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DE19925448A1 - Multiplex-PCR mit fluoreszenzoptischer Produktdetektion durch den Einsatz von Primern mit "primerintegrierten Reportersequenzen" (PIRS) - Google Patents

Multiplex-PCR mit fluoreszenzoptischer Produktdetektion durch den Einsatz von Primern mit "primerintegrierten Reportersequenzen" (PIRS)

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Publication number
DE19925448A1
DE19925448A1 DE19925448A DE19925448A DE19925448A1 DE 19925448 A1 DE19925448 A1 DE 19925448A1 DE 19925448 A DE19925448 A DE 19925448A DE 19925448 A DE19925448 A DE 19925448A DE 19925448 A1 DE19925448 A1 DE 19925448A1
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DE
Germany
Prior art keywords
sequence
primers
primer
pirs
nucleic acid
Prior art date
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Withdrawn
Application number
DE19925448A
Other languages
English (en)
Inventor
Reinald Repp
Wolfgang Rascher
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Individual
Original Assignee
Individual
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Publication date
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Priority to PCT/EP2000/005023 priority patent/WO2000075369A1/de
Priority to AU52191/00A priority patent/AU5219100A/en
Publication of DE19925448A1 publication Critical patent/DE19925448A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6823—Release of bound markers

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Abstract

Durch den Einsatz von Primern mit primer-integrierten Reportersequenzen (PIRS-Primern) ist bei Multiplex-PCR-Anwendungen mit fluorenzenzoptischer Produktdetektion nur mehr eine Sondenoligonukleotidsequenz pro PIRS notwendigt. Eine Markierung jedes einzelnen spezifischen Primers mit Fluoreszenzfarbstoffmolekülen entfällt.

Description

Fluoreszenzoptische Verfahren zur Detektion von Produkten der Polymerase- Kettenreaktion (PCR) ermöglichen eine hochempfindliche quantitative Bestimmung von Molekülen einer DNA-Zielsequenz.
Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) stellt ein Verfahren zur exponentiellen Vermehrung von spezifischen DNA-Abschnitten dar.
Zur Automatisierung der Detektion von Produkten einer Polymerase- Kettenreaktion wurden zwei Verfahren entwickelt, die eine fluoreszenzoptische Detektion der Reaktionsprodukte während der laufenden Reaktion in quantitativer Hinsicht ermöglichen und so die Anzahl von Molekülen der Zielsequenz, die im PCR-Ansatz vor Beginn der Reaktion vorhanden waren zu ermitteln helfen. Das erste Verfahren betrifft die TaqMan™-Technologie der Firma Applied Biosystems/Perkin Elmer, die das ABI-PRISM™-Sequenzdetektionssystem einschließt. Das TaqMan-System nutzt die 5'-Nuklease-Aktivität der Taq-DNA-Polymerase, wobei ein Oligonukleotid verwendet wird, das am 5'-Ende mit einem Fluoreszenzmolekül und am 3'-Ende mit einem Quenchermolekül markiert ist, wobei die Taq-DNA-Polymerase durch ihre 5'-Exonukleaseaktivität das Fluoreszenzmolekül freisetzt, dessen Signal im ABI-PRISM- Sequenzdetektionssystem nachgewiesen wird. Als Fluoreszenzfarbstoffe stehen die drei Moleküle FAM, JOE und VIC zur Verfügung, die mit dem Quenchermoleküle TAMRA kombiniert werden können. Die Synthese von TaqMan™-Sonden wird von verschiedenen Herstellern angeboten.
Das zweite System betrifft das Light-Cycler™-System der Firmen Boehringer Mannheim/Hoffmann La Roche. Hierbei sind die Fluoreszenzfarbstoffe auf zwei verschiedene Oligonukleotide verteilt. Am 3'-Ende des ersten Oligonukleotids befindet sich der Fluoreszenzfarbstoff Fluorescein, während das sich stromabwärts vom ersten Oligonukleotid anlagernde zweite Oligonukleotid an seinem 5'-Ende den Fluoreszenzfarbstoff LC Red 640 aufweist. Das Fluorescein wird von einer LED als Lichtquelle angeregt und emittiert Licht, das über Fluoreszenzresonanzenergietransfer das zweite Fluoreszenzmolekül (LC Red 640 oder LC Red 705) anregt. Das von dem zweiten Farbstoff emittierte Licht wird über einen entsprechenden Filter detektiert. Eine Anregung des zweiten Farbstoffs kann nur dann erfolgen, wenn sich durch die Anlagerung der beiden Oligonukleotide an ihren Komplementärstrang die beiden Farbstoffmoleküle in räumlicher Nähe (Distanz von 1 bis 5 Nukleotiden) befinden, erfolgen. Das Prinzip des Systems beruht also auf der sekundären Anregung eines zweiten Fluoreszenzfarbstoffs, die erst durch die Generation von PCR-Produkt ermöglicht wird. Beim bereits beschriebenen TaqMan™-System dagegen wird vom Fluoreszenzfarbstoffmolekül emittiertes Licht vom Quenchermolekül absorbiert, weswegen erst nach der Hydrolyse des Fluoreszenzfarbstoffmoleküls vom Oligonukleotid durch die 5'-3'- Exonukleaseaktivität der Taq-DNA-Polymerase die Quencherwirkung aufgehoben und emittiertes Licht gemessen werden kann.
Die durch beide Systeme ermöglichte hochempfindliche quantitative Bestimmung von Molekülen einer DNA-Zielsequenz macht eine aufwendige Produktanalyse, wie z. B. durch gelelektrophoretische Auftrennung nach der eigentlichen PCR-Reaktion überflüssig. Für jede zu erfassende Zielsequenz wird jedoch eine spezifische Sonde benötigt, entweder ein an beiden Enden fluoreszenzmarkiertes Oligonukleotid wie beim TaqMan™-System oder zwei einfach fluoreszenzmarkierte Oligonukleotide wie beim Light-Cycler™- System. Die genannten Systeme sind grundsätzlich einsetzbar für Multiplexanwendungen, d. h. es können mehrere Zielsequenzen hierbei gleichzeitig amplifiziert werden. Ein Nachteil dieser Anwendungsart bei diesen bekannten Verfahren ist, dass zur Detektion für jede einzelne Zielsequenz eine eigene Sonde bzw. ein eigenes Sondenpaar benötigt wird, die/das spezifisch an einen internen Bereich der durch die Amplifikation entstandenen Zielsequenz binden muss. Sollen viele verschiedene Zielsequenzen nebeneinander nachgewiesen werden, so wird der Reaktionsansatz wegen der steigenden Anzahl verschiedener Detektionssonden relativ teuer und die zunehmende Zahl der Sonden kann die RCR-Amplifikation beeinträchtigen. Die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe besteht somit darin, durch geeignete Veränderungen der Primer-Strukturen sowohl bei Anwendung des TaqMan™- wie des Light Cycler™-Systems eine Möglichkeit zu finden, den teuren Einsatz jeweils spezifischer Sondenoligonukleotide zu umgehen. Hierbei sollte die Multiplex-Anwendung, die für die heutige Diagnostik immer wichtiger wird, nicht beeinträchtigt werden.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe gelöst durch ein Verfahren zur Detektion von Produkten einer Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion mittels mindestens zweier Primer, dadurch gekennzeichnet, dass
  • a) einer der für die Amplifikationsreaktion eingesetzten Primer in 5'-3'-Richtung folgende Elemente umfasst: eine 5'-Homo-Tail- Sequenz, eine Sondenbindungssequenz, die als primer­ integrierte Reportersequenz (PIRS) bezeichnet ist, und eine für die zu amplifizierende Nukleinsäure spezifische Sequenz,
  • b) ein anderer der für die Amplifikationsreaktion eingesetzten Primer in 5'-3'-Richtung folgende Elemente umfasst: eine 5'- Homo-Tail-Sequenz, und eine für die zu amplifizierende Nukleinsäure spezifische Sequenz, und
  • c) die zur Detektion eingesetzten Sonden mit dem Komplementärstrang der Sondenbindungssequenz des einen der beiden Amplifikationsprimer wechselwirken können, und die eingesetzten Sonden detektierbare Markierungsgruppen tragen.
Die Erfindung basiert auf einem neuartigen Primer-Design, das in einem ersten Aspekt der Erfindung Primer mit primer-integrierten Reportersequenzen ("PIRS-Primer") vorsieht. Die PIRS-Primer (mit integrierter Sondenbindungssequenz/Reportersequenz) haben dabei folgenden allgemeinen Aufbau:
5'-Homo-Tail - Sondenbindungssequenz/PIRS - Spezifische Sequenz-3'.
Der in der PCR zu verwendende zweite Primer mit entgegengesetzter Polarität enthält keine PIRS und hat den folgenden schematischen Aufbau:
5'- Homo-Tail - Spezifische Sequenz - 3'.
Ein weiteres wesentliches Merkmal der Erfindung ist, dass beide PCR-Primer an ihrem 5'-Ende eine als "5'-Homo-Tail" bezeichnete zusätzlich angefügte Sequenz aufweisen. Diese "5'-Homo-Tail"-Sequenz kann frei gewählt werden, sie muss jedoch auch bei einer Kombination mehrerer Primersätze zu einer Multiplex-PCR bei allen Primern identisch sein und sollte in ihrer Schmelztemperatur etwas höher liegen als der die "spezifische Sequenz" definierende Primerabschnitt. Das zugrundeliegende Prinzip entspricht der "HANDS"-PCR-Technologie (Homo-Tag-Assisted-Non-Dimer-System) (Brownie et al.; EP-0 731 177, EP-0 332 435). Durch die Verwendung des "HANDS"-PCR-Prinzips wird die unerwünschte Bildung von Primer-Dimeren während der PCR-Reaktion um mehrere Zehnerpotenzen verringert. Die beschriebenen Primer stellen daher einen weiteren Gegenstand der Erfindung dar.
In einer erfindungsgemäßen Multiplex-PCR mit PIRS-Primern lassen sich mit den oben beschriebenen Verfahren mehrere Primersätze kombinieren, die aufgrund unterschiedlicher "spezifischer Sequenzen" am 3'-Ende des ersten Primertyps die Detektion mehrerer Zielsequenzen in einem einzigen Reaktionsansatz erlauben. Bei der Bildung von PCR-Produkten entsteht eine zur Sondenbindungsstelle/Reportersequenz komplementäre Sequenz, mit der die Sondenoligonukleotide hybridisieren müssen. Durch den Einsatz mehrerer Sonden mit entsprechenden Fluoreszenzfarbstoffmolekülen nach dem TaqMan™-System lassen sich verschiedene Gruppen von Zielsequenzen unterscheiden. Dies wird anhand der unten dargestellten Beispiele 1 bis 4 verdeutlicht.
Der Einsatz der erfindungsgemäßen PIRS-Primer in Kombination mit den beschriebenen Maßnahmen zur Vermeidung der unerwünschten Bildung von Primer-Dimeren (HANDS-PCR), erlaubt es mit Hilfe der fluoreszenzoptischen Detektionssysteme TaqMan™ und Light Cycler™ mit einer einzelnen Sonde bzw. einem Sondenpaar, die/das mit einem der zur Verfügung stehenden Fluoreszenzfarbstoffe markiert ist, eine große Zahl verschiedener Zielsequenzen in einem Reaktionsansatz zu detektieren. Zusätzlich können alle zur Verfügung stehenden Fluoreszenzfarbstoffe parallel mit Hilfe spezifischer Sonden eingesetzt werden. Somit ist es möglich, verschiedene Gruppen von Zielsequenzen einer Sonde bzw. einer dazugehörenden Fluoreszenzfarbe, zuzuordnen. Die Zielsequenzen der einzelnen Gruppen können in einer einzigen PCR-Reaktion parallel detektiert werden und in ihrer Gruppenzugehörigkeit anhand der zugeordneten Farbe der eingesetzten Sonde identifiziert werden, wodurch ein sehr hoher Automatisierungsgrad der PCR-Diagnose erreicht wird.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Reagenzienkit, der die erfindungsgemäßen PIRS-Primer enthält und zum Einsatz in der Diagnose von
  • 1. Leukämien,
  • 2. Meningitis oder Enzephalitis und
  • 3. Zytokin-Antworten
geeignet ist, wie in den Beispielen 1, 3 und 4 verdeutlicht wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält ein unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Reagenzienkits erzeugter 50 µl-Reaktionsansatz:
2 µl der zu untersuchenden Probe
5 µl 10 × PCR-Puffer
4 µl 25 nM MgCl2
2 µl dNTP-Mix (jeweils dATP, dCTP, dGTP und TTP)
5 µl "Homo-Tail"-Primer (500 nM Endkonzentration)
0,125 µl thermostabile DNA-Polymerase
0,5 µl PIRS-Primer und Rückprimer (10 nM Endkonzentration)
5 µl Sondenoligonukleotid A mit Fluoreszenzfarbstoff 1 (200 nM Endkonzentration)
5 µl Sondenoligonukleotid B mit Fluoreszenzfarbstoff 2 (200 nM Endkonzentration)
steriles Aqua bidest. ad 50 µl.
Der erfindungsgemäße Reagenzienkit umfasst mindestens eine Nukleinsäure zum Einsatz als Primer in Nukleinsäure-Amplifikationsreaktionen, dadurch gekennzeichnet, dass sie in 5'-3'-Richtung folgende Elemente umfasst: eine 5'-Homo-Tail- Sequenz, eine Sondenbindungssequenz, die als primer-integrierte Reportersequenz (PIRS) bezeichnet ist und mit deren Komplementärstrang mindestens eine Sonde mit detektierbaren Markierungsgruppen wechselwirken kann, und eine für die zu amplifizierende Nukleinsäure spezifische Sequenz.
Die folgenden erfindungsgemäßen PIRS-Primer sind Grundlage des erfindungsgemäßen Verfahrens in der Ausführungsform der beanspruchten Reagenzienkits, deren Durchführung in den Beispielen 1, 3 und 4 beschrieben wird. Ihre Sequenzen sind im Sequenzprotokoll wiedergegeben.
SEQ ID No. 1: ABL intern Hands NPY antisense,
SEQ ID No. 2: TEL intern Hands HNNO sense,
SEQ 1D No. 3: ETO intern Hands HNNO antisense,
SEQ ID No. 4: HSV1 intern Hands HNNO sense,
SEQ ID No. 5: HSV2 intern Hands HNNO sense,
SEQ ID No. 6: Men intern Hands NPY Rec sense,
SEQ ID No. 7: Hae intern Hands NPY Rec sense,
SEQ ID No. 8: Pneu intern Hands NPY Rec sense,
SEQ ID No. 9: IL-2 intern Hands HNNP sense,
SEQ ID No. 10: IF-g intern Hands HNNO sense,
SEQ ID No. 1 l: IL-4 intern Hands NPY Rec sense,
SEa ID No. 12: IL-5 intern Hands NPY Rec sense,
SEQ ID No. 13: IL-10 intern Hands NPY Rec sense.
Die Zeichnung besteht aus den Fig. 1 und 2, die das Ergebnis der Durchführung von Beispiel 1 zeigen.
Fig. 1 ist das Ergebnis einer Multiplex-PCR unter Einsatz von PIRS-Primern mit dem TaqMan™-Verfahren. Das Ergebnis ist so dargestellt, wie es vom ABI-PRIS™ Sequence Detection System erhalten wird. Auf der X-Achse ist die Zahl der abgelaufenen PCR-Zyklen (0-35) dargestellt. Die Y-Achse gibt die zugehörigen in den jeweiligen Zyklen gemessenen Fluoreszenzintensitäten an. Die schwarze Linie parallel zur X-Achse gibt den Grenzwert an, unter dem das Fluoreszenzsignal als negativ bezeichnet wird (Threshold). Er wird mathematisch vom Gerät ermittelt. In Abb. 1 werden nur die FAM-Signale sichtbar. Die Proben (samples) sind wie folgt bezeichnet:
A4 = m-BRC (Bady), A5 = M-BCR (Bady), A6 = TEL/AML (Goody),
A7 = AML/ETO (Goody); B4-B7 = vier gleiche Negativkontrollen (mRNA der Zelllinie HL60 ohne Translokation); C4 = Wasserkontrolle der PCR (ohne Template).
Fig. 2 ist das Ergebnis einer Multiplex-PCR unter Einsatz von PIRS-Primern mit dem TaqMan™-Verfahren. Das Ergebnis ist so dargestellt, wie es vom ABI-PRISM™ Sequence Detection System erhalten wird. Auf der X-Achse ist die Zahl der abgelaufenen PCR-Zyklen (0-35) dargestellt. Die Y-Achse gibt die zugehörigen in den jeweiligen Zyklen gemessenen Fluoreszenzintensitäten an. Die schwarze Linie parallel zur X-Achse gibt den Grenzwert an, unter dem das Fluoreszenzsignal als negativ bezeichnet wird (Threshold). Er wird mathematisch vom Gerät ermittelt. In Abb. 2 werden nur die VIC-Signale sichtbar. Die Proben (samples) sind wie folgt bezeichnet:
A4 = m-BRC (Bady), A5 = M-BCR (Bady), A6 = TEL/AML (Goody),
A7 = AML/ETO (Goody); B4-B7 = vier gleiche Negativkontrollen (mRNA der Zelllinie HL60 ohne Translokation); C4 = Wasserkontrolle der PCR (ohne Template).
Beispiele Beispiel 1
Unter Einsatz von PIRS-Primern wurde ein Verfahren entwickelt, das es mit einer einzigen PCR-Reaktion ermöglicht, in Leukämiezellen zwischen mehreren genetischen Markern zu unterscheiden, die mit einer besonders guten oder schlechten Prognose der Erkrankung verbunden sind. Die Ergebnisse eines solchen Tests können direkt zur Therapiefestlegung verwendet werden. Als Marker mit schlechter Prognose (im Weiteren bezeichnet als "Badies") wurden zwei Splicingvarianten des BCR/ABL- Rearrangements (als m-BCR bzw. M-BCR bezeichnet) einbezogen, das zytogenetisch der Translokation t(9; 22) entspricht, die auch als Philadelphia- Chromosom bekannt ist. Die entsprechende TaqMan™-Sonde wurde 5'- VICITAMRA-3' markiert. Als chromosomale Translokation mit guter Prognose bei Leukämien des Kindesalters wurden die chromosomalen Translokationen t(12; 21) und t(8; 21) einbezogen. Die hierdurch entstehenden chimären mRNAs werden als "TEL/AML"- bzw. als "AML/ETO"-Fusionsgene bezeichnet. Die entsprechende Sonde wurde 5'- FAM/TAMRA-3' markiert.
Als Ausgangsmaterial wurde RNA aus Leukämiezelllinien verwendet, die jeweils eine der zu detektierenden chromosomalen Translokationen aufweisen, bzw. als Negativkontrolle eine Zeillinie (HL60), die keine solche genetische Veränderung besitzt. Da chimäre mRNA-Moleküle nachgewiesen werden sollen (diese resultieren aus einer Fusion von zwei unterschiedlichen Genfragmenten, die durch die chromosomale Translokation hervorgerufen wurde), muss vor der eigentlichen PCR die RNA nach üblichen Verfahren in cDNA (komplementäre DNA) umgeschrieben werden. Zur Steigerung der Empfindlichkeit wurde noch ein normaler PCR-Lauf vorgeschaltet, bevor die eigentliche PCR-Reaktion unter fluoreszenzoptischer Produktdetektion angeschlossen wurde. Die entscheidende PCR-Reaktion im TaqMan™- Verfahren wurde als zweiter Lauf einer nested-PCR durchgeführt. Die nested-PCR (ursprünglich von Chamberlain et al. beschrieben) stellt ein bekanntes und breit angewandtes Verfahren zur Erhöhung der PCR- Sensitivität und -Spezifität dar. Im ersten Lauf der nested-PCR werden die Zielsequenzen voramplifiziert. In der Regel wird ein Mikroliter des Reaktionsprodukts des ersten Laufs als Ausgangsmaterial für den zweiten Lauf der nested-PCR übertragen. Die im zweiten Lauf eingesetzten Primer binden innerhalb der voramplifizierten DNA Abschnitte. Die Durchführung einer nested-PCR ist bei dem vorgeschlagenen Verfahren mit PIRS-Primern grundsätzlich nicht erforderlich. Es sollte nur demonstriert werden, dass das Verfahren auch in einer nested-PCR eingesetzt werden kann. Alle im ersten Lauf der nested-PCR eingesetzten Primer entsprechen ihrer Struktur nach ganz normalen PCR-Primern ohne jegliche Zusatzsequenzen. Sie sind alle mit einem Pfeil (→) vor dem Bezeichnungskürzel versehen.
Externe Primer für vorgeschalteten Lauf einer Nested-PCR:
Im folgenden Abschnitt sind die genauen Sequenzen der verwendeten PCR- Primer aufgeführt: (5'-Homo-Tail = kursiv; Sondenbindungsstelle (PIRS) = fett gedruckt; Spezifische Sequenz = unterstrichen).
PCR-Bedingungen für diesen Ansatz
Ein 50 µl Reaktionsansatz enthält folgende Komponenten:
5 µl 10 × PCR-Puffer
4 µl 25 nM MgCl2
2 µl dNTP-Mix (dATP, dCTP, dGTP und TTP)
5 µl "Homo-Tail"-Primer (500 nM Endkonzentration)
5 µl FAM-Sonde HNNO (200 nM Endkonzentration)
5 µl VIC-Sonde NPY-Rec (200 nM Endkonzentration)
0,25 µl UNG (Substanz zur Eliminierung von Kontaminationen)
0,125 µl AmpliTaq Gold Polymerase
0,5 µl von jedem spezifischen Primer (PIRS-Primer und jeweilige Gegenprimer, 10 nM Endkonzentration)
2 µl der zu untersuchenden Probe
steriles Aqua bidest. ad 50 µl.
PCR-Cycler Bedingungen
50°C - 2 min (Kontaminationsinaktivierung durch UNG)
95°C - 10 min (Denaturierung und Aktivierung der AmpliTaq Gold Polymerase = Hot Start)
danach 5 Zyklen zu 95°C - 15 s → 60°C - 1 min → 72°C- 1 min
danach 35 Zyklen zu 95°C - 15 s → 68°C- 1 min → 72°C- 1 min.
Die Resultate des Anwendungsbeispiels sind in den Fig. 1 und 2 gezeigt.
Man sieht, dass nur die "Badies" ein positives VIC-Signal aufweisen, während nur die "Goodies" ein positives FAM-Signal zeigen. Alle anderen Proben sind negativ. Es liegen somit keine falsch positiven Resultate vor.
Beispiel 2
Eine Multiplex-PCR mit PIRS-Primern kann genutzt werden, um mehrere genetisch heterogene Erkrankungen gleichzeitig nachzuweisen. Für jede zu berücksichtigende Erkrankung wird eine Sondenfarbe reserviert. Die einzelnen PCR-Primer erhalten aufgrund unterschiedlicher 3'-Enden die Spezifität für eine einzige Punktmutation. Aufgrund identischer PIRS können die entsprechenden Gruppen von Primern jeweils einer in Frage kommenden Erkrankung zugeordnet werden. So könnte zur Ursachenklärung bei Kindern mit einer Lungenerkrankung eine Fluoreszenzfarbe für den Nachweis verschiedener Punktmutationen im CFTR-Gen reserviert werden, um eine Mukoviszidose zu erkennen. Eine zweite PIRS könnte bei einem PCR- Primersatz eingebaut werden, um in der gleichen PCR-Reaktion Mutationen im PIZ-Gen zu detektieren, die beim alpha-1-Antitrypsinmangel vorliegen.
Beispiel 3
Eine Multiplex-PCR mit PIRS-Primern kann auch eingesetzt werden, um verschiedene Gruppen von Infektionserregern in einem einzigen PCR-Ansatz nachzuweisen. Für klinische Fragestellungen kann dies besonders hilfreich sein, wenn die einzelnen Gruppen ein unterschiedliches therapeutisches Vorgehen erfordern. So können bei Patienten mit klinischem Verdacht auf eine Meningitis oder Enzephalitis in einer einzigen Multiplex-PCR sowohl bakterielle als auch virale Erkrankungen nachgewiesen werden. Wird eine Sondenfarbe für alle bakteriellen - und eine andere Sondenfarbe für alle viralen Erreger reserviert, so ließe sich anhand des PCR-Ergebnisses sofort die notwendige Therapie ableiten: Breitspektrumantibiotika (z. B. Cefotaxim) bei bakteriellen Erregern oder Virostatika (z. B. Acyclovir) bei Herpesvirusinfektionen. Im ersten Lauf der nested-PCR werden nur zwei Primersätze eingesetzt. Einer detektiert beide Typen des Herpes simplex Virus. (Die Primersequenzen sind der folgenden Arbeit entnommen: Casas et al. Detection of both Herpes simplex and Varicella-Zoster Viruses in cerebrospinal fluid from patients with encephalitits, J. Med. Virol. Vol. 50: 82-92, 1996). Der zweite bindet an hochkonservierte bakterielle DNA- Regionen, die für Abschnitte der 16S rRNA von Bakterien (Eubacteriae) codieren. Mit ihm können die entsprechenden Genombereiche einer Vielzahl von Bakterien detektiert und amplifiziert werden (siehe Radström et al., J. Clin. Microbiology, Vol. 32: 2738-2744, 1994). Die Abgrenzung der klinisch relevanten pathogenen Bakterien (Meningokokken, Hämophilus influenza und Pneumokokken) erfolgt erst im zweiten Lauf der nested-PCR unter Verwendung spezifischer Primersätze mit PIRS-Primern auf einem fluoreszenzoptischen System zur Detektion der PCR-Produkte. Die bakterienspezifischen Primersequenzen sind der Arbeit von Radström et al. entnommen (s. o.); die herpesvirusspezifischen Primersequenzen stammen aus der Arbeit von Casas et al. (s. o.). Eine weitere Besonderheit ist die Ausführung des bakterienspezifischen Primersatzes als "semi-nested-PCR". Der universelle Antisense-Primer zum Nachweis von Bakterien wird auch im zweiten Lauf als Gegenprimer zu den Bakterienspezies-spezifischen PIRS- Primern eingesetzt. Die Speziesspezifität wird alleine durch die Sense-Primer erreicht. Aus diesem Grund muss der Primer bereits im ersten Lauf die "HANDS-Sequenz" 5'-wärts von dem zielsequenzspezifischen Abschnitt tragen. Hätte der Primer im ersten Lauf noch nicht die "HANDS-Sequenz", so würden im zweiten Lauf Primer mit und Primer ohne "HANDS-Sequenz" miteinander kompetieren, was bei der geringen Konzentration der zielsequenzspezifischen Primer im entscheidenden zweiten Lauf der nested- PCR zu einem ineffizienten Einbau der "HANDS-Sequenz" führen könnte, mit der Folge einer deutlich beeinträchtigen Sensitivität.
Primersequenzen
Außer dem Primer "Eubac-exdo" bzw. "Eubac-Hands-antisense", wie oben erwähnt, entsprechen alle im ersten Lauf der nested-PCR eingesetzten Primer ihrer Struktur nach normalen PCR-Primern ohne jegliche Zusatzsequenzen. Sie sind alle mit einem Pfeil (→) vor dem Bezeichnungskürzel versehen.
Externe Primer für vorgeschalteten Lauf einer Nested-PCR:
Im folgenden Abschnitt sind die genauen Sequenzen der verwendeten PCR- Primer aufgeführt: (5'-Homo-Tail = kursiv, Sondenbindungsstelle (PIRS) = fett gedruckt; Spezifische Sequenz = unterstrichen).
PCR-Reaktionsbedingungen
(Im Vergleich zu den im vorherigen Anwendungsbeispiel beschriebenen PCR-Bedingungen ergeben sich keine Unterschiede außer einer von 60 auf 55°C reduzierten Annealingtemperatur in den ersten fünf Zyklen der multiplex-PCR mit PIRS-Primern).
Ein 50 µl Reaktionsansatz enthält folgende Komponenten:
5 µl 10 × PCR-Puffer
4 µl 25 nM MgCl2
2 µl dNTP-Mix (dATP, dCTP, dGTP und TTP)
5 µl "Homo-Tail"-Primer (500 nM Endkonzentration)
5 µl FAM-Sonde HNNO (200 nM Endkonzentration)
5 µl VIC-Sonde NPY-Rec (200 nM Endkonzentration)
0,25 µl UNG (Substanz zur Eliminierung von Kontaminationen)
0,125 µl AmpliTaq Gold Polymerase
0,5 µl von jedem spezifischen Primer (PIRS-Primer und jeweilige Gegenprimer, 10 nM Endkonzentration)
2 µl der zu untersuchenden Probe
steriles Aqua bidest. ad 50 µl.
PCR-Cycler Bedingungen
50°C - 2 min (Kontaminationsinaktivierung durch UNG)
95°C - 10 min (Denaturierung und Aktivierung der AmpliTaq Gold
Polymerase = Hot Start)
danach 5 Zyklen zu 95°C - 15 s → 55°C - 1 min-72°C → 1 min
danach 35 Zyklen zu 95°C - 15 s → 68°C - 1 min → 72°C - 1 min.
Beispiel 4
In einer Multiplex-PCR mit PIRS-Primern lässt sich auch die Fähigkeit zur quantitativen Erfassung der PGR-Produktmenge nutzen, die die oben beschriebenen fluoreszenzoptischen Detektionssysteme besitzen. Die jeweilige Gesamtmenge mehrere Gruppen von Nukleinsäure-Zielsequenzen kann so mit einer einzigen PCR-Reaktion ermittelt werden. So ist es möglich, verschiedene Gruppen von Zytokin-mRNAs jeweils einer Sonde zuzuordnen, um dann mit einer einzigen PCR-Reaktion zu ermitteln, ob z. B. in einer bestimmen Probe ein TH1- oder TH2-Zytokinantwort überwiegt. Viele infektiöse Agentien oder Allergene polarisieren zu einem der beiden Zytokinmuster TH1 und TH2, was zum Schutz des Organismus vor dem entsprechenden Agens oder aber zu einem immunpathologischen Prozess führen kann (siehe Arbeit von Lanzavecchia, Identifying strategies for immune intervention, Science Vol. 260: 937-944, 1993).
Eine PIRS wurde zum Nachweis der Zytokine Interleukin-2 und Interferon­ gamma eingesetzt. Die entsprechende Sonde trägt das Fluoreszenzsignal FAM. Die Intensität des FAM-Signals ist somit proportional zu der Summe der beiden Zielsequenzen Interleukin-2 und Interferongamma als Marker einer TH1-Antwort. Die zweite PIRS generiert die Bindungsstelle für eine VIC- markierte Sonde. Die PIRS-PCR-Primersätze dienen dem Nachweis von Interleukin-4, Interleukin-5 und Interleukin-10 als Repräsentanten einer TH2- Antwort.
Wie bei dem oben beschriebenen Verfahren zum Nachweis prognostisch relevanter chromosomaler Translokationen in Leukämiezellen wird zur Steigerung der Empfindlichkeit eine nested-PCR durchgeführt.
Alle im ersten Lauf der nested-PCR eingesetzten Primer entsprechen ihrer Struktur nach normalen PCR-Primern ohne jegliche Zusatzsequenzen. Sie sind alle mit einem Pfeil (→) vor dem Bezeichnungskürzel versehen.
Externe Primer für vorgeschalteten Lauf einer Nested-PCR
Im folgenden Abschnitt sind die genauen Sequenzen der verwendeten PCR- Primer aufgeführt: (5'-Homo-Tail = kursiv; Sondenbindungsstelle (PIRS) = fett gedruckt; Spezifische Sequenz = unterstrichen).
PCR-Bedingungen
Ein 50 µl Reaktionsansatz enthält folgende Komponenten:
5 µl 10 × PCR-Puffer
4 µl 25 nM MgCl2
2 µl dNTP-Mix (dATP, dCTP, dGTP und TTP)
5 µl "Homo-Trail"-Primer (500 nM Endkonzentration)
5 µl FAM-Sonde HNNO (200 nM Endkonzentration)
5 µl VIC-Sonde NPY-Rec (200 nM Endkonzentration)
0,25 µl UNG (Substanz zur Eliminierung von Kontaminationen)
0,125 µl AmpliTaq Gold Polymerase
0,5 µl von jedem spezifischen Primer (PIRS-Primer und jeweilige Gegenprimer, 10 nM Endkonzentration)
2 µl der zu untersuchenden Probe
steriles Aqua bidest. ad 50 µl.
PCR-Cycler Bedingungen
50°C - 2 min (Kontaminationsinaktivierung durch UNG)
95°C - 10 min (Denaturierung und Aktivierung der AmpliTaq Gold Polymerase = Hot Start)
danach 5 Zyklen zu 95°C - 15 s → 60°C - 1 min → 72°C - 1 min
danach 35 Zyklen zu 95°C - 15 s → 68°C - 1 min → 72°C - 1 min.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims (19)

1. Verfahren zur Detektion von Produkten einer Nukleinsäure- Amplifikationsreaktion mittels mindestens zweier Primer, dadurch gekennzeichnet, dass
  • a) einer der für die Amplifikationsreaktion eingesetzten Primer in 5'-3'-Richtung folgende Elemente umfasst: eine 5'-Homo-Tail- Sequenz, eine Sondenbindungssequenz, die als primer- integrierte Reportersequenz (PIRS) bezeichnet ist, und eine für die zu amplifizierende Nukleinsäure spezifische Sequenz,
  • b) ein anderer der für die Amplifikationsreaktion eingesetzten Primer in 5'-3'-Richtung folgende Elemente umfasst: eine 5'- Homo-Tail-Sequenz, und eine für die zu amplifizierende 5 Nukleinsäure spezifische Sequenz, und
  • c) die zur Detektion eingesetzten Sonden mit dem Komplementärstrang der Sondenbindungssequenz des einen der beiden Amplifikationsprimer wechselwirken können, und die eingesetzten Sonden detektierbare Markierungsgruppen tragen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die eingesetzten Sonden fluoreszenzoptisch detektierbare Markierungsgruppen tragen.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die eingesetzten Sonden an ihren 5'-Enden mit Fluoreszenzfarbstoffmolekülen und an ihren 3'-Enden mit Quenchermolekülen markiert sind, wobei die 3'-Enden so modifiziert sind, dass eine Extension durch Polymerasen nicht möglich ist.
4. Verfahren nach den Ansprüchen 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Fluoreszenzfarbstoffmoleküle FAM, JOE oder VIC sind und dass das Quenchermolekül TAMRA ist.
5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass zwei verschiedene Sonden mit der Sondenbindungssequenz wechselwirken.
6. Verfahren nach den Ansprüchen 2 und 5, dadurch gekennzeichnet, dass eine der beiden Sonden an ihrem 3'-Ende einen ersten Fluoreszenzfarbstoff und die andere der beiden Sonden an ihrem 5'- Ende einen zweiten Fluoreszenzfarbstoff trägt und Licht, das vom ersten Fluoreszenzfarbstoff absorbiert und remittiert wird, vom zweiten, nach Bindung der beiden Sonden an den Komplementärstrang der Sondenbindungssequenz dem ersten Farbstoff räumlich nahen Fluoreszenzfarbstoff erneut absorbiert und remittiert wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Fluoreszenzfarbstoff Fluorescein und der zweite Fluoreszenzfarbstoff LC Red 640 oder LC Red 705 ist.
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifikationsreaktion eine Multiplex-PCR ist.
9. Nukleinsäure zum Einsatz als Primer in Nukleinsäure- Amplifikationsreaktionen, dadurch gekennzeichnet, dass sie in 5'-3'-Richtung folgende Elemente umfasst: eine 5'-Homo- Tail-Sequenz, eine Sondenbindungssequenz, die als primer-integrierte Reportersequenz (PIRS) bezeichnet ist und mit deren Komplementärstrang mindestens eine Sonde mit detektierbaren Markierungsgruppen wechselwirken kann, und eine für die zu amplifizierende Nukleinsäure spezifische Sequenz.
10. Reagenzienkit zum Nachweis von Nukleinsäuren, umfassend:
  • a) mindestens eine Nukleinsäure, die als Primer eingesetzt wird, und die in 5'-3'-Richtung folgende Elemente umfasst: eine 5'- Homo-Tail-Sequenz, eine Sondenbindungsequenz, die als primer-integrierte Reportersequenz bezeichnet ist, und eine für die zu amplifizierende Nukleinsäure spezifische Sequenz,
  • b) mindestens eine Nukleinsäure, die als Primer eingesetzt wird, und die in 5'-3'-Richtung folgende Elemente umfasst: eine 5'- Homo-Tail-Sequenz, und eine für die zu amplifizierende Nukleinsäure spezifische Sequenz,
  • c) mindestens eine Sonde, die aufgrund von Markierungsgruppen detektierbar ist, und die für den Komplementärstrang der Nukleinsäure gemäß a) spezifisch ist,
  • d) Desoxyribonukleotide,
  • e) ein zur Extension der Nukleinsäure-Primer nach a) und b) geeignetes Enzym, und
  • f) einen geeigneten Puffer und gegebenenfalls weitere Hilfsstoffe.
11. Kit nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym eine thermostabile DNA-Polymerase ist, die eine 5'-3'-Exonukleaseaktivität aufweist.
12. Kit nach den Ansprüchen 10 und 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Sonde als detektierbare Markierungsgruppen an ihrem 5'- Ende die Farbstoffmoleküle FAM, JOE oder VIC und an ihrem 3'-Ende das Quenchermolekül TAMRA trägt.
13. Kit nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass drei verschiedene Sonden mit dem Komplementärstrang der Sondenbindungssequenz wechselwirken und dass die erste der drei Sonden an ihrem 3'-Ende das Farbstoffmolekül Fluorescein trägt, die zweite der drei Sonden trägt an ihrem 5'-Ende das Farbstoffmolekül LC Red 640 und die dritte Sonde an ihrem 5'-Ende das Farbstoffmolekül LC Red 705.
14. Kit nach den Ansprüchen 10 und 11, dadurch gekennzeichnet, dass die zu der Amplifikationsreaktion eingesetzten Primer und PIRS- Primer mit m-BCR-cDNA oder/und M-BCR-cDNA oder/und TEL/AML- cDNA oder/und AML/ETO-cDNA hybridisieren.
15. Kit nach den Ansprüchen 10 und 11, dadurch gekennzeichnet, dass die zu der Amplifikationsreaktion eingesetzten Primer und PIRS- Primer mit genomischer Herpesvirus-DNA oder/und mit für die 16S rRNA codierender genomischer DNA aus Haemophilus influenzae oder/und Neisseria meningitidis oder/und Streptococcus pneumoniae hybridisieren.
16. Kit nach den Ansprüchen 10 und 11, dadurch gekennzeichnet, dass die zu der Amplifikationsreaktion eingesetzten Primer und PIRS- Primer mit Interleukin-2-cDNA oder/und Interleukin-4-cDNA oder/und Interleukin-5-cDNA oder/und Interleukin-10-cDNA oder/und Interferon-y-cDNA hybridisieren.
17. Nukleinsäuren zum Einsatz als PIRS-Primer in einem Kit nach Anspruch 14, mit den in SEQ ID No. 1, No. 2 und No. 3 wiedergegebenen Sequenzen.
18. Nukleinsäuren zum Einsatz als PIRS-Primer in einem Kit nach Anspruch 15, mit den in SEQ ID No. 4, No. 5, No. 6, No. 7 und No. 8 wiedergegebenen Sequenzen.
19. Nukleinsäuren zum Einsatz als PIRS-Primer in einem Kit nach Anspruch 16, mit den in SEQ ID No. 9, No. 10, No. 11, No. 12 und No. 13 wiedergegebenen Sequenzen.
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