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WO2000058499A1 - Procede pour la production d'anticorps monoclonal - Google Patents

Procede pour la production d'anticorps monoclonal Download PDF

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Publication number
WO2000058499A1
WO2000058499A1 PCT/JP2000/002022 JP0002022W WO0058499A1 WO 2000058499 A1 WO2000058499 A1 WO 2000058499A1 JP 0002022 W JP0002022 W JP 0002022W WO 0058499 A1 WO0058499 A1 WO 0058499A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
gene
monoclonal antibody
cells
heavy chain
human
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2000/002022
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Chihiro Kusunoki
Atsushi Fukushima
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Japan Tobacco Inc
Amgen Fremont Inc
Original Assignee
Japan Tobacco Inc
Abgenix Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Japan Tobacco Inc, Abgenix Inc filed Critical Japan Tobacco Inc
Priority to DK00912975T priority Critical patent/DK1167537T3/da
Priority to CA002368734A priority patent/CA2368734C/en
Priority to DE60039596T priority patent/DE60039596D1/de
Priority to EP00912975A priority patent/EP1167537B1/en
Priority to AU34563/00A priority patent/AU754808B2/en
Publication of WO2000058499A1 publication Critical patent/WO2000058499A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Priority to US11/238,983 priority patent/US8236530B2/en
Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/108—Plasmid DNA episomal vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/42—Vector systems having a special element relevant for transcription being an intron or intervening sequence for splicing and/or stability of RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a monoclonal antibody, particularly to a method for increasing the amount of the monoclonal antibody secreted from cells, and to cells produced by the method.
  • Mammalian living organisms contain various antigens (eg, foreign antigens (viruses, bacterial toxins, chemical substances, etc.) that are harmful to the homeostasis of the living body and cause the onset or exacerbation (pathogenesis) of various diseases.
  • antigens eg, foreign antigens (viruses, bacterial toxins, chemical substances, etc.
  • humoral immunity a defense system that specifically captures and eliminates autoantigens (eg, autoreactive lymphocytes; tumor cells; excess in vivo factors (cytokines, hormones, growth factors, etc.))
  • autoantigens eg, autoreactive lymphocytes; tumor cells; excess in vivo factors (cytokines, hormones, growth factors, etc.)
  • humoral immunity so-called antibodies (also called immunoglobulins) play a leading role.
  • Antibodies consist of four polypeptide chains, two long polypeptide chains (immunoglobulin heavy chain; IgH chain) and two short polypeptide chains (immunoglobulin light chain; IgL chain). It has a Y-type basic structure composed of peptide chains. This Y-type structure is composed of two IgH chains cross-linked by a disulfide bond, and one IgL chain linked by a disulfide bond.
  • This antibody was early used as an antibody drug because of its ability to capture and eliminate antigens (pathogens) harmful to the living body.
  • Early antibody drugs were so-called antisera, which were sera themselves (ie, polyclonal antibodies) that contained various types of antibodies to specific antigens (eg, bacterial toxins and snake venom).
  • antisera which were sera themselves (ie, polyclonal antibodies) that contained various types of antibodies to specific antigens (eg, bacterial toxins and snake venom).
  • antisera were sera themselves (ie, polyclonal antibodies) that contained various types of antibodies to specific antigens (eg, bacterial toxins and snake venom).
  • the method of obtaining this antiserum was limited to a method based on recovery from serum, and its supply was necessarily limited.
  • B cells that produce a specific type of monoclonal antibody B cells such as spleen cells collected from a non-human mammal immunized with an antigen are fused with myeoma cells and immortalized.
  • immortalized B cells Hypridoma
  • the monoclonal antibody was purified and obtained from a cell culture by culturing the Hydridoma.
  • Monoclonal antibodies are particularly superior in their antigen specificity and stability as compared to the above-described antisera (polyclonal antibodies), and antigens involved in the onset or exacerbation of diseases (for example, viruses and Specifically binds to foreign antigens such as bacterial toxins; various in vivo factors such as cytoforce, hormones or growth factors; and cell surface molecules such as receptors, cell adhesion molecules and signaling molecules.
  • diseases for example, viruses and Specifically binds to foreign antigens such as bacterial toxins; various in vivo factors such as cytoforce, hormones or growth factors; and cell surface molecules such as receptors, cell adhesion molecules and signaling molecules.
  • the biological activity of the antigen can be regulated (inhibition of activity, enhancement of activity, inhibition of signal transduction, signal transduction instead of ligand, or inhibition of cell-cell adhesion, etc.). It is used as an extremely useful drug for prevention and treatment.
  • the production amount of the monoclonal antibody by the above-mentioned hybridoma is not always high, and the hybridoma is cultured and the cell culture medium is used to produce the monoclonal antibody. Only the method of purifying and isolating the noclonal antibody involved difficulty in mass-producing the monoclonal antibody. Therefore, in order to supply a monoclonal antibody that is extremely useful as a pharmaceutical product sufficiently and at low cost, a method for producing a larger amount of a monoclonal antibody from a hybridoma has been studied.
  • Hpten (TNP; 2,4,6-trinitrophenyl) -specific IgH chain gene that encodes the IgH chain and IgL () chain of the anti-TNP monoclonal antibody cloned from the hybridoma Sp6 that produces the mouse IgM monoclonal antibody The recombinant cells obtained by introducing ( ⁇ ) and the Ig light chain gene ( ⁇ ) into a plasmacytoma X63Ag8 that produces an IgG monoclonal antibody against an unknown antigen different from the anti-TNP monoclonal antibody were obtained.
  • the anti-TNP antibody is produced together with the IgG antibody.
  • a cell strain that is a mutant derived from the hybridoma Sp6 secretes only the ⁇ chain, which is the light chain of the TNP antibody, and does not express the heavy chain, and consequently does not secrete the anti-TNP antibody, Recombinant cells obtained by introducing the IgH gene encoding the heavy chain of the antibody produce the anti-TNP antibody.
  • the amount of anti-TNP antibody produced by each of the above recombinant cells was determined by the amount of anti-TNP antibody produced by hybridoma Sp603 subcloned from the hybridoma Sp6. This is about 10 to 25% of that, and it has failed to increase the secretion amount of the target monoclonal antibody.
  • DHFR DHFR gene or glutamate synthase (GS) gene
  • GS glutamate synthase
  • these methods comprise the steps of: constructing an expression vector in which the DHFR gene is inserted in the vicinity of a gene encoding a desired protein; transforming a host cell with the expression vector; The cells are cultured in the presence of a drug (eg, methotrexite (MTX), phosphinothricin, methionine sulfoximine, etc.) to select drug-resistant strains.
  • a drug eg, methotrexite (MTX), phosphinothricin, methionine sulfoximine, etc.
  • the copy number of the introduced dhfr gene increases (gene amplification), and at the same time, the gene adjacent to the dhfr gene is amplified.
  • the gene adjacent to the dhfr gene is amplified.
  • Immortalized B cells obtained by immortalizing monoclonal antibody-producing B cells isolated from a mammal immunized with an antigen (for example, a hybridoma obtained by fusion of the B cells with myeloma cells described above)
  • an antigen for example, a hybridoma obtained by fusion of the B cells with myeloma cells described above
  • the rearranged immunoglobulin gene (IgH gene) and the rearranged immunoglobulin light chain gene (IgL gene) are both integrated into the genome.
  • An object of the present invention is to increase the efficiency of monoclonal antibody production by antibody-producing cells, particularly immortalized B cells (hybridoma), with a simpler operation. That is, an object of the present invention is to provide a novel method capable of increasing the efficiency of monoclonal antibody expression by the immortalized B cells (hypridoma), which has been considered difficult so far.
  • immunoglobulin heavy chain gene immunoglobulin heavy chain gene
  • immunoglobulin light chain gene immunoglobulin light chain gene
  • the present inventors have conducted intensive studies on a method of increasing the amount of antibody molecule secretion by improving (enhancing) the expression of the IgH chain gene.
  • the immortalization of a specific monoclonal antibody In a modified B cell (hybridoma), an IgH protein having the same nucleotide sequence as the rearranged endogenous IgH gene encoding the heavy chain polypeptide of the monoclonal antibody cloned from the hybridoma is used.
  • the secretion amount of the monoclonal antibody is significantly increased, and a gene amplification gene such as a DHFR gene is introduced into the hybridoma together with the IgH-encoding cDNA.
  • the present inventors have also found that the production amount of the monoclonal antibody is increased, and have completed the present invention.
  • the amount of the monoclonal antibody produced by the monoclonal antibody-producing cells can be significantly increased. That is, the method for producing the monoclonal antibody of the present invention and the cells produced by the method are extremely useful for producing a monoclonal antibody useful as a pharmaceutical.
  • the present invention is a method and a cell as described below.
  • a method for producing a monoclonal antibody comprising the following steps:
  • a method for producing a monoclonal antibody comprising:
  • a gene encoding an amino acid sequence identical to the amino acid sequence of the immunoglobulin heavy chain polypeptide is a gene having the same base sequence as the endogenous immunoglobulin heavy chain gene.
  • the immortalized B cells are fusion cells obtained by fusing the B cells with myeloma cells or recombinant myeloma cells.
  • the endogenous immunoglobulin heavy chain gene is a human immunoglobulin heavy chain gene, any one of (1) to (4), (6) or (7) above.
  • the endogenous immunoglobulin light chain gene is a human immunoglobulin light chain gene, any one of (1) to (4), (6) or (7) above.
  • mammal refers to mammals such as humans, porcupines, higgins, bushes, goats, porcupines, rats, hamsters, guinea pigs, and mice.
  • Transgenic non-human mammals capable of producing.
  • a “non-human mammal” means a mammal other than a human, and More specifically, it refers to mammals such as red sea lions, hidge, bush, goats, goats, gray egrets, rats, hamsters, guinea pigs, and mice. "Non-human mammals” are also included.
  • the “antigen” means any substance that the immunocompetent cells in the mammalian organism recognize as non-self as described above, and includes a foreign antigen that is foreign to the organism and an autoantibody. Includes any endogenous substance of the organism that can be produced.
  • the foreign antigen examples include various viruses, bacteria, bacterial toxins and chemical substances.
  • the living body is a specific mammal, an individual different from the living body or a different animal is used. Any substance derived from a species (eg, tissue, cell, protein, fragment thereof, body fluid, etc.) is included.
  • endogenous substances include various cytokines, growth factors, hormones, cell surface molecules (eg, receptors, channel molecules, signal transduction molecules, etc.), which are sometimes produced in excess in the living body, and self-reactivity. Lymphocytes and the like.
  • the “monoclonal antibody” is any monoclonal antibody having reactivity with the above-mentioned antigen.
  • the "monoclonal antibody” can be produced using a natural antibody obtained by immunizing a mammal such as a mouse, rat, hamster, guinea pig, or egret with the above antigen, and a gene recombination technique described below. Also included are chimeric monoclonal antibodies (chimeric antibodies) and human monoclonal antibodies (human antibodies; CDR-grafted antibodies), and human monoclonal antibodies (human antibodies) that can be produced using transgenic animals producing human antibodies. I do.
  • monoclonal antibodies having any isotype such as IgG UgGl, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA, IgD or IgE.
  • IgG IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 or IgM.
  • the term “cells secreting a monoclonal antibody” refers to rearranged endogenous immunoglobulin heavy chain genes and rearranged genes.
  • An immunoglobulin heavy chain polypeptide derived from the endogenous immunoglobulin light chain gene and an immunoglobulin light chain polypeptide derived from the endogenous immunoglobulin light chain gene Any cell that secretes a monoclonal antibody.
  • it is any "monoclonal production immortalized B cell" described in detail below, and more preferably a hybridoma obtained by cell fusion of a monoclonal antibody producing B cell with myeloma cells or the like.
  • the term "monoclonal antibody-producing immortalized B cell” refers to a B cell that produces a monoclonal antibody against the antigen, which is produced in the living body of the mammal described above by immunizing the living body with the antigen, And immortalized B cells produced by immortalizing the B cells by a desired method.
  • the “monoclonal antibody-producing B cells” and “monoclonal antibody-producing immortalized B cells” can be produced by an existing general production method.
  • a mammal preferably a mouse, a rat, a hamster, a guinea pig, a heron, a cat, a dog, a dog, a bush, and an antigen, if necessary, together with Freund's adjuvant.
  • a transgenic non-human mammal that has been engineered to produce antibodies from a goat, poma, magpie, or other animal such as a human antibody-producing transgenic non-human mammal described below.
  • Immunization is performed by injecting one or several times or transplanting into the mammal subcutaneously, intramuscularly, intravenously, in a footpad or intraperitoneally.
  • immunization is performed 1 to 4 times about every 1 to 14 days from the first immunization, and if necessary, immunization is carried out one day before or two days before collection of the monoclonal antibody-producing cells.
  • B cells which are antibody-producing cells, are collected from the immunized mammal as described above from the spleen, lymph node, bone marrow, tonsil, or the like, preferably from the spleen, according to a conventional method.
  • the antibody-producing B cells are preferably purified from mice, according to the method of Köller and Mirsch Yuin et al. (Nature, Vol. 256, p. 95-497, 1975) and a modification method analogous thereto.
  • myeloma cells used for cell fusion include mouse-derived myeloma P3 / X63-AG8.653 (653; ATCC No. CRL1580), P3 / NSI / l-Ag4-l (NS-1), and lake , P3 / X 63-Ag8.Ul (P3U1), SP2 / 0-Agl4 (Sp2 / 0, Sp2), PAI, F0, BW5147, Rat derived myeloma 210RCY3-Ag.2. 3., Human derived myeichia Ma U-266AR1, GM1500-6TG-A1-2, U C729-6, CEM-AGR, D1R11 or CEM-T15 can be used.
  • hybridomas producing monoclonal antibodies produced as described above were performed by culturing the hybridomas, for example, in a microtiter plate, and determining the proliferation of the cells.
  • the reactivity of the culture supernatant to the immunizing antigen used in the above-described mouse immunization can be measured by, for example, an enzyme immunoassay such as RIA or ELISA.
  • human antibody or "human immunoglobulin” refers to the variable region of the H chain (V H ), the constant region of the H chain (C H ), and the variable region of the L chain, which constitute the immunoglobulin.
  • Region (V L ) and the constant region of the L chain are immunoglobulins derived from a gene encoding human immunoglobulin.
  • the H chain is derived from the human immunoglobulin heavy chain gene.
  • An antibody whose light chain is derived from the human immunoglobulin light chain gene.
  • the human antibody can be prepared by immunizing a transgenic animal produced by integrating at least a human immunoglobulin gene into a locus of a non-human mammal such as a mouse with an antigen according to a conventional method.
  • the monoclonal antibody can be produced in the same manner as described above.
  • transgenic mice producing human antibodies have been reported previously (Nature Genetics, Vol. 15, p. 146-156, 1997; Nature Genetics, Vol. 7, p. 13-21, 1994; Hei 4-504365; International Application Publication W094 / 25585; Nikkei Science, June, pages 40-50, 1995, Nature, Vol. 368, p.856-859, 1994; and Japanese Translation of PCT International Publication No. 6-500233).
  • the method for producing the monoclonal antibody of the present invention comprises the following steps (a) and (b).
  • the term "gene encoding the same amino acid sequence as that of the immunoglobulin heavy chain polypeptide” refers to the above-described cells producing monoclonal antibodies (preferably, antibody-producing B cells, antibody-immortalizing cells).
  • a gene preferably cDNA that encodes an amino acid sequence identical to the amino acid sequence of the immunoglobulin heavy chain polypeptide encoded by the endogenous immunoglobulin heavy chain gene of B cells (hybridoma, etc.) Yes, the cDNA can be prepared as follows using known cell engineering techniques and gene recombination techniques according to a conventional method.
  • PolyA + RNA is extracted and purified from a hybridoma producing a desired monoclonal antibody using a commercially available reagent (eg, FastTrack 2.0 kit (manufactured by INVITROGEN)) according to a conventional method. Specifically, for example, it is as follows.
  • a commercially available reagent eg, FastTrack 2.0 kit (manufactured by INVITROGEN)
  • the frozen and stored hybridomas are lysed in a cell lysis buffer (Lysis Buffer), and the cells are disrupted with a commercially available cell lysis reagent (eg, P0LYTR0N). Solubilize. After incubating the lysate at an appropriate temperature (for example, about 45 ° C), add Oligo (dT) cellulose, and gently shake for an appropriate time (for example, about 1 hour).
  • a cell lysis buffer Lisis Buffer
  • P0LYTR0N cell lysis reagent
  • PolyA + RNA is eluted with Elution Buffer.
  • the eluted PolyA + RNA is precipitated with ethanol and dissolved in an appropriate amount of Tris-EDTA buffer.
  • the resulting concentration of PolyA + RNA is determined by measuring the absorbance at the appropriate wavelength (eg, 260 nm).
  • a first strand cDNA and a second strand cDNA are sequentially synthesized.
  • the cDNA is subjected to extraction using phenol / black form / isoamino alcohol and black form.
  • the cDNA is then precipitated and ligated to the adapter DNA.
  • the obtained DNA reaction product was diluted to an appropriate concentration (for example, 1/250) to obtain a type II, which was based on the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the constant region of the heavy chain of the monoclonal antibody produced by the hybridoma.
  • PCR is performed by a conventional method using the primer designed in step 1 and the primer designed based on the nucleotide sequence of the adapter DNA.
  • the obtained PCR product is fractionated by agarose gel electrophoresis, and the cDNA is recovered.
  • the full-length amino acid sequence of the heavy chain polypeptide is coded by PCR based on the base sequence of the cDNA encoding a part of the amino acid sequence of the heavy chain of the monoclonal antibody.
  • a pair of primer DNAs is synthesized so that the cDNA to be loaded can be prepared, and PCR is performed in the same manner as described above using the pair of primers and the purified PolyA + RNA as a type, to thereby obtain the heavy chain polymerase.
  • the method for producing the monoclonal antibody of the present invention comprises the steps of: a "gene encoding an amino acid sequence identical to the amino acid sequence of an immunoglobulin heavy chain polypeptide" described in detail above; Genetic technology is applied to cells secreting the antibody (preferably, the monoclonal antibody-producing hybridoma itself used as the source in the preparation of the gene, that is, synonymous with the above-described monoclonal antibody-producing B cells or immortalized B cells) in accordance with a conventional method. And transforming the transformed cells with the gene, selecting and isolating the transformed cells, and culturing the transformed cells to purify and obtain the monoclonal antibody from a cell culture solution.
  • the gene (for example, cDNA) is introduced into the cell by preparing a plasmid-vector-integrated expression vector so that the gene can be expressed in a host cell according to a conventional method. This is done by transforming the cells.
  • Examples of a method for incorporating cDNA into plasmid include the method described by Maniatis et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 1.53, 1989).
  • Methods for introducing a plasmid into a host include the calcium chloride method, the calcium chloride / rubidium chloride method, and the elemental method described in (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Vol. 1.74, 1989). And the tropoporation method.
  • the vector used in the present invention is not particularly limited as long as it can maintain replication or self-replicate in a host cell (preferably a eukaryotic cell), and includes a plasmid vector and a phage vector.
  • plasmid example pLS407 N pBR322, pBR325, pUC12 , p UC13, pUC19, pSH19, pSH15, pUBllO ⁇ pTP5, pC194, pcD2, pBSV ⁇ CMD, pSV2, and
  • pMAL C2 pEF-BOS (Nucleic Acid Research, Vol. 18, pp. 5322, 1991, etc.) or pME18S (Experimental Medical Supplement Handbook of Genetics ”, 1992, etc.).
  • phage examples include bacterium phage such as phage, and virus of animals and insects (pVL1393, manufactured by Invitrogen) such as retrovirus, plexinia virus, and nucleopolyhedrovirus.
  • bacterium phage such as phage
  • virus of animals and insects pVL1393, manufactured by Invitrogen
  • retrovirus plexinia virus
  • nucleopolyhedrovirus nucleopolyhedrovirus
  • the expression vector is generally at least one promoter region of the promoter, an initiation codon, a gene encoding the desired immunoglobulin heavy chain (IgH chain), and a termination. It consists of a codon, a terminator region, and a replicable unit.
  • the expression vector must include at least a promoter, an initiation codon, the gene encoding the desired immunoglobulin heavy chain (IgH chain), and a termination codon as described above. Is preferred.
  • IgH chain immunoglobulin heavy chain
  • promoters for expressing the above-described gene encoding the desired immunoglobulin heavy chain (IgH chain) in eukaryotic cells such as mammalian cells include, for example, / 5 actin promoter derived from chicken, SV40-derived promoters, retrovirus promoters, and heat shock promoters. Preferably, they are chicken / derived actin promoters, SV40-derived promoters, SV40 and retrovirus promoters. However, it is not particularly limited to these.
  • Use of an enhancer is also an effective method for expression, and a preferred enhancer is CMV enhancer.
  • Promoters for expressing the gene encoding the desired immunoglobulin heavy chain (IgH chain) described above in a bacterium—an operator region include a promoter, an operator, and a Shine-Dalgarno (SD) sequence (eg, MGG, etc.). ).
  • SD Shine-Dalgarno
  • the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia, those containing a Trp promoter, a lac promoter, a recA promoter, a PL promoter, an lpp promoter, a tac promoter, and the like are preferably exemplified.
  • Promoters for expressing the above-described gene encoding the desired immunoglobulin heavy chain (IgH chain) in yeast include PH05 Promoter, PGK Promoter, GAP Promoter, and ADH promoter.
  • examples include SL01 promoter, SP02 promoter, penP promoter and the like.
  • Suitable initiation codons include methionine codon (ATG).
  • stop codon examples include commonly used stop codons (eg, TAG, TGA, TAA).
  • the evening / mineral / night area a commonly used natural / synthetic evening / mineral area can be used.
  • a replicable unit is DNA that has the ability to replicate its entire DNA sequence in a host cell, and is composed of natural plasmids, artificially modified plasmids (prepared from natural plasmids). DNA fragments) and synthetic plasmids.
  • Preferred plasmids include the plasmid pBR322 in E. coli or an artificially modified product thereof (a DNA fragment obtained by treating pBR322 with an appropriate restriction enzyme), and the yeast in yeast.
  • yeast 2-plasmid or yeast chromosomal DNA examples include yeast 2-plasmid or yeast chromosomal DNA, and mammalian cells include plasmid pRSVneo ATCC 37198, plasmid pSV2 dhfr ATCC 37145, plasmid pdBPV-MMMTneo ATCC 37224, and plasmid pSV2neo ATCC 37149.
  • polyadenylation site and splicing junction site those commonly used by those skilled in the art, such as those derived from SV40, can be used.
  • the above-mentioned expression vector is prepared by ligating the above-mentioned promoter, initiation codon, the above-mentioned gene encoding the IgH chain, and / or the evening / mine / night region to an appropriate replicable unit in a continuous and circular manner. Can be prepared.
  • an appropriate DNA fragment for example, a linker, another restriction enzyme cleavage site, etc.
  • T4 DNA ligase can be used by a conventional method such as digestion with a restriction enzyme or ligation using T4 DNA ligase.
  • a desired selection marker for example, a drug resistance gene
  • a desired selection marker for example, a drug resistance gene
  • the selection marker a commonly used marker can be used by a conventional method. Examples thereof include antibiotic resistance genes such as tetracycline, ampicillin, and kanamycin.
  • the gene amplified gene is inserted together with the gene encoding the heavy chain polypeptide of the desired monoclonal antibody inserted into the expression vector.
  • the copy number of the gene encoding the heavy chain polypeptide is increased to further increase the efficiency of producing the desired monoclonal antibody by the transformed cells.
  • Examples of gene amplification genes that can be used in the present invention include a dihydrofolate reductase (DHFR) gene, a thymidine kinase gene, a neomycin resistance gene, a glucosiminic acid synthase (GS) gene, and an adenosine deminase gene.
  • DHFR dihydrofolate reductase
  • GS glucosiminic acid synthase
  • adenosine deminase gene adenosine deminase gene.
  • ordinin decarboxylase gene hygromycin-1 B-phosphotransferase gene, aspartate transcarbamylase gene and the like.
  • it is a DHFR gene or a GS gene.
  • the gene encoding the amino acid sequence identical to the amino acid sequence of the immunoglobulin heavy chain polypeptide described in detail above may be used.
  • the cell (host cell) to be transformed by the “progenitor cell” may be any cell as long as it is a “cell that secretes a monoclonal antibody comprising the immunoglobulin heavy chain polypeptide”, but is particularly preferably prepared from the gene.
  • the monoclonal antibody-producing hybridoma itself ie, synonymous with the above-described monoclonal antibody-producing B cells or immortalized B cells used as a source in the above.
  • host cells other than the hybridoma include various cells such as natural cells or artificially established recombinant cells (for example, bacteria (Escherichia spp., Bacillus spp.), As long as the desired monoclonal antibody is produced. ), Yeast (such as Saccharomyces and Pichia), animal cells and insect cells, etc.
  • natural cells for example, bacteria (Escherichia spp., Bacillus spp.), As long as the desired monoclonal antibody is produced.
  • Yeast such as Saccharomyces and Pichia
  • animal cells and insect cells etc.
  • the origin of the cells is, for example, Escherichia coli (DH5 HI, BU HB101, etc., mouse-derived cells (C0P, L, C127, Sp2 / 0, NS-1 or NIH3T3, etc.), rat-derived cells (PC12, PC12h), hamster-derived cells (BHK, CH0, etc.), monkey-derived Cells (C0S1, C0S3, C0S7, CV1, and Velo, etc.) and human-derived cells (Hela, cells derived from diploid fibroblasts, myeoma cells and HepG2, etc.) It may be.
  • Escherichia coli DH5 HI, BU HB101, etc.
  • mouse-derived cells C0P, L, C127, Sp2 / 0, NS-1 or NIH3T3, etc.
  • PC12, PC12h rat-derived cells
  • hamster-derived cells BHK, CH0, etc.
  • monkey-derived Cells C0S1,
  • the "transformed cells” in the above-described method for producing the monoclonal antibody of the present invention which are transformed with the gene encoding the desired immunoglobulin heavy chain, can be cultured by a conventional method as follows. Can be done. By such culture, a desired monoclonal antibody can be obtained from the cell culture solution.
  • the cells transformed with the gene encoding the heavy chain of the desired immunoglobulin are the monoclonal antibody-producing hybridomas themselves (the above-described monoclonal antibody-producing B cells or immortalized B cells) used as a source in the preparation of the gene.
  • the method can be performed in the same manner as a general culture method of a hybridoma.
  • the recombinant hybridoma is performed in vitro, or in vivo in a mouse, rat, guinea pig, hams or a heron or the like, preferably a mouse or a rat, more preferably a mouse ascites, and the like. It can be carried out by isolating from the obtained culture supernatant or ascites of a mammal.
  • hybridomas When culturing in vitro, hybridomas are grown, maintained, and stored according to various conditions such as the characteristics of the cell type to be cultured, the purpose of the test and research, and the culture method, and the monoclonal antibody is produced in the culture supernatant. It can be carried out using any known nutrient medium or any nutrient medium derived and prepared from a known basal medium.
  • a low calcium medium such as Hajn 'F12 medium, MCDB153 medium or low calcium MEM medium and a high calcium medium such as MCDB104 medium, MEM medium, D-MEM medium, RPMI1640 medium, ASF104 medium or RD medium
  • the basal medium can contain, for example, serum, hormones, cytosolic acid, and / or various inorganic or organic substances, depending on the purpose.
  • Isolation and purification of the monoclonal antibody from the recombinant hybridoma were carried out using the above-mentioned culture supernatant or ascites by the addition of saturated ammonium sulfate, euglobulin precipitation, It can be carried out by subjecting it to an in-acid method, a caprylic acid method, ion-exchange chromatography (DEAE or DE52, etc.), affinity column chromatography such as an anti-immunoglobulin column or a protein A column.
  • a cell transformed with the gene encoding the heavy chain of the desired immunoglobulin is a host cell such as a CHO cell generally used in the production of the above-mentioned recombinant protein
  • a host cell such as a CHO cell generally used in the production of the above-mentioned recombinant protein
  • the nutrient medium preferably contains a carbon source, an inorganic nitrogen source or an organic nitrogen source necessary for the growth of the host cell (transformant).
  • carbon sources include glucose, dextran, soluble starch, and sucrose.
  • inorganic or organic nitrogen sources include ammonium salts, nitrates, amino acids, corn steep liquor, peptone, casein, and meat extract. , Soybean meal, potato extract and the like.
  • other nutrients eg, inorganic salts (eg, calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, magnesium chloride)
  • vitamins antibiotics (eg, tetracycline, neomycin, ampicillin, kanamycin, etc.) are included. May be.
  • the culturing is performed by a method known in the art. Culture conditions, for example, temperature, pH of the medium, and culture time are appropriately selected so that the desired monoclonal antibody of the present invention is produced in a large amount from the transformed cells.
  • a liquid medium containing the above-mentioned nutrient is suitable.
  • the medium has a pH of 5 to 8.
  • preferred mediums are LB medium and M9 medium (Miller et al., Exp. Mol. Genet (Cold Spring Harbor Laboratory, p.431, 1972).
  • the culturing can be carried out usually at 14 to 43 ° (:, about 3 to 24 hours) with aeration and stirring as necessary.
  • the reaction can be carried out usually at 30 to 40 ° C. for about 16 to 96 hours with aeration and stirring as necessary.
  • the medium includes, for example, Burkholder minimum culture (Bostian, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 77, p. 505, 1980), and the pH is 5 to 8. It is desirable. Culture is usually performed at about 20 to 35 ° C for about 14 to 144 hours, and if necessary, aeration and stirring can be performed.
  • the host is an animal cell
  • a MEM medium containing about 5 to 20% fetal bovine serum (Science, Vol. 122, p. 501, 1952)
  • a DMEM medium (Virology, Vol. 8, p. 396,
  • the pH of the medium is preferably about 6 to 8, and the cultivation is usually performed at about 30 to 40 ° C for about 15 to 72 hours, and if necessary, aeration and stirring can be performed.
  • the host is an insect cell
  • Grace's medium containing fetal bovine serum Pro Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 82, p. 8404, 1985
  • its pH is about 5 to 8. Is preferred.
  • the cultivation is usually performed at about 20 to 40 ° C for 15 to 100 hours, and if necessary, aeration and agitation can be performed.
  • the desired monoclonal antibody in the present invention can be obtained from the culture supernatant of the transformed cells thus cultured by the above-described general method for purifying a monoclonal antibody.
  • FIG. 1 is a diagram schematically showing the structure of an expression vector PDH502 and a restriction enzyme map.
  • Figure 2 shows the amount of anti-human IL-8 monoclonal antibody produced by the recombinant hybridoma.
  • the vertical axis indicates the amount of monoclonal antibody produced, and the horizontal axis indicates the type of each recombinant hybridoma clone in each well in the microplate.
  • a hybridoma producing a human monoclonal antibody against human IL-8 described in the previous report was used in the following tests (Nature genetics Vol.15, p.146-156, 1997, and International Patent Application Publication W096 / 33735). No.).
  • the hybridoma was produced as follows.
  • mice The human IgG 2 / antibody-producing transgenic mice (8 to 10 weeks old) were inoculated intraperitoneally with recombinant human IL-8 (25 ⁇ g) together with complete Freund's adjuvant for the first immunization. Every two weeks after the initial immunization, the IL-8 was boosted (three times) with incomplete Freund's adjuvant, and finally immunized 4 days before the following cell fusion.
  • lymphocytes including antibody-producing B lymphocytes.
  • the antibody-producing lymphocytes can be obtained by a conventional method.
  • the cells were fused with mouse myeloma cells (NS0-bsl2 cell line) that did not produce any autoantibodies.
  • Hybridomas obtained by cell fusion were selected by the HAT selection method according to a conventional method.
  • the reactivity of the human monoclonal antibody produced by the obtained hybridoma with human IL_8 was measured by ELISA according to a conventional method, and multiple hybridomas producing an anti-human IL-8 human monoclonal antibody were obtained. Was. Each hybridoma was stored frozen.
  • Anti-human IL-8 human IgG 2 / monoclonal antibody production was prepared as described above Ha ibritumomab dormer: Frozen cells (clone. K2.2 1), were dissolved in lysis buffer (Lysis Buff er), P0LYTR0N The cells were disrupted and solubilized.
  • RNA was extracted and purified from the cell lysate using a commercially available RNA extraction kit (FastTrack 2.0 kit (manufactured by INVIT R0GEN)).
  • cDNA was synthesized by the RACE-PCR method using a commercially available Marathon cDNA Amplification Kit (manufactured by CLONTECH) by a conventional method ("Gene amplification PCR method, basic and new developments").
  • Second Printing 1992, Kyoritsu Shuppan Co., p. l3-15 c i.e., PolyA NA purified from the High Priestess dormer a (1 5 ⁇ G) as ⁇ , 1 st strand cDNA and 2nd strand cDNA Were sequentially synthesized.
  • the cDNA was subjected to extraction once each using phenol / chloroform / isoamino alcohol and black form. Next, the cDNA is precipitated with ethanol, and the adapter attached to the kit is Yuichi I ligated to DNA.
  • the PCR product was fractionated by agarose gel electrophoresis, and DNA was recovered.
  • the nucleotide sequence of the obtained cDNA was determined using a commercially available DyeTerminator Cycle Sequencing FS Kit (manufactured by PE-Applied Biosystems) and a PRISM377 DNA Sequencer (manufactured by PE-Applied Biosystems).
  • the primer used in the above-mentioned PCR was used as the sequencing primer for this sequencing.
  • the cDNA (SEQ ID NO: 1) encoding the full length of the heavy chain polypeptide ( IgH ) of the anti-human IL-8 human monoclonal antibody secreted by the hybridoma K2.2.1 obtained above was obtained by a conventional method. Therefore, the expression vector PDH502 was prepared by using DNA ligase to insert and ligate into the EcoRI restriction site of plasmid PLS407 carrying CMV Enhanza-1 / Chicken Bactin Promoter and DHFR gene (FIG. 1). The DHFR gene is both a marker gene and a gene amplification gene. The presence of the DHFR gene selects transformed cells by the expression vector by culturing the cells in the presence of methotrexite (MTX). Becomes possible.
  • MTX methotrexite
  • the IgH gene expression vector pDH502 was introduced into Hybridoma K2.2.1 by electroporation. Then, the hybridomas were cultured in a selection medium (IMDM (JRH BIOSCUENCE); containing 10% FBS and 300 mM MTX), and about 100 transformants (recombinant hybridomas) that grew were selected and obtained. did. Each of the selected recombinant hybridomas was cultured in a 96-well microphone plate.
  • IMDM JRH BIOSCUENCE
  • the amount of transformants each being cultured in the Uweru human monoclonal antibodies produced in the culture Youe brass of (recombinant High Priestess dormer) (IgG 2) was determined by sub sandwiches ELISA.
  • An anti-human IgG (Fc) (manufactured by Organon Teknika) was used as a solid phase antibody (primary antibody) and an anti-human Igc antibody (manufactured by PHOTOS IMMUNORE SEARCH) labeled with horseradish peroxidase (HRP) was used as a detection antibody (secondary antibody).
  • HRP horseradish peroxidase
  • Table 1 shows the production amounts of monoclonal antibodies of several clones of the recombinant hybridoma.
  • the production amount of the monoclonal antibody of each sub-cloned recombinant hybridoma was significantly higher than that of the parent recombinant hybridoma.
  • the amount of antibody produced by the parent recombinant hybridoma (No. 15) was about 37.3 ⁇ g / ml, whereas the antibody produced by the recombinant hybridoma (No. 15-4) subcloned from the parent strain. Production increased to about 95.3 mg / ml.
  • Each of the sub-cloned recombinant hybridomas (clone Nos. 12-6 15-4 15-124, and 89-5) prepared above was subjected to 12 or 5 / M methotrexate (MTX). ) was further cultured in a nutrient medium containing) to select and obtain MTX-resistant cell lines.
  • MTX methotrexate
  • the production efficiency of the monoclonal antibody per cell number of each recombinant hybridoma selected by MTX was lower than that before MTX selection (before gene amplification by DHFR), but it was transformed with the IgH gene.
  • the production efficiency of the monoclonal antibody of the recombinant hybridopoma selected by the MTX is as follows. It was significantly increased compared to that of the hybridoma.
  • the use of the method of the present invention makes it possible to easily and significantly increase the amount of a monoclonal antibody produced by a monoclonal antibody-producing cell in the production of a monoclonal antibody useful as a pharmaceutical. Become.
  • the efficiency of monoclonal antibody production of immortalized B cells (hybridomas) commonly used in the production of monoclonal antibodies is low, depending on the instability or low expression of endogenous IgH genes In such a case, it is possible to significantly increase the amount of monoclonal antibody secreted by the parent hybridoma by using the method of the present invention.
  • the method for producing the monoclonal antibody of the present invention and the transformed cell (recombinant cell) producing the monoclonal antibody obtained by the method are extremely useful means for producing an antibody drug.

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Description

明細 モノクローナル抗体の製造方法 技術分野
本発明は、 モノクローナル抗体を製造する方法、 特には細胞からの該モノクロ ーナル抗体の分泌量を増大させる方法、 並びに該方法により製造される細胞に関 する。 背景技術
哺乳動物の生体は、 生体の恒常的維持にとって有害であり種々の疾患の発症ま たは増悪の原因 （病原） となる種々の抗原 （例えば、 外来性抗原 （ウィルス、 細 菌毒素及び化学物質等） あるいは自己抗原 （例えば、 自己反応性リンパ球；腫瘍 細胞；過剰の生体内因子 （サイ トカイン、 ホルモン若しくは成長因子等） など） を特異的に捕捉し生体から排除する防御システムである体液性免疫を有している。 この体液性免疫においては、 いわゆる抗体 （免疫グロブリンとも呼ばれる） が主 役を演じている。
抗体（免疫グロプリン）は、 2本の長いポリべプチド鎖（免疫グロプリン重鎖； IgH鎖） と 2本の短いポリべプチド鎖 （免疫グロプリン軽鎖； IgL鎖） との 4本の のポリべプチド鎖により構成される Y型の基本構造を有する。 この Y型構造は、 ジスルフィ ド結合により架橋した 2本の IgH鎖の各々に IgL鎖が 1つずつジスルフ ィ ド結合により結合して構成される。
この抗体の生体にとって有害な抗原 （病因） の捕捉 '排除という機能から、 早 くから抗体の医薬品として利用された。 初期の抗体医薬は、 いわゆる抗血清と呼 ばれるものであり、 特定の抗原 （例えば、 細菌毒素やへビ毒など） に対する様々 なタイプの抗体が混在する血清自体 （即ちポリクローナル抗体） である。 しかし ながら、 この抗血清の取得方法は、 血清からの回収による方法に限られているこ とからその供給は必然的に限りがあった。 また、 様々なタイプの抗体が混在する この抗血清から特定の抗原特異性を有する単一のタイプの抗体分子、 即ちモノク ローナル抗体を単離することにおいても多大な困難性を有していた。
これらの問題は、 1975年のケーラ一及びミルシュタインらによるいわゆるハイ プリ ドーマによるモノクローナル抗体の作製の成功 （Nature, Vol .256, p. 95-4 97, 1975 ) により解決へと導かれた。
この方法は、 即ち、 抗原により免疫感作された非ヒト哺乳動物から採取した特 定のタイプのモノクローナル抗体を産生する細胞 （脾臓細胞等の B細胞） をミエ 口一マ細胞と細胞融合させ不死化させることにより不死化 B細胞 （ハイプリ ドー マ） を得、 該ハイプリ ドーマを培養することにより細胞培養液中から該モノクロ ーナル抗体を精製、 取得を可能にするものであった。 この方法のみでは、 所望の モノクローナル抗体の大量製造が必ずしも達成されないものの、 所望のモノクロ ーナル抗体を所望の折に取得できるという点では画期的技術であつた。 この技術 により、 モノクローナル抗体の抗体医薬としての利用への道が開かれた。
モノクローナル抗体は、 上述のような抗血清 （ポリクロナ一ル抗体） に比べ、 その抗原特異性や安定性などにおいて特段に優れること、 並びに疾患の発症ある いは増悪に関与する抗原 （例えば、 ウィルスや細菌毒素等の外来性抗原；サイ ト 力イン、 ホルモン若しくは成長因子等の種々の生体内因子；並びに受容体、 細胞 接着分子及びシグナル伝達分子などの細胞表面分子など） に特異的に結合するこ とにより、 該抗原の生物活性を調節 （活性阻害、 活性増強、 シグナル伝達阻害、 リガンドに代わるシグナル伝達、 あるいは細胞間接着の阻害など） することがで きることから、 これまでに種々の疾患の予防及び治療のための極めて有用な医薬 品として用いられている。
一方、 上述のハイプリ ドーマによるモノクローナル抗体の産生量は、 必ずしも 高いものとは言えず、 該ハイブリ ドーマを培養して、 その細胞培養液中から該モ ノクローナル抗体を精製、 単離する方法のみでは、 該モノクローナル抗体の大量 製造に困難性を伴うものであった。 従って、 医薬品として極めて有用なモノクロ ーナル抗体を、 十分に且つ安価に供給するために、 ハイプリ ドーマからより多く の量のモノクローナル抗体を製造する方法が検討されている。
例えば、 ヒト抗体産生ハイプリ ドーマをインターロイキン一 2を添加した培地 で培養することにより抗体の産生量が増大する旨の報告がされている （Cel lular immunology, Vol . 115 , p. 325-333 , 1988 ) ) 。
また、 遺伝子工学技術を用いた試みとして、 ォチ （Ochi ) 等らは、 下記のよう な報告をしている (Proc . Natl . Acad. Sc i . USA vol .80 , p.6351 , 1983) 。 ハプテン （TNP ; 2, 4，6- trinitrophenyl ) 特異的なマウス IgMモノクローナル抗 体を産生するハイプリ ドーマ Sp6からクローニングした該抗 TNPモノクローナル抗 体の IgH鎖及び IgL ( )鎖各々をコードする IgH鎖遺伝子（〃）と IgL鎖遺伝子（ κ ) を、 該抗 TNPモノクローナル抗体とは異なる未知の抗原に対する I gGモノクロ一ナ ル抗体を産生するプラズマ細胞腫 X63Ag8に導入して得た組換え細胞が、該 IgG抗体 とともに該抗 TNP抗体を産生する。 また、 該ハイプリ ドーマ Sp6に由来する変異株 であり、該 TNP抗体の軽鎖である κ鎖のみを分泌し重鎖を発現せず結果として該抗 TNP抗体を分泌しない細胞株に、該抗 TNP抗体の重鎖をコードする IgH遺伝子を導入 して得た組換え細胞が、 該抗 TNP抗体を産生する。
しかしながら、 このォチらの実験の結果では、 上記各々の組換え細胞により産 生される抗 TNP抗体の量は、 該ハイプリ ドーマ Sp6からサブクローニングされたハ イブリ ドーマ Sp603が産生する抗 TNP抗体の量の 10乃至 25 %程度であり、 目的のモ ノクロ一ナル抗体の分泌量を上げることには失敗している。
一般に、 ハイプリ ドーマや抗体遺伝子を組み込んだ宿主細胞によりモノクロ一 ナル抗体を大量に生産させる手段として、 培養液当たりの細胞数を増加させる方 法と、 細胞当たりの物質生産を向上させる方法が検討されている。
培養液当たりの細胞数を増加させることは好ましい方法であるが、 細胞数の増 加が必ずしも抗体の高生産につながるとは限らず、 むしろ抗体生産性の高い単一 の細胞株を選別、 単離し、 該単一の細胞株を培養することが重要である。 この抗 体生産性の高い細胞株 （ハイプリ ドーマや組換え細胞など） の選別、 単離には多 犬の労力を有すものの、 所望のモノクロ一ナル抗体の生産性を上げる目的におい ては、 極めて重要なファクターである。
一方、 遺伝子組換え細胞を用いた所望の蛋白質の製造においては、 該組換え細 胞に導入された該所望の蛋白をコ一ドする遺伝子の発現効率を高めるため、 該組 換え細胞に該所望の蛋白をコードする遺伝子とともにジヒドロ葉酸レダク夕ーゼ
(DHFR) 遺伝子やグルタミン酸合成酵素 （GS) 遺伝子を導入し、 該所望の蛋白の 遺伝子のコピー数を増幅することにより、 該所望の蛋白の産生量を増大される方 法が利用されている（国際特許出願公開 W081/02426号、及び同 W087/04462号など）。
DHFR遺伝子を例に挙げれば、 これらの方法は、 即ち、 所望の蛋白をコードする 遺伝子の近傍に DHFR遺伝子を挿入した発現ベクターを構築し、 該発現ベクターで 宿主細胞を形質転換した後、 該宿主細胞を薬剤 （例えば、 メソトレキセィ ト （MT X) 、 ホスフィノ トリシン、 メチォニンスルホキシミン等） の存在下で培養して薬 剤耐性株を選択する。
得られた薬剤耐性株では、 導入された dhfr遺伝子のコピー数が増大 （遺伝子増 幅） すると同時に、 その近傍に隣接する遺伝子も遺伝子増幅される。 所望の蛋白 をコードする遺伝子のコピー数を増幅される結果、 該所望の蛋白を産生量の増大 が期待される。
抗原により免疫感作させた哺乳動物から単離したモノクローナル抗体産生 B細 胞を不死化して得られる不死化 B細胞 （例えば、 前述の該 B細胞とミエローマ細 胞との融合により得られるハイプリ ドーマ） においては、 再配列された免疫グロ ブリン遺伝子 （IgH遺伝子） 及び再配列された免疫グロブリン軽鎖遺伝子 （IgL遺 伝子） はともにゲノム中に組み込まれている。
上述の遺伝子増幅遺伝子により該 IgH遺伝子及び IgL遺伝子を増幅するためには、 該各々の遺伝子のゲノム上における存在位置を同定し、 且つ各々の遺伝子の近傍 に該遺伝子増幅遺伝子を挿入する必要がある。
しかしながら、 この方法は理論的には可能性を有するが、 多大な時間と労力を 有する上、 該不死化 B細胞のゲノム上の所望の位置に正確に該遺伝子増幅遺伝子 を夕一ゲティングすることは現実には不可能である。 発明の開示
本発明は、 より簡便な操作で確実に、 抗体産生細胞、 特に不死化 B細胞 （ハイ プリ ドーマ） によるモノクローナル抗体の産生効率を増大させることを目的とす る。 即ち、 これまで困難とされてきた該不死化 B細胞 （ハイプリ ドーマ） による モノクローナル抗体発現効率を増大することができる新規な方法を提供すること を目的とする。
本発明者等は、 ハイブリ ド一マによるモノクローナル抗体生産においては、 免 疫グロプリン軽鎖遺伝子（IgL鎖遺伝子）の発現に比べ、 免疫グロプリン重鎖遺伝 子（IgH鎖遺伝子）の発現がしばしば不安定であり、 場合によっては抗体分子の分 泌が停止すること着目し、抗体分子の分泌量は、 IgH鎖遺伝子の発現量に依存する ものと発想した。
本発明者らは、 この発想に基づき、 IgH鎖遺伝子の発現を改善 （増強） すること により抗体分子の分泌量を増大させる方法に関しで鋭意研究を行った結果、 特定 のモノクローナル抗体を産生する不死化 B細胞 （ハイプリ ドーマ） に、 該ハイブ リ ドーマからクロ一ニングした該モノクローナル抗体の重鎖ポリべプチドをコ一 ドする再配列された内在性 IgH遺伝子と同一の塩基配列を有する IgHコ一ディング cDNAを導入して得た組換えハイプリ ドーマにおいては、 該モノクローナル抗体の 分泌量が有意に増大すること、 また、 該ハイブリ ドーマに該 IgHコーディング cDN Aとともに DHFR遺伝子などの遺伝子増幅遺伝子を導入することによつても、該モノ クローナル抗体の産生量が増大することを見出し本発明を完成するに到った。 本発明の方法を用いれば、 モノクローナル抗体産生細胞による該モノクロ一ナ ルの産生量を有意に増大することができる。 即ち、 本発明のモノクローナル抗体 の製造方法並びに該方法により製造される細胞は、 医薬品として有用なモノクロ ーナル抗体の製造において極めて有用である。
即ち、 本発明は下記のとおりの方法及び細胞である。
(1) モノクローナル抗体の製造方法であって、 下記工程：
(a) 再配列された内在性免疫グロプリン重鎖遺伝子及び再配列された内 在性免疫グロプリン軽鎖遺伝子を有し、 該内在性免疫グロプリン重鎖遺伝子に由 来する免疫グロブリン重鎖ポリペプチド及び該内在性免疫グ口ブリン軽鎖遺伝子 に由来する免疫グロプリン軽鎖ポリべプチドとからなるモノクローナル抗体を分 泌する細胞に、 該免疫グロプリン重鎖ポリべプチドのアミノ酸配列と同一のアミ ノ酸配列をコードする遺伝子を含む外来性 D N Aを導入し、 該外来性 D N Aによ り形質転換された形質転換細胞を得る工程；及び
(b) 該形質転換細胞を培養し、 細胞培養液中に分泌された該モノクロ一 ナル抗体を取得する工程、
からなることを特徴とするモノクローナル抗体の製造方法。
(2) 該免疫グ口ブリン重鎖ポリペプチドのァミノ酸配列と同一のアミノ酸 配列をコードする遺伝子が、 該内在性免疫グロプリン重鎖遺伝子と同一の塩基配 列を有する遺伝子であることを特徴とする前記（1)に記載の製造方法。
(3) 該細胞が、 哺乳動物の B細胞に由来する不死化 B細胞であることを特 徴とする前記（1)または前記 (2)に記載の製造方法。
(4) 該不死化 B細胞が、 該 B細胞をミエローマ細胞または組換えミエロー マ細胞と融合することにより得られる融合細胞であることを特徴とする前記 (3) に記載の製造方法。
( 5) 該哺乳動物が、 非ヒト哺乳動物であることを特徴とする前記（3)または 前記 (4)に記載の製造方法。 ( 6) 該哺乳動物が、 ヒトであることを特徴とする前記 (3)または前記 (4)に 記載の製造方法。
(7) 該哺乳動物が、 ヒト抗体を産生する能力を有する トランスジヱニック 非ヒト哺乳動物であることを特徴とする前記（3)または前記 (4)に記載の製造方法。
(8) 該内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子が、 ヒ ト免疫グロブリン重鎖遺伝 子であることを特徴とする前記（1)乃至前記 (4)、 前記 (6)または前記（7)のいずれ かに記載の製造方法。
( 9) 該内在性免疫グロブリン軽鎖遺伝子が、 ヒ ト免疫グロブリン軽鎖遺伝 子であることを特徴とする前記（1)乃至前記 (4)、 前記 (6)または前記（7)のいずれ かに記載の製造方法。
(10) 該モノクローナル抗体が、 非ヒト哺乳動物のモノクローナル抗体であ ることを特徴とする前記（1)乃至前記（5)のいずれかに記載の製造方法。
(11) 該モノクローナル抗体が、 ヒトモノクローナル抗体であることを特徴 とする前記（1)乃至前記 (4)、前記 (6)または前記 (7)のいずれかに記載の製造方法。
(12) 該外来性 DN Aが、 さらに遺伝子増幅遺伝子を含むことを特徴とする 前記（1)乃至前記（11)のいずれかに記載の製造方法。
(13) 該遺伝子増幅遺伝子が、 ジヒドロ葉酸レダク夕一ゼ （DHFR) 遺伝子で あることを特徴とする前記（12)に記載の製造方法。
(14) 前記（1)乃至前記（13)のいずれかの方法により製造される形質転換細胞。 以下、 本発明で用いる語句の意味及び本発明の具体的態様を明らかにすること により本発明をさらに詳細に説明する。
本発明において 「哺乳動物」 とは、 ヒト、 ゥシ、 ヒッジ、 ブ夕、 ャギ、 ゥサギ、 ラッ ト、 ハムスター、 モルモッ ト、 及びマウスなどの哺乳動物を意味し、 さらに 後述する「ヒト抗体を産生する能力を有するトランスジエニック非ヒト哺乳動物」 も包含する。
本発明において 「非ヒ ト哺乳動物」 とは、 ヒト以外の哺乳動物を意味し、 具体 的には、 ゥシ、 ヒッジ、 ブ夕、 ャギ、 ゥサギ、 ラッ ト、 ハムスター、 モルモッ ト、 及びマウスなどの哺乳動物を意味し、 さらに後述する 「ヒト抗体を産生する能力 を有するトランスジエニック非ヒ卜哺乳動物」 も包含する。
本発明において 「抗原」 とは、 上記に哺乳動物の生体における免疫担当細胞が、 非自己と認識する任意の物質を意味し、 該生体にとって外来である外来性抗原及 び該生体が自己抗体を産生し得る該生体の任意の内因性物質を包含する。
該外来性抗原としては、 例えば、 種々のウィルス、 細菌、 細菌毒素及び化学物 質が挙げられ、 また、 該生体が、 特定の哺乳動物である場合には、 該生体と異な る個体あるいは異なる動物種に由来する任意の物質 （例えば、 組織、 細胞、 蛋白 質、 それらの断片、 体液など） が包含される。
内因性物質としては、 場合によっては該生体中で過剰に産生される種々のサイ トカイン、 成長因子、 ホルモン、 細胞表面分子 （例えば、 受容体、 チャンネル分 子、 シグナル伝達分子など） 、 自己反応性リンパ球などが挙げられる。
本発明において 「モノクローナル抗体」 とは、 前述の抗原に反応性を有する任 意のモノクローナル抗体である。
該 「モノクローナル抗体」 は、 前記の抗原を、 マウス、 ラッ ト、 ハムスター、 モルモッ トあるいはゥサギ等の哺乳動物に免疫して得られる天然型抗体、 後述す る遺伝子組換技術を用いて製造され得るキメラモノクロ一ナル抗体（キメラ抗体） 及びヒト型モノクローナル抗体（ヒト型抗体； CDR- grafted抗体）、 並びにヒト抗 体産生トランスジ Iニック動物等を用いて製造され得るヒトモノクローナル抗体 (ヒト抗体） も包含する。
また、 I g G UgGl , IgG2, IgG3，IgG4)、 I g M、 I g A、 I g Dあるいは I g E等のいずれのアイソタイプを有するモノクローナル抗体をも包含する。 好まし くは、 I g G ( IgGl, IgG2, IgG3, IgG4) または I g Mである。
本発明における 「モノクローナル抗体を分泌する細胞」 とは、 再配列 （rearra nged) された内在性 （endogenous) 免疫グロブリン重鎖遺伝子及び再配列された 内在性免疫グロプリン軽鎖遺伝子を有し、 該内在性免疫グロプリン重鎖遺伝子に 由来する免疫グロプリン重鎖ポリべプチド及び該内在性免疫グロプリン軽鎖遺伝 子に由来する免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドとからなるモノクローナル抗体を 分泌する任意の細胞である。
好ましくは、 下記に詳述される任意の 「モノクローナル産生不死化 B細胞」 で あり、 より好ましくはモノクローナル抗体産生 B細胞をミエローマ細胞などと細 胞融合して得られるハイプリ ドーマである。
本発明における 「モノクローナル抗体産生不死化 B細胞」 とは、 上述の哺乳動 物の生体が抗原により免疫感作されることにより該生体中に生ずる該抗原に対す るモノクローナル抗体を産生する B細胞、 並びに該 B細胞を所望の方法によって 不死化することにより製造される不死化 B細胞を意味する。
この 「モノクローナル抗体産生 B細胞」 及び 「モノクローナル抗体産生不死化 B細胞」 は、 既存の一般的な製造方法によって製造することができる。
即ち、 例えば、 抗原を、 必要に応じてフロイン トアジュバント （Freund' s Adj uvant) とともに、 哺乳動物、 好ましくは、 マウス、 ラッ ト、 ハムスター、 モルモ ヅ ト、 ゥサギ、 ネコ、 ィヌ、 ブ夕、 ャギ、 ゥマ、 ゥシあるいは後述のヒト抗体産 生トランスジエニック非ヒト哺乳動物のような他の動物由来の抗体を産生するよ うに作出されたトランスジヱニック非ヒト哺乳動物に免疫する。
免疫は、 該哺乳動物の皮下内、 筋肉内、 静脈内、 フッ ドパッ ド内あるいは腹腔 内に 1乃至数回注射するかあるいは移植することにより免疫感作を施す。
通常、 初回免疫から約 1乃至 1 4日毎に 1乃至 4回免疫を行って、 さらに必要 に応じ、モノクローナル抗体産生細胞の採取の前日または前々日にも免疫を行う。 前述の如く免疫感作された哺乳動物から常法に従って、 脾臓、 リンパ節、 骨髄 あるいは扁桃等、 好ましくは脾臓から、 抗体産生細胞である B細胞を回収する。 この抗体産生 B細胞を、 ケ一ラー及びミルシュ夕インらの方法 （Nature, Vol . 256, p. 95-497, 1975 )及びそれに準じる修飾方法に従って、好ましくはマウス、 ラッ ト、 モルモヅ ト、 ハムスター、 ゥサギまたはヒト等の哺乳動物、 より好まし くはマウス、 ラッ 卜またはヒト由来の自己抗体産生能のないミエ口一マ細胞との 細胞融合させて不死化してハイプリ ドーマとすることにより抗体産生不死化 B細 胞を得る。
細胞融合に用いられるミエローマ細胞としては、例えばマウス由来ミエ口一マ P 3/X63-AG8.653 (653； ATCC No. CRL1580) 、 P3/NSI/l-Ag4-l (NS- 1 ) 、 湖、 P3/X 63-Ag8. Ul (P3U1 ) 、 SP2/0-Agl4 ( Sp2/0、 Sp2) 、 PAI、 F0、 BW5147, ラッ ト由来 ミエローマ 210RCY3- Ag.2. 3.、 ヒト由来ミエ口一マ U- 266AR1、 GM1500- 6TG-A1- 2、 U C729 - 6、 CEM-AGR, D1R11あるいは CEM- T15を使用することができる。
上述のようにして作製されたモノクローナル抗体を産生するハイプリ ドーマ (モノクローナル抗体産生不死化 B細胞） のスクリーニングは、 ハイプリ ドーマ を、 例えばマイクロタイ夕一プレート中で培養し、 増殖の見られたゥヱルの培養 上清の前述のマウス免疫感作で用いた免疫抗原に対する反応性を、 例えば RI Aや E LISA等の酵素免疫測定法によつて測定することにより行なうことができる。
本発明における 「ヒ ト抗体」 あるいは 「ヒ ト免疫グロブリン」 とは、 前述した 免疫グロブリンを構成する H鎖の可変領域 （VH) 及び H鎖の定常領域 （CH) 並び に L鎖の可変領域 （VL) 及び L鎖の定常領域 （CJ を含む全ての領域がヒトイム ノグロプリンをコ一ドする遺伝子に由来するィムノグロプリンである。 換言すれ ば、 H鎖がヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子に由来し、 軽鎖がヒト免疫グロブリン 軽鎖遺伝子に由来するものである抗体を意味する。
ヒト抗体は、 常法に従って、 例えば、 少なくともヒトイムノグロブリン遺伝子 をマウス等のヒト以外の哺乳動物の遺伝子座中に組込むことにより作製されたト ランスジヱニック動物を、 抗原で免疫感作することにより、 前述したモノクロ一 ナル抗体の作製法と同様にして製造することができる。
例えば、 ヒト抗体を産生するトランスジヱニックマウスは、 既報（Nature Gene tics, Vol . 15 , p . 146-156 , 1997 ; Nature Genetics, Vol . 7, p. 13-21， 1994; 表 平 4- 504365号公報；国際出願公開 W094/25585号公報； 日経サイエンス、 6月号、 第 4 0〜第 5 0頁、 1 9 9 5年； Nature , Vol .368, p.856-859, 1994 ; 及び特表 平 6- 500233号公報） に記載の方法に従って作製することができる。
本発明のモノクローナル抗体の製造方法は、 下記工程 （a ) 及び （b ) の工程 からなる。
( a ) 再配列された内在性免疫グロプリン重鎖遺伝子及び再配列された内在性 免疫グロプリン軽鎖遺伝子を有し、 該内在性免疫グロプリン重鎖遺伝子に由来す る免疫グロプリン重鎖ポリぺプチド及び該内在性免疫グロプリン軽鎖遺伝子に由 来する免疫グロプリン軽鎖ポリべプチドとからなるモノクローナル抗体を分泌す る細胞に、 該免疫グロプリン重鎖ポリべプチドのアミノ酸配列と同一のアミノ酸 配列をコ一ドする遺伝子を含む外来性 D N Aを導入し、 該外来性 D N Aにより形 質転換された形質転換細胞を得る工程。
( b ) 該形質転換細胞を培養し、 細胞培養液中に分泌された該モノクローナル 抗体を取得する工程。
ここで 「免疫グロプリン重鎖ポリべプチドのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配 列をコードする遺伝子」 とは、 前述したモノクローナル抗体を産生する細胞 （好 ましくは、 抗体産生 B細胞、 抗体産生不死化 B細胞 （ハイプリ ドーマなど） ） が 有する内在性免疫グ口ブリン重鎖遺伝子によりコードされる免疫グロブリン重鎖 ポリべプチドのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードする遺伝子 （好まし くは cDNA) であり、 該 cDNAは、 既知の細胞工学技術及び遺伝子組換え技術を用い て常法に従って下記のようにして調製することができる。
( 1 ) 所望のモノクローナル抗体を産生するハイプリ ドーマから、 市販の試薬 (例えば、 FastTrack2. 0kit( INVITROGEN製） など） を用いて常法に従って PolyA +RNAの抽出、 精製する。 具体的には、 例えば、 下記のとおりである。
凍結して保存しておいたハイプリ ドーマを、 細胞溶解緩衝液 （Lysis Buffer) に溶解し、 市販の細胞溶解試薬 （例えば、 P0LYTR0Nなど） により細胞を破壊し、 可溶化する。 該可溶化物を適切な温度 （例えば、 約 45°C) でインキュベーション した後、 Ol igo(dT) cel luloseを加え適切な時間 （例えば、 約 1時間） 緩やかに 振盪する。
次いで、 Ol igo(dT) cel luloseを洗浄後、 PolyA+RNA を El lution Bufferで溶 出させる。 溶出した PolyA+RNAをエタノール沈殿させ、 適切量の Tris- EDTA緩衝 液に溶解する。 得られた PolyA+RNAの濃度を、 適切な波長 （例えば、 260nm) での 吸光度を測定することにより決定する。
( 2 ) 得られた PolyA+RNAを銪型とし、 市販の試薬 （例えば、 Marathon cDNA Amplification Kit (CLONTECH製） など） を用いて RACE- PCR法により常法により cDNAを合成する （「遺伝子増幅 PCR法 ·基礎と新しい展開」、 1992年第 2刷、 共立 出版株式会社発行、 ρ· 13-15)。 具体的には下記のとおりである、
適切量の精製 PolyA+RNA (例えば約 1乃至 5 g) を錶型として、 1st strand c DNA及び 2nd strand cDNAを順次合成する。該 c DNAを、 フエノール/クロ口ホル ム /ィソアミノアルコール並びにクロ口ホルムを用いて抽出に供する。次いで、 c DNAをェ夕ノ一ル沈殿させ、 アダプター DNAに連結する。得られた DNA反応物を適 切な濃度に希釈 （例えば、 1/250) したものを銪型とし、 該ハイプリ ドーマが産生 するモノクローナル抗体の重鎖の定常領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列 を基に設計したプライマ一及び該アダプター D N Aの塩基配列を基に設計したプ ライマーを用いて、 常法により PCRを行う。 得られた PCR産物をァガロースゲル 電気泳動で分画し、 cDNAを回収する。
( 3 ) 得られた該モノクローナル抗体の重鎖の全長あるいは一部のアミノ酸配 列をコードする cDNAの塩基配列を市販の試薬 （例えば、 Dye Terminator Cycle Sequence Kit (PE - Appl ied Biosystems製）、 及び PRISM377 DNA Sequencer (PE- Applied Biosystems製）) を用いて決定する。
( 4 ) 該モノクローナル抗体の重鎖の一部のアミノ酸配列をコードする cDNA の塩基配列を基に、 PCRにより該重鎖ポリべプチドのアミノ酸配列の全長をコー ドする cDNAが可能なように一対のプライマ一 DNAを合成し、該一対のプライマ一 を用いて、 前記の精製 PolyA+RNAを錶型として前記と同様に PCRを行し、 該重鎖 ポリぺプチドの全長をコードする cDNAを得る。
本発明のモノクローナル抗体の製造方法は、 上記で詳述した 「免疫グロブリン 重鎖ポリペプチドのァミノ酸配列と同一のァミノ酸配列をコードする遺伝子」を、 該免疫グロプリン重鎖ポリべプチドからなるモノクローナル抗体を分泌する細胞 (好ましくは該遺伝子の調製においてソースとしたモノクローナル抗体産生ハイ プリ ドーマ自体、 即ち、 上述のモノクローナル抗体産生 B細胞あるいは不死化 B 細胞と同義） に、 常法に従って遺伝子工学技術を用いて導入し、 該遺伝子により 形質転換された形質転換細胞を選別、 単離し、 該形質転換細胞を培養することに より細胞培養液中から該モノクローナル抗体を精製、 取得することからなる。 該細胞への該遺伝子 （例えば、 cDNA) の導入は、 該遺伝子を常法に従って該遺 伝子が宿主細胞中で発現可能なようにプラスミ ドベクター組み込み発現ベクター を作製し、 該発現ベクターで宿主細胞を形質転換することにより行う。
プラスミ ドに cDNAを組み込む方法としては、 例えば Maniatisらの方法 （Molecu lar Cloning, A Laboratory Manual , second edition, Cold Spring Harbor Lab oratory, p. 1.53, 1989) に記載の方法などが挙げられる。
プラスミ ドを宿主に導入する方法としては、 （Molecular Cloning, A Laborat ory Manual , second edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Vol .1.74, 198 9) に記載の塩化カルシウム法または塩化 カルシウム/塩化ルビジウム法、 エレ クトロポレーション法等が挙げられる。
本発明で使用されるべクタ一としては、 宿主細胞 （好ましくは真核細胞） 内で 複製保持または自己増殖できるものであれば特に制限されず、 プラスミ ドベクタ —およびファージベクターが包含される。
具体的には、 プラスミ ドとしては例えば、 pLS407N pBR322、 pBR325、 pUC12、 p UC13、 pUC19、 pSH19、 pSH15、 pUBllOヽ pTP5、 pC194、 pcD2、 pBSVヽ CMD、 pSV2、 さ らに pMAL C2、 pEF-BOS (ヌクレイックァシッドリサーチ （Nuc leic Ac id Researc h)、第 1 8卷、第 5 3 2 2頁、 1 9 9 0年等）あるいは pME18S (実験医学別冊「遺 伝子工学ハンドブック」 、 1 9 9 2年等） 等などが例示される。
また、 ファージとしては、 えファージなどのパクテリオファージが、 さらにレ トロウィルス、 ヮクシニヤウィルス、 核多角体ウィルスなどの動物や昆虫のウイ ルス （pVL1393、 インビトロゲン製） が例示される。
宿主細胞として細菌、 特に大腸菌を用いる場合、 一般に発現べクタ一は少なく ともプロモ一夕一一オペレーター領域、 開始コドン、 並びに上述の所望の免疫グ ロブリン重鎖 （IgH鎖） をコードする遺伝子、 終止コ ドン、 ターミネータ一領域お よび複製可能単位から構成される。
宿主として酵母、 動物細胞または昆虫細胞を用いる場合、 発現べクタ一は少な くともプロモーター、 開始コドン、 上述の所望の免疫グロブリン重鎖 （IgH鎖） を コードする遺伝子、 終止コドンを含んでいることが好ましい。
またシグナルペプチドをコードする D N A、 ェンハンサー配列、 上述の所望の 免疫グロブリン重鎖（IgH鎖） をコードする遺伝子をコードする遺伝子の 5，側お よび 3 ' 側の非翻訳領域、 スプライシング接合部、 ポリアデニレーション部位、 選択マーカ一領域または複製可能単位などを含んでいてもよい。
さらに、 目的に応じて通常用いられる遺伝子増幅遺伝子を含んでいてもよい。 哺乳動物細胞等の真核細胞で上述の所望の免疫グロプリン重鎖（IgH鎖）をコー ドする遺伝子を発現させるためのプロモー夕一としては、 例えば、 ニヮトリ由来 の /5ァクチンプロモー夕一、 SV40由来のプロモー夕一、 レトロウイルスのプロモ 一夕一、 ヒートショックプロモーターなどが挙げられる。 好ましくは、 ニヮトリ 由来の/?ァクチンプロモ一夕一、 SV40由来のプロモーター、 SV40、 レ トロウィル スのプロモーターである。 しかしながら、特にこれらに限定されるものではない。 また、 発現にはェンハンサ一の利用も効果的な方法であり、 好ましいェンハン サ一としては CMVェンハンサ一が挙げられる。 細菌中で上述の所望の免疫グロプリン重鎖（IgH鎖）をコードする遺伝子を発現 させるためのプロモ一夕——オペレータ一領域は、 プロモーター、 オペレーター 及び Shine- Dalgarno( SD ) 配列 （例えば、 MGGなど） を含むものである。例えば宿 主がェシエリキア属菌の場合、 好適には Trpプロモー夕一、 lacプロモーター、 re cAプロモーター、 え PLプロモーター、 lppプロモーター、 tacプロモーターなどを 含むものが例示される。
酵母中で上述の所望の免疫グロプリン重鎖（IgH鎖）をコードする遺伝子を発現 させるためのプロモ一夕一としては、 PH05プロモー夕一、 PGKプロモー夕一、 GAP プロモー夕一、 ADHプロモーターが挙げられ、 宿主がバチルス属菌の場合は、 SL0 1プロモー夕一、 SP02プロモーター、 penPプロモーターなどが挙げられる。
好適な開始コ ドンとしては、 メチォニンコドン （ATG) が例示される。
終止コドンとしては、 常用の終止コドン （例えば、 TAG、 TGA、 TAA) が例示され る。 夕一ミネ一夕一領域としては、 通常用いられる天然または合成の夕一ミネ一 夕一を用いることができる。
複製可能単位とは、 宿主細胞中でその全 D N A配列を複製することができる能 力をもつ D N Aを言い、 天然のプラスミ ド、 人工的に修飾されたプラスミ ド （天 然のプラスミ ドから調製された D N Aフラグメント） および合成プラスミ ド等が 含まれる。 好適なプラスミ ドとしては、 E. col i ではプラスミ ド p B R 3 2 2、 もしくはその人工的修飾物 （p B R 3 2 2を適当な制限酵素で処理して得られる D N Aフラグメント） が、 酵母では酵母 2〃プラスミ ド、 もしくは酵母染色体 D N Aが、 また哺乳動物細胞ではプラスミ ド pRSVneo ATCC 37198、 プラスミ ド pSV2 dhfr ATCC 37145, プラスミ ド pdBPV - MMTneo ATCC 37224、 プラスミ ド pSV2neo AT CC 37149等があげられる。
ェンハンサー配列、 ポリアデ二レーシヨン部位およびスプライシング接合部位 については、 例えばそれそれ SV40に由来するもの等、 当業者において通常使用さ れるものを用いることができる。 上述の発現ベクターの作製は、 上述のプロモーター、 開始コドン、 上述の IgH 鎖をコードする遺伝子及び/または夕一ミネ一夕一領域などを連続的かつ環状に 適当な複製可能単位に連結することによって調製することができる。またこの際、 所望により制限酵素での消化や T4 DNAリガーゼを用いるライゲーシヨン等の常法 により適当な D N Aフラグメント （例えば、 リンカ一、 他の制限酵素切断部位な ど） を用いることができる。
上述の発現ベクターで形質転換された宿主細胞、 即ち形質転換細胞の選別は、 該発現ベクターに所望の選択マーカ一 （例えば、 薬剤耐性遺伝子など） を挿入し ておき、 該形質転換細胞を、 該薬剤の存在下で培養することにより可能である。 選択マーカーとしては、通常使用されるものを常法により用いることができる。 例えばテトラサイクリン、 アンピシリン、 またはカナマイシン等の抗生物質耐性 遺伝子等が例示される。
上述の本発明のモノクローナル抗体の製造方法には、 上記発現ベクターに挿入 された上述した所望のモノクローナル抗体の重鎖ポリべプチドをコ一ドする遺伝 子とともに、 遺伝子増幅遺伝子を挿入しておくことにより、 該重鎖ポリペプチド をコードする遺伝子のコピー数を増幅させることにより、 該形質転換細胞による 所望のモノクローナル抗体の産生効率をさらに増大させる態様も本発明の態様と して包含する。
本発明において使用され得る遺伝子増幅遺伝子としては、 ジヒドロ葉酸レダク 夕一ゼ （DHFR) 遺伝子、 チミジンキナーゼ遺伝子、 ネオマイシン耐性遺伝子、 グ ル夕ミン酸合成酵素 （GS) 遺伝子、 アデノシンデァミナ一ゼ遺伝子、 オル二チン デカルボキシラ一ゼ遺伝子、 ヒグロマイシン一 B—ホスホトランスフェラーゼ遺 伝子、ァスパルラート 卜ランスカルバミラ一ゼ遺伝子等を例示することができる。 好ましくは、 DHFR遺伝子または GS遺伝子である。
本発明のモノクローナル抗体の製造方法において、 上記で詳述した 「免疫グロ ブリン重鎖ポリペプチドのァミノ酸配列と同一のァミノ酸配列をコ一ドする遺伝 子」 により形質転換される細胞 （宿主細胞） は、 即ち、 「該免疫グロブリン重鎖 ポリペプチドからなるモノクローナル抗体を分泌する細胞」 であれば、 いかなる 細胞でも良いが、 特に好ましくは該遺伝子の調製においてソースとしたモノクロ ーナル抗体産生ハイプリ ドーマ自体 （即ち、 上述のモノクローナル抗体産生 B細 胞あるいは不死化 B細胞と同義） である。
当該ハイプリ ドーマ以外の宿主細胞の例としては、 当該所望のモノクローナル 抗体を産生する限り、 天然細胞あるいは人工的に樹立された組換細胞など種々の 細胞 （例えば、 細菌 （ェシエリキア属菌、 バチルス属菌） 、 酵母 （サヅカロマイ セス属、 ピキア属など） 、 動物細胞または昆虫細胞などのいずれをも包含する。 当該所望のモノクローナル抗体を産生する細胞であれば、 当該細胞の起源が、 例えば、 大腸菌 （DH5ひ、 BU HB101等） 、 マウス由来細胞 （C0P、 L、 C127、 Sp2 /0、 NS-1または NIH3T3等） 、 ラット由来細胞 （PC12,PC12h)、 ハムスター由来細胞 (BHK及び CH0等） 、 サル由来細胞 （C0S1、 C0S3、 C0S7、 CV1及び Velo等） およびヒ ト由来細胞 （Hela、 2倍体線維芽細胞に由来する細胞、 ミエ口一マ細胞および He pG2等） などのいずれであっても良い。
上述した該所望の免疫グロプリンの重鎖をコードする遺伝子が挿入された発現 ベクタ一の宿主細胞への導入 （形質転換 （形質移入） ） は従来公知の方法を用い て行うことができる。
例えば、 動物細胞の場合は、 例えば Grahamの方法 (Virology, Vol.52, p.456, 1973) に従って、 細菌 （E.coli、 Bacillus subtilis 等） の場合は、 例えば Coh enらの方法（Pro Natl. Acad. Sci. USA.， Vol.69, p.2110, 1972) 、 プロ トプ ラス 卜法 （Mol. Gen. Genet., Vol.168, p. Ill, 1979) やコンビテント法 （J. M ol. Biol. , Vol.56, p.209, 1971) によって、 Saccharomyces cerevisiaeの場合 は、 例えば Hinnenらの方法 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol.75, p.1927, 1 978) やリチウム法 （J. Bacterid., Vol.153, p.163, 1983) によって、 昆虫細 胞の場合は、 例えば Summersらの方法 (Mol. Cell. Biol., Vol.3, p.2156-2165, 1983) によってそれぞれ形質転換することができる。
上述した本発明のモノクローナル抗体の製造方法における 「形質転換細胞」 で あって、 上述の所望の免疫グロプリンの重鎖をコードする遺伝子で形質転換され た形質転換細胞の培養は常法によって下記のように行うことができる。 当該培養 により、 細胞培養液中から所望モノクローナル抗体を得ることができる。
該所望の免疫グロプリンの重鎖をコ一ドする遺伝子で形質転換される細胞が、 該遺伝子の調製においてソースとしたモノクローナル抗体産生ハイプリ ドーマ自 体（上述のモノクローナル抗体産生 B細胞あるいは不死化 B細胞と同義）であり、 即ち、 得られる形質転換細胞が、 組換えハイプリ ドーマである場合には、 通常の ハイプリ ドーマの一般的な培養方法と同様にして行うことができる。
具体的には、 該組換えハイプリ ドーマを、 インビトロ、 またはマウス、 ラヅ ト、 モルモット、 ハムス夕一またはゥサギ等、 好ましくはマウスまたはラッ ト、 より 好ましくはマウスの腹水中等でのインビボで行い、 得られた培養上清、 または哺 乳動物の腹水から単離することにより行うことができる。
インビトロで培養する場合には、 培養する細胞種の特性、 試験研究の目的及び 培養方法等の種々条件に合わせて、 ハイプリ ドーマを増殖、 維持及び保存させ、 培養上清中にモノクローナル抗体を産生させるために用いられるような既知栄養 培地あるいは既知の基本培地から誘導調製されるあらゆる栄養培地を用いて実施 することが可能である。
基本培地としては、 例えば、 Hajn' F12培地、 MCDB153培地あるいは低カルシウム M E M培地等の低カルシウム培地及び MCDB104培地、 MEM培地、 D- MEM培地、 RPMI1 640培地、 ASF104培地あるいは RD培地等の高カルシウム培地等が挙げられ、該基本 培地は、 目的に応じて、 例えば血清、 ホルモン、 サイ ト力イン及び/または種々 無機あるいは有機物質等を含有することができる。
該組換えハイプリ ドーマからのモノクローナル抗体の単離、 精製は、 上述の培 養上清あるいは腹水を、 飽和硫酸アンモニゥム、 ユーグロブリン沈澱法、 力プロ イン酸法、 力プリル酸法、 イオン交換クロマトグラフィー （DEAEまたは DE52等）、 抗ィムノグロプリンカラムあるいはプロテイン Aカラム等のァフィニティカラム クロマトグラフィーに供すること等により行うことができる。
一方、 該所望の免疫グロプリンの重鎖をコードする遺伝子で形質転換される細 胞が、 上述した組換え蛋白の製造において一般的に使用される例えば、 C H O細 胞などの宿主細胞である場合には、 組換え蛋白の製造における一般的な培養方法 と同様にして行うことができる。
即ち、 該形質転換細胞を栄養培地で培養することによって製造することができ る。
栄養培地は、 宿主細胞 （形質転換体） の生育に必要な炭素源、 無機窒素源もし くは有機窒素源を含でいることが好ましい。炭素源としては、例えばグルコース、 デキス トラン、 可溶性デンプン、 ショ糖などが、 無機窒素源もしくは有機窒素源 としては、 例えばアンモニゥム塩類、 硝酸塩類、 アミノ酸、 コーンスチープ - リ カー、 ペプトン、 カゼイン、 肉エキス、 大豆粕、 バレイショ抽出液などが例示さ れる。 また所望により他の栄養素 （例えば、 無機塩 （例えば塩化カルシウム、 リ ン酸ニ水素ナトリウム、 塩化マグネシウム） 、 ビタミン類、 抗生物質 （例えばテ トラサイクリン、 ネオマイシン、 アンピシリン、 カナマイシン等） など） を含ん でいてもよい。
培養は当業界において知られている方法により行われる。 培養条件、 例えば温 度、 培地の p Hおよび培養時間は、 該形質転換細胞から本発明の所望のモノクロ ーナル抗体が大量に生産されるように適宜選択される。
なお、 下記に宿主細胞に応じて用いられる具体的な培地および培養条件を例示 する力 何らこれらに限定されるものではない。
宿主が細菌、 放線菌、 酵母、 糸状菌である場合、 例えば上記栄養源を含有する 液体培地が適当である。 好ましくは、 pHが 5〜8である培地である。
宿主が E. coliの場合、 好ましい培地として LB培地、 M9培地 （Mil lerら、 Exp. Mol. Genetヽ Cold Spring Harbor Laboratory, p.431, 1972)等が例示される。 かかる場合、 培養は、 必要により通気、 撹拌しながら、 通常 14〜43° (：、 約 3〜24 時間行うことができる。
宿主が Bacillus属菌の場合、 必要により通気、 撹拌をしながら、 通常 30〜40°C、 約 16〜96時間行うことができる。
宿主が酵母である場合、 培地として、 例えば Burkholder最小培 （Bostian, Pro c. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.77, p. 505, 1980)が挙げられ、 pHは 5〜 8であ ることが望ましい。培養は通常約 20〜35°Cで約 14~144時間行なわれ、必要により 通気や撹拌を行うこともできる。
宿主が動物細胞の場合、 培地として例えば約 5〜20%の胎児牛血清を含む MEM 培地 (Science, Vol.122, p.501， 1952)、 DMEM培地 (Virology, Vol.8， p.396,
1959) 、 RPMI1640培地 （J. Am. Med. Assoc., Vol.199, p.519, 1967) 、 199培 地（proc. Soc. Exp. Biol. Med., Vol.73, p.l, 1950)等を用いることができる。 培地の pHは約 6〜 8であるのが好ましく、 培養は通常約 30〜40°Cで約 15〜72時間 行なわれ、 必要により通気や撹拌を行うこともできる。
宿主が昆虫細胞の場合、 例えば胎児牛血清を含む Grace's 培地 （Pro Natl. Acad. Sci. USA, Vol.82, p.8404, 1985) 等が挙げられ、 その pHは約 5〜8であ るのが好ましい。培養は通常約 20〜40°Cで 15〜100時間行なわれ、必要により通気 や撹拌を行うこともできる。
本発明における所望のモノクローナル抗体は、 そのようにして培養された形質 転換細胞の培養上清中から上述したモノクローナル抗体の一般的な精製方法によ り得ることができる。 図面の簡単な説明
図 1は、 発現ベクター PDH502の構造及び制限酵素地図を模式的に示す図。
図 2は、 組換えハイプリ ドーマによる抗ヒト IL- 8モノクローナル抗体の産生量 を示す図。
縦軸は、 モノクローナル抗体の産生量を示し、 横軸はマイクロプレート中の各 ゥエルの各組換えハイプリ ドーマクローンの種類を示す。 発明を実施するための最良の形態
以下、 実施例を以つて本発明をさらに詳細に説明するが、 本発明が該実施例に 記載される態様のみに限定されるものではないことは言うまでもない。
実施例 1 モノクローナル抗体産生ハイプリ ドーマの調製
既報に記載されるヒト IL- 8に対するヒトモノクローナル抗体を産生するハイブ リ ドーマを以下の試験において用いた (Nature genetics Vol .15 , p. 146-156, 1 997、 及び国際特許出願公開 W096/33735号公報） 。
なお、 該ハイプリ ドーマは、 下記のように製造されだ。
マウスの重鎖及び軽鎖の各々の内在性遺伝子座を不活性化し、 且つヒト免疫グ ロブリンの重鎖 （C〃及び (：ァ2) 及び軽鎖 （ ） の各々遺伝子座を含む DNAをマウ スの内在性ゲノムに組み込むことにより作製したヒト IgG2/ A7モノクローナル抗 体を産生する既報のトランスジヱニックマウスを被免疫動物として用いた（Natur e Genetics, Vol .15, p. 146-156, 1997; Nature Genetics, Vol .7, p.13-21, 19 94; 表平 4- 504365号公報；国際出願公開 W094/25585号公報； 日経サイエンス、 6 月号、 第 4 0〜第 5 0頁、 1 9 9 5年； Nature, Vol .368, p.856- 859, 1994; 及 び特表平 6- 500233号公報）
該ヒト IgG2/ 抗体産生トランスジエニックマウス （8乃至 10週齢） に、 組換え ヒト IL-8 (25〃g)を完全フロインドアジュバン卜とともに腹腔内投与して初回免 疫した。初回免疫から 2週間毎に、該 IL- 8を不完全フロインドアジュバン卜ととも に追加免疫 （3回） し、 以下の細胞融合の 4日前に最終免疫した。
最終免疫の後、 該被免疫マウスの脾臓及びリンパ節を採取してリンパ球 （抗体 産生 Bリンパ球を含む） を回収した。 該抗体産生リンパ球を、 常法に従って、 い ずれの自己抗体をも産生しないマウスミエローマ細胞 （NS0- bsl2細胞株） と細胞 融合した。細胞融合により得られるハイプリ ドーマを常法に従って HAT選択法によ り選別した。
得られたハイプリ ドーマが産生するヒトモノクローナル抗体のヒト IL_8に対す る反応性の有無を、常法に従って ELISAにより測定し、抗ヒト IL-8ヒ トモノクロ一 ナル抗体を産生する複数のハイプリ ドーマを得た。 各々のハイプリ ドーマは凍結 保存された。
実施例 2 モノクローナル抗体産生ハイプリ ドーマからの内在性 IgH遺伝子の単 離
上記のようにして調製した抗ヒト IL-8ヒト IgG2 / モノクローナル抗体産生ハ イブリ ドーマ （クローン ： K2.2. 1 ) の凍結細胞を、 細胞溶解緩衝液 （Lysis Buff er) に溶解し、 P0LYTR0Nにより細胞を破壊し、 可溶化させた。
次いで、 該細胞可溶化物から、 市販の RNA抽出キッ ト (FastTrack2.0kit( INVIT R0GEN製） ） を用いて PolyA+RNAを抽出、 精製した。
該細胞可溶化物を 45°Cでィンキュベ一シヨンした後、 Ol igo(dT) celluloseを加 え約 1時間緩やかに振盪した。 次いで、 Oligo( dT ) cel luloseを洗浄後、 PolyA+RN A を El lution Bufferで溶出させた。 溶出した PolyA+RNAをエタノール沈殿させ、 T ris-EDTA緩衝液に溶解した。 得られた PolyA+RNAの濃度を、 260nmの波長での吸光 度を測定することにより決定した。
得られた PolyA+RNAを錡型とし、 市販の Marathon cDNA Amplification Kit (C LONTECH製） を用いた RACE- PCR法により常法により cDNAを合成した （「遺伝子増 幅 PCR法 ·基礎と新しい展開」、 1992年第 2刷、 共立出版株式会社発行、 p. l3-15)c 即ち、 該ハイプリ ドーマから精製した PolyA NA ( 1乃至 5〃g) を銪型として、 1 st strand cDNA及び 2nd strand cDNAを順次合成した。 該 c DNAを、 フエノール /クロロホルム/ィソァミノアルコール並びにクロ口ホルムを用いて各々 1回ず つ抽出に供した。 次いで、 cDNAをエタノール沈殿させ、 該キッ 卜に付属のァダプ 夕一 DNAに連結させた。
得られた DNA反応物の希釈物を鎵型とし、 合成プライマーを用いて常法により 5' RACE-PCRを行い内在性免疫グロプリン重鎖ポリべプチドの一部をコ一ドする c DNAを調製した。 該 PCRには免疫グ口ブリン重鎖定常領域のァミノ酸配列をコ一 ドする塩基配列を基に設計したプライマー HG2-3- 437 (配列番号 3 )及び該ァダブ 夕一 DNAの塩基配列を基に設計したプライマ一を用いた。
PCR産物をァガロースゲル電気泳動で分画し、 DNAを回収した。 得られた cDNA の塩基配列の決定を、 市販の DyeTerminator Cyc le Sequencing FS Kit (PE-Appl ied B iosystems製） 及び PRISM377 DNA Sequencer (PE - Appl ied Biosystems製） を用いて行った。 なお、 本配列決定のための Sequencing Primerは、 前述の PCR において使用したプライマーを使用した。
決定した該免疫グロプリンの重鎖ポリべプチドの一部をコードする cDNAの塩 基配列 （翻訳開始点の付近の塩基配列を含む） を基に、 一対のプライマー VH4-21
(配列番号 4 ) 及び CG2- 1 (配列番号 5 ) を合成した。 この一対のプライマーを 用いて、 上述と同様にしてさらに PCRを行った。 得られた PCR産物から上述と同 様にして得た cDNAの塩基配列を上述と同様にして決定し、該ハイプリ ドーマ K2. 2. 1が産生する抗ヒト IL- 8ヒトモノクローナル抗体の重鎖ポリペプチド （IgH) の全長をコードする cDNAを得た （塩基配列：配列番号 1、 及びアミノ酸配列配列 番号 2 )。
実施例 3 ハイプリ ドーマ K2.2. 1への IgH cDNAの導入、 及び組換えハイプリ ドー マによるモノクローナル抗体の製造
前記で得たハイプリ ドーマ K2. 2. 1が分泌する抗ヒト IL- 8ヒ 卜モノクローナル抗 体の重鎖ポリペプチド （IgH) の全長をコードする cDNA (配列番号 1 ) を、 常法に 従って DNAリガーゼを用いて、 CMVェンハンザ一/ニヮトリ Bァクチンプロモ一夕一 及び DHFR遺伝子を保持するプラスミ ド PLS407の EcoRI制限酵素部位に挿入、連結し、 発現ベクター PDH502を作製した （図 1 ) 。 該 DHFR遺伝子は、 マーカー遺伝子であると同時に遺伝子増幅遺伝子であり、 該 遺伝子の存在により該発現べクタ一による形質転換細胞の選別は、 該細胞をメソ トレキセィ ト （MTX) 存在下で培養することにより可能となる。
該 IgH遺伝子発現ベクター pDH502を、エレク トロポレーシヨンによりハイプリ ド 一マ K2.2. 1に導入した。 次いで、 該ハイプリ ドーマを、 選択培地 （IMDM (JRH BI OSCUENCE )； 10%FBS及び 300mM MTXを含有） 中で培養し、 生育した約 100個の形質転 換体 （組換えハイプリ ドーマ） を選別、 取得した。 該選別した各々の組換えハイ ブリ ド一マを、 96ウェルマイク口プレート中で培養した。
各ゥヱル中で培養されている各々の形質転換体 （組換えハイプリ ドーマ） の培 養上清中に産生されるヒトモノクローナル抗体 （IgG2) の量を常法に従って、 サ ンドイッチ ELISAにより測定した。 なお、 固相抗体 （一次抗体） として抗ヒト IgG (Fc ) (Organon Teknika製） を、 検出抗体（二次抗体） として西洋ヮサビペルォキ シダーゼ （HRP) で標識した抗ヒト Ig c抗体 （PHOTOS IMMUNORE SEARCH製） を用い た。 また、 対照標準品としてヒト IgG/ (The Binding Site) を用いた。
結果を図 2に示す。
その結果、 親株ハイプリ ドーマである K2.2. 1のほとんどのクローンのモノクロ —ナル抗体の産生量が極めて低い値であるのに対し、 組換えハイプリ ドーマのほ とんどのクローンにおいて、 有意なモノクローナル抗体の産生量の増大が認めら れた。
また、 該組換えハイブリ ド一マのいくつかのクローンのモノクローナル抗体の 産生量を表 1に示す。 表 1
組換えハイプリ ドーマの抗体生産性
Figure imgf000027_0001
*印 ：後にサフ"ク 11-ニンク"及び MTX選択した, 次に、 組換えハイプリ ドーマクローンの中で、 特に高濃度のモノクロ一ナル抗 体の産生を示したクローン （クローン No. 12、 15、 41、 89) を、 限界希釈法により サブクローニングしてサブクローンド （sub- c loned) 組換えハイプリ ドーマを得 た （クローン No. 12-6、 15-4、 15-12、 41-2, 及び 89- 5 ) 。 各々の sub- c loned組換 えハイプリ ドーマのモノクローナル抗体の産生量を、上述と同様の EL ISAにより測 定した。 結果を表 2 (上段） に示す。
表 2
Figure imgf000028_0001
その結果、 各々の sub-cloned組換えハイブリ ドーマのモノクローナル抗体の産 生量は、 親組換えハイプリ ドーマのそれに比べ有意に高い値であった。 例えば、 親組換えハイプリ ドーマ （No.15) の抗体産生量は、 約 37.3〃g/mlであったのに対 し、 該親株からサブクローニングした組換えハイプリ ドーマ （No.15- 4)の抗体産 生量は、 約 95.3〃g/mlに増大した。
実施例 4 遺伝子増幅を施した組換えハイプリ ドーマからのモノクローナル抗体 の製造
DHFR遺伝子による IgH遺伝子の増幅のモノクローナル抗体の産生効率上昇に対 する効果の有無を検討した。
前記で作製した sub- cloned組換えハイプリ ドーマ （クローン No.12-6 15-4 1 5-12 4卜 2、 及び 89- 5) の各々を、 1 2または 5 /Mのメ ト トレキセート （MTX) を含む栄養培地中でさらに培養して MTX耐性細胞株を選択、 取得した。
各々の sub- cloned組換えハイプリ ドーマから、 下記 MTX耐性細胞株を取得した。 くクローン Νο.12-6> クローン No.12- 5/ - 96- 8 くクローン Νο· 15- 4> クローン No.15- 1 - 82-1
<クローン No. 15- 12 > クローン No. 15- 1 -87 - 4
<クロ一ン No.4卜 2〉 クローン No.41- 2 /- 75-4
くクローン No.89- 5 > クローン No.89-2//- 2- 5、 及び 89- 2 - 33- 12 各々の MTX耐性組換えハイプリ ドーマクローンのモノクローナル抗体の産生量 を、 前記と同様のサンドィツチ ELISAにより測定した。 結果を前記表 2 (下段） に 示した。
その結果、 MTX選択した各々の組換えハイプリ ドーマの 1細胞数当りのモノクロ ーナル抗体の産生効率は、 MTX選択する前（DHFRによる遺伝子増幅前）のそれに比 ベ低いものの、 IgH遺伝子で形質転換する前の野生型親ハイプリ ドーマ K2.2.1のモ ノクローナル抗体の産生量が極めて低い （図 2 ) ことを考慮すると、 該 MTX選択し た組換えハイプリ ドーマのモノクローナル抗体の産生効率は、 該野生型親ハイプ リ ドーマのそれに比べ有意に増大していた。 産業上の利用の可能性
以上述べたように、 本発明の方法を用いれば、 医薬品として有用なモノクロ一 ナル抗体の製造において、 モノクローナル抗体産生細胞によるモノクロ一ナル抗 体の産生量を簡便に有意に増大させることが可能となる。
特に、 モノクローナル抗体の製造において一般的に用いられるモノクローナル 抗体産生不死化 B細胞 （ハイプリ ドーマ） のモノクローナル抗体の産生効率が、 内在性 IgH遺伝子の発現の不安定さまたは低発現性に依存して低い場合には、本発 明の方法を用いることにより該親ハイプリ ドーマのモノクローナル抗体の分泌量 を有意に増大させることが可能である。
従って、 本発明のモノクローナル抗体の製造方法及び該方法により得られるモ ノクローナル抗体産生形質転換細胞 （組換え細胞） は、 抗体医薬品の製造におい て極めて有用な手段である。

Claims

請求の範固
1 . モノクローナル抗体の製造方法であって、 下記工程：
( a ) 再配列された内在性免疫グロプリン重鎖遺伝子及び再配列された内在性 免疫グロプリン軽鎖遺伝子を有し、 該内在性免疫グロプリン重鎖遺伝子に由来す る免疫グロプリン重鎖ポリぺプチド及び該内在性免疫グロプリン軽鎖遺伝子に由 来する免疫グロブリン軽鎖ポリペプチドとからなるモノクローナル抗体を分泌す る細胞に、 該免疫グロプリン重鎖ポリぺプチドのァミノ酸配列と同一のァミノ酸 配列をコードする遺伝子を含む外来性 D N Aを導入し、 該外来性 D N Aにより形 質転換された形質転換細胞を得る工程；及び
( b ) 該形質転換細胞を培養し、 細胞培養液中に分泌された該モノクローナル 抗体を取得する工程、
からなることを特徴とするモノクローナル抗体の製造方法。
2 . 該免疫グ口ブリン重鎖ポリペプチドのァミノ酸配列と同一のァミノ酸配列 をコードする遺伝子が、 該内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子と同一の塩基配列を 有する遺伝子であることを特徴とする請求項 1に記載の製造方法。
3 . 該細胞が、 哺乳動物の B細胞に由来する不死化 B細胞であることを特徴と する請求項 1または請求項 2に記載の製造方法。
4 . 該不死化 B細胞が、 該 B細胞をミエローマ細胞または組換えミエローマ細 胞と融合することにより得られる融合細胞であることを特徴とする請求項 3に記 載の製造方法。
5 . 該哺乳動物が、 非ヒト哺乳動物であることを特徴とする請求項 3または請 求項 4に記載の製造方法。
6 . 該哺乳動物が、 ヒトであることを特徴とする請求項 3または請求項 4に記 載の製造方法。
7 . 該哺乳動物が、 ヒト抗体を産生する能力を有する トランスジエニック非ヒ ト哺乳動物であることを特徴とする請求項 3または請求項 4に記載の製造方法。
8 . 該内在性免疫グロプリン重鎖遺伝子が、 ヒト免疫グロプリン重鎖遺伝子で あることを特徴とする請求項 1乃至請求項 4、 請求項 6または請求項 7のいずれ かに記載の製造方法。
9 . 該内在性免疫グロプリン軽鎖遺伝子が、 ヒト免疫グロプリン軽鎖遺伝子で あることを特徴とする請求項 1乃至請求項 4、 請求項 6または請求項 7のいずれ かに記載の製造方法。
1 0 . 該モノクローナル抗体が、 非ヒト哺乳動物のモノクローナル抗体である ことを特徴とする請求項 1乃至請求項 5のいずれかに記載の製造方法。
1 1 . 該モノクローナル抗体が、 ヒトモノクローナル抗体であることを特徴と する請求項 1乃至請求項 4、 請求項 6または請求項 7のいずれかに記載の製造方 法。
1 2 . 該外来性 D N Aが、 さらに遺伝子増幅遺伝子を含むことを特徴とする請 求項 1乃至請求項 1 1のいずれかに記載の製造方法。
1 3 . 該遺伝子増幅遺伝子が、 ジヒドロ葉酸レダク夕ーゼ （DHFR) 遺伝子であ ることを特徴とする請求項 1 2に記載の製造方法。
1 4 . 請求項 1乃至請求項 1 3のいずれかの方法により製造される形質転換細 胞。
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