[go: up one dir, main page]

WO2000053678A1 - Laser-kompatible nir-marker-farbstoffe - Google Patents

Laser-kompatible nir-marker-farbstoffe Download PDF

Info

Publication number
WO2000053678A1
WO2000053678A1 PCT/DE2000/000802 DE0000802W WO0053678A1 WO 2000053678 A1 WO2000053678 A1 WO 2000053678A1 DE 0000802 W DE0000802 W DE 0000802W WO 0053678 A1 WO0053678 A1 WO 0053678A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
laser
marker dyes
dyes according
compatible
compatible nir
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/DE2000/000802
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Peter Czerney
Frank Lehmann
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Dyomics GmbH
Original Assignee
Dyomics GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dyomics GmbH filed Critical Dyomics GmbH
Priority to DE10080558T priority Critical patent/DE10080558B4/de
Publication of WO2000053678A1 publication Critical patent/WO2000053678A1/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
    • C09B23/00—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes
    • C09B23/02—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes the polymethine chain containing an odd number of >CH- or >C[alkyl]- groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
    • C09B23/00—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes
    • C09B23/10—The polymethine chain containing an even number of >CH- groups

Definitions

  • the invention relates to so-called laser-compatible NIR marker dyes based on polymethines for use in optical, in particular fluorescence-optical, determination and detection methods.
  • Typical procedural applications are based on the reaction of dye-labeled antigens, antibodies or DNA segments with the respective complementary species. Possible applications arise, for example, in medicine and pharmacy, in bio and material science, in environmental control and the detection of organic and inorganic micro samples occurring in nature or technology, and much more.
  • Polymethines have long been known as NIR markers and are characterized by intensive absorption maxima that can be easily shifted into the NIR range (Fabian, J .; Nakazumi, H .; Matsuoka, M .: Chem.- Rev. 1992, 92, 1 197). With a suitable substituent pattern and ⁇ -electron system, they fluoresce with sufficient quantum efficiency even in the NIR range.
  • these compounds are widely used in various areas of technology, as sensitizers in AgX materials, as laser dyes, as quantum numbers, as indicator dyes in sensor technology and not least as biomarkers ("Near-Infrared Dyes for High Technology Applications") by Daehne, S .; Resch-Genger, U .; Wolfbeis, O.-S., Kluwer, Academic Publishers - Dordrecht / Boston / London - 1998.
  • biomarkers Near-Infrared Dyes for High Technology Applications
  • trimethine Cy3 derived from astraphloxin (DE 41 5 534), or the vinylogous pentamethine Cy5 and the double vinylogous heptamethine Cy7 with absorption maxima at approx. 550 nm, approx. 650 nm and approx. 750 nm have been found ( No. 5,627,027)
  • polysulfonated trimethine Cy3.5 and pentamethine Cy5.5 derived from the commercial heptamethine "Indocyanine Green" or "Cardio Green" are available (US Pat. No.
  • NIR polymethines used technically as biomarkers
  • a major disadvantage of the NIR polymethines used technically as biomarkers is that with increasing the length of the polymeth in chain there are increasing nudeopile or electrophilic attack possibilities on the chain, as a result of which the ⁇ system is destroyed.
  • the biomarkers suitable for "multiple color fluorescence assays” can only be excited by discrete light sources (such as those mentioned above) specified by the ⁇ system of the polymethine.
  • discrete light sources such as those mentioned above
  • Cy5 is excited by an argon laser, for example with the aid of Energy transfer via the excitation of fluorescein - »rhodamine -> Texas Red -> Cy5 causes an emission via the excitation of light at the border to the NIR range (US Pat. No. 5,800,996).
  • Glazer (US Pat. No. 5,760,201) provides another example of the excitation of pentamethines which are not absorbable per se at 488 nm.
  • a strong affinity for DNA is also achieved (specific ion binding).
  • a corresponding process effort for excitation is essential.
  • Further disadvantages of these marker dyes are inadequate photo or storage stability, in complex synthesis and purification steps, in low absorption coefficients or an unsatisfactory fluorescence quantum yield as well as in undesired changes in the optical properties in the presence of proteins or nucleic acid oligomers or after binding to them.
  • the invention is based on the object of creating NIR marker dyes based on polymethine with high photo and storage stability and high fluorescence yield which are as simple as possible by laser radiation in the visible or in the near IR spectral range, in particular with light from an argon -, helium / neon or diode lasers can be excited to fluoresce.
  • marker dyes based on polymethines are used, the substituted benzooxazole, benzothiazole, 2,3,3-trimethylindolenine, 2,3,3-trimethyl-4,5-benzo-3 / - / - indolenine -, 2- and 4-picoline, lepidine, quinaldine and 9-methylacridine derivatives of the general formulas la or Ib or Ic
  • X or Y represents an element from the group 0, S, Se or the structural element N-alkyl or C (alkyl) 2 ,
  • R 1 - R 15 are the same or different and are hydrogen, one or more alkyl or aryl, heteroaryl or heterocycloaliphatic radicals, a hydroxy or alkoxy group, an alkyl-substituted or cyclic amine function and / or two or / io radicals, z.
  • R 2 and R 3 together can form a further aromatic ring,
  • At least one of the substituents R 1 -R 15 can be an ionizable or ionized substituent, such as SO 3 " , PO 3 ⁇ , COO " or NR 3 + , which determines the hydrophilic properties of these dyes,
  • At least one of the substituents R 1 - R 15 can represent a reactive group which enables the dye to be covalently linked to the abovementioned carrier molecules and
  • U-V or U'-V are the same or different and can consist of hydrogen, a saturated aliphatic, heteroaliphatic or a lactone or thiolactone group.
  • the functional groups of these markers activated against nucleophiles are able to covalently couple to an OH, NH 2 or SH function. This creates a system for the qualitative or quantitative determination of organic and inorganic materials, such as said proteins, nucleic acids, DNA, biological cells, lipids, pharmaceuticals or organic or inorganic polymers.
  • This coupling reaction can be carried out in aqueous or predominantly aqueous solution and preferably at room temperature. This creates a conjugate with fluorescent properties.
  • Both the compounds of the general formulas la or Ib or Ic and systems derived therefrom can be used in optical, in particular fluorescence-optical, qualitative and quantitative determination methods for the diagnosis of cell properties, in biosensors (point of care measurements), genome research and in miniaturization technologies. Typical applications are in cytometry and cell sorting, fluorescence correlation spectroscopy (FCS), in ultra high throughput screening (UHTS), in multicolor fluorescence in situ hybridization (FISH) and in microarrays (gene chips) .
  • FCS fluorescence correlation spectroscopy
  • UHTS ultra high throughput screening
  • FISH multicolor fluorescence in situ hybridization
  • microarrays gene chips
  • non-symmetrical polymethines which on the one hand have an easily derivatizable heterocycle of the pyridine, quinoline, indole, heteroindole or acridine derivative type as well as a novel 6-ring heterocycle as the terminal function, achieves the following advantages in particular:
  • trimethines absorb in the spectral range> 650 nm and show a significantly improved photochemical and thermal stability compared to the previously known polymethines with absorption maxima> 650 nm (penta- and hepta-methines).
  • "Molecular engineering" makes it possible to control the position and intensity of the absorption and emission maxima as desired and to adapt them to the emission wavelengths of different excitation lasers, especially NIR laser diodes. Due to the selection of suitable terminal heterocycles, the dyes according to the invention show additional absorption maxima in the visible or NIR -Spectral range used for excitation, for example with an argon laser can be used. These dyes are particularly suitable for use in “multiple color fluorescence assays”.
  • the marker dyes can be prepared by a relatively simple synthesis which can be carried out in two stages and with which a multitude of differently functionalized dyes, for example with regard to the total charge of the dye and the number, specificity and reactivity of the activated groups used for immobilization, are made available in an application-specific manner can.
  • Fig. 2 Synthesis according to embodiment 3
  • Fig. 3 Synthesis according to embodiment 4 to 6
  • Fig. 10 Emission spectrum of C 1591 (free, bound, 670 nm diode laser)
  • Fig. 1 1 Emission spectrum of C 1591 (free, bound, 488 nm Ar ion laser)
  • Formula 1 a or 1 b are dissolved in 40 ml of acetic anhydride and briefly heated with 2.0 g of triethoxymethane. The precipitate that precipitates after about an hour is filtered off and recrystallized from glacial acetic acid.
  • FIG. 5 shows the absorption spectrum of C 1601 in pure PBS (phosphate buffer saline) and after the addition of albumin from human serum (HSA).
  • FIG. 9 shows the absorption spectrum of an activated C 1 591 NHS ester and C 1591 covalently tied to HSA.
  • PBS phosphate buffer saline
  • FIG. 10 shows the emission spectrum of an activated C 1591 NHS ester and C 1591 covalently bound to the HSA.
  • a 670 nm diode laser (Spindler & Hoyer, power max. 3 mW) was used for excitation.
  • PBS was used as the solvent for both measurements.
  • a 488 nm Ar ion laser (Ion Laser Technology, max. Power 100 mW) was used for excitation.
  • PBS was used as the solvent for both measurements.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Indole Compounds (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

Die Erfindung betrifft sogenannte Laser-kompatible NIR-Marker-Farbstoffe auf der Basis von Polymethinen zur Verwendung in optischen, insbesondere fluoreszenz-optischen, Bestimmungs- und Nachweisverfahren, beispielsweise in der Medizin, in der Pharmazie sowie in der Bio-, Material- und Umweltwissenschaft. Aufgabe war es, NIR-Marker-Farbstoffe auf Polymethin-Basis mit hoher Photo- und Lagerstabilität sowie hoher Fluoreszenzausbeute zu schaffen, die auf möglichst einfache Weise durch Laserstrahlung im sichtbaren oder NIR-Spektralbereich, insbesondere mit Licht eines Argon-, Helium/Neon- oder Diodenlasers, zur Fluoreszenz angeregt werden können. Erfindungsgemäss werden Farbstoffe auf der Basis von Polymethinen der allgemeinen Formel (I) eingesetzt.

Description

Laser-kompatible NIR-Marker-Farbstoffe
Die Erfindung betrifft sogenannte Laser-kompatible NIR-Marker-Farbstoffe auf der Basis von Polymethinen zur Verwendung in optischen, insbesondere fluoreszenz- optischen, Bestimmungs- und Nachweisverfahren. Typische Ver ahrensanwendungen beruhen auf der Reaktion von farbstoffmarkierten Antigenen, Antikörpern oder DNA-Segmenten mit der jeweils komplementären Spezies. Einsatzmöglichkeiten ergeben sich beispielsweise in der Medizin und der Pharmazie, in der Bio- und Materialwissenschaft, bei der Umweltkontrolle und dem Nachweis von in Natur oder Technik vorkommenden organischen und anorganischen Mikroproben sowie anderes mehr.
Polymethine sind als NIR-Marker seit langem bekannt und zeichnen sich durch intensive, leicht in den NIR-Bereich verschiebbare Absorptionsmaxima aus (Fabian, J.; Nakazumi, H.; Matsuoka, M.: Chem.- Rev. 1992, 92, 1 197). Bei geeignetem Substituentenmuster und π-Elektronensystem fluoreszieren sie mit ausreichender Quantenausbeute auch im NIR-Bereich. Entsprechend finden diese Verbindungen breite Anwendung in verschiedenen Bereichen der Technik, als Sensibilisatoren in AgX-Materialien, als Laserfarbstoffe, als Quantenzahler, als Indikator-Farbstoffe in der Sensorik und nicht zuletzt als Biomarker („Near-Infrared Dyes for High Technology Applications", herausgegeben von Daehne, S.; Resch-Genger, U.; Wolfbeis, O.-S., Kluwer, Academic Publishers - Dord recht/Boston/ London - 1998). Die Anzahl der als Biomarker verwendeten Polymethine ist begrenzt. Breite kommerzielle Anwendung haben in diesem Sinne bisher nur das sich vom Astraphloxin (DE 41 5 534) abgeleitete Trimethin Cy3, bzw. das vinyloge Pentamethin Cy5 und das doppelt vinyloge Heptamethin Cy7 mit Absorptionsmaxima bei ca. 550 nm, ca. 650 nm und ca. 750 nm gefunden (US- PS 5 627 027). Darüber hinaus wird das polysulfonierte, vom kommerziellen Heptamethin " Indocyaningreen " bzw. "Cardio Green " abgeleitete Trimethin Cy3.5 und Pentamethin Cy5.5 angeboten (US-PS 5 569 766). In der Polymethinkette aliphatisch verbrückte Heptamethine wurden von Patonay entwickelt (US- PS 5 800 995). Charakteristisch für alle kommerziellen Biomarker sind die sich vom Inden (Fischer-Base) bzw. Heteroinden ableitenden terminalen Heteroaromaten. Werden methylsubstituierte Cycloimonium-Salze dieses Typs als terminale Polymethin-Bausteine verwendet, so ist es notwendig, mindestens fünf aufeinander folgende sp2-hybridisierte Kohlenstoffatome (Pentamethine) zwischen den Hetero- cyclen anzuordnen um Absorptionsmaxima an der Grenze zum NIR-Bereich zu erzeugen.
Ein wesentlicher Nachteil der als Biomarker technisch genutzten NIR-Polymethine besteht darin, daß mit Verlängerung der Polymeth in kette im steigenden Maße nudeopile bzw. elektrophile Angriffsmöglichkeiten auf die Kette gegeben sind, in deren Folge es zur Zerstörung des π-Systems kommt. Neben der ungenügenden thermischen und photochemischen Stabilität besteht ein weiterer wesentlicher Mangel der Polymethine darin, daß sie neben ihren intensiven Absorptionsmaxima keine weiteren Absorptionsbanden im sichtbaren Spektralbereich aufweisen und in diesem Spektrum, insbesondere durch Argon-Laser mit einer Emissonswellenlänge von λem = 488 nm oder He/Ne-Laser mit λem = 633 nm bzw. entsprechende Laserdioden ab λem = 670 nm, nicht unmittelbar angeregt werden können. Speziell die für " multiple color fluorescence assay's" geeigneten Biomarker können aber nur durch diskrete, vom π-System des Polymethins vorgegebene Lichtquellen (wie die vorgenannten) zur Anregung gebracht werden. Um dennoch derartige Anwendungen zu ermöglichen (bei der Nutzung von " multiple color fluorescence assay's" ist es notwendig mit beispielsweise einer dieser Anregungslichtquellen verschiedene Biomarker mit deutlich unterschiedlichen Emissionmaxima anzuregen), erfolgt die Anregung von Cy5 durch einen Argon-Laser, indem beispielsweise mit Hilfe von Energietransfer über die Anregung von Fluorescein — » Rhodamin — > Texas Red — > Cy5 eine Emission über die Anregung von Licht an der Grenze zum NIR- Bereich bewirkt wird (US-PS 5 800 996). Weitere Möglichkeiten zur Anregung von Cy5, beispielsweise durch einen Argon-Laser bestehen darin, Mikropartikel aus intrinsischen Fluorophoren (Phycobiliproteinen) und dem extrinsischen Cy5 zu erzeugen, die über Energiekaskaden die Anregung des bei 650 nm absorbierenden Cy5-Derivates gestatten (Szöllösi, J.; Damjanovich, S.; Matyus, L.: Cytometry 1998, 34, 159). Von Gupta (US-PS 5 783 673) werden Farbstoff-Konjukate beschrieben, die durch die Reaktion von Phycobiliprotein mit aktivierten Fluorescein, Texas Red oder Cy5- Farbstoffen (Phycobiliprotein/Amine-Reactive Dye - PARD) dargestellt wurden. Diese so erhaltenen Farbstoff-Konjugate zeigen im sichtbaren Spektralbereich zusätzliche Absorptionsbanden, die zur Anregung genutzt werden können. Nachteilig an diesen Proben sind die hohe Molmasse, die aufwendige Präparation und die geringe Stabilität dieser Marker-Farbstoffe.
Ein weiteres Beispiel für die Anregung von an sich bei 488 nm nicht absorbierenden Pentamethinen gibt Glazer (US-PS 5 760 201). Durch die kovalente Verknüpfung mit einem im gewünschten Bereich absorbierenden Monomethin über mehrere ammoniumhaltige optimierte Alkylspacer wird zusätzlich eine starke Affinität zur DNA erreicht (spezifische lonenbindung). Auch hier ist ein entsprechender Verfahrensaufwand zur Anregung unumgänglich. Weitere Nachteile dieser Marker- Farbstoffe bestehen in einer ungenügenden Photo- oder Lagerstabilität, in aufwendigen Synthese- und Reinigungsschritten, in geringen Absorptionskoeffizienten bzw. einer unbefriedigenden Fluoreszenzquantenausbeute sowie in unerwünschten Änderungen der optischen Eigenschaften in Gegenwart von Proteinen oder Nudeinsäureoligomeren bzw. nach Bindung an diese.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, NIR-Marker-Farbstoffe auf Polymethin- Basis mit hoher Photo- und Lagerstabilität sowie hoher Fluoreszenzausbeute zu schaffen, die auf möglichst einfache Weise durch Laserstrahlung im sichtbaren oder im nahen IR-Spektralbereich, insbesondere mit Licht eines Argon-, Helium/Neonoder Diodenlasers zur Fluoreszenz angeregt werden können.
Erfindungsgemäß werden Marker-Farbstoffe auf der Basis von Polymethinen eingesetzt, die substituierte Benzooxazol-, Benzothiazol-, 2,3,3-Trimethylindolenin-, das 2,3,3-Trimethyl-4,5-benzo- 3/-/-indolenin-, 2- und 4-Picolin-, Lepidin-, Chinaldin- sowie 9-Methylacridinderivate der allgemeinen Formeln la oder Ib oder Ic
Figure imgf000006_0001
enthalten mit Z als
Figure imgf000006_0002
oder
wobei
- X bzw. Y für ein Element aus der Gruppe 0, S, Se oder das Strukturelement N- alkyl oder C(alkyl)2 steht,
- n für die Zahlenwerte 1 , 2 oder 3 steht,
R1 - R15 gleich oder unterschiedlich sind und Wasserstoff, ein oder mehrere Alkyl-, oder Aryl-, Heteroaryl- oder heterocycloaliphatische Reste, eine Hydroxy- oder Alkoxygruppe, eine alkylsubsituierte oder cyclische Aminfunktion sein können und/oder zwei or /io-ständige Reste, z. B. R2 und R3, zusammen einen weiteren aromatischen Ring bilden können,
- mindestens einer der Substituenten R1 - R15 einen ionisierbaren bzw. ionisierten Substituenten, wie SO3 ", PO3 ~, COO", oder NR3 +, darstellen kann, der die hydrophilen Eigenschaften dieser Farbstoffe bestimmt,
mindestens einer der Substituenten R1 - R15 für eine reaktive Gruppe stehen kann, welche eine kovalente Verknüpfung des Farbstoffs mit den oben genannten Trägermolekülen ermöglicht und
U-V bzw. U'-V gleich oder unterschiedlich sind und aus Wasserstoff, aus einer gesättigten aliphatischen, heteroaliphatischen oder aus einer Lacton- bzw. Thiolactongruppierung bestehen können.
In den Unteransprüchen 2-10 sind spezielle Ausführungsformen zu den Marker- Farbstoffen aufgeführt. Diese substituierten Indol-, Heteroindol-, Pyridin-, Chinolin- oder Acridinderivate der allgemeinen Formel la oder Ib oder Ic können als Farbstoffe zur optischen Markierung von organischen oder anorganischen Mikropartikeln, z. B. von Proteinen, Nucleinsäuren, DNA, biologische Zellen, Lipiden, Pharmaka oder organischen bzw. anorganischen polymerer Trägermaterialien verwendet werden. Die Markierung der Partikel kann dabei durch die Ausbildung von ionischen Wechselwirkungen zwischen den Markern der allgemeinen Formeln la oder Ib oder Ic und dem zu markierenden Materialien erfolgen.
Die gegenüber Nucleophilen aktivierten funktioneilen Gruppen dieser Marker vermögen kovalent an eine OH-, NH2- oder SH-Funktion zu koppeln. Somit entsteht ein System zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung von organischen und anorganischen Materialien, wie den besagten Proteinen, Nucleinsäuren, DNA, biologische Zellen, Lipiden, Pharmaka oder organischen bzw. anorganischen Polymeren.
Diese Kopplungsreaktion kann in wäßriger oder überwiegend wäßriger Lösung und vorzugsweise bei Raumtemperatur durchgeführt werden. Dabei entsteht ein Konjugat mit fluoreszenten Eigenschaften.
Sowohl die Verbindungen der allgemeinen Formeln la oder Ib oder Ic und davon abgeleitete Systeme können in optischen, insbesondere fluoreszenzoptischen, qualitativen und quantitativen Bestimmungsverfahren zur Diagnostik von Zelleigenschaften, in Biosensoren (point of care-Messungen), Erforschung des Genoms und in Miniaturisierungstechnologien eingesetzt werden. Typische Anwendungen erfolgen in der Zytometrie und Zellsortierung, der Fluoreszenz- Korrelations-Spektroskopie (FCS), im Ultra-High-Troughput-Screening (UHTS), bei der multicolor Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) und in Mikroarrays (Genchips).
Durch die Darstellung von nichtsymmetrischen Polymethinen, die einerseits als terminale Funktion einen leicht derivatisierbaren Heterocyclus vom Typ der Pyridin-, Chinolin-, Indol-, Heteroindol- bzw. Acridinderivate sowie andererseits einen neuartigen 6-Ringheterocyclus aufweisen, werden insbesondere nachfolgende Vorteile erreicht:
Bereits Trimethine absorbieren im Spektralbereich > 650 nm und zeigen eine gegenüber den bisher bekannten Polymethinen mit Absorptionsmaxima > 650 nm (Penta- und Hepta-methine) eine wesentlich verbesserte photochemische und thermische Stabilität. Durch „molecular engineering" ist es möglich, Lage und Intensität der Absorptionsund Emissionsmaxima beliebig zu steuern und den Emissionswellenlängen unterschiedlicher Anregungslaser, vor allem NIR-Laserdioden, anzupassen. Bedingt durch die Auswahl geeigneter terminaler Heterocyclen zeigen die erfindungsgemäßen Farbstoffe zusätzliche Absorptionsmaxima im sichtbaren bzw. NIR-Spektralbereich, die zur Anregung, beispielsweise mit einem Argon-Laser genutzt werden können. Diese Farbstoffe sind insbesondere zur Anwendung in „multiple color fluorescence assay's" geeignet.
Die Marker-Farbstoffe sind durch relativ einfache und in zwei Stufen durchzuführende Synthese herstellbar, mit welcher eine Vielzahl unterschiedlich funktionalisierter Farbstoffe, beispielsweise hinsichtlich der Gesamtladung des Farbstoffes und der Anzahl, Spezifität und Reaktivität der zur Immobilisierung genutzten aktivierten Gruppen, anwendungsspezifisch zur Ver ügung gestellt werden kann.
Die Erfindung soll nachstehend anhand von in der Zeichnung dargestellten
Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.
Es zeigen:
Fig. 1 : Synthesen gemäß Ausführungsbeispiel 1 und 2
Fig. 2: Synthese gemäß Ausführungsbeispiel 3 Fig. 3: Synthesen gemäß Ausführungsbeispiel 4 bis 6
Fig. 4: Synthesen gemäß Ausführungsbeispiel 7 und 8
Fig. 5: Absorptionsspektrum von C 1601
Fig. 6: Emissionsspektrum von C 1601 (frei, gebunden, 670 nm Diodenlaser)
Fig. 7: Synthesen gemäß Ausführungsbeispiel 1 1 und 12 Fig. 8: Synthesen gemäß Ausführungsbeispiel 13 und 14
Fig. 9: Absorptionsspektrum von C 1591 - NHS-ester
Fig. 10: Emissionsspektrum von C 1591 (frei, gebunden, 670 nm Diodenlaser)
Fig. 1 1 : Emissionsspektrum von C 1591 (frei, gebunden, 488 nm Ar-Ionenlaser)
Fig. 12: Synthesen gemäß Ausführungsbeispiel 19 und 20
Allgemeine Vorschrift zur Darstellung von 3. 1 -verbrückten 2-(2-Ethoxyethenyl)-7- diethylamino-benzo[b]pyrylium perchloraten C 1595 und L 107, vgl. Fig. 1:
0,01 mol von einem 2-Methylen-7-diethylamin-benzo[ ]pyrylium perchlorat der
Formel 1 a oder 1 b werden in 40 ml Acetanhydrid gelöst und mit 2,0 g Triethoxymethan kurz erhitzt. Der nach ca. einer Stunde ausfallende Niederschlag wird abgesaugt und aus Eisessig umkristallisiert. 1 : 6-Diethylamino-4-ethoxymethylen- 1.2.3.4-tetrahydro-<dibenzo[b;e]pyrylium> perchlorat C 1595: 3,58 g (87 %) Ausbeute, 178 °C Schmelzpunkt. -Η NMR (CDCI3): 1.29 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 1.42 (t, J = 7.1 Hz, 3H), 1.78-1.82 (m, 2H), 2.54 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.75 (t, J = 5.8 Hz, 2H), 3.59 (q, J = 7.1 Hz, 4H), 4.53 (q, = 7.1 Hz, 2H), 6.93 (dd, J = 2.3, J = 9.3 Hz, 1 H), 7.32 (d, J = 2.0 Hz, 1 H), 7.50 (d, J = 9.3 Hz, 1 H), 7.84 (s, 1 H), 8.52 (s, 1 H). -13C NMR (CDCI3): 12.5, 15.6, 20.2, 21.8, 27.8, 45.8, 73.1 , 97.1 , 108.3, 1 15.4, 1 15.8, 120.3, 130.6, 145.6, 154.8, 157.8, 163.0, 167.9. - C20H26CINO6 (41 1.88): ber. C 58.32, H 6.36, Cl 8.61 , N 3.40, gef. C 57.75, H 6.58, Cl 8.43, N 3.46.
2 : 3-Diethylamino-6-ethoxymethylen-7.8.9.10-tetrahydro-6H-<5-oxonia- cydohepta[b]-naphthalen> perchlorat L 107: 3,96 g (93 %) Ausbeute, 158-60 °C Schmelzpunkt. -Η NMR (CDCI3): 1 .27 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 1.39 (t, J = 7.1 Hz,
3H), 1 .75-1 .77 (m, 2H), 1 .85-1 .87 (m, 2H), 2.58-2.61 (m, 2H), 2.79-2.83 (m, 2H), 3.58 (q, J = 7Λ Hz, 4H), 4.56 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 6.99 (dd, J = 2.4, J = 9.3 Hz, 1 H), 7.16 (d, = 2.0 Hz, 1 H), 7.60 (d, J = 93 Hz, 1 H), 8.00 (s, 1 H), 8.18 (s, 1 H). -13C NMR (CDCI3): 12.5, 15.5, 21.1 ,23.8, 25.1 , 29.2, 45.8, 72.4, 96.3, 1 13.2, 1 16.1 , 1 16.3, 124.2, 130.8, 149.0, 155.0, 157.9, 162.8, 171.0. - C21H28CIN06 (425.91): ber. C 59.22, H 6.63, Cl 8.32, N 3.29, gef. C 58.76, H 6.39, Cl 8.75, N 3.34.
3 : 3-Diethylamino-6-[3-(N-acetylanilino)-prop-2-yliden]-7.8.9. 10-tetrahydro-6H-<5- oxonia-cydohepta[b]naphthalen> perchlorat C 1590, vgl. Fig. 2: 2,13 g (0,005 mol) 2-Methylen-7-diethylamin-benzo[jb]pyrylium perchlorat der Formel 1 b werden in 40 ml Acetanhydrid gelöst und mit 1 ,29 g (0,005 mol) (3- Anilinopropenyliden)-phenyl-ammoniumchlohd kurz erhitzt. Der nach ca. einer Stunde ausfallende Niederschlag wird abgesaugt, mit Ether gewaschen und aus Eisessig umkristallisiert: 2,00 g (74 %) Ausbeute, 216-20 °C Schmelzpunkt. -1H NMR (CD3NO2): 1 .34 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 1 .64-1 .69 (m, 2H), 1 .82-1 .87 (m, 2H), 2.00 (s, 3H), 2.49 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.89 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.72 (q, J = 7.1 Hz, 4H), 5.61 (dd, J = 1 1 .8 Hz, J = 13.5 Hz, 1 H), 7.04 (d, J = 2.4 Hz, 1 H), 7.32 (dd, J = 2.4 Hz, J = 9.4 Hz, 1 H), 7.36-7.39 (m, 2H), 7.54-7.65 (m, 4H), 8.21 (s, 1 H), 8.27 (d, J = 13.5 Hz, 1 H). -13C NMR (CD3NO2): 12.8, 23.5, 25.2, 25.8, 25.9, 30.4, 47.2, 96.2, 109.9, 1 19.0, 1 19.3, 127.4, 129.9, 130.6, 130.7, 131 .7, 132.0, 132.5, 140.1 , 142.2, 151.3, 157.2, 160.1 , 169.7, 171 .2. - C29H33CIN2O6 (541 .04): ber. C 64.38, H 6.15, Cl 6.55, N 5.18, gef. C 63.73, H 6.15, Cl 6.81 , N 5.07.
Allgemeine Vorschrift zur Darstellung von 3. 1 -verbrückten 2-[6-(N-acetylanilino)- hexatrien-1.3.5-yliden]-benzo[b]pyrylium und thiopyrylium perchloraten C 1586, C 1573 und C 1574, vgl. Fig. 3: 0,005 mol von einem 2-Methylen-7-diethylamin-benzo[ ]-pyrylium perchlorat der Formel 1 a, 1 b oder ein 2-Methylen-4.6-diphenyl-thiopyrylium perchlorat der Formel 1 c werden in 40 ml Acetanhydrid gelöst und mit 1 ,42 g (0,005 mol) (5- Anilinopenta-2.4-dienyliden)-phenyl-ammonium chlorid kurz erhitzt. Der nach ca. einer Stunde ausfallende Niederschlag wird abgesaugt, mit Ether gewaschen und aus Eisessig umkristallisiert.
4: 6-Diethylamino-4-[5-(N-Acetylanilino)-penta-2.4-dienyliden]- 1.2.3.4. -tetrahydro- <dibenzo[b;e]pyrylium> perchlorat C 1586: 2,65 g (96 %) Ausbeute, 246-48 °C Schmelzpunkt. -Η NMR (CD3NO2): 1 .34 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 1.84-1 .88 (m, 2H), 2.08 (s, 3H), 2.67 (t, 7 = 5.7 Hz, 2H), 2.85 (t, 7 = 6 Hz, 2H), 3.72 (q, 7 = 7.1 Hz, 4H), 5.38 (dd, 7 = 1 1 .4 Hz, J = 13.8 Hz, 1 H), 6.55 ( dd, = 1 1 .9 Hz, J = 14.3 Hz, 1 H), 7.00- 7.08 (m, 2H), 7.27-7.33 (m, 3H), 7.56-7.62 (m, 3H), 7.71 -7.75 (m, 2H), 8.00 (d, J = 13.8 Hz, 1 H), 8.12 (s, 1 H). - C30H33CIN2O6 (553.05): ber. C 65.15, H 6.01 , Cl 6.41 , N 5.07, gef. C 63.57, H 6.08, Cl 6.14, N 4.92.
5 : 3-Diethylamino-6-[5-(N-acetylanilino)-penta-2.4-dienylidene]-7.8.9. 10-tetrahydro- 6H-<5-oxonia-cydohepta[b]naphthalen> perchlorat C 1573: 2,61 g (92 %) Ausbeute, 202 °C Schmelzpunkt. -1H NMR (CD3NO2): 1.36 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 1 .78- 1 .82 (m, 2H), 1 .90-1 .94 (m, 2H), 2.01 (s, 3H), 2.76 (t, = 6 Hz, 2H), 2.95 (t, 7 = 6 Hz, 2H), 3.75 (q, 7 = 7.1 Hz, 4H), 5.39 ( dd, 7 = 1 1 .3 Hz, J = 13.9 Hz, 1 H), 6.57 ( dd, 7 = 1 1 .9 Hz, = 14.3 Hz, 1 H), 6.98-7.06 (m, 2H), 7.32-7.36 (m, 3H), 7.52-7.63 (m, 4H), 7.77 (d, 7 = 9.4 Hz, 1 H), 7.97 (d, 7 = 13.8 Hz, 1 H), 8.22 (s, 1 H). -13C NMR (CD3NO2): 12.3, 22.9, 25.2, 25.5, 25.7, 30.2, 46.8, 95.7, 1 14.5, 1 18.7, 1 19.1 ,
126.0, 127.7, 129.7, 130.1 , 131.1 , 131.5, 132.1 , 137.8, 140.1 , 142.1 , 144.4,
150.8, 156.9, 159.8, 169.3, 170.3. - C31H35CIN2O6 (567.08): ber. C 65.66, H 6.22, Cl 6.25, N 4.94, gef. C 64.42, H 6.27, Cl 6.13, N 4.78.
6: 8-[5-(N-Acetylanilino)-penta-2.4-dienylidene]-2.4-diphenyl-5.6.7.8-tetrahydro- <benzo[b]thiopyrylium>perchlorat C 1574: 2,37 g (79 %) Ausbeute, 216-18 °C Schmelzpunkt. - C34H30CINO5S (600.13): ber. C 68.05, H 5.04, Cl 5.91 , N 2.33, S 5.34, gef. C 67.34, H 5.03, Cl 5.67, N 2.24, S 5.18.
Allgemeine Vorschrift zur Darstellung von 3. 1 -verbrückten 7-Diethylamino-2-[3-(1- alkyl-3.3-dimetyl- 1.3-dihydro-indol-2-yliden)-propen- 1 -yl]-benzo[b]pyrylium perchloraten C 1592 und C 1601, vgl. Fig. 4: In einer ersten Variante werden 0,005 mol von einem Indolderivat 2a bzw. 2b (Mujumdar, R. T.; Ernst, L. A.; Mujumdar, S. R.; Lewis, C. J.; Waggoner, A. S.: Bioconjugate Chem. 1993, 4, 105) zusammen mit 2,13 g (0,005 mol) L 107 in 30 ml Acetanhydrid und 10 Tropfen Piperidin für ca. zehn Minuten unter Rückfluß erhitzt. Nach dem Abkühlen wird das Rohprodukt mit Ethylether gefällt und durch Säulenchromatographie (Silicagel, Methanol/Aceton 1 : 1) gereinigt. In einer zweiten Variante kommen (wie in Fig. 4 angedeutet) anstelle von L 107 2,13 g (0,005 mol) von einem Perchlorat 3b (Kanitz, A; Hartmann, H.; Czerney, P:. J. Prakt. Chem. 1998, 340, 34) zur Anwendung. Dabei ist es notwendig, die Reaktionszeit um ca. zehn Minuten zu erhöhen.
7 : 3-Diethylamino-6-[2-(1-n-butyl-3.3-dimethyl- 1.3-dihydro-indol-2-yliden)- ethylidenl]-7.8.9. 10-tetrahydro-6H-<5-oxonia-cydohepta[b]naphthalen> perchlorat C 1592: 1 ,87 g (63 %) AusbeuteΛ/ariante A, 1 ,34 g (45 %) Ausbeute/Variante B, 216-18 °C Schmelzpunkt. - HRMS-FAB (C34H43N2O): ber. 495.337539; gef. 495.335970; D = 1 .569 mmU. 8: 3-Diethylamino-6-<2-[1-(4-sulfonatobutyl)-3.3-dimethyl-5-sulfonato-1.3-dihydro- indol-2-yliden]-ethylidenl>-7.8.9. 10-tetrahydro-6H-<5-oxonia- cydohepta[b]naphthalen>kali-um C 1601: 1 ,25 g (36 %) Ausbeute, 216-18 °C Schmelzpunkt - HRMS-FAB (C34H42KN2O7S2): ber. 693.207053; gef. 693.203060; D = 3.99 mmU.
9: Absorptionsspektren von C 1601: Fig. 5 zeigt das Absorptionsspektrum von C 1601 in reinem PBS (Phosphate Buffer Saline) und nach der Zugabe von Albumin aus Humanserun (HSA).
10: Fluoreszenzspekten von C 1601: Fig. 6 zeigt die Emissionsspektren von C
1601 (angeregt durch einen 670 nm Diodenlaser) in reinem PBS und nach der Zugabe von HSA. Die Intensität der Fluoreszenz hat sich nach der Zugabe von HSA um den Faktor fünf verstärkt.
Allgemeine Vorschrift zur Darstellung von 3. 1 -verbrückten 7-Diethylamino-2-[3-(1- (5-carboxypentyl-3.3-dimetyl-5-sulfonato- 1.3-dihydro-indol-2-yliden)-propen- 1 -yl]- benzo[b]-pyrylium perch braten C 1602 und C 1591, vgl. Fig. 7: 1 ,77 g (0,005 mol) von einem Indolderivat 2c (Mujumdar, R. T.; Ernst, L. A.; Mujumdar, S. R.; Lewis, C. J.; Waggoner, A. S.: Bioconjugate Chem. 1993, 4, 105) und 0,005 mol C 1595 bzw. L 107 werden in 40 ml einer Mischung aus
Pyridin/Acetanhydrid (1/1 ) für ca. zehn Minuten unter Rückfluß erhitzt. Nach dem Abkühlen wird das Rohprodukt mit Ethylether gefällt und durch Säulenchromatographie (Silicagel, Methanol) gereinigt.
1 1 : 6-Diethylamino-4-<2-[1-(5-carboxypentyl)-3.3-dimethyl-5-sulfonato- 1.3- dihydro-indol-2-yliden]-ethylidenl>-1.2.3.4-tetrahydro-<dibenzo[b;e]pyrylium> betain C 1602:
2,20 g (71 %) Ausbeute, >310 °C Schmelzpunkt. - C^H^KNAS (657.89 * H20): ber. C 62.20, H 6.56, N 4.14, S 4.74, gef. C 61 .74, H 6.53, N 4.06, S 4.26. - HRMS-FAB (C35H43N2O6S): ber. 619.284184; gef. 619.286390; D = -2.205 mmU. 12 : 3-Diethylamino-6-<2-[1 -(5-carboxypentyl)-3.3-dimethyl-5-sulfonato- 1.3- dihydro-indol-2-yliden]-ethylidenl>-7.8.9. 10-tetrahydro-6H-<5-oxonia- cycbhepta[b]naphthalen> betain C 1591: 2,15 g (68 %) Ausbeute, >340 °C Schmelzpunkt. - C36H46KN2O7S (671.91 * H2O): ber. C 62.68, H 6.73, N 4.06, S 4.64, gef. C 62.37, H 6.61 , N 4.07, S 4.34. - HRMS-FAB (C36H45N2O6S): ber.
633.299834; gef. 633.308710; D = -8.875 mmU.
Allgemeine Vorschrift zur Darstellung von NHS-ester mit N-Hydroxysuccinimid
(NHS)IN.N'-Dicycbhexylcarbodümid (DCC), vgl. Fig. 8: 15 mg C 1602 bzw. C 1591 , 14 mg DCC und 4 mg NHS werden in 1 ml trockenem
DMF gelöst und mit 10 μl Triethylamin versetzt. Die Reaktionsmischung wird 24
Stunden bei Raumtemperatur gerührt und anschließend filtriert. Nach dem
Abziehen des Lösungsmittels wird der Rückstand mit Ether gewaschen und am
Ölpumpenvakuum getrocknet.
13: C 1602-NHS-ester: Die Reaktion verläuft quantitativ.
14: C 1591 -NHS-ester: Die Reaktion verläuft quantitativ.
1 5: Kovalente Markierung von Albumin aus Humanserum (HSA) mit C 1591-
NHS-ester:
C 1591 -NHS-ester (ca. 0,5 mg) werden in 50 μl DMF und 5 mg HSA in 750 μl Bicarbonatpuffer (0.1 mol/l, pH = 9.0) gelöst. Beide Lösungen werden langsam vereint und 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wird das markierte HSA durch Gelchromatographie vom nicht gebundenen Farbstoff getrennt. Als stationäre Phase dient Sephadex G50, als Laufmittel Phosphatpuffer (22 mmol/l, pH 7.2).
16: Absorptionsspektren von C 1591 -Derivaten: Fig. 9 zeigt das Absorptionsspektrum von einem aktivierten C 1 591 -NHS-ester und C 1591 kovalent gebunden an HSA. Als Lösungsmittel wurde für beide Messungen PBS (Phosphate Buffer Saline) verwendet.
17: Fluoreszenzspektren von C 1591 -Derivaten: Fig. 10 zeigt das Emissionsspektrum von einem aktivierten C 1591 -NHS-ester und C 1591 kovalent gebunden ans HSA.
Zur Anregung wurde ein 670 nm Diodenlaser (Spindler & Hoyer, Leistung max. 3 mW) verwendet. Als Lösungsmittel für beide Messungen diente PBS.
18: Fluoreszenzspektren von C 1591 -Derivaten: Fig. 1 1 zeigt das
Emissionsspektrum von einem aktivierten C 1591 -NHS-ester und C 1591 kovalent gebunden an HSA.
Zur Anregung wurde ein 488 nm Ar-Ionenlaser (Ion Laser Technology, Leistung max. 100 mW) verwendet. Als Lösungsmittel für beide Messungen diente PBS.
19 : 3-Diethylamino-6-<2-[1 -(3-acetoxypropyl)-3.3-dimethyl- 1.3-dihydro-indol-
2-yliden]-ethylidenl>-7.8.9.10-tetrahydro-6H-<5-oxonia-cydohepta[b]naphthalen> perchlorat C 1594, vgl. Fig. 12: 1 ,94 g (0,005 mol) 1 -(1 -Acetoxypropyl)-2.3.3-trimethyl-3H-indolinium iodid 2d (Brush et al. , US-PS 5 808 044) und 2,13 g (0,005 mol) L 107 werden in einer Mischung aus jeweils 20 ml Pyridin und 20 ml Acetanhydrid ca. 20 Minuten unter Rückfluß erhitzt. Nach dem Abkühlen wird die noch acetylierte Zwischenstufe mit Ether gefällt und im Vakuum getrocknet. Die Reinigung des Produktes erfolgt durch präparative Säulenchromatographie (Silicagel, Methanol). 0,87 g (29 %) Ausbeute, 155-62 °C Schmelzpunkt. - HRMS-FAB (C35H43N203): ber. 539.327368; gef. 539.328510; D = -1 .142 mmU.
20: Darstellung vom C 1594-phosphoramidit, vgl. Fig. 12:
Zur Hydrolyse werden 200 mg C 1594 in 10 ml Methanol gelöst und unter Zugabe von 50 mg Natriumcarbonat zwei Stunden gerührt. Im Anschluß daran wird filtriert sowie der entacylierte Farbstoff durch Zugabe von Ether ausgefällt und getrocknet. Das erhaltene Produkt wird in trockenem DMF gelöst und mit 0.15 ml N.N- Diisopropylamin versetzt. Zu dieser Lösung gibt man im Verlauf einer Stunde dreimal je 40 μl 2-Cyanoethyl-N.N-Diisopropylchlorophosphoramidit. Dabei wird der Reaktionsverlauf dünnschichtchromatographisch verfolgt und nach quantitativem Ablauf der Reaktion das Produkt direkt zum Markieren von DNA eingesetzt.

Claims

Patentansprüche
1. Laser-kompatible NIR-Marker-Farbstoffe auf der Basis von Polymethinen, enthaltend substituierte Benzooxazol-, Benzothiazol-, 2,3,3-Trimethylindolenin-, das 2,3,3-Trimethyl-4,5-benzo- 3/-/-indolenin-, 2- und 4-Picolin-, Lepidin-, Chinaldin- sowie 9-Methylacridinderivate der allgemeinen Formeln la oder Ib oder Ic
Figure imgf000017_0001
mit Z als
Figure imgf000017_0002
oder oder oder
Figure imgf000017_0003
oder wobei
- X bzw. Y für ein Element aus der Gruppe O, S, Se oder das Strukturelement N- alkyl oder C(alkyl)2 steht,
- n für die Zahlenwerte 1 , 2 oder 3 steht,
- R1 - R15 gleich oder unterschiedlich sind und Wasserstoff, ein oder mehrere Alkyl- , oder Aryl-, Heteroaryl- oder heterocycloaliphatische Reste, eine Hydroxy- oder Alkoxygruppe, eine alkylsubsituierte oder cyclische Aminfunktion sein können und/oder zwei orf/io-ständige Reste, z. B. R2 und R3, zusammen einen weiteren aromatischen Ring bilden können,
- mindestens einer der Substituenten R1 - R15 einen ionisierbaren bzw. ionisierten Substituenten, wie SO3 ", PO3 ~, COO~, oder NR3 +, darstellen kann, der die hydrophilen Eigenschaften dieser Farbstoffe bestimmt,
- mindestens einer der Substituenten R1 - R15 für eine reaktive Gruppe stehen kann, welche eine kovalente Verknüpfung des Farbstoffs mit den oben genannten Trägermolekülen ermöglicht und
- U-V bzw. U'-V gleich oder unterschiedlich sind und aus Wasserstoff, aus einer gesättigten aliphatischen, heteroaliphatischen oder aus einer Lacton- bzw. Thiolactongruppierung bestehen können.
2. Laser-kompatible NIR-Marker-Farbstoffe gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die reaktive Gruppe aus folgenden Funktionalitäten ausgewählt ist: Isothiocyanate, Isocyanate, Monochlortriazine, Dichlortriazine, Aziridine, Sulfonylhalogenide, /V-Hydroxysuccinimidester, Imido-Ester, Glyoxal oder Aldehyd für Amin- und Hydroxy-Funktionen bzw. Maleimide oder lodacetamide für Thiol-Funktionen sowie Phosphoramidite für die Markierung der DNA oder RNA oder deren Bruchstücke.
3. Laser-kompatible NIR-Marker-Farbstoffe gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die reaktive Gruppe über Spacer-Gruppen der allgemeinen Struktur -(CH2)m- am eigentlichen Chromophor gebunden ist, wobei m Werte von 1 bis 18 annehmen kann.
4. Laser-kompatible NIR-Marker-Farbstoffe gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die Struktureinheit =CR7- auch eine Verbrückung über vierfünf- und sechsgliedrige Ringsysteme beinhaltet, wobei sich an dieser auch reaktive Gruppen befinden und die Substituenten A - G die gleiche Funktionalität wie die Substituenten R1 - R15 besitzen können.
5. Laser-kompatible NIR-Marker-Farbstoffe gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Struktureinheit =CR7- (n = 2) für
Figure imgf000019_0001
steht.
6. Laser-kompatible NIR-Marker-Farbstoffe gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Struktureinheit =CR7- (n = 2) für
Figure imgf000019_0002
steht. 1 Ϊ
7. Laser-kompatible NIR-Marker-Farbstoffe gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Struktureinheit =CR7- (n = 3) für
Figure imgf000020_0001
steht.
8. Laser-kompatible NIR-Marker-Farbstoffe gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Struktureinheit =CR7- (n = 3) für
Figure imgf000020_0002
steht.
9. Laser-kompatible NIR-Marker-Farbstoffe gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Substituenten A - C für O, S, C(CN)2 bzw. N-R stehen, wobei R in N-R für einen aliphatischen oder aromatischen bzw. einem reaktiven aliphatischen oder aromatischen Rest, wie (CH2)nCOOH oder (CH2)nNH2, stehen kann.
10. Laser-kompatible NIR-Marker-Farbstoffe gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Substituent D für Cl oder ein aromatisches bzw. aliphatisches Ringsystem steht, an dem gegebenenfalls reaktive Substituenten entsprechend den R1 bis R15 angebracht sind.
PCT/DE2000/000802 1999-03-11 2000-03-09 Laser-kompatible nir-marker-farbstoffe Ceased WO2000053678A1 (de)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10080558T DE10080558B4 (de) 1999-03-11 2000-03-09 Laser-kompatible NIR-Marker-Farbstoffe

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE1999111421 DE19911421A1 (de) 1999-03-11 1999-03-11 Laser-kompatible NIR-Marker-Farbstoffe
DE19911421.8 1999-03-11

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2000053678A1 true WO2000053678A1 (de) 2000-09-14

Family

ID=7900996

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/DE2000/000802 Ceased WO2000053678A1 (de) 1999-03-11 2000-03-09 Laser-kompatible nir-marker-farbstoffe

Country Status (2)

Country Link
DE (2) DE19911421A1 (de)
WO (1) WO2000053678A1 (de)

Cited By (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002046139A3 (fr) * 2000-12-07 2002-08-01 Centre Nat Rech Scient Sels de 1,7- et de 1,9-diarylpolymethine
FR2827597A1 (fr) * 2001-07-20 2003-01-24 Centre Nat Rech Scient Sels de 1,9-diarylheptamethine
EP1318177A3 (de) * 2001-12-05 2003-07-16 Dyomics GmbH Verbindung, insbesondere Marker-Farbstoff, auf der Basis von Polymethinen
EP1428858A1 (de) 2002-12-10 2004-06-16 Dyomics GmbH Hydrophile Marker auf der Basis von Benzopyrylo-Polymethinen
EP1535969A3 (de) * 2003-11-26 2005-06-08 Dyomics GmbH Neue Polymethinfarbstoffe auf Cumarin-Basis mit einstellbarem Stoke's-Shift
WO2008013543A1 (en) * 2006-07-28 2008-01-31 Pierce Biotechnology, Inc. Protein probe compounds, compositions, and methods
US7553869B2 (en) 2006-07-28 2009-06-30 Pierce Biotechnology, Inc. Protein probe compounds, compositions, and methods
WO2010138738A1 (en) 2009-05-27 2010-12-02 Lumicell Diagnostics, Inc. Methods and systems for spatially identifying abnormal cells
WO2012075075A2 (en) 2010-12-01 2012-06-07 Lumicell Diagnostics, Inc. Methods and systems for spatially identifying abnormal cells
CN104086536A (zh) * 2014-06-27 2014-10-08 中国科学院化学研究所 一种用于检测pH值的荧光探针及其制备方法与专用检测试剂盒
US9032965B2 (en) 2010-12-08 2015-05-19 Lumicell, Inc. Methods and system for image guided cell ablation with microscopic resolution
CN106279124A (zh) * 2016-08-12 2017-01-04 中国科学院化学研究所 一种用于检测酪氨酸酶的荧光探针及其制备方法与应用
US9763577B2 (en) 2013-03-14 2017-09-19 Lumicell, Inc. Imaging agent for detection of diseased cells
CN108997771A (zh) * 2018-06-12 2018-12-14 大连理工大学 一类在近红外区具有强吸收和光热效应的染料及其制备方法与应用
CN114591633A (zh) * 2022-01-23 2022-06-07 大连理工大学 一类氧杂蒽-半花菁近红外荧光染料，其合成方法及应用
CN114874639A (zh) * 2022-05-12 2022-08-09 大连理工大学 一类新型半花菁近红外荧光染料，其合成方法及应用
CN117534660A (zh) * 2023-09-26 2024-02-09 华东理工大学 双响应有机荧光化合物及其制备方法和应用
WO2024239539A1 (zh) * 2023-05-23 2024-11-28 中山大学 一种两性离子荧光化合物及其制备方法和应用

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10140469B4 (de) * 2001-08-17 2005-09-22 Infineon Technologies Ag Karte, Dokument oder Banknote mit erhöhter Fälschungssicherheit

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3912046A1 (de) * 1988-09-02 1990-03-15 Univ Carnegie Mellon Verfahren zum markieren einer komponente einer waessrigen fluessigkeit
WO1994024213A1 (en) * 1993-04-13 1994-10-27 Molecular Probes, Inc. Cyclic-substituted unsymmetrical cyanine dyes
WO1996013552A2 (en) * 1994-10-27 1996-05-09 Molecular Probes, Inc. Substituted unsymmetrical cyanine dyes with selected permeability
WO1996041144A2 (en) * 1995-06-06 1996-12-19 Hyperion, Inc. Polyoxyhydrocarbyl marker products and methods for fluorescence assays
US5760201A (en) * 1994-07-29 1998-06-02 The Regents Of The University Of California Dimeric fluorescent energy transfer dyes comprising asymmetric cyanine azole-indolenine chromophores

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE410487C (de) * 1922-06-04 1925-03-10 Farbenfab Vorm Bayer F & Co Verfahren zur Darstellung von Polymethinfarbstoffen
DE415534C (de) * 1924-03-11 1925-06-22 Farbenfab Vorm Bayer F & Co Verfahren zur Darstellung von Polymethinfarbstoffen
US5230781A (en) * 1984-03-29 1993-07-27 Li-Cor, Inc. Sequencing near infrared and infrared fluorescence labeled DNA for detecting using laser diodes
US5571388A (en) * 1984-03-29 1996-11-05 Li-Cor, Inc. Sequencing near infrared and infrared fluorescense labeled DNA for detecting using laser diodes and suitable labels thereof
US5268486A (en) * 1986-04-18 1993-12-07 Carnegie-Mellon Unversity Method for labeling and detecting materials employing arylsulfonate cyanine dyes
US5627027A (en) * 1986-04-18 1997-05-06 Carnegie Mellon University Cyanine dyes as labeling reagents for detection of biological and other materials by luminescence methods
US5171846A (en) * 1990-05-21 1992-12-15 Coulter Corporation Method of preferential labelling of a phycobiliprotein with a second dye for use in a multiple color assay and product for such use

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3912046A1 (de) * 1988-09-02 1990-03-15 Univ Carnegie Mellon Verfahren zum markieren einer komponente einer waessrigen fluessigkeit
WO1994024213A1 (en) * 1993-04-13 1994-10-27 Molecular Probes, Inc. Cyclic-substituted unsymmetrical cyanine dyes
US5760201A (en) * 1994-07-29 1998-06-02 The Regents Of The University Of California Dimeric fluorescent energy transfer dyes comprising asymmetric cyanine azole-indolenine chromophores
WO1996013552A2 (en) * 1994-10-27 1996-05-09 Molecular Probes, Inc. Substituted unsymmetrical cyanine dyes with selected permeability
WO1996041144A2 (en) * 1995-06-06 1996-12-19 Hyperion, Inc. Polyoxyhydrocarbyl marker products and methods for fluorescence assays

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HIROYUKI NAKAZUMI AND MASARU MATSUOKA: "Near-Infrared Absorbing Dyes", CHEMICAL REVIEWS,US,AMERICAN CHEMICAL SOCIETY. EASTON, 1 January 1992 (1992-01-01), pages 1197 - 1226, XP002076242, ISSN: 0009-2665 *

Cited By (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002046139A3 (fr) * 2000-12-07 2002-08-01 Centre Nat Rech Scient Sels de 1,7- et de 1,9-diarylpolymethine
FR2827597A1 (fr) * 2001-07-20 2003-01-24 Centre Nat Rech Scient Sels de 1,9-diarylheptamethine
EP1318177A3 (de) * 2001-12-05 2003-07-16 Dyomics GmbH Verbindung, insbesondere Marker-Farbstoff, auf der Basis von Polymethinen
EP1428858A1 (de) 2002-12-10 2004-06-16 Dyomics GmbH Hydrophile Marker auf der Basis von Benzopyrylo-Polymethinen
US6924372B2 (en) 2002-12-10 2005-08-02 Dyomics Gmbh Benzopyrylo-polymethine-based hydrophilic markers
EP1535969A3 (de) * 2003-11-26 2005-06-08 Dyomics GmbH Neue Polymethinfarbstoffe auf Cumarin-Basis mit einstellbarem Stoke's-Shift
GB2458016B (en) * 2006-07-28 2011-09-21 Pierce Biotechnology Inc Protein probe, compositions and methods
GB2458016A (en) * 2006-07-28 2009-09-09 Pierce Biotechnology Inc Protein probe compounds, compositions, and methods
US7553869B2 (en) 2006-07-28 2009-06-30 Pierce Biotechnology, Inc. Protein probe compounds, compositions, and methods
WO2008013543A1 (en) * 2006-07-28 2008-01-31 Pierce Biotechnology, Inc. Protein probe compounds, compositions, and methods
US12163887B2 (en) 2009-05-27 2024-12-10 Lumicell, Inc. Methods and systems for spatially identifying abnormal cells
WO2010138738A1 (en) 2009-05-27 2010-12-02 Lumicell Diagnostics, Inc. Methods and systems for spatially identifying abnormal cells
US9155471B2 (en) 2009-05-27 2015-10-13 Lumicell, Inc'. Methods and systems for spatially identifying abnormal cells
US11592396B2 (en) 2009-05-27 2023-02-28 Lumicell, Inc. Methods and systems for spatially identifying abnormal cells
WO2012075075A2 (en) 2010-12-01 2012-06-07 Lumicell Diagnostics, Inc. Methods and systems for spatially identifying abnormal cells
EP3695853A1 (de) 2010-12-01 2020-08-19 Lumicell Diagnostics, Inc. Molekulare imaging-sonden und ihre zusammensetzungen
US10285759B2 (en) 2010-12-08 2019-05-14 Lumicell, Inc. Methods and system for image guided cell ablation with microscopic resolution
US9532835B2 (en) 2010-12-08 2017-01-03 Lumicell, Inc. Methods and system for image guided cell ablation with microscopic resolution
US9314304B2 (en) 2010-12-08 2016-04-19 Lumicell, Inc. Methods and system for image guided cell ablation with microscopic resolution
US9032965B2 (en) 2010-12-08 2015-05-19 Lumicell, Inc. Methods and system for image guided cell ablation with microscopic resolution
US10039603B2 (en) 2010-12-08 2018-08-07 Lumicell, Inc. Methods and system for image guided cell ablation
US12318139B2 (en) 2010-12-08 2025-06-03 Lumicell, Inc. Methods and system for image guided cell ablation
US10813554B2 (en) 2013-03-14 2020-10-27 Lumicell, Inc. Medical imaging device and methods of use
US10791937B2 (en) 2013-03-14 2020-10-06 Lumicell, Inc. Medical imaging device and methods of use
US9763577B2 (en) 2013-03-14 2017-09-19 Lumicell, Inc. Imaging agent for detection of diseased cells
US11471056B2 (en) 2013-03-14 2022-10-18 Lumicell, Inc. Medical imaging device and methods of use
CN104086536B (zh) * 2014-06-27 2016-08-24 中国科学院化学研究所 一种用于检测pH值的荧光探针及其制备方法与专用检测试剂盒
CN104086536A (zh) * 2014-06-27 2014-10-08 中国科学院化学研究所 一种用于检测pH值的荧光探针及其制备方法与专用检测试剂盒
CN106279124B (zh) * 2016-08-12 2019-04-09 中国科学院化学研究所 一种用于检测酪氨酸酶的荧光探针及其制备方法与应用
CN106279124A (zh) * 2016-08-12 2017-01-04 中国科学院化学研究所 一种用于检测酪氨酸酶的荧光探针及其制备方法与应用
CN108997771B (zh) * 2018-06-12 2019-12-06 大连理工大学 一类在近红外区具有强吸收和光热效应的染料及其制备方法与应用
CN108997771A (zh) * 2018-06-12 2018-12-14 大连理工大学 一类在近红外区具有强吸收和光热效应的染料及其制备方法与应用
CN114591633A (zh) * 2022-01-23 2022-06-07 大连理工大学 一类氧杂蒽-半花菁近红外荧光染料，其合成方法及应用
CN114874639A (zh) * 2022-05-12 2022-08-09 大连理工大学 一类新型半花菁近红外荧光染料，其合成方法及应用
WO2024239539A1 (zh) * 2023-05-23 2024-11-28 中山大学 一种两性离子荧光化合物及其制备方法和应用
CN117534660A (zh) * 2023-09-26 2024-02-09 华东理工大学 双响应有机荧光化合物及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
DE10080558D2 (de) 2001-06-13
DE19911421A1 (de) 2000-10-05
DE10080558B4 (de) 2008-09-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE10080558B4 (de) Laser-kompatible NIR-Marker-Farbstoffe
EP1283855B1 (de) Stabile nir-marker-farbstoffe auf der basis von benzopyrylium-polymethinen
DE60116510T2 (de) Cyaninfarbstoffe
DE69818044T2 (de) Chemilumineszente energietransfer-konjugate und ihre verwendung als markierungsmittel in bindungstests
EP0567622B1 (de) Neue pentacyclische verbindungen und ihre verwendung als absorptions- oder fluoreszenzfarbstoffe
EP3461815B1 (de) Neue poly-sulfonierte fluoreszenz-farbstoffe
DE10258150A1 (de) Hydrophile Marker auf der Basis von Benzopyrylo-Polymethinen
EP1318177B1 (de) Verbindung, insbesondere Marker-Farbstoff, auf der Basis von Polymethinen
DE19937024A1 (de) Verwendung von Acylsulfonamido substituierten Polymethin-Farbstoffen als Fluoreszenz-Farbstoffe und/oder Marker
DE69921151T2 (de) Fluorszierende marker
EP1320571B1 (de) 3-spiro-cyanin fluorochrome und deren verwendung in bioassays
EP1535969B1 (de) Neue Polymethinfarbstoffe auf Cumarin-Basis mit einstellbarem Stoke&#39;s-Shift
DE102006029454A1 (de) Hydrophile Marker auf Basis von diasteromeren
EP1273584B1 (de) Verbindungen auf der Basis von 2-bzw. 4-Chromenyliden-Merocyaninen und ihre Verwendung
DE102013114848A1 (de) Markerfarbstoffe für UV- und kurzwellige Anregung mit hohem Stokes Shift auf der Basis von Benzoxazolen
DE19921234B4 (de) Cyanin-Farbstoffe
EP1272566B1 (de) Cyaninfarbstoffe als fluoreszenzmarker
DE10025820C2 (de) Stabile NIR-Marker-Farbstoffe auf der Basis von Benzopyrylium-Polymethinen
DE19957007A1 (de) Cyaninfarbstoffe
WO2000064987A1 (de) Neue amidopyrylium-fluoreszenz-farbstoffe
DE102018124199B4 (de) Neue Fluoreszenzfarbstoffe, deren Synthese und neue Analyseverfahren für die Glycan-Analytik
EP1325084A2 (de) Pyridin- und chinolin-farbstoffe als marker für biomoleküle, polymere, arzneistoffe und partikel
DE102012205807A1 (de) Cyanin-Farbstoffe
EP4127069A1 (de) Fluoreszenzfarbstoffe mit hohem stokes shift auf der basis von verbrückten benzopyryliumsalzen
DE19856152A1 (de) Pyridin- und Chinolinfarbstoffe als Marker für Biomoleküle, Polymere und Arzneistoffe

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): DE US

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 09700072

Country of ref document: US

REF Corresponds to

Ref document number: 10080558

Country of ref document: DE

Date of ref document: 20010613

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 10080558

Country of ref document: DE

REG Reference to national code

Ref country code: DE

Ref legal event code: 8607