、に関する。

本発明は、ダイズグリシニンタンパク質をコードする遺伝子が導入された植物細胞および植物体、並びにその繁殖媒体に関する。

ダイズグリシニンは、 AlaBlb,AlbB2，A2Bla，A3B4，A5A4B3のサブュニッ卜が、ほぼランダムに 6個組み合わさつて形成されている（グリシニンのサブュニヅト構造および配列については、文献「Utsumi,S.et al., Marcel Dekker, 257-291, 1997, U tsumi,S.et al. , J. Agric. Food. Chem. ,35,210-214, 1987, Cho,T. -J. and Nielsen, N.CNucl. Acids Res. , 17,4338, 1989, Utsumi , S . et al. ,Agric. Biol. Chem. ,51,3 267-3273,1987, Fukazawa,C.et al. , J. Biol. Chem. ,260,6234- 6239, 1985、 M画 a， T.et al. ,Eur. J.Biochem. , 149,491-496, 1985j 参照のこと）。本発明において植物細胞内で発現させるダイズグリシニンタンパク質をコードする遺伝子としては、これらダイズグリシニンのサブュニットをコードする限り特に制限はないが、コレステロール値低下機能などが知られている AlaBlbサブュニット（配列番号： 1) またはこれと同様の効果を示すと考えられる AlbB2若しくは A2Blaサブュニットをコードする遺伝子が特に好ましい。本発明においては、植物細胞内においてこれらサブュニットのうち単一のサブュニットを発現させてもよく、また複数のサブュニットを組み合わせて発現させてもよい。

また、天然型のダイズグリシニンタンパク質のみならず、その機能的誘導体を発現させてもよい。「機能的誘導体」とは、天然型のタンパク質のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、および/若しくは付加したァミノ酸配列からなり、天然型のタンパク質と機能的に同等なタンパク質を指す。機能的に同等とは、変異夕ンパク質が天然型のタンパク質と同等のコレステロ一ル値低下作用、加工特性、および/または栄養性を有していることを指す。機能的誘導体は、自然界において生じることもあるが、人為的に調製することも可能である。人為的な調製方法としては、例えば、一本鎖のオリゴヌクレオチドを利用して部位特異的に特定のアミノ酸（1〜複数残基）を他のアミノ酸に置換する、欠失させる、あるいは特定の部位にアミノ酸（1〜複数残基）を挿入する方法、特定の制限酵素サイトを利用して二本鎖の外来遺伝子あるいは合成遺伝子のァミノ酸を挿入、置換、あるいは欠失させる方法などが挙げられる（Utsumi，S. ,Adv. Fo od Nutr. Res.，36, 89-208, 1992参照）。

ダイズグリシニン遺伝子を導入する植物細胞としては、特に制限はなく、あらゆる植物種に由来する細胞を用いることが可能であるが、ダイズグリシニンのコレステロール値低下機能などを生体内において発揮させるという本発明の目的からして、特に農作物の細胞が好ましい。農作物としては、例えば、イネ、ォォムギ、コムギ、ライムギ、トウモロコシなどの穀類、インゲンマメ、ゾラマメ、ェンドウなどの豆科作物、ピ一ナツ、ゴマ、ナタネ、綿実、ヒマヮリ、サフラワーなどの油糧用種子作物、ジャガイモ、サヅマイモなどの塊根を形成する作物、リンゴ、メロン、ブドウなどの果実を有する作物、ホウレン草、チンゲンサイ、キャべッなどのように葉が食用となる作物が挙げられる。本発明においてダイズグリシニン遺伝子が導入される植物細胞の形態としては、植物体に再生可能なあらゆる種類の形態の植物細胞が含まれる。例えば、培養細胞、プロトプラスト、苗条原基、多芽体、毛状根、カルスが挙げられるが、これらに制限されない。本発明における植物細胞には、植物体中の細胞も含まれる。

ダイズグリシニン遺伝子を植物細胞内で発現させるためには、（i )植物細胞内で転写可能なプロモーター配列、（ii )プロモーター配列の下流にセンス方向に結合されたダイズグリシニン遺伝子と、（iii )該遺伝子の下流に結合された、転写の終結およびポリァデニル化に必要な配列を含む夕一ミネ一夕一配列、を含む DNA分子を植物細胞に導入する。このような DNA分子は、プロモーター以外にも、転写をさらに増強するための DNA配列、例えば、ェンハンサ一配列を含んでいてもよい。用いられるプロモーターとしては、植物細胞内で機能するものであれば特に制限はないが、再生した植物体においてグリシニン遺伝子を発現させたい所望の部位で効果的な発現を保証する組織特異的プロモーターが好ましい。組織特異的プロモ—夕—としては、例えば、イネの種子において発現させる場合にはグルテリン遺伝子のプロモーター（TakaiwaJ.et al., Plant Mol. Biol.，17， 875- 885,1991)、インゲンマメ、ソラマメ、エンドゥなどの豆科作物やピーナツ、ゴマ、ナタネ、綿実、ヒマヮリ、サフラワーなどの油糧用種子作物の種子において発現させる場合には、グリシニン遺伝子のプロモーターあるいは各作物の主要な貯蔵タンパク質遺伝子のプロモーター、例えば、インゲンマメであればファゼォリン遺伝子のプロモーター（Murai，N.et al. , Science, 222, 476- 482， 1983)、ナ夕ネであればクルシフェリン遺伝子のプロモーター（Rodin，J.et al., Plant Mol. Biol. ,20, 559- 563,1992) が挙げられる。また、ジャガイモの塊茎で発現させる場合には、パ夕チン遺伝子のプロモーター (Rocha-Sosa,M.et al.,EMB0 J. ,8,23-29, 1989) 、サツマィモの塊根で発現させる場合には、スポラミン遺伝子のプロモ一夕一（Hatt ori,T.and Nakamura,K. , Plant Mol. Biol. ,11, 417-426, 1988) ,ホウレン草などの野菜の葉で発現させる場合には、リブロース- 1，5-ビスリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子のプロモーター (Orozco,B.M.and 0gren,W.L. , Plant Mol. Biol. ,23, 1129- 1138, 1993)が好適である。これらプロモーターの具体例は、あくまで例示であり、実際には目的に応じてこれら以外の様々なプロモー夕一を利用することが可能である。また、上記組織特異的プロモーター以外にも、例えば、 35Sプロモーターなどの恒常的な発現のためのプロモーターや誘導可能なプロモ一夕一を用いることも可能である。

植物細胞へのダイズグリシニン遺伝子の導入は、当技術分野における技術者に公知の種々の方法を用いて導入することが可能である。例えば、ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンスゃァグロパクテリゥム · リゾゲネスを利用した間接導入法 (Hiei,Y.et al., Plant J. ,6,271-282, 1994, Takai aJ.et al., Plant Sci.11 1,39-49,1995) や、エレクト口ポレーシヨン法（Tada，Y. et al. Theor.Appl.Ge net,80, 475, 1990) 、ポリエチレングリコール法 (Datta,S.K.et al., Plant Mol Biol. ,20,619-629, 1992)、パーティクルガン法 (Christou,P.et al., Plant J.2， 275-281,1992、 Fro腿 ,Μ.Ε.，Bio/Technology，8，833- 839， 1990) などに代表される直接導入法を用いることが可能である。

形質転換された植物細胞は、再生させることにより植物体を作出することができる。再生の方法は植物細胞の種類により異なるが、代表的な方法としては、例えば、イネであれば Fujimuraらの方法（Fujimura, t.et al., Plant Tissue Cultu re Lett., 2, 74, 1995)、トウモロコシであれば Armstrongらの方法 (Armstrong, C. L.and Phillips, R. L. , Crop Sci, ,28,363- 369, 1988) 、ナ夕ネであれば Radkeらの方法（Radke S.E. ,Theor.Appl. Genet.75, 685-694, 1988) 、ジャガイモであれば S heermanらの方法 (Sheerman,S,and Bevan, .W. , Plant Cell Rep. ,7, 13-16, 1988) が挙げられる。

これにより作出されたトランスジエニック植物体またはその繁殖媒体 (例えば、種子、塊根、塊茎、果実、切穂など）から得た植物体には、導入したダイズグリシニン遺伝子の発現により、標的部位にダイズグリシニンが発現し、蓄積する。これにより栄養性、加工特性、健康増進特性などのダイズグリシニンタンパク質が保持する特性を他の植物種において実現することが可能である図面の簡単な説明

図 1は、ダイズグリシニンおよびイネグルテリンの成熟過程を示す図である。図 2は、本発明においてイネの形質転換に用いたプラスミド「pGluBlGlyN」および「pGluBlGlyIV」を示す図である。図 3は、トランスジエニックイネ植物体の完熟種子および葉におけるグリシ二ン遺伝子およびグルテリン遺伝子の発現をノ一ザンブロット法により検出した結果を示す電気泳動像写真である。図中の「DAF」は、開花後の日数を示す。

図 4は、トランスジヱニックイネ植物体の完熟種子における天然型および改造型グリシニンの発現をドットプロット解析した結果を示す図である。

図 5は、トランスジエニックィネ植物体の完熟種子において発現する天然型および改造型グリシ二ンの分子集合形態を解析した結果を示す電気泳動写真である。図 6は、ダイズグリシニンとコメグルテリンの相互作用にっき検出した結果を示す電気泳動写真である。

図 7は、コメ種子における発現グリシニンの In situ発現部位をティシュプリント法により解析した結果を示す写真である。

図 8は、連続抽出処理によるダイズグリシニンの溶解性解析の結果を示す電気泳動写真である。発明を実施するための最良の形態

以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。

[実施例 1 ] ダイズグリシ二ン発現べク夕一の構築およびダイズグリシニンを発現する形質転換ィネ植物体の作出

( 1 )ダイズグリシ二ン cDNAの単離

イネの形質転換に用いるダイズグリシニン発現プラスミドの構築を行った。具体的には、 AlaBlb cDNA を含む pUGl (S. Utsumi, S. Kitaga a, T. Katsube, I . J. Kang, A.B. Gidamis, F. Takaiwa, and M. Kito, 1993， 92(2) : 191-202) の X hoi断片（1.7kb) を dNTP存在下でクレノウ修復した。

(2)ィネグルテリン遺伝子プロモーターを有するベクターへのダイズグリシニン c DNAの挿入グルテリン GluB-1遺伝子のゲノミッククローン； I INE9 (Takai aJ. et al . ,Pla nt.Mol.Biol.17,875-885, 1991)の DNAをまず制限酵素 Kpnlと EcoRIで切断して、グルテリン遺伝子のプロモーターと N末端のコ一ド領域を含む断片をクローニングし、サブクローン Kpn9を得た。さらにこのサブクローン DNAを制限酵素 Sau3Aで切断し、 1.6kbの Sau3A断片（ィネグルテリン遺伝子の転写領域 330bpと 5'上流領域 1. 3kb) を得た。このプラスミドを用いてグルテリン遺伝子の転写開始点 +18にある制限酵素 Af 1 I Iと pUC 118ベクターにある Sma Iを利用してグルテリンのコード領域を除去し、この部分に（ 1 )で調製したグリシニン c DN Aを挿入した。方向性はグリシニン cDNA中にある EcoRIサイトと pUC118ベクターの Hindll lサイトを利用して確認した。

GluB- 1プロモ一夕（- 1302から + 18)とグリシニン cDNAを含む断片を Hindi IIおよび Sacl消化により回収し、 GluB- 1の 3，非翻訳領域 0.7 kb、 CaMV35Sプロモータ、ビァラフォス耐性遺伝子（BAR)およびノバリン合成遺伝子夕一ミネ一夕（N0S termin ator)を含む pUC18に挿入した。これにより構築したプラスミドを「pGluBlGly」と命名した。同様にして、改質グリシニン cDNA (pUGHV) (S. Utsumi, S. Kitagaw a, T. Katsube, I .J. Kang, A.B. Gidamis, F. Takaiwa, and M. Kito, 1993, P lant Sci . , 92(2) : 191- 202) と GluB- 1プロモータ（-1302から +18)を含むキメラ遺伝子のプラスミドも調製した。このプラスミドを「pGluBlGlyIV」と命名した。構築したプラスミドの模式図を図 2に示す。

形質転換体の作製は以下のように行った。イネのカルスを完熟種子の胚盤より誘導し、改変 N6培地でカルスを培養し、プロトプラストを Fujimuraらの方法（Fu jimura,T. , et al . , Plant Tissue Culture Lett.2，74- 75, 1985)で単離した後、大槻らの方法（大槻義昭ら，イネ 'プロトプラストの効率的調製にかかわるけん濁培養条件，育種学雑誌， 35巻,別冊 1, 78-79) でプロトプラスト培養を行った。

キメラ遺伝子を含むプラスミドを、エレクトロポレーション法によってプロトプラストに直接導入した。エレクトロボレ一シヨンは、 Tadaら（Tada，Y. et al . , Theor. Appl . Genet, 80, 475-480, 1990) の ASP緩衝液を用いて、プラスミド 20〃g /ml、 750V/cm、 40msecで行った。組み換え体の選抜は、プロトプラスト培地、力ルス増殖培地、および再分化培地に選抜マーカーのビアラフォス剤を 1 Omg/ 1添加して'仃つた。

「_PGluBlGly」と「_PGluBlGlyIV」が導入された、それそれ 68個体と 52個体（松山三井）、 26個体と 15個体（ひめのまい）を完熟まで育成した。植物体の再生は、 Ozawaらの方法 (Oza a,K. and Komamine, A. , Theor. Appl . Genet, 77, 205-211 , 1989) に従った。グリシ二ン遺伝子および BAR遺伝子がイネゲノムに挿入されていることは、グルテリンプロモーターとダイズグリシニン遺伝子に特異的なプライマーを用いた PCRにより確認した。

[実施例 2 ] グルテリンおよびグリシニンの組み換えタンパク質の調製グルテリン（GluA- 1、 GluB-1) とグリシニン（AlaBlb) の成熟型タンパク質に相当する cDNA部分を、以下の組み合わせのプライマ一、即ち、 GluA- 1 (配列番号： 2 /5' -CAGCAGCTATTAGGCCAGAGCACTAG-3' , 配列番号： 3 /5， - GGGAAGCTTTATCCGCA AGCCGACCTAAG-3' ) 、 GluB-1 (配列番号： 4 /5， - CAGCTATTTMTCCCAGCACAMCCC- 3 \配列番号： 5 /5， - GGGAAGCTTACATTACTCTGAGGTCTCGC- 3， )、 AlaBlb (配列番号： 6 /5' -TTCAGTTCCAGAGAGCAGCC-3'、配列番号： 7 /5， -CGCGGATCCATACAAAAAGGGCT CTAAG-3' ) を用いて PCR増幅した。それそれのプライマー組み合わせのうち、後者のプライマーは成熟型サブュニッ卜の C末端部分の塩基配列の相補鎖に相当し、 G luA- 1と GluB- 1のプライマ一については Hindll lサイトを、 AlaBlbのプライマーについては BamHIサイトを有している。 PCR増幅断片は、ブランティングキット（Tak ara社）を使って末端平滑化した後、 Hindl l l (GluA- 1、 GluB-1) もしくは BamHI (A laBlb)で消化した。得られた DNA断片は、 pET - 21dべク夕—(Novagen社）の Ncol (末端修復済み）および Hindl l lサイト（GluA-l、 GluB - 1) 、もしくは Ncol (末端修復済み）および BamHIサイト（AlaBlb) に挿入し、大腸菌発現用プラスミド pEGluA- 1、 pEGluB-K pEAlaBlbを構築した。それそれの発現プラスミドを有する大腸菌 BL21 (DE3 )を、吸光度 A_{6 0 0}が 0.6になるまで LB培地にて培養し、その後 37°Cで IPTG (終濃度 1 mM)の添加により発現を誘導した。

[実施例 3 ] 抗グルテリン GluA- 1抗血清および抗グルテリン GluB- 1抗血清の調製

プログルテリン GluA- 1あるいは GluB- 1を発現した大腸菌を、 35 mM リン酸ナトリウム緩衝液（pH8.0)/0. 1 NaCl/1 mM EDTA/1.5 mM フエ二ルメチルスルフォ二ルフルオラィド（PMSF)で超音波処理した後に、大腸菌の塩可溶性タンパク質を除去した。その後、プログルテリン GluA- 1あるいは GluB- 1を、 1 % (v/v)乳酸 /1 mM

EDTAで抽出した。抽出したプログルテリンを、 50 mM トリス塩酸緩衝液（pH8.0 ) /1 mM EDTA/1 mM PMSF/6 M 尿素 /0. 1 M 2-メルカプトエタノール（2ME ) (緩衝液 A) に対して透析し、緩衝液 Aで平衡化した SP Sepharose FF (2.6 x 10 cm) (Pha rmacia社）カラムクロマトグラフィ一に供した。プログルテリンを 0-0.2 M NaCl の直線勾配により溶出し、得た部分精製サンプルを、さらに SDS- PAGEによって精製した。 GluA- 1および GluB- 1を、ゲル上の単一バンドから電気的に溶出し、 10 m M リン酸カリウム緩衝液 (pH7.6 )/6 M 尿素に対し、十分に透析した。精製したプログルテリン GluA-1 および GluB- 1の各々を、 FreuncT sコンプリートアジュバントとともに乳化し、文献（S. Utsumi , S. Kitagawa, T. Katsube, I . J. Kang, A.B.

Gidamis, F. Takaiwa, and M. Kito, 1993, Plant Sci . , 92(2) : 191-202) の記載に従い、体重およそ 2kgの雄ゥサギに皮内注射した。一次免疫後、 2週間目に二次免疫、その後 3週間目に三次免疫、その後 2週間目に四次免疫を行い、その 10 日後に採血して、抗血清を得た。

[実施例 4 ] RNAプロット解析

RNAを文献 ( Takaiwa, F. et al . ,Mol . Gen. Genet. , 208, 15-22, 1987)の記載に従い、実施例 1において作出したトランスジヱニック植物体の葉、登熟中の種子より抽出した。 15 ug の全 RNAを、ホルムアルデヒドを含む 1.2 %変性ァガロースゲルの電気泳動にかけたのち、帯電性ナイロンメンブレン（ Amersham社 )に転写した。メンブレン上の UNAを、ランダムプライミング法（Feinberg，A.P , and Vogelstein,B. , Anl . Biochem.， 13， 6- 13, 1983) によって^{3 2}P標識した pUGlのグリシニン cDNAプロ一ブを用いてハイプリダイゼーシヨン処理した。比較のためにグルテリン（GluB- 1) 遺伝子の発現も検出した（図 3 ) 。その結果、登熟過程において、グルテリン遺伝子と同程度のグリシ二ン遺伝子の発現が認められたが、葉においてはグリシ二ン遺伝子の発現が認められなかった。なお、図中の 0, 5, 12, 16, 22は、開花後の日数を示す。

[実施例 5 ] 夕ンパク質の抽出と免疫学的検出

分離解析に関しては、天然型および改造型グリシニンを発現する最初の形質転換植物体の完熟種子 50粒の各々を個別に乳鉢で粉碎し、 35 mM リン酸カリウム緩衝液 (pH7.6 )/0.4 M NaCl/1.5 mM PMSF/1 mM EDTA (抽出用緩衝液）で 4°Cにてタンパク質を抽出した。 50粒各々の抽出液の一部（タンパク質 10 g) をニトロセル口ース膜にスポヅティングし、抗グリシニン抗血清、ャギ抗ゥサギ IgG抗血清一アルカリフォスファターゼ複合体（Promega社）（S. Utsumi， T. Sato, C. -S. Kim an d M. Kito, 233 ( 1988) 273-276. ) を使って発現産物を検出した。

その結果を図 4に示す。天然型（図左）では、最大 5%程度、 IV+4Met (図右）は最大 0.5%程度の発現レベルを示した。この発現レベルの度数分布を図下にまとめた。発現レベルは高いもの、中ぐらいのもの、低いもの、そしてほとんど発現していないものが、それそれおよそ 4分の 1ずつの割合で分布した。このことから、グリシニン遺伝子は単一コビー、もしくは数コピーが良く連鎖したゲノム領域に挿入されたことが示唆された。

なお、この実験結果においてノーマルと I V +4Metで最高発現レベルの差が 10倍程度存在したが、これまでタバコゃジャガイモで発現させた実験ではこのような相違は見られなかった。また、ノーザン分析においても転写レベルに同様の差異が見られた。このため、発現レベルの差異は、ポジション効果によるものと考えられる。このように、発現量の高い種子（天然型： 8、 6、 15、 IV+4Met : 8、 19、 3) は、グリシニン遺伝子がホモになっていると考えらる。そこで、半粒分析法により発現量の高い種子に由来する第 2世代を育成した。その結果、第 2世代の自家受精種子 10粒ずつ調べたうち全ての種子において発現量が高いことが判明した。即ち、本発明者らは、グリシニン遺伝子をゲノムに固定することに成功した。

[実施例 6 ] ショ糖密度勾配遠心分離法による自己会合性の解析

分子集合や成熟型へのプロセッシングが正しく起こっているか調べるために、発現レベルの高い系統の種子塩抽出液をショ糖密度勾配遠心分離にかけた。 100 mgの完熟種子より抽出緩衝液を使って抽出したタンパク質を、文献（S. Utsimi , S. Kitaga a, T. Katsube, I .J. Kang, A. B. Gidamis, F. Takaiwa, and M. Ki to, 1993, Plant Sci .， 92(2) : 191- 202)の記載に従い、ショ糖密度勾配遠心分離法に供した。 Thanhと Shibasaki (V. H. Thanh and K. Shibasaki, J. Agric. Foo d Chem. , 24 ( 1976) 1117- 1121. )の方法に従ってダイズ種子より精製した 2S、 7S、 11S画分を、サイズマ一力一として、同時に解析に供した。得られた画分は、 SDS -PAGE後、ウエスタンブロッティングによって分析した。ウエスタンブロッティングに関しては、サンプル（25 ug)を、 SDSサンプルバッファー（1 (v/v) 2-メルカプトエタノール（2- ME) ) を含有、または含有しない、 62.5 mM トリス塩酸緩衝液 (pH6.8)/2 %(w/v ) SDS/30 % (v/v) グリセロール）に溶かして 3分間煮沸処理し、 SDS- PAGE (ポリアクリルアミド濃度 11 % w/v)に供した。ゲル中のタンパク質を、ニトロセルロース膜に転写し、抗プログリシニン抗血清、抗グリシニン抗血清、抗プログルテリン抗血清を用いて、実施例 5と同様に検出した。

その結果を図 5に示す。何も形質転換していないコントロ一ルでは観察されないバンドが、 IV十 4Metではグリシニンの単量体、 3量体、および 6量体に相当する 2 S、 7S、 11Sのフラクションを中心に観察された。還元剤の非存在下では、成熟型グリシニンに相当するバンドとプログリシニンに相当する少しサイズの大きいバンドが観察された。還元剤の存在下では、プログリシニンに相当するバンドは 2S と 7Sのフラクションにのみ見られ、グリシニン A鎖に相当するバンドは 2S、 7S、 1 ISのいずれのフラクションにも存在した。また、天然型ノーマルも IV+4Metと同様の結果を与えた。これらの結果は、天然型も改造型も同様に、成熟型へのプロセッシングを受け 6量体に分子集合できることを示唆する。

次にコメで発現するダイズグリシニンとコヌグルテリンとの相互作用について検討した。図 6は、図 5と同様コメ種子の塩抽出液、即ちグロブリン画分をショ糖密度勾配遠心で分離し、 SDS-PAGE後、ウエスタンブロッテイングを行い、グルテリン抗体で検出したものである。形質転換していないコントロールでは、 2Sのフラクションを中心にグルテリン A鎖に相当するバンドが観察された。一方、グリシニンを発現する形質転換体の方では、コントロールで見られたバンドの他に、主に 11Sのフラクションと一部 7Sのフラクションにバンドが検出された。還元剤の非存在下では、プログルテリンに相当するサイズを示し、還元剤の存在下では、グルテリン A鎖に相当するサイズを示すことが判明した。この図において、レーン Mとレーン Pにはダイズの成熟型グリシニンとプログリシニンがそれそれ lugずつアプライされている。図から明らかなように、グルテリン抗体はそれらダイズグリシニンとほとんど交差していないため、 11S、 7Sのフラクションに観察されたバンドは、コメグルテリンであると考えられる。即ち、コメ種子においてダイズグリシニンを発現させたことにより、一部のグルテリンが塩溶液可溶性、即ちグロプリンになった。それらは、主にグリシニンと同じ 11S . 7Sのフラクションに存在することから、グリシニンと相互作用してハイプリッド 6量体およびハイプリッド 3量体を形成しているものと推察される。それら可溶化したグルテリンの量は、予備的な見積もりで、可溶性グリシニンの 5%程度と推定された。

[実施例 7 ] ティシュプリント法によるコメ種子における発現グリシニンの In situ発現部位解析

グルテリンプロモー夕は種子の胚乳で特異的に発現する。そこで、この発現の組織特異性が保持されているかどうかを、ティシュプリント法によって調べた。 I n situ発現部位解析を、 Manteuffel ¾ (R. Mo Manteuffel and R. Ranitz, Plan t Mol . Biol .， 2 ( 1993 ) 1129-1134. ) の記載に従い、ティシュプリント法によつて行った。 0.01 M リン酸緩衝液 (pH7.4)/0.8 ¾ (w/v) NaCl/0.2 % (w/v) KC1/ 10 mM NaN 3 /0.4 スクロースに浸漬したコメ種子を、カミソリの刃を使って垂直に切断した。そして、脂質を除くために 20秒間アセトンに浸した後、ニトロセルロース膜に 5~10秒間押しつけた。その後、そのニトロセルロース膜を、 60°Cで 30分間乾燥させ、抗グリシニン抗血清を使つたィムノブロッテイングに供した。その結果を図 7に示す。左がコントロール、右が IV+4Metを示す。グリシニンは胚乳で発現し、胚では発現していなかった。また天然型ノーマルも改造型 IV+4M etと同様の結果を与えた。つまり、天然型も改造型も発現の組織特異性が保持されていることが判明した。さらに、電子顕微鏡を用いた胚乳部の免疫組織化学的観察により、グリシニンはプロティンボディ一のマトリヅクス部に認められた。即ち、発現グリシニンはプロテインボディ一にソーティングされていることが判明した。

[実施例 8 ] 連続抽出処理による溶解性解析

コメ種子 U8 mg)を細かく粉砕し、各々 1800 ulの 25 mM N-ェチルマレイミド（N EM)を含む抽出用緩衝液で 6回、室温で 1時間ずつ激しく振とうしながら連続的に抽出した。抽出用緩衝液で抽出した後の残さに対し、さらに 3回、各々 1800 ulの 1 % (v/v)乳酸 /1 mM EDTA/25 mM NEMで抽出処理を施した。最後に、その後の残さに対して 1回、 1800ulの SDSサンプルバッファーで同様に抽出処理を行った。

一方、逆に発現グリシニンがグルテリン化しているか否かにつき解析した。図 8は、コメ種子に対し塩溶液で 6回、十分な抽出操作を繰り返した後、 1%乳酸で 3 回、さらに SDSで 1回抽出操作して得られた各画分を SDS-PAGE後、ウエスタンプロッティングにかけグリシニン抗体で検出した。グルテリンは乳酸で抽出されるが、その抽出液に塩化ナトリウムを加えると沈澱する。図から明らかなように、塩溶液で抽出されるグリシニンは抽出操作を繰り返す度に少なくなり、 6回目ではほとんど消失した。しかしながら 1 %乳酸や SDSでは再びグリシニンが抽出されていた。このことから、一部の発現グリシニンはコメグルテリンと相互作用することで、グルテリン化しているものと推察される。それら不溶化した発現グリシニンの量は、予備的な見積もりで、全発現グリシニンのうちの 20%程度と推定された。産業上の利用の可能性

本発明により、ダイズグリシニンを発現するトランスジエニック植物およびその繁殖媒体が提供された。ダイズグリシニンは、栄養性や加工特性が優れていることに加え、ヒ卜の血清中コレステロール値を低下させる健康維持増進性を備えているため、本発明によれば付加価値を高めた農作物を生産することが可能である。また、ダイズグリシニンは、日常食べているダイズ由来のタンパク質であるため、本発明により生産された農作物は、安全性が高い点でも有益である。

Claims

請求の範囲

1 . ダイズグリシニンタンパク質をコードする遺伝子が導入されたトランスジエニック植物細胞。

2 . ダイズグリシニンタンパク質が AlaBlbサブユニットである、請求項 1に記載のトランスジヱニック植物細胞。

3 . ダイズグリシニンタンパク質をコードする遺伝子がィネグルテリン遺伝子のプロモ一夕一の下流に結合している、請求項 1または 2に記載のトランスジェニック植物細胞。

4 . 請求項 1から 3のいずれかに記載のトランスジエニック植物細胞を含むトランスジヱニック植物体。

5 . イネ科植物である、請求項 4に記載のトランスジエニック植物体。

6 . イネである、請求項 4に記載のトランスジヱニック植物体。

7 . 少なくともその一部にダイズグリシニンタンパク質が蓄積している、請求項 4から 6のいずれかに記載のトランスジヱニック植物体。

8 . 請求項 4から 6のいずれかに記載の植物体の繁殖媒体。

9 . コメである、請求項 8に記載の繁殖媒体。

1 0 . ダイズグリシニンタンパク質が蓄積している、請求項 8または 9に記載の繁殖媒体。