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WO2000073465A1 - Peptides capable of inducing hiv-specific ctl and preventives/remedies for aids containing the peptides - Google Patents

Peptides capable of inducing hiv-specific ctl and preventives/remedies for aids containing the peptides Download PDF

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WO2000073465A1
WO2000073465A1 PCT/JP2000/003455 JP0003455W WO0073465A1 WO 2000073465 A1 WO2000073465 A1 WO 2000073465A1 JP 0003455 W JP0003455 W JP 0003455W WO 0073465 A1 WO0073465 A1 WO 0073465A1
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WO
WIPO (PCT)
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peptide
hla
hiv
cells
peptides
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PCT/JP2000/003455
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English (en)
French (fr)
Inventor
Masafumi Takiguchi
Kiyoshi Miwa
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Ajinomoto Co Inc
Original Assignee
Ajinomoto Co Inc
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Publication date
Application filed by Ajinomoto Co Inc filed Critical Ajinomoto Co Inc
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    • C12N2740/16211—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV gagpol
    • C12N2740/16222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • a peptide capable of inducing HIV-specific CTL A peptide capable of inducing HIV-specific CTL and
  • the present invention relates to a peptide which has an amino acid sequence of a partial region of a human immunodeficiency virus (hereinafter referred to as “HIV”) protein and is capable of inducing an immune response to HIV and an antibody containing the peptide.
  • HIV human immunodeficiency virus
  • HIV prevention and treatment Acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) is a disease caused by HIV infection.
  • drugs to treat 2.0 diseases is being actively conducted, and drugs such as azidothymidine (hereinafter abbreviated as “AZT”) and didoxyinosine (hereinafter abbreviated as “DDI”) have been put into practical use.
  • vaccines that enhance the immune resistance to HIV as a means of preventing HIV infection and suppressing the development of AIDS are also expected to be a trump card that can suppress the rapid spread of this disease worldwide, and are being studied extensively.
  • various types of vaccines have been devised, some of which have entered clinical trials. The following are typical vaccines reported so far. i) Vaccine using inactivated or attenuated virions: Mutational deletion of genes involved in HIV pathogenesis (Pro Natl. Acad. Sci. USA, 84, 1434, (1987)), HIV-common antigenicity (Science, 232, 238, (1987)) is conceivable, but cannot be easily put into practical use due to the potential danger.
  • Subunit vaccine using a partial antigenic protein of the virus Only a part of the antigenic protein among the viral particles is produced by genetic recombination and used as an immunogen. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 6924, (1987), Ann. Int. Med., 114, 119, (1991), Nature, ⁇ , 728, (1992). It is the most widely tried, with many clinical trials. However, there are many problems that need to be overcome, such as the neutralizing antibody titer does not increase or the antibody titer persistence. Although this approach is thought to be effective in enhancing humoral immunity such as antibody production, it is difficult to activate cell-mediated immunity that kills infected cells. The effect on infection prevention cannot always be expected.
  • Recombinant live vaccines such as vaccinia virus and BCG bacteria:
  • a method of incorporating and expressing a partial gene sequence derived from HIV can theoretically be expected to have a cellular immunity enhancing effect.
  • serious infectious diseases such as harmless vaccinia virus may occur in patients with reduced immunity (Lane et 337, 1034, (1991)).
  • There are problems such as that a sufficient immune response has not been generated with the recombinant production bacterium.
  • Anti-idiotypic antibody A method using an anti-idiotypic antibody as an immunogen instead of a virus antigen (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, ⁇ , 254 ⁇ , (1992)) has been reported.
  • Synthetic peptide vaccine Chemical synthesis of the peptide sequence in the critical region of the neutralizing antibody is under study.
  • CTL cytotoxic ⁇ cells
  • Antigens such as viral proteins are processed into short peptide fragments inside the cell and presented on the cell surface in a form that binds to major histocompatibility complex (MHC).
  • MHC major histocompatibility complex
  • CTLs recognize target peptides expressed by class IMHC antigens expressed on the cell surface and attack target cells. More specifically, CTL simultaneously recognizes the processed antigen fragment bound to the groove of the MHC molecule on the target cell and a part of the MHC molecule and attacks cells having the same.
  • MHC restriction the antigen recognition of CTL depends strongly on MHC on the cell surface, and such antigen recognition is called MHC restriction.
  • epitope peptides that are presented by binding to antigens are peptides of about 9 amino acids in length, and their amino acid sequences are known to have certain rules (motifs). (Nature, 351,290, (1991), Eur. J. Im munol., 22, 2453, (1992), Nature, 353, 326, (1991) Nature, 360,434, (1992), Im munogenetics, 38,161, ( 1993)).
  • the present inventors searched for a CTL peptide that specifically impairs cells infected with HIV-1, and found that class I human leukocytes i3 ⁇ 4 (hereinafter abbreviated as ⁇ HLAj ''), which is a human class IMHC.
  • ⁇ HLAj '' class I human leukocytes i3 ⁇ 4
  • HLA-B35 and HLA-B5K HLA-A31 peptides that can induce HIV-1-specific CTL (W095 / 11255). Induced HIV-1 specific CTL restricted by antigen.
  • HLA gene is an extremely polymorphic gene
  • peptides that bind to the HLA class I antigen are also highly polymorphic, subject to certain rules. This thing This suggests that peptides that are effective in the prevention and treatment of HIV infection may differ in their efficacy among individuals and ethnic groups. Therefore, in the prevention and treatment of HIV infection using such peptides, peptide sets capable of inducing other HLA-restricted CTLs are desired in addition to the already obtained peptides. I have. Disclosure of the invention
  • An object of the present invention is to provide a peptide capable of inducing a specific CTL against HIV-1.
  • Another object of the present invention is to provide a peptide useful for HIV-1 vaccine development, particularly in Asia.
  • a major problem with HIV vaccine development is that HIV easily mutates and evades host immunity. That is, a vaccine that carries only one epitope as an immunogen is likely to lose efficacy over time.
  • An object of the present invention is to provide a plurality of effective epitope peptides as immunogens that can be used simultaneously.
  • the peptide of the present invention is a peptide that can bind to HLA-A * 1101 class I antigen and induce HLA-A * 1101-restricted CTL targeting HIV-1 infected cells.
  • the DNA of the present invention is a DNA encoding the above-mentioned peptide.
  • HLA is a molecule that is extremely polymorphic between ethnic groups or individuals, but all of the peptides of the present invention are common in Asians, particularly Japanese.
  • HLA-A11 molecule (HLA-A * 1101) (Clayton J, Lonj on C, Whittle D: Allele and haplotype frequencies for HLA loci in variou s ethnic group: HLA volume I Genetic diversity of HLA functional and medical impl ication: Charron D.
  • the peptide of the present invention and the peptide encoded by the DNA of the present invention are fragments of the HIV-1 Pol protein or Env protein, and have the amino acid sequence QIYAGIKVK (SEQ ID NO: 1), SVITQACPK (SEQ ID NO: 2), QI IEELIKK (SEQ ID NO: 2). SEQ ID NO: 3), QI IEKLIEK (SEQ ID NO: 4), ACQGVGGPSHK (SEQ ID NO: 5), AFDLSFFLK (SEQ ID NO: 6), and ALDLSHFLK (SEQ ID NO: 7).
  • FIG. 1 shows the degree of recognition of HLA-A * 1101-restricted HIV-1-specific CTL epitopes by CTL clones.
  • black symbols indicate C1R-A * 1101 cells, and open symbols indicate C1R cells.
  • target 2: 1.
  • Two CTL clones were used for each peptide. Hata and ⁇ represent the SF2-Pol4 24-9-27CTL clone.
  • FIG. 2 shows CTL activity against target cells infected with recombinant vaccinia virus expressing the HIV-1 Pol protein.
  • the hatched bar graph shows the percent specific lysis for C1R-A * 1101 infected with recombinant vaccinia virus expressing the Pol protein of HIV-1.
  • the open bar graph shows the percentage of specific cell lysis for C1R-A * 1101 infected with wild-type pixia virus.
  • Figure 3 shows a recombinant vaccinia virus expressing the HIV-1 Env protein. It shows the CTL activity against infected target cells.
  • the bar graphs show C1R-A * 1101 infected with vaccinia virus expressing Env protein, C1R-A * 1101 infected with wild-type vaccinia virus, and Env protein, respectively, from the top.
  • Specific cell lysis for C1R infected with vaccinia virus, C1 infected with wild-type vaccinia virus, C1R-A * 1101 pulsed with SF2-Env202-9, and C1R pulsed with SF2-Env202-9 Represents ⁇ The peptide concentration was set at 10-.
  • the peptide of the present invention is a fragment of the HIV protein and has an HLA-A * 1101 binding motif, and actually binds to HLA.
  • the HLA-A * 1101 binding motif is composed of 8 to 12 amino acids
  • the second amino acid is an amino acid selected from Val, Ile, Thr, Leu, Tyr, Cys or Phe
  • C- Examples include peptides whose terminal amino acid is Lys. Such peptides can be synthesized without a peptide synthesizer.
  • HLA-A * 1101 binding motif actually binds to HLA-A * 1101 can be confirmed using a cell expressing HLA-A * 1101.
  • a cell expressing HLA-A * 1101. As such cells, C1R cells or RMA-S cells expressing HLA-A * 1101 can be used.
  • the synthesized HIV-1 derived peptide can actually stimulate peripheral blood lymphocytes (PBL) of a patient to induce cytotoxic T cells (CTL).
  • PBL peripheral blood lymphocytes
  • CTL cytotoxic T cells
  • the fragments of the above HIV-1 Pol protein comprising the amino acid sequences QIYA GIKVK (SEQ ID NO: 1), SVITQACPK (SEQ ID NO: 2), QI IEELIKK (SEQ ID NO: 3), QI IEKLIEK (SEQ ID NO: 4) ), ACQGVGGPSHK (SEQ ID NO: 5), AFDLSFFLK (SEQ ID NO: 6) And a peptide having ALDLSHFLK (SEQ ID NO: 7) was obtained.
  • the peptide of the present invention can be synthesized by a peptide synthesizer.
  • a DNA encoding a peptide having any of the amino acid sequences of SEQ ID NOS: 1 to 7 can be obtained by appropriate DNA-host cells. It can also be prepared by expression in a system. In this case, the codon usage may differ depending on the host cell used, so that a preferred codon can be used in each cell.
  • DNA that hybridizes to such DNA under stringent conditions and encodes a peptide that binds to HLA-A11 molecule and can induce cytotoxic cells targeting HIV-infected cells Can also be used.
  • the peptide of the present invention is very useful as a vaccine because it can induce HIV-1-specific CTL as a T cell epitope.
  • the peptide solution may be administered as it is or together with a physiologically compatible adjuvant by a syringe, or may be administered by percutaneous absorption through mucous membranes by spraying or the like.
  • the administration can be repeated 0.1 times to 100 mg once or multiple times. Further, a plurality of peptides may be used at the same time, which may be more effective than using a single peptide.
  • the preparation may be lyophilized or granulated by adding an excipient such as sugar, and is not particularly limited.
  • Epitope peptide is given in vitro to a cell collected from a patient or a cell having HLA class I antigen of the same haplotype to present the antigen, and then injected into the patient's blood vessel to effectively generate CTL in the patient.
  • a method of inducing the same or adding the same peptide to the peripheral blood lymphocytes of a patient, culturing the same in a test tube, inducing CTLs in the test tube, and then returning the patient to the patient is also considered. Can be applied effectively. Therefore, CTLs obtained by culturing peripheral blood lymphocytes having the HLA-A * 1101 antigen in the presence of a peptide having any one of SEQ ID NOs: 1 to 7 can also be used as an anti-AIDS vaccine.
  • CTL epitopes disclosed in the present invention can be effectively used for vaccinia virus, live recombinant BCG vaccine, and the like.
  • a DNA encoding a peptide having any one of SEQ ID NOs: 1 to 7 is incorporated into a recombinant antigen protein gene expressed in these recombinant raw vaccines, the peptide sequence will be is the process in cells after expressed as part of an antigen protein presented by HLA-a * l 101 antigen, expression methods International Patent Publication of foreign genes in c BCG bacteria can induce CTL recognizing this Detailed on W088 / 06626. Details of the live recombinant BCG vaccine are described in J. Exp. Med., 1 ⁇ , 197, (1993). The dose and administration method can be performed according to the usual vaccination or BCG vaccine. Acute toxicity is not different from normal vaccination or BCG notin.
  • C1R cells expressing HLA-A * 1101 C1R-A * 1101 and marauder-S cells expressing HLA-A * 1101 (RMA-S-A * 1101) can be obtained by methods described in the literature ( Tissue Antigens, 52, 501-509, (1998)).
  • RMA-S cells and C1R cells are mouse cell lines and human cell lines, respectively, which are defective in the transporter molecule TAP (Transporter Associated Protein) (Nature, ⁇ , 476, (1990)).
  • C1R cells and AS cells were cultured in RPMI1640 medium supplemented with 10% FCS.
  • C1R-A * 1101 cells and fragile-S-A * l101 cells were cultured in RPMI1640 medium containing 10% FCS and 0.15 mg / ml hygromycin B.
  • the cell line Tm-EBV (HLA-All / A24, B52 / B52, Cw7 / Cw * 1202) transformed with Epstein-Barr virus was RPMI16 supplemented with 10% FCS. Maintained at 40.
  • the peptide was synthesized using a multi-peptide synthesizer (Shimadzu Model PSSM-8, Shimadzu Corporation) and its sequence was confirmed by mass spectroscopy. In the following examples, peptides having a purity of 90% or more were used.
  • HIV-1 derived peptides The ability of HIV-1 derived peptides to bind to the HLA-A * 1101 molecule was determined by peptide-stabilized Atsusei as described in the literature (Tissue Antigens, 52, 501-509, (1998)).
  • the peptide stabilization method is briefly described below.
  • EMA-S cells and C1R cells are a mouse cell line and a human cell line, respectively, which are defective in the transporter-associated protein (TAP). Therefore, only low levels of MHC class I antigen are expressed on the cell surface when cultured at 37 ° C. However, it is known that when cultured at low temperature (26 ° C.), a high level of class I antigen not bound to a peptide is expressed on the cell surface (Nature, 346, 476, (1990)).
  • HLA-A * 1101 antigen is expressed on the cell surface at high levels when cultured at 26 ° C in RMA-SA * 1101 cells and C1R-A * 1101 cells, but is expressed when cultured at 37 ° C. Drops.
  • the expression of HLA-A * 1101 antigen on RMA-SA * 1101 cells or C1R-A * 1101 cells cultured at 26 ° C was incubated at 37 ° C for 3 hours, and then cultured at 37 ° C. As in the case of the expression, the expression level is low.
  • the binding activity of the peptide was determined by measuring the expression level of HLA-A * 1101 on the cell surface by flow cytometry using an anti-HLA- ⁇ * ⁇ 01 monoclonal antibody.
  • an available monoclonal antibody that recognizes the HLA-A antigen was used, but the TP25.99 antibody or B40 provided by Dr. Soldano Ferrone of New York Medical College. Five antibodies (ATCC HB-116) were mainly used.
  • Peripheral from HIV-1 seropositive patients with HLA-A * 1101 IU HLA-A11 / A24, B38 / B51, C7 /-
  • K0G HLA-A2 / A11, B46 / B54, CI /-
  • Peripheral blood lymphocytes can be separated by conventional Ficoll-Conray density centrifugation (Junichi Yada, Michio Fujiwara) Compiled by "New Lymphocyte Function Retrieval Method", Chugai Medical Co., Ltd. (1987), New Chemistry Laboratory Course 12 "Molecular Immunology I", Tokyo Chemical Dojin U989)).
  • HLA-A * 1101 expressing Tm-EBV transformed cells (l xlO 5) the saline at 1 00 ⁇ Ci of Na 2 51 Cr0 4 and 60 minutes at 37 ° C for Inkyube one Chillon then 10% The cells were washed three times with RPMI1640 culture solution containing FCS to obtain labeled target cells. Next, to each well of a 96-well plate, 5 ⁇ 10 3 labeled target cells suspended in a 50-1 culture medium were added.
  • cytotoxic activity specific relative lysis rate, ie relative percentage of specific cell lysis
  • the minimum release value is the spontaneous release value of 51 Cr from the target cells as measured in a gel containing only the target cells, and the maximum release value is obtained by adding the detergent TritonX-100 to the target cells. It shows the label release value when cells were disrupted.
  • SF2-Pol424-9 SEQ ID NO: 1
  • SF2-Env202-9 SEQ ID NO: 2
  • a recombinant vaccinia virus having a gag / pol gene or an env gene of an HIV- lsf-2 isolate was prepared according to the description in the literature (Virology, ⁇ 75, 139, (1990)).
  • the cells were cultured with the recombinant virus or wild-type virus at 10 plaque forming units per cell and infected with the recombinant vaccinia virus.
  • the resulting cells should present the internally processed HIV gene product fragment on the cell surface in a form associated with the HLA antigen molecule.
  • two peptide-specific CTL clones, SF-2-Pol424-9 and SF2-Env202-9 were isolated from peptide-specific bulk cultures from HIV-infected patients, respectively.
  • CTL attachment was performed according to the method described in Example 3-2. Briefly, when using the infected cells (1 x10 s) was incubated with Na 2 51 Cr0 4 of 100 ⁇ Ci in saline (C 1R-A * 1101 cells or RMA-SA * 1101 cells 26 At 90 ° C. for 90 minutes), and then washed three times with RPMI1640 culture solution containing 10% NCS to obtain labeled target cells. Next, 5 ⁇ 10 3 labeled target cells suspended in a 50 ⁇ 1 culture medium were added to each well of a 96-well plate.
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • HLA-A * 1101-restricted HIV-1-specific CTLs Pol313-321 (AIFQSSMTK) (J. Immunol 1997, 159: 1648-1657) and Pol496-505 (HIV Sequence Database, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, 1997) Together; cultured for l week. This was used as effector cells, and CTL activity was measured using C1R-A * ll01 and C1R cells pulsed with the corresponding peptide as target cells. Table 1 shows the results.
  • Relative cell lysis rate (%) Relative cell lysis rate (%) obtained by subtracting lysis without peptide from lysis of HLA-A * 1101-positive Tm EBV transformed cells pulsed with peptide (1 M) ).
  • Pol 675-9- 5E is 5 of 7 people
  • Pol 675-9-5K8E is 2 of 6 people
  • Nef84-9-2F 6F is 6 of 7 people
  • Gag 349-11-9 S Was able to induce specific CTL in 3 out of 7
  • Nef 84-9-2L in 3 out of 5 persons.
  • These subtype E-derived peptides cannot be recognized by the corresponding subtype B-specific CTLs, and these subtype E specific CTLs do not recognize the corresponding subtype B peptides. It is a subtype E-specific Web.
  • Nef 84-9 (AVDLSHFLK) (J.
  • Relative cell lysis rate (%) Relative cell lysis rate (%) obtained by subtracting the lysis rate without peptide from the lysis rate of HLA-A * 1101-positive TmEBV-transformed cells pulsed with peptide (1).
  • the ratio of 1: 1: target cells was 40: 1.
  • V Relative cell lysis rate (%) obtained by subtracting the lysis rate in the absence of peptide from the lysis rate of transformed cells.
  • the effector: target cell ratio was 40: 1.
  • the present invention provides seven new epitopes of the HIV-1 protein and provides a powerful further step for vaccine development to induce HLA-A11 restricted CTL.
  • the peptide of the present invention can induce HIV-1 protein-specific CTL restricted by HLA-All, which is commonly found in Asians, especially Japanese, so that it will be the basis of AIDS research in Asia and HIV-1 vaccine development. Provide a very important means for

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Description

明細書
HIV特異的 CTLを誘導し得るぺプチド及び
該ぺプチドを含む抗 AIDS予防 ·治療剤 発明の背景
本発明は、 ヒト免疫不全ウィルス （Human Immunodeficiency Virus, 以下 「HI V」 と略称する） タンパクの一部領域のアミノ酸配列をもち、 HIVに対する免疫応 答を誘導できるぺプチド及び該ぺプチドを含む抗 AIDS予防 ·治療剤に関する。 後天的免疫不全症候群 （以下 「AIDS」 と略称する） は HIVの感染によって生じ る病気である。 二 .0疾患を治療する薬剤の研究は活発に行われており、 アジドチ ミジン （以下 「AZT」 と略称する） 、 ジデォキシイノシン （以下 「DDI」 と略称す る） などの薬剤が実用に用いられているが、 効果や副作用の点で問題があり、 HI Vの感染によって生じる病気を完全に治療することができる薬剤は未だに発見さ れておらず、 その見通しも立っていない。 一方、 HIV感染予防と AIDS発症の抑制 手段として HIVに対する免疫抵抗力を増強させるワクチンもこの病気の急速な世 界的広がりを抑制できる切り札として期待され広く研究が進められている。 現在 までに種々のタイプのワクチンが考案され、一部のものは臨床試験に入つている。 これまでに報告されているワクチンとしては以下のようなものが代表的である。 i ) 不活化または弱毒化ウィルス粒子を用いるワクチン： HIVの病原性に関与 する遺伝子を変異欠損させる方法（Pro Natl . Acad. Sci . USA, 84, 1434, ( 1987) )、 HIVと共通抗原性を持つサルなどの類縁ウィルスを用いるアプローチ（S cience,232, 238，（ 1987 ) )が考えられるが、潜在的危険性から容易には実用化でき ない。
ii ) ウィルスの一部の抗原タンパクを用いるサブュニッ 卜ワクチン ： ウィルス粒 子のうちの一部の抗原性夕ンパクのみを遺伝子組換え法などで生産し免疫原とし て用いるというアプローチ（Proc. Natl . Acad. Sci. USA, 84, 6924, ( 1987)、 An n. Int. Med. , 114, 119, ( 1991 ), Nature, ^，728, ( 1992) )。最も広く試みられて おり、 臨床試験例も多い。 しかしながら中和抗体価が上がらなかったり、 抗体価 の持続性など克服すベき問題点が多い。 またこのアプローチでは抗体産生など体 液性免疫の増強には効果があると考えられるが、 感染細胞を殺す細胞性免疫の活 性化にはつながりにくく、 HIVの感染様式から考えてこのアプローチのみの感染 予防への効果は必ずしも期待できない。
iii )ワクシニアウィルスや BCG菌などの組換え生ワクチン： ヒ卜の細胞内で増殖 可能なワクシニアウィルス（Nature, ， 728，（1988) )や BCG菌 (Nature, 351,479, ( 1991 ) )の遺伝子に HIV由来の一部遺伝子配列を組み込み発現させる方法で、理論 的には細胞性免疫増強効果が期待できる。 しかし、 免疫力の低下した患者では通 常無害なワクシニアウィルスなどでも重篤な感染がおこったりする可能性 (Lane et 337, 1034, ( 1991 )) と、 少なくとも今までに作られたワクシニアの組換え生ヮ クチンでは充分な免疫応答を起こしていない等の問題がある。
iv)抗ィディォ夕ィプ抗体：ウィルス抗原のかわりに抗ィディォタイプ抗体を免疫 原として用いる方法 (Proc. Natl. Acad. Sci . USA, ^，254ϋ，（ 1992) )が報告され ている。
V )合成べプチドワクチン ：中和抗体の決定領域のぺプチド配列を化学合成したも のなどが検討されている。
上に述べたこれらのワクチンは主として中和抗体を誘導する液性免疫増強型の ものであるが、 Η IVがフリーのウィルス粒子としてよりも感染細胞と非感染細胞 との融合によって伝播しやすいということから中和抗体による液性免疫よりも感 染細胞を障害する細胞障害性 Τ細胞 (以下「CTL」と省略する）による細胞免疫が感 染防御に重要と考えられる。 実際、 HIV感染の機会にさらされながら感染が成立 しなかった患者について調べてみると、 H IV特異的 CTLが検出されることが報告 されている（J Clin. Invest., 93, 1293,(1994), Nature, Med., 1, 59， (199 5))oまた、変異型 CTLェピトープを有する HIVは CTLの攻撃から逃れることが報 告されており（Nature Med.， 3, 205, (1997))、 HIVに慢性感染した患者が AIDSを 発症するのはそのような変異型ェピトープを有する HIVが出現してくることによ るものとされている（Nature Med.， 3, 212, (1997))。従って、早期の CTL誘導が 感染予防に重要である。
ウィルス由来夕ンパク質などの抗原は細胞内部で短いベプチド断片にプロセッ シングされ、 主要組織適合性抗原複合体（以下「MHC」 と略称する） と結合した形 で細胞表面に提示される。 CTLは細胞表面に発現されるクラス IMHC抗原によって 抗原提示されたェビ卜一プぺプチドを認識して標的細胞を攻撃する。 より詳しく は、 CTLは標的細胞上の MHC分子の溝に結合したプロッセシングされた抗原断片 と MHC分子の一部を同時に認識してこれを有する細胞を攻撃する。 すなわち、 CT Lの抗原認識は細胞表面上の MHCに強く依存しており、 このような抗原認識を MH C拘束と呼ぶ。 特定の MHCクラス ; [抗原に結合して 提示されるェビ卜一プぺ プチドは 9アミノ酸長程度のぺプチドであってそのアミノ酸配列には一定の法則 性（モチーフ）があることが知られている （Nature, 351,290,(1991), Eur. J. Im munol., 22, 2453, (1992), Nature, 353, 326, (1991 ) Nature, 360,434,(1992), Im munogenetics, 38,161,(1993))。
本発明者等はこれらの知見を基に HIV- 1が感染した細胞を特異的に障害する CT Lペプチドを探索し、ヒ卜のクラス IMHCであるクラス Iヒト白血球 i¾ (以下「H LAj と略称する） のうち HLA- B35、 HLA-B5K HLA- A31に結合して HIV-1特異的 CT Lを誘導し得るペプチドを明らかにしている （W095/11255) 。 これらのペプチド は、 それぞれの HLAァロ抗原夕ィプ拘束性の HIV- 1特異的 CTLを誘導した。
HLA遺伝子は極めて多型性に富む遺伝子であるため、 HLAクラス I抗原に結合す るペプチドも、 一定の法則性に従うものの、 多型性に富むものである。 このこと は、 HIV感染の予防 ·治療に効果を有するぺプチドがその効力に関して個体間、 民族集団間などで相違する可能性を示唆する。 従って、 このようなペプチドを利 用した HIV感染の予防 ·治療においては、 既に得られているべプチド群の他に、 更に他の HLA拘束性の CTLを誘導し得るぺプチドセヅ卜が望まれている。 発明の開示
本発明は HIV- 1に対する特異的 CTLを誘導できるぺプチドを提供することを目 的とする。特に HLA- A*1101拘束性の HIV- 1特異的 CTLを誘導するべプチドを提供 することを目的とする。
また、 本発明は上記べプチドをコードする DNAを提供することを目的とする。 更に本発明は上記べプチドを含む抗 AIDS予防'治療剤を提供することを目的と する。
本発明はまた HIV- 1ワクチン開発、 特にアジアにおけるワクチン開発に有用な ぺプチドを提供することも目的とする。 HIVワクチン開発の大きな問題点は HIV が容易に変異を起こして宿主免疫を逃れる点にある。 すなわち、 免疫原として一 つのェピトープのみを担ったワクチンはやがて効力を失う可能性が大である。 本 発明は、 同時に使用し得る、 免疫原として有効な複数のェピトープペプチドを提 供することを目的とする。
本発明のペプチドは、 HLA- A*1101クラス I抗原に結合し、 HIV- 1感染細胞を 標的とする HLA- A*1101拘束性 CTLを誘導し得るぺプチドである。また、本発明の DNAは前記べプチドをコ一ドする DNAである。
本発明者等は、 すでに述べたように HLA- B*3501、 HLA- B*5101、 HLA-A*3101クラ ス I抗原に結合し得るぺプチドをこれまでに明らかにした（W095/11255 )。 HLAは 民族あるいは個体間で極めて多型性に富む分子であるが、 本発明のぺプチドはい ずれもアジア人、 特に日本人に多い HLA-A11分子 (HLA-A*1101 ) (Clayton J， Lonj on C， Whittle D : Allele and haplotype frequencies for HLA loci in variou s ethnic group: HLA volume I Genetic diversity of HLA functional and med ical impl ication: Charron D. Paris編集： EDK Medical and Scientific Inter national Publisher; 1997; 665- 820)に結合し得る HIV- 1 Polまたは Env由来のぺ プチドであることを特徴とする。 本発明のぺプチドおよび本発明の DNAによって コードされるペプチドは、 HIV- 1 Polタンパク質または Envタンパク質の断片で あって、 アミノ酸配列 QIYAGIKVK (配列番号 1 )、 SVITQACPK (配列番号 2 )、 QI IEELIKK (配列番号 3 )、 QI IEKLIEK (配列番号 4 )、 ACQGVGGPSHK (配列番号 5 )、 AFDLSFFLK (配列番号 6 ) および、 ALDLSHFLK (配列番号 7 ) 、 のいずれかを有し、 HLA-A*1101結 '.チーフを有し、 実際に HLA- A*1101に結合し、 かつ、 HIV-1感染 細胞に対する HLA- A*1101拘束特異的 CTLを誘導し得るぺプチドである。 図面の簡単な説明 図 1は、 HLA-A*1101拘束 HIV- 1特異的 CTLェピトープの CTLクローンによる認 識の程度を示したものである。図中、 黒塗り記号は C1R- A*1101細胞を、 白抜き記 号は C1R細胞を表す。 デ一夕はエフェクター：標的 = 2 ： 1のものである。 各べ プチドに関してそれぞれ 2系統ずつ CTLクローンを用いた。秦及び〇は SF2-Pol4 24-9-27CTLクローンを表す。▲および は SF2- Pol424- 9- 34 CTLクローンを表す。 図 2は HIV-1の Polタンパク質を発現している組換えワクシニアウィルスに感 染させた標的細胞に対する CTL活性を示したものである。 斜線棒グラフは HIV-1 の Polタンパク質を発現している組換えワクシニアウィルスに感染した C1R-A*11 01に対する特異的溶解のパーセントを示す。白抜きの棒グラフは野生型ヮクシ二 ァウィルスに感染した C1R-A*1101に対する特異的細胞溶解のパーセントを示す。 図 3は、 HI V-1の Envタンパク質を発現している組換えワクシニアウィルスに 感染させた標的細胞に対する CTL活性を示したものである。 図 3 Aおよび図 3 B において棒グラフは上から、 それぞれ、 Envタンパク質を発現しているワクシニ ァウィルスに感染した C1R-A*1101、 野生型ワクシニアウィルスに感染した C1R-A *1101、 Envタンパク質を発現しているワクシニアウィルスに感染した C1R、 野生 型ワクシニアウイルスに感染した C1 SF2-Env202-9でパルスした C1R- A*1101、 SF2-Env202-9でパルスした C1Rに対する特異的細胞溶解のパ一セントを表す。ぺ プチド濃度は 10— とした。 発明を実施するための最良の形態
HIVの全タンパク質は、 例えば、 Nature Vol .313, p277-283( 1985 ) や Proc. N atl . , Acad. Sc i . USA Vol . 83, p2209- 2213( 1986 ) などに記載されている。本発 明のペプチドは、 HIVタンパク質の断片であって、 さらに、 HLA- A*1101結合モチ —フを有し、 実際に HLAに結合する。 ここで、 HLA- A*1101結合モチーフとしては 8〜12個のアミノ酸からなり、 2番目のアミノ酸が Val、 Ile、 Thr、 Leu、 Tyr、 C ysまたは Pheから選ばれるァミノ酸であり、 C-末端ァミノ酸が Lysであるべプチ ドが挙げられる。 このようなぺプチドはべプチド合成機なしによつて合成するこ とができる。 HLA-A*1101結合モチーフを有する本発明のぺプチドが実際に HLA - A *1101に結合することは HLA- A*1101を発現している細胞を用いて確認することが できる。 このような細胞としては、 HLA- A*1101を発現している C1R細胞または R MA-S細胞を利用することができる。
本発明においては、合成した HIV- 1 由来べプチドが実際に患者の末梢血リンパ 球 (PBL )を刺激して細胞障害性 T細胞 （CTL) を誘導し得ることが確認される。 こ のような方法で、 上記 HIV- 1 Polタンパク質の断片であって、 アミノ酸配列 QIYA GIKVK (配列番号 1 ) 、 SVITQACPK (配列番号 2 ) 、 QI IEELIKK (配列番号 3 ) 、 Q I IEKLIEK (配列番号 4 )、 ACQGVGGPSHK (配列番号 5 ) 、 AFDLSFFLK (配列番号 6 ) および、 ALDLSHFLK (配列番号 7 ) を有するペプチドが得られた。本発明のぺプチ ドはペプチド合成機によって合成することもでき、 あるいは、 例えば配列番号 1 〜 7のいずれかのアミノ酸配列を有するぺプチドをコ一ドする DNAを適切なべク 夕一-宿主細胞系で発現させることによって調製することもできる。この場合、使 用する宿主細胞によりコドン使用頻度が異なることがあるため、 各細胞において 好まれるコドンを使用することができる。 また、 そのような DNAにストリンジェ ントな条件でハイブリダイズし、 HLA-A11 ί¾Ρ分子に結合して HIV感染細胞を標 的とする細胞障害性 Τ細胞を誘導し得るぺプチドをコ一ドする DNAも利用するこ とができる。 ここでストリンジェン卜な条件とは、 例えば温度および塩濃度につ いて言えば、融解温度 Tin (¾=81.5 + 10 [ +]+0.41 (6+(含量％)—（600/塩基 長）） よりも 20~25°C低い温度、 2 x SSC (20xSSC :水 1 L中 NaC175.3g、 クェン酸 ナトリウム 88.2g、 pH7.0) でァニーリングを行い、 Tmよりも 12〜20°C低い温度、 0. lxSSCの塩濃度で洗浄を行うような場合を言う。
このような組換え DNA技術を用いた DNA断片の単離、 ベクターの構築、 形質転 換方法、 ペプチドの製造法、 および CTL活性の測定法等は当業者によく知られた ものである。
本発明のぺプチドは T細胞ェピトープとして HIV- 1特異的 CTLを誘導すること ができるので、 ワクチンとして非常に有用である。 ワクチンとしては、 ペプチド 溶液をそのまま、 あるいは生理的に共存できる補助剤と共に注射器で投与しても よく、 噴霧などにより粘膜からの経皮的吸収などで投与してもよい。 投与は 1回 0. 1mg〜100mgで 1回または複数回繰り返して行うことができる。 また、 複数のぺ プチドを同時に用いてもよく、 単一のぺプチドを使用するよりも効果的である場 合がある。 製剤としては凍結乾燥し、 あるいは糖などの賦形剤を加えて顆粒等に してもよく、 特に制限されない。 このようにして調製された本ペプチド製剤は、 問題となる重篤な急性毒性は認められない。 ワクチンに添加して免疫原性を高める補助剤としては BCG菌などの菌体成分、 Moreinらにより開発された QuillAという樹皮から抽出した ISCOM (Immunosti mulating complex) (Nature, 308,457,(1984), Nature, 344,873,(1990)) 、 サ ポニン系の QS- 21 (J. Iimunol.,1 8,1438,(1992)), リボソーム （ I腿 unol.， 8,1585,(1992)) 、 水酸化アルミニウム （ァラム） 、 KLH (キーホールリンぺッ卜 へモシァニン） （J. Virol., 65,489, (1991))などが利用できる。 このような方法 で生体内に CTLなどの免疫応答を誘導できることは上記のそれぞれの先行文献や Science, 255,333,(1992) などにも述べられている。
患者から採取した細胞または同ハプロタイプの HLAクラス I抗原をもつ細胞に 試験管内で当該ェピト一プぺプチドを与えて抗原提示させたのち患者血管中に投 与して患者体内で効果的に CTLを誘導させる方法、 あるいは患者末梢血リンパ球 に同べプチドを加えて試験管内で培養し、 試験管内で CTLを誘導増殖させたのち 患者にもどす方法も、 本発明のェビトープペプチドを使うことにより有効に適用 することができる。 従って、 配列番号 1から 7のうちいずれかのアミノ酸配列を 有するぺプチド存在下で HLA- A*1101抗原を有する末梢血リンパ球を培養して得 られる CTLを抗 AIDSワクチンとして用いることもできる。
実際には患者末梢血リンパ球 107 から 109個に本発明のぺプチド O.Olm から 1 m を加えて数時間から 1日培養した後患者静脈中に投与するか、あるいはさらに 組換えィン夕一ロイキン 2を 50U/mlと当該べプチド 1〃g/mlを加えた培養液で 数週間培地交換しながら培養を継続して試験管内で CTLを誘導してから患者静脈 より注入する。 培養の方法は当業者間でよく知られている通常の方法でよく、 培 養後は遠心分離等で培地成分を洗浄した後、 生理食塩水等に培養細胞を懸濁して 投与する。 このような細胞注入による治療はすでに癌治療法として実施されてお り、 当業者間ではよく知られている方法である （New Eng. J . Med., 313,4185,(1 985)、 Science,233, 1318, (1986)) 。 また本発明で明らかにされた CTLェピトープはワクシニアウィルスや BCG菌 組換え生ワクチンなどでも有効に活用できる。 すなわちこれらの組換え生ワクチ ンにおいて発現させる組換え抗原夕ンパク遺伝子中に配列番号 1から 7のうちい ずれかのアミノ酸配列を有するペプチドをコードする D N Aを組み込んでおけば、 該ぺプチド配列が抗原タンパクの一部として発現したのち細胞内でプロセスされ て HLA- A*l 101抗原により提示され、これを認識する CTLを誘導することができる c BCG菌における外来遺伝子の発現方法は国際特許公開 W088/06626に詳しい。 BCG 菌組換え生ワクチンについては J. Exp. Med.，1^, 197, ( 1993 )に詳しい。 投与量、 投与方法は通常の種痘や BCGワクチンに準じて行うことができる。 急性毒性等も 通常の種痘や BCG ノクチンと変わるところはない。 ただしワクシニアウィルスの 場合 AIDSが発症し、免疫能が低下している患者には重篤感染の危険性があり、治 療用ワクチンとしては慎重に行う必要がある。 BCGワクチンについてはこのよう な事例はまだない。 このような方法で生体に CTLなどの免疫応答を誘導できるこ とは Nature, ^，728，（1988)や Nature, ^1, 479, ( 1991 ) などに示されている。 実施例 1 . HLA-A*1101発現細胞の調製
HLA-A*1101を発現している C1R細胞 (C1R- A*1101 )および HLA- A*1101を発現し ている匪- S細胞 (RMA- S- A*1101 )は, 文献記載の方法 (Tissue Antigens, 52, 50 1-509, ( 1998) )に従って調製した。 ここで、 RMA- S細胞および C1R細胞はトラン スポーター分子 TAP (Transporter Associated Protein) に欠陥のある、 それぞ れマウス細胞株およびヒト細胞株である （Nature, ^,476, ( 1990) )。 C1R細胞お よび A- S細胞は 10%FCSを添加した RPMI1640培地で培養した。 C1R- A*1101細 胞ぉよび脆- S- A*l 101細胞は 10 %FCSおよび 0 · 15mg/mlのハイグロマイシン Bを 含む RPMI1640培地で培養した。 ェプスタイン-バールウィルスで形質転換した細 胞株 Tm-EBV(HLA-All/A24, B52/B52, Cw7/Cw*1202 )は 10%FCSを添加した RPMI16 40中で維持した。
特に断らない限り、 遺伝子のクローニング、 細胞の形質転換等は、 分子生物学 の分野で一般的な手法に従って行った（Sambrook, J.ら、 Molecular Cloning: A Laboratory Manual , 2nd ed. ( 1989)、 Ausubel, F. M. 、 Current protocols i n molecular bio丄 ogy、 John Wiley & Sons, Inc. )0 実施例 2 . HLA-A*1101結合 HIV- 1- SF2株由来べプチドの推定
2 - 1 . ぺプチドの合成
ペプチドはマルチペプチド合成機（島津モデル PSSM- 8、 島津製作所） を用いて 合成し、 質量分光法によりその配列を確認した。以下の実施例においては 90%以 上の純度のぺプチドを使用した。
2 - 2 . ぺプチドの HLA-A*1101分子への結合能
HIV-1由来べプチドの HLA- A*1101分子への結合能を文献に記載されているよう に（Tissue Antigens, 52, 501-509, ( 1998) )ペプチド安定化アツセィによって調 ベた。
以下にぺプチド安定化アツセィ法を簡単に説明する。
EMA-S細胞および C1R細胞はトランスポー夕一分子 TAP (Transporter Associa ted Protein)に欠陥のある、 それぞれマウス細胞株およびヒト細胞株である。 こ のため、 37°Cで培養した時には低レベルでしか細胞表面上に MHCクラス I抗原が 発現しない。 しかし低温 （26°C) で培養するとペプチドと結合していないクラス I抗原が高レベルで細胞表面上に発現することが知られている （Nature, 346,47 6, (1990) ) 。
RMA-S-A*1101細胞および C1R- A*1101細胞でも同様に HLA- A*1101抗原は 26°Cで 培養した時には高レベルで細胞表面上に発現するが、 37°Cで培養するとその発現 は低下する。また 26°Cで培養しておいた RMA- S-A*1101細胞または C1R- A*1101細 胞上の HLA- A*1101抗原の発現は 37°Cに 3時間おくことにより、 37°Cで培養した 場合と同じに発現量は低くなる。 しかしながらぺプチドが結合していない HLA-A* 1101 l¾gに外から加えたぺプチドが結合すると、 ぺプチドの結合した HLA-A*110 1抗原は 37°Cにおいても消失せず高発現量が保たれる。 これを利用してべプチド の HLA-A*1101抗原に対する結合性を測定した。 実際には 26°Cで培養した EMA-S - A*1101または C1R- A*1101細胞に合成したぺプチドを加えて 26°Cで 1時間、 その 後 37°Cで 3時間置いた後、 抗 HLA- Α*Π01モノクローナル抗体を用いてフローサ ィ トメトリーによって HLA-A*1101の細胞表面の発現レベルを測定することによ つてべプチドの結合性を測定した。抗 HLA- A*1101モノクローナル抗体としては、 HLA-A抗原を認識する入手可能なモノクローナル抗体を使用したが、 New York Me dical Col legeの Dr. Soldano Ferroneから供与された TP25. 99抗体または B40. 5抗体 (ATCC HB- 116)を主として使用した。
その結果、合成した 92種のぺプチドのうち 61種が HLA- A*1101抗原分子に結合 した。 この 61種のぺプチドについて更に HLA- A*1101拘束性 CTL誘導活性を調べ た。 実施例 3 . HLA-A*11Q1結合べプチドを用いた HIV- 1感染患者からの CTLの誘導と、 その細胞障害性活性
実施例 2で得られた HLA- A*1101結合べプチドを用いて HIV- 1感染患者から CTL を誘導し、 その細胞障害性活性を調べた。
3 - 1 . CTLの誘導
HLA-A*1101を有する HIV- 1セロポジティブ患者 IU(HLA-A11/A24、 B38/B51, C 7/- )および K0G(HLA- A2/A11、 B46/B54, CI/- )からの末梢血リンパ球を単離した。 末梢血リンパ球の分離は通常の Ficol l- Conray 比重遠心法（矢田純一、 藤原道夫 編著、 「新リンパ球機能検索法」、 中外医学社 ( 1987)、 新生化学実験講座 12「分 子免疫学 I」東京化学同人 U989)) によった。 すなわちへパリン加注射器で採血 後、 生理食塩水で希釈し、 Ficoll- Paque分離液 （Pharmacia社） 上に重層後 400 X g、 30分室温で遠心した。 中間層のリンパ球画分をピペットで回収、 洗浄して 以下に用いた。 24穴培養プレー卜の各 wellに 2 x 106個のリンパ球を入れさら に組換えヒト IL- 2および合成べプチドの最終濃度がそれぞれ 50U/mlおよび 10—6 Mになるように調製した RPMI 1640( 10% F C Sを含む）培養液で培養する。 2日〜 3日おきに、 50U/ml濃度の組換えヒト IL- 2を添加した RPMI1640培養液を半量 かえた。
3 - 2 . HLA-A*11Q1結合ぺププチドを用いて誘導された CTLによる特異的細胞障 害活性の測定 （CTLアツセィ）
まず、バルクの培養物を、 PHAで刺激したのち放射線照射した自己リンパ球（ 1 xlO6) および 10— の HLA- A*1101結合べプチドをそれぞれ加えることによって 1 週間ごとに再刺激して特異的 CTL細胞を増殖させた。 このようにして 2〜3回リ ンパ球バルク培養物を再刺激した後、 予め対応するペプチドでパルスした、 HLA - A*1101を発現している Tm- EBV形質転換細胞に対するそれぞれの培養物中の CTL 活性を測定した。 CTLアツセィは以下のように行った。
HLA-A*1101を発現している Tm- EBV形質転換細胞（ l xlO5) を生理食塩水中で 1 00〃Ciの Na2 51Cr04 と 37°Cで 60分間ィンキュベ一シヨンしその後 10%FCSを含 む RPMI1640培養液で 3回洗浄し標識標的細胞とした。 次に、 96穴プレー卜の各 ゥエルに 50〃1の培養液中に浮遊させた 5 x 103個の標識標的細胞を加えた。 さ らに 4 X 10—6Mから 4 lO—^Mに希釈したそれぞれの HLA- A*1101結合ぺプチドの 溶液を 50 1加え 37°Cにて 30分間、 C 02 インキュベータ一に放置した後、 同 じべプチドで刺激して培養した患者末梢リンパ球をエフェクター細胞として、 ェ フエクタ一：標的細胞比 (E:T) = 2 ： 1となるように （100〃1の培養液に浮遊さ せる） 加え、 37°Cの C 02インキュベータ一に 4時間放置した。
その後各ゥエルの半量の培養液 （100// 1) をとり、 ガンマ一カウン夕一にて培 養した患者末梢リンノ 求の細胞障害活性によつて標的細胞から遊離された 51Crを 測定した。標的細胞に対する CTLクローンの細胞障害性活性（特異的相対溶解率、 すなわち特異的な細胞溶解の相対的割合） を次のとおり計算した。
特異的相対藝率 ^ ^ ! ¾^^^ X 1 0 0
最大遊離値-最小遊離値
( I ) ただし、 最小遊離値は標的細胞のみ入っているゥエルの測定値で標的細胞から の51 Crの自然遊離値を意味し、 最大遊離値は標的細胞に界面活性剤 TritonX- 100 を加えて細胞を破壊した際の標識遊離値を示している。
この結果、 HLA-A*1101特異的 CTLを誘導し得る 2つの新たなぺプチド SF2-Pol 424-9 (配列番号 1 ) および SF2- Env202- 9(配列番号 2 )が 2人の患者の少なくと も 1方から得られた （図 1および図 3 ) 。
実施例 4 . HLA- A*1101結合べプチドの CTLェピトープとしての同定
本発明の 2種のぺプチド SF2- Pol424-9 (配列番号 1 ) および SF2- Env202-9(配 列番号 2 )が確かに HIV夕ンパク質の内部プロッセシングされて HLA- A*1101分子 によって提示されるべプチドであることを、単離した特異的 CTLクローンおよび、 標的細胞として組換えワクシニアウィルスに感染させた細胞を使用することによ つて確かめた。
まず、 HIV- lsf-2分離株の gag/pol遺伝子または env遺伝子を有する組換えワク シニアウィルスを文献の記載（Virology, Γ75, 139, ( 1990))に従って作製した 次に、細胞あたり 10プラーク形成ュニッ卜の組換えウィルスまたは野生型ウィル スと共にー晚培養してこの組換えワクシニアウイルスに感染させた。 得られた細 胞は、 細胞表面上に内部プロセッシングされた HIV遺伝子産物断片を HLA抗原分 子と結合した形態で提示しているはずである。 一方、 SF-2- Pol424- 9および SF2 - Env202- 9の 2種のぺプチドに特異的な CTLクローンを、それぞれ HIV感染患者に 由来するべプチド特異的バルク培養物から単離した。
前述のようにして得られたワクシニアウィルス感染細胞を標的細胞として、 実 施例 3— 2に記載した方法に準じて CTLアツセィを行った。 簡単に言えば、 感染 細胞（ 1 x10s)を生理食塩水中で 100〃Ciの Na2 51Cr04 とインキュベーションし（C 1R-A*1101細胞または RMA-S-A*1101細胞を使用する場合は 26°Cにて 90分間） 、 その後 10%NCSを含む RPMI1640培養液で 3回洗浄し標識標的細胞とした。次に、 96穴プレー卜の各ゥヱルに 50〃1の培養液中に浮遊させた 5 x 103個の標識標的 細胞を加えた。さらに 4 X 10— から 4 X 10— "Mに希釈したそれぞれの HLA- A*110 1結合ペプチドの溶液を 50〃1加え 37°Cにて 30分間、 C 02 インキュベータ一に 放置した後、 前述のようにして単離した HIV- 1 Polまたは Env特異的 CTLクロ一 ンをエフェクター細胞として、 エフェクター：標的細胞比（::::： 1') = 1 ： 1〜4 ： 1 となるように （100〃1の培養液中に浮遊） 加え、 37°Cの C 02インキュべ一夕一 に 4時間放置した。 その後各穴の半量の培養液 （100〃 1) をとり、 ガンマ一カウ ン夕一にて培養患者末梢リンパ球の細胞障害活性によって標的細胞から遊離され た51 Crを測定した。 各ペプチドに対して 2系統ずつ CTLクローンをテストし、 標 的細胞に対する CTLクローンの細胞障害性活性を上述の式（I )によって計算した。 すべての CTLクローンは、対応するぺプチドでパルスされた C1R-A*1101に対し て細胞障害活性を示した （図 1および図 3、 エフヱクタ一：標的 = 2 ： 1 ) 。 一 方、 種々のエフェクター：標的比において、 これらの CTLクローンはいずれの場 合も HIV- 1 Polタンパク質または Envタンパク質を発現している組換えワクシニ ァウィルスに感染した C1R-A*1101細胞を殺すことができたが、野生型ワクシニア ウィルスに感染した細胞を殺さなかった （図 2および図 3 ) 。 これらのデ一夕は 本発明の 2種のぺプチド SF2- P01424-9および SF2- Env209-2が HIV- 1特異的な HL A-A*1101拘束性 CTLェピトープを含むことを示すものである。 実施例 5 . 各ェピトープの HIV- 1感染患者における共通性および特異的 CTL誘導 能の比較
HLA-A*1101を有する HIV-1感染患者において本発明のェピトープ SF2- Pol424- 9 (配列番号 1 )、 および既知の 2種のェピト一プが一般的かつ強く提示されてい るかどうかを調べるために、 HLA- A*1101を有する 6人の HIV- 1セロポジティブ患 者からの末梢血単核細胞 (PBMC)を本発明のぺプチドおよび HLA- A*1101拘束 HIV-1 特異的 CTLェピ卜ープであるとして報告されている Pol313- 321(AIFQSSMTK)( J. I mmunol 1997, 159: 1648- 1657)および Pol496-505(HIV Sequence Database, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, 1997)と一緒に； l週間培養した。これ をエフェクター細胞として用い、対応するぺプチドでパルスしておいた C1R- A*ll 01および C1R細胞を標的細胞として、 CTL活性を測定した。 その結果を表 1に示 した。
SF2- Pol424-9、 Pol496-505に特異的な CTL活性は 6人の患者のうち 1人におい て誘導された。一方 Pol313- 321に対する CTL活性は 3人の患者において誘導され た。 これらの結果は、 Polェピトープは HIV- 1感染患者において個体差があるが、 HLA- All拘束 CTLの主要な標的分子の一つであることを示唆するものである。 表 1. HLA-Allを有する HIV- 1セロポジティブ患者からの末梢血リンパ球 (PBL : おける、 ぺプチドによる単一刺激による特異的 CTL誘導
I U TAK KOG
ぺプチド 配列 40:1* 5:1 40:1 5:1 40:1 5 :1
SF2-Pol424-9 QIYAGIKVK 27.4" 11.7 2.3 2.0 -0.2 3.1
Pol496-505 IYQEPFKNLK 8.00 4.6 12.9 3.0 -0.6 -2.9
Pol313-321 AIFQSSMT 53.5 26.8 0.7 1.1 13.6 3.7
Env77-85*tt DPNPQEVVL 2.5 1.5 0.5 0.0 0.2 -0.1
表 1. つづき
SKG S SK SZK
ぺプチド 配列 40:1 5:1 40:1 5:1 40:1 5:1
SF2-Pol424-9 QIYAGIKVK -3.7 -1.7 7.0 -3.3 4.9 -0.2
Pol496-505 IYQEPFKNLK 4.9 -2.8 5.1 3.2 2.5 2.6
Pol313-321 AIFQSSMTK 2.8 -3.7 -2.4 2.3 31.1 8.2
Env77-85*M DPNPQEVVL 1.7 -3.6 - 0.3 -2.8 -1.1 -0.4
* エフェクター：標的の比率
** 相対細胞溶解率 （％) ：ぺプチド（ 1 M)でパルスした HLA- A*1101陽性 Tm EBV形質転換細胞の溶解からぺプチドを共存させない場合の溶解を差し引い た相対細胞溶解率 （％) 。
*** ネガティブコントロ一ルのぺプチド 実施例 6HIV- 1サブ夕ィプ Eと HIV-1サブタイプ B由来のぺプチドの特異的 CTL誘 同様の方法で HIV- 1サブダイプ Eおよびサブタイプ B由来のェピトープぺプチド の探索を行い、 サブタイプ Eより Pol 675-9-5E(QIIEELIKK) (配列番号 3) ， Pol 675-9-5K8E (QIIEKLIEK) (配列番号 4)、 Gag 349-11 (ACQGVGGPSHK) (配列番 号 5) , Nef 84-9-2F6F (AFDLSFFLK) (配列番号 6) 、 サブタイプ Bより Nef 84-9 - 2L (ALDLSHFLK) (配列番号 7) をェピトープ候補として選抜した。 そこでこれ らのペプチドとそれぞれサブ夕ィプ Eおよびサブタィプ Bの HIV- 1に感染している 人の末梢血単核球を一緒に 1週間培養し、 これをエフェクター細胞として用い HL A-A*1101の陽性 EBV形質転換細胞を標的細胞として、 CTL活性を測定した。 その結 果を表 3、 表 4に示した。
Pol 675-9- 5Eは、 7人中 5人で、 Pol 675- 9-5K8Eは 6人中 2人で、 Nef84-9-2F 6Fは 7人中 6人で、 Gag 349-11-9 Sは 7人中 3人で、また Nef 84-9-2Lは 5人中 3 人で特異的な CTLが誘導できた。 これらのサブタイプ E由来のペプチドは、 対応す るサブ夕ィプ B特異的 CTLでは認識できず、 またこれらのサブ夕ィプ E特異的 CTLは 対応するサブタイプ Bぺプチドを認識しないことから、 サブ夕ィプ E特異的ェビト ープである。 また HLA- All陽性で HIV- 1サブタイプ Bに感染した 5人中、 Nef 84-9 (AVDLSHFLK) (J. Immunol 146： 1560-1565 1991 )では特異的 CTLが誘導できるが N ef 84-9- 2Lでは誘導できない人が 1人おり、その逆に Nef 84- 9-2Lでは誘導できる が、 Nef 84- 9ではできない人が 1名いる （表 4 ) ことから、 Nef 84-9- 2Lは Nef 8 4-9とは独立した Lェピトープと考えられた。 表 3 . HLA-A11を有する HIV- 1サブタイプ Eセロプジティブ患者からの末梢血単 核球 (PBMC) をペプチドで単一刺激培養後の 特異的 CTL誘導
HIV-1感染者
ぺプチド 配列 TT-005 TT-007 TT-008 TT-009
Pol 675-9-5E QI IEELIKK 3.4* 55. 1 23.4 63.8
Pol 675-9-5K8E QI IEKLIEK -4. 1 21.7 10.3 4.5
Nef 84-9-2F6F AFDLSFFLK -1.3 24.6 75.5 76.5
Gag 349-11-9S ACQGVGGPSHK 4.0 84.3 82.9 40.4
HIV- 1感染者
ぺプチド 配列 TU-002 TU-003 TU-007
Pol 675-9-5E QI IEELIKK 3.4 0.2 5.7
Pol 675-9-5K8E QI IEKLIEK 5.6 -5.6
Nef 84-9-2F6F AFDLSFFLK 15.4 41.2 64.2
Gag 349-11- 9S ACQGVGGPSHK 3. 9 -2.8 3.4 *相対細胞溶解率 （％) ：ベプチド （ 1 でパルスした HLA-A*1101陽性 TmEB V形質転換細胞の溶解率からペプチドを共存させない場合の溶解率を差し引いた 相対細胞溶解率 （％) 。 エフヱクタ一：標的細胞の比率は 40： 1でおこなった。
表 4 . HLA-A11を有する HIV-1サブタイプ Bセロプジティブ患者からの末梢血 単核球 (PBMC) をペプチドで単一刺激培養後の 特異的 CTL誘導
HIV- 1感染者
ペプチド 配列 KI-005 KI-015 KI-035 KI-030 KI-036 Nef 84-9 AVDLSHFLK 25.3* 68.6 5.8 6.6 16.5 Nef 84-9-2L _ALDLSHFLK 68.3 ― 6. 3 ― 16.4― 5.5 _ 50.4 _
*相対細胞溶解率 （％) ：ぺプチド （ 1〃M) でパルスした HLA- A*1101陽性 TmEB
V形質転換細胞の溶解率からぺプチドを共存させない場合の溶解率を差し引いた 相対細胞溶解率 （％) 。 エフヱクタ一：標的細胞の比率は 40： 1でおこなった。
本発明により、 HIV-1タンパク質の新たな 7つのェピトープが提供され、 HLA-A 11拘束性 CTLを誘導するワクチン開発のための強力な更なる 段が提供される。 本発明のぺプチドはアジア人、特に日本人に多く見られる HLA- Allに拘束される、 HIV-1タンパク質に特異的な CTLを誘導できるため、アジアにおける AIDS研究の 基礎および HIV- 1ワクチン開発のための極めて重要な手段を提供する。

Claims

請求の範囲
1 . 配列番号 1〜 7のいずれかのアミノ酸配列からなり、 HIV感染細胞を標的と する細胞障害性 T細胞誘導し得るぺプチド。
2 . 請求項 1に記載のぺプチドをコ一ドする DNA分子。
3 . 請求項 1に記載のぺプチド及び医薬的に許容される担体及び/又は希釈剤を 含む AIDS予防 ·治療剤。
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