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WO2000008148A1 - Sequences nucleiques codant pour une proteine (atip) interagissant avec le recepteur at2 et leurs applications - Google Patents

Sequences nucleiques codant pour une proteine (atip) interagissant avec le recepteur at2 et leurs applications Download PDF

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WO2000008148A1
WO2000008148A1 PCT/FR1999/001908 FR9901908W WO0008148A1 WO 2000008148 A1 WO2000008148 A1 WO 2000008148A1 FR 9901908 W FR9901908 W FR 9901908W WO 0008148 A1 WO0008148 A1 WO 0008148A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protein
atip
receptor
transcription factor
group
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/FR1999/001908
Other languages
English (en)
Inventor
Nathalie Elbaz
Clara Nahmias
Arthur Donny Strosberg
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority to US09/762,194 priority Critical patent/US6835539B1/en
Priority to CA002339083A priority patent/CA2339083A1/fr
Priority to EP99936666A priority patent/EP1102843A1/fr
Publication of WO2000008148A1 publication Critical patent/WO2000008148A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Priority to US10/976,933 priority patent/US20060040277A1/en
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Definitions

  • the AT2 receptor which also belongs to the family of G protein-coupled receptors, is still poorly characterized both from the point of view of its activation mechanisms and of its physiological role (C. Nahmias et al, Trends Pharmacol Sri, 1995, 16, 223-225). Several arguments, however, suggest a role for this receptor in the phenomena of proliferation, differentiation or cell adhesion.
  • the AT2 receptor is highly expressed during fetal life, disappears in adults in most tissues, but is re-expressed under pathophysiological conditions involving tissue restructuring.
  • the AT2 receptor has also been shown to interfere with the growth factor receptor activation pathways and inhibit the activity of MAP kinases (ERK1 and ERK2) (mitogen-activated protein), which play a key role in the phenomena cell proliferation and differentiation.
  • MAP kinases ERK1 and ERK2
  • the inhibitory effect of AT2 on the activation of MAP kinases is rapid and transient, does not involve a regulatory protein sensitive to pertussis toxin (Gi / Go type), but involves the activation of a tyrosine phosphatase sensitive to orthovanadate.
  • the inventors Given the role of the AT2 receptor on cell proliferation, the inventors have sought to develop tools capable of regulating 1st action of the AT2 receptor. Indeed, the activation of the AT2 receptor can have repercussions in oncology (inhibition of cell proliferation).
  • the AT2 receptor has effects opposite to those of AT1 on the activation of MAP kinases and on cell proliferation; the study of the communication which can exist between these two subtypes of receptors, binding the same ligand, is therefore of interest.
  • the study of the signaling pathways and the regulation of the AT2 receptor also represents an important issue for human health, knowing that today ATI receptor antagonists are administered to patients with hypertension. In this context, it becomes essential to know the biological effects associated with the AT2 receptor which remains activatable by the circulating Ang II in this type of treatment.
  • the subject of the present invention is a fragment of isolated nucleic acids (DNA or RNA), coding for a protein capable of binding to the AT2 receptor, which fragment is selected from the group consisting of the sequences SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 and 9, as presented in the list of sequences, included in this Application. These different sequences correspond to complementary DNA (cDNA) coding for part or all of the protein hereinafter called ATIP (AT2 interacting protein).
  • sequence SEQ ID NO: 1 (1803 bp) corresponds to the complete nucleic sequence of the mouse ATIP and includes both the parts coding for the AT2 receptor binding protein and the non-coding parts.
  • sequence NO: 3 corresponds to the nucleic acid sequence of the coding part of the sequence SEQ ID NO: l, while the sequence SEQ ID NO: 5 corresponds to the fragment of the sequence NO: l, obtained by the double-hybrid technique (A. Plessis et al., M / S, 1994, 9, I-1K; J. Luban et al, Curr. Op. Biotechnol, 1995, 6, 59-64).
  • sequence SEQ ID NO: 7 (3742 bp) corresponds to the complete nucleic sequence of human cDNA and includes both the parts coding for the protein homologous to mouse ATIP and the non-coding parts.
  • sequence SEQ ID NO: 9 (1308 bp) corresponds to the coding part of the sequence SEQ ID NO: 7.
  • the present invention also relates to transcripts, characterized in that they are complementary to the sequences according to the invention and are in particular generated from said sequences.
  • the present invention further relates to fragments of said sequences comprising between 20 and 400 bp, useful as probes or as primers, for the detection of sequences SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 or 9, or of homologous sequences.
  • fragments there may be mentioned in particular a probe of 354 bp, (SEQ ID NO: 5) as well as any fragment of 20 bp to 400 bp included in the sequences SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 or 9.
  • sequence SEQ ID NO: 10 antisense oligonucleotide
  • ATIP 5 ′ RACE technique: Marathon cDNA amplification kit, Clontech
  • hybridization and hybridization are in particular the following: 45% formamide, 9% Dextransulfate, 0.2% BSA, 0.2% polyvinyl pyrrolidone, 0.2% Ficoll, 0.1% sodium pyrophosphate, 0.01% SDS, 0.05 mM Tris pH 7.5, 0.9 M NaCl and rinses to a stringency corresponding to the buffer: SSCX1, 0.1% SDS.
  • the present invention also relates to a purified and isolated protein, called ATIP, capable of interacting with the AT2 receptor, selected from the group consisting of the sequences SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 8.
  • the murine and human sequences have 85.6% homologies.
  • the human sequence (human ATIP) has 5 fewer amino acids than the mouse sequence (ATIP mouse).
  • the missing amino acids in the human sequence are at the amino acid level: 162, 163,
  • the present invention also relates to a translation product, characterized in that it is coded by a nucleotide sequence in accordance with the invention.
  • the present invention further relates to antibodies, characterized in that they are directed against the ATIP protein or a fragment of ATIP protein according to the invention.
  • the present invention also relates to a recombinant cloning and / or expression vector, characterized in that it comprises a nucleotide sequence in accordance with the invention.
  • the present invention also relates to a transformed host cell, characterized in that it comprises a vector as defined above.
  • a transformed host cell characterized in that it comprises a vector as defined above.
  • the preferred transformed cells according to the invention mention may be made of E. coli and CHO cells.
  • the present invention also relates to transformed host cells, characterized in that they consist of a suitable yeast strain co-transformed with at least two vectors which respectively code (i) for a protein called bait selected in the group consisting of a fragment containing at least SEQ ID NO: 5 of the ATIP protein and a fragment containing at least the C-terminal end of the AT2 receptor, which bait protein is fused to a protein selected from the group consisting of the domain of DNA binding of a transcription factor and the activation domain of the same transcription factor and (ii) for a protein known as prey, selected from the group consisting of a fragment containing at least SEQ ID NO: 5 protein ATIP, a fragment containing at least the C-terminal end of the AT2 receptor and any other polypeptide corresponding to a sequence contained in a cDNA library, which prey protein is fused to a protein selected from the group consisting of DNA binding domain of a transcription factor and the activation domain of the same transcription factor, which vectors further comprise selectable markers we.
  • said cells notably consist of:
  • Such a method notably implements the so-called triple-hybrid or reverse double-hybrid technique, as described in Vidal et al. (Proc. Natl. Acad. Sri. USA, 1996, 93, 10315-10320 and 10321-10326) or Tirode et al. (]. Biol. Chem., 1997, 272, 37, 22995-22999).
  • the present invention also relates to a method of screening for polypeptides interacting with the ATIP protein according to the invention, which method comprises:
  • the present invention also relates to a method for characterizing the domains involved in the ATIP protein-AT2 receptor interaction, characterized in that it comprises:
  • Such a method makes it possible to identify and delimit the important domains of the ATIP protein or of the C-terminal end of the AT2 receptor, on which their interaction depends, in order to use them as a privileged target for modifying the signaling of the AT2 receptor.
  • the subject of the present invention is also a method of selecting substances capable of influencing the ATIP protein interaction according to the invention-AT2 receptor, which method comprises: (a) bringing the ATIP protein fixed on a support into contact with a AT2 receptor-tag protein fusion protein, possibly in the presence of a test substance,
  • the visualization step is negative.
  • ATIP is fixed to said support either covalently or by affinity bonding between a fixing substance fused to ATIP and said support.
  • said support consists of beads coupled either to a substance having an affinity with said fixing protein, fused to ATIP, or to suitable antibodies.
  • the AT2 receptor-tag protein fusion protein is in particular obtained from a lysate of cells transfected with a vector expressing the AT2-tag protein fusion protein.
  • said method for selecting substances capable of interacting with the ATIP protein according to the invention comprises:
  • the invention-AT2 receptor it is possible to use, in particular as ATIP-tag protein fusion proteins, the GST-ATIPc and MYC-ATIPc proteins, which constitute tools which can make it possible to entrain possible interacting proteins in vitro with ATIP, for example, from cell lysates activated or not by ligands of the AT2 receptor.
  • the GST-ATIP protein can be caused by specific interaction of GST with agarose beads coupled to glutathione, or else immunoprecipitated with the anti-ATIP antibody.
  • the Myc-ATIP protein can be immunoprecipitated with commercial anti-MYC antibodies or with anti-ATIP antibody.
  • the interest of these methods consists in finding means of modifying the signaling, the level of expression or the pharmacology of the AT2 receptor, this being able to have therapeutic applications.
  • a modification of this transduction in particular by acting on the binding of the AT2 receptor to the protein according to the invention, may then possibly compensate for the pathological disorder or at least influence it.
  • the present invention also relates to the use of the aforementioned co-transformed cells, for the selection and screening of substances or proteins capable of influencing the ATIP protein-AT2 receptor interaction or capable of interacting with the ATIP protein.
  • FIG. 2 illustrates the position of the GAL4 binding domain and the multiple cloning site of the plasmid pGBT9 (Clontech);
  • FIG. 8 illustrates the structure of the plasmid pBAC-PAK-poly HIS
  • Protein X C-terminal end of the sequence coding for the mouse AT2 receptor (52 amino acids from CNNPF at the stop codon, see FIG. 1), fused to the sequence coding for the DNA binding domain of Gal4 (FIG. 2 ).
  • any other pair of ohgonucleotides (primers) of more than 20 bp and comprising a part of the ATIP sequence can also be used. to amplify by PCR (PCR conditions to be determined for each pair of oligonucleotides using the OLIGO 4 software) part of the ATIP (and give a DNA fragment which could possibly be used as a probe to recognize the DNA or RNA corresponding to ATIP).
  • PCR PCR conditions to be determined for each pair of oligonucleotides using the OLIGO 4 software
  • Stable clones expressing both the human AT2 receptor and the short mouse ATIP (SEQ ID NO: 6) or the long mouse ATIP (SEQ ID NO: 3) were obtained by transfection.
  • the selected clone CHO-hAT2, expressing 100 fmol of AT2 receptor / mg of protein, is cultured on HAMF12 medium supplemented with 10% fetal calf serum and used between passages 10 and 30.
  • This clone has itself been transfected with the plasmids pCDNA3-MYC-ATIPsouris-short or pCDNA3-ATIPsouris-long described in Example 3.
  • the selection of the clones stably expressing the ATIP protein (short form or long form) was done in selective medium containing 800 ⁇ g / ml of G418.
  • the results obtained indicate that different clones expressing different levels of short mouse ATIP could be obtained.
  • GGA TCC-SEQ NO: 5-TAG-TGA-ATT is inserted into the plasmid pRSETA, as defined above.
  • Nickel Ni-NTA, QuiAexpressionist 07/97, Quiagen
  • the protein obtained is then injected into rabbits to obtain polyclonal antibodies directed against the protein ATIP.
  • the grooves obtained have a very good titer.
  • This purified antibody was used in immunofluorescence on CHO-hAT2 cells, fixed by a 15-minute treatment with paraformaldehyde (3%). After fixation, the cells are successively treated with PBS / 50 mM glycine solutions for 20 minutes, PBS / Triton X100 0.1% for 5 minutes and PBS / BSA 0.2% for 15 minutes. They are then incubated successively in solutions at 15 ⁇ g / ml of antibody containing the purified anti-ATIP antibody, then the rabbit anti-immunoglobulin antibody coupled to rhodamine for 30 minutes. Between each new incubation, three rinses in PBS are carried out. Observations under the fluorescence microscope indicate an expression of the endogenous ATIP protein in the nucleus (mainly) and in the cytoplasm of CHO-hAT2 cells.
  • the CHO-hAT2 cells are seeded at a density of 3.10 6 cells per 15 cm 2 dish in diameter. They are made quiescent by a weaning of 16 hours before being treated.
  • the treatment consists in bringing into contact for 5 minutes with 15 ml of F12 medium containing insulin with or without CGP42112 added (selective agonist of the AT2 receptor).
  • the cells are dissolved in lysis buffer containing: 50 mM Hepes, pH 7.6, 1% Triton X-100, 20 mM EDTA, 30 mM sodium pyrophosphate, 30 mM sodium fluoride, 2 mM benzamidine, 1 mM sodium orthovanadate, 1 mM phenylmethylsuphonyl fluoride and 1 ⁇ g / ml aprotinin, pepstatin, antipain and leupeptin.
  • the lysates are then subjected to a purification on a wheat germ lectin column according to the protocol described in Issad, T., et al. (Eur.]. Biochem. 1995, 234, 108-115).
  • SIRP newly cloned protein
  • the phosphorylation of this protein, as well as that of IR ⁇ is inhibited in the presence of CGP42112 in the case of the clone CHO-hAT2 and is not in the case of the clone CHO-hAT2-ATIP. This confirms that the ATIP protein interferes with the signaling pathways of the AT2 receptor.

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Abstract

Séquences nucléiques codant pour une protéine apte à interagir avec le récepteur AT2, oligonucléotides compris dans lesdites séquences, leurs applications en tant que sondes et pour l'expression desdites protéines, vecteurs utiles pour ladite expression, hôtes cellulaires contenant lesdits vecteurs, ainsi qu'un modèle d'étude du récepteur AT2. Protéines ainsi que leurs applications. Ledit fragment d'acides nucléiques isolé, codant pour une protéine apte à se lier au récepteur AT2, est sélectionné dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO:1, 3, 5, 7 et 9.

Description

SEQUENCES NUCLEIQUES CODANT POUR UNE PROTEINE (ATIP) INTERAGISSANT AVEC LE RECEPTEUR AT2 ET LEURS APPLICATIONS
La présente invention est relative à des séquences nucléiques 5 codant pour une protéine apte à interagir avec le récepteur AT2, à des oligo- nucléotides compris dans lesdites séquences, à leurs applications en tant que sondes et pour l'expression desdites protéines, aux vecteurs utiles pour ladite expression, aux hôtes cellulaires contenant lesdits vecteurs, ainsi qu'à un modèle d'étude du récepteur AT2. 10 La présente invention est également relative aux dites protéines ainsi qu'à leurs applications.
L'octapeptide angiotensine II, principalement connu comme régulateur de la pression artérielle, a également été décrit comme un important modulateur de la croissance cellulaire. De façon intéressante ce peptide 15 semble exercer des effets opposés sur la croissance cellulaire, selon qu'il se lie sur l'un ou l'autre de ses deux sous-types de récepteurs membranaires (ATI ou AT2).
Le récepteur de sous-type AT2, qui appartient aussi à la famille des récepteurs couplés aux protéines G, est encore mal caractérisé tant 20 du point de vue de ses mécanismes d' activation que de son rôle physiologique (C. Nahmias et al, Trends Pharmacol Sri, 1995, 16, 223-225). Plusieurs arguments suggèrent cependant un rôle de ce récepteur dans les phénomènes de prolifération, de différenciation ou d'adhésion cellulaire.
Le récepteur AT2 est fortement exprimé au cours de la vie 25 foetale, disparaît chez l'adulte dans la plupart des tissus, mais se trouve réexprimé dans des conditions pathophysiologiques impliquant la restructuration des tissus.
Des études réalisées in vivo ont mis en évidence le rôle inhibiteur exercé par le sous-type AT2 sur la prolifération des cellules musculaires 30 de l'intima, après lésion vasculaire (P. Janiak et al., Hypertension, 1992, 20, 737- 745 ; M. Nakajima et al., Proc. Natl. Acad. Sri. USA, 1995, 92, 10663-10667).
Par ailleurs, la stimulation du récepteur AT2 active la phos- phatase SHP-1 (Bedecs K. et al; Biochem. /., 1997, 325, 449-454). Le fait que le récepteur AT2 active une phosphatase est en accord avec ses effets antiprolifé- ratifs.
Compte tenu de ce qui précède, il a été montré que sur des cellules en culture, le récepteur AT2 :
- inhibe la synthèse d'ADN et la prolifération, induites par l'angiotensine II (Ang II) et le bFGF (M. Stoll et al, /. Clin. Invest, 1995, 95, 651- 657),
- induit l'apoptose (T. Yamada et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 156-160) et
- induit la différenciation neuronale (L. Laflamme et al, /. Biol. Chem., 1996, 271, 22729-22735). L'étude des voies de signalisation, associées au récepteur AT2, a été abordée dans les cellules de la lignée N1E-115, dérivées d'un neuro- blastome murin, qui n'expriment que le sous-type AT2. Une première étude a permis de mettre en évidence une déphosphorylation rapide et transitoire de certaines protéines sur résidus tyrosine, suite au traitement des cellules N1E- 115 par l'angiotensine II (C. Nahmias et al, Biochem. ]., 1995, 306, 87-92). Il a également été montré que le récepteur AT2 interfère avec les voies d' activation des récepteurs aux facteurs de croissance et inhibe l'activité des MAP kinases (ERK1 et ERK2) (mitogen-activated protein), qui jouent un rôle clé dans les phénomènes de prolifération et de différenciation cellulaire. L'effet inhibiteur de l'AT2 sur l'activation des MAP kinases est rapide et transitoire, ne fait pas intervenir une protéine régulatrice sensible à la toxine pertussique (de type Gi/Go), mais implique l'activation d'une tyrosine phosphatase sensible à l'orthovanadate.
Compte tenu du rôle du récepteur AT2 sur la prolifération cellulaire, les Inventeurs ont cherché à mettre au point des outils aptes à régu- 1er l'action du récepteur AT2. En effet, l'activation du récepteur AT2 peut avoir des répercussions en cancérologie (inhibition de la prolifération cellulaire).
De manière générale, le récepteur AT2 présente des effets inverses de ceux de l'ATl sur l'activation des MAP kinases et sur la prolifération cellulaire ; l'étude de la communication qui peut exister entre ces deux sous-types de récepteurs, liant le même ligand, présente par conséquent de l'intérêt.
L'étude des voies de signalisation et de la régulation du récep- teur AT2 représente également un enjeu important pour la santé humaine sachant qu'aujourd'hui des antagonistes du récepteur ATI sont administrés aux patients atteints d'hypertension. Dans ce contexte il devient essentiel de connaître les effets biologiques associés au récepteur AT2 qui reste activable par l'Ang II circulante dans ce type de traitement. La présente invention a pour objet un fragment d'acides nucléiques (ADN ou ARN) isolé, codant pour une protéine apte à se lier au récepteur AT2, lequel fragment est sélectionné dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO:l, 3, 5, 7 et 9, telles que présentées dans la liste des séquences, incluse dans la présente Demande. Ces différentes séquences correspondent à l'ADN complémentaire (ADNc) codant pour une partie ou la totalité de la protéine ci-après dénommée ATIP (AT2 interacting protein).
La séquence SEQ ID NO:l (1803 pb) correspond à la séquence nucléique complète de l'ATIP de souris et inclut aussi bien les parties codant pour la protéine de liaison au récepteur AT2 que les parties non codantes.
La séquence NO:3 (1323 pb) correspond à la séquence en acides nucléiques de la partie codante de la séquence SEQ ID NO:l, alors que la séquence SEQ ID NO:5 correspond au fragment de la séquence NO:l, obtenu par la technique du double-hybride (A. Plessis et al., M/ S, 1994, 9, I- 1K ; J. Luban et al, Curr. Op. Biotechnol, 1995, 6, 59-64). La séquence SEQ ID NO:7 (3742 pb) correspond à la séquence nucléique complète de l'ADNc humain et inclut aussi bien les parties codant pour la protéine homologue de l' ATIP de souris que les parties non codantes.
La séquence SEQ ID NO:9 (1308 pb) correspond à la partie codante de la séquence SEQ ID NO : 7.
La présente invention a également pour objet des transcrits, caractérisés en ce qu'ils sont complémentaires des séquences conformes à l'invention et sont notamment générés à partir desdites séquences.
La présente invention a en outre pour objet des fragments desdites séquences comprenant entre 20 et 400 pb, utiles comme sondes ou comme amorces, pour la détection des séquences SEQ ID NO:l, 3, 5, 7 ou 9, ou de séquences homologues.
Parmi lesdits fragments, on peut notamment citer une sonde de 354 pb, (SEQ ID NO:5) ainsi que tout fragment de 20 pb à 400 pb inclus dans les séquences SEQ ID NO:l, 3, 5, 7 ou 9.
Comme amorce, on utilisera en particulier la séquence SEQ ID NO:10 (oligonucléotide antisens), qui permet notamment d'amplifier les parties 5' des différents ARNm correspondant à l'ATIP (technique du 5' RACE : Marathon cDNA amplification kit, Clontech). On peut également utiliser comme amorces d'amplification, tout couple d' ohgonucleotides de plus de 20 pb et comprenant une partie de la séquence nucléique ATIP (humaine ou de souris), notamment le couple SEQ ID NO:ll-SEQ ID NO:12.
Les conditions préférées d'hybridation (préhybridation et hybridation) sont notamment les suivantes : 45 % formamide, 9 % Dextran- sulfate, 0,2 % BSA, 0,2 % polyvinyl pyrrolidone, 0,2 % Ficoll, 0,1 % sodium pyrophosphate, 0,01 % SDS, 0,05 mM Tris pH 7,5, 0,9 M NaCl et rinçages jusqu'à une stringence correspondant au tampon : SSCX1, 0,1 % SDS.
La présente invention a également pour objet une protéine purifiée et isolée, dénommée ATIP, apte à interagir avec le récepteur AT2, sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO:2, 4, 6 ou 8.
Les séquences murines et humaine présentent 85,6 % d'homologies. La séquence humaine (ATIP humain) possède 5 aminoacides de moins que la séquence de souris (ATIP souris). Les acides aminés manquants dans la séquence humaine se situent au niveau des acides aminés : 162, 163,
164, 166 et 214 de la séquence ATIP souris.
Les comparaisons (Blast) entre les séquences protéiques ATIP selon l'invention et les séquences contenues dans les banques de données indiquent que ATIP humain (comme ATIP souris), ne présentent jamais plus de 25 % d'homologie avec une séquence connue, et cela, seulement sur une partie de cette séquence.
La présente invention a également pour objet un produit de traduction, caractérisé en ce qu'il est codé par une séquence nucléotidique conforme à l'invention.
La présente invention a en outre pour objet des anticorps, caractérisés en ce qu'ils sont dirigés contre la protéine ATIP ou un fragment de protéine ATIP selon l'invention.
La présente invention a également pour objet un vecteur recombinant de clonage et/ ou d'expression, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique conforme à l'invention.
La présente invention a également pour objet une cellule hôte transformée, caractérisée en ce qu'elle comprend un vecteur tel que défini ci-dessus. Parmi les cellules transformées préférées selon l'invention, on peut citer E. coli et les cellules CHO.
La présente invention a également pour objet des cellules hôtes transformées, caractérisées en ce qu'elles sont constituées par une souche de levure convenable co-transformée avec au moins deux vecteurs qui codent respectivement (i) pour une protéine dite appât sélectionnée dans le groupe constitué par un fragment contenant au moins la SEQ ID NO:5 de la protéine ATIP et un fragment contenant au moins l'extrémité C-terminale du récepteur AT2, laquelle protéine appât est fusionnée à une protéine sélectionnée dans le groupe constitué par le domaine de liaison à l'ADN d'un facteur de transcription et le domaine d' activation du même facteur de transcription et (ii) pour une protéine dite proie, sélectionnée dans le groupe constitué par un fragment contenant au moins la SEQ ID NO:5 de la protéine ATIP, un fragment contenant au moins l'extrémité C-terminale du récepteur AT2 et tout autre polypeptide correspondant à une séquence contenue dans une banque d'ADNc, laquelle protéine proie est fusionnée à une protéine sélectionnée dans le groupe constitué par le domaine de liaison à l'ADN d'un facteur de transcription et le domaine d' activation du même facteur de transcription, lesquels vecteurs comportent en outre des marqueurs de sélection.
Selon un mode de réalisation avantageux desdites cellules, elles sont notamment constituées :
- soit par une souche de levure convenable co-transformée avec trois vecteurs qui codent respectivement pour (i) un appât correspondant à un fragment contenant l'extrémité C-terminale du récepteur AT2 fusionné à une protéine sélectionnée dans le groupe constitué par le domaine de liaison à l'ADN d'un facteur de transcription et le domaine d' activation dudit facteur de transcription, (ii) un fragment contenant au moins la SEQ ID NO:5 de la protéine ATIP selon l'invention, fusionné à une protéine sélectionnée dans le groupe constitué par le domaine de liaison à l'ADN d'un facteur de transcription et le domaine d'activation dudit facteur de transcription et (iii) un poly- peptide correspondant à une séquence contenue dans une banque d'ADNc, lesquels vecteurs comportent en outre des marqueurs de sélection,
- soit par une souche de levure convenable co-transformée avec deux vecteurs qui codent respectivement pour (i) un fragment contenant au moins la SEQ ID NO:5 de la protéine ATIP selon l'invention, fusionné à une protéine sélectionnée dans le groupe constitué par le domaine de liaison à l'ADN d'un facteur de transcription et le domaine d'activation dudit facteur de transcription et (ii) un polypeptide correspondant à une séquence contenue dans une banque d'ADNc, fusionné à une protéine sélectionnée dans le groupe constitué par le domaine de liaison à l'ADN d'un facteur de transcrip- tion et le domaine d'activation dudit facteur de transcription, lesquels vecteurs comportent en outre des marqueurs de sélection,
- soit par une souche de levure convenable co-transformée avec deux vecteurs, à savoir (i) un vecteur codant pour un fragment contenant au moins la SEQ ID NO:5 de la protéine ATIP mutée ou non, fusionné à une protéine sélectionnée dans le groupe constitué par le domaine de liaison à l'ADN d'un facteur de transcription et le domaine d'activation dudit facteur de transcription et (ii) un vecteur codant pour un fragment contenant l'extrémité C-terminale du récepteur AT2 muté ou non, fusionné à une protéine sélectionnée dans le groupe constitué par le domaine de liaison à l'ADN d'un facteur de transcription et le domaine d'activation dudit facteur de transcription, lesquels vecteurs comportent en outre des marqueurs de sélection, l'un des deux vecteurs codant obligatoirement pour une protéine mutée.
La présente invention a également pour objet une méthode de sélection de protéines inhibitrices de l'interaction protéine ATIP selon l' invention-récepteur AT2, laquelle méthode comprend :
(a) la co-transformation d'une souche de levure convenable avec trois vecteurs qui codent respectivement pour (i) un appât correspondant à un fragment contenant l'extrémité C-terminale du récepteur AT2 fusionné à une protéine sélectionnée dans le groupe constitué par le domaine de liaison à l'ADN d'un facteur de transcription et le domaine d'activation dudit facteur de transcription, (ii) un fragment contenant au moins la SEQ ID NO:5 de la protéine ATIP selon l'invention, fusionné à une protéine sélectionnée dans le groupe constitué par le domaine de liaison à l'ADN d'un facteur de transcrip- tion et le domaine d'activation dudit facteur de transcription et (iii) un poly- peptide correspondant à une séquence contenue dans une banque d'ADNc, lesquels vecteurs comportent en outre des marqueurs de sélection,
(b) la sélection des clones de la banque d'ADNc exprimant un polypeptide inhibant l'interaction récepteur AT2-protéine ATIP selon l'invention, sur un milieu sélectif approprié et
(c) l'identification dudit polypeptide.
Une telle méthode met notamment en œuvre la technique dite du triple-hybride ou du double-hybride inverse, telles que décrites dans Vidal et al. (Proc. Natl. Acad. Sri. USA, 1996, 93, 10315-10320 et 10321-10326) ou Tirode et al. (]. Biol. Chem., 1997, 272, 37, 22995-22999).
La présente invention a également pour objet une méthode de criblage de polypeptides interagissant avec la protéine ATIP selon l'invention, laquelle méthode comprend :
(a) la co-transformation d'une souche de levure convenable avec deux vecteurs tels que définis ci-dessus, à savoir qui codent respectivement pour (i) un fragment contenant au moins la SEQ ID NO:5 de la protéine ATIP selon l'invention, fusionné à une protéine sélectionnée dans le groupe constitué par le domaine de liaison à l'ADN d'un facteur de transcription et le domaine d'activation dudit facteur de transcription et (ii) un polypeptide correspondant à une séquence contenue dans une banque d'ADNc, fusionné à une protéine sélectionnée dans le groupe constitué par le domaine de liaison à l'ADN d'un facteur de transcription et le domaine d'activation dudit facteur de transcription, lesquels vecteurs comportent en outre des marqueurs de sélection, et (b) la sélection des clones exprimant un polypeptide interagissant avec la protéine ATIP, sur un milieu sélectif convenable.
Une telle méthode permet notamment de rechercher d'autres protéines interagissant avec la protéine ATIP, en particulier pour trouver les maillons suivants de la voie activée par le récepteur AT2, en vue de les utiliser pour modifier l'interaction protéine selon l'invention-récepteur AT2. La présente invention a également pour objet une méthode de caractérisation des domaines impliqués dans l'interaction protéine ATIP- récepteur AT2, caractérisée en ce qu'elle comprend :
(a) la co-transformation d'une souche de levure convenable avec deux vecteurs, tels que définis ci-dessus, à savoir (i) un vecteur codant pour un fragment contenant au moins la SEQ ID NO:5 de la protéine ATIP mutée ou non, fusionné à une protéine sélectionnée dans le groupe constitué par le domaine de liaison à l'ADN d'un facteur de transcription et le domaine d'activation dudit facteur de transcription et (ii) un vecteur codant pour un fragment contenant l'extrémité C-terminale du récepteur AT2 muté ou non, fusionné à une protéine sélectionnée dans le groupe constitué par le domaine de liaison à l'ADN d'un facteur de transcription et le domaine d'activation dudit facteur de transcription, lesquels vecteurs comportent en outre des marqueurs de sélection, l'un des deux vecteurs codant obligatoirement pour une protéine mutée et
(b) la visualisation, par sélection sur un milieu sélectif convenable, de la perte éventuelle de l'interaction ATIP-récepteur AT2.
Une telle méthode permet d'identifier et de délimiter les domaines importants de la protéine ATIP ou de l'extrémité C-terminale du récepteur AT2, dont dépend leur interaction, afin de les utiliser comme cible privilégiée pour modifier la signalisation du récepteur AT2.
La présente invention a également pour objet une méthode de sélection de substances aptes à influencer l'interaction protéine ATIP selon l' invention-récepteur AT2, laquelle méthode comprend : (a) la mise en contact de la protéine ATIP fixée sur un support avec une protéine de fusion récepteur AT2-protéine étiquette, éventuellement en présence d'une substance à tester,
(b) au moins un lavage dudit support ainsi traité avec un tampon convenable et (c) la visualisation de l'éventuelle interaction ATIP-récepteur AT2, en particulier en SDS-PAGE, suivie d'une immuno-empreinte avec des anticorps dirigés soit contre la protéine étiquette, fusionnée au récepteur AT2, soit contre le récepteur AT2.
Si la substance à tester inhibe l'interaction ATIP-récepteur AT2, l'étape de visualisation est négative.
Conformément à l'invention l'ATIP est fixée sur ledit support soit de manière covalente, soit par liaison d'affinité entre une substance de fixation fusionnée à l'ATIP et ledit support. Par exemple, ledit support est constitué de billes couplées, soit à une substance présentant une affinité avec ladite protéine de fixation, fusionnée à l'ATIP, soit à des anticorps convenables.
La protéine de fusion récepteur AT2-protéine étiquette est notamment obtenue à partir d'un lysat de cellules transfectées avec un vecteur exprimant la protéine de fusion AT2-protéine étiquette. En variante, ladite méthode de sélection de substances aptes à interagir avec la protéine ATIP selon l'invention, comprend :
(a) la mise en contact de la protéine ATIP fixée sur un support, avec un lysat cellulaire,
(b) au moins un lavage dudit support ainsi traité avec un tampon convenable,
(c) la visualisation de l'éventuelle protéine associée à la protéine ATIP, en particulier en SDS-PAGE, suivie d'une immuno-empreinte avec des anticorps appropriés et
(d) l'identification de la protéine du lysat cellulaire interagis- sant avec la protéine ATIP.
Conformément à ladite méthode de sélection de substances aptes à influencer l'interaction protéine ATIP selon l'invention-récepteur AT2, il est possible d'utiliser notamment comme protéines de fusion ATIP-protéine étiquette, les protéines GST-ATIPc et MYC-ATIPc, qui constituent des outils pouvant permettre d'entraîner in vitro d'éventuelles protéines interagissant avec ATIP, par exemple, à partir de lysats cellulaires activés ou non par des ligands du récepteur AT2. La protéine GST-ATIP peut-être entraînée par interaction spécifique du GST avec des billes d'agarose couplées à de la gluta- thione, ou encore immunoprécipitée avec l'anticorps anti-ATIP. La protéine Myc-ATIP peut-être immunoprécipitée avec les anticorps anti-MYC commerciaux ou avec l'anticorps anti-ATIP.
L'intérêt de ces méthodes consiste à trouver des moyens de modifier la signalisation, le niveau d'expression ou la pharmacologie du récepteur AT2, ceci pouvant avoir des applications thérapeutiques. En effet lorsqu'une pathologie aura été corrélée de façon claire à une anomalie de la transduction associée au récepteur AT2, une modification de cette transduc- tion, en particulier en jouant sur la liaison du récepteur AT2 à la protéine selon l'invention, pourra alors éventuellement compenser le désordre pathologique ou au moins l'influencer. La présente invention a également pour objet l'utilisation des cellules co-transformées précitées, pour la sélection et le criblage de substances ou de protéines aptes à influencer l'interaction protéine ATIP- récepteur AT2 ou aptes à interagir avec la protéine ATIP.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en œuvre du procédé objet de la présente invention ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels :
- la figure 1 correspond à l'extrémité C-terminale du récepteur AT2 de souris, utilisée comme appât en double hybride pour cribler une banque d'ADNc de souris ;
- la figure 2 illustre la position du domaine de liaison GAL4 et le site de clonage multiple du plasmide pGBT9 (Clontech) ;
- la figure 3 illustre les structures présumées coiled-coil (surenroulées) (domaines coiled-coil soulignés) de l'ATIP de souris ; - la figure 4 illustre les structures présumées coiled-coil (surenroulées) (domaines coiled-coil soulignés) de l'ATIP humaine ;
- la figure 5 illustre la structure du plasmide pNP16 ;
- la figure 6 illustre le site de clonage multiple du plasmide pRSET A ; - la figure 7 illustre la séquence MYC utilisée, pour construire le plasmide pcDΝA3-MYC ;
- la figure 8 illustre la structure du plasmide pBAC-PAK-poly HIS,
- la figure 9 illustre un Northern blot de plusieurs tissus humains hybrides avec la sonde ATIPsouris-court (SEQ ID NO:5) ;
- la figure 10, illustre l'interaction in vitro de la protéine ATIPsouris-court avec l' extrémité C-terminale du récepteur AT2 ; et
- la figure 11 illustre les modifications du signal induit par le récepteur AT2 par surexpression de la protéine ATIP. II doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
EXEMPLE 1 : Mise en évidence d'une interaction protéine-protéine spécifique entre le récepteur AT2 et la protéine de séquence SEQ ID NO:6 selon l'invention.
Matériel et méthodes
- Le système double-hybride, initialement développé par Song et Fields en 1989 (Nature, 340, 245-246) repose sur le fait que l'activité de nombreux facteurs activateurs de transcription eucaryotes ne nécessite que deux domaines : un domaine activateur qui n'a pas la capacité de lier l'ADN et un domaine de liaison à l'ADN.
Dans le système double-hybride, le domaine de liaison de l'ADN est fusionné à une protéine X et le domaine d'activation est fusionné à une protéine Y. Si, et seulement si, X et Y interagissent, un complexe est formé qui reconstitue un facteur de transcription fonctionnel. - Construction des vecteurs d'expression : . vecteurs « appâts »:
Protéine X : extrémité C-terminale de la séquence codant pour le récepteur AT2 de souris (52 aminoacides de CNNPF au codon stop, voir figure 1), fusionnée à la séquence codant pour le domaine de liaison à l'ADN de Gal4 (figure 2).
Insert : extrémité du récepteur AT2 de souris (159 pb + 16 pb de sites générés par PCR) inséré au niveau des sites EcoRI et BamHI des vecteurs pLEX9 (Clontech) ou pGBT9 (pBTM116 ou pGAD424 modifié; A.B. Vojtek et al., Cell, 1993, 74, 205-214).
On obtient ainsi la séquence suivante : CGGAATTC coté 5'-AT2 séquence C-terminale de 52 acides aminés- GGATCCCG coté 3'
. Banque criblée : Banque d'ADNc de fœtus de souris (A.B. Vojtek et al, Cell,
1993, 74, 205-214), contenant des inserts de 350 à 700 pb (protéine Y) dans le vecteur VP16 (figure 5).
. Vecteurs contrôles « appâts »
Protéine X : extrémité C-terminale des récepteurs β2- adrénergique humain, ATI de rat ou bradykinine humain.
. Souche de levure transformée HF7c (Clontech) pour l'appât construit dans pGBT9 ; L40 pour l'appât construit dans pLex9. Résultats Cette stratégie a permis d'isoler un clone issu de la banque d'ADNc contenant un insert de 354 pb (ATIP) qui interagit de façon spécifique avec l'extrémité C-terminale de l'AT2. Il est intéressant de noter que le criblage de cette banque avec les constructions réalisées dans les deux vecteurs d'expression pGBT9 et pLEX9 a permis de retrouver dans les deux cas ce même clone. Ce clone n'interagit pas avec des protéines contrôles, d'interactions non spécifiques.
Pour juger de la sélectivité de cette interaction, le clone ATIP a été testé en double-hybride avec les extrémités C-terminales des récepteurs : β2 adrénergique humain, ATI de rat et bradykinine humain, et toutes ont donné des résultats négatifs. Ceci indique que le polypeptide codé par le clone ATIP interagit, de façon sélective, avec l'extrémité C-terminale du récepteur AT2 de souris. EXEMPLE 2 : Caractérisation du clone ATIP.
Pour rechercher le clone entier correspondant, une sonde de 354 pb (SEQ ID NO:5), qui correspond à l'insert obtenu par digestion avec l'enzyme de restriction Notl du plasmide isolé en double hybride (celui extrait de la banque VP16, sélectionné comme positif dans le crible utilisant comme appât, l'extrémité C-terminale du récepteur AT2 de souris), est utilisée pour cribler une banque d'ADNc de fœtus de souris construite avec des inserts de taille supérieure à 1 kb. Deux clones chevauchants, comprenant la séquence ATIP, ont ainsi été identifiés et ont permis de séquencer 1803 pb de l'ADNc correspondant (SEQ ID NO:l). Cette séquence contient une phase ouverte de lecture de 1323 pb (SEQ ID NO:3) codant potentiellement pour une protéine de 440 acides aminés (SEQ ID NO:2 et 4). Les comparaisons entre la séquence protéique identifiée et les séquences contenues dans les banques de données indiquent que celle-ci ne présente jamais plus de 25 % d'homologie avec une partie d'une séquence connue.
La sonde de 354 pb (SEQ ID NO:5) a été utilisée comme sonde en Southern et Northern de façon très satisfaisante dans les conditions d'hybridation ci-après : préhybridation et hybridation en 45 % formamide, 9 % Dextran-sulfate, 0,2 % BSA, 0,2 % polyvinyl pyrrolidone, 0,2 % Ficoll, 0,1 % sodium pyrophosphate, 0,01 % SDS, 0,05 mM Tris pH 7,5, 0,9 M NaCl et rinçages jusqu'à stringence : SSCX1, 0,1% SDS .
En parallèle, des expériences d'hybridation de Northern blot effectuées sur des ARN totaux de cellules N1E-115 avec la sonde ATIP (SEQ ID NO:5) confirment l'expression de l'ARNm correspondant dans les cellules N1E-115, et indique l'existence d'au moins 5 transcrits de tailles différentes. Ces transcrits correspondent à des épissages alternatifs d'un même gène ou à des gènes différents homologues. Sur un Northern, effectué dans les conditions décrites dans la littérature sur un échantillon de 5 μg d'ARN poly A+ de cellules N1E-115, les tailles des différents transcrits hybridant avec la sonde ATIPsouris sont = 2,5- 3,5-5-5,3 et 7,5 kb.
La figure 9 représente un Northern blot contenant des ARN poly A+ de différents tissus humains, hybrides avec la même sonde ATIPsouris. On peut constater que l'ATIP est exprimé de façon ubiquitaire. On trouve dans tous les tissus représentés un transcrit majoritaire à 4,4 kb, auquel s'ajoute, selon les tissus, d'autres transcrits plus longs (pancréas et cœur) ou plus courts (pancréas, muscle squelettique, placenta, cerveau et cœur). Ceux-ci sont peut-être le fruit d'un épissage alternatif de l'ARN de ATIP qui serait dépendant du tissu considéré ou encore ils sont le signe de l'existence d'une famille d'ARN codant pour des protéines de "la famille ATIP", homologues de ATIP et qui sont révélés par la sonde, à la stringence utilisée. Afin de connaître la taille du plus petit transcrit codant pour l'ATIP, une amplification rapide des extrémités d'ADNc (RACE 5', Marathon cDNA Amplification Kit de Clontech) à partir d'ARN poly A+ de cellules N1E- 115 a été réalisé, en utilisant l'oligonucléotide antisens de SEQ ID NO:10, pour amplifier les parties 5' des différents ARNm correspondant à l'ATIP endogène des cellules N1E-115 (neuroblastome murin).
Les résultats obtenus ont indiqué que le plus petit transcrit incluant le domaine ATIP est un ARNm de 1950 pb, qui contient bien le début de la séquence codante obtenue par clonage.
Tout autre couple d' ohgonucleotides (amorces) de plus de 20 pb et comprenant une partie de la séquence ATIP, peut également être utilisé pour amplifier par PCR (conditions de PCR à déterminer pour chaque couple d'oligonucléotides à l'aide du logiciel OLIGO 4) une partie de l'ATIP (et donner un fragment d'ADN qui pourrait éventuellement être utilisé comme sonde pour reconnaître l'ADN ou l'ARN correspondant à l'ATIP). EXEMPLE 3 : Construction de différents vecteurs selon l'invention
D'une façon générale les vecteurs contenant ATIPsouris-court (à l'exception de pRSETA-ATIPsouris-court) ont été obtenus à partir d'un insert produit par PCR avec les deux oligonucléotides suivants (SEQ ID NO:ll et SEQ ID NO:12): oligo. sens: 5' CGCGGATCCCAGACAGACCGGACGGAACTGGAG 3' oligo. antisens: 5' CCGGAATTCACTACAACCTTTCGTTTAAAGCATC 3', en utilisant comme matrice le vecteur VP16-ATIPsouris-court (figure 5). Par commodité, ce vecteur est dénommé ^ATIPcst°pΕ. En effet, digéré par BamHI et EcoRI, il donne un insert correspondant à la séquence
1er brin: GATCC-SEQ ID NO: 5 (moins CAT)-TAGTG
2ème brin: CCTAG CTTAAG
(STOP)
Site BamHI Site EcoRI
D'autres vecteurs peuvent également être construits ; ils comprennent tout ou partie de la protéine ATIP et sont les suivants :
-VP16- ATIPsouris-court (vecteur sorti de la banque criblée en double hybride, comprend 354 pb (SEQ ID NO:5), insérées en Notl dans VP16).
-pCDNA3-MYC-ATIPsouris-court (insert BATIPcstoP'E. inséré en BamHI-EcoRI dans pCDNA3-MYC (pcDNA3 d'Invitrogen, modifié par insertion de la séquence MYC, figure 7) ; ce plasmide peut être utilisé en transfections stables ou transitoires. Il permet d'exprimer MYC-ATIPsouris- court en cellules eucaryotes. L'expression de cette protéine dans des cellules eucaryotes après transfection du plasmide correspondant a déjà été obtenue et vérifiée par immunoréaction avec un anticorps anti-MYC et anti-ATIP. -pRSETA-HIS-ATIPsouris-court (insert BATIPcstoP'E. inséré en BamHI-EcoRI dans pRSETA, Invitrogen). Ce plasmide permet d'exprimer la protéine de fusion HIS-ATIPsouris-court en cellules bactériennes et de la purifier sur colonne de Nickel (Voir figure 6 pour le site multiple de clonage). -pBacPAK-polyHIS-ATIPsouris-court (insert BATIPcstoP/E. inséré en BamHI-EcoRI dans le vecteur pBacPAK-polyHIS (pBacPAK commercial, modifié par insertion d'une séquence contenant un tag histidine et un site de clivage à la thrombine, figure 8). Cette construction peut être utilisée pour exprimer la protéine ATIP souris-court, fusionnée à un tag histi- dine, dans des cellules d'insectes (type SF9). En effet, comme il est indiqué, ce vecteur contient une insertion poly-histidine et peut donc coder pour la protéine de fusion. Celle-ci, de même que la protéine de fusion clonée dans pRSET, peut-être purifiée sur colonne de Nickel et servir au même type de techniques. -pGEX-4Tl-GST- ATIPsouris-court (insert amplifié par PCR identique à BATIPcstoP'E. mais sans codon STOP, ce qui prolonge la séquence de ATIPsouris-court des quelques acides aminés suivants: Phe-Glu-Phe-Pro- Gly-Arg-Leu-Glu-Arg-Pro-His-Arg-Asp provenant du plasmide ρGEX-4T-l (Pharmacia). Ce plasmide permet d'exprimer la protéine GST-ATIPsouris- court en cellules bactériennes et de la purifier sur billes glutathion-agarose.
-pCDNAI-ATIPsouris clonel (totalité du 5' séquence de ATIP et ORF jusqu'à pb: 1205 en partant du début du clone, inséré en Bstxl dans pCDNAI). Ce plasmide est issu du clonage de la banque de fœtus de souris avec la sonde SEQ ID NO:5. Ce plasmide peut servir à produire en bactéries, la portion 5' de l'ADN ATIPsouris, pour l'utiliser comme sonde.
-pCDNAI-ATIPsouris clone 2 (2ème moitié de l'ORF de ATIP à partir de pb: 616 et jusqu'à la fin du 3' séquence (pb 1803), inséré en Bstxl dans pcDNAI, Invitrogen). Ce plasmide peut servir à produire en bactéries, la portion 3' de l'ADN ATIPsouris, pour l'utiliser comme sonde. -pcDNAI-ATIPsouris-long (clones 1 et 2 mis bout à bout, en utilisant le site intermédiaire Sapl. Ce plasmide contient la totalité du clone ATIP souris, inséré en Bstxl dans pCDNAI). Ce plasmide peut être utilisé en transfections transitoires en cellules eucaryotes.
-ρcDNA3-ATIPsouris-long (ATIPsouris entier sorti BamHI- Xbal de pCDNAI-ATIPsouris-long, et inséré dans pcDNA3, Invitrogen, à ces mêmes sites). Ce plasmide peut être utilisé en transfections stables ou transitoires en cellules eucaryotes. Il a permis de traduire in vitro (kit TNT T7 coupled reticulocytes lysate Systems, Promega) la protéine ATIP entière et de constater que son produit de traduction a un poids moléculaire apparent sur gel de 58 kDa. A ce produit majoritaire s'ajoute deux produits minoritaires de 30 et 15 kDa. D'après la séquence de ATIP, ceux-ci pourraient correspondre à des produits partiels de traduction in vitro commençant à d'autres ATG que celui en position 178 de la SEQ ID NO:l.
EXEMPLE 4 : Obtention de clones stables exprimant la protéine ATIPsouris- court ou long.
On a obtenu par transfection des clones stables exprimant à la fois le récepteur AT2 humain et l'ATIP souris court (SEQ ID NO:6) ou l'ATIP souris long (SEQ ID NO:3).
Les cellules CHO, déficientes en dihydrofolate réductase, sont transfectées avec un plasmide contenant la région codant pour le récepteur AT2 humain (Bedecs et al., Biochem. J. 1997, 325, 449-454).
Le clone sélectionné, CHO-hAT2, exprimant 100 fmol de récepteur AT2/mg de protéine, est cultivé sur milieu HAMF12 complémenté avec du sérum de veau fœtal à 10 % et utilisé entre les passages 10 et 30. Ce clone a lui même été transfecté avec les plasmides pCDNA3-MYC-ATIPsouris-court ou pCDNA3-ATIPsouris-long décrits à l'exemple 3. La sélection des clones exprimant, de manière stable, la protéine ATIP (forme courte ou forme longue) s'est faite en milieu sélectif contenant 800 μg/ml de G418. Les lysats cellulaires, correspondant aux différents clones sélectionnés, ont été soumis à un SDS-PAGE suivi d'une immuno-empreinte et celui-ci a été incubé avec l'anticorps polyclonal anti-ATIP. Les résultats obtenus indiquent que différents clones exprimant des taux différents d'ATIP souris court, ont pu être obtenus.
EXEMPLE 5 : Production d'anticorps polyclonaux dirigés contre la séquence SEQ ID NO:6.
Afin de progresser dans la caractérisation de ce clone, la production d'anticorps polyclonaux dirigés contre le domaine ATIP a été entreprise.
Pour cela, un vecteur codant pour une protéine correspondant à ce domaine fusionné à six résidus histidine a été construit.
La séquence suivante :
GGA TCC-SEQ NO:5-TAG-TGA-ATT est insérée dans le plasmide pRSETA, tel que défini ci-dessus.
Dans cet insert, la SEQ ID NO:5 ne comprend pas le premier CAT.
Le plasmide obtenu est exprimé dans la souche d'E. coli BL 21 (DE3) (F" ompT" r_" mβ") contenant le bactériophage DE3 qui porte un fragment d'ADN contenant le gène lad, le promoteur lacUVS, le début du gène lacZ et le gène codant pour la T7 ARN polymérase. Ce fragment est introduit dans le gène int.
En présence de DE3, seul le promoteur lacUV5, inductible par IPTG dirige la transcription de la T7 ARN polymérase.
L'addition de 0,4 mM d'IPTG à une culture de cellules BL21 (DE3) induit la production de T7 ARN polymérase qui, à son tour, entraîne la transcription de l'ADN cible du plasmide pRSETA (permettant la traduction de la protéine se liant au récepteur AT2).
La protéine obtenue (17 kDa) est purifiée sur colonne de
Nickel (Ni-NTA, QuiAexpressionist 07/97, Quiagen), grâce à l'affinité de ses six résidus histidine pour le nickel. La protéine obtenue est ensuite injectée à des lapins pour obtenir des anticorps polyclonaux dirigés contre la protéine ATIP. Les saignées obtenues présentent un très bon titre.
Ces anticorps purifiés sur colonne de GST-ATIP, après passage sur colonne de GST seul (afin d'éliminer les éventuels anticorps spécifiques de GST et de ne retenir sur la colonne de GST-ATIP que les anticorps spécifiques de ATIPsouris-court) peuvent être utilisés avec succès pour immuno-précipiter et révéler en immuno-empreinte MYC- ATIPsouris-court à partir de cellules COS transfectées de façon transitoire. De plus cet anticorps purifié révèle également en immuno-empreinte la protéine ATIPsouris-long contenue dans des lysats de cellules COS transitoirement transfectées avec le plasmide pCDN A3- ATIPsouris-long.
La protéine ATIPsouris-long transfectée est visualisée après SDS-PAGE et immuno-empreinte avec un anticorps anti-ATIP, sous la forme de deux polypeptides de poids moléculaires apparents de 50 et 45 kDa.
Cet anticorps purifié a été utilisé en immuno-fluorescence sur des cellules CHO-hAT2, fixées par un traitement de 15 minutes en para- formaldéhyde (3 %). Après fixation, les cellules sont traitées successivement par des solutions de PBS/ glycine 50 mM pendant 20 minutes, PBS/ Triton X100 0,1 % pendant 5 minutes et PBS/ BSA 0,2 % pendant 15 minutes. Elles sont ensuite incubées successivement dans des solutions à 15 μg/ml d'anticorps contenant l'anticorps anti-ATIP purifié, puis l'anticorps anti- immunoglobuline de lapin couplé à de la rhodamine pendant 30 minutes. Entre chaque nouvelle incubation, trois rinçages en PBS sont effectués. Les observations au microscope à fluorescence indiquent une expression de la protéine ATIP endogène au niveau du noyau (de façon majoritaire) et du cytoplasme des cellules CHO-hAT2.
Certaines cellules montrent une répartition homogène de la fluorescence due à l'anticorps anti-ATIP dans ces compartiments, alors que d'autres cellules qui paraissent plus étalées, montrent une répartition hétérogène de la fluorescence le long de filaments qui semblent partir du noyau et s'étendre jusqu'à la membrane plasmique de la cellule, en un réseau organisé. Des expériences complémentaires de co-localisation doivent être effectuées pour déterminer si ces filaments coïncident ou non avec des structures connues du cytosquelette.
EXEMPLE 6 : Confirmation de l'interaction in vitro de la protéine ATIPsouris-court avec l'extrémité C-terminale du récepteur AT2.
Pour démontrer l'interaction de la protéine ATIPsouris-court avec l'extrémité C-terminale du récepteur AT2 dans un autre système que celui du double hybride, un protocole permettant de mettre en évidence cette interaction in vitro a été mis en place. Pour cela, la protéine de fusion GST- ATIP telle que décrite ci-dessus a été produite ; elle est associée par sa partie GST à de la glutathione couplée à des billes d'agarose (GA). En parallèle, des bactéries (DH5α) sont transfectées avec un plasmide (pMAL-c2-AT2, issu de pMAL-c2 de New England Biolabs) codant pour une protéine de fusion entre l'extrémité C-terminale du récepteur AT2 humain (Asn314-Ser363) et la MBP (Maltose Binding Protein). Ces bactéries ont été cultivées et la protéine de fusion a été induite en IPTG 0,3 mM selon le protocole "pMAL Protein Fusion and Purification System" de New England Biolabs. Après centrifugation de la culture à 4 000 g et solubilisation du culot obtenu en "column buffer" (20 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA), une nouvelle centrifugation à 9 000 g a permis de récupérer un surnageant contenant une forte concentration de MBP-AT2. Ce surnageant a été mis en contact, pendant 3 heures à 4°C, avec les billes de glutathione agarose couplées à la protéine GST seule après addition de NaCl de façon à se placer à 300 mM final NaCl. Cette étape de préincubation permet d'éliminer les interactions non spécifiques qui peuvent exis- ter entre ATIP et GA-GST. Le surnageant récupéré a été mis en contact avec les billes GA-GST-ATIPsouris-court ou GA-GSTseul pendant une nuit à 4°C. Après contact les billes ont été rincées 3 fois en tampon 20 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 1 mM EDTA et une fois en "column buffer". Après analyse des billes rincées en SDS-PAGE et immuno-empreinte avec un anticorps anti-MBP (New England Biolabs), on observe une rétention spécifique de la protéine MBP-AT2 sur billes GA-GST-ATIPsouris-court qui n'est pas observée sur les billes GA-GSTseul (Figure 10).
Ce même protocole a été réalisé avec un plasmide exprimant MBP-ATl (extrémité C-terminale du récepteur ATI humain (Leu297-Glu359)) et indique que la protéine MBP-ATl n'est pas retenue de façon spécifique sur les billes GA-GST-ATIPsouris-court (Figure 10).
Ces résultats confirment ceux obtenus en double hybride indiquant une interaction spécifique et sélective entre la protéine selon l'invention et l'extrémité C-terminale du récepteur AT2 ( et pas ATI). EXEMPLE 7 : Modification de la transduction du signal du récepteur AT2 dans des clones surexprimant la protéine ATIPsouris-long.
Afin de vérifier que la protéine ATIP interagit in vivo avec le récepteur AT2, on a évalué si une une surexpression de cette protéine modifie un signal induit par le récepteur AT2. Pour cela un clone stable de cellules CHO-hAT2 exprimant la protéine ATIPsouris-long (CHO-hAT2-ATIP), obtenu selon la méthodologie décrite dans l'exemple 4 a été utilisé ; le test fonctionnel de l'activité du récepteur AT2 mis au point sur le clone CHO-hAT2 qui consiste à inhiber la phosphorylation de la sous-unité IRβ du récepteur de l'insuline induite par son ligand, a été reproduit.
Mise en évidence d'une inhibition par le récepteur AT2 de la phosphrylation d'IRβ induite par l'insuline dans les cellules CHO-hAT2 :
Les cellules CHO-hAT2 sont ensemencées à une densité de 3.106 cellules par boîte de 15 cm2 de diamètre. Elles sont rendues quiescentes par un sevrage de 16 heures avant d'être traitées. Le traitement consiste en une mise en contact de 5 minutes avec 15 ml de milieu F12 contenant de l'insuline additionné ou non de CGP42112 (agoniste sélectif du récepteur AT2). Après traitement, les cellules sont solubilisées en tampon de lyse contenant : 50 mM Hepes, pH 7.6, 1 % Triton X-100, 20 mM EDTA, 30 mM pyro- phosphate de sodium, 30 mM fluorure de sodium, 2 mM benzamidine, 1 mM sodium orthovanadate, 1 mM fluorure de phénylméthylsuphonyle et 1 μg/ml d'aprotinine, pepstatine, antipaïne and leupeptine. Les lysats sont ensuite soumis à une purification sur colonne de lectine de germe de blé selon le protocole décrit dans Issad, T., et al. (Eur. ]. Biochem. 1995, 234, 108-115). Après mise en contact et lavages, les billes de lectine couplée à de la sépharose (Pharmacia) sont reprises dans du tampon d'échantillon contenant du SDS et les protéines éluées sont analysées en SDS-PAGE suivie d'immuno-empreintes avec des anticorps anti-phosphotyrosine (Upstate Biotechnology, Inc.) ou anti- IRβ (décrit dans Issad, T., et al, précité). La sous-unité β du récepteur de l'insuline apparaît comme un polypeptide de 97 kDa dont la phosphorylation (visualisée par révélation avec un anticorps anti-phosphotyrosine) augmente de façon dose-dépendante avec la concentration en insuline. L'angiotensine II (100 nM) ainsi que le CGP42112 (100 nM) inhibent cette phosphorylation à toutes les doses d'insuline testées entre 0,1 et 0,001 μg/ml (Figure 11). A titre d'exemple, le CGP42112 inhibe la phosphorylation de IRβ induite par 0,01 μg/ml d'un facteur 64 + 4 % (n=7). Ce résultat démontre que le récepteur AT2 interfère négativement sur les voies de signalisation du récepteur de l'insuline à l'étape initiale de son activation, qui est son autophosphorylation. Ces résultats fournissent également la première mise en évidence d'une interconnection entre les voies de signalisation des récepteurs tyrosines kinases et le récepteur à sept domaines trans- membranaires qu'est 1ΑT2.
Reproduction de cette méthodologie sur les cellules CHO-hAT2-ATIP : Lorsque ce protocole est réalisé sur des cellules
CHO-hAT2-ATIP, l'inhibition par le CGP42112 (100 nM) de la phosphorylation du récepteur de l'insuline obtenue pour différentes doses d'insuline (0,05, 0,01, 0,005, 0,001 μg/ml) n'est pas observée (Figure 11). Ce résultat a été reproduit 3 fois pour chacune des doses d'insuline en prenant comme contrôle positif, dans chaque expérience, l'inhibition obtenue pour le clone CHO-hAT2. Ceci démontre donc que la surexpression de la protéine ATIP dans les cellules CHO-hAT2 interfère avec la signalisation du récepteur AT2, ce qui confirme l'interaction in vivo de la protéine ATIP avec le récepteur AT2. Une autre protéine glycosylée, retenue sur colonne de lectine, ayant un poids apparent de 120 kDa, identifiée comme étant la protéine nouvellement clonée SIRP (Kharitonenkov, A. et al, Nature, 1997, 386, 181- 186) est phosphorylée sur tyrosine en réponse à l'insuline. La phosphorylation de cette protéine, de même que celle de IRβ est inhibée en présence de CGP42112 dans le cas du clone CHO-hAT2 et ne l'est pas dans le cas du clone CHO-hAT2-ATIP. Ceci confirme que la protéine ATIP interfère sur les voies de signalisation du récepteur AT2. Ces résultats montrent bien l'intérêt que peut présenter l'utilisation de la protéine ATIP pour modifier la signalisation médiée par le récepteur AT2 et compenser éventuellement des pathologies associées à des anomalies de la régulation de ce récepteur. Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en évidence, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention.

Claims

REVENDICATIONS
1°) Fragment d'acides nucléiques isolé, codant pour une protéine apte à se lier au récepteur AT2, lequel fragment est sélectionné dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO:l, 3, 5, 7 et 9. 2°) Fragment d'une des séquences selon la revendication 1, comprenant entre 20 et 400 pb, utile comme sondes ou comme amorces, pour la détection des séquences SEQ ID NO:l, 3, 5, 7 ou 9, ou de séquences homologues.
3°) Fragment selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comprend de 20 pb à 400 pb incluses dans les séquences SEQ ID NO:l, 3, 5, 7 ou 9.
4°) Fragment selon la revendication 2 ou la revendication 3, caractérisé en ce qu'il est sélectionné dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:llet SEQ ID NO:12. 5°) Transcrits, caractérisés en ce qu'ils sont complémentaires des séquences selon la revendication 1.
6°) Protéine purifiée et isolée, apte à interagir avec le récepteur AT2, sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO:2, 4, 6 ou 8, laquelle protéine est dénommée ATIP. 7°) Produit de traduction, caractérisé en ce qu'il est codé par une séquence nucléotidique selon la revendication 1.
8°) Anticorps, caractérisés en ce qu'ils sont dirigés contre une protéine ou un fragment de protéine selon la revendication 6 ou la revendication 7. 9°) Vecteur recombinant de clonage et/ ou d'expression, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique selon la revendication 1.
10°) Cellule hôte transformée, caractérisée en ce qu'elle comprend un vecteur selon la revendication 9. 11°) Cellules hôtes transformées, caractérisées en ce qu'elles sont constituées par une souche de levure convenable co-transformée avec au moins deux vecteurs qui codent respectivement (i) pour une protéine dite appât sélectionnée dans le groupe constitué par un fragment contenant au moins la SEQ ID NO:5 de la protéine ATIP selon la revendication 6 ou la revendication 7 et un fragment contenant au moins l'extrémité C-terminale du récepteur AT2, laquelle protéine appât est fusionnée à une protéine sélectionnée dans le groupe constitué par le domaine de liaison à l'ADN d'un facteur de transcription et le domaine d'activation du même facteur de transcription et (ii) pour une protéine dite proie, sélectionnée dans le groupe constitué par un fragment contenant au moins la SEQ ID NO:5 de la protéine ATIP selon la revendication 6 ou la revendication 7, un fragment contenant au moins l'extrémité C-terminale du récepteur AT2 et tout autre polypeptide correspondant à une séquence contenue dans une banque d'ADNc, laquelle protéine proie est fusionnée à une protéine sélectionnée dans le groupe constitué par le domaine de liaison à l'ADN d'un facteur de transcription et le domaine d'activation du même facteur de transcription, lesquels vecteurs comportent en outre des marqueurs de sélection.
12°) Cellule hôte transformée selon la revendication 11, caractérisée en ce qu'elle est constituée par une souche de levure convenable co- transformée avec trois vecteurs qui codent respectivement pour (i) un appât correspondant à un fragment contenant l'extrémité C-terminale du récepteur AT2 fusionné à une protéine sélectionnée dans le groupe constitué par le domaine de liaison à l'ADN d'un facteur de transcription et le domaine d'activation dudit facteur de transcription, (ii) un fragment contenant au moins la SEQ ID NO:5 de la protéine ATIP selon la revendication 6 ou la revendication 7, fusionné à une protéine sélectionnée dans le groupe constitué par le domaine de liaison à l'ADN d'un facteur de transcription et le domaine d'activation dudit facteur de transcription et (iii) un polypeptide correspondant à une séquence contenue dans une banque d'ADNc, lesquels vecteurs comportent en outre des marqueurs de sélection. 13°) Cellule hôte transformée selon la revendication 11, caractérisée en ce qu'elle est constituée par une souche de levure convenable co- transformée avec deux vecteurs qui codent respectivement pour (i) un fragment contenant au moins la séquence SEQ ID NO:5 de la protéine ATIP selon la revendication 6 ou la revendication 7, fusionné à une protéine sélectionnée dans le groupe constitué par le domaine de liaison à l'ADN d'un facteur de transcription et le domaine d'activation dudit facteur de transcription et (ii) un polypeptide correspondant à une séquence contenue dans une banque d'ADNc, fusionné à une protéine sélectionnée dans le groupe constitué par le domaine de liaison à l'ADN d'un facteur de transcription et le domaine d'activation dudit facteur de transcription, lesquels vecteurs comportent en outre des marqueurs de sélection.
14°) Cellule hôte transformée selon la revendication 11, caractérisée en ce qu'elle est constituée par une souche de levure convenable co- transformée avec deux vecteurs, à savoir (i) un vecteur codant pour un fragment contenant au moins la séquence SEQ ID NO:5 de la protéine ATIP selon la revendication 6 mutée ou non, fusionné à une protéine sélectionnée dans le groupe constitué par le domaine de liaison à l'ADN d'un facteur de transcription et le domaine d'activation dudit facteur de transcription et (ii) un vecteur codant pour un fragment contenant l'extrémité C-terminale du récepteur AT2 muté ou non, fusionné à une protéine sélectionnée dans le groupe constitué par le domaine de liaison à l'ADN d'un facteur de transcription et le domaine d'activation dudit facteur de transcription, lesquels vecteurs comportent en outre des marqueurs de sélection,, l'un des deux vecteurs codant obligatoire- ment pour une protéine mutée.
15°) Méthode de sélection de protéines inhibitrices de l'interaction protéine ATIP selon la revendication 6 ou la revendication 7- récepteur AT2, laquelle méthode comprend :
(a) la co-rransformation d'une souche de levure convenable avec trois vecteurs qui codent respectivement pour (i) un appât correspondant à un fragment contenant l'extrémité C-terminale du récepteur AT2 fusionné à une protéine sélectionnée dans le groupe constitué par le domaine de liaison à l'ADN d'un facteur de transcription et le domaine d'activation dudit facteur de transcription, (ii) un fragment contenant au moins la SEQ ID NO:5 de la protéine ATIP selon la revendication 6 ou la revendication 7, fusionné à une protéine sélectionnée dans le groupe constitué par le domaine de liaison à l'ADN d'un facteur de transcription et le domaine d'activation dudit facteur de transcription et (iii) un polypeptide correspondant à une séquence contenue dans une banque d'ADNc, lesquels vecteurs comportent en outre des marqueurs de sélection,
(b) la sélection des clones de la banque d'ADNc exprimant un polypeptide inhibant l'interaction récepteur AT2-protéine ATIP selon la revendication 6 ou la revendication 7, sur un milieu sélectif approprié et
(c) l'identification dudit polypeptide. 16°) Méthode de criblage de polypeptides interagissant avec la protéine ATIP selon la revendication 6 ou la revendication 7, laquelle méthode comprend :
(a) la co-transformation d'une souche de levure convenable avec deux vecteurs tels que définis ci-dessus, à savoir qui codent respective- ment pour (i) un fragment contenant au moins la SEQ ID NO:5 de la protéine ATIP selon la revendication 6 ou la revendication 7, fusionné à une protéine sélectionnée dans le groupe constitué par le domaine de liaison à l'ADN d'un facteur de transcription et le domaine d'activation dudit facteur de transcription, et (ii) un polypeptide correspondant à une séquence contenue dans une banque d'ADNc, fusionné à une protéine sélectionnée dans le groupe constitué par le domaine de liaison à l'ADN d'un facteur de transcription et le domaine d'activation dudit facteur de transcription, lesquels vecteurs comportent en outre des marqueurs de sélection, et
(b) la sélection des clones exprimant un polypeptide interagis- sant avec la protéine ATIP selon la revendication 6 ou la revendication 7, sur un milieu sélectif convenable.
17°) Méthode de caractérisation des domaines impliqués dans l'interaction protéine ATIP-récepteur AT2, caractérisée en ce qu'elle comprend : (a) la co-transformation d'une souche de levure convenable avec deux vecteurs, à savoir (i) un vecteur codant pour un fragment contenant au moins la SEQ ID NO:5 de la protéine ATIP selon la revendication 6 mutée ou non, fusionné à une protéine sélectionnée dans le groupe constitué par le domaine de liaison à l'ADN d'un facteur de transcription et le domaine d'acti- vation dudit facteur de transcription et (ii) un vecteur codant pour un fragment contenant l'extrémité C-terminale du récepteur AT2 muté ou non, fusionné à une protéine sélectionnée dans le groupe constitué par le domaine de liaison à l'ADN d'un facteur de transcription et le domaine d'activation dudit facteur de transcription, lesquels vecteurs comportent en outre des marqueurs de sélection, l'un des deux vecteurs codant obligatoirement pour une protéine mutée et
(b) la visualisation, par sélection sur un milieu sélectif convenable, de la perte éventuelle de l'interaction protéine ATIP selon la revendication 6 ou selon la revendication 7-récepteur AT2. 18°) Méthode de sélection de substances aptes à influencer l'interaction protéine ATIP selon la revendication 6 ou la revendication 7- récepteur AT2, laquelle méthode comprend :
(a) la mise en contact de la protéine ATIP selon la revendication 6 ou la revendication 7, fixée sur un support avec une protéine de fusion récepteur AT2-protéine étiquette, éventuellement en présence d'une substance à tester,
(b) au moins un lavage dudit support ainsi traité avec un tampon convenable et
(c) la visualisation de l'éventuelle interaction protéine ATIP selon la revendication 6 ou la revendication 7-récepteur AT2, en particulier en SDS-PAGE, suivie d'une immuno-empreinte avec des anticorps dirigés contre la protéine étiquette, fusionnée au récepteur AT2.
19°) Méthode de sélection de substances aptes à interagir avec la protéine ATIP selon la revendication 6 ou la revendication 7, caractérisée en ce qu'elle comprend :
(a) la mise en contact de la protéine ATIP selon la revendication 6 ou la revendication 7, fixée sur un support, avec un lysat cellulaire,
(b) au moins un lavage dudit support ainsi traité avec un tampon convenable, (c) la visualisation de l'éventuelle protéine associée à la protéine ATIP, en particulier en SDS-PAGE, suivie d'une immuno-empreinte avec des anticorps appropriés et
(d) l'identification de la protéine du lysat cellulaire interagissant avec la protéine ATIP. 20°) Utilisation des cellules co-transformées selon l'une quelconque des revendications 10 à 13, pour la sélection et le criblage de substances ou de protéines aptes à influencer l'interaction protéine ATIP- récepteur AT2 ou aptes à interagir avec la protéine ATIP.
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