JP3030339B2

JP3030339B2 - ダイズグリシニンを発現するトランスジェニック植物

Info

Publication number: JP3030339B2
Application number: JP10223897A
Authority: JP
Inventors: 文雄 ▲高▼岩; 成内海; 朋之勝部
Original assignee: 農林水産省農業生物資源研究所長; 生物系特定産業技術研究推進機構
Priority date: 1998-08-07
Filing date: 1998-08-07
Publication date: 2000-04-10
Anticipated expiration: 2018-08-07
Also published as: JP2000050871A; US6576820B1; WO2000008161A1; CA2362013A1

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、食物成分として有
用なダイズグリシニンを発現させた植物およびその繁殖
媒体に関し、農業や食品などの分野に属する。

【０００２】

【従来の技術】ダイズからタンパク質を抽出し、酸沈殿
（pH4.5）させたダイズ分離タンパク質（ダイズグロブ
リンを主要成分としている）は、ヒトの血清コレステロ
ール値を低下させ、動脈硬化や冠状動脈性心疾患などの
予防や治療に有効である。特に、高コレステロール血症
患者の総コレステロール値、LDL-コレステロール値及び
トリグリセリド値の低下に顕著な効果がある（Mercer,
N.J.H., Carroll, K.K.,Giovannetti, P.M., Steinke,
F.H. and Wolfe, B.M., Nutr. Rep. Int., 35,279-287
(1987)、井村隆、田中真実、渡辺毅、工藤重光、打
田悌治、金沢武動 Ther. Res., 17, 2451-2456 (199
6)、菅野道廣食品工業, 39 (18), 59-68(1996)）。ま
た、コレステロール値が正常範囲の健常者においても総
コレステロール値に有意の低下が見られる（Kito, M.,
Moriyama, T., Kimura, Y. and Kambara, H. Biosci. B
iotech. Biochem., 57, 354-355 (1993)、神原啓文、野
原隆司、鬼頭誠 Ther. Res., 14, 3197-3204 (199
3)）。

【０００３】ダイズのコレステロール値低下機能に対し
て、ダイズタンパク質によるコレステロールや胆汁酸の
吸収阻害が第一義的な役割を果たしている（菅野道廣
食品工業, 39 (18), 59-68 (1996)）。すなわち、コレ
ステロールの吸収が阻害された結果、肝臓でのコレステ
ロール合成が上昇する。しかし、同時に胆汁酸の再吸収
も阻害されるので肝臓のコレステロールは胆汁酸へと酸
化される。この結果、肝臓のコレステロール濃度が低く
なり、血清中のコレステロールの肝臓への取り込みが促
進され、血清コレステロール値が低下することになる
（菅野道廣食品工業, 39 (18), 59-68 (1996)）。

【０００４】ダイズタンパク質をプロテアーゼで強く消
化したときの不消化画分が強い血清コレステロール値低
下作用を示すことが知られている（菅野道廣食品工
業, 39(18), 59-68 (1996)）。不消化画分に存在するペ
プチドの一次構造は決定されていない（菅野道廣食品
工業, 39 (18), 59-68 (1996)）。一方、ダイズグロブ
リンの主要成分であるグリシニンのA1aB1bサブユニット
に由来するペプチドが胆汁酸結合能を持つことが示され
ており（牧野志雄食品工業, 39 (24), 77-87(199
6)）、上記不消化画分は、A1aB1bサブユニットに由来す
る胆汁酸結合性ペプチドに由来していると考えられてい
る（菅野道廣食品工業, 39 (18), 59-68(1996)）。ま
た、ダイズタンパク質に由来する疎水性ペプチドが胆汁
酸結合能を有することが知られている（Iwami, K., Sak
akibara, K. and Ibuki, F. Agric. Biol. Chem., 50,
1217-1222 (1986)）。ダイズグロブリンの中で、グリシ
ニンが最も疎水性に富み、A1aB1bサブユニットに由来す
る胆汁酸結合性ペプチド中にも疎水性領域が２ヶ所存在
する（内海成食品工業, 40 (10), 68-79 (199
7)）。したがって、ダイズタンパク質の血清コレステロ
ール値低下機能は、主にグリシニンに存在しており、特
にA1aB1bサブユニットへの依存度が高いと考えられる。

【０００５】ダイズ分離タンパク質の産業上の応用とし
ては、食品分野において、不二醤油のダイズからあげ、
プロテインがんも、かねさ株式会社のG-9、G-9 100、日
本ハムのてりやきミートボール、ハンバーグ、ポールフ
ランクなどが販売されている。しかしながら、グリシニ
ン自体を添加した機能性食品に関しては、これまでに報
告されていない。

【０００６】一方、農業分野においても、ダイズグリシ
ニンの特性を他の植物に付与するなどの試みは報告され
ていない。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、上記の
ようなダイズグリシニンの性質に着目し、ダイズグリシ
ニンをダイズ以外の植物種において発現させることによ
り、コレステロール値低下機能などのダイズにみられる
特性を他の植物種において実現することが可能であると
考えた。また、本発明者らは、ダイズグリシニンタンパ
ク質が、上記コレステロール値低下機能以外にも、水溶
性で豆腐のように幅広い加工用途があること、およびコ
メなどには少ない必須アミノ酸「リジン」を多く含むた
め栄養性の観点からも優れていることにも着目し、他の
農作物においてダイズグリシニンタンパク質を発現させ
ることにより新しい加工食品の生産や、栄養価の高い新
たな農作物の生産を行うことが可能であると考えた。従
って、本発明は、ダイズグリシニンを発現させたダイズ
以外の植物、特に食糧として有用な農作物を提供するこ
とを課題とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】イネは、その種子である
コメが我々の食生活において不可欠であり、最も重要な
農作物の一つである。コメには、そのタンパク質の80％
を占める、主要貯蔵タンパク質グルテリンが存在する。
グルテリンは、ダイズグリシニンとアミノ酸配列レベル
で32〜37％の相同性があり、基本構造が類似している。
即ちグリシニン・グルテリンどちらも、シグナルペプチ
ド、A鎖、B鎖から成るプレプロ型として生合成され、プ
ロ型を経て、配列がよく保存された特異的部位でプロセ
ッシングを受けて成熟型になる。グリシニンは3量体を
経て6量体に分子集合し、塩溶液可溶性であり、グルテ
リンはジスルフイド結合や疎水的結合により巨大分子化
していると考えられ塩溶液不溶性であるという相違も存
在するが、基本構造の類似性などから、両タンパク質は
共通の祖先遺伝子に出来していると考えられている（図
１）。そこで、このグルテリン遺伝子のプロモータを用
いて、栄養性や加工特性が優れ、ヒトの血清中コレステ
ロール値を低下させる健康維持増進性を備えたダイズグ
リシニンを、グルテリンと同様にコメ種子で発現、蓄積
させることができれば、コメの野生型に近い形を維持し
たまま、コメの付加価値を高めうると考えられる。ま
た、グリシニンとグルテリンのハイブリッドタンパク質
の蓄積も期待できる。そこで、本発明者らは、ダイズグ
リシニンを発現させる植物として、特にイネを選択し、
その種子であり有用農作物であるコメにおいてダイズグ
リシニンの発現および蓄積を行った。

【０００９】具体的には、イネ種子の胚乳に特異的に遺
伝子を発現させるグルテリン遺伝子のプロモーター領域
を単離して、該プロモーターの下流に天然型あるいは改
造型のダイズグリシニン遺伝子が連結されたベクターを
構築し、これらキメラ遺伝子をイネ培養細胞に導入し
て、トランスジェニックイネ植物体を得た。次いで、作
出したトランスジェニックイネ植物体において発現させ
たダイズグリシニンの組織特異性および形態につき検討
を行った。その結果、本発明者らは、イネにおいて発現
させたダイズグリシニンがイネ種子に蓄積しており、ま
た蓄積したダイズグリシニンがプロセシング過程を経た
成熟型として存在することを見出した。即ち、本発明者
らは、イネ種子においてダイズグリシニンを発現させ、
機能的な形態で蓄積させることに成功し、本発明を完成
した。

【００１０】本発明は、ダイズグリシニン遺伝子が導入
された植物細胞および植物体、好ましくはイネ植物体、
並びにその繁殖媒体に関し、より具体的には、（１）
ダイズグリシニンタンパク質をコードする遺伝子を発現
可能に保持するトランスジェニック植物細胞、（２）
ダイズグリシニンタンパク質がAlaB1bサブユニットであ
る、（１）に記載のトランスジェニック植物細胞、
（３）ダイズグリシニンタンパク質をコードする遺伝
子がイネグルテリン遺伝子のプロモーターの下流に結合
している、（１）または（２）に記載のトランスジェニ
ック植物細胞、（４）（１）から（３）のいずれかに
記載のトランスジェニック植物細胞を含むトランスジェ
ニック植物体、（５）イネ科植物である、（４）に記
載のトランスジェニック植物体、（６）イネである、
（４）に記載のトランスジェニック植物体、（７）少
なくともその一部にダイズグリシニンタンパク質が蓄積
している、（４）から（６）のいずれかに記載のトラン
スジェニック植物体、（８）（４）から（６）のいず
れかに記載の植物体の繁殖媒体、（９）コメである、
（８）に記載の繁殖媒体、（１０）ダイズグリシニン
タンパク質が蓄積している、（８）または（９）に記載
の繁殖媒体、に関する。

【００１１】

【発明の実施の形態】本発明は、ダイズグリシニンタン
パク質をコードする遺伝子が導入された植物細胞および
植物体、並びにその繁殖媒体に関する。

【００１２】ダイズグリシニンは、A1aB1b,A1bB2,A2B1
a,A3B4,A5A4B3のサブユニットが、ほぼランダムに6個組
み合わさって形成されている（グリシニンのサブユニッ
ト構造および配列については、文献「Utsumi,S.et al.,
Marcel Dekker,257-291,1997、Utsumi,S.et al.,J.Agri
c.Food.Chem.,35,210-214,1987、Cho,T.-J. and Nielse
n,N.C.,Nucl.Acids Res.,17,4338,1989、Utsumi,S.et a
l.,Agric.Biol.Chem.,51,3267-3273,1987、Fukazawa,C.
et al.,J.Biol.Chem.,260,6234-6239,1985、Momma,T.et
al.,Eur.J.Biochem.,149,491-496,1985」参照のこ
と）。本発明において植物細胞内で発現させるダイズグ
リシニンタンパク質をコードする遺伝子としては、これ
らダイズグリシニンのサブユニットをコードする限り特
に制限はないが、コレステロール値低下機能などが知ら
れているA1aB1bサブユニット（配列番号：１）またはこ
れと同様の効果を示すと考えられるA1bB2若しくはA2B1a
サブユニットをコードする遺伝子が特に好ましい。本発
明においては、植物細胞内においてこれらサブユニット
のうち単一のサブユニットを発現させてもよく、また複
数のサブユニットを組み合わせて発現させてもよい。

【００１３】また、天然型のダイズグリシニンタンパク
質のみならず、その機能的誘導体を発現させてもよい。
「機能的誘導体」とは、天然型のタンパク質のアミノ酸
配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、
および／若しくは付加したアミノ酸配列からなり、天然
型のタンパク質と機能的に同等なタンパク質を指す。機
能的に同等とは、変異タンパク質が天然型のタンパク質
と同等のコレステロール値低下作用、加工特性、および
／または栄養性を有していることを指す。機能的誘導体
は、自然界において生じることもあるが、人為的に調製
することも可能である。人為的な調製方法としては、例
えば、一本鎖のオリゴヌクレオチドを利用して部位特異
的に特定のアミノ酸（1〜複数残基）を他のアミノ酸に
置換する、欠失させる、あるいは特定の部位にアミノ酸
（1〜複数残基）を挿入する方法、特定の制限酵素サイ
トを利用して二本鎖の外来遺伝子あるいは合成遺伝子の
アミノ酸を挿入、置換、あるいは欠失させる方法などが
挙げられる（Utsumi,S.,Adv.Food Nutr.Res.,36,89-20
8,1992参照）。

【００１４】ダイズグリシニン遺伝子を導入する植物細
胞としては、特に制限はなく、あらゆる植物種に由来す
る細胞を用いることが可能であるが、ダイズグリシニン
のコレステロール値低下機能などを生体内において発揮
させるという本発明の目的からして、特に農作物の細胞
が好ましい。農作物としては、例えば、イネ、オオム
ギ、コムギ、ライムギ、トウモロコシなどの穀類、イン
ゲンマメ、ソラマメ、エンドウなどの豆科作物、ピーナ
ツ、ゴマ、ナタネ、綿実、ヒマワリ、サフラワーなどの
油糧用種子作物、ジャガイモ、サツマイモなどの塊根を
形成する作物、リンゴ、メロン、ブドウなどの果実を有
する作物、ホウレン草、チンゲンサイ、キャベツなどの
ように葉が食用となる作物が挙げられる。本発明におい
てダイズグリシニン遺伝子が導入される植物細胞の形態
としては、植物体に再生可能なあらゆる種類の形態の植
物細胞が含まれる。例えば、培養細胞、プロトプラス
ト、苗条原基、多芽体、毛状根、カルスが挙げられる
が、これらに制限されない。本発明における植物細胞に
は、植物体中の細胞も含まれる。

【００１５】ダイズグリシニン遺伝子を植物細胞内で発
現させるためには、(i)植物細胞内で転写可能なプロモ
ーター配列、(ii)プロモーター配列の下流にセンス方向
に結合されたダイズグリシニン遺伝子と、(iii)該遺伝
子の下流に結合された、転写の終結およびポリアデニル
化に必要な配列を含むターミネーター配列、を含むDNA
分子を植物細胞に導入する。このようなDNA分子は、プ
ロモーター以外にも、転写をさらに増強するためのDNA
配列、例えば、エンハンサー配列を含んでいてもよい。

【００１６】用いられるプロモーターとしては、植物細
胞内で機能するものであれば特に制限はないが、再生し
た植物体においてグリシニン遺伝子を発現させたい所望
の部位で効果的な発現を保証する組織特異的プロモータ
ーが好ましい。組織特異的プロモーターとしては、例え
ば、イネの種子において発現させる場合にはグルテリン
遺伝子のプロモーター（Takaiwa,F.et al.,Plant Mol.B
iol.,17,875-885,1991）、インゲンマメ、ソラマメ、エ
ンドウなどの豆科作物やピーナツ、ゴマ、ナタネ、綿
実、ヒマワリ、サフラワーなどの油糧用種子作物の種子
において発現させる場合には、グリシニン遺伝子のプロ
モーターあるいは各作物の主要な貯蔵タンパク質遺伝子
のプロモーター、例えば、インゲンマメであればファゼ
オリン遺伝子のプロモーター（Murai,N.et al.,Scienc
e,222,476-482,1983）、ナタネであればクルシフェリン
遺伝子のプロモーター（Rodin,J.et al.,Plant Mol.Bio
l.,20,559-563,1992）が挙げられる。また、ジャガイモ
の塊茎で発現させる場合には、パタチン遺伝子のプロモ
ーター（Rocha-Sosa,M.et al.,EMBO J.,8,23-29,198
9）、サツマイモの塊根で発現させる場合には、スポラ
ミン遺伝子のプロモーター（Hattori,T.and Nakamura,
K.,Plant Mol.Biol.,11,417-426,1988）、ホウレン草な
どの野菜の葉で発現させる場合には、リブロース-1,5-
ビスリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子のプロモーター
（Orozco,B.M.and Ogren,W.L.,Plant Mol.Biol.,23,112
9-1138,1993）が好適である。これらプロモーターの具
体例は、あくまで例示であり、実際には目的に応じてこ
れら以外の様々なプロモーターを利用することが可能で
ある。また、上記組織特異的プロモーター以外にも、例
えば、35Sプロモーターなどの恒常的な発現のためのプ
ロモーターや誘導可能なプロモーターを用いることも可
能である。

【００１７】植物細胞へのダイズグリシニン遺伝子の導
入は、当技術分野における技術者に公知の種々の方法を
用いて導入することが可能である。例えば、アグロバク
テリウム・ツメファシエンスやアグロバクテリウム・リ
ゾゲネスを利用した間接導入法（Hiei,Y.et al.,Plant
J.,6,271-282,1994、Takaiwa,F.et al.,Plant Sci.111,
39-49,1995）や、エレクトロポレーション法（Tada,Y.
et al. Theor.Appl.Genet,80,475,1990）、ポリエチレ
ングリコール法（Datta,S.K.et al.,Plant MolBiol.,2
0,619-629,1992）、パーティクルガン法（Christou,P.e
t al.,Plant J.2,275-281,1992、Fromm,M.E.,Bio/Techn
ology,8,833-839,1990）などに代表される直接導入法を
用いることが可能である。

【００１８】形質転換された植物細胞は、再生させるこ
とにより植物体を作出することができる。再生の方法は
植物細胞の種類により異なるが、代表的な方法として
は、例えば、イネであればFujimuraらの方法（Fujimur
a,t.et al.,Plant Tissue Culture Lett.,2,74,199
5）、トウモロコシであればArmstrongらの方法（Armstr
ong,C.L.and Phillips,R.L.,Crop Sci.,28,363-369,198
8）、ナタネであればRadkeらの方法（Radke S.E.,Theo
r.Appl.Genet.75,685-694,1988）、ジャガイモであれば
Sheermanらの方法（Sheerman,S,and Bevan,M.W.,Plant
Cell Rep.,7,13-16,1988）が挙げられる。

【００１９】これにより作出されたトランスジェニック
植物体またはその繁殖媒体（例えば、種子、塊根、塊
茎、果実、切穂など）から得た植物体には、導入したダ
イズグリシニン遺伝子の発現により、標的部位にダイズ
グリシニンが発現し、蓄積する。これにより栄養性、加
工特性、健康増進特性などのダイズグリシニンタンパク
質が保持する特性を他の植物種において実現することが
可能である

【００２０】

【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説
明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものでは
ない。

【００２１】[実施例１] ダイズグリシニン発現ベクタ
ーの構築およびダイズグリシニンを発現する形質転換イ
ネ植物体の作出 (1)ダイズグリシニンcDNAの単離イネの形質転換に用いるダイズグリシニン発現プラスミ
ドの構築を行った。具体的には、A1aB1b cDNA を含むpU
G1（S. Utsumi, S. Kitagawa, T. Katsube, I.J. Kang,
A.B. Gidamis, F. Takaiwa, and M. Kito, 1993, 92
(2):191-202）のXhoI断片（1.7kb）をdNTP存在下でクレ
ノウ修復した。 (2)イネグルテリン遺伝子プロモーターを有するベクタ
ーへのダイズグリシニンcDNAの挿入グルテリンGluB-1
遺伝子のゲノミッククローンλINE9（Takaiwa,F.et a
l.,Plant.Mol.Biol.17,875-885,1991）のDNAをまず制限
酵素KpnIとEcoRIで切断して、グルテリン遺伝子のプロ
モーターとN末端のコード領域を含む断片をクローニン
グし、サブクローンKpn9を得た。さらにこのサブクロー
ンDNAを制限酵素Sau3Aで切断し、1.6kbのSau3A断片（イ
ネグルテリン遺伝子の転写領域330bpと5'上流領域1.3k
b）を得た。このプラスミドを用いてグルテリン遺伝子
の転写開始点+18にある制限酵素AflIIとpUC118ベクター
にあるSmaIを利用してグルテリンのコード領域を除去
し、この部分に(1)で調製したグリシニンcDNAを挿入し
た。方向性はグリシニンcDNA中にあるEcoRIサイトとpUC
118ベクターのHindIIIサイトを利用して確認した。

【００２２】GluB-1プロモータ(-1302から+18)とグリシ
ニンcDNAを含む断片をHindIIIおよびSacI消化により回
収し、GluB-1の3'非翻訳領域0.7 kb、CaMV35Sプロモー
タ、ビアラフォス耐性遺伝子(BAR)およびノパリン合成
遺伝子ターミネータ(NOS terminator)を含むpUC18に挿
入した。これにより構築したプラスミドを「pGluB1Gl
y」と命名した。同様にして、改質グリシニンcDNA (pUG
1IV)（S. Utsumi, S. Kitagawa, T. Katsube, I.J. Kan
g, A.B. Gidamis, F. Takaiwa, and M. Kito, 1993, Pl
ant Sci., 92(2):191-202）とGluB-1プロモータ(-1302
から+18)を含むキメラ遺伝子のプラスミドも調製した。
このプラスミドを「pGluB1GlyIV」と命名した。構築し
たプラスミドの模式図を図２に示す。

【００２３】形質転換体の作製は以下のように行った。
イネのカルスを完熟種子の胚盤より誘導し、改変N6培地
でカルスを培養し、プロトプラストをFujimuraらの方法
（Fujimura,T.,et al.,Plant Tissue Culture Lett.2,7
4-75,1985）で単離した後、大槻らの方法（大槻義昭ら,
イネ・プロトプラストの効率的調製にかかわるけん濁培
養条件,育種学雑誌,35巻,別冊1,78-79）でプロトプラス
ト培養を行った。

【００２４】キメラ遺伝子を含むプラスミドを、エレク
トロポレーション法によってプロトプラストに直接導入
した。エレクトロポレーションは、Tadaら（Tada,Y.et
al.,Theor. Appl. Genet,80,475-480,1990）のASP緩衝
液を用いて、プラスミド20μg/ml、750V/cm、40msecで
行った。組み換え体の選抜は、プロトプラスト培地、カ
ルス増殖培地、および再分化培地に選抜マーカーのビア
ラフォス剤を10mg/l添加して行った。

【００２５】「pGluB1Gly」と「pGluB1GlyIV」が導入さ
れた、それぞれ68個体と52個体（松山三井）、26個体と
15個体（ひめのまい）を完熟まで育成した。植物体の再
生は、Ozawaらの方法（Ozawa,K.and Komamine,A.,Theo
r.Appl.Genet,77,205-211,1989）に従った。グリシニン
遺伝子およびBAR遺伝子がイネゲノムに挿入されている
ことは、グルテリンプロモーターとダイズグリシニン遺
伝子に特異的なプライマーを用いたPCRにより確認し
た。

【００２６】[実施例２] グルテリンおよびグリシニン
の組み換えタンパク質の調製グルテリン（GluA-1、GluB-1）とグリシニン（A1aB1b）
の成熟型タンパク質に相当するcDNA部分を、以下の組み
合わせのプライマー、即ち、GluA-1（配列番号：２／5'
-CAGCAGCTATTAGGCCAGAGCACTAG-3'、配列番号：３／5'-G
GGAAGCTTTATCCGCAAGCCGACCTAAG-3'）、GluB-1（配列番
号：４／5'-CAGCTATTTAATCCCAGCACAAACCC-3'、配列番
号：５／5'-GGGAAGCTTACATTACTCTGAGGTCTCGC-3'）、A1a
B1b（配列番号：６／5'-TTCAGTTCCAGAGAGCAGCC-3'、配
列番号：７／5'-CGCGGATCCATACAAAAAGGGCTCTAAG-3'）を
用いてPCR増幅した。それぞれのプライマー組み合わせ
のうち、後者のプライマーは成熟型サブユニットのC末
端部分の塩基配列の相補鎖に相当し、GluA-1とGluB-1の
プライマーについてはHindIIIサイトを、A1aB1bのプラ
イマーについてはBamHIサイトを有している。PCR増幅断
片は、ブランティングキット(Takara社)を使って末端平
滑化した後、HindIII（GluA-1、GluB-1）もしくはBamHI
（A1aB1b）で消化した。得られたDNA断片は、pET-21dベ
クター(Novagen社)のNcoI (末端修復済み)およびHindII
Iサイト（GluA-1、GluB-1）、もしくはNcoI (末端修復
済み)およびBamHIサイト（A1aB1b）に挿入し、大腸菌発
現用プラスミドpEGluA-1、pEGluB-1、pEA1aB1bを構築し
た。それぞれの発現プラスミドを有する大腸菌BL21(DE
3)を、吸光度A_６００が0.6になるまでLB培地にて培養
し、その後37℃でIPTG(終濃度1 mM)の添加により発現を
誘導した。

【００２７】[実施例３] 抗グルテリンGluA-1抗血清お
よび抗グルテリンGluB-1抗血清の調製プログルテリンGluA-1あるいはGluB-1を発現した大腸菌
を、35 mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH8.0)/0.1 M NaCl
/1 mM EDTA/1.5 mM フェニルメチルスルフォニルフルオ
ライド(PMSF)で超音波処理した後に、大腸菌の塩可溶性
タンパク質を除去した。その後、プログルテリンGluA-1
あるいはGluB-1を、1 % (v/v)乳酸/1 mMEDTAで抽出し
た。抽出したプログルテリンを、50 mM トリス塩酸緩衝
液 (pH8.0)/1 mM EDTA/1 mM PMSF/6 M 尿素/0.1 M 2-メ
ルカプトエタノール(2ME) （緩衝液A）に対して透析
し、緩衝液Aで平衡化したSP Sepharose FF (2.6 x 10 c
m) (Pharmacia社)カラムクロマトグラフィーに供した。
プログルテリンを0-0.2 M NaClの直線勾配により溶出
し、得た部分精製サンプルを、さらにSDS-PAGEによって
精製した。GluA-1およびGluB-1を、ゲル上の単一バンド
から電気的に溶出し、10mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.
6)/6 M 尿素に対し、十分に透析した。精製したプログ
ルテリンGluA-1 およびGluB-1の各々を、Freund'sコン
プリートアジュバントとともに乳化し、文献（S. Utsum
i, S. Kitagawa, T. Katsube, I.J. Kang,A.B. Gidami
s, F. Takaiwa, and M. Kito, 1993, Plant Sci., 92
(2):191-202）の記載に従い、体重およそ2kgの雄ウサギ
に皮内注射した。一次免疫後、２週間目に二次免疫、そ
の後３週間目に三次免疫、その後２週間目に四次免疫を
行い、その10日後に採血して、抗血清を得た。

【００２８】[実施例４] RNAブロット解析 RNAを文献（Takaiwa,F.et al.,Mol.Gen.Genet.,208,15-
22,1987）の記載に従い、実施例１において作出したト
ランスジェニック植物体の葉、登熟中の種子より抽出し
た。15 ug の全RNAを、ホルムアルデヒドを含む 1.2 %
変性アガロースゲルの電気泳動にかけたのち、帯電性ナ
イロンメンブレン(Amersham社)に転写した。メンブレン
上のRNAを、ランダムプライミング法（Feinberg,A.P.an
d Vogelstein,B.,Anl.Biochem.,13,6-13,1983）によっ
て^３２P標識したpUG1のグリシニンcDNAプローブを用い
てハイブリダイゼーション処理した。比較のためにグル
テリン（GluB-1）遺伝子の発現も検出した（図３）。そ
の結果、登熟過程において、グルテリン遺伝子と同程度
のグリシニン遺伝子の発現が認められたが、葉において
はグリシニン遺伝子の発現が認められなかった。なお、
図中の0,5,12,16,22は、開花後の日数を示す。

【００２９】[実施例５] タンパク質の抽出と免疫学的
検出分離解析に関しては、天然型および改造型グリシニンを
発現する最初の形質転換植物体の完熟種子50粒の各々を
個別に乳鉢で粉砕し、35 mM リン酸カリウム緩衝液(pH
7.6)/0.4 M NaCl/1.5 mM PMSF/1 mM EDTA (抽出用緩衝
液)で4℃にてタンパク質を抽出した。50粒各々の抽出液
の一部（タンパク質10μg）をニトロセルロース膜にス
ポッティングし、抗グリシニン抗血清、ヤギ抗ウサギIg
G抗血清−アルカリフォスファターゼ複合体 (Promega
社)（S. Utsumi, T. Sato, C.-S. Kim and M. Kito, 23
3 (1988) 273-276.）を使って発現産物を検出した。

【００３０】その結果を図４に示す。天然型（図左）で
は、最大5％程度、IV＋4Met（図右）は最大0.5％程度の
発現レベルを示した。この発現レベルの度数分布を図下
にまとめた。発現レベルは高いもの、中ぐらいのもの、
低いもの、そしてほとんど発現していないものが、それ
ぞれおよそ4分の1ずつの割合で分布した。このことか
ら、グリシニン遣伝子は単一コピー、もしくは数コピー
が良く連鎖したゲノム領域に挿入されたことが示唆され
た。

【００３１】なお、この実験結果においてノーマルとIV
＋4Metで最高発現レベルの差が10倍程度存在したが、こ
れまでタバコやジャガイモで発現させた実験ではこのよ
うな相違は見られなかった。また、ノーザン分析におい
ても転写レベルに同様の差異が見られた。このため、発
現レベルの差異は、ポジション効果によるものと考えら
れる。

【００３２】このように、発現量の高い種子（天然型：
8、6、15、IV＋4Met：8、19、3）は、グリシニン遺伝子
がホモになっていると考えらる。そこで、半粒分析法に
より発現量の高い種子に由来する第2世代を育成した。
その結果、第2世代の自家受精種子10粒ずつ調べたうち
全ての種子において発現量が高いことが判明した。即
ち、本発明者らは、グリシニン遺伝子をゲノムに固定す
ることに成功した。

【００３３】[実施例６] ショ糖密度勾配遠心分離法に
よる自己会合性の解析分子集合や成熟型へのプロセッシングが正しく起こって
いるか調べるために、発現レベルの高い系統の種子塩抽
出液をショ糖密度勾配遠心分離にかけた。100mgの完熟
種子より抽出緩衝液を使って抽出したタンパク質を、文
献（S. Utsumi,S. Kitagawa, T. Katsube, I.J. Kang,
A.B. Gidamis, F. Takaiwa, and M. Kito, 1993, Plant
Sci., 92(2):191-202）の記載に従い、ショ糖密度勾配
遠心分離法に供した。ThanhとShibasaki（V.H. Thanh a
nd K. Shibasaki, J. Agric. Food Chem.,24 (1976) 11
17-1121.）の方法に従ってダイズ種子より精製した2S、
7S、11S画分を、サイズマーカーとして、同時に解析に
供した。得られた画分は、SDS-PAGE後、ウエスタンブロ
ッティングによって分析した。ウエスタンブロッティン
グに関しては、サンプル(25 ug)を、SDSサンプルバッフ
ァー（1 % (v/v)2-メルカプトエタノール(2-ME)）を含
有、または含有しない、62.5 mM トリス塩酸緩衝液(pH
6.8)/2 %(w/v) SDS/30 % (v/v) グリセロール）に溶か
して3分間煮沸処理し、 SDS-PAGE（ポリアクリルアミド
濃度11 %, w/v)に供した。ゲル中のタンパク質を、ニト
ロセルロース膜に転写し、抗プログリシニン抗血清、抗
グリシニン抗血清、抗プログルテリン抗血清を用いて、
実施例５と同様に検出した。

【００３４】その結果を図５に示す。何も形質転換して
いないコントロールでは観察されないバンドが、IV十4M
etではグリシニンの単量体、3量体、および6量体に相当
する2S、7S、1lSのフラクシヨンを中心に観察された。
還元剤の非存在下では、成熟型グリシニンに相当するバ
ンドとプログリシニンに相当する少しサイズの大きいバ
ンドが観察された。還元剤の存在下では、プログリシニ
ンに相当するバンドは2Sと7Sのフラクシヨンにのみ見ら
れ、グリシニンA鎖に相当するバンドは2S、7S、11Sのい
ずれのフラクションにも存在した。また、天然型ノーマ
ルもIV＋4Metと同様の結果を与えた。これらの結果は、
天然型も改造型も同様に、成熟型へのプロセッシングを
受け6量体に分子集合できることを示唆する。

【００３５】次にコメで発現するダイズグリシニンとコ
メグルテリンとの相互作用について検討した。図６
は、図５と同様コメ種子の塩抽出液、即ちグロブリン画
分をショ糖密度勾配遠心で分離し、SDS-PAGE後、ウエス
タンブロッティングを行い、グルテリン抗体で検出した
ものである。形質転換していないコントロールでは、2S
のフラクションを中心にグルテリンA鎖に相当するバン
ドが観察された。一方、グリシニンを発現する形質転換
体の方では、コントロールで見られたバンドの他に、主
に11Sのフラクシヨンと一部7Sのフラクションにバンド
が検出された。還元剤の非存在下では、プログルテリン
に相当するサイズを示し、還元剤の存在下では、グルテ
リンA鎖に相当するサイズを示すことが判明した。この
図において、レーンMとレーンPにはダイズの成熟型グリ
シニンとプログリシニンがそれぞれ1ugずつアプライさ
れている。図から明らかなように、グルテリン抗体はそ
れらダイズグリシニンとほとんど交差していないため、
11S、7Sのフラクシヨンに観察されたバンドは、コメグ
ルテリンであると考えられる。即ち、コメ種子において
ダイズグリシニンを発現させたことにより、一部のグル
テリンが塩溶液可溶性、即ちグロブリンになった。それ
らは、主にグリシニンと同じ1lS・7Sのフラクシヨンに
存在することから、グリシニンと相互作用してハイブリ
ッド6量体およびハイブリッド3量体を形成しているもの
と推察される。それら可溶化したグルテリンの量は、予
備的な見積もりで、可溶性グリシニンの5％程度と推定
された。

【００３６】[実施例７] ティシュプリント法によるコ
メ種子における発現グリシニンのInsitu発現部位解析グルテリンプロモータは種子の胚乳で特異的に発現す
る。そこで、この発現の組織特異性が保持されているか
どうかを、テイシュプリント法によって調べた。In sit
u発現部位解析を、Manteuffelら（R. Mo Manteuffel an
d R. Ranitz, Plant Mol. Biol., 22 (1993) 1129-113
4.）の記載に従い、ティシュプリント法によって行っ
た。0.01 M リン酸緩衝液(pH7.4)/0.8 % (w/v) NaCl/0.
2 % (w/v) KCl/10 mM NaN３/0.4 M スクロースに浸漬し
たコメ種子を、カミソリの刃を使って垂直に切断した。
そして、脂質を除くために20秒間アセトンに浸した後、
ニトロセルロース膜に5〜10秒間押しつけた。その後、
そのニトロセルロース膜を、60℃で30分間乾燥させ、抗
グリシニン抗血清を使ったイムノブロッティングに供し
た。その結果を図７に示す。左がコントロール、右がIV
＋4Metを示す。グリシニンは胚乳で発現し、胚では発現
していなかった。また天然型ノーマルも改造型IV＋4Met
と同様の結果を与えた。つまり、天然型も改造型も発現
の組織特異性が保持されていることが判明した。さら
に、電子顕微鏡を用いた胚乳部の免疫組織化学的観察に
より、グリシニンはプロテインボデイーのマトリックス
部に認められた。即ち、発現グリシニンはプロテインボ
ディーにソーテイングされていることが判明した。

【００３７】[実施例８] 連続抽出処理による溶解性解
析コメ種子(18 mg)を細かく粉砕し、各々1800 ulの25 mM
N-エチルマレイミド(NEM)を含む抽出用緩衝液で6回、室
温で1時間ずつ激しく振とうしながら連続的に抽出し
た。抽出用緩衝液で抽出した後の残さに対し、さらに3
回、各々1800 ulの1 % (v/v)乳酸/1 mM EDTA/25 mM NEM
で抽出処理を施した。最後に、その後の残さに対して1
回、1800ulのSDSサンプルバッファーで同様に抽出処理
を行った。

【００３８】一方、逆に発現グリシニンがグルテリン化
しているか否かにつき解析した。図８は、コメ種子に対
し塩溶液で6回、十分な抽出操作を繰り返した後、1％乳
酸で3回、さらにSDSで1回抽出操作して得られた各画分
をSDS-PAGE後、ウェスタンプロッテイングにかけグリシ
ニン抗体で検出した。グルテリンは乳酸で抽出される
が、その抽出液に塩化ナトリウムを加えると沈澱する。
図から明らかなように、塩溶液で抽出されるグリシニン
は抽出操作を繰り返す度に少なくなり、6回目ではほと
んど消失した。しかしながら1％乳酸やSDSでは再びグリ
シニンが抽出されていた。このことから、一部の発現グ
リシニンはコメグルテリンと相互作用することで、グル
テリン化しているものと推察される。それら不溶化した
発現グリシニンの量は、予備的な見積もりで、全発現グ
リシニンのうちの20％程度と推定された。

【００３９】

【発明の効果】本発明により、ダイズグリシニンを発現
するトランスジェニック植物およびその繁殖媒体が提供
された。ダイズグリシニンは、栄養性や加工特性が優れ
ていることに加え、ヒトの血清中コレステロール値を低
下させる健康維持増進性を備えているため、本発明によ
れば付加価値を高めた農作物を生産することが可能であ
る。また、ダイズグリシニンは、日常食べているダイズ
由来のタンパク質であるため、本発明により生産された
農作物は、安全性が高い点でも有益である。

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Director general of National Institute of Agrobiological Resourc es Naoki Katsura <120> Transgenic plants expressing Soybean Glycinin. <130> MOA-002 <140> <141> <160> 7 <170> PatentIn version 2.0 <210> 1 <211> 1743 <212> DNA <213> Glycine max <220> <221> CDS <222> (52)...(1536) <400> 1 acaactcaaa cattctctcc attggtcctt aaacactcat cagtcatcac c atg gcc 57 Met Ala 1 aag cta gtt ttt tcc ctt tgt ttt ctg ctt ttc agt ggc tgc tgc ttc 105 Lys Leu Val Phe Ser Leu Cys Phe Leu Leu Phe Ser Gly Cys Cys Phe 5 10 15 gct ttc agt tcc aga gag cag cct cag caa aac gag tgc cag atc caa 153 Ala Phe Ser Ser Arg Glu Gln Pro Gln Gln Asn Glu Cys Gln Ile Gln 20 25 30 ａａａｃｔｃａａｔｇｃｃｃｔｃａａａｃｃｇｇａｔａａｃ
ｃｇｔａｔａｇａｇｔｃａｇａａｇｇａｇｇｇ 201 Lys Leu Asn Ala Leu Lys Pro Asp Asn Arg Ile Glu Ser Glu Gly Gly 35 40 45 50 ctc att gag aca tgg aac cct aac aac aag cca ttc cag tgt gcc ggt 249 Leu Ile Glu Thr Trp Asn Pro Asn Asn Lys Pro Phe Gln Cys Ala Gly 55 60 65 gtt gcc ctc tct cgc tgc acc ctc aac cgc aac gcc ctt cgt aga cct 297 Val Ala Leu Ser Arg Cys Thr Leu Asn Arg Asn Ala Leu Arg Arg Pro 70 75 80 tcc tac acc aac ggt ccc cag gaa atc tac atc caa caa ggt aag ggt 345 Ser Tyr Thr Asn Gly Pro Gln Glu Ile Tyr Ile Gln Gln Gly Lys Gly 85 90 95 att ttt ggc atg ata tac ccg ggt tgt cct agc aca ttt gaa gag cct 393 Ile Phe Gly Met Ile Tyr Pro Gly Cys Pro Ser Thr Phe Glu Glu Pro 100 105 110 caa caa cct caa caa aga gga caa agc agc aga cca caa gac cgt cac 441 Gln Gln Pro Gln Gln Arg Gly Gln Ser Ser Arg Pro Gln Asp Arg His 115 120 125 130 ｃａｇａａｇａｔｃｔａｔａａｃｔｔｃａｇａｇａｇｇｇｔ
ｇａｔｔｔｇａｔｃｇｃａｇｔｇｃｃｔａｃｔ 489 Gln Lys Ile Tyr Asn Phe Arg Glu Gly Asp Leu Ile Ala Val Pro Thr 135 140 145 ggt gtt gca tgg tgg atg tac aac aat gaa gac act cct gtt gtt gcc 537 Gly Val Ala Trp Trp Met Tyr Asn Asn Glu Asp Thr Pro Val Val Ala 150 155 160 gtt tct att att gac acc aac agc ttg gag aac cag ctc gac cag atg 585 Val Ser Ile Ile Asp Thr Asn Ser Leu Glu Asn Gln Leu Asp Gln Met 165 170 175 cct agg aga ttc tat ctt gct ggg aac caa gag caa gag ttt cta aaa 633 Pro Arg Arg Phe Tyr Leu Ala Gly Asn Gln Glu Gln Glu Phe Leu Lys 180 185 190 tat cag caa gag caa gga ggt cat caa agc cag aaa gga aag cat cag 681 Tyr Gln Gln Glu Gln Gly Gly His Gln Ser Gln Lys Gly Lys His Gln 195 200 205 210 caa gaa gaa gaa aac gaa gga ggc agc ata ttg agt ggc ttc acc ctg 729 Gln Glu Glu Glu Asn Glu Gly Gly Ser Ile Leu Ser Gly Phe Thr Leu 215 220 225 gaa ttc ttg gaa cat gca ttc agc gtg gac aag cag ata gcg aaa aac 777 Glu Phe Leu Glu His Ala Phe Ser Val Asp Lys Gln Ile Ala Lys Asn 230 235 240 cta caa gga gag aac gaa ggg gaa gac aag gga gcc att gtg aca gtg 825 Leu Gln Gly Glu Asn Glu Gly Glu Asp Lys Gly Ala Ile Val Thr Val 245 250 255 aaa gga ggt ctg agc gtg ata aaa cca ccc acg gac gag cag caa caa 873 Lys Gly Gly Leu Ser Val Ile Lys Pro Pro Thr Asp Glu Gln Gln Gln 260 265 270 aga ccc cag gaa gag gaa gaa gaa gaa gag gat gag aag cca cag tgc 921 Arg Pro Gln Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Lys Pro Gln Cys 275 280 285 290 aag ggt aaa gac aaa cac tgc caa cgc ccc cga gga agc caa agc aaa 969 Lys Gly Lys Asp Lys His Cys Gln Arg Pro Arg Gly Ser Gln Ser Lys 295 300 305 agc aga aga aat ggc att gac gag acc ata tgc acc atg aga ctt cgc 1017 Ser Arg Arg Asn Gly Ile Asp Glu Thr Ile Cys Thr Met Arg Leu Arg 310 315 320 cac aac att ggc cag act tca tca cct gac atc tac aac cct caa gcc 1065 His Asn Ile Gly Gln Thr Ser Ser Pro Asp Ile Tyr Asn Pro Gln Ala 325 330 335 ggt agc gtc aca acc gcc acc agc ctt gac ttc cca gcc ctc tcg tgg 1113 Gly Ser Val Thr Thr Ala Thr Ser Leu Asp Phe Pro Ala Leu Ser Trp 340 345 350 ctc aga ctc agt gct gag ttt gga tct ctc cgc aag aat gca atg ttc 1161 Leu Arg Leu Ser Ala Glu Phe Gly Ser Leu Arg Lys Asn Ala Met Phe 355 360 365 370 gtg cca cac tac aac ctg aac gcg aac agc ata ata tac gca ttg aat 1209 Val Pro His Tyr Asn Leu Asn Ala Asn Ser Ile Ile Tyr Ala Leu Asn 375 380 385 gga cgg gca ttg ata caa gtg gtg aat tgc aac ggt gag aga gtg ttt 1257 Gly Arg Ala Leu Ile Gln Val Val Asn Cys Asn Gly Glu Arg Val Phe 390 395 400 gat gga gag ctg caa gag gga cgg gtg ctg atc gtg cca caa aac ttt 1305 Asp Gly Glu Leu Gln Glu Gly Arg Val Leu Ile Val Pro Gln Asn Phe 405 410 415 gtg gtg gct gca aga tca cag agt gac aac ttc gag tat gtg tca ttc 1353 Val Val Ala Ala Arg Ser Gln Ser Asp Asn Phe Glu Tyr Val Ser Phe 420 425 430 aag acc aat gat aca ccc atg atc ggc act ctt gca ggg gca aac tca 1401 Lys Thr Asn Asp Thr Pro Met Ile Gly Thr Leu Ala Gly Ala Asn Ser 435 440 445 450 ttg ttg aac gca tta cca gag gaa gtg att cag cac act ttc aac cta 1449 Leu Leu Asn Ala Leu Pro Glu Glu Val Ile Gln His Thr Phe Asn Leu 455 460 465 aaa agc cag cag gcc agg cag ata aag aac aac aac cct ttc aag ttc 1497 Lys Ser Gln Gln Ala Arg Gln Ile Lys Asn Asn Asn Pro Phe Lys Phe 470 475 480 ctg gtt cca cct cag gag tct cag aag aga gct gtg gct tagagccctt 1546 Leu Val Pro Pro Gln Glu Ser Gln Lys Arg Ala Val Ala 485 490 495 tttgtatgtg ctaccccact tttgtctttt tggcaatagt gctagcaacc aataaataat 1606 aataataata atgaataaga aaacaaaggc tttagcttgc cttttgttca ctgtaaaata 1666 ataatgtaag tactctctat aatgagtcac gaaacttttg cgggaataaa aggagaaatt 1726 ccaatgagtt ttctgtc 1743 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplifying Glutelin gene <400> 2 cagcagctat taggccaga gcactag 27 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplifying Glutelin gene <400> 3 gggaagcttt atccgcaagc cgacctaag 29 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplifying Glutelin gene <400> 4 cagctattta atcccagcac aaaccc 26 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplifying Glutelin gene <400> 5 gggaagctta cattactctg aggtctcgc 29 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplifying Glycinin gene <400> 6 ttcagttcca gagagcagcc 20 <210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplifying Glycinin gene <400> 7 cgcggatcca tacaaaaagg gctctaag 28

【図面の簡単な説明】

【図１】ダイズグリシニンおよびイネグルテリンの成熟
過程を示す図である。

【図２】本発明においてイネの形質転換に用いたプラス
ミド「pGluB1GlyN」および「pGluB1GlyIV」を示す図で
ある。

【図３】トランスジェニックイネ植物体の完熟種子およ
び葉におけるグリシニン遺伝子およびグルテリン遺伝子
の発現をノーザンブロット法により検出した結果を示す
電気泳動像写真である。図中の「DAF」は、開花後の日
数を示す。

【図４】トランスジェニックイネ植物体の完熟種子にお
ける天然型および改造型グリシニンの発現をドットブロ
ット解析した結果を示す図である。

【図５】トランスジェニックイネ植物体の完熟種子にお
いて発現する天然型および改造型グリシニンの分子集合
形態を解析した結果を示す電気泳動写真である。

【図６】ダイズグリシニンとコメグルテリンの相互作用
につき検出した結果を示す電気泳動写真である。

【図７】コメ種子における発現グリシニンのIn situ発
現部位をティシュプリント法により解析した結果を示す
写真である。

【図８】連続抽出処理によるダイズグリシニンの溶解性
解析の結果を示す電気泳動写真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き特許法第30条第１項適用申請有り京都新聞（1998年６月９日）に発表特許法第30条第１項適用申請有り日本工業新聞（1998 年６月23日）に発表特許法第30条第１項適用申請有り産経新聞（1998年６月９日）に発表特許法第30条第１項適用申請有り商経アドバイス新聞（1998年６月25日）に発表特許法第30条第１項適用申請有り山陰中央新報（1998 年６月９日）に発表特許法第30条第１項適用申請有り日本農業新聞（1998 年６月９日）に発表 (56)参考文献特開平２−156889（ＪＰ，Ａ) ＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅ，130, ｐ．189−196，1997 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 A01H 5/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】ダイズグリシニンタンパク質AlaB1bサブ
ユニットをコードする遺伝子が導入されたトランスジェ
ニックイネ。
【請求項２】ダイズグリシニンタンパク質AlaB1bサブ
ユニットをコードする遺伝子がイネグルテリン遺伝子の
プロモーターの下流に結合している、請求項１に記載の
トランスジェニックイネ。
【請求項３】請求項１または２に記載のトランスジェ
ニックイネの繁殖媒体。