EP1325084A2 - Pyridin- und chinolin-farbstoffe als marker für biomoleküle, polymere, arzneistoffe und partikel - Google Patents
Pyridin- und chinolin-farbstoffe als marker für biomoleküle, polymere, arzneistoffe und partikelInfo
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- EP1325084A2 EP1325084A2 EP99963383A EP99963383A EP1325084A2 EP 1325084 A2 EP1325084 A2 EP 1325084A2 EP 99963383 A EP99963383 A EP 99963383A EP 99963383 A EP99963383 A EP 99963383A EP 1325084 A2 EP1325084 A2 EP 1325084A2
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Classifications
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- C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
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- C09B23/02—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes the polymethine chain containing an odd number of >CH- or >C[alkyl]- groups
- C09B23/06—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes the polymethine chain containing an odd number of >CH- or >C[alkyl]- groups three >CH- groups, e.g. carbocyanines
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
- C09B23/00—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes
- C09B23/0066—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes the polymethine chain being part of a carbocyclic ring,(e.g. benzene, naphtalene, cyclohexene, cyclobutenene-quadratic acid)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
Definitions
- the invention relates to quinolinium or pyridinium derivatives, which are particularly suitable as markers for biomolecules, polymers, drugs and particles.
- this object is achieved by a quinolinium or pyridinium derivative of the general formula (Ia), (Ib), (Ha) or (IIb):
- the compounds according to the invention are - to varying degrees - free from the disadvantages of the markers of the prior art.
- the compounds according to the invention thus have excellent photo and storage stability.
- the compounds according to the invention, as described below, can be obtained in high yields using simple synthesis steps, starting from commercially available starting products.
- the compounds also have high extinction coefficients or fluorescence quantum yields.
- Another advantage of the quinoline or pyridine derivatives according to the invention is that the optical properties, such as the absorption behavior, are generally not deteriorated in the presence of and in particular after binding to carrier molecules, such as proteins or nucleic acids. As can be seen, for example, from FIG.
- All compounds according to the invention have a nitrogen-containing 6-ring heterocycle as one of the substituents on the polymer grouping.
- the rest Z comprises the polymer grouping and the second auxochrome group.
- the compounds according to the invention are reactive dyes, ie dyes which, in addition to the color-giving chromophoric component, comprise at least one reactive component, via which they can be covalently bound to carrier substances by reaction with functional groups.
- at least one of the radicals R to R 15 comprises a reactive group which enables covalent linkage to a carrier molecule.
- the radicals R to R 15 can themselves represent the reactive group.
- the at least one preferably has
- Radical R- to R 15 which comprises a reactive group, but the
- W represents a spacer group via which the reactive group is bonded to the actual chromophore.
- the spacer group preferably has the general one
- the spacer group can be straight-chain or branched. However, the reactive group can also be bound to the chromophore via other spacer groups.
- the reactive group can enable a covalent bond to the amine and / or hydroxyl functions of the carrier substance, for which the functional groups isothiocyanate, isocyanate, monochlorotriazine, dichlorotriazine, aziridine, sulfonyl halide, N-hydroxysuccinimide ester, imido ester, glyoxal or aldehyde are particularly suitable.
- the reactive group is preferably selected from Maleiimide or iodoacetamide selected.
- the reactive group phosphoramidite is particularly suitable for labeling nucleic acids, such as DNA or RNA, or their fragments.
- the compounds according to the invention comprise at least one reactive group. While theoretically each of the radicals R to R may include 15 a reactive group dyes are a maximum of three, more preferably at most two reactive groups are preferred. Most preferred are compounds in which exactly one radical R to R 15 contains a reactive group.
- At least one of the radicals R. to R 15 of the compounds comprises an ionizable or ionized group.
- This ionizable or ionized group determines the hydrophilic properties of the dye.
- This at least one residue is preferably selected so that a water-soluble dye is obtained, a low water solubility being sufficient, in which the dye does not precipitate out of an aqueous solution
- ionizable groups are in particular groups which form ions in aqueous environments, for example by cleavage or recording a proton.
- the ionizable or ionized group is preferably selected from S0 3 " , PO 3 2 ' , COO " and N (R 16 ) 3 + , with groups belonging to
- R 16 means C 1 -C 4 alkyl. It is possible that the at least one residue R-,
- R 15 itself represents the ionizable or ionized group. It is also possible for a radical R which contains an ionizable or ionized group to R 15 to have the general formula W1, in which I represents the ionizable or ionized group and W represents a spacer group, as defined above.
- the remaining radicals R 1 to R 15 which do not comprise any reactive group or ionizable or ionized group, are selected independently from the following groups on each occurrence: hydrogen, Halogen, in particular fluorine, chlorine, bromine or iodine,
- Hydrocarbon chains can be unbranched or branched chains which optionally contain one or more olefinically unsaturated units, the hydrocarbon chains preferably having 1 to 6 and most preferably 1 to 4 carbon atoms,
- C 4 -C 14 aryl which may optionally contain heteroatoms, in particular selected from N, 0 and / or S, phenyl and naphthyl radicals being particularly preferred, nitro,
- (Dialkyl) amino where it is preferably primary or secondary amino groups and the alkyl radicals are each independently one in particular a C 1 -C 6 -alkyl and particularly preferably a C 1 -C 4 -alkyl radical which can be straight-chain or branched and can optionally contain one or more olefinically unsaturated units.
- radicals R and R 12 together with the polymethine carbons to which they are attached, can also form 4-, 5- or 6-membered ring systems which form a bridge between the polymethine system.
- the at least one reactive group present on the radicals R ⁇ - to R 15 can then also on this
- Ring systems are bound. It is also possible for one or more of the radicals R to R 10 , which are bonded to the auxochromic ring systems of the compounds according to the invention, to form more condensed aromatic and / or heterocyclic rings with them.
- m can finally stand for the numerical values 1, 2 or 3, which then results in three, five or seven carbon-atomic polymethine chains.
- the structural unit is in the event that the radicals R and R 12 form a ring bridge
- radicals A, B, C, D, E, F and G are independently selected from
- Halogen in particular fluorine, chlorine, bromine or iodine, C.-Cg-alkoxy, CC 18 -alkyl, C r C 18 -acyl, where the alkyl chains can be straight-chain or branched and can optionally contain one or more olefinically unsaturated units, where the hydrocarbon radicals preferably have 1 to 6 and particularly preferably 1 to 4 carbon atoms, C 4 -C 14 aryl, which optionally contains heteroatoms, in particular N,
- Dialkyl amino the (dialkyl) amino radical preferably comprising primary or secondary amino groups and the alkyl radicals each preferably 1 to
- 1 8 more preferably 1 to 6 and particularly preferably 1 to 4 carbon atoms, may be straight-chain or branched and may optionally have one or more olefinically unsaturated units.
- At least one of the radicals A, B, C, D, E, F and G can be a reactive group which forms a covalent bond with a carrier substance
- A, B and C can also represent a residue selected from O, S,
- R 18 is a Ci-Cg-aliphatic or C 4 -C 14 - aromatic radical, which may optionally be substituted.
- Suitable substituents are, for example, the reactive or ionizable ⁇ or ionized groups.
- R is preferably the radical (CH 2 ) n COOH or (CH 2 ) n NH 2 .
- D can furthermore represent Cl or a C 4 -C 14 aromatic or a CC 18 aliphatic ring system, which may optionally have a reactive group selected from isothiocyanates, isocyanates, monochlorotriazines, dichlorotriazines, azeridines, sulfonyl halides, N-hydroxysuccinimide esters, imidoesters, glyoxals , Aldehydes, maleiimides, iodoacetamides and phosphoramidites can be substituted.
- a reactive group selected from isothiocyanates, isocyanates, monochlorotriazines, dichlorotriazines, azeridines, sulfonyl halides, N-hydroxysuccinimide esters, imidoesters, glyoxals , Aldehydes, maleiimides, iodoacetamides and phosphoramidites can be substituted
- the invention relates to substituted quinoline and pyridine derivatives of the general formula (la) or (Ib) or (lla) or (Mb)
- the reactive group can be selected from the following functionalities: isothiocyanates, isocyanates, monochlorotriazines, dichlorotriazines, aziridines, sulfonyl halides, N-hydroxysuccinimide esters, imido esters, glyoxal or aldehydes for amine and hydroxyl functions or maleimides or iodoacetamides for thiol functions and Phosphoramidites for labeling DNA or RNA or their fragments.
- These reactive groups can also be bonded to the actual chromophore via spacer groups of the general empirical formula - (CH 2 ) n -, where n can assume values from 1 to 1 8;
- the substituents R and R 12 also include bridging via four-, five- and six-membered ring systems, where one or more of the above-mentioned reactive groups can also be located on this.
- Such ring bridges of the polymethine chain are shown below. So it can Structure stand for or
- the structural unit can stand for
- substituents A, B, C, D, E, F and G can have the same functionalities as R T to R 15 .
- A, B and C can be O, S, C (CN) 2 or NRg, where R 18 in NR 18 is an aliphatic or aromatic or a reactive aliphatic or aromatic radical such as (CH 2 ) ⁇ COOH or (CH 2 ) n NH 2 can stand.
- D can furthermore stand for Cl or an aromatic or aliphatic ring system, to which reactive substituents are optionally attached analogously to R to R 15 ;
- At least one of the substituents R to R 15 is an ionizable or ionized substituent such as S0 3 ' , PO 3 2 " , COO " or N (R 16 ) 3 + , which determines the hydrophilic properties of this dye;
- the definitions for the radicals are in each case as described hereinbefore.
- the compounds according to the invention in particular have an absorption or fluorescence in a range> 400 nm, preferably> 450 nm, particularly preferably> 600 nm and most preferably> 630 nm and up to preferably 900 nm.
- the use of marker substances with an absorption in the range> 600 nm enables high penetration depths in the tissue, since there is no disturbing absorption by the tissue in this wavelength range. It is furthermore possible, by suitable selection of the ring systems or the substituents, to adjust the dyes according to the invention to suit all diode light sources.
- the dyes according to the invention Due to the choice of the substituents according to the invention, in particular the choice of the quinolinium or pyridinium residues, which are six-ring heterocycles, the dyes according to the invention have an absorption maximum which is in the long-wave range in comparison to conventionally substituted polymethine dyes with the same polymethine chain length. In this way it is possible to produce absorbent dyes with relatively short polymethine chain lengths in the long-wave range. Since longer polymethine chains in particular are susceptible to degradation, a higher stability of the dyes according to the invention can be obtained.
- the invention further comprises a process for the preparation of a reactive substituted quinoline or pyridinium derivative according to one of the preceding claims, comprising the steps of: a) providing a pyridine or quinoline heterocycle which has a methyl substituent in the ortho-para position, b) alkylating the ortho - or para-methyl-substituted pyridine or quinoline heterocycle on the nitrogen atom, a salt or an inner salt being formed, c) adding a C, C 3 or C 5 building block to the ortho or para methyl group, d) forming a reactive polymethine dye by reacting with another heterocyclic salt or inner salt.
- the alkylation of the ortho- or para-methyl-substituted pyridine or quinoline heterocycle on the nitrogen atom is preferably carried out at a temperature of 110 to 150 ° C., it being possible to use all conventional alkylating reagents.
- the alkylation can be carried out either without solvents or with customary solvents used for the alkylation.
- a C, C 3 or C 5 building block is preferably added to the ortho or para methyl group at the boiling point (under reflux) using a solvent.
- Preferred solvents are alcohols, such as ethanol or methanol, and a mixture of butanol and toluene.
- a polymethine dye by reaction with a further heterocyclic salt or inner salt also preferably takes place in a solvent, in particular an alcohol, such as ethanol or methanol or a butanol / toluene mixture.
- a solvent in particular an alcohol, such as ethanol or methanol or a butanol / toluene mixture.
- the reactive group is activated by one or more of the substituents R 1 to R 15 after the preparation of the polymethine dye.
- the activation is preferably carried out in a solvent such as DMF, DMSO, a slightly alkaline buffer such as PBS or a bicarbonate buffer at room temperature, preferably at 10 ° C. to 50 ° C.
- the salt or inner salt used in step d) is preferably a nitrogen-containing heterocycle, the nitrogen carrying a positive charge.
- Synthesis building blocks which are required for the preparation of the dyes according to the invention are commercially available. These include, for example, lepidine, quinaldine, 2-picoline, 4-picoline, 9-methylacridine, benzothiazole, 2,3,3-trimethylindolenine and 2,3,3-trimethyl-4,5-benzo-3H-indole.
- hydrophilic and reactive groups can also easily be carried out by alkylating the heterocyclic nitrogen (R 14 , R 15 ) with suitable reagents, for example ⁇ -haloalkanoic acids, ⁇ -haloalkyiacetates, sultones, ⁇ -haloalkylphosphonic acids or their esters.
- suitable reagents for example ⁇ -haloalkanoic acids, ⁇ -haloalkyiacetates, sultones, ⁇ -haloalkylphosphonic acids or their esters.
- a C ,, C 3 or C 5 building block is then added to the reactive methyl group of the heterocycle. This is done, for example, by reaction with N, N'-diphenylformamidine, orthocarboxylic acid esters, malondialdehyde dianil or its hydrochloride, malondialdehyde tetraacetal, squaric acid (or its derivatives), glutacondialdehyde dianil or its hydrochloride or using the
- a symmetrical or asymmetrical polymethine dye is obtained, which usually carries a reactive group (R ⁇ ... R 15 ).
- a compound (1) which is a salt, obtained by alkylation of a paramethylquinoline at 110 ° C. to 150 ° C. is first reacted with a C building block under reflux in ethanol / methanol or butanol / toluene.
- the C building block is attached to the methyl group, so that compound (3) has two (from the final three) C atoms of the polymethine chain.
- the compound (3) is then reacted in an alcohol with a heterocyclic inner salt (compound 2) which also contains an ionized group (S0 3 ).
- connection PB-630 is formed.
- PB-630 is then activated at room temperature in a solvent such as DMF to form the PB-630-NHS ester.
- the resulting product absorbs and fluoresces in the spectral range above 400 nm, in particular above 450 nm. This means that its fluorescence can be excited with - diode light sources and the fluorescence signal can be excited using a suitable optical device detectable.
- substituted quinoline or pyridine derivatives of the general formula (la) or (Ib) or (lla) or (Mb) can be used as dyes for the optical labeling of carrier substances, in particular proteins, nucleic acids such as DNA or RNA, biological cells, lipids, polymers or pharmaceuticals can be used.
- the functional groups of the compounds of the general formula (Ia) or (Ib) or (Ila) or (Mb) are the reactive ones with appropriate selection Group is able to covalently couple to an OH-NH 2 or SH function. This creates a system for the qualitative or quantitative determination of proteins, nucleic acids such as DNA or RNA, biological cells, lipids, organic or inorganic polymers or pharmaceuticals.
- This coupling reaction can be aqueous, preferably predominantly aqueous. Solution and preferably at room temperature, in particular between 1 0 ° C and 50 ° C. This creates a conjugate, which preferably has fluorescent properties.
- Both the compounds of the general formula (la) or (Ib) or (lla) or (Mb) and systems produced therefrom can be determined in optical, in particular fluorescence-optical qualitative and quantitative determination methods, including immunoassays, hybridization methods, chromatographic or electrophoretic methods and the high-throughput method. Screenings are used.
- Table 1 shows the width of the through
- the compounds according to the invention are particularly suitable for use as a dye for optically marking a carrier substance.
- the marking is preferably carried out by covalent coupling of the compound to a suitable functional group of the carrier substance, for example an OH, NH 2 or SH group.
- the carrier substance is preferably selected from biomolecules, such as proteins, peptides, nucleic acids, such as DNA or RNA and lipids, and from organic, biological and / or inorganic oligomers or polymers as well as from drugs, biological cells and also from polymer particles.
- the compounds according to the invention can also be used for coloring inorganic or organic polymer particles, the coloring being possible both covalently and non-covalently, for example by incorporation.
- the coloring compound can be introduced into the polymer particles or arranged on the surface of the polymer particles.
- polymer particles with a diameter of 10 nm to 5 ⁇ m are colored.
- Magnetic particles, in particular polymer particles with a magnetic core, are particularly preferably colored or marked, since numerous detection or separation methods can be carried out in a simple manner with such particles.
- the invention further comprises a method for the qualitative and / or quantitative detection of an analyte, which is characterized in that a sample containing the analyte is reacted with a quinoline or pyridine derivative according to the invention and the quinoline or pyridine derivative via the reactive group covalently couples to the analyte and the conjugate of quinoline or pyridine derivative and analyte is determined.
- the analyte is preferably selected from biological molecules, such as proteins, Nucleic acids, e.g. B. DNA or RNA, lipids, drugs, inorganic or organic oligomers and / or polymers, biological cells and polymer particles.
- the analyte preferably has an OH, NH 2 or SH function to which the quinoline or pyridine derivative is covalently coupled.
- a specific binding reagent for example a nucleic acid hybridization probe, an antibody or an antigen or a partner of a specific binding pair, for example biotin or avidin, is coupled with the dye according to the invention and then the conjugate of the coupled binding partner and analyte is detected.
- the compounds according to the invention can be used in aqueous solution, so that the coupling reaction is preferably carried out in aqueous solution.
- optical properties in particular the absorption and fluorescence properties of the dyes according to the invention can be adjusted by a suitable choice of the auxochrome groups (cf. e.g. Table 1 in FIG. 2).
- the optical properties are preferably set such that the conjugate of dye and analyte has fluorescent properties.
- Optical, in particular fluorescence-optical determination methods can be used to determine the labeled conjugates, for example immunoassays, hybridization methods, chromatographic or electrical methods and high-throughput screening.
- the present invention relates to water-soluble marker dyes which are derived from the pyridine heterocycle. You are able to bind with biomolecules such as. B. proteins, lipids, polynucleotides, DNA, drugs or pharmaceuticals as well as with polymer particles. They are used for staining, especially fluorescent labeling of these materials.
- the labeled molecules or particles can then in optical, in particular fluorescence-optical determination methods are used. Typical methods are based on the reaction of dye-labeled antigens, antibodies or DNA segments with the respective complementary species.
- the reagents required to carry out the methods according to the invention can be provided in the form of a reagent kit.
- Such a reagent kit contains, for example, a reactive dye for coupling to an analyte as well as suitable buffers or a binding partner coupled with a reactive dye for the analyte sought and suitable buffers and optionally further auxiliary reagents.
- Figure 1 shows the absorption (left side) or fluorescence spectra
- FIG. 2 shows Table 1, in which the absorption maxima of various trimethine compounds according to the invention are shown for different end groups.
- the trimethine compounds in Table 1, in which both end groups are bonded to the methine unit via a hetero five-membered ring, are given as comparative examples.
- PB-630 35 mg was dissolved in a mixture of 1 ml of DMF, 1 ml of 1,4-dioxane and 0.5 ml of water. 25 mg of TSTU and 1 l of p ⁇ diisopropylethylamine were added. The reaction mixture was then stirred for 50 minutes at room temperature and then filtered. The solvent was then stripped off and the product was dried in a desiccator over P 2 O 5 . 6.
- PB-630 NHS esters (approx. 0.5 mg) were dissolved in 50 ⁇ l DMF. 5 mg HSA were dissolved in 750 ⁇ l bicarbonate buffer (0.1 mol / l, pH 9.0). The dye solution was slowly added to the protein solution and stirred for 20 hours at room temperature. The reaction mixture was dialyzed against a phosphate buffer (22 mmol / l, pH 7.2) using a dialysis membrane (1 500 FT, Union Carbide) with a cut-off of 1 0.000.
- FIG. 1 shows the fluorescence spectra of dissolved PB-630 and of PB-630 covalently bound to HSA (conjugate prepared according to
- Example 7 The integral fluorescence intensity increased six-fold when bound to the protein.
- the particle suspension was a solution of the desired dye, eg. B. 1 - (3-Methyl-benzothiazol-2-yl) -3- (1 -octadecyl- ⁇ 4> Quinolyl) trimethinium perchlorate, (10 mg in 1 ml toluene) added in 20 ⁇ l portions. Care was taken to ensure that a further portion was only added when the previous portion had completely dissolved and was no longer on the surface of the stirred suspension.
- the desired dye eg. B. 1 - (3-Methyl-benzothiazol-2-yl) -3- (1 -octadecyl- ⁇ 4> Quinolyl) trimethinium perchlorate, (10 mg in 1 ml toluene) added in 20 ⁇ l portions. Care was taken to ensure that a further portion was only added when the previous portion had completely dissolved and was no longer on the surface of the stirred suspension.
- the particles obtained in this way have a fluorescence with a maximum at 652 nm.
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft wasserlösliche Markerfarbstoffe, welche sich vom Chinolin oder Pyridin-Heterocyclus ableiten. Sie sind in der Lage, Bindungen mit Biomolekülen wie z.B. Proteinen, Lipiden, Polynucleotiden, DNA, Arzneistoffen oder Pharmaka sowie mit Polymer-Partikeln einzugehen. Sie dienen der Anfärbung, insbesondere der Fluoreszenzmarkierung dieser Materialien. Die so markierten Moleküle bzw. Partikel können dann in optischen, insbesondere fluoreszenz-optischen Bestimmungsverfahren eingesetzt werden. Typische Verfahren beruhen auf der Reaktion von farbstoffmarkierten Antigenen, Antikörpern oder DNA-Segmenten mit der jeweils komplementären Spezies.
Description
Pyridin- und Chinolin-Farbstoffe als Marker für Biomoleküle, Polymere, Arzneistoffe und Partikel
Beschreibung
Die Erfindung betrifft Chinolinium- bzw. Pyridiniumderivate, die insbesondere als Marker für Biomoleküle, Polymere, Arzneistoffe und Partikel geeignet sind.
Die Fluoreszenzmarkierung von Biomolekülen mit Farbstoffen, deren Absorptionen und Emissionen im roten ( > 600 nm) und nahem infraroten ( > 700 nm) Spektralbereich liegen, findet u.a. Anwendungen in der Biotechnologie und medizinischen Diagnostik [Methods Enzymol. 246 ( 1 995) 362-73] . Gegenwärtig werden dazu oft reaktive Cyaninfarbstoffe (Polymethine) verwendet, die im Chromophor symmetrisch sind. Das heißt, die beiden heterocyclischen Endgruppen der Polymethinkette sind identisch bzw. unterscheiden sich nur in der Art der Stickstoffsubstituenten. Auch werden fast ausschließlich Hetero-Inden-Derivate als Endgruppen verwendet. Dazu gehören u.a. die Ringysteme des 3,3-Dialkylindols,
Benzothiazols, Benzoxazols und ihre benzoanellierten Analoga (siehe z.B. US
- Patent 5569766; US Patent 5800995; WO 97/40104) . Um mit solchen
Endgruppen eine Absorption bei über 600 nm zu erreichen, sind aber mindestens 5 C-Atome in der exocyclischen Polymethinkette notwendig. Eine derart lange Polymethinkette vermindert allerdings die Stabilität des Farbstoff-Chromophors.
Pyridinium- und Chinolinium-Farbstoffe mit Funktionalitäten, die sie als Interkalatoren für DNA und RNA geeignet machen, sind aus dem US-Patent 541 0030 und WO 97/1 7076 bekannt. Interkalatoren sind aber als Reaktivfarbstoffe ungeeignet.
Pease beschreibt polymethinartige Quadratsäure-Farbstoffe, die als fluoreszierende Marker verwendet werden können (US Patent 541 6214; US Patent 531 0992; US Patent 4830786) . Dabei sind die Endgruppen aus der Reihe der Fünfring-Hetero-Indene bzw. der Aniline ausgewählt.
Die bisher beschriebenen Marker-Farbstoffe weisen in ihrer Gesamtheit einen oder mehrere der folgenden Nachteile auf: ungenügende Photo- oder Lagerstabilität aufwendige Synthese- bzw. Reinigungsschritte geringe Absorptionskoeffizienten bzw. Fluoreszenzquantenausbeuten unerwünschte Änderung der optischen Eigenschaften in Gegenwart von - oder nach -Bindung an Proteine oder Nucleinsäureoiigomere.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand deshalb darin, neue Verbindungen bereitzustellen, die als Marker-Farbstoffe verwendet werden können und mit denen die Nachteile der bekannten Marker-Farbstoffe zumindest teilweise ausgeräumt werden können.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Chinolinium- oder Pyridiniumderivat der allgemeinen Formel (la), (Ib), (Ha) oder (llb):
(la) Ob)
oder
(Ha) (üb) worin Z für eine Gruppe
steht, worin X ein Element ausgewählt aus der Gruppe O, S, Se oder ein Struktureiement ausgewählt aus NR17, C(CH3)2 oder CH = CH darstellt; mindestens einer der Reste R, bis R15 und gegebenenfalls R17 eine reaktive Gruppe umfasst, die eine kovalente Verknüpfung mit einem Trägermolekül ermöglicht und insbesondere ausgewählt ist aus Isothiocyanaten, Isocyanaten , Monochlortriazinen, Dichlortriazinen, Aziridinen,
Sulfonylhalogeniden, N-Hydroxysuccinimidestern, Imidoestern, Glyoxalen, Aldehyden, Maleimiden, lodacetamiden und Phosphoramiditen; mindestens einer der Reste R- bis R15 und gegebenenfalls R17 eine ionisierbare oder ionisierte Gruppe umfasst und die übrigen Reste R1 bis R15 sowie der Rest R17 bei jedem Auftreten unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoff, Halogen, C C18-Alkoxy, CrC18-Alkyl, C4-C14-Aryl, welches gegebenenfalls Heteroatome enthalten kann, CτC-8-Acyl, Nitro, Cyano und (Dialkyl)amino, wobei die Reste R und R12 auch vier-, fünf- oder sechsgliedrige Ringsysteme bilden können und einer oder mehrere Reste R. bis R10 auch kondensierte aromatische oder/und heterocyclische Ringe bilden können und m für die Zahlenwerte 1 , 2 oder 3 steht.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind - in unterschiedlichem Ausmaß - von den genannten Nachteilen der Marker des Standes der Technik frei. So weisen die erfindungsgemäßen Verbindungen eine hervorragende Foto- sowie Lagerstabilität auf. Weiterhin können die erfindungsgemäßen Verbindungen, wie im Folgenden beschrieben, ausgehend von kommerziell erhältlichen Ausgangsprodukten in hohen Ausbeuten mittels einfacher Syntheseschritte erhalten werden. Die Verbindungen weisen zudem hohe Extinktionskoeffizienten bzw. Fluoreszenzquantenausbeuten auf. Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Chinolin- bzw. Pyridinderivate besteht darin, dass die optischen Eigenschaften, wie etwa das Absorptionsverhalten, in Gegenwart von und insbesondere nach einer Bindung an Trägermoleküle, wie etwa Proteine oder Nukleinsäuren im allgemeinen nicht verschlechtert werden. Wie beispielsweise der Figur 1 zu entnehmen ist, kann teilweise sogar eine Verbesserung der optischen Eigenschaften, beispielsweise der Absorption bzw. der Fluoreszenz für Konjugate aus Protein und erfindungsgemäßer Verbindung im Vergleich zur nicht gebundenen Verbindung erhalten werden. So können die Fluoreszenzeigenschaften des Konjugats deutlich erhöht sein, was die
erfindungsgemäßen Verbindungen insbesondere zur Verwendung als Fluoreszenzmarkerstoffe geeignet macht.
Alle erfindungsgemäßen Verbindungen weisen einen Stickstoff enthaltenden 6-Ring-Heterozyklus als einen der Substituenten an der Polymethingruppierung auf. Der Rest Z umfasst die Polymethingruppierung sowie die zweite auxochrome Gruppe.
Bei den erfindungsgemäßen Verbindungen handelt es sich um Reaktivfarbstoffe, d.h. um Farbstoffe, die neben der farbgegebenden chromophoren Komponente mindestenseine Reaktivkomponente umfassen, über die sie durch Reaktion mit funktionellen Gruppen an Trägersubstanzen kovalent gebunden werden können. Entsprechend umfasst mindestens einer der Reste R- bis R15 eine reaktive Gruppe, die eine kovalente Verknüpfung mit einem Trägermolekül ermöglicht. Die Reste R- bis R15 können dabei selbst die reaktive Gruppe darstellen. Bevorzugt weist der mindestens eine
Rest R-, bis R15, der eine reaktive Gruppe umfasst, jedoch die
Zusammensetzung -W-V auf, worin V die reaktive Gruppe bezeichnet und
W eine Spacergruppe darstellt, über die die reaktive Gruppe am eigentlichen Chromophor gebunden ist. Die Spacergruppe weist bevorzugt die allgemeine
Summenformel -(CH2)n- auf, wobei n Werte von 1 bis 1 8 annehmen kann.
- Die Spacergruppe kann geradkettig oder verzweigt sein. Die reaktive Gruppe kann aber auch über andere Spacergruppen an das Chromophor gebunden sein.
Die reaktive Gruppe kann eine kovalente Bindung an Amin- oder/und Hydroxy-Funktionen der Trägersubstanz ermöglichen, wofür insbesondere die funktioneilen Gruppen Isothiocyanat, Isocyanat, Monochlortriazin, Dichlortriazin, Aziridin, Sulfonylhalogenid, N-Hydroxysuccinimidester, Imidoester, Glyoxal oder Aldehyd geeignet sind. Falls das erfinduπgsgemäße Chinolin- oder Pyridinderivat zur Bindung an eine Trägersubstanz vorgesehen ist, die eine Thiolfunktion aufweist, wird die reaktive Gruppe bevorzugt aus
Maleiimid oder lodazetamid ausgewählt. Die reaktive Gruppe Phosphoramidit ist insbesondere für die Markierung von Nukleinsäuren, wie etwa DNA oder RNA, oder deren Bruchstücke geeignet.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen mindestens eine reaktive Gruppe. Während theoretisch jeder der Reste R- bis R15 eine reaktive Gruppe umfassen kann, sind Farbstoffe mit höchstens drei, mehr bevorzugt höchstens zwei reaktiven Gruppen bevorzugt. Am meisten bevorzugt sind Verbindungen, in denen genau ein Rest R, bis R15 eine reaktive Gruppe enthält.
Weiterhin umfasst mindestens einer der Reste R. bis R15 der Verbindungen eine ionisierbare oder ionisierte Gruppe. Diese ionisierbare oder ionisierte Gruppe bestimmt die hydrophilen Eigenschaften des Farbstoffs. Bevorzugt wird dieser mindestens eine Rest so ausgewählt, dass ein wasserlöslicher Farbstoff erhalten wird, wobei bereits eine geringe Wasserlöslichkeit ausreicht, bei der der Farbstoff nicht aus einer wässrigen Lösung ausfällt, lonisierbare Gruppen sind insbesondere Gruppen, welche in wässrigen Umgebungen Ionen bilden, beispielsweise durch Abspaltung oder Aufnahme eines Protons. Bevorzugt wird die ionisierbare oder ionisierte Gruppe ausgewählt aus S03 ", PO3 2', COO" und N(R16)3 + , wobei Gruppen, die zu
- Anionen ionisierbar bzw. als Anionen ionisiert sind, bevorzugt sind. R16 bedeutet C.-C^-Alkyl. Es ist möglich, dass der mindestens eine Rest R-, bis
R15 selbst die ionisierbare oder ionisierte Gruppe darstellt. Es ist auch möglich, dass ein eine ionisierbare oder ionisierte Gruppe enthaltender Rest R, bis R15 die allgemeine Formel W-l aufweist, worin I die ionisierbare oder ionisierte Gruppe und W eine Spacergruppe, wie oben definiert, darstellt.
Die übrigen Reste R, bis R15, die keine reaktive Gruppe oder ionisierbare oder ionisierte Gruppe umfassen, werden bei jedem Auftreten unabhängig voneinander aus den folgenden Gruppen ausgewählt: Wasserstoff,
Halogen, insbesondere Fluor, Chlor, Brom oder lod,
CT-C-g-Alkoxy, C^C-s-Alky! oder C C18-Acyl, wobei es sich bei den
Kohlenwasserstoffketten um unverzweigte oder verzweigte Ketten handeln kann, die gegebenenfalls ein oder mehrere olefinisch ungesättigte Einheiten enthalten, wobei die Kohlenwasserstoffketten bevorzugt 1 bis 6 und am meisten bevorzugt 1 bis 4 Kohlenstoffatome aufweisen,
C4-C14-Aryl, welches gegebenenfalls Heteroatome, insbesondere ausgewählt aus N, 0 oder/und S enthalten kann, wobei Phenyl- und Naphthylreste besonders bevorzugt sind, Nitro,
Cyano und
(Dialkyl)amino, wobei es sich bevorzugt um primäre oder sekundäre Aminogruppen handelt und es sich bei den Alkylresten jeweils unabhängig voneinander um einen
insbesondere einen C.,-C6-Alkyl und besonders bevorzugt um einen C1-C4-Alkylrest handelt, der geradkettig oder verzweigt sein kann und gegebenenfalls eine oder mehrere olefinisch ungesättigte Einheiten enthalten kann.
Die Reste R und R12 können, zusammen mitden Polymethin-Kohlenstoffen, an die sie gebunden sind, auch 4-, 5- oder 6-gliedrige Ringsysteme bilden, die eine Verbrückung des Polymethinsystems bilden. Die an den Resten R^ - bis R15 enthaltene mindestens eine reaktive Gruppe kann dann auch an diese
Ringsysteme gebunden vorliegen. Weiterhin ist es möglich, dass einer oder mehrere der Reste R bis R10, die an die auxochromen Ringsysteme der erfindungsgemäßen Verbindungen gebunden sind, mit diesen höher kondensierte aromatische oder/und heterocyclische Ringe bilden.
m kann schließlich für die Zahlenwerte 1 , 2 oder 3 stehen, woraus sich dann jeweils drei, fünf bzw. sieben kohlenstoffatomige Polymethinketten ergeben.
Für den Fall, dass die Reste R und R12 eine Ringverbrückung bilden, steht die Struktureinheit
bevorzugt für
oder die Struktureinheit
bevorzugt für
worin die Reste A, B, C, D, E, F und G unabhängig voneinander ausgewählt sind aus
Wasserstoff,
Halogen, insbesondere Fluor, Chlor, Brom oder Jod, C.-C-g-Alkoxy, C C18-Alkyl, CrC18-Acyl, wobei die Alkylketten geradkettig oder verzweigt sein können und gegebenenfalls eine oder mehrere olefinisch ungesättigte Einheiten enthalten können, wobei die Kohlenwasserstoffreste bevorzugt 1 bis 6 und besonders bevorzugt 1 bis 4 Kohlenstoffatome aufweisen, C4-C14-Aryl, welches gegebenenfalls Heteroatome, insbesondere N,
O oder/und S enthalten kann, wobei Phenyl- und Naphtylreste bevorzugt sind,
Nitro, Cyano und
(Dialkyl)amino, wobei der (Dialkyl)aminorest bevorzugt primäre oder sekundäre Aminogruppen umfasst und die Alkylreste jeweils bevorzugt 1 bis
1 8, mehr bevorzugt 1 bis 6 und besonders bevorzugt 1 bis 4 C-Atome enthalten, geradkettig oder verzweigt sein können und gegebenenfalls eine oder mehrere olefinisch ungesättigte Einheiten aufweisen können.
Gegebenenfalls kann mindestens einer der Reste A, B, C, D, E, F und G eine reaktive Gruppe, die eine kovalente Bindung mit einer Trägersubstanz
- ermöglicht und insbesondere ausgewählt ist aus Isothiocyanaten,
Isocyanaten , Monochlortriazinen, Dichlortriazinen, Aziridinen,
Sulfonylhalogeniden, N-Hydroxysuccinimidestern, Imidoestern, Glyoxalen, Aldehyden, Maleimiden, lodacetamiden und Phosphoramiditen oder/und eine ionisierbare oder ionisierte Gruppe, wie oben beschrieben, umfassen.
A, B und C können weiterhin einen Rest darstellen, ausgewählt aus O, S,
C(CN)2 oder N-R18, worin R18 einen Ci-C-g-aliphatischen oder C4-C14- aromatischen Rest darstellt, der gegebenenfalls substituiert sein kann.
Geeignete Substituenten sind z.B. die oben genannten reaktiven oder
ionisierbareπ oder ionisierten Gruppen. Bevorzugt steht R für den Rest (CH2)nCOOH oder (CH2)nNH2.
D kann weiterhin Cl oder ein C4-C14-aromatisches oder ein C C18- aliphatisches Ringsystem darstellen, welche gegebenenfalls mit einer reaktiven Gruppe, ausgewählt aus Isothiocyanaten, Isocyanaten, Monochlortriazinen, Dichlortriazinen, Azeridinen, Sulfonylhalogeniden, N- Hydroxysuccinimidestern, Imidoestern, Glyoxalen, Aldehyden, Maleiimiden, lodazetamiden und Phosphoramiditen substituiert sein können.
Insbesondere betrifft die Erfindung substituierte Chinolin- und Pyridinderivate der allgemeinen Formel (la) oder (Ib) oder(lla) oder (Mb)
(la) (Ib)
oder
wobei Z für
steht,
- X für ein Element aus der Gruppe O, S, Se, bzw. ein Struktruelement NR17, C(CH3)2 oder CH = CH steht; - zumindest einer der Substituenten R- bis R15 für eine reaktive Gruppe stehen kann, welche eine kovalente Verknüpfung des Farbstoffes mit einem Trägermolekül ermöglicht. Die reaktive Gruppe kann aus folgenden Funktionalitäten ausgewählt werden: Isothiocyanate, Isocyanate, Monochlortriazine, Dichlortriazine, Aziridine, Sulfonylhalogenide, N- Hydroxysuccinimidester, Imido-Ester, Glyoxal oder Aldehyd für Amin- und Hydroxy-Funktionen bzw. Maleimide oder lodacetamide für Thiol- Funktionen sowie Phosphoramidite für die Markierung der DNA oder RNA oder deren Bruckstücke. Diese reaktiven Gruppen können auch über Spacer- Gruppen der allgemeinen Summenformel -(CH2)n- am eigentlichen Chromophor gebunden sein, wobei n Werte von 1 bis 1 8 annehmen kann;
- m für die Zahlenwerte 1 , 2, oder 3 steht;
- die Substituenten R und R12 auch eine Verbrückung über vier-, fünf- und sechsgliedrige Ringsysteme beinhaltet, wobei sich auch an dieser eine oder mehrere der oben genannten reaktiven Gruppen befinden können. Solche Ringverbrückuπgen der Polymethinkette sind im Folgenden gezeigt. So kann die
Stru tureinlieit stehen für oder
Die Struktureinheit kann stehen für
wobei die Substituenten A, B, C, D, E, F und G die gleichen Funktionalitäten wie RT bis R15 besitzen können. Zusätzlich können A, B und C für O, S, C(CN)2 bzw N-R-g stehen, wobei R18 in N-R18 für einen aliphatischen oder aromatischen bzw. einen reaktiven aliphatischen oder aromatische Rest wie (CH2)πCOOH oder (CH2)nNH2 stehen kann. D kann weiterhin für Cl oder ein aromatisches bzw. aliphatisches Ringsystem stehen, an dem gegebenenfalls reaktive Substituenten analog zu R- bis R15 angebracht sind;
- zumindest einer der Substituenten R, bis R15 einen ionisierbaren bzw. ionisierten Substituenten wie S03 ', PO3 2", COO" oder N(R16)3 + darstellt, der die hydrophilen Eigenschaften dieses Farbstoffes bestimmt;
- und die Substituenten R- bis R10 auch für höher kondensierte aromatische oder heterocyclische Ringe stehen können.
Die Definitionen für die Reste sind dabei jeweils wie hierin zuvor beschrieben.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen weisen insbesondere eine Absorption bzw. eine Fluoreszenz in einem Bereich > 400 nm, bevorzugt > 450 nm, besonders bevorzugt > 600 nm und am meisten bevorzugt > 630 nm und von bis zu bevorzugt 900 nm auf. Die Verwendung von Markerstoffen mit einer Absorption im Bereich > 600 nm ermöglicht hohe Eindringtiefen im Gewebe, da in diesem Wellenlängenbereich keine störende Absorption durch das Gewebe auftritt. Weiterhin ist es möglich durch geeignete Wahl der Ringsysteme bzw. der Substituenten die erfindungsgemäßen Farbstoffe passend für alle Diodenlichtquellen einzustellen.
Durch die Wahl der erfindungsgemäßen Substituenten, insbesondere die Wahl der Chinolinium- bzw. Pyridiniumreste, bei denen es sich um Sechsring-Heterozyklen handelt, weisen die erfindungsgemäße Farbstoffe bei gleicher Polymethinkettenlänge ein Absorptionsmaximum auf, das im Vergleich zu herkömmlich substituierten Polymethinfarbstoffen im langwelligeren Bereich liegt. Auf diese Weise ist es möglich, im langwelligen Bereich absorbierende Farbstoffe mit relativ kurzen Polymethinkettenlängen herzustellen. Da gerade längere Polymethinketten anfällig gegenüber einem Abbau sind, kann dadurch eine höhere Stabilität der erfindungsgemäßen Farbstoffe erhalten werden.
Weiterhin umfaßt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines reaktiven substituierten Chinolin- oder Pyridiniumderivats nach einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend die Schritte: a) Bereitstellen eines Pyridin- oder Chinolinheterozyklus, der in ortho- para-Position einen Methylsubstituenten aufweist, b) Alkylieren des ortho- oder para-Methyl-substituierten Pyridin- oder Chinolinheterozyklus am Stickstoffatom, wobei ein Salz oder ein inneres Salz gebildet wird, c) Anfügen eines C , C3- oder C5-Bausteins an die ortho- oder para- Methylgruppe,
d) Bilden eines reaktiven Polymethinfarbstoffes durch Umsetzen mit einem weiteren heterocyclischen Salz oder inneren Salz.
Die Alkylierung des ortho- oder para-Methyl-substituierten Pyridin- oder Chinolinheterozyklus am Stickstoffatom wird bevorzugt bei einer Temperatur von 1 1 0 bis 1 50 °C durchgeführt, wobei alle herkömmlichen Alkylierungsreagenzien verwendet werden können. Die Alkylierung kann sowohl lösungsmittelfrei als auch mit üblichen für die Alkylierung verwendeten Lösungsmitteln durchgeführt werden.
Das Anfügen eines C , C3- oder C5-Bausteins an die ortho- oder para- Methylgruppe erfolgt bevorzugt in der Siedehitze (unter Rückfluss) unter Verwendung eines Lösungsmittels. Bevorzugte Lösungsmittel sind Alkohole, wie etwa Ethanol oder Methanol sowie ein Gemisch aus Butanol und Toluol.
Die Bildung eines Polymethinfarbstoffs durch Umsetzen mit einem weiteren heterocyclischen Salz oder inneren Salz erfolgt ebenfalls bevorzugt in einem Lösungsmittel, insbesondere einem Alkohol, wie etwa Ethanol oder Methanol oder einem Butanol/Toluol-Gemisch.
Gegebenenfalls wird die reaktive Gruppe von einem oder mehreren der - Substituenten R, bis R15 nach Herstellung des Polymethinfarbstoffs aktiviert. Die Aktivierung wird bevorzugt in einem Lösungsmittel, wie etwa DMF, DMSO, einem leicht alkalischen Puffer, wie etwa PBS oder einem Bicarbonatpuffer bei Raumtemperatur, bevorzugt bei 1 0 °C bis 50 °C, durchgeführt.
Bei dem in Schritt d) eingesetzten Salz oder inneren Salz handelt es sich bevorzugt um einen Stickstoff-enthaltenden Heterozyklus, wobei der Stickstoff eine positive Ladung trägt.
Synthesebausteine, die zur Darstellung der erfindungsgemäßen Farbstoffe erforderlich sind, sind kommerziell erhältlich. Dazu gehören beispielsweise Lepidin, Chinaldin, 2-Picolin, 4-Picolin, 9-Methylacridin, Benzothiazol, 2,3,3- Trimethylindolenin und 2,3,3-Trimethyl-4,5-benzo-3H-indol. Andere lassen sich durch Ringschlußreaktionen (2-Methylchinolin-6-sulfonsäure, 4- Methylchinolin-6-sulfonsäure, 2,3,3-Trimethylindol-5-sulfonsäure u.a.) bzw. Sufonierungsreaktionen (monosulfoniertes 2,3,3-Trimethyl-4, 5-benzo-3H- indol, 4-Methylchinolin-6-sulfonsäure u.a.) relativ einfach herstellen.
Die Einführung weiterer hydrophiler und reaktiver Gruppen kann über die Alkylierung des heterocyclischen Stickstoffs (R14, R15) mit geeigneten Reagenzien, z.B. ω-Halogenalkansäuren, ω-Halogenalkyiacetaten, Sultonen, ω-Halogenalkylphosphonsäuren bzw. deren Ester ebenfalls leicht erfolgen.
Über einen weiteren Reaktionsschritt wird dann an die reaktive Methylgruppe des Heterocyclus ein C,, C3 oder C5-Baustein angefügt. Dies geschieht beispielsweise durch Umsetzung mit N,N'-Diphenylformamidin, Orthocarbonsäureestern, Malondialdehyd-Dianil oder dessen Hydrochlorid, Malondialdehyd-Tetraacetal, Quadratsäure (bzw. deren Derivaten), Glutacondialdehyd-Dianil oder dessen Hydrochlorid oder Anwendung der
Vilsmeier-Formylierung, wobei der C, , C3 bzw. C5-Baustein weitere
- Substituenten tragen kann (R , R12, R13), einschließlich geeigneter
Ringsysteme. In einem nächsten Schritt wird die zweite Endgruppe ankondensiert, und man erhält schließlich einen symmetrischen bzw. unsymmetrischen Polymethinfarbstoff, der üblicherweise eine reaktive Gruppe (R^ ... R15) trägt.
Eventuell sind noch weitere Reaktionsschritte nötig, um die reaktive Gruppe in eine Form zu bringen, in der sie an ein Biomolekül, Partikel oder einen Arzneistoff bindet.
Ein bevorzugter Syntheseweg ist in den Ausführungsbeispielen beschrieben. Dabei wird eine durch Alkylierung eines Paramethylchinolin bei 1 1 0 °C bis 1 50 °C erhaltene Verbindung ( 1 ), welche ein Salz darstellt, zunächst mit einem C Baustein unter Rückfluss in Ethanol/Methanol oder Butanol/Toluol umgesetzt. Dabei wird der C Baustein an die Methylgruppe angehängt, sodass die Verbindung (3) zwei (von den schließlichen drei) C-Atomen der Polymethinkette aufweist. Die Verbindung (3) wird dann in einem Alkohol mit einem, heterocyclischen inneren Salz (Verbindung 2), welches zudem eine ionisierte Gruppe (S03 ) enthält, umgesetzt. In diesem Schritt wird die Verbindung PB-630 gebildet. PB-630 wird dann bei Raumtemperatur in einem Lösungsmittel, wie etwa DMF, aktiviert, wobei der PB-630-NHS-Ester gebildet wird.
Um die durch chemische Reaktion erhaltenen Farbstoffe aus den Reaktiongemischen zu isolieren, können Verfahren wie Kristallisation, selektive Extraktion oder Chromatographie eingesetzt werden.
Nach der Umsetzung und Aufarbeitung des Farbstoffs mit dem entsprechenden Biomolekül, Partikel oder Arzneistoff absorbiert und fluoresziert das entstandene Produkt im Spektralbereich oberhalb von 400 nm, insbesondere oberhalb von 450 nm. Somit ist seine Fluoreszenz mit - Diodenlichtquellen anregbar und das Fluoreszenzsignal über eine geeignete optische Einrichtung detektierbar.
Die substituierten Chinolin- oder Pyridinderivate der aligemeinen Formel (la) oder (Ib) oder (lla) oder (Mb) können als Farbstoffe zur optischen Markierung von Trägersubstanzen, insbesondere von Proteinen, Nukleinsäuren wie etwa DNA oder RNA, biologischen Zellen, Lipiden, Polymeren oder Pharmaka verwendet werden.
Die funktionellen Gruppen der Verbindungen der allgemeinen Formel (la) oder (Ib) oder (lla) oder (Mb) sind bei entsprechender Auswahl der reaktiven
Gruppe in der Lage, kovalent an eine OH- NH2- oder SH-Funktion zu koppeln. Somit entsteht ein System zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung von Proteinen, Nukleinsäuren wie etwa DNA oder RNA, biologischen Zellen, Lipiden, organischen oder anorganischen Polymeren oder Pharmaka.
Diese Kopplungsreaktion kann in wässriger, bevorzugt in überwiegend wässriger . Lösung und vorzugsweise bei Raumtemperatur, insbesondere zwischen 1 0 °C und 50 °C durchgeführt werden. Dabei entsteht ein Konjugat, welches bevorzugt fluoreszierende Eigenschaften aufweist.
Sowohl die Verbindungen der allgemeinen Formel (la) oder (Ib) oder (lla) oder (Mb) und daraus hergestellte Systeme können in optischen, insbesondere fluoreszenzoptischen qualitativen und quantitativen Bestimmungsverfahren einschließlich Immuntests, Hybridisierungsverfahren, chromatographischer oder elektrophoretischer Verfahren und des Hoch- Durchsatz-Screenings eingesetzt werden.
Durch synthesechemische Variation der beiden heterocyclischen Endgruppen der Trimethine lassen sich Absorption und Emission der
Farbstoffe nahezu beliebig steuern und sogar an die Emissionslinien von
- roten und NIR-Laserdioden anpassen. Tabelle 1 zeigt die Breite der durch
Variation der Substituenten erzielbaren Wellenlängen.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind insbesondere zur Verwendung als Farbstoff zur optischen Markierung einer Trägersubstanz geeignet. Bevorzugt erfolgt die Markierung durch kovalente Kopplung der Verbindung an eine geeignete funktioneile Gruppe der Trägersubstanz, beispielsweise eine OH-, NH2- oder SH-Gruppe. Die Trägersubstanz wird bevorzugt ausgewählt aus Biomoleküien, wie etwa Proteinen, Peptiden, Nukleinsäuren, wie etwa DNA oder RNA und Lipiden sowie aus organischen, biologischen
und/oder anorganischen Oligomeren oder Polymeren sowie aus Arzneimitteln, biologischen Zellen und auch aus Polymerpartikeln.
Bevorzugt werden zur Markierung 1 bis 1 0, besonders bevorzugt 1 bis 7 Farbstoffmoleküle pro Mol der Trägersubstanz kovalent gekoppelt. Weiterhin können die erfindungsgemäßen Verbindungen auch zum Anfärben von anorganischen oder organischen Polymerpartikeln eingesetzt werden, wobei die Anfärbung sowohl kovalent als auch nicht-kovalent, beispielsweise durch Einlagerung erfolgen kann. Die farbgebende Verbindung kann dabei in die Polymerpartikel eingebracht oder auf der Oberfläche der Polymerpartikel angeordnet werden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsformen werden Polymerpartikel mit einem Durchmesser von 1 0 nm bis 5 μm angefärbt. Besonders bevorzugt werden magnetische Partikel, insbesondere Polymerpartikel mit einem magnetischen Kern angefärbt oder markiert, da mit solchen Partikeln zahlreiche Nachweis- bzw. Separationsverfahren auf einfache Weise durchgeführt werden können.
Die Erfindung umfasst weiterhin ein Verfahren zum qualitativen oder/und quantitativen Nachweis eines Analyten, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man eine den Analyten enthaltende Probe mit einem Chinolin- oder Pyridinderivat gemäß der Erfindung umsetzt und dabei das Chinolin- oder - Pyridinderivat über die reaktive Gruppe kovalent an den Analyten koppelt und das Konjugat aus Chinolin- oder Pyridinderivat und Analyt bestimmt.
Aufgrund der hervorragenden Fluoreszenzeigenschaften der erfindungsgemäßen Verbindungen handelt es sich hierbei um ein hochsensitives Verfahren. Daneben ist es selbstverständlich auch möglich, ein Nachweisreagenz, welches selbst mit dem zu bestimmenden Analyten bindet, mit einer erfindungsgemäßen Markierung zu kennzeichnen und ein derartiges Konjugat zum Nachweis des Analyten einzusetzen. Der Analyt wird bevorzugt ausgewählt aus biologischen Molekülen, wie etwa Proteinen,
Nukleinsäuren, z. B. DNA oder RNA, Lipiden, Arzneimitteln, anorganischen oder organischen Oligomeren oder/und Polymeren, biologischen Zellen und Polymerpartikeln. Für den Fall der direkten Kopplung weist der Analyt bevorzugt eine OH-, NH2- oder SH-Funktion auf, an die das Chinolin- bzw. Pyridinderivat kovalent gekoppelt wird. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird ein spezifisches Bindereagenz, beispielsweise eine Nukleinsäurehybridisierungssonde, ein Antikörper bzw. ein Antigen oder ein Partner eines spezifischen Bindepaares, etwa Biotin oder Avidin mit dem erfindungsgemäßen Farbstoff gekoppelt und dann das Konjugat aus gekoppeltem Bindepartner und Analyt nachgewiesen.
Aufgrund der Löslichkeitseigenschaften können die erfindungsgemäßen Verbindungen in wässriger Lösung eingesetzt werden, sodass die Kopplungsreaktion bevorzugt in wässriger Lösung durchgeführt wird.
Durch geeignete Wahl der auxochromen Gruppen können die optischen Eigenschaften, insbesondere die Absorptions- und Fluoreszenzeigenschaften der erfindungsgemäßen Farbstoffe eingestellt werden (vgl. z.B. Tabelle 1 in Figur 2) . Bevorzugt werden die optischen Eigenschaften derart eingestellt, dass das Konjugat aus Farbstoff und Analyt fluoreszierende Eigenschaften aufweist. Zur Bestimmung der markierten Konjugate können optische, insbesondere fluoreszenzoptische Bestimmungsverfahren verwendet werden, beispielsweise Immunotests, Hybridisierungsverfahren, chromatographische oder elektrische Verfahren und Hoch-Durchsatz- Screening.
Die vorliegende Erfindung betrifft wasserlösliche Markerfarbstoffe, welche sich vom Pyridin-Heterocyclus ableiten. Sie sind in der Lage, Bindungen mit Biomolekülen wie z. B. Proteinen, Lipiden, Polynucleotiden, DNA, Arzneistoffen oder Pharmaka sowie mit Polymer-Partikeln einzugehen. Sie dienen der Anfärbung, insbesondere der Fluoreszenzmarkierung dieser Materialien. Die so markierten Moleküle bzw. Partikel können dann in
optischen, insbesondere fluoreszenz-optischen Bestimmungsverfahren eingesetzt werden. Typische Verfahren beruhen auf der Reaktion von farbstoffmarkierten Antigenen, Antikörpern oder DNA-Segmenten mit der jeweils komplementären Spezies. Die zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren erforderlichen Reagenzien können in Form eines Reagenzienkits bereitgestellt werden. Ein solcher Reagenzienkit enthält z.B. einen Reaktivfarbstoff zur Kopplung an einen Analyten sowie geeignete Puffer oder einen mit einem Reaktivfarbstoff gekoppelten Bindepartner für den gesuchten Analyten und geeignete Puffer sowie gegebenenfalls weitere Hilfsreagenzien.
Die Erfindung wird durch die beigefügten Figuren und die folgenden Beispiele weiter erläutert.
Figur 1 zeigt die Absorptions- (linke Seite) bzw. Fluoreszenzspektren
(rechte Seite) von PB-630-NHS-Ester in freier Form bzw. in kovalent an HSA (humanes Serumalbumin) gebundener Form. Es ist eine Erhöhung der Absorption und eine beträchtliche Erhöhung der Fluoreszenz zu sehen.
Figur 2 zeigt die Tabelle 1 in der die Absorptionsmaxima von verschiedenen erfindungsgemäßen Trimethinverbindungen für verschiedene Endgruppen dargestellt sind. Die Trimethinverbindungen in Tabelle 1 , in denen beide Endgruppen über einen Heterofünfring an die Methineinheit gebunden sind, sind als Vergleichsbeispiele angegeben.
A usführungsbeispiele
1. Darstellung von 1-(5-Carboxypentyl)-4-methyl-chinoliniumbromid (1)
1 0,0 g (0,07 mol) 4-Methylchinolin und 1 5,6 g (0,08 mol) 6- Bromhexansäure wurden in 200 ml 1 ,2-Dichlorbenzol 72 Stunden unter
Stickstoff bei 1 10 °C refluxiert. Nach dem Abkühlen wurde das
Lösungsmittel abdekantiert und der Rückstand durch Behandlung mit 2-
Propanol auskristaliisiert. Das Produkt wurde mit Aceton gewaschen und im Exsikkator über CaCI2 getrocknet.
2. Darstellung von 2-Methyl 3-(4-sulfonatobutyl)- benzothiazolium-Betain (2) 5 1 0,0 g (0,067 mol) 2-Methylbenzothiazol und 9, 1 g (0,067 mol) Butansulton wurden 3 Stunden unter Stickstoff bei 1 30 °C zur Reaktion gebracht. Nach dem Abkühlen wurde mit Ether gewaschen und 3 Stunden im Vakuum getrocknet.
o .Darstellungvon l-(5-Carboxypentyl)-4-acetanilinovinylchinoliniumbromid (3)
2,0 g (6 mmol) 1 -(5-Carboxypentyl)-4-methyl-chinoliniumbromid ( 1 ) und 1 ,2 5 g (6 mmol) N,N'-Diphenylformamidin-Hydrochlorid wurden in Acetanhydrid 30 min unter Rückfluß erhitzt. Nach dem Erkalten wurde das Produkt mit Ether aus der Reaktionslösung gefällt. Die erhaltene ölige Substanz wurde vakuumgetrocknet und ohne weitere Reinigungsschritte weiterverarbeitet. Ausbeute: 83 %. 0
4. Darstellung von l-(5-carboxypentyl)-4- < 3-(3-(4-sulfonatobutyl)-3H- benzothiazol-2-yliden)-propenyl> -chinolinium-Betain (PB-630)
0,5 g 2-Methyl 3-(4-Sulfonatobutyl)- benzothiazolium-Betain (2) und 0,85 g 1 -(5-Carboxypentyl)-4-acetanilinovinylchinoliniumbromid (3) wurden 20 Minuten in Pyridin unter Rückfluß erhitzt. Nach dem Abkühlen wurde das Rohprodukt mit Diethylether gefällt. Die Aufarbeitung erfolgte durch Chromatographie auf einer präparativen Kieselgelplatte (Fa. Merck, Kieselgel 60, 2mm) (Eluent: CHCI3/MeOH 1 : 1 ) . Ausbeute: 1 3 %.
5. Darstellung von PB-630-NHS-ester mit 0-(N-Succinimidyl)-NrN,N'rNr- tetramethyl-uronium-tetrafluoroborat (TSTU)
35 mg PB-630 wurden in einem Gemisch aus 1 ml DMF, 1 ml 1 ,4-Dioxan und 0,5 ml Wasser gelöst. Dazu gab man 25 mg TSTU und 1 1 p\ Diisopropylethylamin. Die Reaktionsmischung wurde dann 50 Min. bei Raumtemperatur gerührt und anschließend filtriert. Dann wurde das Lösungsmittel abgezogen und das Produkt im Exsikkator über P2O5 getrocknet.
6. Darstellung von PB-630-NHS-ester mit N-Hydroxysuccinimid (NHS)/N,Nr- Dicyclo-hexylcarbodiimid (DCC)
1 5 mg PB-630, 1 4 mg DCC und 4 mg NHS wurden in 1 ml trockenem DMF gelöst. Dann gab man 10 μ\ Triethylamin zu. Das Reaktionsgemisch wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und anschließend filtriert. Dann wurde das Lösungsmittel abgezogen, der Rückstand mit Ether gewaschen und am Ölpumpenvakuum getrocknet. Dieser Schritt verlief quantitativ.
7. Allgemeine Vorschrift zur Markierung von Proteinen Die Proteinmarkierungen wurden in einem 50 mmol/l Bicarbonatpuffer (pH 9,0) ausgeführt. Es wurde eine Stammlösung mit 1 mg Reaktivfarbstoff (z. B. PB-630-NHS-ester) in 1 00 μl DMF hergestellt. 1 0 mg Protein wurden in 1 ml Bicarbonatpuffer gelöst, worauf verschiedene Mengen an Farbstoff aus der Stammlösung hinzugegeben wurden. Dann wurde das Reaktionsgemisch 20 - 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Der freie Farbstoff wurde vom markierten Protein entweder durch Gelchromatographie oder duch Dialyse abgetrennt. Der Markierungsgrad des Farbstoff-Konjugates wurde mit einem BCA Protein Assay Kit von Pierce, Rockford bestimmt und lag bei Humanserum-Albumin (HSA) zwischen 1 ,2 und 4,9 Molekülen Farbstoff pro Proteinmolekül.
8. Markierung von polyclonalem anti-HS A mit PB-630-NHS-ester 385 μl anti-HSA (c = 5,2 mg/ml) wurden in 750 μl Bicarbonatpuffer (0, 1 mol/l, pH = 9,0) gelöst. 1 mg PB-630-NHS-ester wird in 50 μl DMF gelöst, und die Farbstofflösung wurde langsam unter Rühren in die Proteinlösung gegeben, wonach noch weitere 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt wurde. Der markierte Antikörper wurde vom freien Farbstoff durch Gelchromatographie getrennt. Als stationäre Phase diente Sephadex G50, als Laufmitτel wurde Phosphatpuffer (22 mmol/l, pH 7,2) verwendet. Die blaue Bande des markierten Antikörpers wurde dabei zuerst eluiert.
9. Markierung von HSA mit PB-630-NHS-ester
PB-630-NHS-ester (ca. 0,5 mg) wurdenin 50 μl DMF gelöst. 5 mg HSA wurden in 750 μl Bicarbonatpuffer (0, 1 mol/l, pH 9,0) gelöst. Die Farbstofflösung wurde langsam zu der Proteinlösung gegeben und 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde gegen einen Phosphatpuffer (22 mmol/l, pH 7,2) unter Verwendung einer Dialysemembran ( 1 500 FT, Union Carbide) mit cut-off von 1 0.000 dialysiert.
10. Absorptions- und Fluoreszenzspektren von gelöstem und gebundenem
PB-630
- Die Abbildung 1 zeigt die Fluoreszenzspektren von gelöstem PB-630 und von kovalent an HSA gebundenem PB-630 (Konjugat hergestellt nach
Beispiel 7) . Die integrale Fluoreszenzintensität stieg beim Binden an das Protein auf das Sechsfache.
7 7. Darstellung von 2-Methyl- 1-(4-Sulfonato-butyl)-chinolinium-Betain (4) 1 0 g (0,07 mol) 2-Methylchinolin und 9,5 g (0,07 mol) Butansulton wurden drei Stunden unter Stickstoff bei 1 30 °C zur Reaktion gebracht. Nach dem Abkühlen wurde mit Ether gewaschen und im Vakuum getrocknet. Ausbeute 50 %.
72. Darstellung von 1-(5-Acetoxypentyl)-4-methyl-chinoliniumbromid (5) 1 0 g (0,07 mol) 4-Methylchinolin und 14,6 g (0,07 mol) 5-Bromoamylacetat wurden vier Stunden unter Stickstoff bei 1 20 °C zur Reaktion gebracht. Nach dem Abkühlen wurde das viskose Öl mehrmals mit Ether behandelt und danach im Vakuum getrocknet. Das Produkt wurde ohne weitere Reinigung eingesetzt. Ausbeute 60 %.
13. Darstellung von 1-(4-sulfonatobutyl)-2-acetaniiidovinylchinolinium-Betain (6)
2 g (7 mmol) 2-Mehtγl-1 -(4-Sulfonato-butyl)-chinolinium-Betain und 1 ,4 g (7 mmoI) N,N'-Diphenylformamidin-Hydrochlorid wurden in Acetanhydrid 20 Minuten unter Rückfluß erhitzt. Nach dem Erkalten wurde das ölige Produkt mit Ether aus der Reaktionslösung ausgefällt und danach mehrmals mit Ether gewaschen und im Vakuum getrocknet. Das Produkt wurde ohne weitere Reinigung eingesetzt. Ausbeute 78 %.
14. Darstellung von 0B-657-0H
,5 g ( 1 ,4 mmol) 1 -(5 und 0,6 g (1 ,4 mmol) 1 -(4-suifonatobutγl)-2-acetanilidovinylchinolinium-Betain wurden in 1 0 ml Pyridin 20 Minuten unter Rückfluß erhitzt, wobei sich die Reaktionslösung tief blau färbte. Nach dem Abkühlen wurde die noch
acetylierte Zwischenstufe mit Ether gefällt, im Vakuum getrocknet und in 1 0 ml Methanol gelöst. Zu dieser Lösung wurden 250 mg Natriumcarbonat gegeben. Danach wurde eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt und mit Ether gefällt. Die Reinigung des Produktes erfolgte über eine präparative Säule (C1 8-Kieselgei, Methanol/Wasser 1 : 1 ). Ausbeute: 1 9 % .
15. Darstellung von OB-657 -phosphoramidit
200 mg OB-657-OH wurden in trockenem DMF gelöst. Zu dieser Lösung wurden 0, 1 5 ml N,N-Diisoprσpylamin und im Verlauf einer Stunde dreimal je 40 μl 2-Cyanoethyl-N,N-Diisopropylchlorophosphoramidit hinzugegeben. Der Reaktionsverlauf wurd dünnschicht-chromatographisch verfolgt. Nach quantitativem Ablauf der Reaktion kann die Lösung direkt zur Markierung von DNA eingesetzt werden. Absorptionsmaximum (Methanol) : 657 nm.
16. Darstellung von 1-(5-Carboxypentyl)-4-(3-(1-(5-carboxypentyl)- l H- chinolin-4-yliden)-propenyl)-chinoliniumbromid (PB710)
Man löst 338 mg (1 mmol) 1 -(5-Pentylcarbonsäure)-lepidiniumbromid in 3 ml Pyridin, gibt 2 ml Orthoameisensäuremethylester zu und refluxiert die Lösung 2 h lang. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur versetzt man die Reaktionsmischung mit 20 ml Diethylether und saugt das ausgefallene Produkt ab. Zur chromatographischen Reinigung wird das erhaltenene Rohprodukt in Chloroform / Methanol 1 : 1 gelöst und auf die Säule aus Kieselgel-60 aufgetragen. Man eluiert zuerst mit Methanol / Chloroform 1 : 1 bis sich die vorauslaufende blaue Zone von den Verunreinigungen absetzt, dann mit Methanol. Für die Weiterverarbeitung zum Aktivester kann jedoch auch das Rohprodukt verwendet werden.
Ausbeute: 48 mg (0,08 mmol, 1 6 %)
17. Darstellung von PB-710-NHS-ester
Man löst 1 07 mg (0, 1 8 mmol) PB-710-Vorstufe (Rohprodukt), 83 mg (0,72 mmol) NHS, 149 mg DCC (0,72 mmol) in 4 ml DMF und gibt 60 μL Triethylamin zu. Die Reaktioπsmischung wird unter Lichtausschluß 20 h bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend filtriert man durch Glaswolle und zieht das DMF am Rotationsverdampfer ab. Das Rohprodukt wird chromatographisch auf Kieselgel-60 mit Chlorform / Methanol 7:3 gereinigt. tiefblaue Kristalle, C37H40BrN3O6 (M = 702.65 g/mol)
Ausbeute: 1 8, 1 mg (0,026 mmol, 14 %) Schmelzpunkt: 67°C
18. Allgemeine Vorschrift zum Färben von Polystyren-Mikropartikeln
500 μl einer 8 %-igen Lösung der Mikropartikel (IDC, Portland, Oregon) wurden in einer Mischung aus 1 2 ml bidestilliertem Wasser und 1 2,5 ml Methanol suspendiert.
Unter kräftigem Rühren mit einem glasummantelten Magnetrührer wurde der Partikelsuspension im Verlauf mehrerer Stunden eine Lösung des gewünschten Farbstoffs, z. B. 1 -(3-Methyl-benzothiazol-2-yl)-3-( 1 -octadecyl-
< 4 > chinolyl)-trimethinium-perchlorat, ( 1 0 mg in 1 ml Toluen) in 20 μl- Portionen hinzugefügt. Dabei wurde darauf geachtet, daß erst dann eine weitere Portion hinzugegeben wurde, wenn sich die vorherige Portion vollständig gelöst hatte und sich nicht mehr auf der Oberfläche der gerührten Suspension befand.
Nach Beendigung der Farbstoffzugabe wurde noch weitere 1 0 Stunden gerührt. Anschließend wurden die gefärbten Partikel durch Zentrifungation abgetrennt und durch mehrmaliges Waschen mit bidestilliertem Wasser und Zentrifugation gereinigt.
Die so erhaltenen Partikel weisen nach Anregung mit einem 635nm Diodenlaser oder einem 633 nm He-Ne-Laser eine Fluoreszenz mit einem Maximum bei 652 nm auf.
Claims
Ansprüche
Chinoiinium- oder Pyridiniumderivat der allgemeinen Formel (la), (Ib), (lla) oder ( b) :
) (Ib)
oder
(na) (üb)
worin Z für eine Gruppe
steht, worin X ein Element ausgewählt aus der Gruppe O, S, Se oder ein Strukturelement ausgewählt aus NR17, C(CH3)2 oder CH = CH darstellt; mindestens einer der Reste R. bis R15 und gegebenenfalls R17 eine reaktive Gruppe umfasst, ausgewählt aus Isothiocyanaten,
Isocyanaten, Monochlortriazinen, Dichlortriazinen, Aziridinen,
Sulfonylhalogeniden, N-Hydroxysuccinimidestern, Imidoestem,
Glyoxalen, Aldehyden , Maleimiden, lodacetamiden und
Phosphoramiditen; mindestens einer der Reste R- bis R15 und gegebenenfalls R17 eine ionisierbare oder ionisierte Gruppe umfasst und die übrigen Reste R, bis R15 und gegebenenfalls R17 bei jedem
Auftreten unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoff,
Halogen, CrC18-Alkoxy, C C18-Alkyl, C4-C14-Aryl, welches gegebenenfalls Heteroatome enthalten kann, C C18-Acyl, Nitro,
Cyano und (Dialkyl)amino, wobei die Reste R und R12 auch vier-, fünf- oder sechsgliedrige
Ringsysteme bilden können und einer oder mehrere Reste R-, bis R10 auch kondensierte aromatische oder/und heterocyclische Ringe bilden können und m für die Zahlenwerte 1 , 2 oder 3 steht.
Chinoiinium- oder Pyridiniumderivat nach Anspruch 1 , d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t ,
dass die Reste R und R12 eine Ringverbrückung bilden, wobei die Struktureinheit
für
steht oder die Struktureinheit
für
steht, worin die Reste A, B, C, D, E, F und G unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoff, Halogen, C C18-Alkoxy, CrC18- Alkyl, C4-C14-Aryl, welches gegebenenfalls Heteroatome enthalten kann, C C18-Acyl, Nitro, Cyano und (Dialkyl)amino und gegebenenfalls mindestens einer der Reste A, B, C, D, E, F und G eine reaktive Gruppe umfassen kann, ausgewählt aus Isothiocyanaten, Isocyanaten, Monochlortriazinen, Dichlortriazinen, Aziridinen, Sulfonylhalogeniden, N-Hydroxysuccinimidestern, Imidoestern, Glyoxalen, Aldehyden, Maleimiden, lodacetamiden und
Phosphoramiditen oder/und eine ionisierbare oder ionisierte Gruppe umfassen kann, worin A, B und C weiterhin einen Rest darstellen können, ausgewählt aus O, S, C(CN)2 oder N-R18, worin R18 einen C--C18-aliphatischen oder C5-C14-aromatischen Rest darstellt, der gegebenenfalls substituiert sein kann,
D weiterhin Cl oder ein C5-C14-aromatisches oder ein C--C18 aliphatisches Ringsystem darstellen kann, das gegebenenfalls mit einer reaktiven Gruppe ausgewählt aus Isothiocyanaten, Isocyanaten, Monochlortriazinen, Dichlortriazinen, Aziridinen, Sulfonylhalogeniden,
N-Hydroxysuccinimidestern, Imidoestern, Glyoxalen, Aldehyden, Maleiimiden, Jodazetamiden und Phosphoramiditen substituiert sein kann.
Chinoiinium- oder Pyridiniumderivat nach Anspruch 1 , d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass die reaktive Gruppe von mindestens einem Rest R- bis R15 über Spacer-Gruppen der allgemeinen Summenformel -(CH2)n- an das Chromophor gebunden ist, wobei n Werte von 1 bis 1 8 annehmen kann .
4. Chinoiinium- oder Pyridiniumderivat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d a d u rc h g e ke n n ze i c h n et , dass die ionisierbare oder ionisierte Gruppe ausgewählt wird aus SO3 ", PO3 2", COO" oder N(R16)3 +, worin R16 CrC18-Alkyl bedeutet.
5. Chinoiinium- oder Pyridiniumderivat nach Anspruch 1 bis 4, d a d u rc h g e ke n n ze i c h n et , dass es sich um einen 1-(5-Carboxypentyl)-4-[3-(3-(4-sulfonatobutyl)- 3H-benzothiazol-2-yliden)-propenyl]-chinolinium-Betain-NHS-ester oder um einen 1-(5-Carboxypentyl)-4-(3-(1-(5-carboxypentyl)-1 H- chinolin-4-yliden)-propenyl)-chinoliniumbromid-NHS-ester handelt.
6. Verfahren zur Herstellung eines substituierten reaktiven Chinolin- oder Pyridiniumderivats nach einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend die Schritte: a) Bereitstellen eines Pyridin- oder Chinolinheterozyklus, der in ortho-para-Position einen Methylsubstituenten aufweist, b) Alkylieren des ortho- oder para-Methyl-substituierten Pyridin- oder Chinolinheterozyklus am Stickstoffatom, wobei ein Salz oder ein inneres Salz gebildet wird, c) Anfügen eines C , C3- oder C5-Bausteins an die ortho- oder para-Methylgruppe, d) Bilden eines Polymethinfarbstoffes durch Umsetzen mit einem weiteren heterocyclischen Salz oder inneren Salz.
7. Verfahren nach Anspruch 6, weiterhin umfassend den Schritt der Aktivierung von einem oder mehreren der Substituenten R^ bis R15.
8. Verwendung eines Chinoiinium- oder Pyridiniumderivats nach einem der Ansprüche 1 bis 5 als Farbstoff zur optischen Markierung einer Trägersubstanz.
9. Verwendung nach Anspruch 8, d a d u rc h g e ke n n z e i c h n et , dass die Trägersubstanz ausgewählt wird aus Proteinen, Nukleinsäuren, Lipiden, Arzneimitteln, Oligomeren, Polymeren, biologischen Zellen und Polymerpartikeln.
10. Verwendung nach Anspruch 8 oder 9, d a d u rc h g e ke n n z e i c h n et , dass die Trägersubstanz eine funktionelle Gruppe, ausgewählt aus OH, NH2 und SH aufweist.
11. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Anfärbung von anorganischen oder organischen Polymerpartikeln.
12. Verwendung nach Anspruch 11, d a d u rc h g e ke n n ze i c h n et , dass die Anfärbung kovalent oder nicht-kovalent erfolgt.
13. Verwendung nach Anspruch 11 oder 12, d a d u rc h g e ke n n z e i c h n et , dass mindestens eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 in die Polymerpartikel eingebracht wird.
14. Verwendung nach einem der Ansprüche 11 bis 13, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass die Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 an der Oberfläche der Polymerpartikel angeordnet wird.
15. Verwendung nach einem der Ansprüche 8 bis 14, d a d u rc h g e ke n n z e i c h n et , dass Polymerpartikel mit einem Durchmesser von 10 nm bis 5 μm angefärbt werden.
16. Verwendung nach einem der Ansprüche 11 bis 15, d a d u rc h g e ke n n ze i c h n e t , dass magnetische Partikel angefärbt werden.
17. Verfahren zum qualitativen oder/und quantitativen Nachweis eines Analyten, d a d u rc h g e ke n n ze i c h n et , dass man eine den Analyten enthaltende Probe mit einem Chinolin- oder Pyridinderivat nach einem der Ansprüche 1 bis 5 umsetzt und dabei das Chinolin- oder Pyridinderivat über die reaktive Gruppe kovalent an den Analyten koppelt und das Konjugat aus Chinolin- oder Pyridinderivat und Analyt bestimmt.
18. Verfahren nach Anspruch 17, d ad u rch g e ke n nzei c h n et , dass der Analyt ausgewählt aus Proteinen, Nukleinsäuren, Lipiden, Arzneimitteln, Oligomeren, Polymeren, biologischen Zellen und Polymerpartikeln.
19. Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, d ad u rc h g e ke n n z e i c h n et , dass der Analyt eine OH-, NH2- oder SH-Funktion aufweist, an die das Chinolin- oder Pyridinderivat kovalent gekoppelt wird.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 19, d ad u rc h g e k e n n z e i c h n et , dass die Kopplungsreaktion in wässriger Lösung durchgeführt wird.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 20, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , dass das Konjugat fluoreszierende Eigenschaften aufweist.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 21, d a d u rc h g e ke n n ze i c h n et , dass zur Bestimmung des Konjugats ein fluoreszenz-optisches Bestimmungsverfahren verwendet wird.
23. Verwendung nach Anspruch 22, d a d u rc h g e ke n n ze i c h n et , dass ein optisches Bestimmungsverfahren ausgewählt aus Immuntests, Hybridisierungsverfahren, chromatographischen oder elektrophoretischen Verfahren und Hoch-Durchsatz-Screening verwendet wird.
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Non-Patent Citations (1)
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