CN102286075A - 乙肝病毒表面抗原的免疫显性hla-a*1101限制性ctl表位及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种乙肝病毒表面抗原的免疫显性HLA-A*1101限制性CTL表位，由以下氨基酸序列组成：Ser-Met-Tyr-Pro-Ser-Cys-Cys-Cys-Thr-Lys；其对于携带HLA-A*1101基因个体的外周血有很强的激发CTL应答的能力，从而为研制覆盖中国近三分之一的HLA-A*1101阳性人群的乙型肝炎治疗性多肽疫苗提供了新的候选核心序列。

Description

乙肝病毒表面抗原的免疫显性HLA-A*1101限制性CTL表位及其应用

技术领域

本发明属于医药生物领域，涉及一种抗原表位，特别涉及乙肝病毒表面抗原(HBsAg)的免疫显性HLA-A*1101限制性CTL(细胞毒性T淋巴细胞)表位。

背景技术

乙型肝炎(Hepatitis B)是由于感染了乙型肝炎病毒B(Hepatitis B virus, HBV)引起的一种严重危害人类健康的传染病。目前全球约有4亿HBV携带者，主要集中在发展中国家。在全球范围内，中国属高流行区，HBV携带者约占总人口的10%(1.2亿)，慢性肝炎患者约3000万。乙型肝炎多为围产期传播、青春期发病、青壮年恶化，因此其危害人群多为青壮年。大部分患者感染后通过自然病程痊愈，而部分患者迁延不愈并发展为肝硬化、肝癌。据估计，全球每年至少有50万慢性感染患者死于肝硬化和肝癌。乙型肝炎已成为我国最严重的公共健康问题之一。随着对体液保护性免疫的深入认识和预防性疫苗的使用，乙型肝炎的特异性预防问题基本得到解决，但乙型肝炎的特异性治疗至今一直未能突破。

目前已证实：(1)HBV作为一种嗜肝病毒，并不能直接引起肝细胞损伤，其感染的病理和临床后果取决于免疫机制；(2)作为细胞内感染，慢性持续性感染状态主要与机体抗感染细胞的免疫应答缺陷有关。其中，HBV特异性CTL反应决定了HBV感染的最终结果。感染HBV后，CTL活性高者体内病毒被清除而痊愈；CTL活性低或根本检测不到的感染者则发展为慢性持续感染状态，并进一步发展为肝硬化或/和肝癌。因此，在体启动HBV特异性CTL反应有望解决HBV慢性感染持续状态及其相关疾病的防治问题，对研制乙型肝炎和乙肝继发性肝硬化、肝癌的治疗性疫苗具有非常重要的意义。

既往研究发现，引起CTL免疫应答反应的并非完整的病毒抗原分子，而是抗原来源的特异性CTL表位。抗原提呈细胞将抗原加工处理成多肽片段，该多肽片段即为CTL表位，其与主要组织相容性复合体(MHC) I类分子结合形成多肽-MHC复合物(pMHC)，并最终将pMHC呈递到细胞表面供CD8⁺ T细胞表面的T细胞抗原受体(TCR)识别，从而活化CTL，引发CTL免疫应答反应。因此，在HBV相关抗原中鉴定出免疫显性CTL表位是慢性乙型肝炎免疫治疗的前提和基础。

CTL表位具有MHC I类分子限制性。既往研究发现的HBV相关抗原的免疫显性CTL表位多是HLA-A*0201限制性表位。例如，目前已经鉴定出HBcAg_18-27为HBcAg的HLA-A*0201限制性CTL表位，且该表位已应用于乙型肝炎治疗用多肽疫苗εPA44的设计研发中。εPA44摒弃了HBcAg中抑制免疫反应的不利因素并联合了有利于激发细胞免疫的化学基团，体内外实验证实，εPA44能够有效打破乙肝免疫耐受，重建针对HBcAg18-27的特异性CTL免疫功能，有效抑制和清除乙肝病毒。目前，εPA44已经顺利进入临床IIb期试验，但其局限性在于适用人群只能是HLA-A*0201个体。在我国，携带HLA-A*1101等位基因的人群占到了总人群的近三分之一，是仅次于HLA-A*0201的高频等位基因。但目前关于HBV来源的HLA-A*1101限制性CTL表位的研究目前很少。文献报道了一个HLA-A*1101限制性CTL表位HBcAg_88-96，是用弱酸及去污剂处理，抽提细胞膜上与HLA-A*1101分子结合的抗原肽，经HPLC分离、纯化及序列分析获得的。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种HBsAg的免疫显性HLA-A*1101限制性CTL表位，目的之二在于提供该CTL表位在制药方面的应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1．HBsAg的免疫显性HLA-A*1101限制性CTL表位，由以下氨基酸序列组成：Ser-Met- Tyr-Pro-Ser-Cys-Cys-Cys-Thr-Lys(SEQ ID No.1)，即HBsAg_295-304。

2．所述HBsAg的免疫显性HLA-A*1101限制性CTL表位在制备乙型肝炎治疗性多肽疫苗中的应用。

本发明的有益效果在于：本发明通过检测抗原特异性CTL增殖、细胞因子分泌以及特异性CTL频率检测金标准pentamer技术等，从有效激发特异性CTL应答的角度充分证实了HBsAg_295-304是一个免疫显性HLA-A*1101限制性CTL表位，其对于携带HLA-A*1101基因个体的外周血有很强的激发CTL应答的能力，从而为研制覆盖中国近三分之一的HLA-A*1101阳性人群的乙型肝炎治疗性多肽疫苗提供了新的候选核心序列，不仅如此，将其与HLA-A*0201限制性表位以及一些利于激发细胞应答的化学基团联合用于制备乙型肝炎治疗性多肽疫苗，还可以极大地拓宽疫苗的适用人群，有望覆盖我国四分之三以上的乙肝患者，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为具有代表性的HLA-A*1101纯合分型电泳图。

图2为Elispot法检测HBsAg_295-304诱导的特异性CTL分泌IFN-γ的能力。

图3为胞内因子染色检测HBsAg_295-304诱导的特异性CTL分泌IFN-γ的能力。

图4为CFSE标记检测HLA-A*1101阳性健康个体经HBsAg_295-304诱导刺激前后的特异性CTL增殖情况。

图5为肽-MHC五聚体技术(Pentamer)检测HLA-A*1101阳性健康个体经HBsAg_295-304诱导刺激前后的特异性CTL频率。

图6为Pentamer检测HBsAg_295-304在慢性乙型肝炎患者中的频率。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述。

一、多肽HBcAg _295-304 的合成、纯化及鉴定

多肽HBcAg_295-304委托上海生工生物工程技术服务有限公司采用标准Fmoc方案进行合成，合成多肽粗品采用高效液相色谱法进行纯化，纯化后的多肽经反相高效液相色谱法鉴定纯度为96.0%，经质谱法鉴定分子量与计算值一致，最后冷冻干燥，温度-70℃保存备用。

二、HLA-A*1101健康志愿者和慢性乙型肝炎患者的鉴定

分别取健康志愿者和慢性乙型肝炎患者外周血300μL，采用DNA提取试剂盒(TBG公司)获得浓度为30~60ng/μL的DNA 100μL，经检测其吸光度比值A₂₆₀/A₂₈₀为1.70~1.90，满足下一步实验要求；将所得DNA采用PCR-SSP低分试剂盒(Invitrogen公司)鉴定HLA型别。具有代表性的HLA-A*1101纯合分型电泳图如图1所示。

三、Elispot法检测HBcAg _295-304 诱导的特异性CTL分泌细胞因子IFN-γ的能力

采用密度梯度离心法从HLA-A*1101健康志愿者静脉血中分离外周血单个核细胞(PBMC)，用RPMI-1640培养基重悬，一部分调整细胞密度至1.0×10⁷/3mL，接种于6孔板；另一部分调整细胞密度至1.0×10⁶/mL，接种于48孔板。

将接种于6孔板的PBMC在温度37℃、CO₂气体体积分数为5%的条件下孵育1.5小时，移除非贴壁细胞(主要为淋巴细胞)，补充树突状细胞(DC)培养基2mL/孔，孵育1小时，移除非贴壁细胞，剩余贴壁细胞即为抗原递呈细胞DC，再补充DC培养基3mL/孔，并加入终浓度为800IU/mL的集落刺激因子(GM-CSF)和终浓度为1000IU/mL的白介素4(IL-4)，孵育3天，再补充DC培养基1.5mL/孔，并补充GM-CSF至终浓度为1600IU/mL、IL-4至终浓度为1000IU/mL，第6天重悬，调整细胞浓度为5.0×10⁵/3mL，并加入终浓度为800 IU/mL的GM-CSF、终浓度为1000IU/mL的IL-4、终浓度为10ng/mL的肿瘤坏死因子(TNF-α)、终浓度为10ng/mL的白介素1β(IL-1β)和终浓度为1000IU/mL的白介素6(IL-6)，孵育1天获得成熟DC，用流式细胞仪鉴定，备用。

将接种于48孔板的PBMC分别用终浓度为10μg/mL的HBsAg_295-304和HBcAg_88-96 (阳性对照表位肽)刺激10~14天；同时设植物血凝素(PHA)组和Blank组，两组不加任何刺激物；之后各组每隔3天换液并加入终浓度为30IU/mL的IL-2和终浓度为5ng/mL的IL-7维持，得经肽刺激过的PBMC。将前面制得的成熟DC离心重悬后按1×10⁵/孔铺板，分别加入终浓度为10μg/mL的HBsAg_295-304(HBsAg_295-304组)和HBcAg_88-96(HBcAg_88-96组)以及终浓度为2.5μg/mL的PHA(PHA组)，Blank组不加任何肽，于第7天按照数量比为1:10将各组负载肽的DC加入到上述经相应肽刺激过的同源PBMC中，7天为1个周期，共诱导2个周期，获得肽特异性CTL。

采用Elispot试剂盒检测肽特异性CTL分泌IFN-γ的能力：调整肽特异性CTL浓度至1.0×10⁶/mL，取100μL铺板，分别加入终浓度为10μg/mL的HBsAg_295-304(HBsAg_295-304组)和HBcAg_88-96(HBcAg_88-96组)以及终浓度为2.5μg/mL的PHA(PHA组)，Blank组不加任何肽，刺激48小时后去除细胞，按试剂盒说明书依次加入一抗、二抗和显色剂进行反应，显色晾干后读数。

结果如图2所示(PHA组实验结果良好，柱状图中未显示其结果)，HBsAg_295-304诱导的特异性CTL分泌IFN-γ的能力明显高于HBcAg_88-96和Blank组(P<0.01)。

四、胞内因子染色检测HBsAg _295-304 诱导的特异性CTL分泌IFN-γ的能力

采用密度梯度离心法从HLA-A*1101纯合慢性乙型肝炎患者的外周血中分离得到PBMC，按前述方法培养细胞，经肽刺激1个周期后，加入负载相应肽的同源DC，在第2个周期的第3天，分别加入终浓度为10μg/mL的HBsAg_295-304(HBsAg_295-304组)和HBcAg_88-96(HBcAg_88-96组)以及终浓度为1μg/mL的PHA(PHA组)，Blank组不加任何肽，再加入高尔基阻断剂0.7μL，6小时后采用胞内因子染色试剂盒(eBioscience公司)对IFN-γ进行染色，按照试剂盒说明书操作，流式细胞仪测定，计算肽特异性CTL中分泌IFN-γ的T细胞(即CD3^＋CD8^＋IFN-γ^＋T细胞)所占的百分率。

结果如图3所示，HBsAg_295-304诱导的特异性CTL分泌IFN-γ的能力明显高于HBcAg_88-96和Blank组。

五、CFSE标记检测HLA-A*1101阳性健康个体经HBsAg _295-304 诱导刺激前后的特异性CTL增殖

采用密度梯度离心法从HLA-A*1101健康志愿者静脉血中分离得到PBMC，用CFSE溶液(将0.5μL浓度为10mmol/L的CFSE储备液用1mL含0.1%BSA的PBS稀释制得)重悬细胞，37℃孵育10分钟，加入200μL胎牛血清，离心弃上清，用新鲜的预热至37℃的含血清培养基重悬，37℃孵育30分钟(确保CFSE的完全修饰)，用培养基洗涤1次，再用含10%人AB血清的1640培养基重悬细胞，将细胞浓度调整为1×10⁶/mL，平衡过夜后，接种至48孔板，每孔1mL，分别加入终浓度为10μg/mL的HBsAg_295-304(HBsAg_295-304组)和HBcAg_88-96(HBcAg_88-96组)以及终浓度为1μg/mL的PHA(PHA组)，Blank组不加任何肽，经肽刺激1个周期后，再加入负载相应肽的同源DC，在温度37℃、CO₂气体体积分数为5%的条件下培养3~5天，收集细胞，流式细胞仪检测。

结果如图4所示，HBsAg_295-304诱导的特异性CTL增殖较HBcAg_88-96和Blank组明显增多。

六、Pentamer检测HLA-A*1101阳性健康个体经HBsAg _295-304 诱导刺激前后的特异性CTL频率

采用密度梯度离心法从HLA-A*1101健康志愿者静脉血中分离得到PBMC，按前述方法培养细胞，经肽[HBsAg_295-304、阳性对照表位肽HBcAg_88-96、阴性对照表位肽HBcAg_18-27(Control组)、Blank组不加任何肽]刺激1个周期后，加入负载相应肽的同源DC诱导10天，获得肽特异性CTL，通过PE标记的HLA-A*1101/HBsAg_295-304及HLA-A*1101/HBcAg_88-96 Pentamer染色后，利用流式细胞术检测肽特异性CD8⁺CTL频率。

结果如图5所示，诱导前均检测不到肽特异性CTL频率，但诱导10天后，HBsAg_295-304诱导的特异性CTL频率显著高于HBcAg_88-96诱导的特异性CTL频率。

七、Pentamer检测HBsAg _295-304 在慢性乙型肝炎患者中的频率

在8例HLA-A*1101阳性的慢性乙型肝炎患者中，利用HLA-A*1101/HBsAg_295-304及HLA- A*1101/HBcAg_88-96 Pentamer检测外周血中肽特异性CD8⁺CTL频率，结果发现：在HLA-A*1101阳性的慢性乙型肝炎患者外周血中，虽未经肽诱导扩增，仍然存在相应的肽特异性CD8⁺ CTL，占CD8⁺ T细胞的频率范围从0.1%到2.3%。经统计学分析，在同一个体中，HBsAg_295-304特异性CTL频率较HBcAg_88-96特异性CTL频率高，说明与已知的HLA-A*1101限制性表位HBcAg_88-96相比，HBsAg_295-304是更优势的HLA-A*1101限制性CTL表位。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

<110>  中国人民解放军第三军医大学

<120>  乙肝病毒表面抗原的免疫显性HLA-A*1101限制性CTL表位及其应用

<160>  1

 

<210>  1

<211>  10

<212>  PRT

<213>  乙型肝炎病毒B(Hepatitis B virus)

<400>  1

Ser Met Tyr Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys

 1                       5                            10

 

Claims (2)

1.乙肝病毒表面抗原的免疫显性HLA-A*1101限制性CTL表位，其特征在于，由以下氨基酸序列组成：Ser-Met-Tyr-Pro-Ser-Cys-Cys-Cys-Thr-Lys。

2.权利要求1所述的乙肝病毒表面抗原的免疫显性HLA-A*1101限制性CTL表位在制备乙型肝炎治疗性多肽疫苗中的应用。

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