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WO1999037780A1 - Expression du gene insl4 dans les tissus osseux embryonnaires humains et applications - Google Patents

Expression du gene insl4 dans les tissus osseux embryonnaires humains et applications Download PDF

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Publication number
WO1999037780A1
WO1999037780A1 PCT/FR1999/000137 FR9900137W WO9937780A1 WO 1999037780 A1 WO1999037780 A1 WO 1999037780A1 FR 9900137 W FR9900137 W FR 9900137W WO 9937780 A1 WO9937780 A1 WO 9937780A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
epil
acid sequence
nucleic acid
bone tissue
ligaments
Prior art date
Application number
PCT/FR1999/000137
Other languages
English (en)
Inventor
Anne Laurent
Dominique Bellet
Original Assignee
Institut Gustave-Roussy
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut Gustave-Roussy filed Critical Institut Gustave-Roussy
Priority to CA002319076A priority Critical patent/CA2319076A1/fr
Priority to EP99900993A priority patent/EP1064380A1/fr
Priority to JP2000528687A priority patent/JP2002500888A/ja
Publication of WO1999037780A1 publication Critical patent/WO1999037780A1/fr

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/64—Relaxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to the localization of the expression of the insulin 4 gene (INSL4) in bone tissues and embryonic ligaments in humans, methods of detection and diagnosis, methods of labeling and detection of cells of said cells. tissues expressing the expression products of the ⁇ NSL4 gene as well as methods of selecting compounds capable of modulating the activity of said cells.
  • the invention also relates to medicaments intended for the treatment of pathologies linked to the differentiation and / or the abnormal proliferation of said tissues, in particular the pathologies linked to the abnormal development of cartilage and / or to an abnormal ossification of the bone in formation and / or abnormal development of the interosseous ligaments.
  • Insulin, IGF-I, IGF-II Insulin-like growth factors I and II
  • relaxin belong to a family of peptide hormones with certain common structures and functions, including their influence on proliferation, development, differentiation and cell metabolism (D. Le Roith, 1997).
  • Insulin is well known as a pancreatic endocrine hormone that regulates energy metabolism.
  • Insulin-IGF-I growth factors are growth promoter peptides involved in the endocrine, paracrine and autocrine regulation of cell growth and which are expressed in many tissues. IGF-II has similar properties but is expressed in greater amounts during the prenatal period and is considered to be a factor in fetal growth.
  • Relaxin induces a remodeling of the connective tissues in the reproductive tract and inhibits uterine contractions.
  • the relaxin gene is expressed in the corpus luteum, the decidua, the trophoblast and the prostate (Bogie, LN et al., 1995). Its functional role in the brain, where a very important expression has been observed, remains to be elucidated.
  • Ley IL LNL3
  • Ley IL transcripts are present in Leydig cells and in other tissues such as the corpus luteum, trophoblast, fetal membranes and breast tissue (Adham, IM et al., 1993; Tashima, LS et al. , 1995).
  • IGF-I and IGF-II are expressed by most fetal and embryonic tissues and regulate cell growth and differentiation as an autocrine / paracrine factor.
  • Site-directed mutagenesis experiments performed on genes encoding growth factors IGF-I and IGF-II have demonstrated the important application of growth factor systems in the growth process (J. Baker et al., 1993 ; TM De Chiara et al., 1990, and JP Liu et al., 1993).
  • De Chiara et al. have demonstrated a causal relationship between a disabling IGF-II gene and a growth deficiency phenotype that becomes apparent from the sixteenth day of the embryo and persists after birth. Liu et al.
  • IGF-I (- / -) mutant mice had a birth weight of approximately 60% of their normal weight and that some of them were stillborn.
  • This peptide family has in common structural characteristics defined by the position of different cysteines essential for the formation of a tertiary structure.
  • RTK's receptor tyrosine kinase
  • EGF receptor c-erbB2 / neu
  • CSF-1 receptor fms
  • NGF receptor trk
  • the intracellular signal transduction pathway for these receptors is characterized by tyrosine kinase activity which produces autophosphorylation of tyrosine residues on the receptor followed by a chain of events corresponding to phosphorylations.
  • IRS-1 insulin and IGFs
  • P13K P13K
  • Shc P13K
  • GBR2 protein activating mitogenesis
  • Ras Ras
  • Raf protein activating mitogenesis
  • the member polypeptides of this family are all characterized by the presence of a signal peptide, a B chain, a C junction peptide or C chain and an A chain.
  • pre-prohormone for these polypeptide hormones, the terms pre-prohormone, prohormone or mature hormone are defined on the basis of the presence or absence of certain elements and their arrangement in a tertiary structure. Pre-prohormone is distinguished from prohormone by the presence of the signal peptide element. The distinction between prohormone and active mature hormone is more complex and depends on the hormone considered.
  • the B and A chains are located respectively at the N- and C-terminal ends and are separated by a long C junction peptide which is cleaved during the maturation phase which results in the form active hormone.
  • the C peptide of IGFs is not cleaved during the maturation phase.
  • the mature forms of the IGFs peptides contain, in addition to the domains A, B and C, two terminal carboxyl peptides (domains D and E) which are cleaved after expression.
  • a new gene, called INSL4 from the insulin-like family
  • the INSL4 gene codes for a polypeptide of 139 amino acids called "EPIL” (insulin-like peptide of early placenta).
  • EPIL polypeptide means the putative polypeptide of 139 amino acids deduced from the coding nucleic acid sequence and as defined in FIG. 1.
  • the deduced amino acid sequence showed, in agreement with the general organization of this family of hormones, certain structural homologies such as the presence of a signal peptide, a B and A chain and a C peptide of junction or C chain, as well as the presence of 6 cysteine residues, which must probably be involved in the formation of 3 disulfide bridges.
  • the INSL4 gene which also belongs to this family could be a new member of this gene family which is involved in human development. To allow us to better understand the role of these genes in embryonic and fetal development, the study of the expression pathways of these genes at different stages of development has been a successful approach (T. Strachan et al., 1997; C Ottolenghi et al., 1997, and J. Burn et al., 1995).
  • the inventors By studying the chronology and the localization of the expression of the INSL4 and IGF-II genes in the development of the placenta and human tissues of embryos at the start of gestation by the in situ hybridization technique, the inventors have highlighted a high level of expression of INSL4 transcripts in the human trophoblast, in particular in the syncytio-trophoblasts. Surprisingly, the inventors have also demonstrated a high level of expression of INSL4 transcripts in eight-week-old fetal tissues, but only in the interosseous ligaments and in the perichondrium.
  • the present invention therefore relates to an EPIL 1, EPIL 2 or EPIL 3 polypeptide encoded by the INSL4 gene, characterized in that it is expressed in fetal cells of bone tissue.
  • polypeptide also denotes a protein or a peptide.
  • EPIL 1 polypeptide is intended to denote in the present invention, a polypeptide encoded by the INSL4 gene, consisting of a single chain comprising the regions A, B and C of global amino acid sequence chosen from the amino acid sequences included between positions 18 and 139, ends included, of the amino acid sequence defined in FIG. 1, said overall sequence comprising at least the amino acid sequence comprised between positions 24 and 139, ends included, said EPIL 1 polypeptide may further comprise a signal peptide such that the amino acid sequence of the EPIL 1 polypeptide comprising the signal peptide is the sequence between positions 1 and 139, ends included, of the amino acid sequence defined in the figure 1.
  • EPIL 2 polypeptide is intended to denote in the present invention, a polypeptide encoded by the INSL4 gene, consisting of: a) a chain A, the amino acid sequence of which is the sequence between positions 115 and 139, ends included of the amino acid sequence defined in Figure 1; b) a chain B whose amino acid sequence is chosen from a sequence between positions 18 and 58, ends included, of the amino acid sequence defined in FIG. 1, said sequence comprising at least the sequence between positions 24 and 53, ends included; said EPIL 2 polypeptide may also comprise an amino acid sequence signal peptide chosen from a sequence between positions 1 and
  • EPIL 3 polypeptide is intended to denote in the present invention, a polypeptide encoded by the INSL4 gene, consisting of a C chain, the amino acid sequence of which is chosen from a sequence between positions 54 and 114, ends included, of the amino acid sequence defined in Figure 1, said sequence comprising at least the sequence between positions 59 and 114, ends included.
  • bone tissue is intended to denote in the present description, the tissues preferably constituting the long, short or flat cartilaginous bones.
  • the invention also relates to the polypeptides according to the invention, characterized in that the fetal cells of the bone tissue are cells of the perichondrium.
  • the subject of the invention is also the EPIL 1, EPIL 2 or EPIL 3 polypeptides encoded by the INSL4 gene, characterized in that they are expressed in fetal ligament cells, in particular the interosseous ligaments.
  • the invention further comprises the EPIL 1, EPIL 2 or EPIL 3 polypeptides encoded by the INSL4 gene, characterized in that they are involved in the process of differentiation, proliferation and / or regeneration of bone tissue cells and / or ligaments.
  • EPIL 1, EPIL 2 or EPIL 3 polypeptides encoded by the INSL4 gene characterized in that they are involved in the process of cartilage development and / or ossification of the bone in training.
  • polypeptides in natural form that is to say that they are not taken in their natural environment but that they could have been obtained by purification from natural sources , or else obtained by genetic recombination, which can be glycosylated or not, or even obtained by chemical synthesis and which can then contain unnatural or modified amino acids.
  • the invention relates to the use of one or more antibodies directed against a polypeptide EPIL 1, EPIL 2, EPIL 3, one of their homologs or variants or one of their fragments, for detection, identification , the location and / or the assay of an EPIL 1, EPIL 2, EPIL 3 polypeptide or one of their homologs or variants, in the bone tissue and / or in the ligaments.
  • the invention also relates to the use of one or more antibodies directed against a polypeptide EPIL 1, EPIL 2, EPIL 3, one of their homologs or variants, or one of their fragments for the diagnosis of pathologies related to the abnormal expression of the EPIL 1, EPIL 2 and / or EPIL 3 polypeptide in the bone tissue and / or in the ligaments.
  • polypeptides homologous to EPIL 1, EPIL 2 or EPIL 3 will be understood to refer to the polypeptides having, with respect to said EPIL 1, EPIL 2 or EPIL 3 polypeptides, certain modifications such as in particular a deletion, a truncation, an elongation, a fusion chimeric, and / or a mutation, in particular a point mutation.
  • homologous polypeptides those whose amino acid sequence has at least 80%, preferably 90%, of similarity with the amino acid sequences of the polypeptides according to the invention are preferred.
  • variant polypeptide of EPIL 1, EPIL 2 or EPIL will be understood to mean
  • all of the mutated polypeptides possibly existing naturally, in particular in humans, and which correspond in particular to truncations, substitutions, deletions and / or additions of at least one amino acid residue.
  • These variant polypeptides correspond in particular to an abnormal expression of the EPIL 1, EPIL 2 or EPIL 3 polypeptides.
  • fragment of polypeptide EPIL 1, EPIL 2, EPIL 3, or one of their homologs or variants is meant a polypeptide of amino acid sequence comprising at least 5 amino acids, preferably 10 amino acids and 15 amino acids consecutive of said polypeptides.
  • mono or polyclonal antibodies or their fragments chimeric antibodies are preferred, characterized in that they are capable of recognizing specifically an EPIL 1, EPIL 2, EPIL 3 polypeptide, one of their homologs or variants, or one of their fragments.
  • polyclonal antibodies can be obtained from a serum of an animal immunized against, for example:
  • EPIL 1, EPIL 2, EPIL 3 polypeptide one of their homologs or variants, or one of their fragments, in particular produced by genetic recombination or by peptide synthesis, according to the usual procedures, from a nucleic acid sequence encoding said polypeptides or amino acid sequence of said polypeptides.
  • the specific monoclonal antibodies can be obtained according to the conventional hybrid culture method described by Kohler and Milstein, 1975. Said antibodies are, for example, chimeric antibodies, humanized antibodies, Fab or F (ab ') 2 fragments . According to the invention, they can also be in the form of immunoconjugates or labeled antibodies in order to obtain a detectable and / or quantifiable signal.
  • the expression “several antibodies” in the present description means at least two antibodies of different specificity, that is to say capable of recognizing and binding to two different epitopes or domains of said said polypeptides. It is moreover preferred according to the invention to use at least two antibodies of different specificity for the methods, the methods and the kits of the invention which include said antibodies. In this case, it is possible, for example, to use two different antibody labels or two different development systems.
  • said antibodies could thus constitute a means of immunocytochemical or immunohistochemical analysis of the expression of said polypeptides on specific sections of bone tissue and / or ligaments, for example by immunofluorescence, gold labeling, enzyme immunoconjugates. They make it possible in particular to demonstrate and quantify the normal or abnormal specific presence of said polypeptides in bone tissue and / or ligaments, which makes them useful for the identification and localization of the expression of these polypeptides, or for the diagnosis of pathologies linked to the abnormal presence of said polypeptides. More generally, said antibodies can be advantageously used in any situation where the expression of one of said polypeptides must be observed qualitatively and / or quantitatively in a biological sample of bone tissue and / or ligaments.
  • the specific techniques and reagents for the detection, identification, localization and / or assay of antigen-antibody complexes which can be used in the methods of the invention are well known to those skilled in the art. and are, for example, ELISA, RIA or immunofluorescence techniques which can be combined, in the case where the antibodies of the invention are not already immunoconjugated or labeled, with the appropriate reagents such as immunoconjugated antibodies, labeled with fluorcscé ⁇ nc or radiolabelled capable of specifically recognizing said antibodies, as well as chromogenic substrates specific for conjugated enzymes and control reagents of positive, negative and quantitative controls.
  • the invention comprises a method for the detection, identification, localization and / or specific assay of an EPIL 1, EPIL 2 and / or EPIL 3 polypeptide or a fragment thereof in a biological sample of bone tissue and / or ligament, or diagnosis of pathologies linked to the abnormal presence of said polypeptide (s) in the bone tissue and / or in the ligaments, characterized in that it comprises the following stages: a) bringing said biological sample into contact with one or more antibodies directed against said polypeptide (s); b) detection, identification, location and / or determination of the antigen-antibody complex formed.
  • the invention also includes a kit or kit for the detection, identification, localization and / or specific assay of an EPIL 1, EPIL 2 and / or EPIL 3 polypeptide or a fragment thereof in a biological tissue sample.
  • bone and / or ligaments, or for the diagnosis of pathologies linked to the abnormal presence of said polypeptide (s) in said biological sample characterized in that it comprises the following elements: a) one or more antibodies directed against said polypeptide (s) ; b) where appropriate, the reagents for constituting the medium suitable for the immunological reaction; c) where appropriate, the reagents for the detection, identification and / or determination of the antigen-antibody complexes produced by the immunological reaction.
  • the invention also relates to the use of an oligonucleotide probe or primer capable of hybridizing specifically with a nucleic acid sequence corresponding to the INSL4 gene, for the detection, identification, 10
  • nucleic acid sequence corresponding to the INSL4 gene in bone tissue and / or in ligaments.
  • the invention also includes the use of an oligonucleotide probe or primer capable of hybridizing specifically with a nucleic acid sequence corresponding to the INSL4 gene, for the diagnosis of pathologies linked to the abnormal expression of the INSL4 gene in tissue bone and / or ligaments.
  • Said oligonucleotide probes capable of hybridizing specifically with a nucleic acid sequence corresponding to the INSL4 gene may be labeled or fixed on a solid support by covalent bonding or not, the techniques for labeling or fixing such probes being well known from one skilled in the art.
  • hybridization is carried out under stringency conditions, in particular under temperature and ionic strength conditions such that they allow hybridization to be maintained between two globally complementary DNA fragments.
  • high stringency conditions of the hybridization step for the purpose of defining the nucleotide sequences described above are advantageously as follows.
  • Hybridization is carried out at a preferred temperature of 65 ° C., in the presence of a 6 ⁇ SSC buffer, 5 ⁇ Denhardt's solution, 0.5% SDS and 100 ⁇ g / ml of DNA from salmon sperm.
  • 1 x SSC corresponds to 0.15 M NaCl and 0.05M of sodium citrate and a solution of 1 x Denhardt corresponds to 0.02% Ficoll, 0.02% of polyvinylpyrrolidone and 0.02% of bovine serum albumin.
  • the washing steps can, for example, be carried out for 5 to 30 min. at 65 ° C, in 2 x SSC or 1 x SSC buffer and 0.1% SDS. 11
  • oligonucleotide probes or primers and in general the nucleic acid sequences according to the invention, will have a minimum size of 10 bases and fragments of 20 bases, and preferably 30 bases, will be preferred.
  • Also part of the invention are the methods of detection, identification and / or specific assay of nucleic acid sequence corresponding to the INSL4 gene in a biological sample of bone tissue and / or ligament, or of diagnosis of pathologies linked to the abnormal presence of said nucleic acid sequence in said biological sample, characterized in that they comprise the following steps: a) isolation of the DNA from said biological sample to be analyzed, or obtaining a cDNA to from TARN of said biological sample; b) specific amplification of said nucleic acid sequence using at least one primer capable of specifically hybridizing with a nucleic acid sequence corresponding to the INSL4 gene; c) qualitative and / or quantitative analysis of the amplification products.
  • the invention also includes the methods of detection, identification and / or specific assay of nucleic acid sequence corresponding to the INSL4 gene in a biological sample of bone tissue and / or ligament, or of diagnosis of pathologies linked to the abnormal presence of said nucleic acid sequence in said biological sample, characterized in that they comprise the following steps: a) contacting an oligonucleotide probe capable of hybridizing specifically with a nucleic acid sequence corresponding to the INSL4 gene with said biological sample, the DNA contained in said biological sample having, where appropriate, previously made accessible to hybridization, under conditions allowing hybridization of said probe to the DNA contained in said biological sample; 12
  • the invention further relates to methods of detection, identification and / or specific assay of nucleic acid sequence corresponding to the INSL4 gene in a biological sample of bone tissue and / or ligament, or of diagnosis of pathologies linked to the abnormal presence of said nucleic acid sequence in said biological sample, characterized in that they comprise the following steps: a) contacting an oligonucleotide probe immobilized on a support and capable of specifically hybridizing with a nucleic acid sequence corresponding to the INSL4 gene, with said biological sample, the DNA of the sample, having, if necessary, been previously amplified using at least one primer capable of specifically hybridizing with a nucleic acid sequence corresponding to the INSL4 gene and / or made accessible to hybridization, under conditions allowing hybridization of said probe to the DNA of said biological sample; b) bringing the hybrid formed between said oligonucleotide probe immobilized on a support and the DNA contained in said biological sample into contact, if appropriate after removing the DNA from said biological sample which has not hybridized
  • kits or kits for the detection, identification and / or specific assay of nucleic acid sequence corresponding to the INSL4 gene in a biological sample of bone tissue and / or ligament, or for the diagnosis of pathologies linked to the abnormal presence of said nucleic acid sequence in said biological sample characterized in that they comprise the following elements: a) an oligonucleotide probe capable of hybridizing specifically with an acid sequence nucleic acid corresponding to the INSL4 gene; 13
  • reagents necessary for carrying out a hybridization reaction where appropriate, the reagents necessary for carrying out a hybridization reaction; c) where appropriate, at least one primer capable of specifically hybridizing with a nucleic acid sequence corresponding to the INSL4 gene as well as the reagents necessary for a DNA amplification reaction.
  • kits or kits for the detection, identification and / or specific assay of nucleic acid sequence corresponding to the INSL4 gene in a biological sample of bone tissue and / or ligament, or for the diagnosis of pathologies linked to the abnormal presence of said nucleic acid sequence in said biological sample characterized in that they comprise the following elements: a) an oligonucleotide probe, called capture probe, which can be supplied pre-immobilized on a support, and capable to specifically hybridize with a nucleic acid sequence corresponding to the INSL4 gene; b) an oligonucleotide probe, called a revelation probe, in particular labeled, and capable of specifically hybridizing with a nucleic acid sequence corresponding to the INSL4 gene; c) where appropriate, at least one primer capable of specifically hybridizing with a nucleic acid sequence corresponding to the INSL4 gene as well as the reagents necessary for a DNA amplification reaction.
  • capture probe can be supplied pre-immobilized on a support, and capable to specifically hybridize with
  • kits according to the invention for the diagnosis of pathologies linked to the differentiation and / or the abnormal proliferation of bone tissue and / or ligament cells, for the diagnosis of pathologies linked to development abnormal cartilage and / or abnormal ossification of the developing bone and / or for the diagnosis of osteoporosis and / or for the diagnosis of dysplasias.
  • dysplasias there may be mentioned in particular diaphyseal dysplasias such as diaphyseal hypoplasia or osteogenesis imperfecta or else diaphyseal hyperplasia or Engelmann disease.
  • the term “diagnosis of pathologies linked to the differentiation and / or the abnormal proliferation of bone tissue and / or ligament cells” is understood to mean, or the diagnosis of pathologies linked to the abnormal development of the 14
  • said methods or kits can be used to evaluate the effectiveness of a therapeutic treatment of said pathology.
  • the techniques for specific amplification and qualitative and / or quantitative analysis of nucleic sequence which can be used in the methods of the invention are well known to those skilled in the art and are, for example, methods comprising at least one amplification step called by PCR (polymerase chain reaction) or by PCR-like of the target sequence likely to be present using at least one oligonucleotide primer of nucleic sequence as defined above .
  • the amplified products may be treated using an appropriate restriction enzyme before detecting or assaying the targeted product, in particular by a method according to the invention.
  • PCR-like will be understood to mean all the methods implementing direct or indirect reproductions of the nucleic acid sequences, or in which the labeling systems have been amplified. These techniques are of course known. In general it is the amplification of DNA by a polymerase; when the original sample is an RNA, reverse transcription should be carried out beforehand.
  • nucleic acid quantification techniques in which, for example, the nucleic acid to be quantified is amplified by a PCR type method and in the presence of a standard nucleic acid of the same size and quantity. known and capable of hybridizing to the same primers as the target nucleic acid. 15
  • the amplified fragments can be identified, for example after agarose or polyacrylamide gel electrophoresis, or after a chromatographic technique such as gel filtration or ion exchange chromatography.
  • the specificity of the amplification can be controlled for example by molecular hybridization using as probes the probes as defined above, in particular labeled.
  • the invention furthermore comprises the methods of labeling a bone tissue and / or ligament cell, in particular of fetal origin, characterized in that they comprise the following steps: a) bringing a biological sample of bone and / or ligament tissue with one or more antibodies directed against the polypeptide (s) EPIL 1, EPIL 2 and / or EPIL 3, said antibodies being capable of being labeled; b) where appropriate, labeling of said antibodies using labeled compounds capable of recognizing said antibodies.
  • Techniques for labeling cells with antibodies specific for a compound of said cell are well known to immunocytochemists or immunohistochemists and will not be developed in the present description.
  • Also included in the present invention are the methods of labeling a bone tissue and / or ligament cell, in particular of fetal origin, characterized in that they comprise the following steps: a) bringing a biological sample of bone and / or ligament tissue with one or more oligonucleotide probes capable of specifically hybridizing with a nucleic acid sequence corresponding to the INSL4 gene, said probes being capable of being labeled; b) where appropriate, labeling of said probes using labeled compounds capable of recognizing said probes.
  • the subject of the invention is also a method for detecting an abnormal cell of bone tissue and / or ligament, characterized in that it implements a labeling method according to the invention.
  • Another aspect of the invention relates to methods of selecting a chemical or biochemical compound capable of modulating differentiation, regeneration and / or 16
  • telomere proliferation of human and / or animal cells of bone tissue and / or ligament characterized in that they use an EPIL 1, EPIL 2, EPIL 3 polypeptide, one of their homologous or variant polypeptides, or one of their fragments, a nucleic acid sequence corresponding to the INSL4 gene, or a bone or ligament cell, in particular a fetal cell.
  • Said cell can be a cell transformed by genetic recombination or selected according to the invention.
  • said selected compound is capable of inhibiting or promoting the differentiation, regeneration and / or proliferation of human and / or animal cells of bone tissue and / or ligament, in particular the fetal cells of the perichondrium.
  • Said compounds may for example be selected on their capacity to bind to an EPIL 1, EPIL 2, EPIL 3 polypeptide, to one of their homologous or variant polypeptides, or to one of their fragments, and to inhibit or promote the activity of said polypeptides in bone tissue and / or in ligaments, as, for example, agonist or antagonist ligands of a receptor specific for said polypeptides on cells of said tissues.
  • Said compounds may also be selected on their ability to bind to a nucleic acid sequence corresponding to the INSL4 gene, and to inhibit or promote the expression of the gene coding for said polypeptides as an inducer or repressor.
  • Said compounds can also be selected on their capacity to modulate on said cells in vitro or in vivo, the biological activity of said polypeptides expressed by said cells, such as in particular the differentiation, proliferation or regeneration of said cells.
  • the invention includes a method of selecting compounds capable of binding to an EPIL 1, EPIL 2, EPIL 3 polypeptide, to one of their homologous or variant polypeptides, or to one of their fragments, or even capable of binding link to a nucleic acid sequence corresponding to the INSL4 gene, and capable of modulating the activity of said polypeptides in bone tissue and / or in ligaments, characterized in that it comprises the following steps: 17
  • step b) bringing said compound into contact with said polypeptide or said nucleic acid sequence; b) determining the ability of said compound to bind with said polypeptide or said nucleic acid sequence; c) demonstration of the modulation of the activity of said polypeptides on bone tissue and / or ligament cells, capable of being obtained with the compounds selected in step b).
  • step b) and / or c) of the present method it will be possible, for example, to use bone tissue and / or ligament cells transformed by genetic recombination or selected according to the invention, in step b) and / or c) of the present method.
  • the invention also includes chemical or biochemical compounds, which can be selected by a method according to the invention.
  • the compounds which can be selected can be organic compounds such as polypeptides or carbohydrates or any other compounds already known, or new organic compounds developed from molecular modeling techniques and obtained by chemical or biochemical synthesis, these techniques being known to those skilled in the art.
  • a subject of the invention is furthermore compounds according to the invention as a medicament, preferably chosen from: a) an EPIL 1, EPIL 2 or EPIL 3 polypeptide, one of their homologous or variant polypeptides or one of their fragments, obtainable by genetic recombination or chemical synthesis; b) an antibody directed against a polypeptide as defined in a); c) a chemical or biochemical compound, characterized in that it is a ligand of a polypeptide as defined in a); d) a vector comprising all or part of a nucleic acid sequence corresponding to the INSL4 gene; e) a vector as defined in d), having on its surface a specific marker of bone tissue cells or target ligament whose activity is sought to modulate; 18
  • a sense or antisense nucleic acid sequence capable of hybridizing specifically with a nucleic acid sequence corresponding to the INSL4 gene.
  • EPIL 1, EPIL 2 or EPIL 3 polypeptide, or of their homologous or variant polypeptides, and as defined in a) will preferably be characterized in that they are biologically active.
  • biologically active fragment is intended to denote in particular a fragment of the amino acid sequence of the EPIL 1, EPIL 2 or EPIL 3 polypeptide, or of their homologous or variant polypeptides exhibiting at least one of the activities of the said polypeptides such as in particular: - the capacity to modulate, in particular to inhibit or promote, the differentiation, the proliferation and / or the regeneration of cells of bone tissue and / or ligament; and or
  • the EPIL 1, EPIL 2 or EPIL 3 polypeptides, their homologous or variant polypeptides or their recombinant fragments may be obtained from methods well known to those skilled in the art using cloning vectors and / or d expression containing a nucleic acid sequence encoding said polypeptides and host cells transformed by said vectors.
  • the recombinant polypeptides obtained can be both in glycosylated and non-glycosylated form and may or may not have the natural tertiary structure.
  • polypeptides can be produced from the nucleic acid sequences coding for said polypeptides according to the techniques for producing recombinant polypeptides known to those skilled in the art.
  • the nucleic acid sequence used is placed under the control of signals allowing its expression in a cellular host.
  • An efficient system for producing a recombinant polypeptide requires a vector, for example of plasmid or viral origin, and a compatible host cell. 19
  • the cellular host can be chosen from prokaryotic systems, such as bacteria, or eukaryotic systems, such as, for example, yeasts, insect or mammalian cells such as CHO cells (Chinese hamster ovary cells) or murine cells or any other system advantageously available.
  • prokaryotic systems such as bacteria
  • eukaryotic systems such as, for example, yeasts
  • insect or mammalian cells such as CHO cells (Chinese hamster ovary cells) or murine cells or any other system advantageously available.
  • a preferred cellular host for the expression of the proteins of the invention is constituted by Chinese hamster ovary CHO cells, and by 3A-subE cells of human placental origin.
  • the vector must include a promoter, translation initiation and termination signals, as well as appropriate regions for transcription regulation. It must be able to be maintained stably in the cell and may possibly have particular signals specifying the secretion of the translated protein.
  • control signals are chosen according to the cellular host used.
  • the nucleic acid sequences can be inserted into vectors with autonomous replication within the chosen host, or integrative vectors of the chosen host.
  • Such vectors will be prepared according to the methods commonly used by those skilled in the art, and the resulting clones can be introduced into an appropriate host by standard methods, such as for example lipofection, electroporation, heat shock.
  • the host cells transformed by the preceding vectors can be obtained by the introduction into these cells of a nucleotide sequence inserted into a vector as defined above, then the cultivation of said cells under conditions allowing replication and / or expression of the transfected nucleotide sequence.
  • bacterial cells Olins and Lee, 1993
  • yeast cells Buckholz, 1993
  • animal cells in particular cell cultures.
  • mammals Edwards and Aruffo, 1993
  • Chinese hamster ovary (CHO) cells human cells such as 3A-subE cells 20
  • the methods of purification of recombinant or synthetic polypeptide used are known to those skilled in the art.
  • the recombinant or synthetic polypeptide can be purified using methods used individually or in combination, such as fractionation, chromatography methods, immunoaffinity techniques using specific mono or polyclonal antibodies.
  • a preferred variant consists in producing a recombinant polypeptide fused to a “carrier” protein (conjugated protein).
  • a “carrier” protein conjuggated protein
  • EPIL 1, EPIL 2 or EPIL 3 polypeptides, their homologous or variant polypeptides or their fragments can also be obtained by chemical synthesis.
  • the polypeptides obtained by chemical synthesis may contain unnatural amino acids.
  • antisense oligonucleotides that is to say those whose structure ensures, by hybridization with the target sequence, an inhibition of the expression of the corresponding product.
  • sense oligonucleotides which, by interaction with proteins involved in the regulation of expression of the INSL4 gene, will induce either an inhibition or an activation of this expression.
  • the invention relates to compounds according to the invention, intended for the treatment of pathologies linked to the differentiation and / or the abnormal proliferation of bone tissue and / or ligament cells, in particular of pathologies linked to the abnormal development of cartilage and / or to abnormal ossification of the developing bone, in particular intended for the treatment of osteoporosis and / or dysplasia.
  • diaphyseal dysplasias such as diaphyseal hypoplasia or osteogenesis imperfecta and diaphyseal hyperplasia or Engelmann's disease are particularly preferred.
  • the invention finally relates to compounds according to the invention, intended for the treatment of pathologies involving the regeneration of bone tissue and / or ligament, in particular to treatment intended to repair lesions of bone tissue and / or ligaments following to traumatic shock.
  • the compounds of the invention as active principles of medicament will preferably be in soluble form, associated with a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • these compounds will be administered by the systemic route, in particular by the intravenous route, by the intramuscular, intradermal route or by the oral route.
  • Replacement therapy may be carried out by gene therapy, that is to say by introducing the nucleic acid sequences according to the invention and / or the corresponding genes with the elements which allow their expression in vivo, in the case where one of the genes is insufficiently expressed, for example, or when it is expressed in an abnormal form.
  • Viral vectors can be used, for example on the basis of adenoviruses (Perricaudet et al., 1992), AAVs, Adenovirus Associated Nirus (Carter, 1993), retroviruses (Temin, 1986), poxviruses or herpes viruses ( Epstein et al., 1992). Most of the time, these viruses are used in defective form and, in general, with or without integration into the cell genome. It is also possible to provide non-viral vectors, that is to say synthetic vectors, which mimic viral sequences or which are constituted by 22
  • targeting elements ensuring specific expression will have to be provided so as to be able to limit the areas of expression of the polypeptides. It is even advantageous, in certain cases, to have vectors of transient expression or at least of controlled expression which can be blocked when necessary.
  • the compounds according to the invention which can be used as medicament offer a new approach for the treatment of diseases linked to the unregulated differentiation or proliferation of bone cells and / or ligaments or to the absence or insufficiency certain cells of bone tissue and / or ligaments, for example following a trauma.
  • Figure 1 Nucleic acid sequence of the cDNA of the INSL4 gene and amino acid sequence of the EPIL polypeptide encoded by this sequence.
  • Figures 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 2F Comparison of the distribution of INSL4 and IGF-F mRNA in the 14-week-old human placenta;
  • FIG. 2A a light background
  • FIG. 2B a black background
  • nt neural tube
  • m mesonephron
  • Figures 4A, AB, 4C, 4D, 4E and 4F In situ hybridization performed with an INSL4 oligonucleotide probe on an 8 week old human fetus. Light micrographs on a light background (left panel) and black background (right panel) of the same tissue section:
  • INSL4 mRNA is located in the inter-vertebral discs, in the intervertebral ligaments; vb: vertebral body; 1: ligament;
  • the sections were fixed for 30 minutes in a solution of para-formaldehyde in 0.1 M phosphate buffer (pH 7.4), rinsed once in PBS (saline phosphate buffer) and briefly in water, then dehydrated with a series of ethanol solutions at different concentrations (50%, 75%, 95%). The sections were then air dried and stored at -80 ° C to preserve the mRNA.
  • Oligonucleotide probes of 60-mer were synthesized and purified (DNAgency, Malvern, PA). They were labeled in 3 'with [ ⁇ - 3î S] dATP (NEN, Boston, MA) using a terminal deoxyribonucleotidyl transferase (Gibco BRL, Grand Island, NY) with a specific activity of approximately 7 ⁇ 10 8 cpm / mg.
  • the oligonucleotide probes were purified on Biospin columns (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) before use.
  • the sequence of the INSL4 antisense probe is as follows (SEQ ID No. 2):
  • the sequence of the antisense IGF-II probe is as follows (SEQ ID N ° 3): 5 '-AGCC AATCGATTTTGTAC ATGTTTCGTCCG AGGG-3 ', located on exon 7 in the common coding region of iGF-13 mRNAs. Sense probes were used as a control. 25
  • the experimental protocol (M. Abitbol et al., 1993, and M. protagonist et al., 1995) includes a hybridization step using a solution containing 50% formamide, 4 x SSC (standard saline citrate solution), 1 x Denhardt solution, 0.25 mg / ml yeast tRNA, 0.25 mg / ml herring sperm, 0.25 mg / ml poly-A, 10% dextran sulfate, 100 mM dithiothreitol ( DTT) and a probe labeled [- 33 S] dATP with specific activity of 6 x 10 ⁇ cpm / ml. 100 ⁇ l of the hybridization solution was deposited on each of the sections.
  • 4 x SSC standard saline citrate solution
  • 1 x Denhardt solution 0.25 mg / ml yeast tRNA, 0.25 mg / ml herring sperm, 0.25 mg / ml poly-A
  • the sections were covered with a parafilm and incubated in a humid chamber at 43 ° C for 20 hours. After hybridization, the slides were washed twice in 1 x SSC containing 10 mM DTT for 15 minutes at 55 °, and twice in a solution of 0.5 x SSC containing 10 mM DTT for 15 minutes at room temperature. The sections were then immersed in water, dehydrated with a series of ethanol solutions of different concentrations and then exposed for one week on X-ray films Amersham Hyperfilm Betamax and in a Kodak NTB2 photographic emulsion (Eastmman Kodak, Rochester, NY) for one to two months at 4 ° C. The sections were then developed and labeled with toluidine blue. The results are analyzed by phase contrast microscopy.
  • RNA from trophoblast tissues were detected at a size of 0.7 kilobase (kb) with both the oligonucleotide probes and a cDNA probe, in agreement with the size of the INSL4 transcript published by Chassin et al. (1995).
  • IGF-II gene a major transcript of 6.0 kilobases and other transcripts of 2 to 5 kilobases were detected, confirming the results of Han et al.
  • a low level of expression of the INSL4 gene was detected from the 25-day-old early placenta and an abundant level of INSL4 mRNA was identified from the 14-week-old placenta.
  • the INSL4 gene is expressed in syncytiotrophoblasts and less abundantly in cytotrophoblasts.
  • the cells of the central part of the villous mesoderm and the umbilical cord cells express the INSL4 gene even more weakly (FIGS. 2A, 2B and 2C). No signal was detected either in the amnion or in the yolk sac (results not shown).
  • IGF-II mRNA was abundantly expressed in intermediate trophoblast columns and in the villous stroma at 20 days and 14 weeks of development, but was not detectable in syncytiotrophoblast sections ( Figures 2D, 2 @ and 2F). In fetal membranes (20 days), abundant amounts of IGF-II mRNA have been identified in the amnion cells and the outer cells of the yolk sac (results not shown). These results are summarized in Table I below.
  • the INSL4 gene is expressed more prominently in syncytiotrophoblasts than in cytotrophoblasts. These results are confirmed by the RT-PCR technique (polymerase chain reaction amplification using reverse transcriptase) carried out on the total RNA of syncytiotrophoblast and cytotrophoblast cells (D. Bellet et al, 1997). IGF-II mRNA is significantly more abundant than INSLA mRNA in adjacent sections tested with the INSL4 oligonucleotide probe. The expression of the IGF-II gene in the placenta of a human embryo aged 25 to 40 days and 14 weeks is localized in the cells of the central part of the villous mesoderm and in the cells of 28
  • IGF-II transcripts are not detected in the syncytiotrophoblastic layer for the development stages studied. Similar observations have been reported for example by V.K.M. Han (V.K.M. Han et al., 1996). Thus, it is likely that these two genes play a different role in the development of the trophoblast.
  • the 8-week-old fetal tissue sections were also hybridized using the INSL4 oligonucleotide probes.
  • the INSL4 mRNA shows a specific spatial distribution.
  • the majority of INSL4 transcripts are located in the perichondrium of the four limbs, ribs and vertebrae.
  • INSLA mRNA is very abundant in the interosseous ligaments ( Figures 4A to 4F).
  • no markings were detected in the liver, lungs, heart, thymus, stomach, muscle or intestines at this stage of development. Table II below summarizes the results in accordance with the types of cells identified in the fetal tissue sections tested. O 99/37780
  • the INSL4 gene is a member of the insulin related genes superfamily and that other members of this family encode polypeptides that regulate both growth and development in many tissues.
  • insulin-related growth factors IGFs
  • IGFs insulin-related growth factors
  • IGF insulin-like growth factors
  • IGFBP IGF-binding protein

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Abstract

La présente invention concerne la localisation de l'expression du gène insulin-like 4 (INSL4) dans les tissus osseux et ligaments embryonnaires chez l'homme, des procédés de détection et de diagnostic, des méthodes de marquage et de détection de cellules desdits tissus exprimant les produits d'expression du gène INSL4 ainsi que des méthodes de sélection de composés capables de moduler l'activité desdites cellules. L'invention concerne également des médicaments destinés au traitement de pathologies liées à la différenciation et/ou la prolifération anormale desdits tissus, notamment les pathologies liées au développement anormal du cartilage et/ou à une ossification anormale de l'os en formation et/ou au développement anormal des ligaments interosseux.

Description

EXPRESSION DU GENE INSL4 DANS LES TISSUS OSSEUX EMBRYONNAIRES HUMAINS ET APPLICATIONS.
La présente invention concerne la localisation de l'expression du gène insulin- li e 4 (INSL4) dans les tissus osseux et ligaments embryonnaires chez l'homme, des procédés de détection et de diagnostic, des méthodes de marquage et de détection de cellules desdits tissus exprimant les produits d'expression du gène ÏNSL4 ainsi que des méthodes de sélection de composés capables de moduler l'activité desdites cellules. L'invention concerne également des médicaments destinés au traitement de pathologies liées à la différenciation et/ou la prolifération anormale desdits tissus, notamment les pathologies liées au développement anormal du cartilage et/ou à une ossification anormale de l'os en formation et/ou au développement anormal des ligaments interosseux.
L'insuline, l'IGF-I, l'IGF-II (« Insulin-like growth factors I and II » ou facteurs de croissance de type insuline I et II) et la relaxine appartiennent à une famille d'hormones peptidiques ayant certaines structures et fonctions en commun, notamment leur influence sur la prolifération, le développement, la différenciation et le métabolisme cellulaire (D. Le Roith, 1997).
L'insuline est bien connue comme étant une hormone endocrine pancréatique régulant le métabolisme énergétique. Les facteurs de croissance de type insuline-IGF-I sont des peptides promoteurs de croissance impliqués dans la régulation endocrine, paracrine et autocrine de la croissance cellulaire et qui sont exprimés dans de nombreux tissus. L'IGF-II a des propriétés similaires mais est exprimée en quantité plus importante en période prénatale et est considérée comme étant un facteur de croissance foetale.
La relaxine induit un remodelage des tissus conjonctifs dans le tractus reproductif et inhibe les contractions utérines. Le gène de la relaxine est exprimé dans le corpus luteum, la decidua, le trophoblaste et la prostate (Bogie, L.N. et al. , 1995). Son rôle fonctionnel dans le cerveau où une expression très importante a été observée, reste à être élucidé. On a adjoint, également, à cette famille les Ley I-L (INSL3) qui sont actuellement clones sous forme d'ADNc et dont l'activité biologique est encore à définir. Les transcrits Ley I-L sont présents dans les cellules de Leydig et dans d'autres tissus comme par exemple le corpus luteum, le trophoblaste, les membranes foetales et le tissu mammaire (Adham, I.M. et al., 1993 ; Tashima, L.S. et al., 1995).
Différentes études ont montré l'importance évidente de ces gènes dans la régulation de la croissance du foetus et du développement des cellules souches
(V.K.M. Han et al., 1996 ; D.J. Hansell et al. , 1991 , et L.S. Tashiman et al., 1995).
L'IGF-I et l'IGF-II sont exprimées par la plupart des tissus foetaux et embryonnaires et régulent la croissance et la différenciation cellulaire comme facteur autocrine/paracrine. Des expériences de mutagénèse dirigée effectuées sur les gènes codant pour les facteurs de croissance IGF-I et IGF-II ont mis en évidence l'application importante des systèmes de facteurs de croissance dans le processus de croissance (J. Baker et al. , 1993 ; T.M. De Chiara et al., 1990, et J.P. Liu et al., 1993). De Chiara et al. ont démontré une relation causale entre une invalidation du gène de l'IGF-II et un phénotype de déficience de croissance qui devient apparent dès le seizième jour de l'embryon et qui persiste après sa naissance. Liu et al. ont observé que des souris mutantes IGF-I (-/-) présentaient un poids à leur naissance d'environ 60 % de leur poids normal et que certaines d'entre elles étaient mort-nées. Cette famille peptidique présente en commun des caractères structuraux définis par la position de différentes cystéines essentielles pour la formation d'une structure tertiaire.
On a pu démontrer que tous les membres de cette famille se fixaient à des récepteurs de surface cellulaires. Ces récepteurs ont été identifiés par clonage moléculaire et caractérisés en détail pour l'insuline et les IGFs. Ils appartiennent à la superfamille des récepteurs tyrosine-kinases (RTK's) qui comprend des récepteurs de facteurs de croissance et leurs analogues oncogènes tels que c-erbB2/neu (récepteur EGF), c-met (récepteur de facteur de croissance des hépatocytes), fms (récepteur de CSF-1) et trk (récepteur de NGF). La voie de transduction du signal intracellulaire pour ces récepteurs est caractérisée par une activité tyrosine-kinase qui produit une autophosphorylation des résidus tyrosine sur le récepteur suivie par une chaîne d'événements correspondant à des phosphorylations. Ceci inclut notamment l'activation de l'IRS-1 (en particulier pour l'insuline et les IGFs), P13K, Shc, GBR2, Sos, Ras, Raf et la protéine activant la mitogénèse (MAP-kinase), kinase culminant lorsque la cascade de phosphorylation affecte différents processus cellulaires tels que la transcription.
Les effets physiologiques pléiotropiques de cette cascade de signaux en général font l'objet de recherches intensives.
Les polypeptides membres de cette famille sont tous caractérisés par la présence d'un peptide signal, une chaîne B, un peptide de jonction C ou chaîne C et une chaîne A.
Pour ces hormones polypeptidiques, les termes de pré-prohormone, prohormone ou hormone mature sont définis à partir de la présence ou non de certains éléments et de leur arrangement en structure tertiaire. La pré-prohormone se distingue de la prohormone par la présence de l'élément peptide signal. La distinction entre prohormone et hormone mature active est plus complexe et fonction de l'hormone considérée.
Par exemple, dans la proinsuline et la prorelaxine, les chaînes B et A sont localisées respectivement aux extrémités N- et C-terminales et sont séparées par un long peptide C de jonction qui est clivé lors de la phase de maturation qui aboutit à la forme active de l'hormone.
Au contraire de l'insuline et de la relaxine, le peptide C des IGFs n'est pas clivé pendant la phase de maturation. Les formes matures des peptides IGFs contiennent, en plus des domaines A, B et C, deux peptides carboxyl terminaux (domaines D et E) qui sont clivés après expression. Récemment, un nouveau gène, dénommé INSL4, de la famille des insulin-like
(insulines apparentées) a été caractérisé (WO 95 34653, Chassin, D. et al., 1995). Ce gène a été clone à partir d'une banque d'ADNc de placenta précoce et localisé sur le chromosome 9p24.
Le gène INSL4 code pour un polypeptide de 139 acides aminés dénommé « EPIL » (peptide insulin-like de placenta précoce). Pour plus de clarté dans la présente description, on désignera par polypeptide EPIL, le polypeptide putatif de 139 acides aminés déduit de la séquence d'acide nucléique codante et tel que défini dans la figure 1.
La séquence d'acides aminés déduite a montré, en accord avec l'organisation générale de cette famille d'hormones, certaines homologies structurales comme la présence d'un peptide signal, d'une chaîne B et A et d'un peptide C de jonction ou chaîne C, ainsi que la présence de 6 résidus cystéine, devant être probablement impliqués dans la formation de 3 ponts disulfures.
Ces documents décrivent l'organisation du gène INSL4 qui est composé de deux exons et d'un intron. Ces documents montrent également que les transcrits ARNm du gène INSL4 ont seulement été détectés dans les tissus placentaires et faiblement dans l'utérus (D. Chassin et al., 1995).
Le gène INSL4 qui appartient également à cette famille pourrait être un nouveau membre de cette famille de gène qui est impliqué dans le développement humain. Pour nous permettre de mieux comprendre le rôle de ces gènes dans le développement embryonnaire et foetal, l'étude des voies d'expression de ces gènes à différentes étapes du développement a été une approche réussie (T. Strachan et al. , 1997 ; C. Ottolenghi et al., 1997, et J. Burn et al. , 1995). En étudiant la chronologie et la localisation de l'expression des gènes INSL4 et IGF-II dans le développement du placenta et des tissus humains d'embryons en début de gestation par la technique d'hybridation in situ, les inventeurs ont mis en évidence un niveau d'expression élevé de transcrits d'INSL4 dans le trophoblaste humain, en particulier dans les syncytio- trophoblastes. De manière tout à fait surprenante, les inventeurs ont également mis en évidence un niveau d'expression élevé de transcrits d'INSL4 dans des tissus foetaux âgés de huit semaines, mais seulement dans les ligaments interosseux et dans le périchondre.
La présente invention a donc pour objet un polypeptide EPIL 1, EPIL 2 ou EPIL 3 codé par le gène INSL4, caractérisé en ce qu'il est exprimé dans des cellules foetales du tissu osseux. Dans la présente description, le terme de polypeptide désigne également une protéine ou un peptide.
On entend désigner dans la présente invention par polypeptide EPIL 1, un polypeptide codé par le gène INSL4, constitué d'une seule chaîne comportant les régions A, B et C de séquence globale d'acides aminés choisie parmi les séquences d'acides aminés comprises entre les positions 18 et 139, extrémités incluses, de la séquence d'acides aminés définie à la figure 1 , ladite séquence globale comportant au moins la séquence d'acides aminés comprise entre les positions 24 et 139, extrémités incluses, ledit polypeptide EPIL 1 pouvant en outre comporter un peptide signal de telle sorte que la séquence d'acides aminés du polypeptide EPIL 1 comprenant le peptide signal est la séquence comprise entre les positions 1 et 139, extrémités comprises, de la séquence d'acides aminés définie à la figure 1.
On entend désigner dans la présente invention par polypeptide EPIL 2, un polypeptide codé par le gène INSL4, constitué : a) d'une chaîne A dont la séquence d'acides aminés est la séquence comprise entre les positions 115 et 139, extrémités incluses de la séquence d'acides aminés définie à la figure 1 ; b) d'une chaîne B dont la séquence d'acides aminés est choisie parmi une séquence comprise entre les positions 18 et 58, extrémités incluses, de la séquence d'acides aminés définie à la figure 1, ladite séquence comprenant au moins la séquence comprise entre les positions 24 et 53, extrémités incluses ; ledit polypeptide EPIL 2 pouvant comporter en outre un peptide signal de séquence d'acides aminés choisie parmi une séquence comprise entre les positions 1 et
23, extrémités incluses, de la séquence d'acides aminés définie à la figure 1, ladite séquence du peptide signal comprenant au moins la séquence comprise entre les positions 1 et 17, extrémités incluses.
On entend désigner dans la présente invention par polypeptide EPIL 3, un polypeptide codé par le gène INSL4, constitué d'une chaîne C dont la séquence d'acides aminés est choisie parmi une séquence comprise entre les positions 54 et 114, extrémités incluses, de la séquence d'acides aminés définie à la figure 1, ladite séquence comprenant au moins la séquence comprise entre les positions 59 et 114, extrémités incluses.
On entend désigner par tissu osseux dans la présente description, les tissus composant préférentiellement les os cartilagineux longs, courts ou plats. L'invention concerne également les polypeptides selon l'invention, caractérisés en ce que les cellules foetales du tissu osseux sont des cellules du périchondre.
L'invention a aussi pour objet les polypeptides EPIL 1 , EPIL 2 ou EPIL 3 codés par le gène INSL4, caractérisés en ce qu'ils sont exprimés dans des cellules foetales de ligaments, notamment les ligaments interosseux. L'invention comprend en outre les polypeptides EPIL 1, EPIL 2 ou EPIL 3 codés par le gène INSL4, caractérisés en ce qu'ils sont impliqués dans le processus de différenciation, de prolifération et/ou de régénération de cellules du tissu osseux et/ou de ligaments.
Font également partie de l'invention, les polypeptides EPIL 1 , EPIL 2 ou EPIL 3 codés par le gène INSL4, caractérisés en ce qu'ils sont impliqués dans le processus de développement du cartilage et/ou d'ossification de l'os en formation.
Il doit être compris que l'invention ne concerne pas les polypeptides sous forme naturelle, c'est-à-dire qu'ils ne sont pas pris dans leur environnement naturel mais qu'ils ont pu être obtenus par purification à partir de sources naturelles, ou bien obtenus par recombinaison génétique, pouvant être glycosylés ou non, ou encore obtenus par synthèse chimique et pouvant alors comporter des acides aminés non naturels ou modifiés.
L'invention est relative à l'utilisation d'un ou de plusieurs anticorps dirigés contre un polypeptide EPIL 1, EPIL 2, EPIL 3, l'un de leurs homologues ou variants ou un de leurs fragments, pour la détection, l'identification, la localisation et/ou le dosage d'un polypeptide EPIL 1, EPIL 2, EPIL 3 ou l'un de leurs homologues ou variants, dans le tissu osseux et/ou dans les ligaments.
L'invention est aussi relative à l'utilisation d'un ou de plusieurs anticorps dirigés contre un polypeptide EPIL 1, EPIL 2, EPIL 3, l'un de leurs homologues ou variants, ou l'un de leurs fragments pour le diagnostic de pathologies liées à l'expression anormale de polypeptide EPIL 1, EPIL 2 et/ou EPIL 3 dans le tissu osseux et/ou dans les ligaments.
On entendra désigner comme polypeptides homologues de polypeptide EPIL 1 , EPIL 2 ou EPIL 3, les polypeptides présentant, par rapport auxdits polypeptides EPIL 1, EPIL 2 ou EPIL 3, certaines modifications comme en particulier une délétion, une troncation, un allongement, une fusion chimérique, et/ou une mutation, notamment ponctuelle. Parmi les polypeptides homologues, on préfère ceux dont la séquence d'acides aminés présente au moins 80 %, de préférence 90 %, de similitude avec les séquences d'acides aminés des polypeptides selon l'invention. On entendra par polypeptide variant de polypeptide EPIL 1 , EPIL 2 ou EPIL
3, l'ensemble des polypeptides mutés pouvant exister naturellement, en particulier chez l'être humain, et qui correspondent notamment à des troncatures, substitutions, délétions et/ou additions d'au moins un résidu d'acide aminé. Ces polypeptides variants correspondent en particulier à une expression anormale des polypeptides EPIL 1, EPIL 2 ou EPIL 3.
Par fragment de polypeptide EPIL 1, EPIL 2, EPIL 3, ou d'un de leurs homologues ou variants, on entend désigner un polypeptide de séquence d'acides aminés comportant au minimun 5 acides aminés, de préférence 10 acides aminés et 15 acides aminés consécutifs desdits polypeptides. Parmi les anticorps qui pourront être utilisés pour ladite détection, identification, localisation et/ou ledit dosage ou pour ledit diagnostic de pathologies, on préfère les anticorps mono ou polyclonaux ou leurs fragments, anticorps chimériques, caractérisés en ce qu'ils sont capables de reconnaître spécifiquement un polypeptide EPIL 1, EPIL 2, EPIL 3, l'un de leurs homologues ou variants, ou l'un de leurs fragments.
Des anticorps polyclonaux spécifiques peuvent être obtenus à partir d'un sérum d'un animal immunisé contre, par exemple :
- un polypeptide EPIL 1, EPIL 2, EPIL 3, l'un de leurs homologues ou variants, ou l'un de leurs fragments, notamment produit par recombinaison génétique ou par synthèse peptidique, selon les modes opératoires usuels, à partir d'une séquence d'acide nucléique codant pour lesdits polypeptides ou de séquence d'acides aminés desdits polypeptides.
Les anticorps monoclonaux spécifiques peuvent être obtenus selon la méthode classique de culture d'hybrido es décrite par Kôhler et Milstein, 1975. Lesdits anticorps sont, par exemple, des anticorps chimériques, des anticorps humanisés, des fragments Fab ou F(ab')2. Ils peuvent également, selon l'invention, se présenter sous forme d'immunoconjugués ou d'anticorps marqués afin d'obtenir un signal détectable et/ou quantifiable.
Il est bien entendu qu'on entend par l'expression « plusieurs anticorps » dans la présente description, au moins deux anticorps de spécificité différente, c'est-à-dire capable de reconnaître et de se lier à deux épitopes ou domaines différents desdits polypeptides. Il est d'ailleurs préféré selon l'invention d'utiliser au moins deux anticorps de spécificité différente pour les procédés, les méthodes et les kits de l'invention qui incluent lesdits anticorps. Dans ce cas, on pourra par exemple utiliser deux marquages d'anticorps différents ou deux systèmes de révélation différents.
Cesdits anticorps pourront ainsi constituer un moyen d'analyse immuno- cytochimique ou immunohistochimique de l'expression desdits polypeptides sur des coupes spécifiques de tissus osseux et/ou de ligaments, par exemple par immunofiuorescence, marquage à l'or, immunoconjugués enzymatiques. Ils permettent notamment de mettre en évidence et de quantifier la présence spécifique normale ou anormale desdits polypeptides dans les tissus osseux et/ou de ligaments, ce qui les rend utiles pour l'identification et la localisation de l'expression de ces polypeptides, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale desdits polypeptides. Plus généralement, lesdits anticorps peuvent être avantageusement mis en oeuvre dans toute situation où l'expression d'un desdits polypeptides doit être observée de manière qualitative et/ou quantitative dans un échantillon biologique de tissu osseux et/ou de ligaments.
Les techniques et les réactifs spécifiques permettant la détection, l'identification, la localisation et/ou le dosage des complexes antigène-anticorps que l'on pourra utiliser dans les procédés de l'invention, sont bien connus de l'homme du métier et sont, par exemple, les techniques ELISA, RIA ou d'immunofluorescence pouvant être associées, dans le cas où les anticorps de l'invention ne sont pas déjà immunoconjugués ou marqués, avec les réactifs appropriés tels que des anticorps immunoconjugués, marqués à la fluorcscéïnc ou radiomarqués capables de reconnaître spécifiquement lesdits anticorps, ainsi que les substrats chromogènes spécifiques des enzymes conjugués et les réactifs témoins de contrôles positif, négatif et quantitatif.
Ainsi, l'invention comprend un procédé de détection, d'identification, de localisation et/ou de dosage spécifique d'un polypeptide EPIL 1 , EPIL 2 et/ou EPIL 3 ou un de ses fragments dans un échantillon biologique de tissu osseux et/ou de ligament, ou de diagnostic de pathologies liées à la présence anormale du ou desdits polypeptides dans le tissu osseux et/ou dans les ligaments, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mise en contact dudit échantillon biologique avec un ou plusieurs anticorps dirigés contre le ou lesdits polypeptides ; b) mise en évidence, identification, localisation et/ou dosage du complexe antigène- anticorps formé.
L'invention comprend également un kit ou nécessaire pour la détection, l'identification, la localisation et/ou le dosage spécifique d'un polypeptide EPIL 1, EPIL 2 et/ou EPIL 3 ou un de ses fragments dans un échantillon biologique de tissu osseux et/ou de ligaments, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale du ou desdits polypeptides dans ledit échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants : a) un ou plusieurs anticorps dirigés contre le ou lesdits polypeptides ; b) le cas échéant, les réactifs pour la constitution du milieu propice à la réaction immunologique ; c) le cas échéant, les réactifs permettant la détection, l'identification et/ou le dosage des complexes antigène-anticorps produits par la réaction immunologique.
L'invention concerne également l'utilisation d'une sonde ou amorce oligonucléotidique capable de s'hybrider spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4, pour la détection, l'identification, la 10
localisation, l'amplification, et/ou le dosage de séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4 dans le tissu osseux et/ou dans les ligaments.
L'invention comprend également l'utilisation d'une sonde ou amorce oligonucléotidique capable de s'hybrider spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4, pour le diagnostic de pathologies liées à l'expression anormale du gène INSL4 dans le tissu osseux et/ou dans les ligaments.
On entendra désigner par -séquence d'acide nucléique correspondant au gène
INSL4-, la séquence nucléotidique du gène INSL4 telle que définie à la figure 1 ou toutes séquences nucléotidiques codant pour un polypeptide homologue ou variant de polypeptide EPIL 1 , EPIL 2 ou EPIL 3, leur séquence complémentaire, la séquence nucléotidique de leur ARN correspondant ainsi que leurs fragments.
Lesdites sondes oligonucléotidiques capables de s'hybrider spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4, pourront être marquées ou fixées sur un support solide par liaison covalente ou non, les techniques de marquage ou de fixation de telles sondes étant bien connues de l'homme de l'art.
Une hybridation spécifique signifie que l'hybridation est réalisée dans des conditions de stringence, en particulier dans des conditions de température et de force ionique telles qu'elles permettent le maintien de l'hybridation entre deux fragments d'ADN globalement complémentaires. A titre illustratif, des conditions de forte stringence de l'étape d'hybridation aux fins de définir les séquences nucléotidiques décrites ci-dessus, sont avantageusement les suivantes.
L'hybridation est réalisée à une température préférentielle de 65 °C, en présence de tampon 6 x SSC, 5 x de solution de Denhardt, 0,5 % SDS et 100 μg/ml d'ADN de sperme de saumon.
1 x SSC correspond à 0,15 M NaCl et 0.05M de citrate de sodium et une solution de 1 x Denhardt correspond à 0,02 % Ficoll, 0,02 % de polyvinylpyrrolidone et 0,02 % de sérum albumine bovine.
Les étapes de lavage peuvent, par exemple, être effectuées pendant 5 à 30 min. à 65°C, dans un tampon 2 x SSC ou 1 x SSC et à 0,1 % SDS. 11
Les conditions d'hybridation de forte stringence décrites ci-avant pour un polynucléotide de taille définie, seront adaptées par l'homme du métier pour des oligo- nucléotides de taille plus grande ou plus petite, selon l'enseignement de Sambrook et al. , 1989. Les sondes ou amorces oligonucléotidiques, et de manière générale les séquences d'acide nucléique selon l'invention, présenteront une taille minimale de 10 bases et on préférera des fragments de 20 bases, et de préférence 30 bases.
Font également partie de l'invention, les procédés de détection, d'identification et/ou de dosage spécifique de séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4 dans un échantillon biologique de tissu osseux et/ou de ligament, ou de diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de ladite séquence d'acide nucléique dans ledit échantillon biologique, caractérisés en ce qu'ils comportent les étapes suivantes : a) isolement de l'ADN à partir dudit échantillon biologique à analyser, ou obtention d'un ADNc à partir de TARN dudit échantillon biologique ; b) amplification spécifique de ladite séquence d'acide nucléique à l'aide d'au moins une amorce capable de s'hybrider spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4 ; c) analyse qualitative et/ou quantitative des produits d'amplification. L'invention comprend aussi les procédés de détection, d'identification et/ou de dosage spécifique de séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4 dans un échantillon biologique de tissu osseux et/ou de ligament, ou de diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de ladite séquence d'acide nucléique dans ledit échantillon biologique, caractérisés en ce qu'ils comportent les étapes suivantes : a) mise en contact d'une sonde oligonucléotidique capable de s'hybrider spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4 avec ledit échantillon biologique, l'ADN contenu dans ledit échantillon biologique ayant, le cas échéant, préalablement été rendu accessible à l'hybridation, dans des conditions permettant l'hybridation de ladite sonde à l'ADN contenu dans ledit échantillon biologique ; 12
b) détection, identification et/ou dosage de l'hybride formé entre ladite sonde oligonucléotidique et l'ADN dudit échantillon biologique.
L'invention est relative en outre à des procédés de détection, d'identification et/ou de dosage spécifique de séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4 dans un échantillon biologique de tissu osseux et/ou de ligament, ou de diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de ladite séquence d'acide nucléique dans ledit échantillon biologique, caractérisés en ce qu'ils comportent les étapes suivantes : a) mise en contact d'une sonde oligonucléotidique immobilisée sur un support et capable de s'hybrider spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4, avec ledit échantillon biologique, l'ADN de l'échantillon, ayant, le cas échéant, été préalablement amplifié à l'aide d'au moins une amorce capable de s'hybrider spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4 et/ou rendu accessible à l'hybridation, dans des conditions permettant l'hybridation de ladite sonde à l'ADN dudit échantillon biologique ; b) mise en contact de l'hybride formé entre ladite sonde oligonucléotidique immobilisée sur un support et l'ADN contenu dans ledit échantillon biologique, le cas échéant après élimination de l'ADN dudit échantillon biologique n'ayant pas hybride avec ladite sonde, avec une sonde oligonucléotidique, notamment marquée, et capable de s'hybrider spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4.
Font en outre partie de la présente invention, les kits ou nécessaires pour la détection, l'identification et/ou le dosage spécifique de séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4 dans un échantillon biologique de tissu osseux et/ou de ligament, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de ladite séquence d'acide nucléique dans ledit échantillon biologique, caractérisés en ce qu'ils comprennent les éléments suivants : a) une sonde oligonucléotidique capable de s'hybrider spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4 ; 13
b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la mise en oeuvre d'une réaction d'hybridation ; c) le cas échéant, au moins une amorce capable de s'hybrider spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4 ainsi que les réactifs nécessaires à une réaction d'amplification de l'ADN.
L'invention comprend également les kits ou nécessaires pour la détection, l'identification et/ou le dosage spécifique de séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4 dans un échantillon biologique de tissu osseux et/ou de ligament, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de ladite séquence d'acide nucléique dans ledit échantillon biologique, caractérisés en ce qu'ils comprennent les éléments suivants : a) une sonde oligonucléotidique, dite sonde de capture, pouvant être fournie préimmobilisée sur un support, et capable de s'hybrider spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4 ; b) une sonde oligonucléotidique, dite sonde de révélation, notamment marquée, et capable de s'hybrider spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4 ; c) le cas échéant, au moins une amorce capable de s'hybrider spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4 ainsi que les réactifs nécessaires à une réaction d'amplification de l'ADN.
Font aussi partie de l'invention, les procédés ou kits selon l'invention pour le diagnostic de pathologies liées à la différenciation et/ou la prolifération anormale du tissu osseux et/ou des cellules de ligaments, pour le diagnostic de pathologies liées au développement anormal du cartilage et/ou à une ossification anormale de l'os en formation et/ou pour le diagnostic d'ostéoporose et/ou pour le diagnostic de dysplasies. Parmi les dysplasies, on peut citer notamment les dysplasies diaphysaires comme l'hypoplasie diaphysaire ou ostéogénèse imparfaite ou encore l'hyperplasie diaphysaire ou maladie d'Engelmann.
Dans la présente invention on entend par diagnostic de pathologies liées à la différenciation et/ou la prolifération anormale du tissu osseux et/ou des cellules de ligaments, ou pour le diagnostic de pathologies liées au développement anormal du 14
cartilage et/ou à une ossification anormale de l'os en formation ou encore pour le diagnostic d'ostéoporose et/ou de dysplasie, non seulement le diagnostic proprement dit de la pathologie, mais aussi le diagnostic ou pronostic d'évolution de ladite pathologie, suite par exemple à un traitement thérapeutique. Ainsi, selon l'invention, lesdits procédés ou kits peuvent être utilisés pour évaluer l'efficacité d'un traitement thérapeutique de ladite pathologie.
Les techniques d'amplification spécifique et d'analyse qualitative et/ou quantitative de séquence nucléique que l'on pourra utiliser dans les procédés de l'invention, sont bien connues de l'homme du métier et sont, par exemple, les méthodes comprenant au moins une étape d'amplification dite par PCR (réaction en chaîne par la polymérase) ou par PCR-like de la séquence cible susceptible d'être présente à l'aide d'au moins une amorce oligonucléotidique de séquence nucléique telle que définie précédemment. Les produits amplifiés pourront être traités à l'aide d'enzyme de restriction appropriée avant de procéder à la détection ou au dosage du produit ciblé, notamment par un procédé selon l'invention.
Par PCR-like on entendra désigner toutes les méthodes mettant en oeuvre des reproductions directes ou indirectes des séquences d'acide nucléique, ou bien dans lesquelles les systèmes de marquage ont été amplifiés. Ces techniques sont bien entendu connues. En général il s'agit de l'amplification de l'ADN par une polymérase ; lorsque l'échantillon d'origine est un ARN, il convient préalablement d'effectuer une transcription réverse. Il existe actuellement de très nombreux procédés permettant cette amplification, par exemple les méthodes dites NASBA « Nucleic Acid Séquence Based Amplification » (Compton, 1991), TAS « Transcription based Amplification System » (Guatelli et al., 1990), LCR « Ligase Chain Reaction » (Landegren et al. , 1988), « Endo Run Amplification » (ERA), « Cycling Probe Reaction » (CPR), et SDA « Strand Displacement Amplification » (Walker et al., 1992), bien connues de l'homme du métier. Sont également connues de l'homme du métier, les techniques de quantification d'acide nucléique dans lesquelles par exemple on amplifie l'acide nucléique à quantifier par une méthode type PCR et en présence d'un acide nucléique standard de même taille, de quantité connue et capable de s'hybrider aux mêmes amorces que l'acide nucléique cible. 15
Les fragments amplifiés peuvent être identifiés, par exemple après une électrophorèse en gel d'agarose ou de polyacrylamide, ou après une technique chromatographique comme la filtration sur gel ou la chromatographie échangeuse d'ions. La spécificité de l'amplification peut être contrôlée par exemple par hybridation moléculaire en utilisant comme sondes les sondes telles que définies ci- dessus, notamment marquées.
L'invention comprend en outre, les méthodes de marquage de cellule de tissu osseux et/ou de ligament, notamment d'origine foetales, caractérisées en ce qu'elles comprennent les étapes suivantes : a) mise en contact d'un échantillon biologique de tissu osseux et/ou de ligament avec un ou plusieurs anticorps dirigés contre le ou les polypeptides EPIL 1 , EPIL 2 et/ou EPIL 3, lesdits anticorps pouvant être marqués ; b) le cas échéant, marquage desdits anticorps à l'aide de composés marqués capable de reconnaître lesdits anticorps. Les techniques de marquage de cellules par des anticorps spécifiques de composé de ladite cellule, sont bien connues des immunocytochimistes ou des immunohistochimistes et ne seront pas développées dans la présente description.
Sont également comprises dans la présente invention les méthodes de marquage de cellule de tissu osseux et/ou de ligament, notamment d'origine foetales, caractérisées en ce qu'elles comprennent les étapes suivantes : a) mise en contact d'un échantillon biologique de tissu osseux et/ou de ligament avec une ou plusieurs sondes oligonucléotidiques capables de s'hybrider spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4, lesdites sondes pouvant être marquées ; b) le cas échéant, marquage desdites sondes à l'aide de composés marqués capables de reconnaître lesdites sondes.
L'invention a aussi pour objet un procédé de détection de cellule anormale de tissu osseux et/ou de ligament, caractérisé en ce qu'il met en oeuvre une méthode de marquage selon l'invention. Un autre aspect de l'invention concerne des méthodes de sélection de composé chimique ou biochimique capable de moduler la différenciation, la régénération et/ou 16
la prolifération de cellules humaines et/ou animales de tissu osseux et/ou de ligament, caractérisées en ce qu'elles mettent en oeuvre un polypeptide EPIL 1 , EPIL 2, EPIL 3, un de leurs polypeptides homologues ou variant, ou un de leurs fragments, une séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4, ou une cellule de tissu osseux ou de ligament, notamment foetale. Ladite cellule pouvant être une cellule transformée par recombinaison génétique ou sélectionnée selon l'invention.
Parmi ces méthodes, on préfère les méthodes caractérisées en ce que ledit composé sélectionné est capable d'inhiber ou de favoriser la différenciation, la régénération et/ou la prolifération de cellules humaines et/ou animales de tissu osseux et/ou de ligament, notamment les cellules foetales du périchondre.
Lesdits composés pourront par exemple être sélectionnés sur leur capacité à se lier à un polypeptide EPIL 1, EPIL 2, EPIL 3, à un de leurs polypeptides homologues ou variant, ou à un de leurs fragments, et à inhiber ou favoriser l'activité desdits polypeptides dans les tissus osseux et/ou dans les ligaments, en tant que, par exemple, ligands agonistes ou antagonistes d'un récepteur spécifique desdits polypeptides sur les cellules desdits tissus.
Lesdits composés pourront être également sélectionnés sur leur capacité à se lier à une séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4, et à inhiber ou favoriser l'expression du gène codant pour lesdits polypeptides en tant qu'inducteur ou répresseur.
Lesdits composés pourront également être sélectionnés sur leur capacité à moduler sur lesdites cellules in vitro ou in vivo, l'activité biologique desdits polypeptides exprimés par lesdites cellules, comme notamment la différenciation, la prolifération ou la régénération desdites cellules. Par exemple, l'invention comprend une méthode de sélection de composés capables de se lier à un polypeptide EPIL 1, EPIL 2, EPIL 3, à un de leurs polypeptides homologues ou variants, ou à un de leurs fragments, ou encore capables de se lier à une séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4, et capables de moduler l'activité desdits polypeptides dans les tissus osseux et/ou dans les ligaments, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : 17
a) mise en contact dudit composé avec ledit polypeptide ou ladite séquence d'acide nucléique ; b) détermination de la capacité dudit composé à se lier avec ledit polypeptide ou ladite séquence d'acide nucléique ; c) mise en évidence de la modulation de l'activité desdits polypeptides sur des cellules de tissu osseux et/ou de ligament, susceptible d'être obtenue avec les composés sélectionnés à l'étape b).
Il sera possible, par exemple, d'utiliser des cellules de tissu osseux et/ou de ligament transformées par recombinaison génétique ou sélectionnées selon l'invention, à l'étape b) et/ou c) de la présente méthode.
L'invention comprend également les composés chimiques ou biochimiques, susceptibles d'être sélectionnés par une méthode selon l'invention.
Les composés susceptibles d'être sélectionnés peuvent être des composés organiques tels que des polypeptides ou hydrates de carbone ou tous autres composés déjà connus, ou des composés organiques nouveaux élaborés à partir de techniques de modélisation moléculaire et obtenus par synthèse chimique ou biochimique, ces techniques étant connues de l'homme de l'art.
L'invention a en outre pour objet des composés selon l'invention à titre de médicament, de préférence choisis parmi : a) un polypeptide EPIL 1, EPIL 2 ou EPIL 3, un de leurs polypeptides homologues ou variants ou un de leurs fragments, pouvant être obtenu par recombinaison génétique ou par synthèse chimique ; b) un anticorps dirigé contre un polypeptide tel que défini en a) ; c) un composé chimique ou biochimique, caractérisé en ce qu'il est un ligand d'un polypeptide tel que défini en a) ; d) un vecteur comprenant tout ou partie d'une séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4 ; e) un vecteur tel que défini en d), présentant à sa surface un marqueur spécifique de cellules de tissu osseux ou de ligament cible dont on cherche à moduler l'activité ; 18
f) une séquence d'acide nucléique sens ou antisens capable de s'hybrider spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4.
Les fragments de polypeptide EPIL 1 , EPIL 2 ou EPIL 3, ou de leurs polypeptides homologues ou variants, et tels que définis en a) seront de préférence caractérisés en ce qu'ils sont biologiquements actifs.
Par fragment biologiquement actif, on entendra désigner en particulier un fragment de séquence d'acides aminés de polypeptide EPIL 1 , EPIL 2 ou EPIL 3, ou de leurs polypeptides homologues ou variants présentant au moins une des activités desdits polypeptides comme notamment : - la capacité de moduler, notamment d'inhiber ou de favoriser, la différenciation, la prolifération et/ou la régénération de cellules de tissu osseux et/ou de ligament ; et/ou
- la capacité d'être reconnu par un anticorps spécifique d'un polypeptide EPIL 1, EPIL 2 ou EPIL 3, ou d'un de leurs polypeptides homologues ou variants. Les polypeptides EPIL 1, EPIL 2 ou EPIL 3, leurs polypeptides homologues ou variants ou leurs fragments, recombinants pourront être obtenus à partir de méthodes bien connues de l'homme de l'art à l'aide de vecteurs de clonage et/ou d'expression contenant une séquence d'acide nucléique codant pour lesdits polypeptides et de cellules hôtes transformées par lesdits vecteurs. Les polypeptides recombinants obtenus peuvent aussi bien se présenter sous forme glycosylée que non glycosylée et peuvent présenter ou non la structure tertiaire naturelle.
Ces polypeptides peuvent être produits à partir des séquences d'acide nucléique codant pour lesdits polypeptides selon les techniques de production de polypeptides recombinants connues de l'homme du métier. Dans ce cas, la séquence d'acide nucléique utilisée est placée sous le contrôle de signaux permettant son expression dans un hôte cellulaire.
Un système efficace de production d'un polypeptide recombinant nécessite de disposer d'un vecteur, par exemple d'origine plasmidique ou virale, et d'une cellule hôte compatible. 19
L'hôte cellulaire peut être choisi parmi des systèmes procaryotes, comme les bactéries, ou eucaryotes, comme par exemple les levures, cellules d'insectes ou de mammifères comme les cellules CHO (cellules d'ovaires de hamster chinois) ou les cellules murines ou tout autre système avantageusement disponible. Un hôte cellulaire préféré pour l'expression des protéines de l'invention est constitué par les cellules d'ovaire de hamster chinois CHO, et par les cellules 3A-subE d'origine placentaire humaine.
Le vecteur doit comporter un promoteur, des signaux d'initiation et de terminaison de la traduction, ainsi que des régions appropriées de régulation de la transcription. Il doit pouvoir être maintenu de façon stable dans la cellule et peut éventuellement posséder des signaux particuliers spécifiant la sécrétion de la protéine traduite.
Ces différents signaux de contrôle sont choisis en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. A cet effet, les séquences d'acide nucléique peuvent être insérées dans des vecteurs à réplication autonome au sein de l'hôte choisi, ou des vecteurs intégratifs de l'hôte choisi.
De tels vecteurs seront préparés selon les méthodes couramment utilisées par l'homme du métier, et les clones en résultant peuvent être introduits dans un hôte approprié par des méthodes standards, telles que par exemple la lipofection, l'électroporation, le choc thermique.
Les cellules hôtes transformées par les vecteurs précédents peuvent être obtenues par l'introduction dans ces cellules d'une séquence nucléotidique insérée dans un vecteur tel que défini ci-dessus, puis la mise en culture desdites cellules dans des conditions permettant la réplication et/ou l'expression de la séquence nucléotidique transfectée.
Parmi les cellules hôtes utilisables à ces fins, on peut citer bien entendu les cellules bactériennes (Olins et Lee, 1993), mais également les cellules de levure (Buckholz, 1993), de même que les cellules animales, en particulier les cultures de cellules de mammifères (Edwards et Aruffo, 1993), et notamment les cellules d'ovaire de hamster chinois (CHO), des cellules humaines telles que les cellules 3A-subE 20
d'origine placentaire, mais également les cellules d'insectes dans lesquelles on peut utiliser des procédés mettant en oeuvre des baculovirus par exemple (Luckow, 1993).
Les procédés de purification de polypeptide recombinant ou synthétique utilisés sont connus de l'homme du métier. Le polypeptide recombinant ou synthétique peut être purifié à partir de méthodes utilisées individuellement ou en combinaison, telles que le fractionnement, les méthodes de chromatographie, les techniques d'immuno- affinité à l'aide d'anticorps mono ou polyclonaux spécifiques.
Une variante préférée consiste à produire un polypeptide recombinant fusionné à une protéine «porteuse» (protéine conjuguée). L'avantage de ce système est qu'il permet une stabilisation et une diminution de la protéolyse du produit recombinant, une augmentation de la solubilité au cours de la renaturation in vitro et/ou une simplification de la purification lorsque le partenaire de fusion possède une affinité pour un ligand spécifique.
Les polypeptides EPIL 1, EPIL 2 ou EPIL 3, leurs polypeptides homologues ou variants ou leurs fragments peuvent être également obtenus par synthèse chimique. Les polypeptides obtenus par synthèse chimique pourront comporter des acides aminés non naturels.
Parmi lesdits composés sélectionnés à titre de médicament, on peut citer en particulier les oligonucléotides antisens, c'est-à-dire dont la structure assure, par hybridation avec la séquence cible, une inhibition de l'expression du produit correspondant. Il faut également citer les oligonucléotides sens qui, par interaction avec des protéines impliquées dans la régulation de l'expression du gène INSL4, induiront soit une inhibition, soit une activation de cette expression.
L'invention concerne des composés selon l'invention, destinés au traitement de pathologies liées à la différenciation et/ou la prolifération anormale du tissu osseux et/ou des cellules de ligaments, notamment de pathologies liées au développement anormal du cartilage et/ou à une ossification anormale de l'os en formation, en particulier destinés au traitement de l'ostéoporose et/ou de dysplasie.
Parmi lesdites dysplasies, on préfère notamment les dysplasies diaphysaires comme l'hypoplasie diaphysaire ou ostéogénèse imparfaite et l'hyperplasie diaphysaire ou maladie d'Engelmann. 21
L'invention a enfin pour objet des composés selon l'invention, destinés au traitement de pathologies impliquant à la régénération de tissu osseux et/ou de ligament, en particulier au traitement visant à réparer des lésions du tissu osseux et/ou de ligaments suite à un choc traumatique. Les composés de l'invention en tant que principes actifs de médicament, seront préférentiellement sous forme soluble, associés à un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
De préférence, ces composés seront administrés par voie systémique, en particulier par voie intraveineuse, par voie intramusculaire, intradermique ou par voie orale.
Leurs modes d'administration, posologies et formes galéniques optimaux peuvent être déterminés selon les critères généralement pris en compte dans l'établissement d'un traitement adapté à un patient comme par exemple l'âge ou le poids corporel du patient, la gravité de son état général, la tolérance au traitement et les effets secondaires constatés, etc.
On peut également pallier de façon générale la carence ou la surexpression de polypeptides selon l'invention par une thérapie dite «de remplacement» permettant l'amplification ou la diminution des activités desdits polypeptides.
La thérapie de remplacement pourra être effectuée par thérapie génique, c'est- à-dire en introduisant les séquences d'acide nucléique selon l'invention et/ou les gènes correspondants avec les éléments qui permettent leur expression in vivo, dans le cas où l'un des gènes est insuffisamment exprimé par exemple, ou bien lorsqu'il est exprimé sous une forme anormale.
Les principes de la thérapie génique sont connus. On peut utiliser des vecteurs viraux, par exemple sur la base des adénovirus (Perricaudet et al., 1992), des AAV, Adénovirus Associated Nirus (Carter, 1993), des rétrovirus (Temin, 1986), des poxvirus ou des virus herpès (Epstein et al., 1992). La plupart du temps ces virus sont utilisés sous forme défective et, de façon générale, avec ou sans intégration dans le génome cellulaire. Il est également possible de prévoir des vecteurs non viraux, c'est- à-dire synthétiques, qui miment des séquences virales ou bien qui sont constitués par 22
de l'ADN ou de l'ARN nu selon la technique développée notamment par la société VICAL.
Dans la plupart des cas, il faudra prévoir des éléments de ciblage assurant une expression spécifique de façon à pouvoir limiter les zones d'expression des polypeptides. Il est même intéressant, dans certains cas, d'avoir des vecteurs d'expression transitoire ou au moins d'expression contrôlée que l'on pourra bloquer lorsque cela sera nécessaire.
Les composés selon l'invention utilisables à titre de médicament offrent une nouvelle approche pour le traitement de maladies liées à la différenciation ou à la prolifération non régulée de cellules ou tissus osseux et/ou de ligaments ou à l'absence ou à l'insuffisance de certaines cellules de tissus osseux et/ou de ligaments, suite par exemple à un traumatisme.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans la suite de la description avec les exemples et les figures dont les légendes sont représentées ci-après.
Légende des Figures
Figure 1 : Séquence d'acide nucléique de l'ADNc du gène INSL4 et séquence d'acides aminés du polypeptide EPIL codé par cette séquence.
Figures 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 2F : Comparaison de la distribution de l'ARNm d'INSL4 et d'IGF-ϋ dans le placenta humain âgé de 14 semaines ;
- observation sur fond clair (figure 2A) et sur fond noir (figure 2B) d'une même coupe de tissu hybridée avec une sonde INSL4 antisens ;
- agrandissement de la coupe précédente observée sur fond clair (figure 2C) ;
- observation sur fond clair (figure 2D) et sur fond noir (figure 2E) d'une même coupe de tissu hybridée avec une sonde IGF-II antisens ;
- agrandissement de la coupe précédente observée sur fond clair (figure 2F) ; s : syncytiotrophoblaste ; c : cytotrophoblaste ; m : mésenchyme ; la barre d'échelle représente 295 μm pour figures 2A, 2B, 2D et 2E, et représente 15 μm pour figures 2C et 2D. Figures 3A, 3B, 3C, 3D, 3E, 3F, 3G, 3H : Distribution cellulaire de l'ARNm d'IGF-II dans des embryons humains âgés de 25 jours (figures 3 A et 3B), 30 jours 23
(figures 3C, 3D, 3E et 3F) ou 45 jours (figures 3G et 3H) obtenue par hybridation in situ à l'aide d'une sonde oligonucléotidique marquée au 33S.
Microphotographies sur fond clair (panel de gauche) et sur fond noir (panel de droite) d'une même coupe de tissu : - coupe axiale (figures 3A et 3B) au niveau du «rhombencéphale» ; nt : tube neural ; ov : vésicule otique ;
- coupe abdominale longitudinale (figures 3C et 3D) ; nt : tube neural ; m : mésonéphron ;
- coupe sagitale au niveau des arcs branchiaux (ba) (figures 3E et 3F) ; - coupe longitudinale du corps vertébral (vb) (figures 3G et 3H) ; la barre d'échelle représente 295 μm pour figures 3A, 3B, 3C et 3D, et représente 150 μm pour tous les autres panels.
Figures 4A, AB, 4C, 4D, 4E et 4F : Hybridation in situ effectuée avec une sonde oligonucléotidique d'INSL4 sur un foetus humain âgé de 8 semaines. Microphotographies sur fond clair (panel de gauche) et fond noir (panel de droite) d'une même coupe de tissu :
- coupe de la partie distale du fémur dans l'articulation développée de la hanche (figures 4A et 4B) au niveau du «rhombencéphale» ; f : fémur; 1 : ligament ;
- coupe longitudinale du rachis (figures 4C et 4D) ; l'ARNm d'INSL4 est localisé dans les disques inter-vertébraux, dans les ligaments intervertébraux ; vb : corps vertébral ; 1 : ligament ;
- coupe transversale de côte (Figure 4E et 4F) ; pc : périchondre ; r : côte ; la barre d'échelle représente 295 μm pour figures 4A, 4B, 4C et 4D, et représente 150 μm pour figures 4E et 4F.
EXEMPLES
Matériels et méthodes
A) Sujets expérimentaux Des embryons morphologiquement normaux âgés de trois à huit semaines
(après ovulation) ont été obtenus après avortement légal par la mifepristone (RU 486) 24
à l'Hôpital Broussais à Paris. Une complète indépendance a été respectée entre la direction médicale de l'hôpital et le groupe de recherche. Le consentement maternel n'a jamais été demandé avant que l'avortement ait été décidé et réalisé. Le consentement a été obtenu après explication de l'objectif de recherche et seulement après que l'avortement médical ait été effectué. Cette procédure est approuvée par le Comité Ethique de l'Hôpital des Enfants Malades de Necker (Paris). Les embryons ont été séparés du trophoblaste par dissection sous microscope. Le stade de développement de chacun des embryons a été estimé en utilisant la classification de Carnegie établie par O'Rahilly (R. O'Rahilly et al., 1987 et 1994). Les embryons microdisséqués ont été congelés et conservés à - 80°C. Des cryocoupes (12 μm) ont été montés sur des lames prétraitées (lames Probon Plus, Microm France). Les coupes ont été fixées pendant 30 minutes dans une solution de para-formaldéhyde en tampon phosphate 0,1 M (pH 7,4), rincées une fois en PBS (tampon phosphate salin) et brièvement dans de l'eau, puis déshydratées avec une série de solution d'éthanol à différentes concentrations (50 %, 75 %, 95 %). Les coupes ont été ensuite séchées à l'air et conservées à - 80°C afin de préserver l'ARNm.
B) Sonde d'hybridation
Des sondes oligonucléotidiques de 60-mer ont été synthétisées et purifiées (DNAgency, Malvern, PA). Elles ont été marquées en 3' avec [α-3îS]dATP (NEN, Boston, MA) en utilisant une désoxyribonucléotidyle terminale transférase (Gibco BRL, Grand Island, NY) à une activité spécifique d'environ 7 x 108 cpm/mg. Les sondes oligonucléotidiques ont été purifiées sur colonnes Biospin (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) avant utilisation. La séquence de la sonde INSL4 antisens est la suivante (SEQ ID N° 2) :
5 ' -CTGGGGTGGTGGTGAATGTCTTCTC AGGC ATGGGGC A ATATGAC AGC AA GTGTTTTCCAA-3' , localisée sur l'exon 1. La séquence de la sonde IGF-II antisens est la suivante (SEQ ID N° 3) : 5 ' -AGCC AATCGATTTTGTAC ATGTTTGAAGATGCTGCTGTGCTTCCTC AGCC CGATGG AGGG-3', localisée sur l'exon 7 dans la région codante commune des ARNm de iGF-13. Des sondes sens ont été utilisées comme témoin. 25
C) Hybridation in situ
Le protocole expérimental (M. Abitbol et al. , 1993, et M. Gérard et al. , 1995) inclut une étape d'hybridation utilisant une solution contenant 50 % de formamide, 4 x SSC (solution standard de citrate salin), 1 x solution de Denhardt, 0,25 mg/ml d'ARNt de levure, 0,25 mg/ml de sperme de hareng, 0,25 mg/ml de poly-A, 10 % de sulfate dextran, 100 mM de dithiothreitol (DTT) et une sonde marquée [ -33S]dATP d'activité spécifique de 6 x 10δ cpm/ml. 100 μl de la solution d'hybridation a été déposée sur chacune des coupes. Puis les sections ont été recouvertes avec un parafilm et incubées dans une chambre humide à 43 °C pendant 20 heures. Après hybridation, les lames ont été lavées deux fois dans 1 x SSC contenant 10 mM DTT pendant 15 minutes à 55°, et deux fois dans une solution de 0,5 x SSC contenant 10 mM DTT pendant 15 minutes à température ambiante. Les coupes ont été ensuite plongées dans l'eau, déshydratées avec une série de solutions d'éthanol de différentes concentrations puis exposées pendant une semaine sur des films à rayon X Amersham Hyperfilm Betamax et dans une émulsion photographique Kodak NTB2 (Eastmman Kodak, Rochester, NY) pendant un à deux mois à 4°C. Les coupes ont ensuite été développées et marquées avec du bleu toluidine. Les résultats sont analysés par microscopie à contraste de phase.
Exemple 1 : Hybridation in situ de membranes placentaires et foetales
Afin de démontrer la spécificité des sondes oligonucléotidiques, une analyse par Northern blot a été réalisée avec 12 μg d'ARN total issus de tissus de trophoblaste. Les transcrits d'INSL4 ont été détectés à une taille de 0,7 kilobase (kb) avec à la fois les sondes oligonucléotidiques et une sonde d'ADNc, en accord avec la taille du transcrit d'INSL4 publié par Chassin et al. (1995). Pour le gène IGF-II un transcrit majeur de 6,0 kilobases et d'autres transcrits de 2 à 5 kilobases ont été détectés, confirmant les résultats de Han et al. (1988), qui a identifié des transcrits multiples d'IGF-II avec des tailles estimées de 1,8, 2,0, 2,8, 3,0, 4,0, 4,8 et 6,2 kb, le dernier étant le plus abondant. Ces résultats montrent la spécificité des oligomers d'INSL4 et d'IGF-II qui ont été choisis respectivement pour les ARNm d'INSL4 et d'IGF-II humains. L'hybridation in situ effectuée avec des oligonucléotides sens 26
d'INSL4 et d'IGF-II génère seulement des grains diffus correspondant au bruit de fond, démontrant ainsi la spécificité de l'hybridation positive obtenue avec des oligonucléotides antisens.
Un niveau faible d'expression du gène INSL4 a été détecté à partir de placenta précoce âgé de 25 jours et un niveau abondant d'ARNm d'INSL4 a été identifié à partir de placenta âgé de 14 semaines. Le gène INSL4 est exprimé dans les syncytiotrophoblastes et de manière moins abondante dans les cytotrophoblastes. Les cellules de la partie centrale du mésoderme villeux et les cellules de cordon ombilical expriment encore plus faiblement le gène INSL4 (figures 2A, 2B et 2C). Aucun signal n'a été détecté ni dans l'amnion ni dans le sac vitellin (résultats non représentés).
L'ARNm d'IGF-II a été exprimé en quantité abondante dans les colonnes de trophoblastes intermédiaires et dans le stroma villeux à 20 jours et 14 semaines de développement, mais n'est pas détectable dans les coupes de syncytiotrophoblastes (figures 2D, 2@et 2F). Dans les membranes foetales (20 jours), d'abondantes quantités d'ARNm d'IGF-II ont été identifiées dans les cellules d'amnions et les cellules externes du sac vitellin (résultats non représentés). Ces résultats sont résumés dans le tableau I ci-après.
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TABLEAU I : Distribution de l'ARNm d'INSU et d'IGF-II dans le placenta et les membranes foetales humains
Type de Cellules ARNm d'INSL4 ARNm d'IGF-II
Placenta
Syncytiotrophoblastes + + + + Nég.
Cytotrophoblastes + + + +
Stroma villeux + + + +
Trophoblastes Intermédiaires + + + + +
Membranes fœtales
Cellules de + Nd Cordon ombilical
Amnion Nég. + + + +
Sac vitellin Nég. + + + +
Figure imgf000029_0001
Légende du Tableau 1 :
Nd : non déterminé ; Nég. : signal d'hybridation négatif ; + : signal d'hybridation faible ; + + : signal d'hybridation modéré ; + + + : signal d'hybridation fort ;
+ + + + : signal d'hybridation très fort ; les signaux sont observés après 6 semaines d'exposition.
Le gène INSL4 est exprimé de manière plus importante dans les syncytiotrophoblastes que dans les cytotrophoblastes. Ces résultats sont confirmés par la technique RT-PCR (amplification par réaction en chaîne à la polymérase en utilisant la transcriptase inverse) effectuée sur l'ARN total de cellules de syncytiotrophoblaste et de cytotrophoblaste (D. Bellet et al, 1997). L'ARNm d'IGF-II est, de manière significative, plus abondante que l'ARNm d'INSLA dans les coupes adjacentes testées avec la sonde oligonucléotidique d'INSL4. L'expression du gène IGF-II dans le placenta d'embryon humain âgé de 25 à 40 jours et de 14 semaines est localisée dans les cellules de la partie centrale du mésoderme villeux et dans les cellules de 28
cytotrophoblaste intermédiaire ou villeux. Les transcrits d'IGF-II ne sont pas détectés dans la couche syncytiotrophoblastique pour les étapes de développement étudiées. Des observations similaires ont été reportées par exemple par V.K.M. Han (V.K.M. Han et al., 1996). Ainsi, il est probable que ces deux gènes jouent un rôle différent dans le développement du trophoblaste.
Exemple 2 : Hybridation in situ de tissus embryonnaires
Aucune sonde oligonucléotidique marquée d'INSL4 n'a été détectée dans les tissus embryonnaires âgés de 20 ou 30 jours, suggérant que le gène INSL4 n'est pas exprimé à cette étape précoce ou que le niveau de transcrit est trop faible pour être détecté par hybridation in situ. Par opposition, le gène IGF-II a été fortement exprimé à cette étape embryonnaire précoce. L'expression du gène IGF-II a été mise en évidence dans plusieurs tissus dérivés du mésoderme et de l'endoderme (figures 3 A à 3H), résultats concordants avec ceux précédemment décrits (V.K.M. Han et al., 1987a et 1987b, J.E. Lee et al., 1990). Le site majeur de l'expression de VIGF-II est localisé dans le foie pour toutes les étapes étudiées.
Les coupes de tissus foetaux âgés de 8 semaines ont été également hybrides en utilisant les sondes oligo-nucléotidiques d'INSL4. De manière surprenante, l'ARNm d'INSL4 montre une distribution spatiale spécifique. En effet, la majorité des transcrits d'INSL4 sont localisés dans le périchondre des quatre membres, des côtes et des vertèbres. De plus, l'ARNm d'INSLA est très abondant dans les ligaments interosseux (figures 4A à 4F). Par opposition, aucun marquage n'a été détecté dans le foie, les poumons, le coeur, le thymus, l'estomac, le muscle ou les intestins à ce stade de développement. Le tableau II ci-après résume les résultats en accord avec les types de cellules identifiées dans les coupes de tissus foetaux testés. O 99/37780
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TABLEAU II : Distribution de l'ARNm d'INSU et d'IGF-II dans les tisssus embryonnaires (âgés de 25, 30 et 45 jours pour VIGF-II et de 8 semaines pour VINSL4)
Tissus Embryonnaires ARNm d'INSU ARNm d'IGF-II
Méninges Nég. + +
Proéminence mandibulaire Nég. + +
Arcs branchiaux Nég. + +
Thymus Nég. Nd
Arcs aortiques Nég. +
Cœur Nég. +
Moelle osseuse Nég. Nd
Poumon Nég. +
Foie Nég. + + +
Estomac Nég. Nd
Pancréas Nég. Nd
Intestins Nég. Nd
Glandes surrénales Nég. + +
Métanéphros Nég. + +
Sclérotome Nég. +
Périchondre + + + +
Ligaments + + Nd
Muscles squelettiques Nég. + +
Epiderme Nég. Nég.
Figure imgf000031_0001
Légende du Tableau II :
Nd : non déterminé ; Nég. : signal d'hybridation négatif ; + : signal d'hybridation faible ; + + : signal d'hybridation modéré ; + + + : signal d'hybridation fort ;
+ + + + : signal d'hybridation très fort ; les signaux sont observés après 6 semaines d'exposition. 30
Les coupes de tissus embryonnaires hybrides avec les mêmes sondes oligonucléotidiques d'INSL4 et d'IGF-II montrent qu'au contraire des transcrits d'IGF- II, qui sont localisés dans la plupart des tissus embryonnaires (V.R.K. Han et al. , 1987a et 1987b ; J.E. Lee et al., 1990), le gène INSL4 est exprimé seulement dans quelques-uns de ces tissus. En effet, dans les coupes de tissu d'embryon humain âgé de 8 semaines, les transcrits d'INSL4 ne sont localisés que dans les cellules du périchondre et des ligaments. A ce stade de développement, la chondrification est commencée pour tous les os des membres inférieurs.
Il est remarquable que le gène INSL4 soit un membre de la superfamille des gènes apparentés à l'insuline et que d'autres membres de cette famille codent pour des polypeptides régulateurs à la fois de la croissance et du développement dans de nombreux tissus. En particulier, les facteurs de croissance apparentés à l'insuline (IGFs) jouent un rôle important dans la régulation de la formation des os (B. Bhaumic et al., 1993 ; R. Malpe et al. , 1997, et S. Mohan et al., 1991). Dans ce contexte, l'expression spécifique du gène INSL4 au cours du développement embryonnaire chez l'homme, à la fois sur le plan chronologique et sur le plan de sa distribution tissulaire hautement restrictive dans l'embryon, suggère fortement que ce gène est très certainement impliqué dans différents stades de développement de l'os en formation et des ligaments.
31
Bibliographie
• Abitbol M. , et al., 1993, Nucleus basalis magnocellularis and hippocampus are the major sites of FMR-1 expression during human embryonic development, a preliminary report. C R Acad. Sci. Paris 318 : 57-66. • Adham, I.M. et al., (1993), J. Biol. Chem. 268 : 26668-26672.
• Baker J. , et al. 1993, Rôle of insulin-like growth factors in embryonic and postnatal growth. Cell. 75 : 73-82.
• Bellet D. , et al., 1997, Identification of pro-EPIL and EPIL peptides translated from insulin-like 4 (INSL-4) mRNA in human placenta. J. Clin. Endocrinol Metab. 82 : 3169-3172.
• Bhaumic B. , 1993, Insulin-like growth factor (IGF) binding proteins and insulin- like growth factor sécrétion by cultured chondrocyte cells : identification, characteri-zation and ontogeny during cell differentiation. Regularoty Peptides 48 : 113-122. • Bogie, L.V. et al., (1995), J. Clin. Endocrinol. Metab. 80 : 130-137.
• Buckholz, R.G., (1993), Curr. Op. Biotechnology 4 : 538-542.
• Burn J., et al., 1995, Human embryo use in developmental research. Nature Genêt. 11 : 3-6.
• Carter, B.J., (1993), Curr. Op. Biotechnology 3 : 533-539. • Chassin D. , et al. , 1995, Cloning of a new member of the insulin gène superfamily (INSL4) expressed in human placenta. Genomics 29 : 465-470.
• Compton, J. et al. , (1991), Nature, 350 : 91-92.
• De Chiara TM., et al., 1990, A growth-deficiency phenotype in heterozygous mice carrying an insulin-like growth factor II gène disrupted by targeting. Nature 345 : 78-80.
• Edwards, C.P. et al., (1993), Curr. Op. Biotechnology 4 : 558-563.
• Epstein, A., (1992), Médecine/Sciences 8 : 902-911.
• Gérard M., et al., 1995, Pax-Genes expression during human embryonic development, a preliminary report. Compte Rendu Acad. Sci. Paris 318 : 57-66. • Guatelli J.C. et al., (1990), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 87 : 1874-1878. 32
• Han VKM, et al. , 1987a, Identification of somatomedin/insulin-like growth factor immunoreactive cells in the human fétus. Pediatrics Research 22 : 245-249.
• Han VKM, et al. , 1987b, Cellular localization of sommatomedin (insulin-like growth factor) messcnger RNA in the human fétus. Science 236 : 193-197. • Han VKM, et al. , 1988, Expression of sommatomedin (Insulin-like growth factor) messenger ribonucleic acids in the human fétus : identification, characterization, and tissue distribution. J. Clin. Endocrinol. Metab. 66 : 422-429.
• Han VKM, et al., 1996, The expression of insulin-like growth factors (IGF) and IGF-binding protein (IGFBP) gènes in the human placenta at the feto-maternal interface. J. Clin. Endocrinol Metab. 81 : 2680-2693.
• Hansell DJ, et al., 1991, Expression of the human relaxin Hl gène in the decidua, trophoblast, and prostate. J. Clin. Endocrinol. Metab. 72 : 899-904.
• Kôhler et Milstein, (1975), Nature 256, 495-497.
• Landegren, U. et al., (1988), Science 241 : 1077-1080. • Lee JE, et al., 1990, Pattern of the insulin-like growth factor II gène expression during early mouse embryogenesis. Development 110 : 151-159.
• Le Roith D., 1997, Insulin-like growth factors. N. Engl. J. Med. 336 : 633-640.
• Liu JP, et al., 1993, Mice carrying null mutations of the gènes encoding insulin- like growth factor I (Igf-I and type 1 IGF receptor (Igflr). Cell. 75 : 59-72. • Malpe R., 1997, Insulin-like growth factor (IGF)-I, -II, IGF binding proteins (IGFBP)-3, -4, and -5 levels in the conditioned média of normal human bone cells are skeletal site-dependant. J. Bone Minerai Res. 12 : 423-430.
• Mohan S. , et al., 1991, Bone growth factors. Clin. Orthop. Rel. Res. 263 : 30-48.
• Olins, P.O., and Lee, (1993), Curr. Op. Biotechnology 4 : 520-525. • O'Rahilly R., et al., 1987, Developmental stages in human embryos including a revision of Streeter's 'Horizons', and a survey of the Carnegie collection. Canergie Institution of Washington, publication N° 637.
• O'Rahilly R., et al., 1994, The Embryonic Human Brain, An Atlas of Developmental Stages. Wiley-Liss, Inc., New York. 33
• Ottolenghi C, et al., 1997, Genetic homology and divergence between mouse and humans : spécifie and gênerai implications. TIG in press.
• Perricaudet, M. et al. , (1992), La Recherche 23 : 471-473.
• Sambrook, J., et al. , 1989, In Molecular Cloning : A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, NY : Cold Spring Harbor Laboratory Press.
• Strachan T. , et al. , 1997, A new dimension for the human génome project : towards comprehensive expression maps. Nature Genêt. 16 : 126-132.
• Tashima LS, et al., 1995, The human leydig insulin-like (hLEY I-L) gène is expressed in the corpus luteum and trophoblast. J. Clin. Endocrinol Metab. 80 : 707-710.
• Walker, G.T. et al., (1992), Nucleic Acids Res. 20 : 1691-1696.

Claims

34REVENDICATIONS
1. Gène INSL4, caractérisé en ce qu'il est exprimé dans des cellules foetales du tissu osseux et/ou de ligaments.
2. Polypeptide EPIL 1, EPIL 2 ou EPIL 3 codé par le gène INSL4 selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est exprimé dans des cellules foetales du tissu osseux.
3. Polypeptide selon la revendication 2, caractérisé en ce que les cellules foetales du tissu osseux sont des cellules du périchondre.
4. Polypeptide EPIL 1, EPIL 2 ou EPIL 3 codé par le gène INSL4 selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est exprimé dans des cellules foetales de ligaments.
5. Polypeptide selon l'une des revendications 2 à 4, caractérisé en ce qu'il est impliqué dans le processus de différenciation de cellules du tissu osseux et/ou de ligaments.
6. Polypeptide selon l'une des revendications 2 à 4, caractérisé en ce qu'il est impliqué dans le processus de prolifération de cellules du tissu osseux et/ou de ligaments.
7. Polypeptide selon l'une des revendications 2 à 4, caractérisé en ce qu'il est impliqué dans le processus de régénération de cellules du tissu osseux et/ou de ligaments.
8. Polypeptide selon l'une des revendications 2 à 7, caractérisé en ce qu'il est impliqué dans le processus de développement du cartilage de l'os en formation.
9. Polypeptide selon l'une des revendications 2 à 7, caractérisé en ce qu'il est impliqué dans le processus d'ossification de l'os en formation.
10. Utilisation d'un ou de plusieurs anticorps dirigés contre un polypeptide EPIL 1, EPIL 2, EPIL 3 selon l'une des revendications 2 à 9, ou l'un de leurs homologues ou variants, ou contre l'un de leurs fragments, pour la détection, l'identification, la localisation et/ou le dosage d'un polypeptide EPIL 1, EPIL 2, EPIL 3 ou l'un de leurs homologues ou variants, dans le tissu osseux et/ou dans les ligaments. 35
11. Utilisation d'un ou de plusieurs anticorps dirigés contre un polypeptide EPIL 1, EPIL 2, EPIL 3 selon l'une des revendications 2 à 9, ou l'un de leurs homologues ou variants, ou contre l'un de leurs fragments pour le diagnostic de pathologies liées à l'expression anormale de polypeptide EPIL 1, EPIL 2 et/ou EPIL 3 dans le tissu osseux et/ou dans les ligaments.
12. Utilisation d'une sonde ou amorce oligonucléotidique, pour la détection, l'identification, la localisation, l'amplification, et/ou le dosage de séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4 selon la revendication 1 dans le tissu osseux et/ou dans les ligaments.
13. Utilisation d'une sonde ou amorce oligonucléotidique capable de s'hybrider spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4 selon la revendication 1, pour le diagnostic de pathologies liées à l'expression anormale du gène INSL4 dans le tissu osseux et/ou dans les ligaments.
14. Procédé de détection, d'identification, de localisation et/ou de dosage spécifique d'un polypeptide EPIL 1, EPIL 2, EPIL 3 selon l'une des revendications 2 à 9, ou l'un de leurs homologues ou variants, dans un échantillon biologique de tissu osseux et/ou de ligaments, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale du ou desdits polypeptides dans le tissu osseux et/ou dans les ligaments, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mise en contact dudit échantillon biologique avec un ou plusieurs anticorps dirigés contre le ou lesdits polypeptides ou contre l'un de leurs fragments ; b) mise en évidence, identification, localisation et/ou dosage du complexe antigène- anticorps formé.
15. Kit ou nécessaire pour la détection, l'identification, la localisation et/ou le dosage spécifique d'un polypeptide EPIL 1, EPIL 2, EPIL 3 selon l'une des revendications 2 à 9, ou l'un de leurs homologues ou variants, dans un échantillon biologique de tissu osseux et/ou de ligaments, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale du ou desdits polypeptides dans ledit échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants : a) un ou plusieurs anticorps dirigés contre le ou lesdits polypeptides, ou un de leurs fragments ; 36
b) le cas échéant, les réactifs pour la constitution du milieu propice à la réaction immunologique ; c) le cas échéant, les réactifs permettant la détection, l'identification et/ou le dosage des complexes antigène-anticorps produits par la réaction immunologique.
16. Procédé de détection, d'identification et/ou de dosage spécifique de séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4 selon la revendication 1 , dans un échantillon biologique de tissu osseux et/ou de ligaments, ou de diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de ladite séquence d'acide nucléique dans ledit échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : a) isolement de l'ADN à partir dudit échantillon biologique à analyser, ou obtention d'un ADNc à partir de l'ARN dudit échantillon biologique ; b) amplification spécifique de ladite séquence d'acide nucléique à l'aide d'au moins une amorce capable de s'hybrider spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4 ; c) analyse qualitative et/ou quantitative des produits d'amplification.
17. Procédé de détection, d'identification et/ou de dosage spécifique de séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4 selon la revendication 1, dans un échantillon biologique de tissu osseux et/ou de ligaments, ou de diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de ladite séquence d'acide nucléique dans ledit échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : a) mise en contact d'une sonde oligonucléotidique capable de s'hybrider spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4 avec ledit échantillon biologique, l'ADN contenu dans ledit échantillon biologique ayant, le cas échéant, préalablement été rendu accessible à l'hybridation, dans des conditions permettant l'hybridation de ladite sonde à l'ADN contenu dans ledit échantillon biologique ; b) détection, identification et/ou dosage de l'hybride formé entre ladite sonde oligonucléotidique et l'ADN dudit échantillon biologique.
18. Procédé de détection, d'identification et/ou de dosage spécifique de séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4 selon la revendication 1, dans un échantillon biologique de tissu osseux et/ou de ligaments, ou de diagnostic de 37
pathologies liées à la présence anormale de ladite séquence d'acide nucléique dans ledit échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : a) mise en contact d'une sonde oligonucléotidique immobilisée sur un support et capable de s'hybrider spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4, avec ledit échantillon biologique, l'ADN de l'échantillon, ayant, le cas échéant, été préalablement amplifié à l'aide d'au moins une amorce capable de s'hybrider spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4 et/ou rendu accessible à l'hybridation, dans des conditions permettant l'hybridation de ladite sonde à l'ADN dudit échantillon biologique ; b) mise en contact de l'hybride formé entre ladite sonde oligonucléotidique immobilisée sur un support et l'ADN contenu dans ledit échantillon biologique, le cas échéant après élimination de l'ADN dudit échantillon biologique n'ayant pas hybride avec ladite sonde, avec une sonde oligonucléotidique, notamment marquée, et capable de s'hybrider spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSLA.
19. Kit ou nécessaire pour la détection, l'identification et/ou le dosage spécifique de séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4 selon la revendication 1, dans un échantillon biologique de tissu osseux et/ou de ligaments, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de ladite séquence d'acide nucléique dans ledit échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants : a) une sonde oligonucléotidique capable de s'hybrider spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4 ; b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la mise en oeuvre d'une réaction d'hybridation ; c) le cas échéant, au moins une amorce capable de s'hybrider spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4 ainsi que les réactifs nécessaires à une réaction d'amplification de l'ADN. 38
20. Kit ou nécessaire pour la détection, l'identification et/ou le dosage spécifique de séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4 selon la revendication 1, dans un échantillon biologique de tissu osseux et/ou de ligaments, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de ladite séquence d'acide nucléique dans ledit échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants : a) une sonde oligonucléotidique, dite sonde de capture, pouvant être fournie préimmobilisée sur un support, et capable de s'hybrider spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4 ; b) une sonde oligonucléotidique, dite sonde de révélation, notamment marquée, et capable de s'hybrider spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4 ; c) le cas échéant, au moins une amorce capable de s'hybrider spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4 ainsi que les réactifs nécessaires à une réaction d'amplification de l'ADN.
21. Procédé ou kit selon l'une des revendications 14 à 20, pour le diagnostic de pathologies liées à la différenciation et/ou la prolifération anormale du tissu osseux et/ou des cellules de ligaments.
22. Procédé ou kit selon la revendication 21, pour le diagnostic de pathologies liées au développement anormal du cartilage et/ou à une ossification anormale de l'os en formation.
23. Procédé ou kit selon l'une des revendications 14 à 20, pour le diagnostic d'ostéoporose et/ou de dysplasie.
24. Méthode de marquage de cellule de tissu osseux et/ou de ligaments, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : a) mise en contact d'un échantillon biologique de tissu osseux et/ou de ligaments avec un ou plusieurs anticorps dirigés contre le ou les polypeptides EPIL 1, EPIL 2 et/ou EPIL 3 selon l'une des revendications 2 à 9, lesdits anticorps pouvant être marqués ; b) le cas échéant, marquage desdits anticorps à l'aide de composés marqués capables de reconnaître lesdits anticorps. 39
25. Méthode de marquage de cellule de tissu osseux et/ou de ligaments, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : a) mise en contact d'un échantillon biologique de tissu osseux et/ou de ligaments avec une ou plusieurs sondes oligonucléotidiques capables de s'hybrider spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4 selon la revendication 1 , lesdites sondes pouvant être marquées ; b) le cas échéant, marquage desdites sondes à l'aide de composés marqués capables de reconnaître lesdites sondes.
26. Méthode de marquage de cellule selon l'une des revendications 24 et 25, caractérisée en ce que la cellule de tissu osseux et/ou de ligaments est une cellule foetale.
27. Procédé de détection de cellule anormale de tissu osseux et/ou de ligaments, caractérisé en ce qu'il met en oeuvre une méthode selon l'une des revendications 24 à 26.
28. Méthode de sélection de composé chimique ou biochimique capable de moduler la différenciation, la régénération et/ou la prolifération de cellules humaines et/ou animales de tissu osseux et/ou de ligaments, caractérisée en ce qu'elle met en oeuvre un polypeptide EPIL 1, EPIL 2, EPIL 3 selon l'une des revendications 2 à 9, un de leurs polypeptides homologues ou variants, ou un de leurs fragments, une séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4, ou une cellule de tissu osseux ou de ligaments, notamment foetale.
29. Méthode de sélection selon la revendication 28, caractérisée en ce que ledit composé sélectionné est capable d'inhiber la différenciation, la régénération et/ou la prolifération de cellules humaines et/ou animales de tissu osseux et/ou de ligaments.
30. Méthode de sélection selon la revendication 28, caractérisée en ce que ledit composé sélectionné est capable de favoriser la différenciation, la régénération et/ou la prolifération de cellules humaines et/ou animales de tissu osseux et/ou de ligaments.
31. Méthode de sélection selon l'une des revendications 28 à 30, caractérisée en ce que lesdites cellules sont des cellules foetales . 40
32. Méthode de sélection selon la revendication 31, caractérisée en ce que les cellules foetales sont des cellules du périchondre.
33. Composé chimique ou biochimique, caractérisé en ce qu'il est susceptible d'être sélectionné par une méthode selon l'une des revendications 28 à 32.
34. Composé selon la revendication 33, à titre de médicament.
35. Composé selon l'une des revendications 33 et 34, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi : a) un polypeptide EPIL 1, EPIL 2 ou EPIL 3, un de leurs polypeptides homologues ou variants ou un de leurs fragments, pouvant être obtenu par recombinaison génétique ou par synthèse chimique ; b) un anticorps dirigé contre un polypeptide tel que défini en a) ; c) un composé chimique ou biochimique, caractérisé en ce qu'il est un ligand d'un polypeptide tel que défini en a) ; d) un vecteur comprenant tout ou partie d'une séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4 ; e) un vecteur tel que défini en d), présentant à sa surface un marqueur spécifique de cellule de tissu osseux ou de ligaments cible dont on cherche à moduler l'activité ; f) une séquence d'acide nucléique sens ou antisens capable de s'hybrider spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4.
36. Composé selon l'une des revendications 34 à 35, destiné au traitement de pathologies liées à la différenciation et/ou la prolifération anormale du tissu osseux et/ou des cellules de ligaments.
37. Composé selon la revendication 36, destiné au traitement de pathologies liées au développement anormal du cartilage et/ou à une ossification anormale de l'os en formation.
38. Composé selon l'une des revendications 34 à 35, destiné au traitement d'ostéoporose ou de dysplasie.
39. Composé selon l'une des revendications 34 à 35, destiné au traitement de pathologies impliquant à la régénération de tissu osseux et/ou de ligaments. 41
40. Composé selon la revendication 39, caractérisé en ce que ledit traitement vise à réparer des lésions du tissu osseux et/ou de ligaments suite à un choc traumatique.
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995034653A1 (fr) * 1994-06-13 1995-12-21 Institut Gustave-Roussy Epil/placentine
WO1999009172A1 (fr) * 1997-08-14 1999-02-25 Institut Gustave-Roussy Identification et localisation de polypeptides epil exprimes, codes par le gene insl4 et leurs applications

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995034653A1 (fr) * 1994-06-13 1995-12-21 Institut Gustave-Roussy Epil/placentine
WO1999009172A1 (fr) * 1997-08-14 1999-02-25 Institut Gustave-Roussy Identification et localisation de polypeptides epil exprimes, codes par le gene insl4 et leurs applications

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BELLET D ET AL: "IDENTIFICATION OF PRO-EPIL AND EPIL PEPTIDES TRANSLATED FROM INSULIN-LIKE 4 (INSL4) MRNA IN HUMAN PLACENTA", JOURNAL OF CLINICAL ENDOCRINOLOGY AND METABOLISM, vol. 82, no. 9, September 1997 (1997-09-01), NEW YORK US, pages 3169 - 3172, XP002063893 *
CHASSIN D ET AL: "CLONING OF A NEW MEMBER OF THE INSULIN GENE SUPERFAMILY (INSL4) EXPRESSED IN HUMAN PLACENTA", GENOMICS, vol. 29, no. 2, 20 September 1995 (1995-09-20), NEW YORK US, pages 465 - 470, XP000644716 *
KOMAN A ET AL: "MOLECULAR CHARACTERIZATION AND IN VITRO BIOLOGICAL ACTIVITY OF PLACENTIN, A NEW MEMBER OF THE INSULIN GENE FAMILY", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY. (MICROFILMS), vol. 271, no. 34, 23 August 1996 (1996-08-23), BALTIMORE US, pages 20238 - 20241, XP002059722 *
LAURENT A ET AL.: "Insulin-like 4 (INSL4) gene expression in human embryonic and trophoblastic tissues", MOLECULAR REPRODUCTION AND DEVELOPMENT, vol. 51, no. 2, October 1998 (1998-10-01), NEW YORK US, pages 123 - 129, XP002104576 *
LAURENT A ET AL: "INSULIN-LIKE 4 (INSL4) GENE EXPRESSION", INTERNATIONAL JOURNAL OF DEVELOPMENTAL BIOLOGY, vol. 40, no. 3, 1996, pages S27, XP002063892 *

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