WO2000052480A1

WO2000052480A1 - Dosage de composant d'un echantillon biologique

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Publication number: WO2000052480A1
Application number: PCT/JP2000/001172
Authority: WO
Inventors: Koji Kishi; Tsutomu Kakuyama; Koji Ochiai; Yuzo Hasegawa
Original assignee: International Reagents Corp
Current assignee: Sysmex International Reagents Co Ltd
Priority date: 1999-03-01
Filing date: 2000-02-29
Publication date: 2000-09-08
Anticipated expiration: 2001-09-01
Also published as: EP1158299A4; US7208287B2; EP1158299A1; KR100682082B1; EP1158299B1; DE60039418D1; US20040161811A1; KR20010103016A; JP4547095B2; CA2363570A1; ATE400816T1

Description

WO 00/52480 PCT/JPOO/0117^

明細書

生体試料成分の測定方法技術分野

本発明は、血清中の特定のリポ蛋白画分中の成分を酵素反応によって測定する手段および方法に関するものである。背景技術

古くからリポ蛋白は、超遠心操作により高比重リポ蛋白（HD L )、低比重リポ蛋白（LD L)、超低比重リポ蛋白（VLD L)、カイロミクロン（CM) に分画されていた。この操作は熟練が必要であり、超遠心機を備え付け、遠心を数日にわたって行う。そのため、多検体を処理することは出来なかった。

これに代わりポリエチレングリコール、またはデキストラン硫酸等のポリア二オンに、マグネシムゃカルシウム等の二価カチオンを共存させたり、リンタングステン酸に二価カチオンを共存させた溶液と血清とを混和させて LD L、 VLD L、 CMを沈澱させ、遠心後の上清に残る H D Lのみを分画する方法が主流となっていた。

この方法は、臨床検査の分野で広く普及している自動分析装置を用いることができる。すなわち分画した HD L中のコレステロールは、既に確立されている自動分析装置を用いた総コレステロールの酵素法による測定を応用して、その濃度を求めることができる。しかしながらこの方法も低速ではあるが遠心操作が必要であり、分画剤と血清を混和させるときの人為的な定量誤差や検体の取り違えなどが問題となっていた。その上、自動分析装置で他の一般的な生化学項目と同時には測定出来なかつた。臨床検査は迅速な対応が求められており、他の検査項目と同時に測定して検査時間を短縮することが課題となっていた。一方、臨床的に動脈硬化のリスクファクタ一である LD L中のコレステロール値を重視する報告 [総コレステロールの基準値と設定根拠：動脈硬化， 24 ( 6 ), 2 80 ( 1 9 9 6 )] もある。現在 L D L中のコレステロール値は総コレステロール（ T— C H 0 )、中性脂肪（ T G)および HD L中コレステロールの測定結果から、経験的なファクタ一を挿入して求める。その式 [ F r i e d e w a 1 d W. T.， e t a l .， C l i n. Chem., 1 8， 49 9〜 5 02 ( 1 9 72 )] は以下である。 L D L中コレステロール値 =

総コレステロ一ル値ー HD Lコレステロ—ル値一 T G値 /5 この方法は、測定する 3項目が全て正確に測定されなければ成立しない。また、 T G値が 400mg/d Lを越えたり、 LD L中のコレステロ一ル濃度が 1 00 m gノ d L以下になると、計算値が L D L中のコレステロール濃度を反映しなくなると言われている [Wa r n i c k G. R.: e t a l .， C l i n. Ch em., 3 6 ( 1 )， 1 5〜： 1 9 ( 1 9 9 0)]， [Mc Nama r a J . R.， e t a l .， C l i n. Ch emリ 3 6 ( 1 ), 3 6〜 42 ( 1 9 9 0 )]。従って、この方法では測定の目的である LD L中のコレステロ一ルの異常値を検出することが難しかった。

また他に、電気泳動でリポ蛋白を分離し蛋白量を測定する方法や、 H P L Cによるリポ蛋白別コレステロ—ルの測定法もあるが、いずれも検体処理能力に欠ける方法であり、高価な専用装置も必要となる。

近年、 HD L中のコレステロール測定に関して前述した問題を解決するため、 HD L中のコレステロールを全自動で測定するキットが開発され普及しつつある。特許第 2 600 06 5号公報、特開平 8— 20 1 3 9 3号公報および特開平 8 - 1 3 1 1 9 5号公報にみられる技術は、分画剤を併用しており、分画剤に含まれる二価カチオンとして用いられる金属が、自動分析装置で一般的に使用される洗剤により不溶性の沈殿物を形成し、それが該装置の廃液機構内で蓄積することにより、故障の原因となっている。

更に、測定反応中に不溶性の凝集物を形成し、測定結果に影響を与える濁りが生じて測定誤差の原因となっているばかりか、その凝集物により反応セルが汚染され、同時に測定している他の生化学項目の測定結果に少なからず影響を与えている。

この H D L中のコレステロールの自動測定法では、 2ポイントエンド法、レート法、ダブルレート法、フィックスタイム法などの公知の測光法が選択できるようになっているので、濁ったままの状態でも測定は可能である。しかし、これらの測光法によってもこの濁りの中における測定は、反応中に濁度変化があつたときは、測定値の正確性に問題が生ずる。また、反応液が濁ると再現性が低下する。それ故、測定する検体に制限が加わり、幅広い測定波長を用いることができず、多種多様な患者検体に対応することができない。例えば、 3 4 0 n m付近（短波長域）では凝集物による濁りの現象で吸光度が 2〜 3以上となり分析機の許容範囲をしばしば越えてしまう欠点がある。

二価カチオンを用いることのない特開平 9一 9 6 6 3 7号公報記載の技術は、リポ蛋白と凝集する抗血清とを含ませる方法であるが、これも濁りの原因となる抗原抗体凝集物を形成するので、反応セルが汚染される。従って、同時に測定している他の生化学項目の測定結果に少なからず影響を与える。また、反応液中の濁りが強くなるので、特に短波長域による H D L中のコレステロール測定に対しても前述と同じ原因で正確な測定が不可能である。

これらの技術は、複合体や凝集体を形成することで、酵素反応を阻害する共通の技術と測光法を工夫することで成り立っているものであり、濁り本来が持つ測定への悪影響は、解消されない。このような濁りを最終的に消去する技術が濁り対策の一つである。特閧平 6— 2 4 2 1 1 0 号公報に見られるように、濁りを最終的に消去する操作を加えれば、正確な測定値が得られるようになる。しかし、この方法では最低でも 3〜 4段階の試薬分注操作が必要となる。市販されている自動分析装置の中には 3〜 4段階の試薬分注操作に対応できるものもあるが、一般的に普及している生化学項目用の自動分析装置は最大 2段階の試薬分注操作に対応しているものが多いので、この方法が応用できないことがあつた。一方、 L D L中のコレステロールの測定は、現在も前述したような計算による方法を取らざるを得ない状況である。近年、特開平 0 7 — 2 8 0 8 1 2号公報、 W 0 9 6 / 2 9 5 9 9号公報、特閧平 0 9— 3 1 3 2 0 0号公報記載の技術に見られる、完全自動化を目指した L D L中のコレステロ一ル測定法の報告がある。これらは、凝集体や複合体を形成する技術の延長線上にあるので、測定時の濁りの調整が今後の課題である。発明の開示

本発明が解決しょうとする課題は、血清中の特定のリポ蛋白画分中の成分を酵素反応によって測定する方法において、汎用の自動分析装置を用いて、処理工程中に遠心分離操作をすることなく、また、反応液中に複合体や凝集体による濁りを形成することなく、生体試料中の H D L (高比重リポ蛋白）、 L D L (低比重リポ蛋白）、 V L D L (超低比重リポ蛋白）等のリポ蛋白中の成分を定量する方法を提供することである。

本発明は、血清中の特定リポ蛋白画分中の成分を酵素反応で測定する方法において、特異的に該成分を測定するために、リポ蛋白画分の成分に作用する酵素の反応性を調整する手段を導入することを特徴とする、特定リポ蛋白画分中の成分の測定方法を提供する。特定のリポ蛋白画分の成分に作用する酵素の反応性を調整する手段としては、酵素反応液のイオン強度を調整する物質を添加すること、非イオン界面活性剤を選択すること、および/または特定リポ蛋白に対する反応特異性を有する酵素を選択し用いること、が挙げられる。

本発明は、上記 3つの手段を適宜選択し、単独であるいは組合せて利用することにより、 HD L中の成分の測定法、 L D L中の成分の測定法、および/または V L D L中の成分の測定方法を提供する。

本発明の測定方法は、高比重リポ蛋白（HD L) 中の成分を測定する場合、反応液のイオン強度を十分に高くすること、および/または HD

Lに優先的に作用するリポプロティンリパ一ゼおよび/またはコレステロールエステラーゼを作用させること、およびノまたは HD Lに反応選択性をもち H L B値が 1 6以上である非イオン界面活性剤を使用すること、を導入することを特徴とする。

さらに本発明の測定方法は、低比重リポ蛋白（ L D L) 中のコレステロールを測定する場合、第一酵素反応系においてまず HD L画分中のコレスレロール成分を選択的に酵素反応させて測定または消化し、ついで第二酵素反応系において H L B値が 1 1 ~ 1 3である非イオン界面活性剤を利用して L D L画分中のコレステロ一ル成分を酵素反応により測定する方法を提供する。

さらにまた本発明の測定方法は、第一酵素反応系および第二酵素反応系を同時にまたは別々に行うことにより超低比重リポ蛋白（VLD L) 中のコレステロール成分を残留させ、ついで VL D L画分を分解する手段を導入して V L D L画分中のコレステロール成分を酵素反応により測定する方法を提供する。また、 HD L、 LD Lの消去を伴わず、 V L D

L画分中のコレステロールを測定してもよい。

また本発明の測定方法は、上記本発明の測定方法にコレステロール酸化酵素またはコレステロール脱水素酵素を添加して遊離のコレステロ一ルを消化する工程を加えた測定方法をも含む。上記本発明の測定方法は、その酵素反応液の pHが、リポ蛋白が凝集、または白濁を起こさない範囲であって、リポ蛋白中の成分を酵素反応させる酵素の至適 pHにより選択されることを特徴とする。図面の説明

図 1 ：リポプロテイン ¹リノ一セ、 L P L ;chromobacterium viscosum由来）の添加効果を示した図である。（実験 1 ) 図中、ー秦—は HD L画分、一〇—は L D L画分、 —ローは V L D L画分の反応相対量（％) を示す。図 2 ：ヒドラジンの添加効果を示した図である。（実験 2 ) 図中、ー參一は HD L画分、一〇—は LD L画分、 —ローは V L D L画分の反応相対量（％) を示す。

図 3 ： H L B値が 1 7. 3である非イオン界面活性剤ノニオン K一 2 30の添加効果を示した図である。（実験 3 )図中、ー秦一は HD L画分、一〇—は LD L画分、一口一は VLD L画分の反応相対量（％) を示す。図 4 ：酵素反応液のイオン強度調整物質、非イオン界面活性剤ノニォン K— 2 30、および選択された酵素を添加した効果を示した図である。 (実験 4) 図中、ー秦一は HD L画分、 —〇—は LD L画分、一口—は VLD L画分の反応相対量（％) を示す。発明の実施の最良の形態

本発明の酵素反応液のイオン強度を調整する物質を添加することによる特定リポ蛋白成分に対する酵素の反応性を調整することとは、 HD L、 LD L、 VLD Lの各リポ蛋白画分が水溶解性において差異をもつことから、この性質を利用して特定画分のみを溶解させ、選択的に特定画分中の成分に対して酵素反応を起こすことを意味する。この目的を達成する一手段として、試料中のイオン強度を上昇させる。 HD Lを選択的に溶解させるためのイオン強度は、例えばヒドラジン濃度において約 3 0 mM、より好ましくは 60 mM以上を添加することによって得られる。ヒドラジンとしては、ヒドラジン類、その塩、その水和物、その溶媒和物から、 H D Lの選択溶解性を指標にして選ばれたものが、使用できる。同様に、 Na C l、尿素、グァニジン類、セミカルバジド類も、使用できる。イオン強度を上昇させるこれらの化合物は、単独でまたは複数を組み合わせて使用してもよい。これらの使用濃度は、 HD Lの選択溶解性を指標にして、用時実験的繰返しによって、決定できる。

本発明の、酵素の特定リポ蛋白に対する反応特異性を利用して特定リポ蛋白画分の成分に対して直接的および/または優先的に反応液中で酵素反応を可能とする手段は、 H D L画分に優先的に作用するリポプロテインリパーゼ（ L P L )および/またはコレステロールエステラーゼ（C E ) を選択して行う。この酵素としては、市販の C h r 0 m 0 b a c t e r i u m v i s c o s um由来の L P L、 CEが例示される。なお、 LD L画分を対象にする場合には、 P s e ud omo na s属由来の酵素などを適宜選択することができる。酵素について、各種修飾化は、酵素活性と特定リポ蛋白画分への選択性が維持されていれば、為されても為されなくてもよい。酵素の添加量は、自体公知の基質量に応じて増減され調整される。

本発明の、選択された非イオン界面活性剤の特定リポ蛋白に対する反応選択性を利用して、特定リポ蛋白画分の成分に対して直接的および/ または優先的に反応液中で酵素反応を可能とする手段は、非イオン界面活性剤の H L B値によって特定される。

H D L画分を対象にする場合、 H L B値が 1 6以上のものが選択され、好適には 1 7以上が選択される。より好ましくは、 HLB値が 1 7以上のポリオキシエチレンェ一テル類が選択される。この選択された界面活性剤は、 L D L画分及び V L D L画分に対する L P L、 CE、コレステロール脱水素酵素（CDH) 等の酵素作用を阻害する。具体例を以下に列記するが、本発明に用いる非イオン界面活性剤は、 HLB値を指標にして随時選択可能であり、下記の例に限定されない；セチルエーテル（C 1 6 ) (へキサデシルェ一テル）（商品名：日光ケミカル株式会社： B C 一 2 5 TX、 B C— 30 TX、 B C— 40 ΤΧ)、ラウリルエーテル（C 1 2 ) ( ドデシルエーテル）（商品名：日光ケミカル株式会社： B L— 2 1、 B L— 2 5 )、ォレイルエーテル（商品名：日光ケミカル株式会社： B 0 - 5 0)、ベへニルエーテル（C 2 2 ) (商品名：日光ケミカル株式会社： B B— 30 )、ポリオキシエチレンラウリルェ一テル（商品名：日本油脂株式会社：ノニオン K一 2 3 0 )、ポリオキシエチレンモノラウレート（商品名：日本油脂株式会社：ノニオン S— 40 )、ポリオキシェチレンエーテル類（商品名：シグマ： B r i j 9 8、 B r i j 72 1 , B r i j 78 , B r i j 9 9) 等。

L D L画分または V L D L画分を対象にする場合、とくに積極的に L D L画分の成分への酵素反応を対象とする場合には、 HLB値が 1 1〜 1 3の非イオン界面活性剤が選択される。例示をすれば、トリトン X— 1 00、ノニオン H S 2 1 0、ノニオン A— 1 0 R (日本油脂株式会社）があげられる。しかし、 L D L画分の成分を測定するため使用する界面活性剤も、 H L B値を指標にして随時選択することができ、これらの例に限定されない。

上記界面活性剤の添加量は、測定するリポ蛋白量により変化するが、 H D Lおよび L D Lを対象とした事例において示したのは、検体約 5 μ. Lに対して、界面活性剤濃度 0. 0 1〜 1 0 %の試薬約 1 80〃 Lである。これにより、 HD Lまたは LD Lが選択的に分解され、これらに含まれる成分の酵素反応が可能となる。 V L D Lを対象とする場合には、界面活性剤濃度を 0. 0 5〜2 0 %に調整して使用される。これにより、 V L D Lが選択的に分解され、これに含まれる成分の酵素反応が可能となる。酵素反応がなされる反応液の p Hは、リポ蛋白が凝集または白濁をおこさない範囲であって、リポ蛋白中の成分に作用する酵素の至適 p Hを考慮して選択される。好適には、 p H約 6〜約 9である。 pHが約 6以下であると、リポ蛋白が白濁をおこす。リポ蛋白が比較的安定な p H 7 付近を選択して測定条件を調整すればよいが、 COD (コレステロール酸化酵素）、 CD H (コレステロール脱水素酵素）、 LP L、および CE 等の酵素の至適 p Hも考慮する。好適には、 CDH、 L P L、および C Eの反応は、 p H約 7〜約 9が望ましく、 CODの反応は、 11約6〜約 8が望ましい。反応液は、緩衝液で調整することが好ましく、通常生化学反応に用いられる各種緩衝液が利用できる。例示すれば、 HE P E S 2 ― [ 4一 2 — Hyd r ox y e t hy l) — 1— i p e r a z i n y 1 ] e t hane s u l f o n i c a c i d) 緩衝液、 P I PE S (P i p e r a z i ne— 1 , 4 '—b i s ( 2— e t han e s u l f o n i c a c i d)) 緩衝液、 TAP S (N— T r i s— (h y d r o x yme t h y l ) —me t h y l - 3— am i n o p r o p an e s u l f o n i c a c i d) 緩衝液、 B E S— B i s T r i s 緩衝液、 T r i s—塩酸緩衝液、 3—モルホリノプロパンスルホン酸（M OP S) 緩衝液、リン酸緩衝液、を添加物との適合性により適宜選択して利用する。なお、本発明の実施例および実験例では、 pH条件に合わせて、各々 P I PE S緩衝液および TAP S緩衝液を利用した。

また所望により、 LD L、 VLD Lおよびカイロミクロン中の遊離型コレステロールが、 HD L中のコレステロ一ル測定時の反応に関与して、しばしば誤差の原因となるので、予め CODや CDHでこれらの遊離型コレステロールを反応させてヒドラジン存在下で、コレステノンヒドラゾンに変換し、 H D L中のコレステロール測定時のために、非基質化しておく方法もある。非基質化する技術は公知であり、例えば特開平 5— 1 7 67 97号公報を参考にすればよい。本発明においては、上記 3つの手段、イオン強度の選択、酵素の選択、界面活性剤の選択、を単独でまたは適宜選択し組合せて導入する。より好適にはこれら全ての手段を同時に導入するが、必ずしも全てを同時に導入する必要は無い。

HD L中のコレステロール成分を測定する場合、第一の要件は、水溶性が高い高比重リポ蛋白（HD L) 中の成分を溶液中に溶解しやすくするためにイオン強度を十分な程度に高く調整することであり、第二の要件は H D L画分に優先的に作用するリポプロティンリパ一ゼ（ L P L ) および/またはコレステロールエステラーゼ（CE) を選択して作用させることであり、第三の要件は H D L画分に対して反応選択性をもち H L B値が 1 6以上である非イオン界面活性剤を用いて H D L画分中の成分に対して直接的および/または優先的に反応液中で酵素反応をおこすことである。

リポ蛋白中の成分であるコレステロールを酵素測定法で測定する場合、酵素として CDHを用いるときは補酵素として、 5—ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型（NAD)、チォニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型（t一 NAD)、 ?—ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸酸化型（NADP)、チォニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸酸化型（t一 NAD P) 等を使用する。また、 CODを使用するときは、パ一ォキシダ一ゼ（POD) と公知の過酸化水素定量法を組み合わせて測定を行う。総コレステロールの測定に必要となる酵素の活性化剤であるコール酸類や界面活性剤は、その条件を適宜選択し、実験的繰り返しにより濃度を調整すればよい。

LD L中のコレステロール成分を測定する場合は、まず上記の HD L 画分中のコレステロール成分を第一酵素反応系において選択的に酵素反応させ、ついで第二酵素反応系において L D L画分に対して作用する L P Lおよび/または C Eと L D Lを積極的に分解する界面活性剤とを加え、 CDHによる反応生産物を検出する。

酵素反応生産物の測定は、 CE、 L P L等の酵素作用によって生成される化合物であるコレステロールを定量する自体公知の方法から適宜に以下に示すような測定系を選択して行う。例えば、 CDH— NAD系を用いる場合は 340 nmの吸光度で測定し、 CDH— t— NAD系を用いる場合は 405 nmの吸光度で測定し、 COD系を用いる場合、 5 0

0 nm以上（色原体の種類に依存する）の吸光度で測定する。測光法は、既知のレート法、 2ポイントェンド法等が所望により利用できる。実施例

実施例 1

以下の試薬を調製した。検体は、一般人の血清 1 0例を用いた。測定は、日立 7 1 70型自動分析装置で実施した。操作法は、先ず各検体 5 〃 Lに、試薬 1一 Aまたは Bまたは C 1 80〃 Lをそれそれ加え 37 °C で 5分間恒温し、この時点で主波長 340 nmおよび副波長 570 nm で吸光度 1を測定した。更に、試薬 2を 60〃 L加えて 3 7 °Cで 5分間恒温し、この時点で主波長 340 n mおよび副波長 5 70 n mで吸光度 2を測定した。吸光度 1と吸光度 2の差を求めて、 HD L—コレステロ —ル濃度が既知のコントロールを標準液として検体の値を換算した。対照法としてポリエチレングリコール（P G) 法を用いた。 P G法は国際試薬株式会社製 P Gポールを使用した。また、遠心後の上清のコレテロ —ル濃度は、国際試薬株式会社製 T— CHO試薬 · Αを用いて求めた。測定結果として対照法との比較を表 1に示した。試薬 1— Α、 1— Β、

1一 Cを用いた測定は対照法によく一致した良好な結果となった。試薬 1一 A

緩衝液 p H 7. 0 二塩化ヒドラジニゥム 1 00 mm 01/L ? -N AD 6. 0 mm o 1/L コール酸ナトリウム 0. 1 %

ノニオン K— 230 (HLB値 1 7 3) 0. 6 % 試薬 1一 B

緩衝液 p H 7. 0 二塩化ヒドラジニゥム 1 00 mm o 1/L ? - N AD 6. 0 m m o 1/L

B r i j 9 7 (HLB値 1 9 ) 0. 24%

コ一ル酸ナトリウム 0. 1 % 試薬 1一 C

緩衝液 p H 7. 0 二塩化ヒドラジニゥム 1 00 mm o 1 /L

/5 -N ΑΌ 6. 0 mm 0 1/L ノニオン K一 2 30 (HLB値 1 7. 3) 0. 2%

コレステロール酸化酵素（COD) 1. 0 U/mL コール酸ナトリウム 0. 1 % 試薬 2

緩衝液 p H 8. 5 コレステロール脱水素酵素（CDH) 2 0. 0 U/mL L P L 6. 0 U/mL (Ch r omo b a c t e r i um v s c o s um由来) コール酸ナトリウム 0. 2 % 表 1

単位： m / d L

実施例 2

以下の試薬を調製した。検体は、一般人の血清 1 0例を用いた。測定は、日立 7 1 7 0型自動分析装置で実施した。操作法は、先ず検体 3 Lに試薬 A— 1を 2 1 0 L加え 3 7 °Cで 5分間恒温し、この時点で主波長 3 4 0 nmおよび副波長 5 7 0 nmで吸光度 1を測定した。更に、試薬 A— 2を 7 0 / L加え 3 7 °Cで 5分間恒温し、この時点で主波長 3 4 0 nmおよび副波長 5 7 0 nmで吸光度 2を測定した。吸光度 1 と吸光度 2の差を求めて L D L—コレステロール濃度が既知のコントロ一ルを標準液として検体の値を換算した。試薬 B— 1 と試薬 B— 2も前述と同様に操作する。対照法の値は、フリーデワルド式より求めた。 HD L コレステロール値は、国際試薬株式会社製 P Gポールを使用した。総コレステロール値は、国際試株式会社製 T一 C H 0試薬 · Aを用いて求めた。 T G値は、国際試薬株式会社製 T G試薬 · Aを用いて求めた。測定結果を表 2に示した。本法は、対照法と比べて良好な結果を得た。試薬 A— 1

緩衝液 p H 7. 8 二塩化ヒドラジニゥム 1 0 0 mm 0 1/L コレステロール脱水素酵素（ C D H) 2 0. 0 U/mL ? - N AD 6. 0 mm o 1/L L P L 6. 0 U/mL

^ C r o m o b a c t e r i um v s c o s um由来) ノニオン K一 2 3 0 (H L B値 1 7. 3 ) 0. 1 5 %

コ一ル酸ナトリウム 0. 1 % 試薬 A - 2

緩衝液 p H 8. 5

C E ( P s e u d o mo n a s由来) 3. 0 U/mL ノニオン A— 1 O R 0. 5 %

デォキシコール酸ナトリウム 8. 0 mm 0 1/L 試薬 B - 1

緩衝液 p H 7. 8 二塩化ヒドラジニゥム 1 0 0 mm o 1 /L /S -NAD 5. 0 mm o l/ L コレステロール酸化酵素（ C OD ) 0. 3 U/mL L P L 6. 0 U/mL

( C h r o m o b a c t e r i um v s c o s um由来ノノニオン K— 2 3 0 (H L B値 1 7. 3 ) 0. 1 5 %

コ一ル酸ナトリウム 0. 1 % 試薬 B— 2

緩衝液 p H 8. 5

コレステロール脱水素酵素（ CD H) 2 0. 0 U/mL

C E 3. 0 U/mL

^ P s e u d o mo n a s由来)

ノニオン A— 1 O R 0. 5 %

デォキシコール酸ナトリウム 8. 0 mm o 1 /L 表 2

単位： m g/d L

実験例

以下の試薬を調製し、各ファクタ一の効果を実験 1〜 4で検討した。検体は、一般人の血清 1 0例をプールしたのち、超遠心操作をしてえられる、 HD L、 L D L、および V L D L画分を使用した。測定は、日立 7 1 7 0型自動分析装置で実施した。操作法は、先ず各検体 5 に各々 1 8 0〃 Lの試薬 1— D〜Gを加え、 3 7 °Cで 5分間恒温し、この時点 WO 00/52480 pcT/jpoo/oim

16 で主波長 34 0 nmおよび副波長 5 7 0 nmで吸光度 1を測定した。更に、試薬 1一 D〜Gに各々相応する試薬 2— D〜Gを各 6 0〃L加え、 3 7 °Cで 5分間恒温し、この時点で主波長 34 0 nmおよび副波長 5 7 0 nmで吸光度 2を測定した。吸光度 1 と吸光度 2の差を検定した。実験 1のための試薬一 Dと試薬 2—： D

試薬 1一 D

緩衝液 p H 7. 0

ー NAD 6. 0 mm o 1 / L コール酸ナトリウム 0. 1 % 試薬 2— D

緩衝液 p H 8. 5

コレステロール脱水素酵素（ CD H) 2 0. 0 U/m L L P L 0 - 1 5 U/mL

( C n r o mo b a c t e r i um v i s c o s um由来) コール酸ナトリウム 0. 2 % 実験 2のための試薬 1一 Eと試薬 2— E

試薬 1一 E

緩衝液 p H 7. 0

二塩化ヒドラジニゥム 0〜 1 0 0 mm 0 1 /L

6. 0 mm o 1 / L コール酸ナトリウム 0. 1 % 試薬 2— E

緩衝液 p H 8. 5 コレステロール脱水素酵素（ C D H) 2 0. 0 U/mL L P L 6. 0 U/mL

( C h r o m o b a c t e r i u m v s c o s um由来) コ一ル酸ナトリウム 0. 2 % 実験 3のための試薬 1 一 Fと試薬 2 — F

試薬 1 一 F

緩衝液 p H 7. 0

?一 NAD D . 0 mm o /L ノニオン K一 2 3 0 (H L B値 1 7. 3 ) 0 1 . 0 %

コ一ル酸ナトリウム 0. 1 % 試薬 2 - F

緩衝液 p H 8. 5 コレステロール脱水素酵素（ C D H ) 2 0. 0 U/mL L P L 6. 0 U/mL

( C h r o mo b a c t e r i um V s c o s m由来) コール酸ナトリウム 0. 2 % 実験 4のための試薬 1一 Gと試薬 2— G

試薬 1 一 G

緩衝液 p H 7. 0 二塩化ヒドラジニゥム 1 0 0 mm 0 1 /L 5 - N AD 6. 0 mm o 1 /L ノニオン K一 2 3 0 (H L B値 1 7 . 3 ) 0 1. 0 %

コ一ル酸ナトリウム 0 . 1 % 試薬 2— G

緩衝液 p H 8. 5 コレステロール脱水素酵素（ C D H) 2 0. O U/mL L P L 6. 0 U/mL

(Chr omo b a c t e r i um v i s c o s um由来) コール酸ナトリウム 0. 2 % 実験 1についての考察（図 1 )

Ch r omo b a c t e r i um v i s c o s um由来の LP Lのリポ蛋白画分に対する特異性を調べた結果、 HD Lおよび VLD L画分に対して非常に強く作用し、 L D L画分に対して弱い反応性を示した。この酵素を使って、以下の実験を進めた。なお、各試薬中に、 6 U/m L添加することにした。実験 2についての考察（図 2 )

ヒドラジンの添加効果を確認した。ヒドラジンの添加は、 LP Lの H D L画分に対する特異的反応性を更に強めた。 L D L画分に対する反応性は、殆ど変動が見られなかった。この結果をもとに試薬 1一 Dに、 1 00 m m o 1 / Lのヒドラジンを添加した。実験 3についての考察（図 3)

H L B値 1 7. 3の非イオン界面活性剤のノニオン K一 2 30/日本油脂株式会社を使って、 HD L画分に対する添加効果を確認した。非ィオン界面活性剤の添加は、 L P Lの V L D Lに対する反応性を極端にさげ、 H D L画分に対する特異的反応性を更に強めた。 LD L画分に対する L P Lの反応性も低下させる効果を確認した。この結果をもとに試薬 1— Dに、 0 . 6 %のノニオン K— 2 3 0を添加した。

実験 4についての考察（図 4 )

各手段、すなわちノニオン K一 2 3 0、ヒドラジンおよび L P Lを組合せて用いた結果、より完璧な H D L画分の選択的反応系を確立した。

産業上の利用の可能性

本発明の手段を適宜選択し単独であるいは組合せて導入した特定リポ蛋白画分中の成分の測定方法では、反応液中に形成される複合体や凝集体による濁りが生じることがなく、目的とする特定のリポ蛋白中コレステロールの測定精度を上昇させることができる。

また本発明の測定方法を用いれば、生化学的検査項目を同時に測定してもその測定結果への影響がないため、リポ蛋白中コレステロールの測定と、生化学的検査項目の測定とを同時に行うことが可能となる。また本発明の測定方法は、遠心分離をする必要がなく、試薬分注操作も 2段階であるため、汎用されているほとんどの自動分析装置に適用することができ、測定の簡易化を達成できる。

さらに本発明は、リポ蛋白中のコレステロールのみならず他の脂質成分（中性脂肪、リン脂質等）の測定にも応用可能である。

Claims

請求の範囲

- 血清中の特定リポ蛋白画分中の成分を酵素反応で測定する方法において、特異的に該成分を測定するために、複合体および/または凝集体を形成させることなく、特定リポ蛋白画分中の測定目的の成分に対して優先的に酵素反応を可能にする調整手段を導入することを特徴とする特定リポ蛋白画分中の成分の測定方法。

.前記調整手段が、特定リポ蛋白画分中の測定目的の成分が反応液中で酵素反応しやすくなるように反応液のイオン強度を調整する手段である請求の範囲第 1項に記載の特定リポ蛋白画分中の成分の測定方法。

.前記イオン強度の調整が、高比重リポ蛋白（H D L ) 中の成分を溶液中で酵素反応しやすくするために、反応液のイオン強度を十分な程度に高くすることである請求の範囲第 2項に記載の特定リポ蛋白画分中の成分の測定方法。

.前記調整手段が、酵素の特定リポ蛋白に対する反応特異性を利用して、特定リポ蛋白画分中の成分に対して直接的および/または優先的に反応液中で酵素反応を可能とする手段である請求の範囲第 1項に記載の特定リポ蛋白画分中の成分の測定方法。

.前記特定リポ蛋白画分中の成分に対して直接的および/または優先的に酵素反応を可能とする手段が、 H D L画分に優先的に作用するリポプ口ティンリパーゼぉよび/またはコレステロールエステラーゼを反応させることである請求の範囲第 4項に記載の特定リポ蛋白画分中の成分の測定方法。

.前記調整手段が、選択された非イオン界面活性剤の特定リポ蛋白に対する反応選択性を利用して、特定リポ蛋白画分中の成分に対して直接的および/または優先的に反応液中での酵素反応を可能とする手段である請求の範囲第 1項に記載の特定リポ蛋白画分中の成分の測定方法。

前記非イオン界面活性剤として H D L画分に対して反応選択性をもつ H L B値が 1 6以上である非イオン界面活性剤を使い、 H D L画分の成分に対して直接的および/または優先的に反応液中で酵素反応を可能とする請求の範囲第 6項に記載の特定リポ蛋白画分中の成分の測定方法。

請求の範囲第 5項に記載の測定方法と、第 3項および/または第 7項に記載の測定方法とを組み合わせて行う請求の範囲第 1項に記載の特定リポ蛋白画分中の成分の測定方法。

請求の範囲第 4項に記載の測定方法と、第 2項および/または第 6項に記載の測定方法とを組み合わせて行う請求の範囲第 1項に記載の特定リポ蛋白画分中の成分の測定方法。

. 第一酵素反応系において、請求の範囲第 8項または第 9項に記載の測定方法を利用して H D L画分中のコレステロール成分を選択的に酵素反応させて測定または消化し、第二酵素反応系において、請求の範囲第 4項に記載の測定方法と H L B値が 1 1〜 1 3である非ィオン界面活性剤とを利用して L D L画分中のコレステロール成分を酵素反応させる手段を導入することからなる L D L画分中のコレステロールの測定方法である請求の範囲第 1項に記載の特定リポ蛋白画分中の成分の測定方法。

. 請求の範囲第 1 0項に記載の測定方法において、第一酵素反応系および第二酵素反応系を、同時にまたは別々に処理することによって超低比重リポ蛋白（V L D L ) 中のコレステロール成分を残留させ、ついで V L D L画分を分解する手段を導入して V L D L画分中のコレステロール成分を酵素反応させることからなる V L D L画分中のコレステロールの測定方法である請求の範囲第 1項に記載の特定リポ蛋白画分中の成分の測定方法。

. コレステロール酸化酵素またはコレステロール脱水素酵素を添加して遊離のコレステロールを消化する工程を加えた、請求の範囲第 8〜 1 1項のいずれか 1項に記載の特定リポ蛋白画分中の成分の測定方法。

. 反応液の p Hが、リポ蛋白が凝集または白濁をおこさない範囲であって、リポ蛋白中の成分を酵素反応させる酵素の至適 p Hにより選択される、請求の範囲第 1〜 1 2項のいずれか 1項に記載の特定リポ蛋白画分中の成分の測定方法。