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WO2000075369A1 - Verfahren zur detektion von nukleinsäureamplifikationsprodukten unter verwendung von primern mit 'primer-integrierten reporter-sequenzen' (pirs) - Google Patents

Verfahren zur detektion von nukleinsäureamplifikationsprodukten unter verwendung von primern mit 'primer-integrierten reporter-sequenzen' (pirs) Download PDF

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WO2000075369A1
WO2000075369A1 PCT/EP2000/005023 EP0005023W WO0075369A1 WO 2000075369 A1 WO2000075369 A1 WO 2000075369A1 EP 0005023 W EP0005023 W EP 0005023W WO 0075369 A1 WO0075369 A1 WO 0075369A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
primers
sequence
pirs
primer
nucleic acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/EP2000/005023
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Reinald Repp
Wolfgang Rascher
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to AU52191/00A priority Critical patent/AU5219100A/en
Publication of WO2000075369A1 publication Critical patent/WO2000075369A1/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6823—Release of bound markers

Definitions

  • the present invention relates to methods for the detection of products of a nucleic acid amplification reaction, whereby novel primers with a primer-integrated reporter sequence (PIRS) and probes specific therefor enable highly sensitive quantitative determination of the amplificates.
  • PIRS primer-integrated reporter sequence
  • the invention further relates to reagent kits and nucleic acids which are suitable as PIRS primers.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the TaqMan system uses the 5'-nuclease activity of Taq DNA polymerase, using an oligonucleotide which is labeled with a fluorescent molecule at the 5 'end and with a quencher molecule at the 3' end, the Taq- DNA polymerase, through its 5'-exonuclease activity, releases the fluorescence molecule, the signal of which is detected in the ABI-PRISM - Seq uen zd ete kti on syste m.
  • Fluorescent dyes are available in the 6-FAM, TET, JOE, VIC TM and HEX molecules, which can be combined with the quenching molecule TAMRA.
  • so-called “dark quenchers” can be used, which emit in the infrared range, which means that TAMRA can also be used as a reporter dye.
  • the synthesis of TaqMan TM probes is offered by various manufacturers.
  • the second system concerns the Light-Cycler TM system from Boehringer Mannheim / Hoffmann La Röche.
  • the fluorescent dyes are distributed over two different oligonucleotides.
  • the fluorescent dye fluorescein is located at the 3 'end of the first oligonucleotide, while the second oligonucleotide attached downstream of the first oligonucleotide has the fluorescent dye LC Red 640 at its 5' end.
  • the fluorescein is excited by an LED as a light source and emits light that excites the second fluorescence molecule (LC Red 640 or LC Red 705) via fluorescence resonance energy transfer.
  • the light emitted by the second dye is detected via an appropriate filter.
  • the second dye can only be excited if the two dye molecules are in spatial proximity (distance of 1 to 5 nucleotides) due to the addition of the two oligonucleotides to their complementary strand.
  • the principle of the system is based on the secondary excitation of a second fluorescent dye, which is only made possible by the generation of the PCR product.
  • light emitted by the fluorescent dye molecule is absorbed by the quencher molecule, which is why the quencher effect and the emitted light can only be canceled after the hydrolysis of the fluorescent dye molecule by the oligonucleotide by the 5'-3 'exonuclease activity of the Taq DNA polymerase .
  • a third technique for fluorescence-optical detection of the PCR product generation uses so-called “molecular beacons".
  • "Molecular Beacons” are made up of three domains and used as probes.
  • a central sequence section is complementary to a target sequence in the PCR product. 5'- and 3'-wards of it are two mutually complementary sequence sections. Outermost 5'- and 3 ' If the probe is not bound with its central section to the complementary target sequence, the two mutually complementary terminal sections form an intramolecular double strand, resulting in the reporter dye at one end and the quencher at the other end in close proximity, which means that the quencher neutralizes the light signal emitted by the reporter dye.
  • Molecular beacons can be used in various devices that are suitable for the detection of the resulting fluorescence signals, such as. B. the Sequence Detection Systems TM 7700, 7200 and 5700 from PE Biosystems, the Rotor-Gene RG2000 TM Real-Time Cycler from Corbett Research or the FMBIO II TM Fluorescence Imaging System from Hitachi.
  • the systems mentioned above can basically be used for multiplex applications, i.e. several target sequences can be amplified simultaneously.
  • a disadvantage of this type of application in these known methods is, however, that for each target sequence a separate probe or pair of probes is required for detection, which must specifically bind to an internal region of the target sequence resulting from the amplification. If many different target sequences are to be detected side by side, the reaction approach becomes relatively expensive due to the increasing number of different detection probes and the increasing number of probes can impair the RCR amplification.
  • Primer dimers are double-stranded nucleic acid molecules that arise when two primers hybridize directly with each other over a few nucleotides and then elongate along the complementary strand. These products can in turn hybridize with further primers, which leads to a loss of primer material with the formation of the undesired primer dimers.
  • the use of homo-tail sequences at the 5 'ends of the primers has been proposed (Brownie et al. (1 997), Nucleic Acids Research 25, 3235-3241).
  • primers thus contain a section specific to the sequence to be amplified at the 3 'end and a homo-tail section at the 5' end.
  • the homo-tail sequence is a sequence that is identical for the forward and reverse primers used.
  • primer dimers When primer dimers are formed, single strands with complementary 5 'and 3' ends are formed after the melting of the elongated double strands, which hybridize with one another and so-called "panhandles" - Form structures. These structures are no longer available for further hybridizations with primers and prevent the amplification of the primer dimers. Brownie et al.
  • tail-specific primers tags
  • the advantage of the tags is that they are shorter and reduce the formation of primer dimers by several powers of ten.
  • the system was not developed for fluorescence-coupled detection of the resulting PCR products. This would be possible, but again with the disadvantage that a specific probe would be required for each sequence to be amplified.
  • the specific reaction preceding the amplification via the homo-tail sequences is carried out at lower temperatures than the reaction with the tags. In principle, the specificity of the PCR reaction can be increased by choosing the highest possible primer binding temperature, which in turn requires relatively long primers that can still bind at such temperatures.
  • the upper temperature limit of around 74 ° C results from the optimum activity of the polymerase enzyme used. Since this temperature range with optimal specificity is reserved for the reaction with the tags, it follows inevitably that the amplification carried out at a lower temperature via the sequence-specific primers does not take place under optimal specificity conditions. There is a risk that the areas (tails, reporter sequences) which are still present in addition to the primer sections which bind to the target sequences cause unspecific binding.
  • the object on which the present invention is based is therefore to use suitable changes to the primer structures when using nucleic acid amplification techniques, in particular the TaqMan TM and Light Cycler TM systems, and other systems fluorescence-optical detection of PCR products to increase the number of target sequences to be detected in parallel.
  • this object is achieved by a method for the detection of products of a nucleic acid amplification reaction, comprising the steps: i) providing nucleic acids to be amplified, ii) performing an amplification reaction using at least two primers, iii) detecting the amplification products formed in ii) under
  • one of the primers used for the amplification reaction comprises the following elements in the 5'-3 'direction: a 5'-homo-tail sequence, a probe binding sequence which acts as a primer integrated reporter sequence (PIRS), and a sequence specific for the nucleic acid to be amplified
  • another of the primers used for the amplification reaction in the 5'-3 'direction comprises the following elements: a 5'-homo-tail sequence, and one for the one to be amplified
  • Nucleic acid specific sequence, and c) the probes used for detection can interact with the complementary strand of the probe binding sequence of one of the two amplification primers, and the probes used carry detectable labeling groups.
  • PIRS primers By using primers with primer-integrated reporter sequences (PIRS primers), only one probe oligonucleotide sequence per PIRS is necessary in multiplex PCR applications with fluorescence optical product detection. Labeling of each individual specific primer with fluorescent dye molecules is omitted, so that the invention This represents a great advantage over conventional detection methods of products of an amplification reaction, particularly in multiplex PCR.
  • the fluorescent dyes can be assigned not only individual target sequences but a whole group of target sequences, which are then simultaneously detected in multiplex reactions and discriminated from one another on the basis of the characteristic fluorescence can be.
  • the possibility of detecting multiple target sequences with a single probe construct saves costs, since the production of fluorescence-labeled probes is relatively more expensive.
  • the multiplex application which is becoming increasingly important for today's diagnostics, should not be affected.
  • the invention is based on a novel primer design which, in a first aspect of the invention, primers with primer-integrated
  • PIRS primer Provides reporter sequences ("PIRS primer").
  • the PIRS primers (with integrated probe binding sequence / reporter sequence) have the following general structure
  • the second primer with opposite polarity to be used in the PCR does not have to contain PIRS and thus has the following schematic structure:
  • an additional primer-integrated domain between these two domains, which is not the serves fluorescence-based product detection, but enables certain post-PCR product analyzes.
  • This must differ in its sequence from the PIRS domain used for fluorescence-optical PCR product detection and can e.g. B. serve as an attachment site for a sequencing primer with which the nucleic acid sequence of the PCR product is determined after the PCR reaction.
  • both PCR primers have an additionally attached sequence called "5'-homo-tail" at their 5 'end.
  • This "5'-homo-tail” sequence can be chosen freely, but it is preferably also identical in the case of a combination of several primer sets to form a multiplex PCR for all primers and should be somewhat higher in melting temperature than that of the "specific sequence" defining primer section.
  • the underlying principle corresponds to the "HANDS” -PCR technology (Homo-Tag-Assisted-Non-Dimer-System) (Brownie et al., See above; EP-0 731 1 77; EP-0 332 435). By using the "HANDS" -CRC principle, the undesired formation of primer dimers during the PCR reaction is reduced by several orders of magnitude.
  • the primer integrated sequence is a sequence that is specific for the probes used, i.e. that the amplification products can hybridize to the probes used on the basis of these sequences.
  • the specific sequence is specific for the nucleic acid section to be amplified, with which it hybridizes and initiates the elongation from this hybridized section.
  • primers are used in which, apart from the homo-tail section, at least one of the thymidine bases has been replaced by uracil.
  • the Amplification reaction mixture added an enzyme which is able to degrade nucleic acids with uracil bases, uracil-N-glycosylase is preferred.
  • the PCR approach is used after the first three to five cycles during which the sequence-specific 3 'ends of the multi-domain primers (specific sequence + homo-tail + PIRS) attach to their respective target sequences and PCR products with the universal 5 '- "Homo-Tail" are generated, a digestion with the enzyme uracil-N-glycosylase interposed. Removal of the uracil base residues from the DNA chain and subsequent hydrolysis at 95 ° C. destroys all primer domains that are no longer required for the further amplification mediated exclusively via the “homo-tails” and only for the generation of undesired products, such as Primer dimers contribute.
  • any primer dimers that may have already formed are largely destroyed, since the primer portions contained in them are broken down with the uracil residues.
  • their competition with the fluorescence-labeled reporter probes is eliminated, which contributes to a more efficient signal generation during the PCR.
  • the digestion result in primer fragments that are no longer than 8 to 10 nucleotides.
  • the above-described methods can be used to combine a plurality of primer sets which, owing to different “specific sequences” at the 3 ′ end of the first type of primer, allow the detection of several target sequences in a single reaction mixture.
  • PCR products are formed, a sequence is formed which is complementary to the probe binding site / reporter sequence and with which the probe oligonucleotides must hybridize.
  • Different groups of target sequences can be distinguished by using several probes with appropriate fluorescent dyes, for example using the TaqMan TM system. This is illustrated using the examples below.
  • PIRS primers according to the invention in combination with the measures described to avoid the undesired formation of primer dimers (HANDS-PCR) allows the fluorescence-optical detection systems described above, such as e.g. TaqMan TM and Light Cycler TM with a single probe or a pair of probes, which is labeled with one of the available fluorescent dyes, to detect a large number of different target sequences in one reaction batch.
  • all available fluorescent dyes can be used in parallel with the help of specific probes. It is thus possible to assign different groups of target sequences to a probe or an associated fluorescent color. The target sequences of the individual groups can be detected in parallel in a single PCR reaction and their group membership can be identified on the basis of the assigned color of the probe used, as a result of which a very high degree of automation of the PCR diagnosis is achieved.
  • Another object of the invention is a reagent kit which contains the PIRS primers according to the invention and for use in the diagnosis of 1) leukaemias, 2) meningitis or encephalitis and
  • the reagent kit for the detection of nucleic acid amplification products comprises: a) at least one nucleic acid which is used as a primer and which comprises the following elements in the 5'-3 'direction: a 5'-homo-tail sequence, a probe binding sequence which acts as a primer -integrated reporter sequence, and a sequence specific for the nucleic acid to be amplified, b) at least one nucleic acid which is used as a primer and which comprises the following elements in the 5'-3 'direction: a 5'-homo-tail Sequence, and a sequence specific for the nucleic acid to be amplified, c) at least one probe which can be detected on the basis of labeling groups and which is specific for the complementary strand of the nucleic acid according to a), d) deoxyribonucleotides, e) one for extending the nucleic acid Primer according to a) and b) suitable enzyme, and f) a suitable buffer and optionally further
  • the kit can comprise nucleic acids with the homo-tail sequence, or it can comprise primers in which at least one thymidine base is replaced by uracil, in which case the kit furthermore contains the enzyme uracil-N-glycosylase.
  • the enzyme suitable for the extension is preferably a thermostable DNA polymerase which has a 5'-3 'exonuclease activity.
  • the probe preferably carries the dye molecules 6-FAM, TET, JOE, HEX, VIC TM, fluorescein, LCRed 640 or LCRed 705 at its 5 'end and the quencher molecule TAMRA or DABCYL at its 3' end.
  • the probe is particularly preferably a “molecular beacon”.
  • the kit may also include three different probes that interact with the complementary strand of the probe binding sequence, with the first of the three probes carrying the fluorescein dye molecule at its 3 'end, and the LC Red 640 dye molecule at its 5' end and the third probe carries the dye molecule LC Red 705 at its 5 'end.
  • the kit preferably contains primers which hybridize with m-BCR-cDNA or / and M-BCR-cDNA or / and TEL / AML-cDNA or / and AML / ETO-cDNA.
  • the primers and PIRS primers particularly preferably hybridize with genomic herpesvirus DNA or / and with genomic DNA coding for the 1 6S rRNA from Haemophilus influenzae or / and Neisseria meningitidis or / and Streptococcus pneumoniae, even more preferably with interleukin-2 cDNA or / and interleukin-4 cDNA or / and interleukin-5 cDNA or / and interleukin-10 cDNA or / and interferon-cDNA.
  • a 50 ⁇ l reaction mixture produced using a reagent kit according to the invention contains: 2 ⁇ l of the sample to be examined
  • thermostable DNA polymerase 5 ⁇ "homo-tail" primer (500 nM final concentration) 0.15 vl thermostable DNA polymerase
  • the reagent kit according to the invention comprises at least one nucleic acid for use as a primer in nucleic acid amplification reactions, characterized in that it comprises the following elements in the 5'-3 'direction: a 5'-homo-tail sequence, a probe binding sequence which acts as a primer Integrated reporter sequence (PIRS) and whose complementary strand can interact with at least one probe with detectable marker groups, and a sequence specific for the nucleic acid to be amplified.
  • PIRS primer Integrated reporter sequence
  • Oligonucleotide primers of the type described above are a further subject of the invention.
  • Reagent kits the implementation of which is described in Examples 1, 3, 4, 5 and 6. Their sequences are shown in the sequence listing.
  • SEQ ID No. 1 ABL internal Hands NPY antisense
  • SEQ ID No. 2 TEL internal Hands ENT sense
  • SEQ ID No. 3 ETO internal hands ENT antisense
  • SEQ ID No. 4 HSV1 internal hands ENT sense
  • SEQ ID No. 6 Men intern Hands NPY Rec sense
  • SEQ ID No. 7 Hae intern Hands NPY Rec sense
  • SEQ ID No. 8 Pneu internal Hands NPY Rec sense
  • SEQ ID No. 9 IL-2 internal hands HNNP sense
  • SEQ ID No. 1 0 IF-g internal hands ENT sense
  • SEQ ID No. 1 1 IL-4 internal hands NPY Rec sense
  • SEQ ID No. 1 2 IL-5 internal hands NPY Rec sense
  • SEQ ID No. 1 3 IL-1 0 internal Hands NPY Rec sense.
  • SEQ ID No. 1 4 * ABLrvinBeideHanNPY +
  • SEQ ID No. 1 8 * TELfwinREHHANHNNO + -U
  • SEQ ID No. 1 9 * ETOrvinKasuHANHNNO + -U
  • FIGS. 1 and 2 show the result of carrying out example 1.
  • Fig. 2 is the result of a multiplex PCR using PIRS primers with the TaqMan TM method. The result is shown as it is obtained from the ABI-PRISM TM Sequence Detection System. On the X axis is the number of completed PCR cycles (0 - 35) is shown. The Y axis indicates the associated fluorescence intensities measured in the respective cycles. The black line parallel to the X axis indicates the limit below which the fluorescence signal is referred to as negative (threshold). It is determined mathematically by the device. In Figure 2 only the VIC signals are visible. The samples are labeled as follows:
  • Example 1 Using PIRS primers, a method was developed which, with a single PCR reaction, makes it possible to differentiate between several genetic markers in leukemia cells which are associated with a particularly good or bad prognosis of the disease. The results of such a test can be used directly to determine the therapy.
  • Two splicing variants of the BCR / ABL rearrangement (referred to as m-BCR and M-BCR), which corresponds cytogenetically to the translocation t (9; 22), were also included as markers with poor prognosis (hereinafter referred to as "baddies") known as the Philadelphia chromosome.
  • the corresponding TaqMan TM probe was labeled 5'-VIC / TAMRA-3 '.
  • chromosomal translocation t (1 2; 21) and t (8; 21) were included as a chromosomal translocation with a good prognosis in childhood leukemia.
  • the resulting chimeric mRNAs are referred to as "TEL / AML” or "AML / ETO" fusion genes.
  • the corresponding probe was labeled 5'-FAM / TAMRA-3 '.
  • RNA Since chimeric mRNA molecules are to be detected (these result from a fusion of two different gene fragments, which was caused by the chromosomal translocation), the RNA must be rewritten into cDNA (complementary DNA) according to conventional methods before the actual PCR.
  • cDNA complementary DNA
  • a normal PCR run was carried out before the actual PCR reaction was connected under fluorescence-optical product detection.
  • the decisive PCR reaction in the TaqMan TM procedure was carried out as the second run of a nested PCR.
  • the nested PCR (originally described by Chamberlain et al.) Is a known and widely used method for increasing the PCR sensitivity and specificity.
  • the target sequences are pre-amplified.
  • a microiter of the reaction product of the first run is transferred as starting material for the second run of the nested PCR.
  • the primers used in the second run bind within the pre-amplified DNA sections.
  • All primers used in the first run of the nested PCR correspond to their structure according to normal PCR primers without any additional sequences. They are all marked with an arrow ( ⁇ ) in front of the abbreviation.
  • 5'-homo-tail 5'-GCGTACTAGCGTACCACGTGTCGACT
  • VIC probe NPY-Rec * (for baddies): 5 '- ⁇ VIC) -TGTGGTAGCATTTGCAGTCTGCTGGC- (TAMRA)
  • ABL-internal Hands NPY antisense (SEQ ID No. 1): (This is the counterprimer for both primers mentioned above, both for M-BCR and for mBCR):
  • a 50 ⁇ l reaction mixture contains the following components:
  • Polymerase hot start) then 5 cycles at 95 ° C - 1 5 s ⁇ 60 ° C - 1 min ⁇ 72 ° C - 1 min then 35 cycles at 95 ° C - 1 5 s ⁇ 68 ° C - 1 min ⁇ 72 ° C - 1 min
  • FIGS. 1 and 2 The results of the application example are shown in FIGS. 1 and 2.
  • a multiplex PCR with PIRS primers can be used to detect several genetically heterogeneous diseases at the same time.
  • a probe color is reserved for each disease to be considered.
  • the individual PCR primers receive the specificity for a single point mutation due to different 3 'ends.
  • the corresponding groups of primers can each be assigned to a disease in question.
  • a fluorescent color could be reserved for the detection of various point mutations in the CFTR gene in order to detect cystic fibrosis.
  • a second PIRS could be installed in a PCR primer set in order to detect mutations in the PIZ gene which are present in the alpha-1 antitrypsin deficiency in the same PCR reaction.
  • Example 3 A multiplex PCR with PIRS primers can also be used to detect different groups of infectious agents in a single PCR approach. This can be particularly helpful for clinical questions if the individual groups require a different therapeutic approach.
  • both bacterial and viral diseases can be detected in a single multiplex PCR. Becomes a probe color for all bacterial - and a different probe color for all If the viral pathogen is reserved, the necessary therapy can be derived immediately from the PCR result: broad-spectrum antibiotics (e.g. cefotaxime) for bacterial pathogens or antivirals (e.g. acyclovir) for herpes virus infections. Only two primer sets are used in the first run of the nested PCR.
  • broad-spectrum antibiotics e.g. cefotaxime
  • antivirals e.g. acyclovir
  • the primer sequences are taken from the following work: Casas et al, Detection of both Herpes simplex and Varicella -Zoster Viruses in cerebrospinal fluid from patients with encephalitits, J. Med. Virol. Vol. 50: 82-92, 1 996).
  • the second binds to highly conserved bacterial DNA regions that code for sections of the 1 6S rRNA of bacteria (Eubacteriae). It can be used to detect and amplify the corresponding genome areas of a large number of bacteria (see Radström et al., J. Clin. Microbiology, Vol. 32: 2738-2744, 1 994).
  • the delimitation of the clinically relevant pathogenic bacteria takes place only in the second run of the nested PCR using specific primer sets with PIRS primers on a fluorescence-optical system for the detection of the PCR products.
  • the bacteria-specific primer sequences are the work of Radström et al. taken (see above); the herpes virus-specific primer sequences come from the work of Casas et al. (see above).
  • Another special feature is the execution of the bacteria-specific primer set as a "semi-nested PCR”.
  • the universal antisense primer for the detection of bacteria is also used in the second run as a counterprimer to the bacterial species-specific PIRS primers.
  • Eubac-exdo Eubac-Hands-antisense:
  • 5'-homo-tail 5'-GCGTACTAGCGTACCACGTGTCGACT
  • GA FAM probe HNNO * for the two types of herpes virus: 5 '- (FAM) -TCCTGCTGCGATGCAATGCTTTTC- (TAMRA)
  • VLC probe NPY-Rec * (for the three pathogenic bacteria mentioned above) 5 '- (VIC) -TGTGGTAGCATTTGCAGTCTGCTGGC- (TAMRA)
  • Herpes virus type 1 Herpes virus type 1:
  • HSV1-intem-Hands-HNNO-sense SEQ ID No.4: '-GCGTACTAGCGTACCACGTGTCGACT-GA TCCTGCTGCGATGCAATGCTTTTC-GTCCTCCGCGTCGGGTCGGGCC
  • Herpesvirus type 2 HSV2-intem-hands-HNNO-sense (SEQ ID No.5): '- G C G TA C TA G C G TA C CA C G TG TC GA C T- G A - TCCTGCTGCGATGCAATGCTTTTC-GTCCTCCGCGTGGGCCCGGAG
  • Neisseria meningitidis meningitidis (meningococcal):
  • Men-intern-Hands-NPY-Rec-sense (SEQ ID No.6): 5 '- GCG TA C TA GCG TA C CA CG TG TC GA C T- GA - TGTGGTAGCATTTGCAGTCTGCTGGC-TGTTGGGCAACCTGATTG
  • Streptococcus pneumoniae (pneumococci):
  • Pneu-intern-Hands-NPY-Rec-sense SEQ ID No.8: '- G C G TA C TA G C G TA C CA C G TG TC GA C T- G A TGTGGTAGCATTTGCAGTCTGCTGGC-GTACAACGAGTCGCAAGC
  • Eubac-Hands-antisense '- G C G TA C TA G C G TA C C A C G T G T C G A C T AAGGAGGTGATCCA (G / A) CCGCA (G / C) (G / C) TTC
  • PCR reaction conditions (In comparison to the PCR conditions described in the previous application example, there are no differences except for an annealing temperature reduced from 60 to 55 ° C in the first five cycles of multiplex PCR with PIRS primers).
  • a 50 ⁇ l reaction mixture contains the following components:
  • a multiplex PCR with PIRS primers can also use the ability to quantitatively determine the amount of PCR product that the fluorescence-optical detection systems described above possess.
  • the respective total amount of several groups of nucleic acid target sequences can thus be determined with a single PCR reaction. It is thus possible to assign different groups of cytokine mRNAs to a probe in order to then determine with a single PCR reaction whether, for example, a T H1 or T H2 cytokine response predominates in a specific sample.
  • a PIRS was used to detect the cytokines interleukin-2 and interferon gamma.
  • the corresponding probe carries the fluorescence signal FAM.
  • the intensity of the FAM signal is thus proportional to the sum of the two target sequences interleukin-2 and interferon-gamma as markers of a T H1 response.
  • the second PIRS generates the binding site for a VIC marked probe.
  • the PIRS-PCR primer sets serve to detect interleukin-4, interleukin-5 and interleukin-10 as representatives of a T H2 response.
  • a nested PCR is carried out to increase the sensitivity.
  • Interleukin-1 0
  • FAM probe HNNO * (for T H1 ): 5 '- (FAM) -TCCTGCTGCGATGCAATGCTTTTC- (TAMRA)
  • HNNO HNNO
  • NPY-Rec internal laboratory abbreviations for the identification of the different probe sequences.
  • IL-2-internal-hands-ENT-sense SEQ ID No.9: ⁇ '-GCGTACTAGCGTACCACGTGTCGACT-
  • IF-g-intern-Hands-HNNO-sense (SEQ ID No. 10): 5 '- G C G TA C TA G C G TA C CA C G TG TC GA C T- G A TCCTGCTGCGATGCAATGCTTTTC-CTGTCGCCAGCAGCTAAAACAGG
  • IF-g-internal-hands-antisense ⁇ '-GCGTACTA GCGTACCA CGTGTCGA C7-AAATTCAAATATTGCAGGCAGG
  • IL-4-internal-Hands-NPY-Rec-sense SEQ ID No.11: ⁇ '- G C G TA C TA G C G TA C CA C G TG TC GA C T- G A
  • IL-4-internal-hands-antisense 5 , -GCG74C74GCG74CC ⁇ CG7G7CG .C7-GAGTGTCCTTCTCATGGTGG Interleukin-5:
  • IL-5 internal hands antisense ⁇ '-GCGTACTA GCGTA CCA CGTGTCGA C7-TTGCAGGTAGTCTAGGAATTGG
  • Interleukin-10 IL-10-internal-Hands-NPY-Rec-sense (SEQ ID No. 13):
  • IL-10 internal hands antisense ⁇ '-GCGTA CTA GCGTA CCA CGTGTCGA C7-CTTTGTAGATGCCTTTCTCTTGG
  • a 50 ⁇ l reaction mixture contains the following components:
  • Example 5 serves the same goal as Example 1.
  • the same leukemia cell lines were used as starting material.
  • a modified primer / probe combination was chosen which allows amplification at higher temperatures.
  • 5'-Homo-Tail ⁇ '-gCg TACTAgCgTA CCA Cg Tg TCgACT
  • VlC probe NPYRECplus * (for badies): 5 '- (VIC) -CCCgTgTggTAgCATTTgCAgTCTgCTggC- (TAMRA)
  • MBCRfwinK562HAN '- g C g TACTA g C g TACCAC g T g TC g ACT - TGCAGAGTGGAGGGAACATCCGGGAG
  • a 50 ⁇ l reaction mixture contains the following components:
  • VlC probe NPY-Rec 400 nM final concentration
  • UNG substance to eliminate contamination
  • Example 6 serves the same goal as Example 1.
  • the same leukemia cell lines were used as the starting material.
  • the primer sequences from Example 5 were used, but with the decisive modification that Ts (deoxythymidine residues) were replaced by Us (deoxyuracil residues).
  • all primer oligonucleotides that are no longer required can be digested with the aid of the enzyme uracil-N-glycosylase before the amplification with the help of the homo-tail sequences and the simultaneous generation of fluorescence signals.
  • the competition between the primers with multiple domains, which also carry a PIRS domain, and the fluorescence-labeled probes is removed. Competition with the homo-tail primers is also abolished. Such a competition would reduce the PCR efficiency especially if a large number of target sequences are to be detected simultaneously and thus a large number of different primers with several domains have to be used in one reaction mixture.
  • Primer sequences for the first run of a nested PCR (first run is not listed in the PCR protocol): "Baddies":
  • 5'-homo-tail ⁇ '-gCgTACTAgCgTACCACgTgTCgACT ("Ts" as "Us” within primers with multiple domains)
  • FAM probe HNNOplus * (for thoughts): 5 '- (FAM) -CCCTCCTgCTgCgATgCAATgCTTTTCCgC- (TAMRA)
  • VIC VIC
  • TAMRA TAMRA
  • a 50 ⁇ l reaction mixture contains the following components:

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Detektion von Produkten einer Nukleinsäureamplifikationsreaktion, wobei neuartige Primer mit einer Primer-integrierten Reporter-Sequenz (PIRS) und dafür spezifische Sonden eine hochempfindliche quantitative Bestimmung der Amplifikate ermöglichen. Die Erfindung betrifft weiterhin Reagenzienkits und Nukleinsäuren, die als PIRS-Primer geeignet sind.

Description

Verfahren zur Detektion von Nukleinsäureamplifikationsprodukten unter Verwendung von Primern mit "Primer-integrierten Reporter-Sequenzen" (PIRS)
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Detektion von Produkten einer Nukleinsäureamplifikationsreaktion, wobei neuartige Primer mit einer Primer-integrierten Reporter-Sequenz (PIRS) und dafür spezifische Sonden eine hochempfindliche quantitative Bestimmung der Amplifikate ermöglichen. Die Erfindung betrifft weiterhin Reagenzienkits und Nukleinsäuren, die als PIRS-Primer geeignet sind.
Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) stellt ein Verfahren zur exponentiellen Vermehrung von spezifischen DNA-Abschnitten dar.
Zur Automatisierung der Detektion von Produkten einer Polymerase- Kettenreaktion wurden bisher drei Verfahren entwickelt, die eine fluoreszenzoptische Detektion der Reaktionsprodukte während der laufenden Reaktion in quantitativer Hinsicht ermöglichen und so die Anzahl von Molekülen der Zielsequenz, die im PCR-Ansatz vor Beginn der Reaktion vorhanden waren zu ermitteln helfen.
Das erste Verfahren betrifft die TaqMan™-Technologie der Firma Applied Biosystems/Perkin Eimer, die das ABI-PRISM™-Sequenzdetektionssystem einschließt. Das TaqMan-System nutzt die 5'-Nuklease-Aktivität der Taq- DNA-Polymerase, wobei ein Oligonukleotid verwendet wird, das am 5'-Ende mit einem Fluoreszenzmolekül und am 3'-Ende mit einem Quenchermolekül markiert ist, wobei die Taq-DNA-Polymerase durch ihre 5'- Exonukleaseaktivität das Fluoreszenzmolekül freisetzt, dessen Signal im ABI- P R I S M - Seq u e n zd ete kti o n ssyste m n a c h g e w i e se n wi rd . A l s Fluoreszenzfarbstoffe stehen die Moleküle 6-FAM, TET, JOE, VIC™ und HEX zur Verfügung, die mit dem Quenchermolekül TAMRA kombiniert werden können. Zusätzlich können sogenannte "dark quencher eingesetzt werden, die im Infrarotbereich emittieren, wodurch auch TAMRA als Reporterfarbstoff eingesetzt werden kann. Die Synthese von TaqMan™- Sonden wird von verschiedenen Herstellern angeboten.
Das zweite System betrifft das Light-Cycler™-System der Firmen Boehringer Mannheim/Hoffmann La Röche. Hierbei sind die Fluoreszenzfarbstoffe auf zwei verschiedene Oligonukleotide verteilt. Am 3'-Ende des ersten Oligonukleotids befindet sich der Fluoreszenzfarbstoff Fluorescein, während das sich stromabwärts vom ersten Oligonukleotid anlagernde zweite Oligonukleotid an seinem 5'-Ende den Fluoreszenzfarbstoff LC Red 640 aufweist. Das Fluorescein wird von einer LED als Lichtquelle angeregt und emittiert Licht, das über Fluoreszenzresonanzenergietransfer das zweite Fluoreszenzmolekül (LC Red 640 oder LC Red 705) anregt. Das von dem zweiten Farbstoff emittierte Licht wird über einen entsprechenden Filter detektiert. Eine Anregung des zweiten Farbstoffs kann nur dann erfolgen, wenn sich durch die Anlagerung der beiden Oligonukleotide an ihren Komplementärstrang die beiden Farbstoffmoleküle in räumlicher Nähe (Distanz von 1 bis 5 Nukleotiden) befinden, erfolgen. Das Prinzip des Systems beruht also auf der sekundären Anregung eines zweiten Fluoreszenzfarbstoffs, die erst durch die Generation von PCR-Produkt ermöglicht wird. Beim bereits beschriebenen TaqMan™-System dagegen wird vom Fluoreszenzfarbstoffmolekül emittiertes Licht vom Quenchermolekül absorbiert, weswegen erst nach der Hydrolyse des Fluoreszenzfarbstoffmoleküls vom Oligonukleotid durch die 5'-3'- Exonukleaseaktivität der Taq-DNA-Polymerase die Quencherwirkung aufgehoben und emittiertes Licht gemessen werden kann.
Eine dritte Technik zur fluoreszenzoptischen Detektion der PCR- Produktgeneration erwendetsogenannte "Molecular Beacons". "Molecular Beacons" sind aus drei Domänen aufgebaute, als Sonden eingesetzte Oligonukleotide. Ein zentraler Sequenzabschnitt ist zu einer Zielsequenz im PCR-Produkt komplementär. 5'- und 3'-wärts davon befinden sich zwei zueinander komplementäre Sequenzabschnitte. Am äußersten 5'- und 3'- Ende befinden sich der Reporterfarbstoff bzw. der Quencher. Ist diese Sonde nicht mit ihrem zentralen Abschnitt an die komplementäre Zielsequenz gebunden, so formen die beiden zueinander komplementären endständigen Abschnitte einen intramolekularen Doppelstrang. Hierdurch kommen der Reporterfarbstoff an einem Ende und der Quencher am anderen Ende in enge Nachbarschaft, wodurch der Quencher das vom Reporterfarbstoff emittierte Lichtsignal neutralisiert. Durch die Synthese von PCR-Produkt können zunehmend mehr "Molecular Beacons" mit ihrer zentralen Domäne an die Zielsequenz binden, wodurch Reporterfarbstoff und Quencher räumlich voneinander getrennt werden . Das vom Reporterfarbstoff emittierte Licht ist in einer zur Menge der Zielsequenz proportionalen Intensität detektierbar. Verschiedene Reporterfarbstoffe stehen zur Verfügung (z. B. 6-FAM, TAMRA, TET, Cy3, Cy5, Texas Red™, HEX) . Als Quencher wird in der Regel DABCYL verwendet. Molecular Beacons können in verschiedenen Geräten eingesetzt werden, die zur Detektion der entstehenden Fluoreszenzsignale geeignet sind, wie z. B. den Sequence Detection Systeme™ 7700, 7200 und 5700 der Firma PE Biosystems, dem Rotor-Gene RG2000™ Real-Time Cycler der Firma Corbett Research oder dem FMBIO II™ Fluorescence Imaging System der Firma Hitachi.
Diese auf Detektion der durch die PCR-Reaktion generierten Fluoreszenzsignale basierenden Systeme ermöglichen eine hochempfindliche Bestimmung von Molekülen einer DNA-Zielsequenz und machen eine aufwendige Produktanalyse, wie z. B. durch gelelektrophoretische Auftrennung nach der eigentlichen PCR-Reaktion überflüssig. Ein großer Nachteil der herkömmlichen Systeme ist, daß für jede zu erfassende Zielsequenz eine spezifische Sonde benötigt wird, entweder ein an beiden Enden fiuoreszenzmarkiertes Oligonukleotid wie beim TaqMan™-System, oder zwei einfach fluoreszenzmarkierte Oligonukleotide wie beim Light- CyclerTM-System oder der Einsatz von Molecular Beacons.
Die oben genannten Systeme sind zwar grundsätzlich einsetzbar für Multiplexanwendungen, d.h. es können mehrere Zielsequenzen hierbei gleichzeitig amplifiziert werden. Ein Nachteil dieser Anwendungsart bei diesen bekannten Verfahren ist jedoch, daß zur Detektion für jede einzelne Zielsequenz eine eigene Sonde bzw. ein eigenes Sondenpaar benötigt wird, die/das spezifisch an einen internen Bereich der durch die Amplifikation entstandenen Zielsequenz binden muß. Sollen viele verschiedene Zielsequenzen nebeneinander nachgewiesen werden, so wird der Reaktionsansatz wegen der steigenden Anzahl verschiedener Detektionssonden relativ teuer und die zunehmende Zahl der Sonden kann die RCR-Amplifikation beeinträchtigen.
Ein weiteres Problem, das sich bei der Polymerase-Kettenreaktion stellt, ist die relativ häufige Bildung von Primer-Dimeren. Primer-Dimere sind doppelsträngige Nukleinsäuremoleküle, die entstehen, wenn zwei Primer über einige Nukleotide direkt miteinander hybridisieren und anschließend entlang dem Komplementärstrang elongieren. Diese Produkte können wiederum mit weiteren Primern hybridisieren, was zu einem Verlust an Primermaterial unter Bildung der unerwünschten Primer-Dimere führt. Zur Lösung dieses Problems wurde die Verwendung von Homo-Tail-Sequenzen an den 5'-Enden der Primer vorgeschlagen (Brownie et al. ( 1 997), Nucleic Acids Research 25, 3235-3241 ) . Diese Primer enthalten somit einen für die zu amplifizierende Sequenz spezifischen Abschnitt am 3'-Ende und einen Homo-Tail-Abschnitt am 5'-Ende. Die Homo-Tail-Sequenz ist eine Sequenz, die für die eingesetzten Vorwärts- und Rückwärts-Primer identisch ist. Bei der Bildung von Primer-Dimeren entstehen somit nach der Aufschmelzung der enlongierten Dopplestränge Einzelstränge mit komplementären 5'- und 3'-Enden, die miteinander hybridisieren und sogenannte "Panhandle"- Strukturen bilden. Diese Strukturen stehen für weitere Hybridisierungen mit Primern nicht mehr zur Verfügung und verhindern die Amplifikation der Primer-Dimere. Brownie et al. verwendeten weiterhin Tail-spezische Primer (Tags), die nach einigen Amplifikationszyklen, nämlich nachdem die Homo- Tail-Sequenz in den zu amplifizierenden Abschnitt eingefügt worden ist, zum Primen verwendet werden können. Die Tags haben den Vorteil, daß sie kürzer sind sind und die Bildung von Primer-Dimeren um mehrere Zehnerpotenzen reduzieren. Das System wurde nicht für eine fluoreszenzgekoppelte Detektion der entstehenden PCR-Produkte entwickelt. Dies wäre zwar möglich, allerdings auch hier wiederum mit dem Nachteil, daß für jede zu amplifizierende Sequenz eine eigene spezifische Sonde notwendig wäre. Darüber hinaus wird die der Amplifikation über die Homo- Tail-Sequenzen vorangeschaltete spezifische Reaktion bei niedrigeren Temperaturen durchgeführt, als die Reaktion mit den Tags. Grundsätzlich läßt sich die Spezifität der PCR-Reaktion steigern, indem eine möglichst hohe Primerbindungstemperatur gewählt wird, die wiederum relativ lange Primer erfordert, die bei solchen Temperaturen noch binden können. Die Temperaturbegrenzung nach oben auf etwa 74°C resultiert aus dem Aktivitätsoptimum des verwendeten Polmeraseenzyms. Da dieser Temperaturbereich mit optimaler Spezifität für die Reaktion mit den Tags reserviert ist, folgt zwangsläufig, daß die bei niedrigerer Temperatur durchgeführte Amplifikation über die sequenzspezifischen Primer nicht unter optimalen Spezifitätsbedingungen abläuft. Es besteht die Gefahr, daß die zusätzlich zu den an die Zielsequenzen bindenden Primerabschnitten noch vorhandenen Bereiche (Tails, Reportersequenzen) unspezifische Bindungen verursachen.
Die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe besteht somit darin, durch geeignete Veränderungen der Primer- Strukturen bei Anwendung von Nukleinsäure-Amplifikationstechniken, indbesondere desTaqMan™- und des Light Cycler™-Systems, sowie anderer Systeme zur fluoreszenzoptischen Detektion von PCR-Produkten, die Zahl parallel zu detektierender Zielsequenzen zu erhöhen.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe gelöst durch ein Verfahren zur Detektion von Produkten einer Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion, umfassend die Schritte: i) Bereitstellen von zu amplifizierenden Nukleinsäuren, ii) Durchführen einer Amplifikationsreaktion unter Verwendung von mindestens zwei Primern, iii) Detektieren der in ii) gebildeten Amplifikationsprodukte unter
Verwendung einer oder mehrerer dafür spezifischer Sonden, dadurch gekennzeichnet, daß a) einer der für die Amplifikationsreaktion eingesetzten Primer in 5'-3'-Richtung folgende Elemente umfasst: eine 5'-Homo-Tail- Sequenz, eine Sondenbindungssequenz, die als primer- integrierte Reportersequenz (PIRS) bezeichnet ist, und eine für die zu amplifizierende Nukleinsäure spezifische Sequenz, b) ein anderer der für die Amplifikationsreaktion eingesetzten Primer in 5'-3'-Richtung folgende Elemente umfasst: eine 5'- Homo-Tail-Sequenz, und eine für die zu amplifizierende
Nukleinsäure spezifische Sequenz, und c) die zur Detektion eingesetzten Sonden mit dem Komplementärstrang der Sondenbindungssequenz des einen der beiden Amplifikationsprimer wechselwirken können, und die eingesetzten Sonden detektierbare Markierungsgruppen tragen.
Durch den Einsatz von Primern mit primer-integrierten Reportersequenzen (PIRS-Primern) istbei Multiplex-PCR-Anwendungen mitfluoreszenzoptischer Produktdetektion nur mehr eine Sondenoligonukleotidsequenz pro PIRS notwendig. Eine Markierung jedes einzelnen spezifischen Primers mit Fluoreszenzfarbstoffmolekülen entfällt, so daß das erfindungsgemäße Verfahren ei nen g roßen Vorteil g egen über h erkömmlichen Detektionsverfahren von Produkten einer Amplifikationsreaktion, insbesondere bei Multiplex-PCR darstellt.
H i e rb e i kö n ne n den ve rsc h i ed en e n p a ral l e l ei n setzba re n Fluoreszenzfarbstoffen nicht nur einzelne Zielsequenzen sondern ganze Gruppe von Zielsequenzen zugeordnet werden, die dann in multiplex- Reaktionen gleichzeitig detektiert und anhand der charakteristischen Fluoreszenz voneinander diskriminiert werden können. Neben der Ausweitung der Zahl in einer PCR-Reaktion parallel detektierbarer Zielsequenzen lassen sich durch die Möglichkeit des Nachweises mehrerer Zielsequenzen mit einem einzelnen Sondenkonstrukt Kosten einparen, da die Herstellung fluoreszenzmarkierter Sonden relativ teurer ist. Hierbei sollte die Multiplex-Anwendung, die für die heutige Diagnostik immer wichtiger wird, nicht beeinträchtigt werden.
Die Erfindung basiert auf einem neuartigen Primer-Design, das in einem ersten Aspekt der Erfindung Primer mit primer-|ntegrierten
Reportersequenzen ("PIRS-Primer") vorsieht. Die PIRS-Primer (mit integrierter Sondenbindungssequenz/Reportersequenz) haben dabei folgenden allgemeinen Aufbau
5'-Homo-Tail - Sondenbindungssequenz/PIRS - Spezifische Sequenz-3'
Der in der PCR zu verwendende zweite Primer mit entgegengesetzter Polarität muß keine PIRS enthalten und hat damit den folgenden schematischen Aufbau:
5'- Homo-Tail - Spezifische Sequenz - 3'
Es ist jedoch auch möglich, zwischen diesen beiden Domänen eine zusätzliche primerintegrierte Domäne einzufügen, die nicht der fluoreszenzbasierenden Produktdetektion dient, sondern bestimmte post- PCR Produktanalysen ermöglicht. Diese muß sich in ihrer Sequenz von der zur fluoreszenzoptischen PCR-Produktdetektion verwendeten PIRS-Domäne unterscheiden und kann z. B. als Anlagerungsstelle für einen Sequenzierprimer dienen, mit dem nach der PCR-Reaktion die Nukleinsäuresequenz des PCR-Produkts ermittelt wird.
Ein wesentliches Merkmal der Erfindung ist, daß beide PCR-Primer an ihrem 5'-Ende eine als "5'-Homo-Tail" bezeichnete zusätzlich angefügte Sequenz aufweisen. Diese "5'-Homo-Tail"-Sequenz kann frei gewählt werden, sie ist jedoch vorzugsweise auch bei einer Kombination mehrerer Primersätze zu einer Multiplex-PCR bei allen Primern identisch und sollte in ihrer Schmelztemperatur etwas höher liegen als der die "spezifische Sequenz" definierende Primerabschnitt. Das zugrundeliegende Prinzip entspricht der " HANDS"-PCR-Technologie (Homo-Tag-Assisted-Non-Dimer-System) (Brownie et al., siehe obern; EP-0 731 1 77; EP-0 332 435) . Durch die Verwendung des "HANDS"-PCR-Prinzips wird die unerwünschte Bildung von Primer-Dimeren während der PCR-Reaktion um mehrere Zehnerpotenzen verringert.
Die primerintegrierte Sequenz (PIRS) ist eine Sequenz, die für die eingesetzten Sonden spezifisch ist, d.h. daß die Amplifikationsprodukte anhand dieser Sequenzen mit den verwendeten Sonden hybridisieren können.
Die spezische Sequenz ist spezifisch für die zu amplifizierenden Nukleinsäureabschnitt, mit dem sie hybridisiert und die Elongierung ab diesem hybridisierten Abschnitt initiiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden Primer verwendet, in denen bis auf den Homo-Tail-Abschnitt mindestens eine der Thymidinbasen durch Uracil ersetzt wurde. In diesem Fall wird dann dem Amplifikations-Reaktionsgemisch ein Enzym zugesetzt, welches in der Lage ist, Nukleinsäuren mit Uracilbasen zu degradieren, bevorzugt ist Uracil-N- Glykosylase.
Werden in allen Bereichen der verwendeten PCR-Primer bis auf den " Homo- Tail"-Abschnitt eine oder mehrere Thymidinbasen durch Uracil ersetzt (Grace et al., 1 998, Degradable dUMP outer primers in merged tandem (M/T)-nested PCR: Low and Single target amplification, Analytical Biochemistry 263: 85-92), so kann die Generation von Primer-Dimeren zusätzlich reduziert werden. Hierbei wird dem PCR-Ansatz nach den ersten drei bis fünf Zyklen, während der die sequenzspezifischen 3'-Enden der Mehrdomänen-Primer (Spezifische Sequenz + Homo-Tail + PIRS) sich an ihre jeweiligen Zielsequenzen anlagern und PCR-Produkte mit dem universellen 5'-"Homo-Tail" generiert werden, ein Verdau mit dem Enzym Uracil-N-Glykosylase zwischengeschaltet. Durch Entfernung der Uracil- Basenreste aus der DNA-Kette und anschließender Hydrolyse bei 95 °C werden alle Primerdomänen zerstört, die für die weitere ausschließlich über die "Homo-Tails" vermittelte Amplifikation nicht mehr benötigt werden und nur noch zur Generation unerwünschter Produkte, wie Primer-Dimeren beitragen. Auch eventuell schon entstandene Primer-Dimere werden weitgehend zerstört, da die in ihnen enthaltenen Primeranteile mit den Uracilresten abgebaut werden. Außerdem wird durch Elimination der in den Mehrdomänen-Primern enthaltenen PIRS deren Kompetition mit den fluoreszenzmarkierten Reportersonden aufgehoben, was zu einer effizienteren Signalgeneration während der PCR beiträgt.
Es müssen nicht sämtliche Thymindin-Basen durch Uracil ersetzt werdem, um die genannte Ausführungsform zu verwirklichen. Es ist jedoch bevorzugt, daß der Verdau zu Primerfragmenten führt, die nicht länger als 8 bis 1 0 Nukleotide sind. In einer erfindungsgemäßen Multiplex-PCR mit PIRS-Primern lassen sich mit den oben beschriebenen Verfahren mehrere Primersätze kombinieren, die aufgrund unterschiedlicher "spezifischer Sequenzen" am 3'-Ende des ersten Primertyps die Detektion mehrerer Zielsequenzen in einem einzigen Reaktionsansatz erlauben. Bei der Bildung von PCR-Produkten entsteht eine zur Sondenbindungsstelle/Reportersequenz komplementäre Sequenz, mit der die Sondenoligonukleotide hybridisieren müssen. Durch den Einsatz mehrerer Sonden mit entsprechenden Fluoreszenzfarbstoffen z.B. nach dem TaqMan™-System lassen sich verschiedene Gruppen von Zielsequenzen unterscheiden. Dies wird anhand der unten dargestellten Beispiele verdeutlicht.
Der Einsatz der erfindungsgemäßen PIRS-Primer in Kombination mit den beschriebenen Maßnahmen zur Vermeidung der unerwünschten Bildung von Primer-Dimeren (HANDS-PCR), erlaubt es mit Hilfe der oben beschriebenen fluoreszenzoptischen Detektionssysteme, wie z.B. TaqMan™ und Light Cycler™ mit einer einzelnen Sonde bzw. einem Sondenpaar, die/das mit einem der zur Verfügung stehenden Fluoreszenzfarbstoffe markiert ist, eine große Zahl verschiedener Zielsequenzen in einem Reaktionsansatz zu detektieren. Zusätzlich können alle zur Verfügung stehenden Fluoreszenzfarbstoffe parallel mit Hilfe spezifischer Sonden eingesetzt werden. Somit ist es möglich, verschiedene Gruppen von Zielsequenzen einer Sonde bzw. einer dazugehörenden Fluoreszenzfarbe, zuzuordnen. Die Zielsequenzen der einzelnen Gruppen können in einer einzigen PCR-Reaktion parallel detektiert werden und in ihrer Gruppenzugehörigkeit anhand der zugeordneten Farbe der eingesetzten Sonde identifiziert werden, wodurch ein sehr hoher Automatisierungsgrad der PCR-Diagnose erreicht wird .
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Reagenzienkit, der die erfindungsgemäßen PIRS-Primer enthält und zum Einsatz in der Diagnose von 1 ) Leukämien, 2) Meningitis oder Enzephalitis und
3) Zytokin-Antworten geeignet ist, wie in den Beispielen verdeutlicht wird .
Der Reagenzienkit zum Nachweis von Nukleinsäureamplifikationsprodukten umfaßt: a) mindestens eine Nukleinsäure, die als Primer eingesetzt wird, und die in 5'-3'-Richtung folgende Elemente umfasst: eine 5'- Homo-Tail-Sequenz, eine Sondenbindungsequenz, die als primer-integrierte Reportersequenz bezeichnet ist, und eine für die zu amplifizierende Nukleinsäure spezifische Sequenz, b) mindestens eine Nukleinsäure, die als Primer eingesetzt wird, und die in 5'-3'-Richtung folgende Elemente umfasst: eine 5'- Homo-Tail-Sequenz, und eine für die zu amplifizierende Nukleinsäure spezifische Sequenz, c) mindestens eine Sonde, die aufgrund von Markierungsgruppen detektierbar ist, und die für den Komplementärstrang der Nukleinsäure gemäß a) spezifisch ist, d) Desoxyribonukleotide, e) ein zur Extension der Nukleinsäure-Primer nach a) und b) geeignetes Enzym, und f) einen geeigneten Puffer und gegebenenfalls weitere
Hilfsstoffe.
Zusätzlich kann der Kit Nukleinsäuren mit der Homo-Tail-Sequenz umfassen, oder er kann Primer umfassen, in denen mindestens eine Thymidinbase durch Uracil ersetzt ist, wobei dann der Kit weiterhin das Enzym Uracil-N- Glykosylase enthält.
Das für die Extension geeignete Enzym ist bevorzugt eine thermostabile DNA-Polymerase, die eine 5'-3'-Exonukleaseaktivität aufweist. Die Sonde trägt bevorzugt als detektierbare Markierungsgruppen an ihrem 5'-Ende die Farbstoffmoleküle 6-FAM, TET, JOE, HEX, VIC™, Fluorescein, LCRed 640 oder LCRed 705 und an ihrem 3'-Ende das Quenchermolekül TAMRA oder DABCYL. Besonders bevorzugt ist die Sonde ein "Molecular Beacon" .
Der Kit kann auch drei verschiedene Sonden umfassen, die mit dem Komplementärstrang der Sondenbindungssequenz wechselwirken, wobei die erste der drei Sonden an ihrem 3'-Ende das Farbstoffmolekül Fluorescein trägt, die zweite der drei Sonden an ihrem 5'-Ende das Farbstoffmolekül LC Red 640 trägt und die dritte Sonde an ihrem 5'-Ende das Farbstoffmolekül LC Red 705 trägt.
Vorzugsweise enthält der Kit Primer, die mit m-BCR-cDNA oder/und M-BCR- cDNA oder/und TEL/AML-cDNA oder/und AML/ETO-cDNA hybridisieren. Besonders bevorzugt hybridisieren die Primer und PIRS-Primer mit genomischer Herpesvirus-DNA oder/und mit für die 1 6S rRNA codierender genomischer DNA aus Haemophilus influenzae oder/und Neisseria meningitidis oder/und Streptococcus pneumoniae, noch stärker bevorzugt mit lnterleukin-2-cDNA oder/und lnterleukin-4-cD NA oder/und lnterleukin-5- cDNA oder/und lnterleukin-1 0-cDNA oder/und lnterferon- -cDNA.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält ein unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Reagenzienkits erzeugter 50 μl-Reaktionsansatz: 2 μ\ der zu untersuchenden Probe
5 μl 1 0 x PCR-Puffer
4 μ\ 25 mM MgCI2
2 μ\ dNTP-Mix (jeweils dATP, dCTP, dGTP und TTP)
5 μ\ "Homo-Tail"-Primer (500 nM Endkonzentration) 0, 1 25 vl thermostabile DNA-Polymerase
0,5 μ\ PIRS-Primer und Rückprimer ( 1 0 nM Endkonzentration) 5 μ\ Sondenoligonukleotid A mit Fluoreszenzfarbstoff 1 (200 nM Endkonzentration)
5 μ\ Sondenoligonukleotid B mit Fluoreszenzfarbstoff 2 (200 nM Endkonzentration) steriles Aqua bidest. ad 50 μl.
Der erfindungsgemäße Reagenzienkit umfasst mindestens eine Nukleinsäure zum Einsatz als Primer in Nukleinsäure-Amplifikationsreaktionen, dadurch gekennzeichnet, daß sie in 5'-3'-Richtung folgende Elemente umfasst: eine 5'-Homo-Tail- Sequenz, eine Sondenbindungssequenz, die als primer-integrierte Reportersequenz (PIRS) bezeichnet ist und mit deren Komplementärstrang mindestens eine Sonde mit detektierbaren Markierungsgruppen wechselwirken kann, und eine für die zu amplifizierende Nukleinsäure spezifische Sequenz.
Oligonukleotid-Primer der oben beschrieben Art (PIRS-Primer) stellen einen weiteren Gegenstand der Erfindung dar.
Die folgenden erfindungsgemäßen PIRS-Primer sind Grundlage des erfindungsgemäßen Verfahrens in der Ausführungsform der beanspruchten
Reagenzienkits, deren Durchführung in den Beispielen 1 , 3, 4, 5 und 6 beschrieben wird . Ihre Sequenzen sind im Sequenzprotokoll wiedergegeben.
SEQ ID No. 1 : ABL intern Hands NPY antisense, SEQ ID No. 2: TEL intern Hands HNNO sense,
SEQ ID No. 3: ETO intern Hands HNNO antisense,
SEQ ID No. 4: HSV1 intern Hands HNNO sense,
SEQ ID No. 5: HSV2 intern Hands HNNO sense,
SEQ ID No. 6: Men intern Hands NPY Rec sense, SEQ ID No. 7: Hae intern Hands NPY Rec sense,
SEQ ID No. 8: Pneu intern Hands NPY Rec sense,
SEQ ID No. 9: IL-2 intern Hands HNNP sense, SEQ ID No. 1 0: IF-g intern Hands HNNO sense,
SEQ ID No. 1 1 : IL-4 intern Hands NPY Rec sense,
SEQ ID No. 1 2: IL-5 intern Hands NPY Rec sense,
SEQ ID No. 1 3: IL-1 0 intern Hands NPY Rec sense. SEQ ID No. 1 4: *ABLrvinBeideHanNPY +
SEQ ID No. 1 5: *TELfwinREHHANHNNO +
SEQ ID No. 1 6: *ETOrvinKasuHANHNNO +
SEQ ID No. 1 7: *ABLrvinBeideHanNPY + -U
SEQ ID No. 1 8: *TELfwinREHHANHNNO + -U SEQ ID No. 1 9: *ETOrvinKasuHANHNNO + -U
Die Zeichnung besteht aus den Figuren 1 und 2, die das Ergebnis der Durchführung von Beispiel 1 zeigen.
Fig. 1 ist das Ergebnis einer Multiplex-PCR unter Einsatz von PIRS-Primern mit dem TaqMan™-Verfahren. Das Ergebnis ist so dargestellt, wie es vom ABI-PRISM™ Sequence Detection System erhalten wird. Auf der X-Achse ist die Zahl der abgelaufenen PCR-Zyklen (0 - 35) dargestellt. Die Y-Achse gibt d i e zu geh örigen i n d en jewei l i g e n Zykl e n gemessen e n Fluoreszenzintensitäten an. Die schwarze Linie parallel zur X-Achse gibt den Grenzwert an, unter dem das Fluoreszenzsignal als negativ bezeichnet wird (Threshold). Er wird mathematisch vom Gerät ermittelt. In Abbildung 1 werden nur die FAM-Signale sichtbar. Die Proben (samples) sind wie folgt bezeichnet: A4 = m-BRC (Baddy), A5 = M-BCR (Baddy) , A6 = TEL/AML
(Goody), A7 = AML/ETO (Goody); B4 - B7 = vier gleiche Negativkontrollen (mRNA der Zelllinie HL60 ohne Translokation); C4 = Wasserkontrolle der PCR (ohne Template) .
Fig. 2 ist das Ergebnis einer Multiplex-PCR unter Einsatz von PIRS-Primern mit dem TaqMan™-Verfahren. Das Ergebnis ist so dargestellt, wie es vom ABI-PRISM™ Sequence Detection System erhalten wird . Auf der X-Achse ist die Zahl der abgelaufenen PCR-Zyklen (0 - 35) dargestellt. Die Y-Achse gibt d ie zugehö rigen in d e n jeweilig en Zyklen gemessenen Fluoreszenzintensitäten an. Die schwarze Linie parallel zur X-Achse gibt den Grenzwert an, unter dem das Fluoreszenzsignal als negativ bezeichnet wird (Threshold) . Er wird mathematisch vom Gerät ermittelt. In Abbildung 2 werden nur die VIC-Signale sichtbar. Die Proben (samples) sind wie folgt bezeichnet:
A4 = m-BRC (Baddy), A5 = M-BCR (Baddy) , A6 = TEL/AML (Goody), A7 = AML/ETO (Goody); B4 - B7 = vier gleiche Negativkontrollen (mRNA der Zelllinie HL60 ohne Translokation); C4
= Wasserkontrolle der PCR (ohne Template) .
Beispiele Beispiel 1 Unter Einsatz von PIRS-Primern wurde ein Verfahren entwickelt, das es mit einer einzigen PCR-Reaktion ermöglicht, in Leukämiezellen zwischen mehreren genetischen Markern zu unterscheiden, die mit einer besonders guten oder schlechten Prognose der Erkrankung verbunden sind. Die Ergebnisse eines solchen Tests können direkt zur Therapiefestlegung verwendet werden. Als Marker mit schlechter Prognose (im Weiteren bezeichnet als "Baddies") wurden zwei Splicingvarianten des BCR/ABL- Rearrangements (als m-BCR bzw. M-BCR bezeichnet) einbezogen, das zytogenetisch derTranslokation t(9;22) entspricht, die auch als Philadelphia- Chromosom bekannt ist. Die entsprechende TaqMan™-Sonde wurde 5'- VIC/TAMRA-3' markiert. Als chromosomale Translokation mit guter Prognose bei Leukämien des Kindesalters wurden die chromosomalen Translokationen t( 1 2;21 ) und t(8;21 ) einbezogen. Die hierdurch entstehenden Chimären mRNAs werden als "TEL/AML"- bzw. als "AML/ETO"-Fusionsgene bezeichnet. Die entsprechende Sonde wurde 5'- FAM/TAMRA-3' markiert. Als Ausgangsmaterial wurde RNA aus Leukämiezelllinien verwendet, die jeweils eine der zu detektierenden chromosomalen Translokationen aufweisen, bzw. als Negativkontrolle eine Zelllinie (HL60) , die keine solche genetische Veränderung besitzt. Da chimäre mRNA-Moleküle nachgewiesen werden sollen (diese resultieren aus einer Fusion von zwei unterschiedlichen Genfragmenten, die durch die chromosomale Translokation hervorgerufen wurde), muß vor der eigentlichen PCR die RNA nach üblichen Verfahren in cDNA (komplementäre DNA) umgeschrieben werden. Zur Steigerung der Empfindlichkeit wurde noch ein normaler PCR-Lauf vorgeschaltet, bevor die eigentliche PCR-Reaktion unter fluoreszenzoptischer Produktdetektion angeschlossen wurde. Die entscheidende PCR-Reaktion im TaqMan™- Verfahren wurde als zweiter Lauf einer nested-PCR durchgeführt. Die nested-PCR (ursprünglich von Chamberlain et al. beschrieben) stellt ein bekanntes und breit angewandtes Verfahren zur Erhöhung der PCR- Sensitivität und -Spezifität dar. Im ersten Lauf der nested-PCR werden die Zielsequenzen voramplifiziert. In der Regel wird ein Mikroiiter des Reaktionsprodukts des ersten Laufs als Ausgangsmaterial für den zweiten Lauf der nested-PCR übertragen. Die im zweiten Lauf eingesetzten Primer binden innerhalb der voramplifizierten DNA Abschnitte. Die Durchführung einer nested-PCR ist bei dem vorgeschlagenen Verfahren mit PIRS-Primern grundsätzlich nicht erforderlich. Es sollte nur demonstriert werden, daß das Verfahren auch in einer nested-PCR eingesetzt werden kann. Alle im ersten Lauf der nested-PCR eingesetzten Primer entsprechen ihrer Struktur nach ganz normalen PCR-Primern ohne jegliche Zusatzsequenzen. Sie sind alle mit einem Pfeil (→) vor dem Bezeichnungskürzel versehen.
Externe Primer für vorgeschalteten Lauf einer Nested-PCR: "Baddies":
Baddy 1 und 2 t(9;22) (mBCR Positivzelllinie: SD 1 ; MBCR Positivzelllinie:
K562) →m-BCRupmRNA
5'-CAGCTCCAATGAGAACCTCACCTCCAGCG
→M-BCRupmRNA 5'-AGAGAAGAGGGCGAACAAGGGCAGCAAGG
→ABLdomRNA 5'-CTCAGCGGATACTCAGCGGCATTGCGG
"Goodies" :
Goody 1 t( 1 2;21 ) (verwendete Positivzelllinie: REH)
→TELupmRNA 5'-GGCACTCCGTGGATTTCAAACAG
→AMLdomRNA 5'-AACGCCTCGCTCATCTTGCCTGG
Goody 2 t(8;21 ) (verwendete Positivzelllinie: Kasumi)
→AMLI upmRNA 5'-TTCACAAACCCACCGCAAGTCG
→ETOdomRNA 5'-TGAACTGGTTCTTGGAGCTCCTTG
Primersequenzen:
5'-Homo-Tail = 5'-GCGTACTAGCGTACCACGTGTCGACT
zwischen Homo-Tail (HANDS-Tag) und Sondenbindungsstelle (PIRS) zwei Basen zusätzlich: GA FAM-Sonde HNNO* (für Goodies): 5'-(FAM)-TCCTGCTGCGATGCAATGCTTTTC-(TAMRA)
VIC-Sonde NPY-Rec* (für Baddies): 5'-{VIC)-TGTGGTAGCATTTGCAGTCTGCTGGC-(TAMRA)
* Die Bezeichnungen "HNNO" und "NPY-Rec" stellen laborinterne Kürzel zur Identifikation der unterschiedlichen Sondensequenzen dar.
Im folgenden Abschnitt sind die genauen Sequenzen der verwendeten PCR- Primer aufgeführt: (5'-Homo-Tail = kursiv; Sondenbindungsstelle (PIRS) = fett gedruckt; Spezifische Sequenz = unterstrichen).
"Baddies":
m-BCR intern Hands sense:
5 ' - G C G TA C TA G C G TA C C A C G T G T C G A C T
CCAATGAGAACCTCACCTCCAGCG
M-BCR intern Hands sense: δ ' - G C G TA C TA G C G TA C C A C G T G T C G A C T AGAGGGCGAACAAGGGCAGCAAGG
ABL-intern Hands NPY antisense (SEQ ID No. 1): (Dies ist der Gegenprimer für beide obengenannten Primer, sowohl für M- BCR als auch für mBCR):
5 '- G C G TA C TA G C G TA C CA C G TG TC GA C T- G A - TGTGGTAGCATTTGCAGTCTGCTGGC-GCGGATACTCAGCGGCATTGCGG
'Goodies":
TEL intern Hands HNNO sense (SEQ ID No.2):
5 '- G C G TA C TA G C G TA C CA C G TG TC GA C T- G A TCCTGCTGCGATGCAATGCTTTTC-CGGCACTCCGTGGATTTCAAACAG AML1 intern Hands antisense
5 ' - G C G TA C TA G C G TA C C A C G T G T C G A C T -
AACGCCTCGCTCATCTTGCCTGG
AML1 intern Hands sense δ ' - G C G TA C TA G C G TA C C A C G T G T C G A C T
CTTCACAAACCCACCGCAAGTCG
ETO intern Hands HNNO antisense (SEQ ID No.3):
5 ' - G C G TA C TA G C G TA C CA C G TG TC GA C T- G A
TCCTGCTGCGATGCAATGCTTTTC-TGAACTGGTTCTTGGAGCTCCTTG
PCR-Bedingungen für diesen Ansatz:
Ein 50 μl Reaktionsansatz enthält folgende Komponenten:
5μl 10x PCR-Puffer μl 25 nM MgCI2 2 μl dNTP-Mix (dATP, dCTP, dGTP und TTP)
5 μl "Homo-Tail"-Primer (500 nM Endkonzentration)
5μl FAM-Sonde HNNO (200 nM Endkonzentration)
5 μl VIC-Sonde NPY-Rec (200 nM Endkonzentration)
0,25 μl UNG (Substanz zur Eliminierung von Kontaminationen) 0,125 μl AmpliTaq Gold Polymerase
0,5 μl von jedem spezifischen Primer (PIRS-Primer und jeweilige
Gegenprimer, 10 nM Endkonzentration)
2 μl der zu untersuchenden Probe steriles Aqua bidest. ad 50 μl
PCR-Cycler Bedingungen:
50 °C - 2 min (Kontaminationsinaktivierung durch UNG)
95 °C - 10 min (Denaturierung und Aktivierung der AmpliTaq Gold
Polymerase = Hot Start) danach 5 Zyklen zu 95 °C - 1 5 s → 60 ° C - 1 min → 72 °C - 1 min danach 35 Zyklen zu 95 °C - 1 5 s → 68 °C - 1 min → 72 °C - 1 min
Die Resultate des Anwendungsbeispiels sind in den Figuren 1 und 2 gezeigt.
Man sieht, daß nur die "Baddies" ein positives VIC-Signal aufweisen, während nur die "Goodies" ein positives FAM-Signal zeigen. Alle anderen Proben sind negativ. Es liegen somit keine falsch positiven Resultate vor.
Beispiel 2
Eine Multiplex-PCR mit PIRS-Primern kann genutzt werden, um mehrere genetisch heterogene Erkrankungen gleichzeitig nachzuweisen. Für jede zu berücksichtigende Erkrankung wird eine Sondenfarbe reserviert. Die einzelnen PCR-Primer erhalten aufgrund unterschiedlicher 3'-Enden die Spezifität für eine einzige Punktmutation. Aufgrund identischer PIRS können die entsprechenden Gruppen von Primern jeweils einer in Frage kommenden Erkrankung zugeordnet werden. So könnte zur Ursachenklärung bei Kindern mit einer Lungenerkrankung eine Fluoreszenzfarbe für den Nachweis verschiedener Punktmutationen im CFTR-Gen reserviert werden, um eine Mukoviszidose zu erkennen. Eine zweite PIRS könnte bei einem PCR- Primersatz eingebaut werden, um in der gleichen PCR-Reaktion Mutationen im PIZ-Gen zu detektieren, die beim alpha-1 -Antitrypsinmangel vorliegen.
Beispiel 3 Eine Multiplex-PCR mit PIRS-Primern kann auch eingesetzt werden, um verschiedene Gruppen von Infektionserregern in einem einzigen PCR-Ansatz nachzuweisen. Für klinische Fragestellungen kann dies besonders hilfreich sein, wenn die einzelnen Gruppen ein unterschiedliches therapeutisches Vorgehen erfordern. So können bei Patienten mit klinischem Verdacht auf eine Meningitis oder Enzephalitis in einer einzigen Multiplex-PCR sowohl bakterielle als auch virale Erkrankungen nachgewiesen werden. Wird eine Sondenfarbe für alle bakteriellen - und eine andere Sondenfarbe für alle viralen Erreger reserviert, so ließe sich anhand des PCR-Ergebnisses sofort die notwendige Therapie ableiten: Breitspektrumantibiotika (z. B. Cefotaxim) bei bakteriellen Erregern oder Virostatika (z.B. Acyclovir) bei Herpesvirusinfektionen. Im ersten Lauf der nested-PCR werden nur zwei Primersätze eingesetzt. Einer detektiert beide Typen des Herpes simplex Virus. (Die Primersequenzen sind der folgenden Arbeit entnommen: Casas et al, Detection of both Herpes simplex and Varicella -Zoster Viruses in cerebrospinal fluid from patients with encephalitits, J . Med . Virol. Vol. 50: 82-92, 1 996) . Der zweite bindet an hochkonservierte bakterielle DNA- Regionen, die für Abschnitte der 1 6S rRNA von Bakterien (Eubacteriae) codieren. Mit ihm können die entsprechenden Genombereiche einer Vielzahl von Bakterien detektiert und amplifiziert werden (siehe Radström et al., J. Clin. Microbiology, Vol. 32:2738-2744, 1 994) . Die Abgrenzung der klinisch relevanten pathogenen Bakterien (Meningokokken, Hämophilus influenza und Pneumokokken) erfolgt erst im zweiten Lauf der nested-PCR unter Verwendung spezifischer Primersätze mit PIRS-Primern auf einem fluoreszenzoptischen System zur Detektion der PCR-Produkte. Die bakterienspezifischen Primersequenzen sind der Arbeit von Radström et al. entnommen (s.o.); die herpesvirusspezifischen Primersequenzen stammen aus der Arbeit von Casas et al. (s.o.) . Eine weitere Besonderheit ist die Ausführung des bakterienspezifischen Primersatzes als "semi-nested-PCR" . Der universelle Antisense-Primer zum Nachweis von Bakterien wird auch im zweiten Lauf als Gegenprimer zu den Bakterienspezies-spezifischen PIRS- Primern eingesetzt. Die Speziesspezifität wird alleine durch die Sense-Primer erreicht. Aus diesem Grund muß der Primer bereits im ersten Lauf die "HANDS-Sequenz" 5'-wärts von dem zielsequenzspezifischen Abschnitt tragen. Hätte der Primer im ersten Lauf noch nicht die " HANDS-Sequenz" , so würden im zweiten Lauf Primer mit und Primer ohne "HANDS-Sequenz" miteinander kompetieren, was bei der geringen Konzentration der zielsequenzspezifischen Primer im entscheidenden zweiten Lauf der nested- PCR zu einem ineffizienten Einbau der " HANDS-Sequenz" führen könnte, mit der Folge einer deutlich beeinträchtigen Sensitivität. Primersequenzen:
Außer dem Primer "Eubac-exdo" bzw. "Eubac-Hands-antisense", wie oben erwähnt, entsprechen alle im ersten Lauf der nested-PCR eingesetzten Primer ihrer Struktur nach normalen PCR-Primern ohne jegliche Zusatzsequenzen. Sie sind alle mit einem Pfeil (→) vor dem Bezeichnungskürzel versehen.
Externe Primer für vorgeschalteten Lauf einer Nested-PCR:
"Bakterien (Eubacteriae)":
→Eubac-exup 5'-AACT(C/A)CGTGCCAGCAGCCGCGGTAA
Eubac-exdo = Eubac-Hands-antisense:
5 ' - G C G TA C TA G C G TA C C A C G T G T C G A C T
AAGGAGGTGATCCA(G/A)CCGCA(G/C)(G/C)TTC
"Herpesvirus":
→ Herpes-exup 5'-AGCGAATGCGATGAATTTCGATT
→Herpes-exdo 5'-GAGGCGGAGCTTCACCAGGC
Primersequenzen:
5'-Homo-Tail = 5'-GCGTACTAGCGTACCACGTGTCGACT
zwischen Homo-Tail (HANDS-Tag) und Sondenbindungsstelle zwei Basen zusätzlich: GA FAM-Sonde HNNO* (für die beiden Herpesvirustypen): 5'-(FAM)-TCCTGCTGCGATGCAATGCTTTTC-(TAMRA)
VlC-Sonde NPY-Rec* (für die drei oben erwähnten pathogenen Bakterien) 5'-(VIC)-TGTGGTAGCATTTGCAGTCTGCTGGC-(TAMRA)
* Die Bezeichnungen "HNNO" und "NPY-Rec" stellen laborinterne Kürzel zur Identifikation der unterschiedlichen Sondensequenzen dar.
Im folgenden Abschnitt sind die genauen Sequenzen der verwendeten PCR- Primer aufgeführt: (5'-Homo-Tail = kursiv, Sondenbindungsstelle (PIRS) = fett gedruckt; Spezifische Sequenz = unterstrichen).
"Herpesviren":
Herpesvirus Typ 1 :
HSV1-intem-Hands-HNNO-sense (SEQ ID No.4): ' -GCGTACTAGCGTACCACGTGTCGACT-GA TCCTGCTGCGATGCAATGCTTTTC-GTCCTCCGCGTCGGGTCGGGC
HSV1-intern-Hands-antisense:
5'-GCG74C74GCG74CCqCG7G7CG^C7-TCGCACTACTGCCAGGGGCAG
Herpesvirus Typ 2: HSV2-intem-Hands-HNNO-sense (SEQ ID No.5): ' - G C G TA C TA G C G TA C CA C G TG TC GA C T- G A - TCCTGCTGCGATGCAATGCTTTTC-GTCCTCCGCGTGGGCCCGGAG
HSV2-intern-Hands-antisense:
5,-GCG7 C74GCG74CC .CG7G7CG/4C7-TCGCACTACTGCCAGGGCCGC
"Bakterien":
Neisseria meningitidis (Meningokokken):
Men-intern-Hands-NPY-Rec-sense (SEQ ID No.6): 5 ' - G C G TA C TA G C G TA C CA C G TG TC GA C T- G A - TGTGGTAGCATTTGCAGTCTGCTGGC-TGTTGGGCAACCTGATTG
Haemophilus influenzae:
Hae-intern-Hands-NPY-Rec-sense (SEQ ID No.7):
5 ' - G C G TA C TA G C G TA C CA C G TG TC GA C T- G A
TGTGGTAGCATTTGCAGTCTGCTGGC-CCTAAGAAGAGCTCAGAG
Streptococcus pneumoniae (Pneumokokken):
Pneu-intern-Hands-NPY-Rec-sense (SEQ ID No.8): ' - G C G TA C TA G C G TA C CA C G TG TC GA C T- G A TGTGGTAGCATTTGCAGTCTGCTGGC-GTACAACGAGTCGCAAGC
Eubac-Hands-antisense: ' - G C G TA C TA G C G TA C C A C G T G T C G A C T AAGGAGGTGATCCA(G/A)CCGCA(G/C)(G/C)TTC
PCR-Reaktionsbedingungen: (Im Vergleich zu den im vorherigen Anwendungsbeispiel beschriebenen PCR-Bedingungen ergeben sich keine Unterschiede außer einer von 60 auf 55 °C reduzierten Annealingtemperatur in den ersten fünf Zyklen der multiplex-PCR mit PIRS-Primern).
Ein 50 μl Reaktionsansatz enthält folgende Komponenten:
5μl 10x PCR-Puffer
4μl 25 mM MgCI2
2 μl dNTP-Mix (dATP, dCTP, dGTP und TTP)
5 μl "Homo-Tail"-Primer (500 nM Endkonzentration) 5 μl FAM-Sonde HNNO (200 nM Endkonzentration)
5 μl VlC-Sonde NPY-Rec (200 nM Endkonzentration)
0,25 μl UNG (Substanz zur Eliminierung von Kontaminationen)
0,125 μl AmpliTaq Gold Polymerase 0, 5 μl von jedem spezifischen Primer (PIRS-Primer und jeweilige Gegenprimer, 1 0 nM Endkonzentration) 2 μl der zu untersuchenden Probe steriles Aqua bidest. ad 50 μl
PCR-Cycler Bedingungen:
50 °C - 2 min (Kontaminationsinaktivierung durch UNG) 95 °C - 1 0 min (Denaturierung und Aktivierung der AmpliTaq Gold Polymerase = Hot Start) danch 5 Zyklen zu 95 °C - 1 5 s → 55 °C - 1 min → 72 °C - 1 min danach 35 Zyklen zu 95 °C - 1 5 s → 68 °C - 1 min →72 °C - 1 min
Beispiel 4
In einer Multiplex-PCR mit PIRS-Primern lässt sich auch die Fähigkeit zur quantitativen Erfassung der PCR-Produktmenge nutzen, die die oben beschriebenen fluoreszenzoptischen Detektionssysteme besitzen. Die jeweilige Gesamtmenge mehrere Gruppen von Nukleinsäure-Zielsequenzen kann so mit einer einzigen PCR-Reaktion ermittelt werden. So ist es möglich, verschiedene Gruppen von Zytokin-mRNAs jeweils einer Sonde zuzuordnen, um dann mit einer einzigen PCR-Reaktion zu ermitteln, ob z.B. in einer bestimmen Probe ein TH1- oder TH2-Zytokinantwort überwiegt. Viele infektiöse Agentien oder Allergene polarisieren zu einem der beiden Zytokinmuster TH1 und TH2, was zum Schutz des Organismus vor dem entsprechenden Agens oder aber zu einem immunpathologischen Prozess führen kann (siehe Arbeit von Lanzavecchia, Identifying strategies for immune intervention, Science Vol. 260: 937-944, 1 993) .
Eine PIRS wurde zum Nachweis der Zytokine lnterleukin-2 und Interferon- gamma eingesetzt. Die entsprechende Sonde trägt das Fluoreszenzsignal FAM. Die Intensität des FAM-Signals ist somit proportional zu der Summe der beiden Zielsequenzen lnterleukin-2 und interferon-gamma als Marker einer TH1-Antwort. Die zweite PIRS generiert die Bindungsstelle für eine VIC- markierte Sonde. Die PIRS-PCR-Primersätze dienen dem Nachweis von lnterleukin-4, lnterleukin-5 und lnterleukin- 1 0 als Repräsentanten einer TH2- Antwort.
Wie bei dem oben beschriebenen Verfahren zum Nachweis prognostisch relevanter chromosomaier Translokationen in Leukämiezellen wird zur Steigerung der Empfindlichkeit eine nested-PCR durchgeführt.
Alle im ersten Lauf der nested-PCR eingesetzten Primer entsprechen ihrer Struktur nach normalen PCR-Primern ohne jegliche Zusatzsequenzen. Sie sind alle mit einem Pfeil (-*) vor dem Bezeichnungskürzel versehen.
Externe Primer für vorgeschalteten Lauf einer Nested-PCR:
— Lm— - lnterleukin-2:
→IL-2exup
5'-CAAGAATCCCAAACTCACCAGG
→IL-2-exdo 5'-CCATCTGTTCAGAAATTCTACAATG
Interferon-gamma:
→IF-G-exup
5'-CCAAAAGAGTGTGGAGACCATCAAGG
→IF-G-exdo 5'-CCATTACTGGGATGCTCTTCG
"T H2_ lnterleukin-4:
→IL-4-exup 5'-GAACAGCCTCACAGAGCAGAAG
→IL-4-exdo 5'-CGTTTCAGGAATCGGATCAG
lnterleukin-5:
→IL-5-exup
5'-TCAGGGAATAGGCACACTGGAG
→IL-5-exdo 5'-ACTCGGTGTTCATTACACCAAG
lnterleukin-1 0:
→IL-1 0-exup
5'-CCAAGACCCAGACATCAAGG
→IL-1 0-exdo 5'-ACCCTGATGTCTCAGTTTCG
Primersequenzen:
5'-Homo-Tail =
5'-GCGTACTAGCGTACCACGTGTCGACT
zwischen Homo-Tail (HANDS-Tag) und Sondenbindungsstelle zwei Basen zusätzlich: GA
FAM-Sonde HNNO * (für TH1) : 5'-(FAM)-TCCTGCTGCGATGCAATGCTTTTC-(TAMRA)
VlC-Sonde NPY-Rec * für (TH2) : 5'-(VIC)-TGTGGTAGCATTTGCAGTCTGCTGGC-(TAMRA) *Die Bezeichnungen "HNNO" und "NPY-Rec" stellen laborinterne Kürzel zur Identifikation der unterschiedlichen Sondensequenzen dar.
Im folgenden Abschnitt sind die genauen Sequenzen der verwendeten PCR- Primer aufgeführt: (5'-Homo-Tail = kursiv; Sondenbindungsstelle (PIRS) = fett gedruckt; Spezifische Sequenz = unterstrichen)
— Ü-U — lnterleukin-2:
IL-2-intern-Hands-HNNO-sense (SEQ ID No.9): δ'-GCGTACTAGCGTACCACGTGTCGACT-
GA-TCCTGCTGCGATGCAATGCTTTTC-CCCAAGAAGGCCACAGAACTG
IL-2-intern-Hands-antisense: δ ' - G C G TA C TA G C G TA C C A C G T G T C G A C T
TTGATATTGCTGATTAAGTCCCTG
Interferon-gamma:
IF-g-intern-Hands-HNNO-sense (SEQ ID No. 10): 5 ' - G C G TA C TA G C G TA C CA C G TG TC GA C T- G A TCCTGCTGCGATGCAATGCTTTTC-CTGTCGCCAGCAGCTAAAACAGG
IF-g-intern-Hands-antisense: δ'-GCGTACTA GCGTACCA CGTGTCGA C7-AAATTCAAATATTGCAGGCAGG
- 'TH2— "
lnterleukin-4:
IL-4-intern-Hands-NPY-Rec-sense (SEQ ID No.11): δ ' - G C G TA C TA G C G TA C CA C G TG TC GA C T- G A
T G T G G T A G C A T T T G C A G T C T G C T G G C
CTGCCTCCAAGAACACAACTGAGAAG
IL-4-intern-Hands-antisense: 5,-GCG74C74GCG74CC^CG7G7CG .C7-GAGTGTCCTTCTCATGGTGG lnterleukin-5:
IL-5-intern-Hands-NPY-Rec-sense (SEQ ID No. 12):
5 '- G C G T, C 7 . G C G 7. C C . C G 7G 7C G . C 7- G A -
TGTGGTAGCATTTGCAGTCTGCTGGC-ACTCGGTGTTCATTACACCAAG
IL-5-intern-Hands-antisense: δ'-GCGTACTA GCGTA CCA CGTGTCGA C7-TTGCAGGTAGTCTAGGAATTGG
lnterleukin-10: IL-10-intern-Hands-NPY-Rec-sense (SEQ ID No. 13):
5 '- G C G 7 1 C 7 1 6 C 6 7"/. C C^ C 6 Γ G 7' C 6 ^ C 7- G A - TGTGGTAGCATTTGCAGTCTGCTGGC-AAGACCCTCAGGCTGAGGCTACG
IL-10-intern-Hands-antisense: δ'-GCGTA CTA GCGTA CCA CGTGTCGA C7-CTTTGTAGATGCCTTTCTCTTGG
PCR-Bedingungen:
Ein 50 μl Reaktionsansatz enthält folgende Komponenten:
5μl 10x PCR-Puffer
4μl 25 mM MgCI2
2 μl dNTP-Mix (dATP, dCTP, dGTP und TTP) 5 μl "Homo-Trail"-Primer (500 nM Endkonzentration)
5 μl FAM-Sonde HNNO (200 nM Endkonzentration)
5 μl VlC-Sonde NPY-Rec (200 nM Endkonzentration)
0,25 μl UNG (Substanz zur Eliminieruπg von Kontaminationen)
0,125μl AmpliTaq Gold Polymerase 0,5 μl von jedlem spezifischen Primer (PIRS-Primer und jeweilige
Gegenprimer, 10 nM Endkonzentration)
2 μl der zu untersuchenden Probe steriles Aqua bidest. ad 50 μl PCR-Cycler Bedingungen:
50 °C - 2 min ( Kontaminationsinaktivierung durch UNG) 95 °C - 1 0 min (Denaturierung und Aktivierung der AmpliTaq Gold Polymerase = Hot Start) danach 5 Zyklen zu 95 ° C - 1 5 s → 60 ° C - 1 min → 72 °C - 1 min danach 35 Zyklen zu 95 °C - 1 5 s → 68 ° C - 1 min → 72 °C - 1 min
Beispiel 5:
Beispiel 5 dient dem gleichen Ziel wie Beispiel 1 . Als Ausgangsmaterial wurden die gleichen Leukämiezellinien verwendet. Im Unterschied zu Beispiel 1 wurde eine modifizierte Primer/Sondenkombination gewählt, die eine Amplifikation bei höheren Temperaturen erlaubt.
Externe Primer für vorgeschalteten Lauf einer Nested-PCR ( 1 . Lauf ist im PCR-Protokoll nicht aufgeführt):
"Baddies":
Bady 1 und 2 t(9;22) (mBCR Positivzellinie: SD 1 ; MBCR Positivzellinie: K562)
m-BCRfwexSD 1
*→ 5'-GCTATACCCCGGACTGCAGCTCCAATGAG
*→M-BCRfwexK562
5'-AGAGGCTGAAGAAGAAGCTGTCGGAGCAGG
*→ABLrvexBeide 5'-GAGTGTTTCTCCAGACTGTTGACTGGCGTGATG
"Goodies":
Goody 1 t( 1 2;21 ) (verwendete Positivzellinie: REH)
*→TELfwexREH
5'-TCTCCGAGGACGGGCTGCATAGGGAAGG *→AML1rvexREH 5'-GCCACCACCTTGAAAGCGATGGGCAGG
Goody 2 t(8;21) (verwendete Positivzellinie: Kasumi)
*→AML1 fwexKasumi 5'-TACGCACTGGCGCTGCAACAAGACCCTG
*→ETOrvexKasumi 5'- GCCCATTGCTGAAGCCATTGGGTGGTGAG
Primersequenzen und PCR-Cyclerbedinqunqen, die im entscheidenden PCR- Lauf nach dem TaqMan™-Verfahren unter Einsatz von "PIRS" verwendet wurden:
5'-Homo-Tail = δ'-gCg TACTAgCgTA CCA Cg Tg TCgACT
FAM-Sonde HNNOplus* (für Goodies):
5'-(FAM)-CCCTCCTgCTgCgATgCAATgCTTTTCCgC-(TAMRA)
VlC-Sonde NPYRECplus* (für Badies): 5'-(VIC)-CCCgTgTggTAgCATTTgCAgTCTgCTggC-(TAMRA)
# Die Bezeichnungen "HNNOplus" und "NPYRECplus" stellen laborinterne Kürzel zur Identifikation der unterschiedlichen Sondensequenzen dar.
Im folgenden Abschnitt sind die genauen Sequenzen der verwendeten PCR- Primer aufgeführt: (5'-Homo-Tail = kursiv; Sondenbindungsstelle = fett gedruckt; Spezifische Sequenz = unterstrichen)
"Badies":
*mBCRfwinSD1HAN: b ' - G C G TA C TA G C G TA C CA C G T G T C G A C T- T - CCCTCGCAGAACTCGCAACAGTCCTTCG
^MBCRfwinK562HAN: ' - g C g T A C T A g C g T A C C A C g T g T C g A C T - TGCAGAGTGGAGGGAGAACATCCGGGAG
*ABLrvinBeideHanNPY+ (SEQ ID No. 14) 5 ' - g C g TA C TA g C g TA C C A C g Tg T C g A C T- T - C C C G T g T g g T A g C A T T T g C A g T C T g C T g g C - T -
GTGCAACGAAAAGGTTGGGGTCATTTTCACTGG
"Goodies":
*TELfwinREHHANHNNO+ (SEQ ID No. 15)
5 ' - g C g TA C TA g C g TA C C A C g Tg T C g A C T- T -
C C C T C C T g C T g C g A T g C A A T g C T T T T C C G C - T - GCCTGAAGAGCACGCCATGCCCATTGG
*AML1rvinHANREH
5 ' - g C g TA C TA g C g TA C C A C g T g T C g A C T -
CGGCAACGCCTCGCTCATCTTGCCTG
*AML1fwinHANKasumi
S ' - g C g TA C TA g C g TA C C A C g T g T C g A C T -
GCTGAGCTGAGAAATGCTACCGCAGCCATG *ETOrvinKasuHANHNNO+ (SEQ ID No.16)
5 ' - g C g TA C TA g C g TA C C A C g Tg T C g A C T- T - C C C T C C T g C T g C g A T g C A A T g C T T T T C C G C - T -
GGTGGCATTGTTGGAGGAGTCAGCCTAGATTG
PCR-Bedingungen für diesen Ansatz:
Ein 50 μl Reaktionsansatz enhält folgende Komponenten:
5μl 10x PCR-Puffer 4μl 25 mM MgCI2
2 μl dNTP-Mix (ATP, CTP, GTP und TTP)
5 μl "Homo-Tail"-Primer (500 nM Endkonzentration)
5 μl FAM-Sonde HNNO (400 nM Endkonzentration)
5μl VlC-Sonde NPY-Rec (400 nM Endkonzentration) 0,25 μl UNG (Substanz zur Elimination von Kontaminationen)
0,125 μl AmpliTaq Gold Polymerase 0, 5 μl von jedem spezifischen Primer (SIRS-modifizierte Primer und jeweilige
Gegenprimer, 1 0 nM Endkonzentration) 2 μl der zu untersuchenden Probe steriles Aqua bidest. ad 50 μl
PCR-Cycler Bedingungen:
50 ° C - 2 min (Kontaminationsinaktivierung durch UNG) 95 ° C - 1 0 min (Denaturierung und Aktivierung der AmpliTaq Gold Polymerase = Hot Start) danach 40 Zyklen zu 95 °C 1 5 s → 70 °C - 1 min
Beispiel 6
Beispiel 6 dient dem gleichen Ziel wie Beispiel 1 . Als Ausgangsmaterial wurden die gleichen Leukämiezellinien eingesetzt. Verwendet wurden die Primersequenzen aus Beipiel 5, jedoch mit der entscheidenden Modifikation, daß Ts (Desoxythymidinreste) durch Us (Desoxyuracilreste) ersetzt wurden. Hierdurch können vor der Amplifiaktion mit Hilfe der Homo-Tail-Sequenzen und der gleichzeitigen Generation von Fluoreszenzsignalen alle nicht mehr benötigten Primeroligonukieotide mit Hilfe des Enzyms Uracil-N-Glycosylase verdaut werden. Es resultiert eine teilweise Elimitation eventuell entstandener Primer-Dimere. Außerdem wird die Kompetition zwischen den Primern mit mehreren Domänen, die auch eine PIRS-Domäne tragen, und den floureszenzmarkierten Sonden aufgehoben. Auch die Kompetition mit den Homo-Tail-Primern wird aufgehoben. Eine solche Kompetition würde die PCR-Effizienz besonders dann reduzieren, wenn sehr viele Zielsequenzen gleichzeitig detektiert werden sollen und somit sehr viele verschiedene Primer mit mehreren Domänen in einem Reaktionsansatz eingesetzt werden müssen.
Primersequenzen für den ersten Lauf einer nested-PCR (erster Lauf ist im PCR-Protokoll nicht aufgeführt) : "Baddies":
Bady 1 und 2 t(9;22) (mBCR Positivzellinie: SD 1 ; MBCR Positivzellinie: K562)
m-BCRfwexSD 1 -U
*→ 5'-GCUAUACCCCGGACUGCAGCUCCAAUGAG
*→M-BCRfwexK562-U 5'-AGAGGCUGAAGAAGAAGCUGUCGGAGCAGG
*→ABLrvexBeide-U 5'-GAGUGUUUCUCCAGACUGUUGACUGGCGUGAUG
"Goodies":
Goody 1 t( 1 2;21 ) (verwendete Positivzellinie: REH)
*→TELfwexREH-U 5'-UCUCCGAGGACGGGCUGCAUAGGGAAGG
*→AML1 rvexREH-U 5'-GCCACCACCUUGAAAGCGAUGGGCAGG
Goody 2 t(8;21 ) (verwendete Positivzellinie: Kasumi)
*→AML1 fwexKasumi-U 5'-UACGCACUGGCGCUGCAACAAGACCCUG
*→ETOrvexKasumi-U
5'- GCCCAUUGCUGAAGCCAUUGGGUGGUGAG Primersequenzen und PCR-Cvclerbedinqunqen, die im entscheidenden PCR- Lauf nach dem TaqMan™-Verfahren unter Einsatz von "PIRS" verwendet wurden:
5'-Homo-Tail = δ'-gCgTACTAgCgTACCACgTgTCgACT ("Ts" als "Us" innerhalb von Primern mit mehreren Domänen)
zwischen Homo-Tail (HANDS-Tag) und Sondenbindungsstelle eine Base zusätzlich: "U"
FAM-Sonde HNNOplus* (für Goodies): 5'-(FAM)-CCCTCCTgCTgCgATgCAATgCTTTTCCgC-(TAMRA)
VlC-Sonde NPYRECplus* (für Badies):
5'-(VIC)-CCCgTgTggTAgCATTTgCAgTCTgCTggC-(TAMRA)
# Die Bezeichnungen "HNNOplus" und "NPYRECplus" stellen laborinterne Kürzel zur Identifikation der unterschiedlichen Sondensequenzen dar.
Im folgenden Abschnitt sind die genauen Sequenzen der verwendeten PCR- Primer aufgeführt: (5'-Homo-Tail = kursiv; Sondenbindungsstelle = fett gedruckt; Spezifische Sequenz = unterstrichen)
"Badies":
*mBCRfwinSD1HAN-U: b ' - G C G UA C UA G C G UA C CA C G U G U C GA C U- ü
CCCUCGCAGAACUCGCAACAGUCCUUCG
*MBCRfwinK562HAN-U: 5 ' - g C g U A C U A g C g U A C C A C g U g U C g A C U - UGCAGAGUGGAGGGAGAACAUCCGGGAG
*ABLrvinBeideHanNPY + -U (SEQ ID No. 17) b ' - g C g UA C UA g C g UA C CA C g Ug U C g A C U - U - C C C G U g U g g U A g C A U U U g C A g U C U g C U g g C - U - GUGCAACGAAAAGGUUGGGGUCAUUUUCACUGG
"Goodies":
*TELfwinREHHANHNNO + -U (SEQ ID No. 18) b ' - g C g UA C UA g C g UA C CA C g Ug U C g A C U - C C C U C C U g C U g C g A U g C A A U g C U U U U C C G C - U GCCUGAAGAGCACGCCAUGCCCAUUGG
*AML1rvinHANREH-U b ' - g C g U A C U A g C g U A C C A C g U g U C g A C U
CGGCAACGCCUCGCUCAUCUUGCCUG
* AML1 fwinHANKasumi-U b ' - g C g U A C U A g C g U A C C A C g U g U C g A C U
GCUGAGCUGAGAAAUGCUACCGCAGCCAUG
*ETOrvinKasuHANHNNO + -U (SEQ ID No. 19) b ' - g C g UA C UA g C g UA C CA C g Ug U C g A C U - C C C U C C U g C U g C g A U g C A A U g C U U U U C C G C - U
GGUGGCAUUGUUGGAGGAGUCAGCCUAGAUUG
PCR-Bedingungen für diesen Ansatz: Ein 50 μl Reaktionsansatz enthält folgende Komponenten:
3, 5 μl 1 0x PCR-Puffer
4 μl 25 mM MgCI2
2 μl dNTP-Mix (ATP, CTP, GTP und TTP)
0, 1 25 μl AmpliTaq Gold Polymerase
0, 5 μl von jedem spezifischen Primer (SIRS-modifizierte Primer und jeweilige
Gegenprimer, 1 0 nM Endkonzentration) 2 μl der zu untersuchenden Probe steriles Aqua bidest. ad 35 μl
PCR-Cycler Bedingungen: Voramplifikation:
95 °C - 1 0 min (Denaturierung und Aktivierung der AmpliTaq Gold Polymerase = Hot Start) danach 5 Zyklen zu 95 °C - 1 5 s → 70 °C - 1 min 99 °C - 1 0 min (Zerstörung der Taq-Polmyerase)
Zugabe von 2 Units Uracil-N-Glycosylase (UNG) + 0, 1 25 μl AmpliTaq Gold + 5μl "Homo-Tail"-Primer (500 nM Endkonzentration) + 5 μl FAM-Sonde HNNOplus (400 nM Endkonzentration) +
5 μl VlC-Sonde NPYRECplus (400 nM Endkonzentration) + 1 , 5 μl PCR- Puffer 10x
50 ° C - 1 Stunde (UNG-Verdau)
danach 95 °C - 1 0 min (Aktivierung der neu zugegebenen Polymerase und
Hydrolyse der abasischen Nukleotide)
35 Zyklen zu 95 °C 1 5 s → 70 °C - 1 min

Claims

Ansprüche
Verfahren zur Detektion von Produkten einer Nukleinsäure- Amplifikationsreaktion, umfassend die Schritte
) Bereitstellen von zu amplifizierenden Nukleinsäuren, i) Durchführen einer Amplifikationsreaktion unter
Verwendung von mindestens zwei Primern, iii) Detektieren der in ii) gebildeten
Amplifikationsprodukte unter Verwendung einer oder mehrerer dafür spezifischer Sonden, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß a) einer der für die Amplifikationsreaktion eingesetzten Primer in 5'-3'-Richtung folgende Elemente umfasst: eine 5'-Homo-Tail-Sequenz, eine Sondenbindungssequenz, die als primer-integrierte Reportersequenz (PIRS) bezeichnet ist, und eine für die zu amplifizierende Nukleinsäure spezifische Sequenz, b) ein anderer der für die Amplifikationsreaktion eingesetzten Primer in 5'-3'-Richtung folgende Elemente umfasst: eine 5'-Homo-Tail-Sequenz, und eine für die zu amplifizierende Nukleinsäure spezifische Sequenz, und c) die zur Detektion eingesetzten Sonden mit dem Komplementärstrang der Sondenbindungssequenz des einen der beiden Amplifikatioπsprimer wechselwirken können, und die eingesetzten Sonden detektierbare Markierungsgruppen tragen.
Verfahren nach Anspruch 1 , d a d u rc h g e k e n n z e i c h n et , daß man zusätzlich Nukleinsäuren mit der Homo-Tail-Sequenz in einen molaren Überschuss zu den Primern verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 1, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n et , daß in den Primern mindestens eine der Thymidinbasen durch Uracil ersetzt wird und dem Reaktionsgemisch das Enzym Uracil-N- Glykosyiase zugegeben wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, d a d u rc h g e k e n n z e i c h n et , daß die eingesetzten Sonden fluoreszenzoptisch detektierbare Markierungsgruppen tragen.
5. Verfahren nach Anspruch 4, d a d u rc h g e k e n n z e i c h n et , daß die eingesetzten Sonden an ihren 5'-Enden mit Fluoreszenzfarbstoffmoleküien und an ihren 3'-Enden mit Quenchermolekülen markiert sind, wobei die 3'-Enden so modifiziert sind, daß eine Extension durch Polymerasen nicht möglich ist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüchen 4 oder 5, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß die Fluoreszenzfarbstoffmoleküle 6-FAM, TET, JOE, HEX, VIC™, Fluorescein, LCRed 640 oder LCRed 705 sind und daß das Quenchermolekül TAMRA oder DABCYL ist.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n et, daß als Sonde ein "Molecular Beacon" eingesetzt wird.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß zwei verschiedene Sonden mit der Sondenbindungssequenz wechselwirken.
9. Verfahren nach den Anspruch 8, d a d u rc h g e ke n n z e i c h n et , daß eine der beiden Sonden an ihrem 3'-Ende einen ersten Fluoreszenzfarbstoff und die andere der beiden Sonden an ihrem 5'-Ende einen zweiten Fluoreszenzfarbstoff trägt und Licht, das vom ersten Fluoreszenzfarbstoff absorbiert und remittiert wird, vom zweiten, nach Bindung der beiden Sonden an den Komplementärstrang der Sondenbindungssequenz dem ersten Farbstoff räumlich nahen Fluoreszenzfarbstoff erneut absorbiert und remittiert wird.
10. Verfahren nach Anspruch 9, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß der erste Fluoreszenzfarbstoff Fluorescein und der zweite Fluoreszenzfarbstoff LC Red 640 oder LC Red 705 ist.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d a d u r c h g e k e n n ze i c h n e t , daß die Amplifikationsreaktion eine Multiplex-PCR ist.
12. Nukleinsäure zum Einsatz als Primer in Nukleinsäure- Amplifikationsreaktionen, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n et , daß sie in 5'-3'-Richtung folgende Elemente umfasst: eine 5'- Homo-Tail-Sequenz, eine Sondenbindungssequenz, die als primerintegrierte Reportersequenz (PIRS) bezeichnet ist und mit deren Komplementärstrang mindestens eine Sonde mit detektierbaren Markierungsgruppen wechselwirken kann, und eine für die zu amplifizierende Nukleinsäure spezifische Sequenz.
13. Reagenzienkit zum Nachweis von Nukleinsäureamplifikationsprodukten, umfassend: a) mindestens eine Nukleinsäure, die als Primer eingesetzt wird, und die in 5'-3'-Richtung folgende Elemente umfasst: eine 5'-Homo-Tail-Sequenz, eine Sondenbindungsequenz, die als primer-integrierte Reportersequenz bezeichnet ist, und eine für die zu amplifizierende Nukleinsäure spezifische
Sequenz, b) mindestens eine Nukleinsäure, die als Primer eingesetzt wird, und die in 5'-3'-Richtung folgende Elemente umfasst: eine 5'-Homo-Tail-Sequenz, und eine für die zu amplifizierende Nukleinsäure spezifische Sequenz, c) mindestens eine Sonde, die aufgrund von Markierungsgruppen detektierbar ist, und die für den Komplementärstrang der Nukleinsäure gemäß a) spezifisch ist, d) Desoxyribonukleotide, e) ein zur Extension der Nukleinsäure-Primer nach a) und b) geeignetes Enzym, und f) einen geeigneten Puffer und gegebenenfalls weitere Hilfsstoffe.
14. Kit nach Anspruch 13, d a d u rc h g e k e n n z e i c h n et , daß er zusätzlich Nukleinsäuren mit der Homo-Tail-Sequenz umfasst.
15. Kit nach Anspruch 13, d a d u r c h g e ke n n z e i c h n e t , daß in den Primern mindestens eine der Thymidinbasen durch Uracil ersetzt ist und der Kit weiterhin das Enzym Uracil-N- Glykosylase umfasst.
16. Kit nach einem der Ansprüche 13 bis 15, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n et , daß das Enzym eine thermostabile DNA-Polymerase ist, die eine
5'-3'-Exonukleaseaktivität aufweist.
17. Kit nach einem der Ansprüche 13 bis 16, d a d u rc h g e k e n n z e i c h n et , daß die Sonde als detektierbare Markierungsgruppen an ihrem 5'- Ende die Farbstoffmoleküle 6-FAM, TET, JOE, HEX, VIC™, Fluorescein, LCRed 640 oder LCRed 705 und an ihrem 3'-Ende das Quenchermolekül TAMRA oder DABCYL trägt.
18. Kit nach einem der Ansprüche 13 bis 17, d a d u rc h g e k e n n z e i c h n et , daß die Sonde ein "Molecular Beacon" ist.
19. Kit nach einem der Ansprüche 13 bis 18, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß drei verschiedene Sonden mit dem Komplementärstrang der Sondenbindungssequenz wechselwirken und daß die erste der drei Sonden an ihrem 3'-Ende das Farbstoffmolekül Fluorescein trägt, die zweite der drei Sonden an ihrem 5'-Ende das Farbstoffmolekül LC Red 640 trägt und die dritte Sonde an ihrem 5'-Ende das Farbstoffmolekül LC Red 705 trägt.
20. Kit nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß die zu der Amplifikationsreaktion eingesetzten Primer und PIRS-Primer mit m-BCR-cDNA oder/und M-BCR-cDNA oder/und TEL/AML-cDNA oder/und AML/ETO-cDNA hybridisieren.
21. Kit nach einem der Ansprüche 13 bis 19, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß die zu der Amplifikationsreaktion eingesetzten Primer und PIRS-Primer mit genomischer Herpesvirus-DNA oder/und mit für die 16S rRNA codierender genomischer DNA aus Haemophilus influenzae oder/und Neisseria meningitidis oder/und Streptococcus pneumoniae hybridisieren.
22. Kit nach einem der Ansprüchen 13 und 19, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n et , daß die zu der Amplifikationsreaktion eingesetzten Primer und
PIRS-Primer mit lnterleukin-2-cDNA oder/und lnterleukin-4-cDNA oder/und lnterleukin-5-cDNA oder/und lnterleukin-10-cDNA oder/und Interferon- -cDNA hybridisieren.
23. Nukleinsäuren zum Einsatz als PIRS-Primer in einem Kit nach Anspruch 20, mit den in SEQ ID No. 1, No.2 und No.3 wiedergegebenen Sequenzen.
24. Nukleinsäuren zum Einsatz als PIRS-Primer in einem Kit nach Anspruch 21, mit den in SEQ ID No.4, No. 5, No. 6, No. 7 und
No. 8 wiedergegebenen Sequenzen.
25. Nukleinsäuren zum Einsatz als PIRS-Primer in einem Kit nach Anspruch 22, mit den in SEQ ID No.9, No. 10, No. 11, No. 12 und No. 13 wiedergegebenen Sequenzen.
26. Nukleinsäuren zum Einsatz als PIRS-Primer in einem Kit nach Anspruch 20, mit den in SEQ ID No. 1 4, No. 1 5 und No. 1 6 wiedergegebenen Sequenzen.
27. Nukleinsäuren zum Einsatz als PIRS-Primer in einem Kit nach Anspruch 20, mit den in SEQ ID No. 1 7, No. 1 8 und No. 1 9 wiedergegebenen Sequenzen.
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