FR2782084A1 - Sequences nucleiques codant pour tout ou partie d'une proteine interagissant avec le recepteur at2 et leurs applications - Google Patents

Abstract

Séquences nucléiques codant pour une protéine apte à interagir avec le récepteur AT2, oligonucléotides compris dans lesdites séquences, leurs applications en tant que sondes et pour l'expression desdites protéines, vecteurs utiles pour ladite expression, hôtes cellulaires contenant lesdits vecteurs, ainsi qu'un modèle d'étude du récepteur AT2.Protéines ainsi que leurs applications.Ledit fragment d'acides nucléiques isolé, codant pour une protéine apte à se lier au récepteur AT2, est sélectionné dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO : 1, 3, 5, 7 et 9.

Description

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La présente invention est relative à des séquences nucléiques codant pour une protéine apte à interagir avec le récepteur AT2, à des oligonucléotides compris dans lesdites séquences, à leurs applications en tant que sondes et pour l'expression desdites protéines, aux vecteurs utiles pour ladite expression, aux hôtes cellulaires contenant lesdits vecteurs, ainsi qu'à un modèle d'étude du récepteur AT2.

La présente invention est également relative aux dites protéines ainsi qu'à leurs applications.

L'octapeptide angiotensine II, principalement connu comme régulateur de la pression artérielle, a également été décrit comme un important modulateur de la croissance cellulaire. De façon intéressante ce peptide semble exercer des effets opposés sur la croissance cellulaire, selon qu'il se lie sur l'un ou l'autre de ses deux sous-types de récepteurs membranaires (AT1 ou AT2).

Le récepteur de sous-type AT2, qui appartient aussi à la famille des récepteurs couplés aux protéines G, est encore mal caractérisé tant du point de vue de ses mécanismes d'activation que de son rôle physiologique (C. Nahmias et al., Trends Pharmacol Sci, 1995,16, 223-225). Plusieurs arguments suggèrent cependant un rôle de ce récepteur dans les phénomènes de prolifération, de différenciation ou d'adhésion cellulaire.

Le récepteur AT2 est fortement exprimé au cours de la vie foetale, disparaît chez l'adulte dans la plupart des tissus, mais se trouve réexprimé dans des conditions pathophysiologiques impliquant la restructuration des tissus.

Des études réalisées in vivo ont mis en évidence le rôle inhibiteur exercé par le sous-type AT2 sur la prolifération des cellules musculaires de l'intima, après lésion vasculaire (P. Janiak et al., Hypertension, 1992,20, 737- 745 ; M. Nakajima et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995,92,10663-10667).

Par ailleurs, la stimulation du récepteur AT2 active la phosphatase SHP-1 (Bedecs K. et al; Biochem. J., 1997,325, 449-454). Le fait que le

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récepteur AT2 active une phosphatase est en accord avec ses effets antiprolifératifs.

Compte tenu de ce qui précède, il a été montré que sur des cellules en culture, le récepteur AT2 : - inhibe la synthèse d'ADN et la prolifération, induites par l'angiotensine II (Ang II) et le bFGF (M. Stoll et al., J. Clin. Invest., 1995, 95,651- 657), - induit l'apoptose (T. Yamada et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93,156-160) et - induit la différenciation neuronale (L. Laflamme et al., J. Biol.

Chem., 1996, 271, 22729-22735).

L'étude des voies de signalisation, associées au récepteur AT2, a été abordée dans les cellules de la lignée N1E-115, dérivées d'un neuroblastome murin, qui n'expriment que le sous-type AT2. Une première étude a permis de mettre en évidence une déphosphorylation rapide et transitoire de certaines protéines sur résidus tyrosine, suite au traitement des cellules N1E- 115 par l'angiotensine II (C. Nahmias et al., Biochem. J., 1995,306, 87-92). Il a également été montré que le récepteur AT2 interfère avec les voies d'activation des récepteurs aux facteurs de croissance et inhibe l'activité des MAP kinases (ERK1 et ERK2) (mitogen-activated protein), qui jouent un rôle clé dans les phénomènes de prolifération et de différenciation cellulaire. L'effet inhibiteur de l'AT2 sur l'activation des MAP kinases est rapide et transitoire, ne fait pas intervenir une protéine régulatrice sensible à la toxine pertussique (de type Gi/Go), mais implique l'activation d'une tyrosine phosphatase sensible à l'orthovanadate.

Compte tenu du rôle du récepteur AT2 sur la prolifération cellulaire, les Inventeurs ont cherché à mettre au point des outils aptes à réguler l'action du récepteur AT2. En effet, l'activation du récepteur AT2 peut avoir des répercussions en cancérologie (inhibition de la prolifération cellulaire).

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De manière générale, le récepteur AT2 présente des effets inverses de ceux de l'AT1 sur l'activation des MAP kinases et sur la prolifération cellulaire ; l'étude de la communication qui peut exister entre ces deux sous-types de récepteurs, liant le même ligand, présente par conséquent de l' intérêt.

L'étude des voies de signalisation et de la régulation du récepteur AT2 représente également un enjeu important pour la santé humaine sachant qu'aujourd'hui des antagonistes du récepteur AT1 sont administrés aux patients atteints d'hypertension. Dans ce contexte il devient essentiel de connaître les effets biologiques associés au récepteur AT2 qui reste activable par l'Ang II circulante dans ce type de traitement.

La présente invention a pour objet un fragment d'acides nucléiques (ADN ou ARN) isolé, codant pour une protéine apte à se lier au récepteur AT2, lequel fragment est sélectionné dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO:1, 3,5, 7 et 9, telles que présentées dans la liste des séquences, incluse dans la présente Demande.

Ces différentes séquences correspondent à l'ADN complémentaire (ADNc) codant pour une partie ou la totalité de la protéine ci-après dénommée ATIP (AT2 interacting protein).

La séquence SEQ ID NO:1 (1803 pb) correspond à la séquence nucléique complète de l'ATIP de souris et inclut aussi bien les parties codant pour la protéine de liaison au récepteur AT2 que les parties non codantes.

La séquence NO:3 (1323 pb) correspond à la séquence en acides nucléiques de la partie codante de la séquence SEQ ID NO:1, alors que la séquence SEQ ID NO:5 correspond au fragment de la séquence NO:1, obtenu par la technique du double-hybride (A. Plessis et al., M/S, 1994,9, I- 1K ; J. Luban et al., Curr. Op. Biotechnol., 1995, 6,59-64).

La séquence SEQ ID NO:7 (3742 pb) correspond à la séquence nucléique complète de l'ADNc humain et inclut aussi bien les parties codant pour la protéine homologue de l'ATIP de souris que les parties non codantes.

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La séquence SEQ ID NO:9 (1308 pb) correspond à la partie codante de la séquence SEQ ID NO : 7.

La présente invention a également pour objet des transcrits, caractérisés en ce qu'ils sont complémentaires des séquences conformes à l'invention et sont notamment générés à partir desdites séquences.

La présente invention a en outre pour objet des fragments desdites séquences, utiles comme sondes ou comme amorces, pour la détection des séquences SEQ ID N0:1, 3, 5, 7 ou 9.

Parmi lesdits fragments, on peut notamment citer une sonde de 354 pb, (SEQ ID NO:5) ainsi que tout fragment supérieur à 20 pb inclus dans les séquences SEQ ID NO:1, 3, 5, 7 ou 9.

Comme amorce, on utilisera en particulier la séquence SEQ ID NO:10 (oligonucléotide antisens), qui permet notamment d'amplifier les parties 5' des différents ARNm correspondant à l'ATIP (technique du 5' RACE : Marathon cDNA amplification kit, Clontech).

On peut également utiliser comme amorces d'amplification, tout couple d'oligonucléotides de plus de 20 pb et comprenant une partie de la séquence nucléique ATIP (humaine ou de souris), notamment le couple SEQ ID NO:11-SEQ ID NO:12.

Les conditions préférées d'hybridation (préhybridation et hybridation) sont notamment les suivantes : 45 % formamide, 9 % Dextransulfate, 0,2 % BSA, 0,2 % polyvinyl pyrrolidone, 0,2 % Ficoll, 0,1 % sodium pyrophosphate, 0,01 % SDS, 0,05 mM Tris pH 7,5,0,9 M NaCl et rinçages jusqu'à une stringence correspondant au tampon : SSCX1,0,1 % SDS.

La présente invention a également pour objet une protéine purifiée et isolée, dénommée ATIP, apte à interagir avec le récepteur AT2, sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO:2, 4,6 ou 8.

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Les séquences murines et humaine présentent 85,6 % d'homologies. La séquence humaine (ATIP humain) possède 5 aminoacides de moins que la séquence de souris (ATIP souris). Les acides aminés manquants dans la séquence humaine se situent au niveau des acides aminés : 162,163, 164, 166 et 214 de la séquence ATIP souris.

Les comparaisons (Blast) entre les séquences protéiques ATIP selon l'invention et les séquences contenues dans les banques de données indiquent que ATIP humain (comme ATIP souris), ne présentent jamais plus de 25 % d'homologie avec une séquence connue, et cela, seulement sur une partie de cette séquence.

La présente invention a également pour objet un produit de traduction, caractérisé en ce qu'il est codé par une séquence nucléotidique conforme à l'invention.

La présente invention a en outre pour objet des anticorps, caractérisés en ce qu'ils sont dirigés contre la protéine ATIP ou un fragment de protéine ATIP selon l'invention.

La présente invention a également pour objet un vecteur recombinant de clonage et/ou d'expression, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique conforme à l'invention.

La présente invention a également pour objet une cellule hôte transformée, caractérisée en ce qu'elle comprend un vecteur tel que défini ci-dessus.

Parmi les cellules transformées préférées selon l'invention, on peut citer E. coli et les cellules CHO.

La présente invention a également pour objet des cellules hôtes transformées, caractérisées en ce qu'elles sont constituées par une souche de levure convenable co-transformée avec au moins deux vecteurs qui codent respectivement (i) pour une protéine dite appât sélectionnée dans le groupe constitué par un fragment contenant au moins la SEQ ID NO:5 de la protéine ATIP et un fragment contenant au moins l'extrémité C-terminale du

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récepteur AT2, laquelle protéine appât est fusionnée à une protéine sélectionnée dans le groupe constitué par le domaine de liaison à l'ADN d'un facteur de transcription et le domaine d'activation du même facteur de transcription et (ii) pour une protéine dite proie, sélectionnée dans le groupe constitué par un fragment contenant au moins la SEQ ID NO:5 de la protéine ATIP, un fragment contenant au moins l'extrémité C-terminale du récepteur AT2 et tout autre polypeptide correspondant à une séquence contenue dans une banque d'ADNc, laquelle protéine proie est fusionnée à une protéine sélectionnée dans le groupe constitué par le domaine de liaison à l'ADN d'un facteur de transcription et le domaine d'activation du même facteur de transcription, lesquels vecteurs comportent en outre des marqueurs de sélection.

Selon un mode de réalisation avantageux desdites cellules, elles sont notamment constituées : - soit par une souche de levure convenable co-transformée avec trois vecteurs qui codent respectivement pour (i) un appât correspondant à un fragment contenant l'extrémité C-terminale du récepteur AT2 fusionné à une protéine sélectionnée dans le groupe constitué par le domaine de liaison à l'ADN d'un facteur de transcription et le domaine d'activation dudit facteur de transcription, (ii) un fragment contenant au moins la SEQ ID NO:5 de la protéine ATIP selon l'invention, fusionné à une protéine sélectionnée dans le groupe constitué par le domaine de liaison à l'ADN d'un facteur de transcription et le domaine d'activation dudit facteur de transcription et (iii) un polypeptide correspondant à une séquence contenue dans une banque d'ADNc, lesquels vecteurs comportent en outre des marqueurs de sélection, - soit par une souche de levure convenable co-transformée avec deux vecteurs qui codent respectivement pour (i) un fragment contenant au moins la SEQ ID NO:5 de la protéine ATIP selon l'invention, fusionné à une protéine sélectionnée dans le groupe constitué par le domaine de liaison à l'ADN d'un facteur de transcription et le domaine d'activation dudit facteur de transcription et (ii) un polypeptide correspondant à une séquence contenue

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dans une banque d'ADNc, fusionné à une protéine sélectionnée dans le groupe constitué par le domaine de liaison à l'ADN d'un facteur de transcription et le domaine d'activation dudit facteur de transcription, lesquels vecteurs comportent en outre des marqueurs de sélection, - soit par une souche de levure convenable co-transformée avec deux vecteurs, à savoir (i) un vecteur codant pour un fragment contenant au moins la SEQ ID NO:5 de la protéine ATIP mutée ou non, fusionné à une protéine sélectionnée dans le groupe constitué par le domaine de liaison à l'ADN d'un facteur de transcription et le domaine d'activation dudit facteur de transcription et (ii) un vecteur codant pour un fragment contenant l'extrémité C-terminale du récepteur AT2 muté ou non, fusionné à une protéine sélectionnée dans le groupe constitué par le domaine de liaison à l'ADN d'un facteur de transcription et le domaine d'activation dudit facteur de transcription, lesquels vecteurs comportent en outre des marqueurs de sélection, l'un des deux vecteurs codant obligatoirement pour une protéine mutée.

La présente invention a également pour objet une méthode de sélection de protéines inhibitrices de l'interaction protéine ATIP selon l'invention-récepteur AT2, laquelle méthode comprend : (a) la co-transformation d'une souche de levure convenable avec trois vecteurs qui codent respectivement pour (i) un appât correspondant à un fragment contenant l'extrémité C-terminale du récepteur AT2 fusionné à une protéine sélectionnée dans le groupe constitué par le domaine de liaison à l'ADN d'un facteur de transcription et le domaine d'activation dudit facteur de transcription, (ii) un fragment contenant au moins la SEQ ID NO:5 de la protéine ATIP selon l'invention, fusionné à une protéine sélectionnée dans le groupe constitué par le domaine de liaison à l'ADN d'un facteur de transcription et le domaine d'activation dudit facteur de transcription et (iii) un polypeptide correspondant à une séquence contenue dans une banque d'ADNc, lesquels vecteurs comportent en outre des marqueurs de sélection,

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(b) la sélection des clones de la banque d'ADNc exprimant un polypeptide inhibant l'interaction récepteur AT2-protéine ATIP selon l'invention, sur un milieu sélectif approprié et (c) l'identification dudit polypeptide.

Une telle méthode met notamment en #uvre la technique dite du triple-hybride ou du double-hybride inverse, telles que décrites dans Vidal et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996,93, 10315-10320 et 10321-10326) ou Tirode et al. (J. Rial. Chem., 1997, 272, 37, 22995-22999).

La présente invention a également pour objet une méthode de criblage de polypeptides interagissant avec la protéine ATIP selon l'invention, laquelle méthode comprend : (a) la co-transformation d'une souche de levure convenable avec deux vecteurs tels que définis ci-dessus, à savoir qui codent respectivement pour (i) un fragment contenant au moins la SEQ ID NO:5 de la protéine ATIP selon l'invention, fusionné à une protéine sélectionnée dans le groupe constitué par le domaine de liaison à l'ADN d'un facteur de transcription et le domaine d'activation dudit facteur de transcription et (ii) un polypeptide correspondant à une séquence contenue dans une banque d'ADNc, fusionné à une protéine sélectionnée dans le groupe constitué par le domaine de liaison à l'ADN d'un facteur de transcription et le domaine d'activation dudit facteur de transcription, lesquels vecteurs comportent en outre des marqueurs de sélection, et (b) la sélection des clones exprimant un polypeptide interagissant avec la protéine ATIP, sur un milieu sélectif convenable.

Une telle méthode permet notamment de rechercher d'autres protéines interagissant avec la protéine ATIP, en particulier pour trouver les maillons suivants de la voie activée par le récepteur AT2, en vue de les utiliser pour modifier l'interaction protéine selon l'invention-récepteur AT2.

La présente invention a également pour objet une méthode de caractérisation des domaines impliqués dans l'interaction protéine ATIP-

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récepteur AT2, caractérisée en ce qu'elle comprend : (a) la co-transformation d'une souche de levure convenable avec deux vecteurs, tels que définis ci-dessus, à savoir (i) un vecteur codant pour un fragment contenant au moins la SEQ ID NO:5 de la protéine ATIP mutée ou non, fusionné à une protéine sélectionnée dans le groupe constitué par le domaine de liaison à l'ADN d'un facteur de transcription et le domaine d'activation dudit facteur de transcription et (ii) un vecteur codant pour un fragment contenant l'extrémité C-terminale du récepteur AT2 muté ou non, fusionné à une protéine sélectionnée dans le groupe constitué par le domaine de liaison à l'ADN d'un facteur de transcription et le domaine d'activation dudit facteur de transcription, lesquels vecteurs comportent en outre des marqueurs de sélection, l'un des deux vecteurs codant obligatoirement pour une protéine mutée et (b) la visualisation, par sélection sur un milieu sélectif convenable, de la perte éventuelle de l'interaction ATIP-récepteur AT2.

Une telle méthode permet d'identifier et de délimiter les domaines importants de la protéine ATIP ou de l'extrémité C-terminale du récepteur AT2, dont dépend leur interaction, afin de les utiliser comme cible privilégiée pour modifier la signalisation du récepteur AT2.

La présente invention a également pour objet une méthode de sélection de substances aptes à influencer l'interaction protéine ATIP selon l'invention-récepteur AT2, laquelle méthode comprend : (a) la mise en contact de la protéine ATIP fixée sur un support avec une protéine de fusion récepteur AT2-protéine étiquette, éventuellement en présence d'une substance à tester, (b) au moins un lavage dudit support ainsi traité avec un tampon convenable et (c) la visualisation de l'éventuelle interaction ATIP-récepteur AT2, en particulier en SDS-PAGE, suivie d'une immuno-empreinte avec des anticorps dirigés soit contre la protéine étiquette, fusionnée au récepteur AT2,

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soit contre le récepteur AT2.

Si la substance à tester inhibe l'interaction ATIP-récepteur AT2, l'étape de visualisation est négative.

Conformément à l'invention l'ATIP est fixée sur ledit support soit de manière covalente, soit par liaison d'affinité entre une substance de fixation fusionnée à l'ATIP et ledit support. Par exemple, ledit support est constitué de billes couplées, soit à une substance présentant une affinité avec ladite protéine de fixation, fusionnée à l'ATIP, soit à des anticorps convenables.

La protéine de fusion récepteur AT2-protéine étiquette est notamment obtenue à partir d'un lysat de cellules transfectées avec un vecteur exprimant la protéine de fusion AT2-protéine étiquette.

En variante, ladite méthode de sélection de substances aptes à interagir avec la protéine ATIP selon l'invention, comprend : (a) la mise en contact de la protéine ATIP fixée sur un support, avec un lysat cellulaire, (b) au moins un lavage dudit support ainsi traité avec un tampon convenable, (c) la visualisation de l'éventuelle protéine associée à la protéine ATIP, en particulier en SDS-PAGE, suivie d'une immuno-empreinte avec des anticorps appropriés et (d) l'identification de la protéine du lysat cellulaire interagissant avec la protéine ATIP.

Conformément à ladite méthode de sélection de substances aptes à influencer l'interaction protéine ATIP selon l'invention-récepteur AT2, il est possible d'utiliser notamment comme protéines de fusion ATIP-protéine étiquette, les protéines GST-ATIPc et MYC-ATIPc, qui constituent des outils pouvant permettre d'entraîner in vitro d'éventuelles protéines interagissant avec ATIP, par exemple, à partir de lysats cellulaires activés ou non par des ligands du récepteur AT2. La protéine GST-ATIP peut-être entraînée par

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interaction spécifique du GST avec des billes d'agarose couplées à de la glutathione, ou encore immunoprécipitée avec l'anticorps anti-ATIP. La protéine Myc-ATIP peut-être immunoprécipitée avec les anticorps anti-MYC commerciaux ou avec l'anticorps anti-ATIP.

L'intérêt de ces méthodes consiste à trouver des moyens de modifier la signalisation, le niveau d'expression ou la pharmacologie du récepteur AT2, ceci pouvant avoir des applications thérapeutiques. En effet lorsqu'une pathologie aura été corrélée de façon claire à une anomalie de la transduction associée au récepteur AT2, une modification de cette transduction, en particulier en jouant sur la liaison du récepteur AT2 à la protéine selon l'invention, pourra alors éventuellement compenser le désordre pathologique ou au moins l'influencer.

La présente invention a également pour objet l'utilisation des cellules co-transformées précitées, pour la sélection et le criblage de substances ou de protéines aptes à influencer l'interaction protéine ATIPrécepteur AT2 ou aptes à interagir avec la protéine ATIP.

Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en #uvre du procédé objet de la présente invention ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels : - la figure 1 correspond à l'extrémité C-terminale du récepteur AT2 de souris, utilisée comme appât en double hybride pour cribler une banque d'ADNc de souris ; - la figure 2 illustre la position du domaine de liaison GAL4 et le site de clonage multiple du plasmide pGBT9 (Clontech) ; - la figure 3 illustre les structures présumées coiled-coil (surenroulées) (domaines coiled-coil soulignés) de l'ATIP de souris ; - la figure 4 illustre les structures présumées coiled-coil (surenroulées) (domaines coiled-coil soulignés) de l'ATIP humaine ; - la figure 5 illustre la structure du plasmide pVP16 ;

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- la figure 6 illustre le site de clonage multiple du plasmide pRSET A ; - la figure 7 illustre la séquence MYC utilisée, pour construire le plasmide pcDNA3-MYC ; - la figure 8 illustre la structure du plasmide pBAC-PAK-poly HIS, - la figure 9 illustre un Northern blot de plusieurs tissus humains hybridés avec la sonde ATIPsouris-court (SEQ ID NO:5) ; - la figure 10, illustre l'interaction in vitro de la protéine ATIPsouris-court avec l'extrémité C-terminale du récepteur AT2 ; et - la figure 11 illustre les modifications du signal induit par le récepteur AT2 par surexpression de la protéine ATIP.

Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.

EXEMPLE 1 : Miseen évidence d'une interaction protéine-protéine spéci- fique entre le récepteur AT2 et la protéine de séquence SEQ ID NO:6 selon l'invention.

Matériel et méthodes - Le système double-hybride, initialement développé par Song et Fields en 1989 (Nature, 340,245-246) repose sur le fait que l'activité de nombreux facteurs activateurs de transcription eucaryotes ne nécessite que deux domaines : un domaine activateur qui n'a pas la capacité de lier l'ADN et un domaine de liaison à l'ADN.

Dans le système double-hybride, le domaine de liaison de l'ADN est fusionné à une protéine X et le domaine d'activation est fusionné à une protéine Y. Si, et seulement si, X et Y interagissent, un complexe est formé qui reconstitue un facteur de transcription fonctionnel.

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- Construction des vecteurs d'expression : . vecteurs appâts :
Protéine X : extrémité C-terminale de la séquence codant pour le récepteur AT2 de souris (52 aminoacides de CVNPF au codon stop, voir figure 1), fusionnée à la séquence codant pour le domaine de liaison à l'ADN de Gal4 (figure 2).

Insert : extrémité du récepteur AT2 de souris (159 pb + 16 pb de sites générés par PCR) inséré au niveau des sites EcoRI et BamHI des vecteurs pLEX9 (Clontech) ou pGBT9 (pBTM116 ou pGAD424 modifié ; Vojtek et al., Cell, 1993, 74, 205-214).

On obtient ainsi la séquence suivante : CGGAATTC coté 5'-AT2 séquence C-terminale de 52 acides aminés- GGATCCCG coté 3' . Banque criblée :
Banque d'ADNc de f#tus de souris (A. B. Vojtek et al., Cell, 1993,74, 205-214), contenant des inserts de 350 à 700 pb (protéine Y) dans le vecteur VP16 (figure 5).

. Vecteurs contrôles appâts Protéine X : C-terminale des récepteurs ss2- adrénergique humain, AT1 de rat ou bradykinine humain.

. Souche de levure transformée
HF7c (Clontech) pour l'appât construit dans pGBT9 ;
L40 pour l'appât construit dans pLex9.

Résultats
Cette stratégie a permis d'isoler un clone issu de la banque d'ADNc contenant un insert de 354 pb (ATIP) qui interagit de façon spécifique avec l'extrémité C-terminale de l'AT2. Il est intéressant de noter que le criblage de cette banque avec les constructions réalisées dans les deux vecteurs d'expression pGBT9 et pLEX9 a permis de retrouver dans les deux cas ce même clone. Ce clone n'interagit pas avec des protéines contrôles,

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d'interactions non spécifiques.

Pour juger de la sélectivité de cette interaction, le clone ATIP a été testé en double-hybride avec les extrémités C-terminales des récepteurs : ss2 adrénergique humain, AT1 de rat et bradykinine humain, et toutes ont donné des résultats négatifs. Ceci indique que le polypeptide codé par le clone ATIP interagit, de façon sélective, avec l'extrémité C-terminale du récepteur AT2 de souris.

EXEMPLE 2 : Caractérisation du clone ATIP.

Pour rechercher le clone entier correspondant, une sonde de 354 pb (SEQ ID NO:5), qui correspond à l'insert obtenu par digestion avec l'enzyme de restriction NotI du plasmide isolé en double hybride (celui extrait de la banque VP16, sélectionné comme positif dans le crible utilisant comme appât, l'extrémité C-terminale du récepteur AT2 de souris), est utilisée pour cribler une banque d'ADNc de f#tus de souris construite avec des inserts de taille supérieure à 1 kb. Deux clones chevauchants, comprenant la séquence ATIP, ont ainsi été identifiés et ont permis de séquencer 1803 pb de l'ADNc correspondant (SEQ ID NO:1). Cette séquence contient une phase ouverte de lecture de 1323 pb (SEQ ID NO:3) codant potentiellement pour une protéine de 440 acides aminés (SEQ ID NO:2 et 4). Les comparaisons entre la séquence protéique identifiée et les séquences contenues dans les banques de données indiquent que celle-ci ne présente jamais plus de 25 % d'homologie avec une partie d'une séquence connue.

La sonde de 354 pb (SEQ ID NO:5) a été utilisée comme sonde en Southern et Northern de façon très satisfaisante dans les conditions d'hybridation ci-après : préhybridation et hybridation en 45 % formamide, 9 % Dextran-sulfate, 0,2 % BSA, 0,2 % polyvinyl pyrrolidone, 0,2 % Ficoll, 0,1 % sodium pyrophosphate, 0,01 % SDS, 0,05 mM Tris pH 7,5,0,9 M NaCl et rinçages jusqu'à stringence : SSCXl, 0,1 % SDS .

En parallèle, des expériences d'hybridation de Northern blot effectuées sur des ARN totaux de cellules N1E-115 avec la sonde ATIP (SEQ

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ID NO:5) confirment l'expression de l'ARNm correspondant dans les cellules N1E-115, et indique l'existence d'au moins 5 transcrits de tailles différentes.

Ces transcrits correspondent à des épissages alternatifs d'un même gène ou à des gènes différents homologues.

Sur un Northern, effectué dans les conditions décrites dans la littérature sur un échantillon de 5 g d'ARN poly A+ de cellules N1E-115, les tailles des différents transcrits hybridant avec la sonde ATIPsouris sont = 2,5- 3,5-5-5,3 et 7,5 kb.

La figure 9 représente un Northern blot contenant des ARN poly A+ de différents tissus humains, hybridés avec la même sonde ATIPsouris. On peut constater que l'ATIP est exprimé de façon ubiquitaire.

On trouve dans tous les tissus représentés un transcrit majoritaire à 4,4 kb, auquel s'ajoute, selon les tissus, d'autres transcrits plus longs (pancréas et c#ur) ou plus courts (pancréas, muscle squelettique, placenta, cerveau et c#ur). Ceux-ci sont peut-être le fruit d'un épissage alternatif de l'ARN de ATIP qui serait dépendant du tissu considéré ou encore ils sont le signe de l'existence d'une famille d'ARN codant pour des protéines de "la famille ATIP", homologues de ATIP et qui sont révélés par la sonde, à la stringence utilisée.

Afin de connaître la taille du plus petit transcrit codant pour l'ATIP, une amplification rapide des extrémités d'ADNc (RACE 5', Marathon cDNA Amplification Kit de Clontech) à partir d'ARN poly A+ de cellules N1E- 115 a été réalisé, en utilisant l'oligonucléotide antisens de SEQ ID NO:10, pour amplifier les parties 5' des différents ARNm correspondant à l'ATIP endogène des cellules N1E-115 (neuroblastome murin).

Les résultats obtenus ont indiqué que le plus petit transcrit incluant le domaine ATIP est un ARNm de 1950 pb, qui contient bien le début de la séquence codante obtenue par clonage.

Tout autre couple d'oligonucléotides (amorces) de plus de 20 pb et comprenant une partie de la séquence ATIP, peut également être utilisé

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pour amplifier par PCR (conditions de PCR à déterminer pour chaque couple d'oligonucléotides à l'aide du logiciel OLIGO 4) une partie de l'ATIP (et donner un fragment d'ADN qui pourrait éventuellement être utilisé comme sonde pour reconnaître l'ADN ou l'ARN correspondant à l'ATIP).

EXEMPLE 3 : Construction de différents vecteurs selon l'invention
D'une façon générale les vecteurs contenant ATIPsouris-court (à l'exception de pRSETA-ATIPsouris-court) ont été obtenus à partir d'un insert produit par PCR avec les deux oligonucléotides suivants (SEQ ID NO:11 et SEQ ID N0:12): oligo. sens: 5' CGCGGATCCCAGACAGACCGGACGGAACTGGAG 3' oligo. antisens: 5' CCGGAATTCACTACAACCTTTCGTTTAAAGCATC 3', en utilisant comme matrice le vecteur VP16-ATIPsouris-court (figure 5). Par commodité, ce vecteur est dénommé BATIPcstop,E. En effet, digéré par BamHI et EcoRI, il donne un insert correspondant à la séquence 1er brin : GATCC-SEQ ID NO:5 (moins CAT)-TAGTG 2ème brin: CCTAG------------------------------CTTAAG (STOP)
Site BamHI Site EcoRI
D'autres vecteurs peuvent également être construits ; ils comprennent tout ou partie de la protéine ATIP et sont les suivants : -VP16-ATIPsouris-court (vecteur sorti de la banque criblée en double hybride, comprend 354 pb (SEQ ID NO:5), insérées en Notl dans VP16).

-pCDNA3-MYC-ATIPsouris-court (insert BATIPcstop,E inséré en BamHI-EcoRI dans pCDNA3-MYC (pcDNA3 d'Invitrogen, modifié par insertion de la séquence MYC, figure 7) ; ce plasmide peut être utilisé en transfections stables ou transitoires. Il permet d'exprimer MYC-ATIPsouriscourt en cellules eucaryotes. L'expression de cette protéine dans des cellules eucaryotes après transfection du plasmide correspondant a déjà été obtenue et vérifiée par immunoréaction avec un anticorps anti-MYC et anti-ATIP.

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-pRSETA-HIS-ATIPsouris-court (insert BATIPcstop,E. inséré en BamHI-EcoRI dans pRSETA, Invitrogen). Ce plasmide permet d'exprimer la protéine de fusion HIS-ATIPsouris-court en cellules bactériennes et de la purifier sur colonne de Nickel (Voir figure 6 pour le site multiple de clonage).

-pBacPAK-polyHIS-ATIPsouris-court (insert BATIPcstop,E inséré en BamHI-EcoRI dans le vecteur pBacPAK-polyHIS (pBacPAK commercial, modifié par insertion d'une séquence contenant un tag histidine et un site de clivage à la thrombine, figure 8). Cette construction peut être utilisée pour exprimer la protéine ATIP souris-court, fusionnée à un tag histidine, dans des cellules d'insectes (type SF9). En effet, comme il est indiqué, ce vecteur contient une insertion poly-histidine et peut donc coder pour la protéine de fusion. Celle-ci, de même que la protéine de fusion clonée dans pRSET, peut-être purifiée sur colonne de Nickel et servir au même type de techniques.

-pGEX-4Tl-GST-ATIPsouris-court (insert amplifié par PCR identique à BATIPcstop,E, mais sans codon STOP, ce qui prolonge la séquence de ATIPsouris-court des quelques acides aminés suivants : Phe-Glu-Phe-ProGly-Arg-Leu-Glu-Arg-Pro-His-Arg-Asp provenant du plasmide pGEX-4T-1 (Pharmacia). Ce plasmide permet d'exprimer la protéine GST-ATIPsouriscourt en cellules bactériennes et de la purifier sur billes glutathion-agarose.

-pCDNAI-ATIPsouris clonel (totalité du 5' séquence de ATIP et ORF jusqu'à pb : en partant du début du clone, inséré en BstxI dans pCDNAI). Ce plasmide est issu du clonage de la banque de f#tus de souris avec la sonde SEQ ID NO:5. Ce plasmide peut servir à produire en bactéries, la portion 5' de l'ADN ATIPsouris, pour l'utiliser comme sonde.

-pCDNAI-ATIPsouris clone 2 (2ème moitié de l'ORF de ATIP à partir de pb : et jusqu'à la fin du 3' séquence (pb 1803), inséré en Bstxl dans pcDNAI, Invitrogen). Ce plasmide peut servir à produire en bactéries, la portion 3' de l'ADN ATIPsouris, pour l'utiliser comme sonde.

-pcDNAI-ATIPsouris-long (clones 1 et 2 mis bout à bout, en

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utilisant le site intermédiaire Sapl. Ce plasmide contient la totalité du clone ATIP souris, inséré en BstxI dans pCDNAI). Ce plasmide peut être utilisé en transfections transitoires en cellules eucaryotes.

-pcDNA3-ATIPsouris-long (ATIPsouris entier sorti BamHIXbaI de pCDNAI-ATIPsouris-long, et inséré dans pcDNA3, Invitrogen, à ces mêmes sites). Ce plasmide peut être utilisé en transfections stables ou transitoires en cellules eucaryotes. Il a permis de traduire in vitro (kit TNT T7 coupled reticulocytes lysate systems, Promega) la protéine ATIP entière et de constater que son produit de traduction a un poids moléculaire apparent sur gel de 58 kDa. A ce produit majoritaire s'ajoute deux produits minoritaires de 30 et 15 kDa. D'après la séquence de ATIP, ceux-ci pourraient correspondre à des produits partiels de traduction in vitro commençant à d'autres ATG que celui en position 178 de la SEQ ID NO:1.

EXEMPLE 4 : Obtention de clones stables exprimant la protéine ATIPsouriscourt ou long.

On a obtenu par transfection des clones stables exprimant à la fois le récepteur AT2 humain et l'ATIP souris court (SEQ ID NO:6) ou l'ATIP souris long (SEQ ID NO:3).

Les cellules CHO, déficientes en dihydrofolate réductase, sont transfectées avec un plasmide contenant la région codant pour le récepteur AT2 humain (Bedecs et al., Biochem. J. 1997, 325, 449-454).

Le clone sélectionné, CHO-hAT2, exprimant 100 fmol de récepteur AT2/mg de protéine, est cultivé sur milieu HAMF12 complémenté avec du sérum de veau f#tal à 10 % et utilisé entre les passages 10 et 30.

Ce clone a lui même été transfecté avec les plasmides pCDNA3-MYC-ATIPsouris-court ou pCDNA3-ATIPsouris-long décrits à l'exemple 3. La sélection des clones exprimant, de manière stable, la protéine ATIP (forme courte ou forme longue) s'est faite en milieu sélectif contenant 800 g/ml de G418. Les lysats cellulaires, correspondant aux différents clones sélectionnés, ont été soumis à un SDS-PAGE suivi d'une immuno-empreinte et

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celui-ci a été incubé avec l'anticorps polyclonal anti-ATIP. Les résultats obtenus indiquent que différents clones exprimant des taux différents d'ATIP souris court, ont pu être obtenus.

EXEMPLE 5 : Production d'anticorps polyclonaux dirigés contre la séquence SEQ ID NO:6.

Afin de progresser dans la caractérisation de ce clone, la production d'anticorps polyclonaux dirigés contre le domaine ATIP a été entreprise.

Pour cela, un vecteur codant pour une protéine correspondant à ce domaine fusionné à six résidus histidine a été construit.

La séquence suivante :
GGA TCC-SEQ NO:5-TAG-TGA-ATT est insérée dans le plasmide pRSETA, tel que défini ci-dessus.

Dans cet insert, la SEQ ID NO:5 ne comprend pas le premier CAT.

Le plasmide obtenu est exprimé dans la souche d'E. coli BL 21 (DE3) (F- ompT- rB- ms-) contenant le bactériophage DE3 qui porte un fragment d'ADN contenant le gène lacI, le promoteur lacUV5, le début du gène lacZ et le gène codant pour la T7 ARN polymérase. Ce fragment est introduit dans le gène int.

En présence de DE3, seul le promoteur lacUV5, inductible par IPTG dirige la transcription de la T7 ARN polymérase.

L'addition de 0,4 mM d'IPTG à une culture de cellules BL21 (DE3) induit la production de T7 ARN polymérase qui, à son tour, entraîne la transcription de l'ADN cible du plasmide pRSETA (permettant la traduction de la protéine se liant au récepteur AT2).

La protéine obtenue (17 kDa) est purifiée sur colonne de Nickel (Ni-NTA, QuiAexpressionist 07/97, Quiagen), grâce à l'affinité de ses six résidus histidine pour le nickel. La protéine obtenue est ensuite injectée à des lapins pour obtenir des anticorps polyclonaux dirigés contre la protéine

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ATIP. Les saignées obtenues présentent un très bon titre.

Ces anticorps purifiés sur colonne de GST-ATIP, après passage sur colonne de GST seul (afin d'éliminer les éventuels anticorps spécifiques de GST et de ne retenir sur la colonne de GST-ATIP que les anticorps spécifiques de ATIPsouris-court) peuvent être utilisés avec succès pour immuno-précipiter et révéler en immuno-empreinte MYC-ATIPsouris-court à partir de cellules COS transfectées de façon transitoire. De plus cet anticorps purifié révèle également en immuno-empreinte la protéine ATIPsouris-long contenue dans des lysats de cellules COS transitoirement transfectées avec le plasmide pCDNA3-ATIPsouris-long.

La protéine ATIPsouris-long transfectée est visualisée après SDS-PAGE et immuno-empreinte avec un anticorps anti-ATIP, sous la forme de deux polypeptides de poids moléculaires apparents de 50 et 45 kDa.

Cet anticorps purifié a été utilisé en immuno-fluorescence sur des cellules CHO-hAT2, fixées par un traitement de 15 minutes en paraformaldéhyde (3 %). Après fixation, les cellules sont traitées successivement par des solutions de PBS/glycine 50 mM pendant 20 minutes, PBS/Triton X100 0,1 % pendant 5 minutes et PBS/ BSA 0,2 % pendant 15 minutes. Elles sont ensuite incubées successivement dans des solutions à 15 g/ml d'anticorps contenant l'anticorps anti-ATIP purifié, puis l'anticorps antiimmunoglobuline de lapin couplé à de la rhodamine pendant 30 minutes.

Entre chaque nouvelle incubation, trois rinçages en PBS sont effectués. Les observations au microscope à fluorescence indiquent une expression de la protéine ATIP endogène au niveau du noyau (de façon majoritaire) et du cytoplasme des cellules CHO-hAT2.

Certaines cellules montrent une répartition homogène de la fluorescence due à l'anticorps anti-ATIP dans ces compartiments, alors que d'autres cellules qui paraissent plus étalées, montrent une répartition hétérogène de la fluorescence le long de filaments qui semblent partir du noyau et s'étendre jusqu'à la membrane plasmique de la cellule, en un réseau organisé.

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Des expériences complémentaires de co-localisation doivent être effectuées pour déterminer si ces filaments coïncident ou non avec des structures connues du cytosquelette.

EXEMPLE 6 : Confirmation de l'interaction in vitro de la protéine ATIPsouris-court avec l'extrémité C-terminale du récepteur AT2.

Pour démontrer l'interaction de la protéine ATIPsouris-court avec l'extrémité C-terminale du récepteur AT2 dans un autre système que celui du double hybride, un protocole permettant de mettre en évidence cette interaction in vitro a été mis en place. Pour cela, la protéine de fusion GSTATIP telle que décrite ci-dessus a été produite ; elle est associée par sa partie GST à de la glutathione couplée à des billes d'agarose (GA). En parallèle, des bactéries (DH5a) sont transfectées avec un plasmide (pMAL-c2-AT2, issu de pMAL-c2 de New England Biolabs) codant pour une protéine de fusion entre l'extrémité C-terminale du récepteur AT2 humain (Asn314-Ser363) et la MBP (Maltose Binding Protein). Ces bactéries ont été cultivées et la protéine de fusion a été induite en IPTG 0,3 mM selon le protocole "pMAL Protein Fusion and Purification System" de New England Biolabs. Après centrifugation de la culture à 4 000 g et solubilisation du culot obtenu en "column buffer" (20 mM Tris-HCI, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA), une nouvelle centrifugation à 9 000 g a permis de récupérer un surnageant contenant une forte concentration de MBP-AT2. Ce surnageant a été mis en contact, pendant 3 heures à 4 C, avec les billes de glutathione agarose couplées à la protéine GST seule après addition de NaCl de façon à se placer à 300 mM final NaCl. Cette étape de préincubation permet d'éliminer les interactions non spécifiques qui peuvent exister entre ATIP et GA-GST. Le surnageant récupéré a été mis en contact avec les billes GA-GST-ATIPsouris-court ou GA-GSTseul pendant une nuit à 4 C.

Après contact les billes ont été rincées 3 fois en tampon 20 mM Tris-HCI, 300 mM NaCl, 1 mM EDTA et une fois en "column buffer". Après analyse des billes rincées en SDS-PAGE et immuno-empreinte avec un anticorps anti-MBP (New England Biolabs), on observe une rétention spécifique de la protéine

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MBP-AT2 sur billes GA-GST-ATIPsouris-court qui n'est pas observée sur les billes GA-GSTseul (Figure 10).

Ce même protocole a été réalisé avec un plasmide exprimant MBP-AT1 (extrémité C-terminale du récepteur AT1 humain (Leu297-Glu359)) et indique que la protéine MBP-AT1 n'est pas retenue de façon spécifique sur les billes GA-GST-ATIPsouris-court (Figure 10).

Ces résultats confirment ceux obtenus en double hybride indiquant une interaction spécifique et sélective entre la protéine selon l'invention et l'extrémité C-terminale du récepteur AT2 ( et pas AT1).

EXEMPLE 7 : Modification de la transduction du signal du récepteur AT2 dans des clones surexprimant la protéine ATIPsouris-long.

Afin de vérifier que la protéine ATIP interagit in vivo avec le récepteur AT2, on a évalué si une une surexpression de cette protéine modifie un signal induit par le récepteur AT2.

Pour cela un clone stable de cellules CHO-hAT2 exprimant la protéine ATIPsouris-long (CHO-hAT2-ATIP), obtenu selon la méthodologie décrite dans l'exemple 4 a été utilisé ; le test fonctionnel de l'activité du récepteur AT2 mis au point sur le clone CHO-hAT2 qui consiste à inhiber la phosphorylation de la sous-unité IRp du récepteur de l'insuline induite par son ligand, a été reproduit.

Mise en évidence d'une inhibition par le récepteur AT2 de la phosphrylation d'IRp induite par l'insuline dans les cellules CHO-hAT2 :
Les cellules CHO-hAT2 sont ensemencées à une densité de 3.106 cellules par boîte de 15 cm2 de diamètre. Elles sont rendues quiescentes par un sevrage de 16 heures avant d'être traitées. Le traitement consiste en une mise en contact de 5 minutes avec 15 ml de milieu F12 contenant de l'insuline additionné ou non de CGP42112 (agoniste sélectif du récepteur AT2). Après traitement, les cellules sont solubilisées en tampon de lyse contenant : 50 mM Hepes, pH 7. 6, 1 % Triton X-100,20 mM EDTA, 30 mM pyrophosphate de sodium, 30 mM fluorure de sodium, 2 mM benzamidine, 1 mM

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sodium orthovanadate, 1 mM fluorure de phénylméthylsuphonyle et 1 ug/ml d'aprotinine, pepstatine, antipaïne and leupeptine. Les lysats sont ensuite soumis à une purification sur colonne de lectine de germe de blé selon le protocole décrit dans Issad, T., et al. (Eur. J. Biochem. 1995, 234, 108-115). Après mise en contact et lavages, les billes de lectine couplée à de la sépharose (Pharmacia) sont reprises dans du tampon d'échantillon contenant du SDS et les protéines éluées sont analysées en SDS-PAGE suivie d'immuno-empreintes avec des anticorps anti-phosphotyrosine (Upstate Biotechnology, Inc. ) ou antiIRss (décrit dans Issad, T., et al., précité).

La sous-unité ss du récepteur de l'insuline apparaît comme un polypeptide de 97 kDa dont la phosphorylation (visualisée par révélation avec un anticorps anti-phosphotyrosine) augmente de façon dose-dépendante avec la concentration en insuline. L'angiotensine II (100 nM) ainsi que le CGP42112 (100 nM) inhibent cette phosphorylation à toutes les doses d'insuline testées entre 0,1 et 0,001 ug/ml (Figure 11). A titre d'exemple, le CGP42112 inhibe la phosphorylation de IRp induite par 0,01 g/ml d'un facteur 64 ~ 4 % (n=7). Ce résultat démontre que le récepteur AT2 interfère négativement sur les voies de signalisation du récepteur de l'insuline à l'étape initiale de son activation, qui est son autophosphorylation. Ces résultats fournissent également la première mise en évidence d'une interconnection entre les voies de signalisation des récepteurs tyrosines kinases et le récepteur à sept domaines transmembranaires qu'est l'AT2.

Reproduction de cette méthodologie sur les cellules CHO-hAT2-ATIP :
Lorsque ce protocole est réalisé sur des cellules CHO-hAT2-ATIP, l'inhibition par le CGP42112 (100 nM) de la phosphorylation du récepteur de l'insuline obtenue pour différentes doses d'insuline (0,05, 0,01,0,005, 0,001 g/ml) n'est pas observée (Figure 11). Ce résultat a été reproduit 3 fois pour chacune des doses d'insuline en prenant comme contrôle positif, dans chaque expérience, l'inhibition obtenue pour le clone CHO-hAT2.

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Ceci démontre donc que la surexpression de la protéine ATIP dans les cellules CHO-hAT2 interfère avec la signalisation du récepteur AT2, ce qui confirme l'interaction in vivo de la protéine ATIP avec le récepteur AT2.

Une autre protéine glycosylée, retenue sur colonne de lectine, ayant un poids apparent de 120 kDa, identifiée comme étant la protéine nouvellement clonée SIRP (Kharitonenkov, A. et al, Nature, 1997,386, 181- 186) est phosphorylée sur tyrosine en réponse à l'insuline. La phosphorylation de cette protéine, de même que celle de IRss est inhibée en présence de CGP42112 dans le cas du clone CHO-hAT2 et ne l'est pas dans le cas du clone CHO-hAT2-ATIP. Ceci confirme que la protéine ATIP interfère sur les voies de signalisation du récepteur AT2. Ces résultats montrent bien l'intérêt que peut présenter l'utilisation de la protéine ATIP pour modifier la signalisation médiée par le récepteur AT2 et compenser éventuellement des pathologies associées à des anomalies de la régulation de ce récepteur.

Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en évidence, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention.

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LISTE DE SEQUENCES (1) INFORMATIONS GENERALES: (i) DEPOSANT: (A) NOM : (B) RUE : rue Michel Ange (C) VILLE : (E) PAYS : (F) CODE POSTAL : (ii) TITRE DE L'INVENTION: SEQUENCES NUCLEIQUES CODANT POUR TOUT OU PARTIE D'UNE PROTEINE INTERAGISSANT AVEC LE RECEPTEUR AT2 ET LEURS APPLICATIONS.

(iii) NOMBRE DE SEQUENCES : (iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR: (A) TYPE DE SUPPORT : disk (B) ORDINATEUR : PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS (D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB) (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE: CDS (B) EMPLACEMENT:178..1500 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1: GCTACCCCCC CCCCACGCAC CCCCCAATCT GGGTGGCCTG GCATTAGCAT GTAAGCTTGT 60 TTTTCTCTGG CTGTATCTCT TGGCCTGGAA GAACCCCGAG TTGCCAAGAG ACACAGTATG 120 TGATGGTCCC TGGAAAAGCT GCTTCCCCTG CGAAGTTCTC CCACTGGCTT CGAAGAC 177 ATG CTG TTG TCT CCC AAA TTC TCC TTA TCC ACC ATC CAC GTC CGC CTA 225 Met Leu Leu Ser Pro Lys Phe Ser Leu Ser Thr Ile His Val Arg Leu 1 5 10 15 ACC GCC AAA GGA CTG CTT CGA AAC CTC CGG CTT CCT TCG GGG CTC AGG 273 Thr Ala Lys Gly Leu Leu Arg Asn Leu Arg Leu Pro Ser Gly Leu Arg
20 25 30

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AAA AAC ACT GTC ATT TTC CAC ACA GTT GAA AAG GGC AGG CAG AAG AAT 321 Lys Asn Thr Val Ile Phe His Thr Val Glu Lys Gly Arg Gln Lys Asn
35 40 45 CCC AGG AGC CTG TGC ATC CAG ACC CAG ACA GCT CCA GAT GTG CTG TCC 369 Pro Arg Ser Leu Cys Ile Gln Thr Gln Thr Ala Pro Asp Val Leu Ser
50 55 60 TCC GAG AGA ACG CTT GAG TTG GCC CAA TAC AAG ACA AAA TGT GAA AGC 417 Ser Glu Arg Thr Leu Glu Leu Ala Gln Tyr Lys Thr Lys Cys Glu Ser
65 70 75 80 CAA AGT GGA TTC ATC CTG CAC CTC AGG CAG CTT CTT TCC CGT GGT AAC 465 Gln Ser Gly Phe Ile Leu His Leu Arg Gln Leu Leu Ser Arg Gly Asn
85 90 95 AAC AAG TTT GAA GCG CTG ACA GTT GTG ATC CAG CAC CTC CTG TCT GAG 513 Asn Lys Phe Glu Ala Leu Thr Val Val Ile Gln His Leu Leu Ser Glu
100 105 110 CGG GAG GAA GCA CTG AAG CAA CAC AAA ACC CTC TCT CAA GAA CTT GTC 561 Arg Glu Glu Ala Leu Lys Gln His Lys Thr Leu Ser Gln Glu Leu Val
115 120 125 AGC CTC CGG GGA GAG CTA GTT GCT GCT TCA AGC GCC TGT GAG AAG CTA 609 Ser Leu Arg Gly Glu Leu Val Ala Ala Ser Ser Ala Cys Glu Lys Leu
130 135 140 GAA AAG GCT AGG GCT GAC TTA CAG ACA GCG TAT CAA GAA TTT GTC CAG 657 Glu Lys Ala Arg Ala Asp Leu Gln Thr Ala Tyr Gln Glu Phe Val Gln 145 150 155 160 AAA CTA AAC CAG CAG CAT CAG ACA GAC CGG ACG GAA CTG GAG AAC CGG 705 Lys Leu Asn Gln Gln His Gln Thr Asp Arg Thr Glu Leu Glu Asn Arg
165 170 175 CTG AAG GAC TTA TAC ACC GCA GAG TGT GAG AAG CTT CAG AGC ATT TAC 753 Leu Lys Asp Leu Tyr Thr Ala Glu Cys Glu Lys Leu Gln Ser Ile Tyr
180 185 190 ATT GAG GAG GCA GAA AAA TAT AAA ACT CAA CTG CAA GAG CAG TTT GAC 801 Ile Glu Glu Ala Glu Lys Tyr Lys Thr Gln Leu Gln Glu Gln Phe Asp
195 200 205 AAC TTA AAC GCC GCC CAT GAG ACC ACT AAG CTT GAG ATT GAA GCT AGC 849 Asn Leu Asn Ala Ala His Glu Thr Thr Lys Leu Glu Ile Glu Ala Ser
210 215 220 CAC TCG GAG AAG GTG GAA TTG CTG AAG AAG ACC TAT GAA ACC TCC CTT 897 His Ser Glu Lys Val Glu Leu Leu Lys Lys Thr Tyr Glu Thr Ser Leu @

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TCA GAA ATC AAG AAG AGC CAT GAG ATG GAG AAG AAG TCA CTG GAG GAT 945 Ser Glu Ile Lys Lys Ser His Glu Met Glu Lys Lys Ser Leu Glu Asp
245 250 255 CTG CTT AAT GAG AAG CAG GAA TCG CTG GAG AAA CAA ATC AAT GAT CTG 993 Leu Leu Asn Glu Lys Gln Glu Ser Leu Glu Lys Gln Ile Asn Asp Leu
260 265 270 AAG AGT GAA AAC GAT GCT TTA AAC GAA AGG TTG AAA TCA GAG GAG CAA 1041 Lys Ser Glu Asn Asp Ala Leu Asn Glu Arg Leu Lys Ser Glu Glu Gln
275 280 285 AAG CAA CTG TCA AGA GAG AAG GCG AAT TCC AAA AAC CCT CAG GTC ATG 1089 Lys Gln Leu Ser Arg Glu Lys Ala Asn Ser Lys Asn Pro Gln Val Met
290 295 300 TAT CTG GAG CAA GAA CTA GAA AGC CTG AAG GCT GTG TTA GAG ATC AAG 1137 Tyr Leu Glu Gln Glu Leu Glu Ser Leu Lys Ala Val Leu Glu Ile Lys 305 310 315 320 AAT GAG AAG CTG CAC CAG CAG GAC ATG AAG CTA ATG AAG ATG GAA AAG 1185 Asn Glu Lys Leu His Gln Gln Asp Met Lys Leu Met Lys Met Glu Lys
325 330 335 CTG GTG GAC AAT AAC ACA GCA TTG GTT GAC AAG CTG AAG CGA TTC CAG 1233 Leu Val Asp Asn Asn Thr Ala Leu Val Asp Lys Leu Lys Arg Phe Gln
340 345 350 CAG GAA AAC GAG GAG TTA AAA GCT CGC ATG GAC AAA CAC ATG GCA ATT 1281 Gln Glu Asn Glu Glu Leu Lys Ala Arg Met Asp Lys His Met Ala Ile
355 360 365 TCA AGG CAA CTT TCC ACC GAG CAG GCC GCG CTG CAA GAG TCC CTT GAG 1329 Ser Arg Gln Leu Ser Thr Glu Gln Ala Ala Leu Gln Glu Ser Leu Glu
370 375 380 AAG GAG TCA AAG GTC AAC AAG AGA CTG TCC ATG GAG AAC GAG GAA CTT 1377 Lys Glu Ser Lys Val Asn Lys Arg Leu Ser Met Glu Asn Glu Glu Leu 385 390 395 400 CTG TGG AAA CTG CAC AAC GGA GAC CTG TGC AGC CCC AAG AGA TCC CCC 1425 Leu Trp Lys Leu His Asn Gly Asp Leu Cys Ser Pro Lys Arg Ser Pro
405 410 415 ACC TCC TCG GCC ATC CCT TTC CAG TCC CCC AGG AAT TCT GGT TCC TTC 1473 Thr Ser Ser Ala Ile Pro Phe Gln Ser Pro Arg Asn Ser Gly Ser Phe
420 425 430 TCC AGC CCC AGC ATC TCA CCC AGA TGA CGGCTTCTGA ACGCAGGAGA 1520 Ser Ser Pro Ser Ile Ser Pro Arg *
435 440 CTCTCTGAAG GCACTGAGGT GCGCTTCTGC AGGACTGACC CTCTCATGGG AACTCGAGTT 1580 GCTGCGTTAG CTCTCTGGAA TATCCCCAGG ATATCGGGAG AGCAGCCGCC AACCGTATCA 1640

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GCTACGTACG AATAGAGAGC TCCAATAGAA GACTTTTAAC TTGGTCCAAA AGCCTCCTCC 1700 AAAAACAGAT TTCGGAACTG AAGTGGACAT AGTTGCACAA AGCACTTACG GAACGAGGGA 1760 ACCTTGTTCT TTGCCTTCCT TCACCTAAGC ATAGGCTTTC CAG 1803 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO.- 2 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 440 acides aminés (B) TYPE : aminé (D) CONFIGURATION : (ii) TYPE DE MOLECULE : (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2 : Met Leu Leu Ser Pro Lys Phe Ser Leu Ser Thr Ile His Val Arg Leu 1 5 10 15 Thr Ala Lys Gly Leu Leu Arg Asn Leu Arg Leu Pro Ser Gly Leu Arg
20 25 30 Lys Asn Thr Val Ile Phe His Thr Val Glu Lys Gly Arg Gln Lys Asn
35 40 45 Pro Arg Ser Leu Cys Ile Gln Thr Gln Thr Ala Pro Asp Val Leu Ser
50 55 60 Ser Glu Arg Thr Leu Glu Leu Ala Gln Tyr Lys Thr Lys Cys Glu Ser
65 70 75 80 Gln Ser Gly Phe Ile Leu His Leu Arg Gln Leu Leu Ser Arg Gly Asn
85 90 95 Asn Lys Phe Glu Ala Leu Thr Val Val Ile Gln His Leu Leu Ser Glu
100 105 110 Arg Glu Glu Ala Leu Lys Gln His Lys Thr Leu Ser Gln Glu Leu Val
115 120 125 Ser Leu Arg Gly Glu Leu Val Ala Ala Ser Ser Ala Cys Glu Lys Leu
130 135 140 Glu Lys Ala Arg Ala Asp Leu Gln Thr Ala Tyr Gln Glu Phe Val Gln 145 150 155 160 Lys Leu Asn Gln Gln His Gln Thr Asp Arg Thr Glu Leu Glu Asn Arg
165 170 175 Leu Lys AspLeu Tyr Thr Ala Glu Cys Glu Lys Leu Gln Ser Ile Tyr
180 185 190

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Ile Glu Glu Ala Glu Lys Tyr Lys Thr Gln Leu Gln Glu Gln Phe Asp
195 200 205 Asn Leu Asn Ala Ala His Glu Thr Thr Lys Leu Glu Ile Glu Ala Ser
210 215 220 His Ser Glu Lys Val Glu Leu Leu Lys Lys Thr Tyr Glu Thr Ser Leu 225 230 235 240 Ser Glu Ile Lys Lys Ser His Glu Met Glu Lys Lys Ser Leu Glu Asp
245 250 255 Leu Leu Asn Glu Lys Gln Glu Ser Leu Glu Lys Gln Ile Asn Asp Leu
260 265 270 Lys Ser Glu Asn Asp Ala Leu Asn Glu Arg Leu Lys Ser Glu Glu Gln
275 280 285 Lys Gln Leu Ser Arg Glu Lys Ala Asn Ser Lys Asn Pro Gln Val Met
290 295 300 Tyr Leu Glu Gln Glu Leu Glu Ser Leu Lys Ala Val Leu Glu Ile Lys 305 310 315 320 Asn Glu Lys Leu His Gln Gln Asp Met Lys Leu Met Lys Met Glu Lys
325 330 335 Leu Val Asp Asn Asn Thr Ala Leu Val Asp Lys Leu Lys Arg Phe Gln
340 345 350 Gln Glu Asn Glu Glu Leu Lys Ala Arg Met Asp Lys His Met Ala Ile
355 360 365 Ser Arg Gln Leu Ser Thr Glu Gln Ala Ala Leu Gln Glu Ser Leu Glu
370 375 380 Lys Glu Ser Lys Val Asn Lys Arg Leu Ser Met Glu Asn Glu Glu Leu 385 390 395 400 Leu Trp Lys Leu His Asn Gly Asp Leu Cys Ser Pro Lys Arg Ser Pro
405 410 415 Thr Ser Ser Ala Ile Pro Phe Gln Ser Pro Arg Asn Ser Gly Ser Phe
420 425 430 Ser Ser Pro Ser Ile Ser Pro Arg *
435 440 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 1323 paires de bases (B) TYPE : nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION :

<Desc/Clms Page number 30>

(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE : (B) EMPLACEMENT:1..1322 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3 : ATG CTG TTG TCT CCC AAA TTC TCC TTA TCC ACC ATC CAC GTC CGC CTA 48 Met Leu Leu Ser Pro Lys Phe Ser Leu Ser Thr Ile His Val Arg Leu ACC GCC AAA GGA CTG CTT CGA AAC CTC CGG CTT CCT TCG GGG CTC AGG 96 Thr Ala Lys Gly Leu Leu Arg Asn Leu Arg Leu Pro Ser Gly Leu Arg AAA AAC ACT GTC ATT TTC CAC ACA GTT GAA AAG GGC AGG CAG AAG AAT 144 Lys Asn Thr Val Ile Phe His Thr Val Glu Lys Gly Arg Gln Lys Asn CCC AGG AGC CTG TGC ATC CAG ACC CAG ACA GCT CCA GAT GTG CTG TCC 192 Pro Arg Ser Leu Cys Ile Gln Thr Gln Thr Ala Pro Asp Val Leu Ser TCC GAG AGA ACG CTT GAG TTG GCC CAA TAC AAG ACA AAA TGT GAA AGC 240 Ser Glu Arg Thr Leu Glu Leu Ala Gln Tyr Lys Thr Lys Cys Glu Ser CAA AGT GGA TTC ATC CTG CAC CTC AGG CAG CTT CTT TCC CGT GGT AAC 288 Gln Ser Gly Phe Ile Leu His Leu Arg Gln Leu Leu Ser Arg Gly Asn AAC AAG TTT GAA GCG CTG ACA GTT GTG ATC CAG CAC CTC CTG TCT GAG 336 Asn Lys Phe Glu Ala Leu Thr Val Val Ile Gln His Leu Leu Ser Glu CGG GAG GAA GCA CTG AAG CAA CAC AAA ACC CTC TCT CAA GAA CTT GTC 384 Arg Glu Glu Ala Leu Lys Gln His Lys Thr Leu Ser Gln Glu Leu Val AGC CTC CGG GGA GAG CTA GTT GCT GCT TCA AGC GCC TGT GAG AAG CTA 432 Ser Leu Arg Gly Glu Leu Val Ala Ala Ser Ser Ala Cys Glu Lys Leu GAA AAG GCT AGG GCT GAC TTA CAG ACA GCG TAT CAA GAA TTT GTC CAG 480 Glu Lys Ala Arg Ala Asp Leu Gln Thr Ala Tyr Gln Glu Phe Val Gln AAA CTA AAC CAG CAG CAT CAG ACA GAC CGG ACG GAA CTG GAG AAC CGG 528 Lys Leu Asn Gln Gln His Gln Thr Asp Arg Thr Glu Leu Glu Asn Arg CTG AAG GAC TTA TAC ACC GCA GAG TGT GAG AAG CTT CAG AGC ATT TAC 576 Leu Lys Asp Leu Tyr Thr Ala Glu Cys Glu Lys Leu Gln Ser Ile Tyr ATT GAG GAG GCA GAA AAA TAT AAA ACT CAA CTG CAA GAG CAG TTT GAC 624 Ile Glu Glu Ala Glu Lys Tyr Lys Thr Gln Leu Gln Glu Gln Phe Asp AAC TTA AAC GCC GCC CAT GAG ACC ACT AAG CTT GAG ATT GAA GCT AGC 672 Asn Leu Asn Ala Ala His Glu Thr Thr Lys Leu Glu Ile Glu Ala Ser CAC TCG GAG AAG GTG GAA TTG CTG AAG AAG ACC TAT GAA ACC TCC CTT 720 His Ser Glu Lys Val Glu Leu Leu Lys Lys Thr Tyr Glu Thr Ser Leu

<Desc/Clms Page number 31>

TCA GAA ATC AAG AAG AGC CAT GAG ATG GAG AAG AAG TCA CTG GAG GAT 768 Ser Glu Ile Lys Lys Ser His Glu Met Glu Lys Lys Ser Leu Glu Asp CTG CTT AAT GAG AAG CAG GAA TCG CTG GAG AAA CAA ATC AAT GAT CTG 816 Leu Leu Asn Glu Lys Gln Glu Ser Leu Glu Lys Gln Ile Asn Asp Leu AAG AGT GAA AAC GAT GCT TTA AAC GAA AGG TTG AAA TCA GAG GAG CAA 864 Lys Ser Glu Asn Asp Ala Leu Asn Glu Arg Leu Lys Ser Glu Glu Gln AAG CAA CTG TCA AGA GAG AAG GCG AAT TCC AAA AAC CCT CAG GTC ATG 912 Lys Gln Leu Ser Arg Glu Lys Ala Asn Ser Lys Asn Pro Gln Val Met TAT CTG GAG CAA GAA CTA GAA AGC CTG AAG GCT GTG TTA GAG ATC AAG 960 Tyr Leu Glu Gln Glu Leu Glu Ser Leu Lys Ala Val Leu Glu Ile Lys AAT GAG AAG CTG CAC CAG CAG GAC ATG AAG CTA ATG AAG ATG GAA AAG 1008 Asn Glu Lys Leu His Gln Gln Asp Met Lys Leu Met Lys Met Glu Lys CTG GTG GAC AAT AAC ACA GCA TTG GTT GAC AAG CTG AAG CGA TTC CAG 1056 Leu Val Asp Asn Asn Thr Ala Leu Val Asp Lys Leu Lys Arg Phe Gln CAG GAA AAC GAG GAG TTA AAA GCT CGC ATG GAC AAA CAC ATG GCA ATT 1104 Gln Glu Asn Glu Glu Leu Lys Ala Arg Met Asp Lys His Met Ala Ile TCA AGG CAA CTT TCC ACC GAG CAG GCC GCG CTG CAA GAG TCC CTT GAG 1152 Ser Arg Gln Leu Ser Thr Glu Gln Ala Ala Leu Gln Glu Ser Leu Glu AAG GAG TCA AAG GTC AAC AAG AGA CTG TCC ATG GAG AAC GAG GAA CTT 1200 Lys Glu Ser Lys Val Asn Lys Arg Leu Ser Met Glu Asn Glu Glu Leu CTG TGG AAA CTG CAC AAC GGA GAC CTG TGC AGC CCC AAG AGA TCC CCC 1248 Leu Trp Lys Leu His Asn Gly Asp Leu Cys Ser Pro Lys Arg Ser Pro ACC TCC TCG GCC ATC CCT TTC CAG TCC CCC AGG AAT TCT GGT TCC TTC 1296 Thr Ser Ser Ala Ile Pro Phe Gln Ser Pro Arg Asn Ser Gly Ser Phe TCC AGC CCC AGC ATC TCA CCC AGA TG A 1323 Ser Ser Pro Ser Ile Ser Pro Arg (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : acides aminés (B) TYPE : aminé (D) CONFIGURATION : (ii) TYPE DE MOLECULE : (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4 : Met Leu Leu Ser Pro Lys Phe Ser Leu Ser Thr Ile His Val Arg Leu @

<Desc/Clms Page number 32>

Thr Ala Lys Gly Leu Leu Arg Asn Leu Arg Leu Pro Ser Gly Leu Arg
20 25 30 Lys Asn Thr Val Ile Phe His Thr Val Glu Lys Gly Arg Gln Lys Asn
35 40 45 Pro Arg Ser Leu Cys Ile Gln Thr Gln Thr Ala Pro Asp Val Leu Ser
50 55 60 Ser Glu Arg Thr Leu Glu Leu Ala Gln Tyr Lys Thr Lys Cys Glu Ser
65 70 75 80 Gln Ser Gly Phe Ile Leu His Leu Arg Gln Leu Leu Ser Arg Gly Asn
85 90 95 Asn Lys Phe Glu Ala Leu Thr Val Val Ile Gln His Leu Leu Ser Glu
100 105 110 Arg Glu Glu Ala Leu Lys Gln His Lys Thr Leu Ser Gln Glu Leu Val
115 120 125 Ser Leu Arg Gly Glu Leu Val Ala Ala Ser Ser Ala Cys Glu Lys Leu
130 135 140 Glu Lys Ala Arg Ala Asp Leu Gln Thr Ala Tyr Gln Glu Phe Val Gln 145 150 155 160 Lys Leu Asn Gln Gln His Gln Thr Asp Arg Thr Glu Leu Glu Asn Arg
165 170 175 Leu Lys Asp Leu Tyr Thr Ala Glu Cys Glu Lys Leu Gln Ser Ile Tyr
180 185 190 Ile Glu Glu Ala Glu Lys Tyr Lys Thr Gln Leu Gln Glu Gln Phe Asp
195 200 205 Asn Leu Asn Ala Ala His Glu Thr Thr Lys Leu Glu Ile Glu Ala Ser
210 215 220 His Ser Glu Lys Val Glu Leu Leu Lys Lys Thr Tyr Glu Thr Ser Leu 225 230 235 240 Ser Glu Ile Lys Lys Ser His Glu Met Glu Lys Lys Ser Leu Glu Asp
245 250 255 Leu Leu Asn Glu Lys Gln Glu Ser Leu Glu Lys Gln Ile Asn Asp Leu
260 265 270 Lys Ser Glu Asn Asp Ala Leu Asn Glu Arg Leu Lys Ser Glu Glu Gln
275 280 285 Lys Gln Leu Ser Arg Glu Lys Ala Asn Ser Lys Asn Pro Gln Val Met 290 295 300

<Desc/Clms Page number 33>

Tyr Leu Glu Gln Glu Leu Glu Ser Leu Lys Ala Val Leu Glu Ile Lys 305 310 315 320 Asn Glu Lys Leu His Gln Gln Asp Met Lys Leu Met Lys Met Glu Lys
325 330 335 Leu Val Asp Asn Asn Thr Ala Leu Val Asp Lys Leu Lys Arg Phe Gln
340 345 350 Gln Glu Asn Glu Glu Leu Lys Ala Arg Met Asp Lys His Met Ala Ile
355 360 365 Ser Arg Gln Leu Ser Thr Glu Gln Ala Ala Leu Gln Glu Ser Leu Glu
370 375 380 Lys Glu Ser Lys Val Asn Lys Arg Leu Ser Met Glu Asn Glu Glu Leu 385 390 395 400 Leu Trp Lys Leu His Asn Gly Asp Leu Cys Ser Pro Lys Arg Ser Pro
405 410 415 Thr Ser Ser Ala Ile Pro Phe Gln Ser Pro Arg Asn Ser Gly Ser Phe
420 425 430 Ser Ser Pro Ser Ile Ser Pro Arg
435 440 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 354 paires de bases (B) TYPE : (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE : (B) EMPLACEMENT:1..354 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5: CAT CAG ACA GAC CGG ACG GAA CTG GAG AAC CGG CTG AAG GAC TTA TAC His Gln Thr Asp Arg Thr Glu Leu Glu Asn Arg Leu Lys Asp Leu Tyr ACC GCA GAG TGT GAG AAG CTT CAG AGC ATT TAC ATT GAG GAG GCA GAA Thr Ala Glu Cys Glu Lys Leu Gln Ser Ile Tyr Ile Glu Glu Ala Glu AAA TAT AAA ACT CAA CTG CAA GAG CAG TTT GAC AAC TTA AAC GCC GCC Lys Tyr Lys Thr Gln Leu Gln Glu Gln Phe Asp Asn Leu Asn Ala Ala

<Desc/Clms Page number 34>

CAT GAG ACC ACT AAG CTT GAG ATT GAA GCT AGC CAC TCG GAG AAG GTG 192 His Glu Thr Thr Lys Leu Glu Ile Glu Ala Ser His Ser Glu Lys Val GAA TTG CTG AAG AAG ACC TAT GAA ACC TCC CTT TCA GAA ATC AAG AAG 240 Glu Leu Leu Lys Lys Thr Tyr Glu Thr Ser Leu Ser Glu Ile Lys Lys AGC CAT GAG ATG GAG AAG AAG TCA CTG GAG GAT CTG CTT AAT GAG AAG 288 Ser His Glu Met Glu Lys Lys Ser Leu Glu Asp Leu Leu Asn Glu Lys CAG GAA TCG CTG GAG AAA CAA ATC AAT GAT CTG AAG AGT GAA AAC GAT 336 Gln Glu Ser Leu Glu Lys Gln Ile Asn Asp Leu Lys Ser Glu Asn Asp GCT TTA AAC GAA AGG TTG 354 Ala Leu Asn Glu Arg Leu (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : acides aminés (B) TYPE : aminé (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6 : His Gln Thr Asp Arg Thr Glu Leu Glu Asn Arg Leu Lys Asp Leu Tyr 1 5 10 15 Thr Ala Glu Cys Glu Lys Leu Gln Ser Ile Tyr Ile Glu Glu Ala Glu
20 25 30 Lys Tyr Lys Thr Gln Leu Gln Glu Gln Phe Asp Asn Leu Asn Ala Ala
35 40 45 His Glu Thr Thr Lys Leu Glu Ile Glu Ala Ser His Ser Glu Lys Val
50 55 60 Glu Leu Leu Lys Lys Thr Tyr Glu Thr Ser Leu Ser Glu Ile Lys Lys
65 70 75 80 Ser His Glu Met Glu Lys Lys Ser Leu Glu Asp Leu Leu Asn Glu Lys
85 90 95 Gln Glu Ser Leu Glu Lys Gln Ile Asn Asp Leu Lys Ser Glu Asn Asp
100 105 110 Ala Leu Asn Glu Arg Leu
115 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 7 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 3742 paires de bases (B) TYPE: nucléotide

<Desc/Clms Page number 35>

(C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : linéaire(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ix) CARACTERISTIQUE: (A) NOM/CLE : (B) EMPLACEMENT:293..1600 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7 : CAGTGTGATG TGGTTCAGAG GCAGCTTCTA GACCTGCAGG AGGGAGATTG TATTCAGAGG 60 AAGAGCATCA TTTTGGCAAC ATCTGAAAGT GAAAACGGAA GCCAGAAACA CTTGGCCAGC 120 CCTGGGGGAT TTTTTTCTTC TATGCCTCTG TGGTGGAATG ACATTTGCTG TGTAGGCATC 180 TTTCCTCTGA CTGTATTTCT TGGCCTTGAA GAGTACTGAG TTTAAAAAGA CAGTATGTGA 240 CAGTCCATGG AAATTGCCTC TTCTGTGAAA TCTCGCCACC TGCTCCGAAG AC ATG 295
Met TTG TTG TCT CCC AAA TTC TCC TTA TCC ACC ATT CAC ATA CGA CTG ACG 343 Leu Leu Ser Pro Lys Phe Ser Leu Ser Thr Ile His Ile Arg Leu Thr GCC AAA GGA TTG CTT CGA AAC CTT CGA CTT CCT TCA GGG TTT AGG AGA 391 Ala Lys Gly Leu Leu Arg Asn Leu Arg Leu Pro Ser Gly Phe Arg Arg AGC ACT GTT GTT TTC CAC ACA GTT GAA AAG AGC AGG CAA AAG AAT CCT 439 Ser Thr Val Val Phe His Thr Val Glu Lys Ser Arg Gln Lys Asn Pro CGA AGC TTA TGT ATC CAG CCA CAG ACA GCT CCC GAT GCG CTG CCC CCT 487 Arg Ser Leu Cys Ile Gln Pro Gln Thr Ala Pro Asp Ala Leu Pro Pro GAG AAA ACA CTT GAA TTG ACG CAA TAT AAA ACA AAA TGT GAA AAC CAA 535 Glu Lys Thr Leu Glu Leu Thr Gln Tyr Lys Thr Lys Cys Glu Asn Gln AGT GGA TTT ATC CTG CAG CTC AAG CAG CTT CTT GCC TGT GGT AAT ACC 583 Ser Gly Phe Ile Leu Gln Leu Lys Gln Leu Leu Ala Cys Gly Asn Thr AAG TTT GAG GCA TTG ACA GTT GTG ATT CAG CAC CTG CTG TCT GAG CGG 631 Lys Phe Glu Ala Leu Thr Val Val Ile Gln His Leu Leu Ser Glu Arg GAG GAA GCA CTG AAA CAA CAC AAA ACC CTA TCT CAA GAA CTT GTT AAC 679 Glu Glu Ala Leu Lys Gln His Lys Thr Leu Ser Gln Glu Leu Val Asn CTC CGG GGA GAG CTA GTC ACT GCT TCA ACC ACC TGT GAG AAA TTA GAA 727 Leu Arg Gly Glu Leu Val Thr Ala Ser Thr Thr Cys Glu Lys Leu Glu AAA GCC AGG AAT GAG TTA CAA ACA GTG TAT GAA GCA TTC GTC CAG CAG 775 Lys Ala Arg Asn Glu Leu Gln Thr Val Tyr Glu Ala Phe Val Gln Gln

<Desc/Clms Page number 36>

CAC CAG GCT GAA AAA ACA GAA CGA GAG AAT CGG CTT AAA GAG TTT TAC 823 His Gln Ala Glu Lys Thr Glu Arg Glu Asn Arg Leu Lys Glu Phe Tyr ACC AGG GAG TAT GAA AAG CTT CGG GAC ACT TAC ATT GAA GAA GCA GAG 871 Thr Arg Glu Tyr Glu Lys Leu Arg Asp Thr Tyr Ile Glu Glu Ala Glu AAG TAC AAA ATG CAA TTG CAA GAG CAG TTT GAC AAC TTA AAT GCG CAT 919 Lys Tyr Lys Met Gln Leu Gln Glu Gln Phe Asp Asn Leu Asn Ala His GAA ACC TCT AAG TTG GAA ATT GAA GCT AGC CAC TCA GAG AAA CTT GAA 967 Glu Thr Ser Lys Leu Glu Ile Glu Ala Ser His Ser Glu Lys Leu Glu TTG CTA AAG AAG GCC TAT GAA GCC TCC CTT TCA GAA ATT AAG AAA GGC 1015 Leu Leu Lys Lys Ala Tyr Glu Ala Ser Leu Ser Glu Ile Lys Lys Gly CAT GAA ATA GAA AAG AAA TCG CTT GAA GAT TTA CTT TCT GAG AAG CAG 1063 His Glu Ile Glu Lys Lys Ser Leu Glu Asp Leu Leu Ser Glu Lys Gln GAA TCG CTA GAG AAG CAA ATC AAT GAT CTG AAG AGT GAA AAT GAT GCT 1111 Glu Ser Leu Glu Lys Gln Ile Asn Asp Leu Lys Ser Glu Asn Asp Ala TTA AAT GAA AAA TTG AAA TCA GAA GAA CAA AAA AGA AGA GCA AGA GAA 1159 Leu Asn Glu Lys Leu Lys Ser Glu Glu Gln Lys Arg Arg Ala Arg Glu AAA GCA AAT TTG AAA AAT CCT CAG ATC ATG TAT CTA GAA CAG GAG TTA 1207 Lys Ala Asn Leu Lys Asn Pro Gln Ile Met Tyr Leu Glu Gln Glu Leu GAA AGC CTG AAA GCT GTG TTA GAG ATC AAG AAT GAG AAA CTG CAT CAA 1255 Glu Ser Leu Lys Ala Val Leu Glu Ile Lys Asn Glu Lys Leu His Gln CAG GAC ATC AAG TTA ATG AAA ATG GAG AAA CTG GTG GAC AAC AAC ACA 1303 Gln Asp Ile Lys Leu Met Lys Met Glu Lys Leu Val Asp Asn Asn Thr GCA TTG GTT GAC AAA TTG AAG CGT TTC CAG CAG GAG AAT GAA GAA TTG 1351 Ala Leu Val Asp Lys Leu Lys Arg Phe Gln Gln Glu Asn Glu Glu Leu AAA GCT CGG ATG GAC AAG CAC ATG GCA ATC TCA AGG CAG CTT TCC ACG 1399 Lys Ala Arg Met Asp Lys His Met Ala Ile Ser Arg Gln Leu Ser Thr GAG CAG GCT GTT CTG CAA GAG TCG CTG GAG AAG GAG TCG AAA GTC AAC 1447 Glu Gln Ala Val Leu Gln Glu Ser Leu Glu Lys Glu Ser Lys Val Asn AAG CGA CTC TCT ATG GAA AAC GAG GAG CTT CTG TGG AAA CTG CAC AAT 1495 Lys Arg Leu Ser Met Glu Asn Glu Glu Leu Leu Trp Lys Leu His Asn GGG GAC CTG TGT AGC CCC AAG AGA TCC CCC ACA TCC TCC GCC ATC CCT 1543 Gly Asp Leu Cys Ser Pro Lys Arg Ser Pro Thr Ser Ser Ala Ile Pro TTG CAG TCA CCA AGG AAT TCG GGC TCC TTC CCT AGC CCC AGC ATT TCA 1591 Leu Gln Ser Pro Arg Asn Ser Gly Ser Phe Pro Ser Pro Ser Ile Ser CCC AGA TGA CACGTCCCCA AAGTCCACAG ACTCTCTGAA AGCATTTTGA 1640 Pro Arg * TGCAGGTCTG CAGGACTGAC CCCAAGGAGG AACGTGGGCA CAAGAGGTAT ATCAGCACAC 1700

<Desc/Clms Page number 37>

GTGTGATCAC CGTAGGTAAC TGGAGCGTCA CCACCGGCGG AATCGAGCTT CTGAGACTGG 1760 AAGTCTGGAG GAAGACTTTT GCCTCCGTCC AAAAGATTCC TCCAAAAAAA GATTTAAAAA 1820 AAGATTTCGG CATCGACACG GACGTTGTTG CACAAAGCAC TTAAAGAACG AGAGCATCTT 1880 GTTCATTGCC TTTTTCACCT AAGCATAAGG GGAAAAACTC TCAGGGCCCT ATTAAGATTT 1940 ATAACCTTTG TAATGTTCTT CACCACAGAC ACCTTCTTGT GAGTTTTCAG TCTGACTGTG 2000 GGGGTGGGGG GTGTGAATGA AATGGATGTC ACAGAGTGTC ATGTGTCTGA TGCAGCCTCC 2060 TCTGCTGTGT ATTAAATGTC AAAATCTGAA TATATCTGGA TATGTACTAA TCAAATAATA 2120 ATCAATCAAT CAGCATATAC ATTTCAGCCA AAGCCATAGA AGAAAAAGCA ATAGTTGCTT 2180 GAATTATGAT CATCTACCAC CAACTCTGCT CAGCCCTGTA ACAGGGTAGG GAGAGGGTAT 2240 AACAGGAAGA GCTTTGACTT GTCCCTGTCT ATACATTCTC TGTATCTTTT GGGGGTAACT 2300 TCTTGGCAGT TTTTCAGTGT TCAGCCATGT CAGTTGAAAC TAGATTTTTC TGTAGATTTT 2360 TTACTTACCC ATGTGAGCCT AACACTATCC TGTAATTCAT TTTCTCAGGC TATGTGTAAA 2420 TGTAGAACCC TAATTTTTCT ATAAAAAAAC AAACTAACTA ACTGTGTAAA GAAAGAAAAA 2480 GGGAAGTACC AATGGGTTTT TCCACCTTAT TTTTACCTTT GATCTACCCT TGCAGATTTA 2540 ACCTGTCTTC TTCCCTCCCA TTATTCTCAT TTTCCTTTTA CCTTTCTCCA CCATCCAGAG 2600 CCACAAAAGC AAACCTTCTA CCTCCTACCT ACTTTTCTCT GGGACAAGGA TAAAGGAATA 2660 TGATTTTCCA GAGCCCCAGA GCCAGCTCAT CTTCCAGGTG CTGAAACCAC TTTCCAAATA 2720 AACTAAAGCC TGGATTTGAT ATTACAAATT TTGGGAAATC TTAGAATAAA GAACGAGAAC 2780 AAGGAAGTCA TTGGCTAGTA TAATTAAGAA AGGTAGGATT CAGTGCTTAC CGATGATGCA 2840 GTACTTGATA GAAGAAAACA GTCTGGGAGG ATAGCGCTCA TTTTTCAGTT ACCCTTTAAG 2900 GAGTCCCTTT GTCTTTGGGA AAGTAGCAGA ATGGTCCGCT TCTTTCCCAT GAGTGGAAAA 2960 TGTGGCTTGT CCAACTCTCC TCCAGGTTGC ATTTCAGTTT CTTTCCAAAA CTTATTACCT 3020 CCCCTAATCC TGAGACTTTG GAAAAGGTGG AAGGAAGAAC TGTTGCTTTA TCTCCCCCTC 3080 CCTGCATGTG TCAACATTGT GATGTCAGTA TTTACTAATC TACATTCAGT GGCTGTACAA 3140 ATAACAGCTG TAGTAAGAAG AGATTCAGGA TGCTAGAGGT GAATATTTGG GTCATTTACA 3200 TGTACACTAC ATAGCAAGTT GATACTCATG TTGCATGTTC TTTTAAATTA GTGATTTTGT 3260 GTCTTAAGTC TTTAACTTCC AATACTTCAT CATGTATGTA ACCTTCCATG TTTGCTTCTG 3320

<Desc/Clms Page number 38>

ATAAATGGAA ATGTAGGTTC ACTGCCACTT CATGAGATAT CTCTGCTCAC GCTTCCAAGT 3380 TGTTCTCAAT GACATTAGCC AAAGTTGGGT TTGCCATTCA TCCCCTAGGC ATGGTAAATC 3440 TTGTGTTGTT CCCTGCTGTC CTCCGTATTA CGTGACCGGC AAATAAATCT CATAGCAGTT 3500 AATATAAAAC ATCTTTGGAG GATGGGAGAG AACAGGAGGG AAGATGGGAA ACAAAATAGA 3560 GAATTCTTAA GATTTTGTTT AAACCAAATG TTTCATGTAG AATGCAAAAT GTTGGCACGT 3620 CAAAAATATG AATGTGTAGA CAACTGTAGT TGTGCTCAGT TTGTAGTGAT GGGAAGTGTA 3680 TTTTACTCTG ATCAAATAAA TAATGCTGGA ATACTCAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 3740 AA 3742 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : acides aminés (B) TYPE : aminé (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE : (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8 : Met Leu Leu Ser Pro Lys Phe Ser Leu Ser Thr Ile His Ile Arg Leu 1 5 10 15 Thr Ala Lys Gly Leu Leu Arg Asn Leu Arg Leu Pro Ser Gly Phe Arg
20 25 30 Arg Ser Thr Val Val Phe His Thr Val Glu Lys Ser Arg Gln Lys Asn
35 40 45 Pro Arg Ser Leu Cys Ile Gln Pro Gln Thr Ala Pro Asp Ala Leu Pro
50 55 60 Pro Glu Lys Thr Leu Glu Leu Thr Gln Tyr Lys Thr Lys Cys Glu Asn
65 70 75 80 Gln Ser Gly Phe Ile Leu Gln Leu Lys Gln Leu Leu Ala Cys Gly Asn
85 90 95 Thr Lys Phe Glu Ala Leu Thr Val Val Ile Gln His Leu Leu Ser Glu
100 105 110 Arg Glu Glu Ala Leu Lys Gln His Lys Thr Leu Ser Gln Glu Leu Val
115 120 125 Asn Leu Arg Gly Glu Leu Val Thr Ala Ser Thr Thr Cys Glu Lys Leu
130 135 140

<Desc/Clms Page number 39>

Glu Lys Ala Arg Asn Glu Leu Gln Thr Val Tyr Glu Ala Phe Val Gln 145 150 155 160 Gln His Gln Ala Glu Lys Thr Glu Arg Glu Asn Arg Leu Lys Glu Phe
165 170 175 Tyr Thr Arg Glu Tyr Glu Lys Leu Arg Asp Thr Tyr Ile Glu Glu Ala
180 185 190 Glu Lys Tyr Lys Met Gln Leu Gln Glu Gln Phe Asp Asn Leu Asn Ala
195 200 205 His Glu Thr Ser Lys Leu Glu Ile Glu Ala Ser His Ser Glu Lys Leu
210 215 220 Glu Leu Leu Lys Lys Ala Tyr Glu Ala Ser Leu Ser Glu Ile Lys Lys 225 230 235 240 Gly His Glu Ile Glu Lys Lys Ser Leu Glu Asp Leu Leu Ser Glu Lys
245 250 255 Gln Glu Ser Leu Glu Lys Gln Ile Asn Asp Leu Lys Ser Glu Asn Asp
260 265 270 Ala Leu Asn Glu Lys Leu Lys Ser Glu Glu Gln Lys Arg Arg Ala Arg
275 280 285 Glu Lys Ala Asn Leu Lys Asn Pro Gln Ile Met Tyr Leu Glu Gln Glu
290 295 300 Leu Glu Ser Leu Lys Ala Val Leu Glu Ile Lys Asn Glu Lys Leu His 305 310 315 320 Gln Gln Asp Ile Lys Leu Met Lys Met Glu Lys Leu Val Asp Asn Asn
325 330 335 Thr Ala Leu Val Asp Lys Leu Lys Arg Phe Gln Gln Glu Asn Glu Glu
340 345 350 Leu Lys Ala Arg Met Asp Lys His Met Ala Ile Ser Arg Gln Leu Ser
355 360 365 Thr Glu Gln Ala Val Leu Gln Glu Ser Leu Glu Lys Glu Ser Lys Val
370 375 380 Asn Lys Arg Leu Ser Met Glu Asn Glu Glu Leu Leu Trp Lys Leu His 385 390 395 400 Asn Gly Asp Leu Cys Ser Pro Lys Arg Ser Pro Thr Ser Ser Ala Ile
405 410 415 Pro Leu Gln Ser Pro Arg Asn Ser Gly Ser Phe Pro Ser Pro Ser Ile
420 425 430

<Desc/Clms Page number 40>

Ser Pro Arg *
435 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 9: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 1308 paires de bases (B) TYPE : (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9 : ATGTTGTTGT CTCCCAAATT CTCCTTATCC ACCATTCACA TACGACTGAC GGCCAAAGGA 60 TTGCTTCGAA ACCTTCGACT TCCTTCAGGG TTTAGGAGAA GCACTGTTGT TTTCCACACA 120 GTTGAAAAGA GCAGGCAAAA GAATCCTCGA AGCTTATGTA TCCAGCCACA GACAGCTCCC 180 GATGCGCTGC CCCCTGAGAA AACACTTGAA TTGACGCAAT ATAAAACAAA ATGTGAAAAC 240 CAAAGTGGAT TTATCCTGCA GCTCAAGCAG CTTCTTGCCT GTGGTAATAC CAAGTTTGAG 300 GCATTGACAG TTGTGATTCA GCACCTGCTG TCTGAGCGGG AGGAAGCACT GAAACAACAC 360 AAAACCCTAT CTCAAGAACT TGTTAACCTC CGGGGAGAGC TAGTCACTGC TTCAACCACC 420 TGTGAGAAAT TAGAAAAAGC CAGGAATGAG TTACAAACAG TGTATGAAGC ATTCGTCCAG 480 CAGCACCAGG CTGAAAAAAC AGAACGAGAG AATCGGCTTA AAGAGTTTTA CACCAGGGAG 540 TATGAAAAGC TTCGGGACAC TTACATTGAA GAAGCAGAGA AGTACAAAAT GCAATTGCAA 600 GAGCAGTTTG ACAACTTAAA TGCGCATGAA ACCTCTAAGT TGGAAATTGA AGCTAGCCAC 660 TCAGAGAAAC TTGAATTGCT AAAGAAGGCC TATGAAGCCT CCCTTTCAGA AATTAAGAAA 720 GGCCATGAAA TAGAAAAGAA ATCGCTTGAA GATTTACTTT CTGAGAAGCA GGAATCGCTA 780 GAGAAGCAAA TCAATGATCT GAAGAGTGAA AATGATGCTT TAAATGAAAA ATTGAAATCA 840 GAAGAACAAA AAAGAAGAGC AAGAGAAAAA GCAAATTTGA AAAATCCTCA GATCATGTAT 900 CTAGAACAGG AGTTAGAAAG CCTGAAAGCT GTGTTAGAGA TCAAGAATGA GAAACTGCAT 960 CAACAGGACA TCAAGTTAAT GAAAATGGAG AAACTGGTGG ACAACAACAC AGCATTGGTT 1020 GACAAATTGA AGCGTTTCCA GCAGGAGAAT GAAGAATTGA AAGCTCGGAT GGACAAGCAC 1080 ATGGCAATCT CAAGGCAGCT TTCCACGGAG CAGGCTGTTC TGCAAGAGTC GCTGGAGAAG 1140

<Desc/Clms Page number 41>

GAGTCGAAAG TCAACAAGCG ACTCTCTATG GAAAACGAGG AGCTTCTGTG GAAACTGCAC 1200 AATGGGGACC TGTGTAGCCC CAAGAGATCC CCCACATCCT CCGCCATCCC TTTGCAGTCA 1260 CCAAGGAATT CGGGCTCCTT CCCTAGCCCC AGCATTTCAC CCAGATGA 1308 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 10 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10 : CAAGCGTTCT CTCGGAGGAC A 21 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 11: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE : (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11: CGCGGATCCC AGACAGACCG GACGGAACTG GAG 33 (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 12 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR : paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS : (D) CONFIGURATION : (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 12 : CCGGAATTCA CTACAACCTT TCGTTTAAAG CATC 34

Claims (20)

REVENDICATIONS

1 ) Fragment d'acides nucléiques isolé, codant pour une protéine apte à se lier au récepteur AT2, lequel fragment est sélectionné dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO:1, 3, 5, 7 et 9.

2 ) Fragment d'une des séquences selon la revendication 1, utile comme sondes ou comme amorces, pour la détection des séquences SEQ ID NO:1,3,5,7 ou 9.

3 ) Fragment selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comprend au moins 20 pb incluses dans les séquences SEQ ID NO:1, 3, 5, 7 ou 9.

4 ) Fragment selon la revendication 2 ou la revendication 3, caractérisé en ce qu'il est sélectionné dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:llet SEQ ID NO:12.

5 ) Transcrits, caractérisés en ce qu'ils sont complémentaires des séquences selon la revendication 1.

6 ) Protéine purifiée et isolée, apte à interagir avec le récepteur AT2, sélectionnée dans le groupe constitué par les séquences SEQ ID NO:2, 4,6 ou 8, laquelle protéine est dénommée ATIP.

7 ) Produit de traduction, caractérisé en ce qu'il est codé par une séquence nucléotidique selon la revendication 1.

8 ) Anticorps, caractérisés en ce qu'ils sont dirigés contre une protéine ou un fragment de protéine selon la revendication 6 ou la revendication 7.

9 ) Vecteur recombinant de clonage et/ou d'expression, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique selon la revendication 1.

10 ) Cellule hôte transformée, caractérisée en ce qu'elle comprend un vecteur selon la revendication 9.

11 ) Cellules hôtes transformées, caractérisées en ce qu'elles sont constituées par une souche de levure convenable co-transformée avec au

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moins deux vecteurs qui codent respectivement (i) pour une protéine dite appât sélectionnée dans le groupe constitué par un fragment contenant au moins la SEQ ID NO:5 de la protéine ATIP selon la revendication 6 ou la revendication 7 et un fragment contenant au moins l'extrémité C-terminale du récepteur AT2, laquelle protéine appât est fusionnée à une protéine sélectionnée dans le groupe constitué par le domaine de liaison à l'ADN d'un facteur de transcription et le domaine d'activation du même facteur de transcription et (ii) pour une protéine dite proie, sélectionnée dans le groupe constitué par un fragment contenant au moins la SEQ ID NO:5 de la protéine ATIP selon la revendication 6 ou la revendication 7, un fragment contenant au moins l'extrémité C-terminale du récepteur AT2 et tout autre polypeptide correspondant à une séquence contenue dans une banque d'ADNc, laquelle protéine proie est fusionnée à une protéine sélectionnée dans le groupe constitué par le domaine de liaison à l'ADN d'un facteur de transcription et le domaine d'activation du même facteur de transcription, lesquels vecteurs comportent en outre des marqueurs de sélection.

12 ) Cellule hôte transformée selon la revendication 11, caractérisée en ce qu'elle est constituée par une souche de levure convenable cotransformée avec trois vecteurs qui codent respectivement pour (i) un appât correspondant à un fragment contenant l'extrémité C-terminale du récepteur AT2 fusionné à une protéine sélectionnée dans le groupe constitué par le domaine de liaison à l'ADN d'un facteur de transcription et le domaine d'activation dudit facteur de transcription, (ii) un fragment contenant au moins la SEQ ID NO:5 de la protéine ATIP selon la revendication 6 ou la revendication 7, fusionné à une protéine sélectionnée dans le groupe constitué par le domaine de liaison à l'ADN d'un facteur de transcription et le domaine d'activation dudit facteur de transcription et (iii) un polypeptide correspondant à une séquence contenue dans une banque d'ADNc, lesquels vecteurs comportent en outre des marqueurs de sélection.

13 ) Cellule hôte transformée selon la revendication 11, carac-

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térisée en ce qu'elle est constituée par une souche de levure convenable cotransformée avec deux vecteurs qui codent respectivement pour (i) un fragment contenant au moins la séquence SEQ ID NO:5 de la protéine ATIP selon la revendication 6 ou la revendication 7, fusionné à une protéine sélectionnée dans le groupe constitué par le domaine de liaison à l'ADN d'un facteur de transcription et le domaine d'activation dudit facteur de transcription et (ii) un polypeptide correspondant à une séquence contenue dans une banque d'ADNc, fusionné à une protéine sélectionnée dans le groupe constitué par le domaine de liaison à l'ADN d'un facteur de transcription et le domaine d'activation dudit facteur de transcription, lesquels vecteurs comportent en outre des marqueurs de sélection.

14 ) Cellule hôte transformée selon la revendication 11, caractérisée en ce qu'elle est constituée par une souche de levure convenable cotransformée avec deux vecteurs, à savoir (i) un vecteur codant pour un fragment contenant au moins la séquence SEQ ID NO:5 de la protéine ATIP selon la revendication 6 mutée ou non, fusionné à une protéine sélectionnée dans le groupe constitué par le domaine de liaison à l'ADN d'un facteur de transcription et le domaine d'activation dudit facteur de transcription et (ii) un vecteur codant pour un fragment contenant l'extrémité C-terminale du récepteur AT2 muté ou non, fusionné à une protéine sélectionnée dans le groupe constitué par le domaine de liaison à l'ADN d'un facteur de transcription et le domaine d'activation dudit facteur de transcription, lesquels vecteurs comportent en outre des marqueurs de sélection,, l'un des deux vecteurs codant obligatoirement pour une protéine mutée.

15 ) Méthode de sélection de protéines inhibitrices de l'interaction protéine ATIP selon la revendication 6 ou la revendication 7récepteur AT2, laquelle méthode comprend : (a) la co-transformation d'une souche de levure convenable avec trois vecteurs qui codent respectivement pour (i) un appât correspondant à un fragment contenant l'extrémité C-terminale du récepteur AT2 fusionné à

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une protéine sélectionnée dans le groupe constitué par le domaine de liaison à l'ADN d'un facteur de transcription et le domaine d'activation dudit facteur de transcription, (ii) un fragment contenant au moins la SEQ ID NO:5 de la protéine ATIP selon la revendication 6 ou la revendication 7, fusionné à une protéine sélectionnée dans le groupe constitué par le domaine de liaison à l'ADN d'un facteur de transcription et le domaine d'activation dudit facteur de transcription et (iii) un polypeptide correspondant à une séquence contenue dans une banque d'ADNc, lesquels vecteurs comportent en outre des marqueurs de sélection, (b) la sélection des clones de la banque d'ADNc exprimant un polypeptide inhibant l'interaction récepteur AT2-protéine ATIP selon la revendication 6 ou la revendication 7, sur un milieu sélectif approprié et (c) l'identification dudit polypeptide.

16 ) Méthode de criblage de polypeptides interagissant avec la protéine ATIP selon la revendication 6 ou la revendication 7, laquelle méthode comprend : (a) la co-transformation d'une souche de levure convenable avec deux vecteurs tels que définis ci-dessus, à savoir qui codent respectivement pour (i) un fragment contenant au moins la SEQ ID NO:5 de la protéine ATIP selon la revendication 6 ou la revendication 7, fusionné à une protéine sélectionnée dans le groupe constitué par le domaine de liaison à l'ADN d'un facteur de transcription et le domaine d'activation dudit facteur de transcription, et (ii) un polypeptide correspondant à une séquence contenue dans une banque d'ADNc, fusionné à une protéine sélectionnée dans le groupe constitué par le domaine de liaison à l'ADN d'un facteur de transcription et le domaine d'activation dudit facteur de transcription, lesquels vecteurs comportent en outre des marqueurs de sélection, et (b) la sélection des clones exprimant un polypeptide interagissant avec la protéine ATIP selon la revendication 6 ou la revendication 7, sur un milieu sélectif convenable.

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17 ) Méthode de caractérisation des domaines impliqués dans l'interaction protéine ATIP-récepteur AT2, caractérisée en ce qu'elle comprend : (a) la co-transformation d'une souche de levure convenable avec deux vecteurs, à savoir (i) un vecteur codant pour un fragment contenant au moins la SEQ ID NO:5 de la protéine ATIP selon la revendication 6 mutée ou non, fusionné à une protéine sélectionnée dans le groupe constitué par le domaine de liaison à l'ADN d'un facteur de transcription et le domaine d'activation dudit facteur de transcription et (ii) un vecteur codant pour un fragment contenant l'extrémité C-terminale du récepteur AT2 muté ou non, fusionné à une protéine sélectionnée dans le groupe constitué par le domaine de liaison à l'ADN d'un facteur de transcription et le domaine d'activation dudit facteur de transcription, lesquels vecteurs comportent en outre des marqueurs de sélection, l'un des deux vecteurs codant obligatoirement pour une protéine mutée et (b) la visualisation, par sélection sur un milieu sélectif convenable, de la perte éventuelle de l'interaction protéine ATIP selon la revendication 6 ou selon la revendication 7-récepteur AT2.

18 ) Méthode de sélection de substances aptes à influencer l'interaction protéine ATIP selon la revendication 6 ou la revendication 7récepteur AT2, laquelle méthode comprend : (a) la mise en contact de la protéine ATIP selon la revendication 6 ou la revendication 7, fixée sur un support avec une protéine de fusion récepteur AT2-protéine étiquette, éventuellement en présence d'une substance à tester, (b) au moins un lavage dudit support ainsi traité avec un tampon convenable et (c) la visualisation de l'éventuelle interaction protéine ATIP selon la revendication 6 ou la revendication 7-récepteur AT2, en particulier en SDS-PAGE, suivie d'une immuno-empreinte avec des anticorps dirigés contre

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la protéine étiquette, fusionnée au récepteur AT2.

19 ) Méthode de sélection de substances aptes à interagir avec la protéine ATIP selon la revendication 6 ou la revendication 7, caractérisée en ce qu'elle comprend : (a) la mise en contact de la protéine ATIP selon la revendication 6 ou la revendication 7, fixée sur un support, avec un lysat cellulaire, (b) au moins un lavage dudit support ainsi traité avec un tampon convenable, (c) la visualisation de l'éventuelle protéine associée à la protéine ATIP, en particulier en SDS-PAGE, suivie d'une immuno-empreinte avec des anticorps appropriés et (d) l'identification de la protéine du lysat cellulaire interagissant avec la protéine ATIP.

20 ) Utilisation des cellules co-transformées selon l'une quelconque des revendications 10 à 13, pour la sélection et le criblage de substances ou de protéines aptes à influencer l'interaction protéine ATIPrécepteur AT2 ou aptes à interagir avec la protéine ATIP.