WO2000078323A1

WO2000078323A1 - Utilisation de l'icariine dans la preparation de medicaments pour la prevention et le traitement de troubles de l'erection et de maladies vasoconstrictrices

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Publication number: WO2000078323A1
Application number: PCT/CN2000/000161
Authority: WO
Inventors: Zhongcheng Xin
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Current assignee: Individual
Priority date: 1999-06-17
Filing date: 2000-06-16
Publication date: 2000-12-28
Anticipated expiration: 2001-12-17
Also published as: KR100394329B1; KR20010029802A; JP2003502376A; AU5386700A; CN1199647C; JP4864259B2; CN1282584A

Description

淫羊藿甙在制备用于预防或治疗性功能障碍和血管收缩有关疾病药物中的用途

发明领域

本发明涉及淫羊藿甙在制备用于预防治疗性功能障碍药物中的用途，以及与改善血管收缩有关疾病的用途。

背景技术

男性的性功能包括性欲、阴茎勃起、射精和性快感，是在神经- 内分泌系统的调节下，阴茎血管系统的复杂的生理反映。故如果上述系统的某一过程出现异常既可能引起性欲減退、阴茎勃起障碍、射精障碍或阴茎疲软障碍等疾病，而且，这种疾病可以单独出现或相互合并出现。男性性功能障碍的发病率大约占成人男性的 30-60%, 并有随着年龄增加而增加的趋势。传统的医学把性功能障碍通称为阳萎、早泄，直到最近十年以前，把性功能障碍的原因大部分被认为只是心理性原因。但是随着现代科学技术的发达已经明确了在 50%以上的性功能障碍患者中发现有神经系、血管系、内分泌系疾病以及患有高血压病、糖尿病、服用各种药物等器质性原因。

男性的性功能主要是在有各种性刺激时，在神经-内分泌系统的调节下通过血管系统的复杂的生理反映使阴茎勃起。这种阴茎的勃起过程首先是依靠阴茎小动脉的扩张使阴茎血流量增加，相继出现阴茎海绵体平滑肌松弛而海绵体小孔膨胀，促使血液流入量近一步增加，导制阴茎海绵体内压升高，压迫阴茎白膜下的小静脉阻断血液流出，从而导致阴茎海绵体内血液充盈而阴茎坚硬勃起其强度可达到插入阴道，并维持勃起的时间足以达到性高潮而射精。

这种阴茎勃起过程中阴茎海绵体平滑肌的松弛作用起着关键作用，而且阴茎勃起过程受神经内分泌系统的调节。动物实验表明许多局布因子影响阴茎勃起功能如去甲肾上腺素（ NA )、神经肽 Y (NPY)、乙酰胆碱（Ach)、前列腺素（PGE)、五羟色胺（5-HT)、降钙素基因相关肽（CGRP)、血管活性肠肽（VIP)、内皮素（EDRF)等。

近来的研究表明，一氧化氮（ NO )在阴茎勃起过程中起重要作用。当性刺激时 NO由分布在阴茎的副交感神经和非肾上腺素非乙酰胆碱能神经（NANC )末梢释放，而且 NO也在分布于血管内皮层的内皮细胞和阴茎海面体窦内皮细胞释放， NO可激活平滑肌细胞内鸟苷酸环化酶，使环嶙酸鸟苷（ cGMP )合成增加，也可激活蛋白酶 G(PKG)， PKG可以使钙通道关闭和钾通道开放，两种作用均可引起阴茎海面体平滑肌松弛导致阴茎勃起。环磷酸鸟甘（cGMP)又被碑酸二酯酶（PDE) 灭活。

性功能障碍可分为性欲减退，勃起障碍，性高潮障碍和射精障碍。性功能障碍的原因有血管神经性、内分泌性、心理性病变、糖尿病、高血压、脊髓神经损伤、吸烟等因素均可引起性功能障碍。

传统的观点认为性功能障碍主要是由于心理性原因引起。治疗上用口服药如安定剂曲唑酮，和育亨宾等。但是这种药物的作用机制尚不明确，其疗效不高，并有不同程度的副作用。

近年来随着弄清阴茎勃起机制，各种对阴茎海绵体平滑肌有松弛作用的药物企图用来诊断和治疗男性性功能障碍，目前，已有用血管扩张剂如楼束减（ aparvarin ), 芬托拉明 (phentolamine)、前列腺素 El ( prostajlandin El )等药物直接阴茎海绵体内注射疗法来治疗阴茎勃起障碍获得较满意的疗效。但是，这种疗法可以引起局布疼痛、持续性阴茎勃起、阴茎纤维化等副作用故临床上常被限制使用。

最近，美国发明的治疗勃起障碍的口服药物磷酸二酯酶 V抑制剂 ( Viagra) 被世人瞩目，上述药品作为化学性假体仅仅是用来一次诱发阴茎勃起，并有不同程度的副作用，如面红、头痛、视觉障碍、低血压等，特别是对有心血管疾病的患者安全性有争议值得留心。因此，安全而有效的增进人体本能性勃起功能的药物有待于研究开发，最近的研究力求于开发安全有效的 NO供体用来治疗性功能障碍。 .

生药淫羊藿在传统医学界里用来滋补强壮剂的处方中常常作为一种成份，但是其作用机制尚未弄清。近来的对淫羊藿有效成份研究证明淫羊藿中含有许多成份，如淫羊藿甙、挥发油、蜡醇、州一烷、植物醇、鞣质、亚油酸等。近来又分离出微量的 magnoflorin、淫羊藿糖甙 A、 epimedin A, B, C、槲皮素、脱水淫羊藿甙 -3-0-鼠李糖甙等。其中淫羊藿甙目前仅被用做淫羊藿成份分析用标准试剂。一些研究报告淫羊藿具有抗疲劳作用、增进免疫功能以及改善肝脏功能。但是到目前为止，还没有关于淫羊藿甙单体用来治疗性功能障碍的研究报告。

发明目的

本发明的目的是寻找并开发淫羊藿甙新的医药用途

发明简述

本发明人经研究发现，淫羊藿甙出人意料的具有强烈松弛阴茎海绵体平滑肌的作用，还具有对大动脉平滑肌轻度的松弛作用，其药理作用与平滑肌细胞内一氧化氮（ NO ) - cGMP通路的活性增强有关。从而可用于改善和增进阴茎勃起功能以及与改善血管收缩有关疾病的症状。

因此，本发明涉及淫羊藿甙在制备用于预防治疗性功能障碍的药物中的用途以及与改善血管收缩有关疾病用途。

发明详细描述

本发明涉及下试本发明涉及淫羊藿甙在制备用于预防治疗性功能障碍的药物中的用途以及制备与改善血管收缩有关疾病药物中的用途。

本发明涉及用于预防或治疗性功能障碍和血管收缩有关疾病的药物组合物，其包括作为活性成分的淫羊藿甙及药用载体和赋形剂。本发明涉及预防或治疗性功能障碍和血管收缩有关疾病的方法，包括给需要预防或治疗性功能障碍和血管收缩有关疾病的患者预防或治疗有效量的淫羊藿甙或含淫羊藿甙的药物组合物。

淫羊藿甙由生药淫羊藿分离出来的属于黄酮甙类单体，其化学结构式： C₃₃H₄。0₁₅，分子量： 676. 67, 熔点： 225-230 °C.

根据本发明，本发明中使用的淫羊藿甙可以单独使用或以药物组合物形式使用。药物组合物包括作为活性成份的淫羊藿甙及药用载体。

根据本发明，本发明的药物组合物，可按本领域以知方法制备并可以通过口 Μ_或非肠道或局部途经给药。口服制剂包括如片剂、口嚼剂，胶嚢、悬浮液、溶液等，非肠道给药制剂包括如注射液。局部给药制剂包括如霜剂、软膏剂、贴剂，喷雾剂等。

根椐本发明，淫羊藿甙是从淫羊藿生药中通过有机溶剂或有机溶剂与水的混合物提取得到。可使用的有机溶剂包括醇类如甲醇、乙醇等、代烷类如二氯甲烷、氯仿、醚类如乙醚、酮类如丙酮、脂类如乙酸甲脂、乙酸乙脂、烃类如已烷等。

下面的实施例用来更详细的说明本发明，但不意味着本发明仅限于此。实施例 1淫羊藿甙的制备

提取方法（ 1 )

取干燥淫羊藿（地上部分） 500克加 MeOH 10升，加温提取 3日，共 3回。过泸回收溶媒，减压浓缩获得 MeOH提取物。 MeOH提取物加水混悬后用同量的已烷提取共 4 次，取水层浓缩到 1/3量。在此浓缩水层中加 5% 柠檬酸混悬（pH=5. 5 ) , 再用同等量的 CHC1₃ 提取，再加适量 NH₄0H混悬（pH=10 )，再用同等量的 CHC1₃提取。此过程反复 3次。最终碱性水层用同等量丁醇反复提取 3次，获得淫羊藿甙粗品（icari in rich fraction, IRF) (利用 HPLC分析法测定结果淫羊藿甙含量为 8%)。

提取方法（ 2 )

取干燥淫羊藿（地上部分） 500克加 EtOH 10升， 80C。加温汇流提取 3次，每次 1小时，共 3回。过滤，減压回收乙醇浓缩成浆状。加 4倍量水分散后静止 3小时除去叶绿素几蜡脂等，正丁醇翠取 4 次后合并滤液，减压浓缩。用 40- 60目聚酰氨柱吸附， 30%乙醇洗脱至无色，洗脱液减压浓缩。加 70%乙醇（1: 20 )溶解，静止 8小时，过滤得淫羊藿总甙。淫羊藿总甙与无水乙醇（1: 15 )反复洗脱重结晶得淫羊藿总甙粗品。淫羊藿总甙含量 52%。

淫羊藿甙分离

淫羊藿甙或淫羊藿总甙粗品溶化在 MeOH，吸附在硅胶干燥，再加入已备好的硅胶柱（8x60cm)中，以 CHC1 ： MeOH = 5 ： 1, 4： 1, 3： 1, 2 ： 1 的顺序溶出，各溶出的分液浓缩，再用 MeOH/H₂0 混和液析出淡黄色结晶。

该结晶在 UV发色， pauly试剂显阳性反映， TLC分析结果 Rf 值为 0. 6，熔点： 239。C .确认为是纯品淫羊藿甙（淫羊藿甙，利用 HPLC 分析法测定结果淫羊藿甙含量为 99. 8%) )。

实验 1安全性实验

按照急性毒性试验规则利用 SD系大白鼠雌雄各 5只为 1组，共分 4组，第 1组口服给药量为淫羊藿甙 3g/kg，第 2组 2g/kg, 第 3 组 lg/kg, 第三组 0. 5g/kg。投药后观察 7 日的结果， LD₅。雄性为 1. 88g/kg, 雌性为 1. 95g/kg。实验 2药效及药理作用机制

实验原理男性的性功能主要是在有各种性刺激下时，在神经 -内分泌系统的调节下通过血管系统的复杂的生理反映促使阴茎勃起。这种阴茎的勃起过程首先是依靠阴茎小动脉的扩张作用和阴茎海绵体平滑肌松弛作用，阴茎海绵体窦膨胀促使阴茎海绵体血液流入量增加，导制阴茎海绵体内压升高而压迫阴茎白膜下的小静脉以阻断血液流出，从而导致阴茎海绵体内血液充盈而阴茎坚硬勃起。这种阴茎勃起过程中，阴茎海绵体平滑肌的松弛作用起着关键作用。故具对阴茎海棉体平滑肌有松弛作用的药品有助于阴茎勃起功能。阴茎海绵体平滑肌的松弛作用也受非肾上腺素非已酰胆碱（NANC)能神经和内皮细胞松弛因子（EDRF)的调节，而这种 EDRF中一氧化氮（NO)起着重要的作用。 NO或含有 NO的物质扩散到平滑肌细胞内，激活可溶性鸟苷酸环化酶，使 cGMP合成增加而诱发阴茎海绵体平滑肌松弛促使阴茎勃起。阴茎海绵体内的 cGMP又被碑酸二酯酶 V型失去活性。所以，促使阴茎海棉体平滑肌 NO生成增加，或促进鸟苷酸环化酶活性，或抑制磷酸二酯酶的活性的药品，能使 cGMP合成或活性增加，促进阴茎勃起故对性功能障碍有治疗作用。利用阴茎海棉体活体组织在体外进行实验（in vitro) , 观察药物对其张力的影响，或测定药物对嶙酸二酯酶的影响，是研究药物阴茎勃起功能的有效实验方法。

2. 1. 淫羊藿甙对家兔阴茎海面体平滑肌松弛作用：

用雄性家兔（新西兰家兔，体重： 2. 5 - 3. 0kg) , 分离出阴茎海面体平滑肌，在体外进行了淫羊藿甙的药理药效实验。使用的家兔共 60只，观察了不同浓度淫羊藿甙对阴茎海面体平滑肌张力的影响，并观察了同浓度淫羊藿甙对腹部大动脉平滑肌张力的影响。为了研究淫羊藿甙对阴茎海面体平滑肌松弛作用的药理机制，观察了已酰胆碱（NANC)能神经阻断剂阿托品，前列腺素 E1抑制剂消炎痛，抑制 NO生成或 NO活性的试剂 N^w- nitric- L-精氨酸（L-NNA)和连苯三酚、鸟碑酸环化酶活性抑制剂亚甲兰、 1H- [1， 2, 4]噁二唑并 [4, 3, -a]喹喔淋- 1-酮（0DQ) 对淫羊藿甙对阴茎海面体平滑肌松弛作用的影响。实验方法

家兔用戊巴比妥钠（30- 50mg/kg)麻醉后切除阴茎和腹部大动脉，在持续供给 95%氧气和 5%二氧化碳混和气体并盛有 Tyrode营养液并保持衡温 37. 5°C的容器中，将阴茎海绵体分离成 2x2x6mm大小的肌条，并将在大动脉中分离出 4匪宽的动脉环，分别在盛有 Tyrode 溶液 10ml并持续供给 95%氧气和 5%二氧化碳混和气体的玻璃器管浴中，一端在底部固定，另一端连接力位移传导器上。阴茎海绵体条和动脉环的紧张度的变化，利用多道记录仪（TSD 105， Biopac Systems, Santa Barbara, CA， USA)测定并记氯，观察了淫羊藿提取物和淫羊藿甙对阴茎海绵体条和大动脉环的紧张度所引起的效应。

为了诱导起初安静状态阴茎海棉体条和动脉环的张力，将阴茎海面体条和动脉环牵拉到 2克的张力，效准 1. 5-2小时。当利用笨副林（PHE; 5 X 10 ⁶M)诱发收缩反应后再用台氏溶液洗去至到回复基线。此法反复三次以上，如三次收缩反应幅度之差在 10%以内时，定为效准安静状态阴茎海棉体条和动脉环的张力，进行下一步药效分析。每个平滑肌条或环在实验过程中的先后实验间隔保持 30分钟，使其回复到安静状态阴茎海棉体条和动脉环的张力后再进行下一步实验。 a - 淫羊藿提取物和淫羊藿甙对阴茎海绵体条和大动脉环的紧张度所引起的效应实验

为了观察淫羊藿提取物和淫羊藿甙对阴茎海绵体条和大动脉环的紧张度所引起的效应，将阴茎海绵体条和大动脉环利用苯福林 (PHE ; 5 χ 10⁶Μ)诱发收缩，保持平台时，将淫羊藿提取物和淫羊藿甙以浓度递增的量（淫羊藿提取物 l-50m_g/ml，淫羊藿甙 1(Γ。- 10— ⁴M )依次投入，并观察其个个浓度对平滑肌的松弛效应。每个药物浓度至少观察 8只动物肌条或肌环的药物效应并作统计学分析。 b. 淫羊藿甙对阴茎海绵体条所引起的松弛效应机制实验

b-1. 观 g7已酰胆碱（NANC)能神经阻断剂阿托品（10-⁶M)对淫羊藿甙对阴茎海绵体条所引起的松弛效应的影响

b-2. 察了 ^j腺素 E1 抑制剂消炎痛（10—⁴Μ)对淫羊藿甙对阴茎海绵体条所引起的松弛效应的影响

b-3. 观察了抑制 NO生成或 NO活性的试剂 N^w- nitric-L-精氨酸 (L-赠

(ισ^ ^^^ασ )对淫羊藿戒对阴茎海绵体条所引起的松弛效应的影响

b-4. 观察了鸟环化醻活抑制剂亚甲兰 (10⁴ )， 1H- [1, 2, 4] 二嗤并 [4, 3, - ] 喹喔啉 -1- 酮（TO) (1(TM)对淫羊藿甙对阴茎海面体平滑肌松弛作用的影响

为了观察上述各种试剂对淫羊藿甙对阴茎海绵体条松弛效应的影响，将阴茎海绵体条利用苯福林（ΡΗΕ ; 5 X 10— )诱发收缩，保持平台时，将各种试剂按照各自的浓度分别投入后，等待 20分钟，再将阳藿甙以浓度递增的量（淫羊藿甙 10— ^1Q- 1(ΤΜ )依次投入，并观察其个个浓度淫羊藿甙对平滑肌的松弛效应。与透各种试剂前的松弛程度作比较，分析其对淫羊藿甙对阴茎海绵体条松弛效应的影响。每个药物浓度至少观察 5只动物肌条或肌环的药物效应并作统计学分析。实验使用溶液

笨福林盐酸盐，氯化乙酰胆碱，硫酸阿托品，连笨三酚，消炎痛， N^m-nitric-L-精氨酸, 1H-[1, 2, 4] 噁二唑并 [4, 3， -a]喹喔淋 -1-酮

替换页 (细则第 26糸) 来自 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)产品，亚甲兰来自 Mallinckrodt Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)产品。 Tyrode溶液的组成（mEq八） Na⁺ (153. 6) , Γ (5. 3)， Ca⁺⁺ (3. 0) , Mg⁺⁺ (1. 2) , CI" (157. 2) , H₂P0₄—— (0. 6) , S0₄—— (1. 2)， HC0₃ (7. 1)，葡萄糖（11. 4) . 统计学分析

数据用计算机分析 (Acqkowlege 3. 2 program, Biopac systems, USA) 且所有松弛反应用最大松弛反应百分比表示，最大松弛指在所有试验中 PHE诱导的最大收缩点与曲线中最大向下偏差之间的距离。统计分析用 Student' s 试验进行。不同药物浓度下的平滑肌张力变化用 log衰减分析测定。如 p值小于 0. 05时被认为统计学上有意义。所有值用平均标准误差表示。实验结果

C . 淫羊藿提取物和淫羊藿甙对阴茎海绵体条和大动脉环的紧张度所引起的效应实验

观察淫羊藿提取物和淫羊藿甙对阴茎海绵体条和大动脉环的紧张度所引起的效应结果，结果见表 1 和表 2。由表 1 和表 2 中的数据可看到，淫羊藿提取物和淫羊藿甙对利用苯福林（PHE ; 5 X 10— ⁶M)诱发收缩的阴茎海綿体条和大动脉环，显示出浓度依存性的松弛作用（p〈0. 001)。淫羊藿甙的半数有效浓度（EC₅。）在阴茎海绵体和动脉环分别为 4. 67x10— ⁴M, 2. 71xlO_³M。这种结果表明淫羊藿甙对阴茎海绵体的松弛作用较对动脉环的松弛作用强 ⁵. ⁸ 倍（p〈0. 001)。表 1。淫羊藿提取物（IRF)对利用苯福林（PHE; 5 X 10— ⁶M)诱发收缩的阴茎海绵体条和大动脉环表现出浓度依存性的松弛作用。淫羊藿甙浓度 0. 1 0. 5 1. 0 5. 0 10. 0 15. 0 P 值

( mg/ml )

阴茎海绵体条松 1 o+ 2. 24 9. 86 18. 74 44. 24 87. 45 94. 23 <0. 001 o

弛效应（％) ( CO O

n=8) ±0. 8200 ±1· 27 ±3. 25 ±4. 35 ±4. 12 ±4. 36 大动脉环松弛效 1. 34 9. 45 23. 05 36. 45 <0. 001 应（％) (n=8) ±0. 98 ±3. 24 ±4. 21 ±4. 35

P 值〈0. 001 <0. 001 <0. 001 <0. 001 <0. 001 表 2。淫羊藿甙对利用苯福林 (PHE; 5 X 10—⁶M)诱发收缩的阴茎海绵体条和大动脉环表现出浓度依存性的松弛作用.

淫羊藿甙粗品（IRF)和淫羊藿甙的半数有效浓度（ EC₅。 )

不同药物浓度下的平滑肌张力变化用 log 衰减分析结果，淫羊藿甙粗品（IRF)在阴茎海绵体和动脉环的半数有效浓度（ EC₅。 ) 分别为 4. 08mg/ml， 22. 4mg/ml。淫羊藿甙在阴茎海绵体和动脉环的半数有效浓度（EC₅。）分别为 4. 67x10 ⁴M, 2. 83x10 . 按照淫羊藿甙粗品（IRF)中淫羊藿甙含量 8%计算可换算得出淫羊藿甙浓度为 4. 08x10— ⁴M， 2. 64xlO"³M, 这种结果与淫羊藿甙的半数有效浓度（ EC₅₀ ) 4. 67xlO"M, 2. 83xl0 ³M相差无几。说明淫羊藿戒是淫羊藿成分中的主要药效成分，并且对阴茎海绵体的松弛效应较大动脉环强 5. 5倍以上。淫羊藿甙对阴茎海绵体条所引起的松弛效应机制实验

1. 在观察已酰胆碱（NANC)能神经阻断剂阿托品（10^_6M) 对淫羊藿甙对阴茎海绵体条所引起的松弛效应的影响的结果表明，淫羊藿甙对用阿托品预前处理的阴茎海绵体条所引起的松弛效应较对照组无显著差异（p〉0. 05)，这说明这种松弛效应不受阿托品的影响。

2. 在观察前列腺素 E1 抑制剂消炎痛（10_⁴M) 对淫羊藿甙对阴茎海绵体条所引起的松弛效应的影响的结果表明，淫羊藿甙对用消炎痛预前处理的阴茎海绵体条所引起的松弛效应较对照组无显著差异（p>0. 05)，这说明这种松弛效应不受消炎痛的影响。结果见表 3。

3. 在观察抑制 NO 生成或 NO 活性的试剂 N^w-nitric- L-精氨酸 (L-NNA) (10— ⁴ M) 和连苯三酴（10— ⁴M) 对淫羊藿甙对阴茎海绵体条所引起的松弛效应的影响的结果表明，淫羊藿甙对用 N^w- nitric-L-精氨酸（L-NNA) (10 ⁴ M) 和连苯三酚 (10— ⁴M)预前处理的阴茎海绵体条所引起的松弛效应较对照组显著被抑制（p〈0. 001) ,这说明这种松弛效应与 NO生成或 NO活化作用有关。结果见表 3。

4. 在观察鸟磷酸环化醇活性抑制剂亚甲兰（10—⁴ M)， 1H-[1, 2, 4] 噁二唑并 [4, 3, -a] 喹喔啉 -1-酮（ODQ) (10"⁴M) 对淫羊藿甙对阴茎海面体平滑肌松弛作用的影响的结果表明，淫羊藿甙对用亚甲兰（10— ⁴ M)， 1H-[1, 2, 4]噁二唑并 [4， 3， -a]喹喔啉 -1-酮（0DQ) (1(ΤΜ)预前处理的阴茎海绵体条所引起的松弛效应比对照组显著被抑制（ρ〈0. 001)，结果见表 4。上述实验结果表明淫羊藿甙对平滑肌的松弛效应与一氧化氮

(NO) -鸟磷酸环化酶（CGMP)活化作用有关。结果见表 3。

表 3破坏内皮细胞，连笨三盼，亚甲兰， 0DQ, 阿托品，消炎痛前处理后，淫羊藿甙对利用笨福林（PHE ; 5 X 10— ⁶M)诱发收缩的阴茎海绵体条松弛效应的影响。

表 4不同浓度 0DQ予处理对淫羊藿甙对 ΡΗΕ预接触海绵体肌肉条的松弛作用的反应（ΡΗΕ; 5x10 ⁶Μ )

实验 3淫羊藿戒对碑酸二酯酶活性的影响

实验方法

1. 人血小板中分离磷酸二酯酶

磷酸二酯酶 V型不仅分布在阴茎海绵体，还分布在血小板。利用血小板分离出磷酸二酯酶 V 型，分析药物对其活性的影响是一种常规实验方法。其方法是将新鲜人血液（ 360 gm ) 离心分离（360g) 10 分钟，得出血小板丰富血浆（PRP) , 再将 PRP离心分离（1400g) 10分钟沉淀血小板。取 1ml沉淀的血小板，用水冷緩沖液（Hepes 20nM, Sucrous 0. 25M, EDTA ImM, 笨甲基磺酰氟化物（PMSF) ImM, pH 7. 2) 混匀漂浮后，用超声波震荡器（Cell distuptor, Burkard Scientific, Uxbridge, Middlesex, UK)破坏细胞膜。细胞溶解物远心分离 (799g) 10分钟后，在次连续离心分离 (165. 000g) 60分钟，取上层液用 Pharmacia FPLC (Pharmacia LTD.， Milton Keynes, UK) 将复合酶分离出来备用。

为了利用 Mono- Q离子交换色谱法提纯嶙酸二酯酶，利用 Mono-Q 柱（5ml X 50mm) , 緩冲液 A 5ml和緩冲液 B 10ml反复沖洗后，远心分离（165. 000g)得到的上清液 10ml, 放入 Mono- Q 柱，流速定为 1 ml/min。再让复合酶的活性成分以 1 ml/分钟的流速通过线性梯度盐（linear gradient salt) (0-0. 5M NaCl)分析各种酶成分。在所得到的各种酶成分分别测定其活性，收集对活性酶成分，放入液氮瓶备用。

2. 筛选抑制酶活性物质

磷酸二酯酶的活性分析在最终反应容量 0. 5ml进行，而且从加入酶到反应开始的搡作在水上做准备。分析用緩冲液（ Tris 40mM pH 8. 0, MgCl₂ 10 mM, BSA 0. 125mg/ml, 2-巯基乙醇 3. 75 mM )每次使用新鲜配制的緩冲液，被蘇作用物 [2H] cGMP (ca. 28 ci/mmol； ca. 100, 000 οριη/100μΙ)是事前用分析用緩冲液做好准备备用。 PDE V型的活性检测方法是利用 [3H] cGMP标记的同位素两步分析法。测定时将 [3H] cGMP 200 μΐ 加入试管内，再加入被试物质（淫羊藿甙 10— ^1QM- 10—⁴Μ )或对照物用同量 DMS0 )100 μΐ和提纯的碑酸二酯酶 100 μΐ, 再加入緩冲液到 0. 5ml，在 30°C衡温下反应 20分钟后，将试管浸入开水中以终止反应。反应终了后试管内加入蛇毒（Ophiophagus Hannah； Sigma Chemical Co) 100 L (lmg/ml) , 30°C衡温下孵化 10 分钟，将 [3H] 5-GMP转化成 [3H]鸟苷。被转换的 [3H]鸟苷在 AG1-X2 resion (Bio-Rad)反应器中，利用 NaOH (0. 1 N)在离子交换柱型色谱分析洗脱后得到的样品，测定其放射性来分析磷酸二酯酶 V的活性，

3. 实验结果

本实验结果淫羊藿甙对磷酸二酯酶 V 活性有浓度依赖性抑制作用 (10— ⁸M, 0. 06%; 10— ⁷M, 32. 7% ; 10"⁶M, 56. 2%; 10"⁵ , 83. 7%; 10— ⁴M， 99. 9%)， EC50 为 0. 43μΜ。见下表。淫羊藿甙对磷酸二酯酶 V活性的抑制作用（％)。

浓度 10"⁴Μ 10— ⁵Μ 10— ⁶Μ 10— ⁷Μ 10"⁸Μ 10"⁹Μ

淫羊衮甙 99. 7 87. 9 63. 2 42 2 0 通过实验证明，淫羊藿甙对阴茎海绵体比对大动脉环有强大的松弛作用，而且淫羊藿甙的阴茎海绵体平滑肌的松弛作用的机制是，通过增加 Ν0的生成和鸟磷酸环化酶活化作用，并抑制磷酸二酯酶的活性来阻止 cGMP的灭活，使阴茎海绵体平滑肌内 cGMP浓度增加而松驰阴茎海绵体，诱发阴茎勃起。实验 4。临床效果

为了了解淫羊藿甙的临床效果，在 56名性功能障碍为主述并自愿受试者为对象利用国际性功能评价询问表（ International Index for Sexual Function, IIEF- V )进行了安慰剂对照，二重双盲预备临床实验。被试者平均年龄为 39土6. 1 岁，发病期间为 5. 4土3. 7年。其中患糖尿病 17例，高血压病 9例，心脏病 8例。实验药品（含淫羊藿甙 50mg/片）和安慰剂包装相同，透药者和服药者均不知道药品情报的条件下进行实验。被选的自愿者不随机的分成两组，投用安慰剂或实验药品（ 2片 /次， 3次 /日），口服

1个月。患者在投药前和服药完了后分别添写性功能评价询问表（共 5项，各项 5度评分），比较用药前后的性功能变化通过 Student t test分析来评价药效。

实验结果，在治疗前受试者性功能评价分数分别为，对勃起和勃起的维持功能的自信感评分为 1.82±0.54，阴茎可插入阴道的勃起频度评分为 1.89±0.67, 性交时阴茎插入阴道并维持勃起的频度评分为 1.82±0.65，性交时阴茎勃起和勃起维持困难评分为 1.89±0.61，对性生活的满足度评分为 1.79±0.62。治疗后性功能评分分别为，对勃起和勃起的维持功能的自信感评分中淫羊藿甙组为 3.32±0.39，安慰剂为 2.04±0.63，阴茎可插入阴道的勃起频度评中淫羊藿甙组为 3.11±0.32，安慰剂为 2.07±0.88, 性交时阴茎插入阴道并维持勃起的频度评分中淫羊藿甙组为 3.18±0.47, 安慰剂为 2.17±0.97，性交时阴茎勃起和勃起维持困难评分中淫羊藿甙组为 3.25±0.43，安慰剂为 2.18±0.92，对性生活的满足度评分中淫羊藿甙组为 3.36±0.47，安慰剂为 2.14±0.95，服用淫羊藿甙片组的评分比较安慰剂显著增高（p〈0.01)。总体临床效果淫羊藿甙片组和安慰剂分别为 75.4%和 35.4%。除 4名患者有轻微的胃肠道反应外未发现明显的副作用。患糖尿病，高血压和心脏病患者在临床效果和副作用方面无显著差异。结果见下表。淫羊藿甙对性功能障碍治疗效果的 IIEF评分表

对阴茎

时阴茎对阴茎对 &i齡满足 ^自信感 . ^ ^m- ^m^ . 度

.

治疗治疗治疗治疗治疗治疗治疗治疗治疗治疗前后前后前后前后 8·) 后淫羊藿甙片 1.82士 3.32土 1.89± 3.11土 1.82土 3.18土 i.8a± 3.25± 1.79± 3.36±

(n=280 0.54 0.39 0.67 0.32 0.65 0.47 0.61 0.47 0.62 0.47

•¾^'J (n=28) 2.04± 2.07土 2.17士 2.18土 2.14±

0.63 0.88 0.97 0.92 0.95

P值 0.002 0.001 0.01 0.002 0.001

Claims

权利要求

1. 淫羊藿甙在制备用于预防或治疗性功能障碍和血管收缩有关疾病药物中的用途。

2. 用于预防或治疗性功能障碍和血管收缩有关疾病的药物组合物，其包括作为活性成分的淫羊藿戒及要用载体和赋形剂。

3. 根据权利要求 1的用途或权利要求 2的药物组合物，其中所述的药物或药物组合物含 10-500毫克的淫羊藿甙。

4. 根据权利要求 1-3 的用途或药物组合物其中所述的药物或药物组合物是以片剂，丸剂，胶嚢，悬浮液，溶液，注射剂，霜剂，软膏，喷雾剂，口嚼剂，贴剂形式使用。

5. 根据权利要求 1-3的用途或药物组合物，其中所述的药物给药途经可以为口服，舌下，经皮，经肌肉或皮下，皮肤粘膜，尿道，阴道，或静脉。