WO2000065022A1

WO2000065022A1 - Instrument for testing specimen and instrument for wipe test

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Publication number: WO2000065022A1
Application number: PCT/JP2000/002478
Authority: WO
Inventors: Yasuhiro Harada; Seiji Murakami
Original assignee: Kikkoman Corp
Current assignee: Kikkoman Corp
Priority date: 1999-04-22
Filing date: 2000-04-17
Publication date: 2000-11-02
Anticipated expiration: 2001-10-22
Also published as: AU3680100A

Description

明細書検体検査用器具及び拭取検査用器具技術分野

本発明は、液体中あるいは固体表面の生物細胞を採取し、遊離アデリシン三リン酸（以下、遊離 A T Pと略称する）を消去した後、発光反応によりその量を測定する器具に関する。背景技術

大腸菌、酵母菌、乳酸菌、及びその他の生物細胞の測定は、食品衛生、バィ才、臨床検査、医学、超純水、環境などの分野において非常に重要である。

一般に、生物細胞の測定は、血球計算盤による顕微鏡下での計測法（顕鏡法）、濁度測定法、重量測定法、パックド 'ボリューム（packed volume)^]定法、及びコロニー計測法（以下、混釈培養法）等が知られてる。

しかしながら、顕鏡法、濁度測定法、重量測定法、及びパックド ·ボリュ一ム法等は、感度が低く、死菌体と生菌体の区別ができない問題を有する。混釈培養法は、生物細胞の培養を必要とするので、測定に通常 1 日以上の時間を要し、迅速に結果を得たい場合には適さない。

上記分野における細胞測定には、迅速、且つ高感度の測定が要求される。例えば、食品衛生の分野では、製品出荷のために製品の微生物汚染の検査は必要不可欠である。従来、この検査は、混釈培養法により行われているが、検査に 1 日以上を要するために、結果が出るまで製品を倉庫に保管しておかなければならない。このため、流通効率の点で問題があるだけでなく、牛乳などの製品では、保管時間が長くなるにつれて微生物汚染の可能性が高くなる。また、食品で汚染を問題にする微生物は、総じて低濃度であるため、高感度な検査が要求される。

上記要求を満たす微生物濃度測定法として、生きた微生物には必ず存在する A T Pを生物発光法を用いて測定する方法が知られている。この方法は、生物細胞を含む試料を、トリクロ口酢酸（T CA)、卜リス緩衝液、エタノール、又は溶菌酵素を等を含んだ抽出剤と接触させて、細胞内 AT Pを細胞外に抽出した後、抽出した A T Pを蛍の発光の基質であるルシフェリンと酵素であるルシフェラーゼを含んだ発光試薬と接触させる。そして、ルシフェリン、ルシフェラ一ゼ、及び A T P (こよる酵素反応により生物発光させ、その生成した発光量を測定して細胞内 A T Pを測定し、生物細胞の測定を行う方法である。

AT Pは、本来その量の差こそあれ、全ての生物の細胞内に含まれるもので、微生物ばかりでなく、単細胞生物にも、そして動植物組織の細胞にも、いわゆる体細胞として存在し、更に生物細胞の周辺にはフリー（遊離）の A T P が存在する。

従って、ある生物細胞を含有する試料から生物細胞だけに存在する AT P を検出しょうとしても、生物細胞中の AT Pと、その周辺に存在する遊離 AT Pが一緒になつて検出されてしまう。すなわち、生物細胞の測定に A T Pを指標にしょうと思っても、今述べた生物細胞以外の遊離 AT Pがバクグランド発光量（ノイズ）として同時に測定され、検出精度の低下を招〈欠点を有していた。

この遊離 A T Pを除去する技術として本出願人は、先に「AT P消去剤、 AT P消去法、それを用いた生物細胞測定試薬及び生物測定法」を提案した（特開平 9— 1 82600号）。

この発明は、アデノシンリン酸デアミナ一ゼを単独で使用するか、又は該アデノシンリン酸デアミナ一ゼと共にアビラ一ゼ、アル力リホスフオターゼ、酸性ホスフオターゼ、へキソキナーゼ、及びアデノシントリホスフ才ターゼから成る群より選ばれる少なくとも 1種を併用する AT P消去法、 AT P消去剤それを用いた生物細胞の測定試薬及び生物細胞の測定法である。発明の開示

そこで、本発明者らは、更に研究を進め、検査用器具に遊離 AT P消去剤、 A T P抽出剤、更に発光試薬を組み込めば、簡単に検体の生物細胞を高精度で測定することが可能であることを知見して本願発明を完成させた。本発明の第 1の概念 (こよれば、検体から生物細胞を採取し、これを発光させることにより生物細胞の量を測定する検体検査用器具であって、遊離 A T P消去剤と、前記生物細胞由来の A T Pを抽出するための抽出剤と、抽出された前記 A T Pに作用させて発光させるための発光試薬と、を収容して成る検体検査用器具が提供される。。

上記検体検査用器具としては、例えば実施の例によれば、試験管形状をし、前記発光試薬が収容されている測定容器と、管形状をし、上下の開口部のそれそれにシール材が貼着され、その内部に遊離 A T P消去剤が封入されている A T P消去剤容器と、管形状をし、上下の開口部のそれぞれにシール材が貼着され、その内部に抽出剤が封入されている抽出剤容器と、を備えて成り、前記測定容器の上部開口部の上方に前記 A T P消去剤容器を、下方に前記抽出剤容器を位置させて嵌装する構成とした。

上記 A T P消去剤容器及び上記抽出剤容器の内部下方部には、前記シール材を破るためのブレーカが設けられる。このブレーカは綿棒の下こより下方に曲げられることによりシール材を突き破る。シール材を破り易〈するために、例えば実施の例によれば、ブレーカの先端下面に下方に突出する突起を形成するのが好ましい。

上記測定容器の上端部には、上記 A T P消去剤容器の上方に位置するシ— ル材を破るためのブレー力が更に設けられる。

本発明の第 2の概念によれば、検体から生物細胞を採取し、これを発光させることにより生物細胞の量を測定する拭取検査用器具であって、管形状をし、上下が開口された本体と、前記本体の上端開口部に着脱自在に挿入される保持部材と、該保持部材に保持される綿棒とを有する検体拭取具と、遊離 A T P消去剤と、生物細胞由来の A T Pを抽出するための抽出剤と、抽出された前記 A T Pに作用させて発光させるための発光試薬とを収容して成る検体検査用器具と、を備えて成り、前記検体検査用器具を前記本体の下端開口部に嵌装させたことを特徴とする拭取検査用器具が提供される。

検体検査用器具の構成としては、上述した検査用器具の構成と同じである。本発明の第 3の概念によれば、検体から生物細胞を採取し、これを発光させることにより生物細胞の量を測定する拭取検査用器具であって、下方に先端が銳角状をしたブレーカ破り部材を有し、上下が開口された管状の本体と、前記本体の上部開口部に着脱自在に挿通される保持部材と、該保持部材に保持される綿棒とを有する検体拭取具と、前記本体内の下部に設けられた A T P 消去剤容器及び抽出剤容器と、試験管形状をし、前記本体下端部の開口部に上下動自在に挿通される測定容器と、を備えていることを特徴とする拭取検査用器具が提供される。図面の簡単な説明

図 1は、本発明の第 1実施例に係る拭取検査用器具の断面図である。

図 2は、図 1に示した検体検査用器具を拡大した断面図である。

図 3は、図 2における m— m線による拡大された断面図である。

図 4は、図 1における IV— IV線による拡大された断面図である。

図 5は、検体検査用器具の他の実施例を示す断面図である。 - 図 6は、拭取検査用器具の他の実施例を示す断面図である。

図 7は、検体検査用器具の更に他の実施例を示す断面図である。発明を実施するための最良の形態

本願発明においては、綿棒等で拭取りにより採取した検体から、先ず遊離 A T Pを遊離 A T P消去剤にて分解し、次いで生物細胞由来の A T Pを抽出剤で抽出する。そして、抽出された生物細胞由来の A T Pに発光試薬を作用させてその発光量により、 A T Pすなわち生物細胞を検出する。

遊離 A T P消去剤としては、アビラ一ゼ、アルカリホスフオターゼ、酸性ホスフ才ターゼ、へキソキナーゼ、アデノシントリホスフオタ一ゼ、及びアデノシンリン酸デアミナーゼを単独あるいは複数組み合わせた試薬を挙げることができる。

抽出剤としての A T P抽出試薬としては、例えば、エタノ一ルとアンモニァの混合液、メタノール、エタノール、界面活性剤、卜リクロロ酢酸、過塩素酸等が使用できる。界面活性剤は A T Pの抽出効率が高いので、 A T P抽出試薬として好適である。界面活性剤としては、ァニオン界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（S D S )、ラウリル硫酸力リウム、モノラウロイルリン酸ナ卜リゥム、アルキルべンスルホン酸ナ卜リゥム）、力チ才ン界面活性剤（たとえば、塩化ベンザルコニゥム（ B A C )、塩化ベンザ卜ニゥム（ B Z C )、塩化セチルピリジニゥム、臭化セチル卜リメチルアンモニゥム、塩化ミリスチルジメチルペンジルアンモニゥ厶）、両性（ッイツタ一）界面活性剤（例えば、 Twittergent Detergent 3-08,3-10,3-12,3-14,3-16, Tego )、非イオン性界面活性剤（例えば、 Tween20，60,80、 Span 60,80、 Triton X-45,X- 100、ポリ才キシエチレンエーテル、ポリ才キシエチレンラウリルエーテル）が使用できる。

発光試薬としては、蛍の発光の基質であるルシフェリンと酵素であるルシフェラーゼを含んだ試薬等を挙げることができる。

図 1 において、本願発明の第 1実施例に係る拭取検査用器具 1は、主に上下が開口された管状に形成された本体 2と、該本体 2の上部開口 3より着脱自在に挿通される検体拭取具 4と、本体 2の下部開口 5に嵌装される生物細胞の検体検査用器具 6とを備えている。

検体拭取具 4は、綿棒 9と、該綿棒 9を保持する保持部材 1 0とを備えている。この綿棒 9は、棒状の綿軸 7と、該綿軸 7の下端部に卵状に形成されて設けられている綿部 8とを有している。この検体栻取具 4は、本体 2より取り外されて検体の表面を綿棒 9で拭き、生物細胞を採取する。

保持部材 1 0は、下段の小径部 1 1 と、上段の大 ί圣部 1 2とから成っている。小 ί圣部 1 1の径は、保持部材 1 0を本体 2に挿入した際、該本体 2の任意の位置で保持部材 1 0が停止する程度の大きさとする。前記小佳部 1 1 と大径部 1 2とで形成される段部 1 3は、検体拭取具 4を下動させた際、本体 2 の上端部 1 4と当接し、該検体拭取具 4がそれ以上下動しないようにストツバの役目を果たす。本体 2の上部内壁面には、図 4に示すように軸長手方向に延びる直線状の突起部材 1 5が複数設けられている。これら突起部材 1 5の先端部 1 6と、前記保持部材 1 0の中段部に設けられた鍔状部材 1 7の外周縁とが摺接し、本体 2に対する保持部材 1 0の動きを円滑にしている。

図 2には検体検査用器具 6が示されている。この検体検査用器具 6は、試験管形状に形成された測定容器 2 0と、該測定容器 2 0の開口部 2 1 に嵌裝され上方に位置する A T P消去剤容器 2 2と、該 A T P消去剤容器 2 2の下方に位置する抽出剤容器 2 3とを有している。この検体検査用器具 6は、図 1 に示すように本体 2の下部開口 5の上部において形成されている段部 2 4に当接するまで押し込まれて本体 2に嵌装される。

A T P消去剤容器 2 2は、円筒状をしており、その上下の開口部にシール材 2 5 , 2 6が貼着されることにより形成される密閉室 2 7を有する。該密閉室 2 7内には、綿部 8に付着している遊離 A T Pを消去するための遊離 A T P消去剤 2 8が収納されている。

前記 A T P消去剤容器 2 2は、その内部の下部にブレーカ 2 9を有している。該ブレーカ 2 9は、例えば図 3に示すように A T P消去剤容器 2 2の内壁面から中心部向けて延びる矢印形状をした 6片のブレーカ片 3 1で構成される。各ブレーカ片 3 1の先端部には、下方に突出する突起 3 0を有している。綿棒 9を押し込むことにより、各ブレーカ片 3 1は下方に向けて押し曲げられ、前記突起 3 0によってシール材 2 6は突き破られる。このとき、同時に、後述する抽出剤容器 2 3の上方のシール材 3 3も破られる。

図 1に示すように本体 2の段部 2 4近辺には、前述したブレーカ 2 9と同様の構造をするブレーカ 3 2が設けられている。このブレーカ 3 2は、綿棒 9の下動により前記 A T P消去剤容器 2 2の上方開口部に設けられたシ—ル材 2 5を突き破る。

前記 A T P消去剤容器 2 2のブレーカ 2 9は、綿棒 9の先端部に設けられている綿部 8の表面を搔取ることにより、該綿部 8に付着していた遊離 A T P を遊離 A T P消去剤 2 8に効果的に移行させる。綿棒 9は、ブレーカ 2 9によって下動方向への抵抗を少し受けるが、この抵抗により遊離 A T P消去剤 2 8と綿部 8との接触時間がより長く保持され、綿部 8に付着している遊離 A T Pの遊離 A T P消去剤 2 8への移行が効果的になる。更に、遊離 A T P消去剤 2 8と綿部 8との接触時間を長〈するため、人為的に綿棒 9の下動を停止させるようにしてもよい。

抽出剤容器 2 3の構造は、上記 A T P消去剤容器 2 2と同様である。すなわち、該抽出剤容器 2 3は、円筒状をし、その上下の開口部はシール材 3 3 , 3 4でシールされることにより、密閉室 3 5を有している。この密閉室 3 5 には、綿棒 9により採取した生物細胞による A T Pを抽出させるための抽出剤

3 6が収納されている。抽出剤容器 2 3は、その下部にブレーカ 3 7を有している。このブレーカ 3 7は、 A T P消去剤容器 2 2に設けられているブレ —力 2 9と同様の構造をしている。綿棒 9の下動により、このブレーカ 3 7 は下方に曲げられシール材 3 4を突き破る。ブレーカ 3 7を下方に押し曲げる際に、該ブレーカ 3 7は綿部 8の表面を搔き取る。

上述したように、 A T P消去剤容器 2 2と抽出剤容器 2 3とは、測定容器 2 0内の上部に埋め込まれるように嵌装されるため、該測定容器 2 0には密閉室 3 8が形成される。この密閉室 3 8には発光試薬 3 9が収納される。

A T P消去剤容器 2 2と抽出剤容器 2 3とを測定容器 2 0内に嵌装した際には、抽出剤容器 2 3の上方に位置する A T P消去剤容器 2 2の上端面 4 1 と測定容器 2 0の上端面 4 2とが同一面になるようにすれば、検体検査-用器具 6 が小型化されるので好ましい。更に、シール材 2 5で測定容器 2 0の上端面

4 2までシールすることにより、検体検査用器具 6の開口部は完全に密封されることになり、後述するように検体検査用器具 6を単独で流通させる場合、外部からの雑菌侵入防止に役立ち、三種類の試薬を収納した測定容器となる。

上記ブレーカ 2 9， 3 2， 3 7は、シール材 2 5 , 2 6 , 3 3， 3 4が綿棒 9により容易に破られる場合は、必ずしも設ける必要はなく、必要に応じて設けるようにすればよい。

次に、図 1に示された拭取挨査用器具 1の使用方法について説明する。先ず、検体拭取具 4は本体 2の途中まで挿入された状態で提供される。発光試薬 3 9は測定容器 2 0に封入され、遊離 A T P消去剤 2 8は、 A T P消去剤容器 2 2に封入され、及び抽出剤 3 6は、抽出剤容器容器 2 3に封入された状態である。

次に、検体拭取具 4を本体 2から引き抜き、綿棒 9の先端部に設けられた綿部 8により検体表面を拭き、生物細胞を採取する。

生物細胞を採取した検体拭取具 4を本体 2に再度挿入する。そして、検体拭取具 4、すなわち綿棒 9を押し下げ、ブレーカ 3 2 (こより図 2に示すシール材 2 5を破り、綿部 8を遊離 A T P消去剤 2 8に浸す。そして、更に綿棒 9を押し下げる際、ブレーカ 2 9により押し下げ抵抗を綿棒 9 は受けるが、この押し下げ抵抗を検知し本体 2に設けられたインジケータ（図示せず）の指示により、シール材 2 6を破らず遊離 A T Pが消去されるまで綿部 8を遊離 A T P消去剤 2 8に浸した状態を保持する。このとき、綿棒 9によりブレーカ 3 2が花びら状に開かれる過程において、綿部 8の表面を該ブレ —力 3 2の先端で搔き取る工程があるため、該綿部 8の表面に付着している遊離 A T Pは効率よく遊離 A T P消去剤 2 8に移行される。

更に綿棒 9を押し下げると、ブレーカ 2 9によりシール材 2 6 ， 3 3が破られ、綿部 8は抽出剤 3 6に浸る。この工程において、更に綿棒 9を押し下げようとすると綿部 8がブレーカ 3 7に接触し、該綿棒 9はブレーカ 3 7により押し下げ抵抗を受けるため、綿部 8と抽出剤 3 6との接触時間が必然的に長くなり、生物細胞からの A T Pの抽出及び消去反応停止が保証される

そして、図 1 に示す保持部材 1 0の段部 1 3と本体 2の上端部 1 4とが当接するまで検体拭取具 1 4を押し下げる。この押し下げ操作により、ブレー力 3 7によってシール材 3 4が破られ、生物細胞を含んだ抽出剤 3 6が測定容器 2 0内に落下流入する。

最後に、拭取検査用器具 1全体を軽〈振ることにより、発光試薬 3 9と抽出剤 3 6とが接触し、発光試薬 3 9の作用により発光反応が起こり、生物細胞の検出ができる。

以上、第 1実施例に係る拭取検査用器具 1について説明したが、本発明においては、検体検査用器具 6単独でも検査具として利用可能である。すなわち、綿棒は市販品でよく、この綿棒で検体を拭取った後、検体検査用器具 6の上端部より突き刺し、シール材 2 5 ， 2 6 , 3 3 ， 3 4を順次破り、上述したような手順で実施すれば、検体の生体細胞を検査することができる。このように検体検査用器具 6を単独で利用する場合、図 2に示した検体検査用器具 6 であってもよく、図 5に示すようにシール材 2 5の上方に位置するようブレー力 3 2を設けた検体検査用器具 6であってもよい。図 6には、本発明の第 2の実施例に係る拭取検査用器具が示されている。この第 2の実施例における拭取検査用器具 1 aは、本体 2 aに対して測定容器 2 0 aを上下動自在とし、 A T P消去剤容器 2 2と抽出剤容器 2 3とを本体 2の段部 2 4上に挿入した例である。

測定容器 2 0 aの開口部はシール材 4 3で密封され、測定容器 2 0 aの内部には発光試薬 3 9が収納されている。本体 2は、その段部 2 4の下部に、先端部が銳角状に形成されたパイプ状のシール破り部材 4 4を一体的に有している。このシール破り部材 4 4は、測定容器 2 0 aを押し上げることにより該測定容器 2 0 aのシール材 4 3を破り、測定容器 2 0 aを開放する。

本体 2の下方部には、上方よりブレーカ 3 2 a、遊離 A T P消去剤 2 8が密封された A T P消去剤容器 2 2、及び抽出剤 3 6が密封された抽出剤容器 2 3が順次設けられている。

上記拭取検査用器具 1 aにおいては、先ず、綿棒 9の下動により遊離 A T Pの消去、次いで生物細胞により A T Pの抽出と消去反応の停止がわれ、最後に抽出剤容器 2 3のシール材 3 4が破られる。生物細胞由来の A T Pを含んだ抽出剤 3 6は、シール破り部材 4 4の連通孔 4 5を介して測定容器 2 0 a 内に落下流入する。そして、 A T Pを含んだ抽出剤 3 6は発光試薬 3 9と接触し、発光反応により生物細胞が検出される。

図 7は検体検査用器具 6の他の実施例を示している。この実施例は、検体検査用器具 6の測定容器 2 0の開口部 2 1における該容器 2 0の外径よりも大きいシール材 2 5 aでもって該開口部 2 1をシールした例を示している。

この実施例によれば、測定容器 2 0の外径よりはみ出た部分 2 5 bを指で摘み、シール材 2 5 aを剥がすことにより、綿棒 9でシール材 2 5 aを突き破る手間が省ける。更に、シール材 2 5 aとして丈夫な材料を用いることもでき、単独製品として品質が向上する。産業上の利用可能性

以上のように本発明の拭取検査用器具によれば、遊離 A T Pを消去し、目的とする生物細胞のみを測定することができるため、高精度な測定ができる検査用器具として有用である。

Claims

請求の範囲

1 . 検体から生物細胞を採取し、これを発光させることにより生物細胞の量を測定する検体検査用器具であって、

遊離 A T P消去剤と、

前記生物細胞由来の A T Pを抽出するための抽出剤と、

抽出された前記 A T Pに作用させて発光させるための発光試薬と、を収容して成る検体検査用器具。

2 . 前記検体検査用器具は、

試験管形状をし、前記発光試薬が収容されている測定容器と、

管形状をし、上下の開口部のそれぞれにシール材が貼着され、その内部に遊離 A T P消去剤が封入されている A T P消去剤容器と、

管形状をし、上下の開口部のそれぞれにシール材が貼着され、-その内部に抽出剤が封入されている抽出剤容器と、

を備えて成り、前記測定容器の上部開口部の上部位置に前記 A T P消去剤容器を、下部位置に前記抽出剤容器を位置させて嵌装したことを特徴とする請求の範囲第 1項記載の検体検査用器具。

3 . 前記 A T P消去剤容器及び前記抽出剤容器の内部下方部に、前記シール材を破るためのブレーカを設けたことを特徴とする請求の範囲第 2項記載の検体検査用器具。

4 . 前記測定容器の上端部に前記 A T P消去剤容器の上方に位置するシール材を破るためのブレーカを設けたことを特徴とする請求の範囲第 2項記載の検体検査用器具。

5 . 前記測定容器の開口部を、該測定容器の外径よりも大きいシール材でシールしたことを特徴とする請求の範囲第 2項又は第 3項記載の検体検査用器具。

6 . 検体を拭き取って生物細胞を採取し、これを発光させることにより生物細胞の量を測定する拭取検査用器具であって、

遊離 A T P消去剤と、

前記生物細胞由来の A T Pを抽出するための抽出剤と、

抽出された前記 A T Pに作用させて発光させるための発光試薬と、を有していることを特徴する拭取検査用器具。

7 . 前記拭取検査用器具は、更に、

管形状をし、上下が開口された本体と、

前記本体の上端開口部に着脱自在に挿入される保持部材と、該保持部材に保持される綿棒とを有する検体拭取具と、

前記遊離 A T P消去剤と、前記抽出剤と、前記発光試薬とを収容するための検体検査用器具と、

を備えて成り、前記検体検査用器具を前記本体の下端開口部に嵌装さたことを特徴とする請求の範囲第 6項記載の拭取検査用器具。

8 . 前記検体検査用器具は、

試験管形状をし、前記発光試薬が収容されている測定容器と、管形状をし、上下の開口部のそれぞれにシール材が貼着され、その内部

(こ遊離 A T P消去剤が封入されている A T P消去剤容器と、

管形状をし、上下の開口部のそれぞれにシール材が貼着され、その内部に抽出剤が封入されている抽出剤容器と、

を備えて成り、前記測定容器の上部開口部の上部位置に前記 A T P消去剤容器を、下部位置に前記抽出剤容器を位置させて嵌装したことを特徴とする請求の範囲第 7項記載の拭取検査用器具。

9 . 前記本体内部の下方部に、前記 A T P消去剤容器の上部のシール材を破るためのブレーカを設けていることを特徴とする請求の範囲第 8項記載の拭取検査用器具。

1 0 . 前記 A Τ Ρ消去剤容器及び前記抽出剤容器の内部下方に、前記シール材を破るためのブレーカを設けていることを特徴とする請求の範囲第 8項又は第 9項記載の拭取検査用器具。

1 1 . 検体から生物細胞を採取し、これを発光させることにより生物細胞の量を測定する拭取検査用器具であつて、

下方に先端が銳角状をしたブレーカ破り部材を有し、上下が開口された管状の本体と、

前記本体の上部開口部に着脱自在に挿通される保持部材と、該保持部材に保持される綿棒とを有する検体拭取具と、

前記本体内の下部に設けられた A T P消去剤容器及び抽出剤容器と、試験管形状をし、前記本体下端部の開口部に上下動自在に挿通される測定容器と、

を備えていることを特徴とする拭取検査用器具。